ES2242447T3 - Eliminacion de priones de la sangre, plasma y otros liquidos. - Google Patents

Abstract

Un método para retirar priones de un fluido corporal humano, que comprende las etapas de: poner en contacto un fluido corporal humano en un estado líquido fluible con un sustrato sólido que comprende un agente complejador de priones que se une a la PrPSc nativa; y permitir que el fluido corporal humano permanezca en contacto con el sustrato durante un tiempo tal que los priones en el fluido corporal humano se unen al sustrato; en el que el agente complejador se selecciona del grupo que consiste en un heteropoliácido o sal del mismo, una sal metálica de ácido fosfovolfrámico y un anticuerpo.

Description

Eliminación de priones de la sangre, plasma y otros líquidos.

Campo de la invención

La invención se refiere de forma general a los métodos para purificar muestras y en particular a los métodos para retirar priones de la sangre y de los productos sanguíneos.

Antecedentes de la invención

Los priones son patógenos infecciosos que causan encefalopatías espongiformes en el sistema nervioso central en humanos y animales. Los priones son distintos de las bacterias, virus y viroides. Actualmente, la hipótesis predominante es que no es necesario ningún componente de ácido nucleico para la infectividad de la proteína priónica. Además, un prión que infecte una especie de animal (p. ej., un humano) no infectará otra (p. ej., un ratón).

Un paso importante en el estudio de los priones y las enfermedades que causan fue el descubrimiento y la purificación de una proteína designada como la proteína priónica ("PrP") [Bolton et al., Science 218: 1309-11 (1982); Prusiner et al., Biochemistry 21: 6942-50 (1982); McKinley et al., Cell 35: 57-62 (1983)]. Desde entonces, se han clonado, secuenciado y expresado los genes que codifican proteínas priónicas completas en animales transgénicos. La PrP^{C} está codificada por un gen único en el huésped [Basler et al., Cell 46: 417-28 (1986)] y, normalmente, se encuentra en la superficie exterior de las neuronas. Una hipótesis puntera es que las enfermedades priónicas son el resultado de la conversión de la PrP^{C} en una forma modificada llamada PrP^{Sc}.

Parece que la isoforma de la encefalopatía espongiforme ovina (scrapie) de la proteína priónica ("PrP^{Sc}") es necesaria para la transmisión y para la patogenia de enfermedades neurodegenerativas transmisibles de animales y de humanos. Véase Prusiner, S. B., "Molecular biology of prion disease", Science 252: 1515-1522 (1991). Las enfermedades priónicas de animales más comunes son la encefalopatía espongiforme ovina de las ovejas y las cabras y la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) del ganado [Wilesmith, J. y Wells, Microbiol Inmunol 172: 21-38 (1991)]. Se han identificado cuatro enfermedades priónicas de humanos: 1) curu, 2) enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), 3) enfermedad de Gertsmann y Sträussler (GSS) y 4) insomnio familiar mortal (FFI) [Gajdusek, D. C., Science 197: 943-960 (1977); Medori et al., N. Engl. J. Med. 326: 444-449 (1992)]. La presentación de enfermedades priónicas de humanos como enfermedades esporádicas, genéticas e infecciosas inicialmente supuso un problema complicado que ha sido explicado gracias al origen genético y celular de la PrP.

La mayoría de los casos de la CJD son esporádicos, pero aproximadamente del 10% al 15% se heredan como trastornos dominantes autosómicos causados por mutaciones en el gen humano de la PrP [Hsiao et al., Neurology 40: 1820-1827 (1990); Goldfarb et al., Science 258: 806-808 (1992); Kitamoto et al, Proc. R. Soc. Lond. 343: 391-398]. La CJD yatrógena ha estado causada por la somatropina humana (HGH) obtenida de la pituitaria de los cadáveres así como también de injertos de duramadre [Brown et al., Lancet 340: 24-27 (1992)]. A pesar de los numerosos intentos de relacionar la CJD a una fuente infecciosa tal como el consumo de carne de oveja infectada con la encefalopatía espongiforme ovina, hasta la fecha no se ha identificado ninguna [Harries-Jones et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 51: 1113-1119 (1988)], salvo en los casos de enfermedad provocada yatrógenamente. Por otra parte, se cree que el curu, que durante muchas décadas ha devastado el Fore y las tribus vecinas de las regiones montañosas de Nueva Guinea, se ha diseminado por la infección durante el canibalismo ritual [Alpers, M. P., Slow transmissible diseases of the nervous system, Vol. 1, S. B. Prusiner y W. J. Hadlow, eds. (New York: Academic Press), pp. 66-09 (1979)].

La transmisión inicial de la CJD a primates experimentales tiene una rica historia que comienza con el reconocimiento de William Hadlow de la similitud entre el curu y la encefalopatía espongiforme ovina. En 1959, Hadlow sugirió inocular primates no humanos con extractos preparados a partir de pacientes que morían del curu y que se observara la enfermedad en los animales, lo que predijo que se produciría tras un periodo de incubación prolongado [Hadlow, W. J., Lancet 2: 289-290 (1959)]. Siete años más tarde, Gajdusek, Gibbs y Alpers demostraron la transmisibilidad del curu a chimpancés tras periodos de incubación que iban de 18 a 21 meses [Gajdusek et al., Nature 209: 794-796 (1966)]. La similitud de la neurohistopatología del curu con la de la CJD [Klatzo et al., Lab Invest. 8: 799-847 (1959)] inspiró experimentos similares con chimpancés y se describieron transmisiones de la enfermedad en 1968 [Gibbs, Jr. et al., Science 161: 388-389 (1968)]. Durante los últimos 25 años se han transmitido aproximadamente 300 casos de la CJD, el curu y la GSS a una variedad de simios y macacos.

El coste, la rareza y, a menudo, la inhumanidad percibida en tales experimentos restringió este trabajo y, así, limitó la acumulación del conocimiento. Mientras que se ha dicho que los datos de transmisión más fiables provienen de los estudios que usan a primates no humanos, algunos casos de enfermedad por priones humanos se han transmitido a los roedores pero, aparentemente, con menos regularidad [Gibbs, Jr. et al., Slow transmisible diseases of the nervous system, Vol. 2, S. B. Prusiner y W. J. Hadlow, eds. (New York: Academic Press), pp, 87-110 (1979); Tateishi et al., Prion diseases of humans and animals, Prusiner et al., eds. (London: Ellis Horwood), pp. 129-134 (1992)].

La transmisión infrecuente de la enfermedad por priones humanos a los roedores se ha citado como un ejemplo de la "barrera de especie", descrita primero por Pattison en sus estudios sobre el paso del agente de la encefalopatía espongiforme ovina entre ovejas y roedores [Pattison, I. H., NINDB Monograph 2, D. C. Gajdusek, C. J. Gibbs Jr. y M.P. Alpers, eds (Washington, D. C.: U. S. Government Printing), pp. 249-257 (1965)]. En esas investigaciones, el paso inicial de priones de una especie a otra se asoció con un tiempo de incubación prolongado, y solo unos pocos animales acababan desarrollando la enfermedad. El paso posterior a la misma especie está caracterizado por todos los animales, que enfermaron tras unos periodos de incubación muy breves.

Se demostró que la base molecular de la barrera de especies entre el hámster sirio (SHa) y el ratón residía en la secuencia del gen de la PrP mediante el uso ratones transgénicos (Tg) [Scott et al., Cell 59: 847-857 (1989)]. La SHaPrP difiere de la MoPrP en 16 posiciones de los 254 restos de aminoácidos [Basler et al., Cell 46: 417-428 (1986); Locht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6372-6376 (1986)]. Los ratones Tg(SHaPrP) que expresan la SHaPrP han reducido los tiempos de incubación cuando se inocularon con priones de SHa. Cuando se realizaron estudios similares con ratones que expresaban los transgenes de la PrP humana u ovina, no se suprimió la barrera de especie, a saber, el porcentaje de animales que se infectaron fue inaceptablemente bajo y los periodos de incubación fueron inaceptablemente largos. Así, no ha sido posible, por ejemplo en el caso de los priones humanos, usar animales transgénicos (como ratones que contengan un gen de PrP de otra especie) para probar de manera fiable una muestra y determinar si esa muestra está infectada con priones. Más abajo se ilustra la gravedad del riesgo sanitario que resulta de la ausencia de tal prueba.

Más de 45 adultos jóvenes tratados previamente con la HGH obtenida de pituitarias humanas han desarrollado la CJD [Koch et al., N. Engl. J. Med. 313: 731-733 (1985); Brown et al., Lancet 340: 24-27 (1992); Fradkin et al., JAMA 265: 880-884 (1991); Buchanan et al., Br. Med. J. 302: 824-828 (1991)]. Afortunadamente, hoy se usa la HGH recombinante aunque, al parecer, ha aumentado la remota posibilidad de que un aumento de la expresión de wtPrP^{c} estimulada por una elevada HGH podría inducir la enfermedad priónica [Lasmezas et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1163-1169 (1993)]. La contaminación con priones de la HGH preparada a partir de pituitarias lo confirma la transmisión de la enfermedad priónica a un macaco a los 66 meses de la inoculación con un lote sospechoso de HGH [Gibbs, Jr. et al., N. Engl. J. Med. 328: 358-359 (1993)]. Los largos periodos de incubación asociados con las enfermedades priónicas no revelarán el alcance total de la CJD yatrógena durante décadas en miles de personas tratadas con la HGH en todo el mundo. Parece que la CJD yatrógena se ha desarrollado en cuatro mujeres estériles tratadas con hormona gonadotrofina obtenida de humanos [Healey et al., Br. J. Med. 307: 517-518 (1993); Cochius et al., Aust. N. Z. J. Med. 20: 592-593 (1990); Cochius et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 55: 1094-1095 (1992)] así como también en, al menos, 11 pacientes que recibieron injertos de duramadre [Nisbet et al., J. Am. Med. Assoc. 261: 1118 (1989); Thadani et al., J. Neurosurg. 69: 766-769 (1988); Williamson et al., J. Neurosurg. Psychiatry 54: 940 (1991); Brown et al., Lancet 340: 24-27 (1992)]. Estos casos de CJD yatrógena subrayan la necesidad de detectar fármacos que posiblemente puedan estar contaminados con priones.

La purificación por inmunoafinidad y la neutralización de la infectividad de los priones de encefalopatía espongiforme ovina se describe en Gabazion et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 6617-6621 (1988). La patente internacional WO 93/23432 describe polipéptidos priónicos solubles y métodos para la detección y la purificación de tales polipéptidos. La patente internacional WO 97/40681 describe una sustancia biológica sin patógenos virales y moleculares y un procedimiento para la producción de la misma. La patente internacional WO 97/43649 describe carabinas capaces de unirse a las proteínas priónicas y distinguir las isoformas de la PrP^{C} y la PrP^{Sc}.

En la técnica, se han descrito varios dispositivos de prueba que incorporan heteropoliácidos; véanse las patentes de los EEUU n.º 4300905, 4320086 y 5521060. También se han descrito las propiedades catalíticas y el comportamiento electroquímico de los heteropoliácidos [Saidkhanov, Journal of Molecular Catalysis, 21: 356-373 (1983) y Alpatova et al., Elektrokhimiya 30(7): 859-866 (1994)].

Recientemente, dos médicos en Francia fueron acusados de homicidio involuntario de un niño que había sido tratado con somatropina extraída de cadáveres. El niño desarrolló la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. (Véase New Scientist, 31 de julio, 1993, página 4). Según el Instituto Pasteur, desde 1989 se han publicado 24 casos de CJD en jóvenes que fueron tratados con la somatropina humana entre 1983 y mediados de 1985. Quince de estos niños han muerto. Ahora, no obstante, parece que cientos de niños en Francia han sido tratados con hormona de crecimiento extraída de cuerpos muertos con riesgo de desarrollar la CJD (véase, New Scientist, 20 de noviembre, 1993, página 10). Visto esto, claramente existe la necesidad de unos medios convenientes y rentables para retirar los priones que causan la CJD de la sangre y derivados de la sangre. La presente invención proporciona tal método.

Compendio de la invención

La invención proporciona un método para retirar priones de un líquido corporal humano, que comprende las etapas de poner en contacto un líquido corporal humano en un estado líquido fluido con un sustrato sólido que comprende un agente complejador que se une a una PrP^{Sc} nativa; y permitir que el líquido corporal humano permanezca en contacto con el sustrato durante un tiempo de manera que los priones en el líquido corporal humano se unan al sustrato; en el que el agente complejador se selecciona del grupo que consiste en un heteropoliácido o una sal del mismo, una sal metálica de ácido fosfovolfrámico y un anticuerpo.

Los priones se retiran de un líquido corporal humano como la sangre o el plasma poniendo en contacto estas sustancias con el agente complejador. El sustrato se puede utilizar en cualquier configuración que permita la retirada del prión de las sustancias biológicas, tales como perlas esféricas de polímero recubiertas con el agente complejador y alojadas en una columna a través de la cual se dejan fluir la sangre, el plasma y cualquier otra sustancia que se sospeche que contiene priones.

Otra realización de la invención es un dispositivo para retirar priones de una muestra, cuyo dispositivo comprende un polímero insoluble en agua que recubre un metal ferromagnético y un agente complejador de priones que recubre la superficie del polímero, en la que el agente complejador es una sal metálica de ácido fosfovolfrámico que se une a la PrP^{Sc} nativa.

Un objeto de la invención es proporcionar unos medios simples y económicos para retirar priones de una sustancia.

Una ventaja de la invención es que los productos sanguíneos que podrían contener priones se pueden certificar como "sin priones" cuando se procesan por medio de la invención.

Una característica de la invención es que los priones naturales se unen selectivamente a agentes químicos tales como heteropoliácidos o sales metálicas de los heteropoliácidos. Un agente químico preferido utilizable en los métodos de la invención es el fosfovolframato de sodio.

Otra característica de la invención es que los priones naturales se unen selectivamente a agentes biológicos tales como los anticuerpos que se unen específicamente a la PrP^{Sc}.

Otra realización de la invención es un dispositivo de flujo para retirar priones de una muestra de líquido, que comprende un alojamiento a través del cual fluye la muestra de líquido, y superficies con sustrato que comprenden un agente complejador de priones que es una sal metálica de ácido fosfovolfrámico y que se une a la PrP^{Sc} nativa. El sustrato puede estar en forma de perlas esféricas de polímero que están recubiertas por la sal metálica de ácido fosfovolfrámico. Las perlas esféricas pueden tener un núcleo de metal ferromagnético que permite la separación de las perlas mediante fuerzas magnéticas y tienen un polímero inerte que recubre el núcleo metálico con el polímero recubierto con la sal metálica de ácido fosfovolfrámico.

Estos y otros objetos, aspectos, ventajas y características de la invención serán evidentes para aquellas personas expertas en la técnica al leer los detalles de los agentes de unión, dispositivos y los métodos que se describen con más detalle posteriormente.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Antes de exponer y describir los métodos y dispositivos actuales, se debe entender que esta invención no se limita a etiquetas, ensayos o métodos particulares los cuales, por supuesto, pueden variar. También se entiende que la terminología usada en la presente invención aparece con el propósito de describir sólo realizaciones determinadas y que no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención quedará limitado sólo por las reivindicaciones anexas.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente invención tienen el mismo significado como entiende comúnmente cualquiera o un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se puede usar cualesquiera materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos en la presente invención en la práctica o la validación de la presente invención, a continuación se describen los materiales y métodos preferidos.

Las publicaciones discutidas en la presente invención se proporcionan sólo para su descripción antes de la fecha de registro de la presente solicitud. Además, las fechas de publicación proporcionadas están sujetas a cambio, si se encuentra que la fecha real de publicación es diferente de la que se proporciona aquí.

Definiciones

El "agente complejador" puede ser un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo específico de la PrP^{Sc} nativa, o un ácido fosfovolfrámico (PTA), que se puede añadir en forma de una sal, p. ej., fosfovolframato de sodio. Los agentes complejadores se pueden usar solos o en combinación. Por ejemplo, se puede usar un agente complejador biológico junto con un agente complejador químico. En otro ejemplo, se pueden usar juntos dos agentes complejadores de la misma clase. El complejo formado debe proporcionar algunos medios para separar el complejo del resto de la composición, tal como la inmovilización del agente complejador a la superficie. Un agente complejador preferido se une a la PrP^{Sc} más rápidamente de lo que se une a la PrP^{C} y un agente particularmente preferido se une a la PrP^{Sc} con mucha afinidad y no se une a la PrP^{C} en cantidades significativas. Objetivamente, un agente de unión preferido se une a la PrP^{Sc} con una afinidad de unión de dos veces o más que la de la unión a la PrP^{C} y, preferiblemente, con una afinidad de unión de cinco veces o más que la de la unión a la PrP^{C}.

El término "proteína" como se usa en la presente invención pretende englobar cualquier secuencia de aminoácidos e incluye secuencias modificadas tales como las glucoproteínas. El término incluye proteínas y péptidos que se producen de forma nativa así como también los que se sintetizan de forma recombinante o sintética. Como se usa en relación con la presente invención, el término "proteína" pretende específicamente englobar las proteínas producidas de forma nativa que se producen en, al menos, dos conformaciones diferentes, en la que ambas conformaciones tienen la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos pero tienen dos o más estructuras tridimensionales diferentes. Las dos conformaciones de la proteína incluyen, al menos, una conformación que no se relaciona con un estado de enfermedad y al menos una conformación que se relaciona con un estado de enfermedad -patógeno-. Un ejemplo específico y preferido de una proteína como se usa en relación con esta descripción es un proteína PrP que incluye la forma no patológica referida como la forma PrP^{C} y la forma relacionada con la enfermedad referida como la PrP^{Sc}. Aunque una proteína priónica o la forma PrP^{Sc} de una proteína PrP es infecciosa y patógena, la conformación de la enfermedad de otras proteínas no es infecciosa, aunque es patógena. Como se usa en la presente memoria, el término "patógeno" puede querer decir que la proteína realmente causa la enfermedad o puede simplemente querer decir que la proteína está asociada con la enfermedad y, por lo tanto, aparece cuando existe la enfermedad. Así, una proteína patógena usada en relación con esta descripción no es necesariamente una proteína que es el agente causante específico de una enfermedad.

Los términos "proteína PrP", "PrP" y similares se usan indistintamente en la presente memoria y se refieren tanto a la forma infecciosa de la partícula PrP^{Sc} conocida por causar enfermedades (encefalopatías espongiformes) en humanos y animales, como la forma no infecciosa PrP^{C} que, en condiciones apropiadas, se convierte en la forma infecciosa PrP^{Sc}.

Usamos indistintamente los términos "prión", "proteína priónica" y "proteína PrP^{Sc}" y similares para referirnos a la forma infecciosa de la PrP, la PrP^{Sc}, y es una contracción de las palabras "proteína" e "infección". Las partículas se comprenden en su mayor parte, si no exclusivamente, de moléculas de PrP^{Sc} codificadas por un gen de PrP. Generalmente, los priones son dímeros de PrP^{Sc}. Los priones son distintos de las bacterias, virus y viroides. Los priones conocidos infectan animales para causar la encefalopatía espongiforme ovina, una enfermedad transmisible y degenerativa del sistema nervioso de ovejas y cabras, así como también la encefalopatía espongiforme bovina (EEB), o "enfermedad de las vacas locas", y la encefalopatía espongiforme felina de los gatos. Se sabe que las cuatro enfermedades priónicas que afectan a los humanos son 1) curu, 2) enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), 3) enfermedad de Gertsmann y Sträussler (GSS) y 4) insomnio familiar mortal (FFI). Como se usa en la presente memoria, "prión" incluye todas las formas de priones que causan todas o cualquiera de estas enfermedades u otras en cualquier animal usado -y en particular en humanos y animales de granja domésticos-.

El término "gen de PrP" se usa en la presente memoria para describir el material genético que expresa proteínas, entre ellas polimorfismos y mutaciones patógenas conocidas. En general, el término "gen de PrP" se refiere a cualquier gen de cualquier especie que codifica cualquier forma de una proteína PrP. Algunas de las secuencias de PrP comúnmente conocidas se describen en Gabriel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9097-9101 (1992) y en las patentes de los EEUU 5565186, 5763740, 5792901 y la patente internacional WO 97/04814. El gen de PrP puede ser de cualquier animal, entre ellos animales "huésped" y "de prueba" descritos en la presente memoria y en cualquiera y en todos los polimorfismos y mutaciones de los mismos, y se reconoce que los términos incluyen otros genes de PrP que todavía no se han descubierto. La proteína expresada por tal gen puede adoptar una forma PrP^{C} (no patógena) o una forma PrP^{Sc}(patógena).

El término "anticuerpo" se refiere a una proteína de inmunoglobulina que es capaz de unirse a un antígeno. "Anticuerpo" como se usa en la presente invención quiere decir que incluye todo el anticuerpo como también cualquier fragmento de anticuerpo (p. ej., F(ac)', Fac, Fv) capaz de unir el epítopo, el antígeno o el fragmento antigénico de interés. Los anticuerpos de los ensayos de la invención son inmunorreactivos o inmunoespecíficos de la proteína PrP^{Sc} nativa y, por lo tanto, se unen específica y selectivamente a ella. Se pueden usar anticuerpos que son inmunorreactivos e inmunoespecíficos de la forma no patógena nativa y de la forma patógena (p. ej., de la PrP^{C} nativa y de la PrP^{Sc} nativa). Los anticuerpos contra la PrP son preferiblemente inmunoespecíficos -p. ej., no hay reacción cruzada significativa con las sustancias relacionadas-. Algunos anticuerpos específicos que se pueden usar en relación con la invención se describen en la solicitud publicada PCT de patente internacional WO 97/10505. Esta solicitud PCT publicada corresponde a la patente de los EEUU 5846533 expedida el 8 de diciembre de 1998. El término "anticuerpo" engloba todos los tipos de anticuerpos, p. ej., policlonales, monoclonales y los producidos con la metodología de exposición en fagos (phage display). Los anticuerpos particularmente preferidos de la invención son los anticuerpos que tienen una afinidad relativamente elevada con la PrP^{C} nativa y la PrP^{Sc}, y se prefieren los que tienen una mayor afinidad de unión por PrP^{Sc}. Un anticuerpo de la invención es un "agente complejador" como se define en la presente memoria.

"Anticuerpo purificado" se refiere a que está suficientemente libre de otras proteínas, glúcidos y lípidos con los que se asocia de forma natural. Tal anticuerpo "se une preferiblemente" a la proteína PrP^{Sc} (o un fragmento antigénico de la misma) y no reconoce sustancialmente o no se une a otras moléculas no relacionadas antigénicamente. Un anticuerpo purificado de la invención es preferiblemente inmunorreactivo con una especie específica e inmunoespecífico de ella y más preferiblemente inmunoespecífico de la PrP^{Sc} nativa.

"Fragmento antigénico" de una proteína (p. ej., una proteína PrP) se refiere a una porción de tal proteína que es capaz de unirse a un anticuerpo.

Con "se une específicamente" se hace referencia a una unión de gran avidez y/o gran afinidad de un anticuerpo con un polipéptido específico, p. ej., epítopo de una proteína, p. ej., una PrP^{Sc}. La unión del anticuerpo a su epítopo en este polipéptido específico es preferiblemente más fuerte que la unión del mismo anticuerpo a cualquier otro epítopo, particularmente los que pueden aparecer en moléculas que se le asocian, o de la misma muestra, ya que el polipéptido específico de interés, p. ej., se une más fuertemente a los fragmentos de epítopo de una proteína tal como la PrP^{Sc}, por lo que, ajustando las condiciones de unión, el anticuerpo se une casi exclusivamente a un sitio epitópico o a fragmentos de una proteína deseada tal como un fragmento epitópico de PrP^{Sc}.

Con "anticuerpo marcado para detección", "anti-PrP marcada para detección" o "fragmento anti-PrP marcado para detección" se quiere decir un anticuerpo (o un fragmento de anticuerpo que conserva la especificidad de unión) que tiene una marcación detectable pegada. Normalmente, la marcación detectable se pega por conjugación química, pero donde el marcador es un polipéptido, alternativamente se podría pegar con técnicas de ingeniería genética. Los métodos para producir proteínas marcadas para detección se conocen bien en la técnica. En la técnica se conocen marcadores detectables, pero normalmente son radioisótopos, fluoróforos, marcadores paramagnéticos, enzimas (p. ej., peroxidasa de rábano picante) u otros restos o compuestos que o bien emiten una señal detectable (p. ej., radioactividad, fluorescencia, color) o emiten una señal detectable tras la exposición del marcador a su sustrato. En la técnica, se conocen bien varios pares detectables de marcador/sustrato (p. ej., peroxidasa de rábano/diaminobencidina, avidina/estreptavidina, luciferasa/luciferina), métodos para la marcación de anticuerpos y métodos para usar en anticuerpos marcados (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, eds. Antibodies: A laboratory manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). El europio es un marcador particularmente preferido.

Las abreviaturas usadas en la presente memoria incluyen:

SNC: sistema nervioso central.

EEB: encefalopatía espongiforme bovina.

CJD: enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.

FFI: insomnio familiar mortal.

GdnHCl: hidrocloruro de guanidina.

GSS: enfermedad de Gertsmann y Sträussler.

Hu: humano.

HuPrP:proteína priónica humana.

Mo: ratón.

MoPrP: proteína priónica de ratón.

SHa: hámster sirio.

SHaPrP: proteína priónica de hámster sirio.

PrP^{Sc}: isoforma de la encefalopatía espongiforme ovina de la proteína priónica.

PrP^{C}: isoforma normal común de la proteína priónica contenida en la célula.

PrP^{CJD}: isoforma de CJD de una proteína PrP.

FVB: cepa estándar consanguínea de ratones que se usan, a menudo, para producir ratones transgénicos, ya que los cigotos de la FVB son relativamente grandes y toleran la microinyección de ADN exógeno relativamente bien.

[PrP_{\beta}]: concentración de proteína priónica en la conformación de hoja \beta.

CRE: concentración de la conformación de una proteína relacionada con la enfermedad.

PTA: ácido fosfovolfrámico.

NaPTA: fosfovolframato de sodio.

TCA: ácido tricloroacético.

CA: cromatografía de afinidad.

Aspectos generales de la invención

Se están desarrollando unos análisis para la detección de priones, pero todavía no se comercializan. Además, el coste y la conveniencia de la precisión (a gran escala) de tales análisis todavía no se han determinado. En consecuencia, cuando se sospecha que un material como el plasma humano contiene priones, se destruye -véase The Wall Street journal, 25 de noviembre, 1998, página 1, artículo titulado "'Mad cow' fears leads U.K to destroy parts of all donated blood", que señala que Inglaterra estaba destruyendo su suministro de plasma humano. Esta tajante acción se tomó porque 1) su plasma humano podría contener priones, 2) las enfermedades priónicas son mortales y, por ahora, no tienen tratamiento, 3) por ahora, no hay una prueba de detección de priones disponible comercialmente y 4) por ahora, no hay un método disponible comercialmente para retirar los priones de una muestra. La presente invención incluye un método para retirar priones.

Algunas proteínas, tal como la proteína expresada por el gen de PrP, tienen más de una forma conformacional. Por ejemplo, una proteína PrP puede asumir su forma celular, a saber, la forma PrP^{C} o su forma de encefalopatía espongiforme ovina, a saber, la forma PrP^{Sc}.Una forma de la proteína es inofensiva (p. ej., PrP^{C}) mientras que otra forma de la proteína es patógena (p. ej., PrP^{Sc}). Cuando la forma patógena compacta de la proteína tal como PrP^{Sc} aparece en un animal en cantidades muy pequeñas, el animal no muestra síntomas de la enfermedad. Sin embargo, el animal desarrollará una enfermedad relacionada con la forma patógena de la proteína -p. ej., desarrollará una enfermedad por priones-. Para evitar la progresión y/o la posible transmisión de la enfermedad, es importante retirar cualquier PrP^{Sc} que aparezca en los fluidos biológicos, y particularmente, fluidos biológicos que se deben introducir en un sujeto (p. ej., derivados de la sangre). La presente invención es útil en relación con 1) eliminar la forma patógena de la proteína de la muestra, de tal forma que el material se da "libre de priones" y/o 2) reducir la concentración de la forma patógena de la proteína en un material a un nivel tal que el material se da "sin infección".

La presente invención posibilita retirar los priones de una muestra de un fluido corporal humano al exponer la muestra a un agente complejador, que se une (de manera preferiblemente selectiva) a la PrP^{Sc} nativa y permite retirar la PrP^{Sc} nativa. El presente procedimiento es especialmente, aunque no exclusivamente, útil para tratar y/o retirar la PrP^{Sc} nativa de toda la sangre. Se puede retirar por medio de la formación de un complejo con un agente complejador inmovilizado, a saber, exponer la muestra a una columna, membrana, filtro o perlas de afinidad con el agente complejador inmovilizado. El agente complejador retirará, eficazmente, la PrP^{Sc} nativa de la muestra del fluido corporal humano, mientras que permitirá que la muestra permanezca sustancialmente en la misma forma para permitir un uso adecuado
de la muestra, a saber, manteniendo el pH correcto, la integridad estructural de las células y las proteínas, y similares.

Procedimientos en general

Cualquier tipo de fluido corporal humano se puede procesar con el uso de la presente invención para retirarle una forma patógena de una proteína.

Un fluido corporal humano a tratar debe ser una forma fluible líquida a temperatura ambiente (de 15ºC a 30ºC). La disolución debe tener un pH de aproximadamente 6,4 a 8,4, preferiblemente 7,4, y no debe contener magnesio o calcio en exceso.

La etapa siguiente es la más importante en el procedimiento de la invención. Se expone una muestra de fluido corporal humano a un agente complejador que está inmovilizado sobre una superficie sólida o, de lo contrario, se proporciona en una manera que permite la separación del agente complejador unido al prión de la muestra. El agente complejador forma un complejo, o de algún modo se une preferentemente o exclusivamente, con cualquier forma compacta (generalmente, una forma patógena) de la proteína que aparece en la muestra, de tal modo que se inmoviliza eficazmente cualquier PrPSc nativa que aparezca en la muestra a la superficie sólida una vez que se ha expuesto la muestra al agente complejador inmovilizado.

En una realización, un agente químico como un heteropoliácido (p. ej., PTA) o, preferiblemente, una sal metálica del mismo (NaPTA) se inmoviliza en una superficie sólida cual un filtro de membrana, una perla magnética y similares. La muestra del fluido corporal humano se somete a un agente complejador durante un tiempo suficiente para permitir que sustancialmente toda la PrP^{Sc} nativa en la muestra se compleje con el PTA. Por ejemplo, la muestra se podría incubar entre aproximadamente 30ºC y 45ºC (preferiblemente, 37ºC) durante un periodo de aproximadamente 1 a 16 horas. El agente complejador forma un complejo con la PrP^{Sc} nativa. Lo que es importante es que el complejo formado se pueda separar del resto de la muestra de alguna manera, p. ej., filtración, uso de campo magnético, sedimentación y similares.

El procedimiento de la invención produce una muestra de fluido corporal humano en el que la PrP^{Sc} u otra proteína patógena se retira sustancialmente de la muestra y, preferiblemente, a unos niveles en los que la PrP^{Sc} no se detecta por medios convencionales. Los métodos para retirar la PrP^{Sc} prevendrán la transmisión de las enfermedades mediadas por la PrP^{Sc}, al proporcionar muestras biológicas que están libres de cantidades infecciosas de priones, a saber, "libres de priones".

Agentes complejadores

Los compuestos que son útiles como agentes complejadores en la presente invención incluyen anticuerpos. Estos agentes complejadores se usan de una manera que permite unir y retirar los priones a partir de una solución biológica, mientras que se mantienen intactos los elementos esenciales del material biológico, p. ej., la retención de la morfología celular y de la integridad de la proteína. Tales agentes complejadores se pueden usar con la sangre completa, con componentes de la sangre como el plasma o las plaquetas y con otros fluidos biológicos como será evidente para el experto en la técnica.

Agentes químicos

En una realización de la invención, el compuesto para retirar los priones de un material biológico es un heteropoliácido o una sal del mismo. Los heteropoliácidos son formas total o parcialmente protonadas de oxoaniones que tienen, al menos, un elementos central y, al menos, un elemento coordinador. Los heteropoliácidos pueden tener las estructuras de Keggin o de Dawson.

Una clase particular de heteropoliácidos es la forma protonada de los heteropolimolibdatos. Estos aniones contienen de 2 a 18 átomos de molibdeno hexavalente alrededor de uno o más átomos centrales. Se han identificado aproximadamente 36 elementos diferentes como átomos centrales de estos heteropolimolibdatos. Estos aniones están totalmente oxigenados. Ejemplos de heteropolimolibdatos incluyen [Pmo_{12}O_{40}]^{3}, [As^{2}Mo_{18}O_{62}]^{6} y [TeMo_{6}O_{24}]^{6}, donde los átomos centrales son P^{5+}, As^{5+} y Te^{6+}, respectivamente. Una discusión más detallada de los heteropolimolibdatos se proporciona en la Kirk-Othmer encyclopedia of chemical technology, 3ª ed., 15, 688-689 (1981).

Otra clase de heteropoliácidos, que es análoga a la forma protonada de los heteropolimolibdatos, es la forma protonada de los heteropolivolframatos. En los heteropolivolframatos, el elemento coordinador es el volframio en lugar del molibdeno. La patente de los EEUU n.º 43762919 expone la preparación de varios heteropoliácidos. Los elementos centrales de estos heteropoliácidos se pueden seleccionar del grupo que consiste en P, Si, B, Ge, As, Se, Ti, Zr, Mn, F, V, Ce y Th. Los elementos coordinadores de estos heteropoliácidos incluyen Mo y/o W. Los elementos coordinadores opcionales incluyen V, Mn, Co, Ni, Cu, Zn e Fe. La proporción del número de elementos coordinadores por el número de elementos centrales puede ser de 2,5 a 12, preferiblemente de 9 a 12. Heteropoliácidos particulares, que se ejemplifican en la patente de los EEUU n.º 4376219, incluyen el ácido fosfovolfrámico, el ácido silicovolfrámico, el ácido 10-volfro-2-vanadofosfórico, el ácido 6-volfro-6-molibdofosfórico, el ácido fosfomolíbdico, el ácido silicomolíbdico, el ácido germanovolfrámico, él ácido volfrofluórico y el ácido 18-volfro-2-fosfórico, así como también sales de todos o cualquiera de estos ácidos, p, ej., sales metálicas tales como sales de Na, K, Mg y Ca. Un heteropoliácido particular para usar en la presente invención es el ácido fosfovolfrámico, a saber, H_{3}PW_{12}O_{40} y sus sales metálicas, particularmente, sales de Na. Tales agentes complejadores se unen eficazmente a la PrP^{Sc} nativa.

Tales agentes químicos se pueden usar solos, en combinación, o con otros productos químicos no bioactivos tales como tampones y productos químicos de unión inertes. Los heteropoliácidos de la invención (p. ej., PTA) se usan, preferible aunque no exclusivamente, en forma de sal metálica. La sal metálica incluye sodio, potasio, calcio y similares, pero no se limita a ellos.

La cantidad de heteropoliácido o sal del mismo que se combina con el presente material de soporte debe aparecer en una cantidad suficiente para retirar significativamente la PrP^{Sc} del fluido biológico y, preferiblemente, en una cantidad suficiente para retirar la PrP^{Sc} hasta niveles no detectables o, al menos, a unos niveles no infecciosos. La proporción en peso del heteropoliácido por el material de soporte puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 1:1. El heteropoliácido se puede combinar con el material de soporte de cualquier manera que proporcione una dispersión adecuada del heteropoliácido, por lo que aumenta el área de superficie eficaz del heteropoliácido. Una técnica preferida para combinar estos componentes es por impregnación del material de soporte con el heteropoliácido. El heteropoliácido también se puede combinar con el material de soporte por medio de una técnica de intercambio iónico. La técnica de impregnación puede implicar absorber una disolución acuosa del heteropoliácido en la región porosa del material de soporte seguido de un secado para retirar el agua y dejar el heteropoliácido unido al soporte. Se pueden usar otros métodos de inmovilización de heteropoliácidos o sales de los mismos para inmovilizar estos agentes complejadores, como será evidente para el experto en la técnica, en la lectura de la descripción.

Agentes biológicos

Los anticuerpos útiles que se unen a la PrP^{Sc} y los métodos para fabricar los anticuerpos se describen y explican en la patente de los EEUU n.º 5846533, expedida el 8 de diciembre de 1998. Las porciones de estos anticuerpos que se unen a la PrP^{Sc} se pueden unir a una superficie de soporte y usarse en la presente invención.

El agente complejador de la invención también puede ser un anticuerpo selectivo para los priones. El anticuerpo se puede inmovilizar directamente o unirse a otro componente (p. ej., un metal de gran densidad). El anticuerpo se puede unir a la PrP^{Sc}, p. ej., el anticuerpo descrito en la patente de los EEUU n.º 5846533.

En general, la infección de la encefalopatía espongiforme ovina es incapaz de producir una respuesta inmunitaria, con lo que los organismos hospedadores se hacen tolerantes a la PrP^{Sc} de la misma especie. Los anticuerpos que se unen tanto a la PrPC como la PrP^{Sc} se describen en la patente de los EEUU n.º 5846533. Los expertos en la técnica pueden generar un anticuerpo usando los procedimientos conocidos, p. ej., véanse los métodos para las genotecas de exposición en fagos en la patente de los EEUU n.º 5223409. No obstante, se han producido anticuerpos policlonales anti-PrP en conejos tras la inmunización con grandes cantidades de ShaPrP 27-30 desnaturalizada en SDS. o en ácido fórmico [Bendheim, Barry et al. (1984) Nature 310: 418-421; Bode, Pocchiari et al. (1985) J. Gen. Virol. 66. 2471-2478; Safar, Ceroni et al. (1990) Neurology 40: 513-517]. De forma semejante, se han producido numerosos anticuerpos monoclonales anti-PrP contra la PrP 27-30 en ratones [Barry and Prusiner (1986) J. Infect. Dis. 154: 518-521; Kascsak, Rubenstein et al. (1987) J. Virol. 61: 3688-3693]. Estos anticuerpos se generaron contra la PrP 27-30 desnaturalizada en SDS o en ácido fórmico y eran capaces de reconocer igualmente bien la PrP^{C} nativa y la PrP^{Sc} tratada o desnaturalizada tanto de SHa como de humanos, pero no se unen a la MoPrP. No sorprendió que los epítopos de estos anticuerpos se cartografiaran a regiones de la secuencia que contenía diferencias de aminoácidos entre la SHaPrp y la MoPrP [Rogers, Yehiely et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 3182-3186].

No está del todo claro porqué muchos anticuerpos del tipo descrito en las publicaciones citadas anteriormente se unirán a la PrP^{C} y a la PrP^{Sc} tratada o desnaturalizada pero no a la PrP^{Sc} nativa. Sin estar obligado por una teoría determinada, se cree que esto puede ocurrir porque los epítopos que están expuestos cuando la proteína está en la conformación de PrP^{C} no están expuestos o están parcialmente ocultos en la configuración de PrP^{Sc}, donde la proteína es relativamente insoluble y se pliegan juntas de forma más compacta.

Para propósitos de la invención, una indicación de que no se produce una unión significa que la constante de equilibrio o afinidad K_{a} es de 10^{6} l/mol o menor. Además, se reconocerá que existe unión cuando la K_{a} es de 10^{7} l/mol o mayor, preferiblemente, 10^{8} l/mol o mayor. La afinidad de unión de 10^{7} l/mol o mayor se puede deber a 1) un único anticuerpo monoclonal (a saber, gran cantidad de una clase de anticuerpos) o 2) multitud de anticuerpos monoclonales diferentes (p. ej, un gran número de cada uno de los cinco anticuerpos monoclonales diferentes) o 3) un gran número de anticuerpos policlonales. También es posible usar combinaciones de 1) y 3). Los anticuerpos preferidos seleccionados se unirán al menos 4 veces más ávidamente a las formas de PrP^{Sc} tratadas o desnaturalizadas de la proteína cuando se comparen con su unión a la conformación nativa de PrP^{Sc}. El diferencial de cuatro veces en la afinidad de unión se puede llevar a cabo usando varios anticuerpos distintos como en 1) y 3) anteriormente y como tal, algunos de los anticuerpos en una mezcla podrían tener una diferencia inferior a cuatro veces.

Se puede usar una variedad de métodos diferentes con uno o más anticuerpos diferentes. Los expertos en la técnica reconocerán que los anticuerpos pueden estar marcados con marcadores conocidos y usarse con la robótica, análisis de intercalación, detectores electrónicos, citometría de flujo y similares disponibles hoy en día. Además, los anticuerpos se pueden unir a componentes más densos directamente o a través de otros intermediarios como los anti-anticuerpos.

Métodos de purificación

El agente complejador de la invención se puede usar en una variedad de procedimientos de purificación para retirar eficazmente los priones de un material biológico. A continuación, se resumen una serie de métodos que se usan en la presente invención.

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad (CA) depende de la interacción de la proteína con un ligando inmovilizado. La CA se basa, en parte, en la interacción de ligandos unidos a los soportes cromatográficos. Un ligando hidrófobo acoplado a una matriz se menciona de diversas formas en la presente invención como "soporte de la CA", "gel de la CA" o "columna de CA". Además, se apreciará que la fuerza de interacción entre la proteína y el soporte de la CA no es sólo una función de la proporción entre superficies no polares y polares de la proteína sino también de la distribución de las superficies no polares.

Se puede emplear una cantidad de matrices en la preparación de columnas de CA. Preferiblemente, tales matrices son perlas y, más preferiblemente, perlas esféricas, que sirven como una superficie de soporte del agente complejador de la invención. Los materiales sugeridos para las matrices incluyen agarosa, dextrano entrecruzado, polihidroxil-etil-metacrilato, poliacrilamida, celulosa y derivados o combinaciones de los mismos, preferiblemente en forma de esferas porosas. Anteriormente, el acetato de celulosa se ha usado con éxito en dispositivos de purificación de fluidos biológicos, p. ej., dispositivos externos de purificación de sangre. El poliuretano es particularmente compatible con la sangre. El sílice y sus derivados también son especialmente útiles como material de soporte para usarse con heteropoliácidos. Véanse las patentes de los EEUU n.º 5475178 y 5366945.

El material preferido para usarse en los métodos de la presente invención es la agarosa, un polímero hidrófilo que se produce de forma natural. Se forma un gel de perlas con una porosidad del 90% al 96% al variar el porcentaje de la agarosa. La masa molecular del gel va de 0,5 millones para la agarosa al 10% a 20 millones para la agarosa al 4%. Los diámetros de partículas que van de 20 a 200 micrómetros están disponibles comercialmente. La fuerza mecánica de las perlas de agarosa se puede aumentar tanto incrementando el porcentaje de agarosa como entrecruzando las perlas con epiclorohidrina o 2,3 dibromopropanol, usando el método de J. Porath et al en J. Chromat 60, 167 (1971). Esto permite un aumento correspondiente en la presión máxima operativa (un aumento del 50% en la agarosa conduce a un aumento de dos a cuatro veces en la presión máxima operativa).

Los criterios para determinar el método de acoplamiento apropiado son: minimización de la pérdida del agente complejador desde el soporte, mantenimiento de la estabilidad térmica del compuesto y la retención de la cantidad óptima del agente complejador. La técnica tampoco debe causar un deterioro en el material de soporte o en la producción de grupos reactivos sobre el soporte, que unirían los componentes sanguíneos in vivo. El agente complejador también debe conservar su actividad con el tiempo.

Otros factores que se deben considerar al optimizar el método de acoplamiento para la cromatografía de afinidad son: el grado de la distribución del agente acoplador dentro de las partículas y/o las columnas; pH; temperatura; la velocidad de flujo de la muestra biológica a través de la columna; el tamaño del agente complejador unido; y/o el diámetro y el tamaño de poro del soporte en cuestión. Cada una de estas condiciones se puede optimizar para un procedimiento, muestra biológica y agente complejador determinados, como será evidente para el experto en la técnica.

La composición de la CA de la presente invención puede estar dentro de un cartucho de filtración para usar fácilmente la composición en un procedimiento de purificación del fluido biológico. Cuando la composición de la columna está dentro de un único cartucho, se puede reemplazar fácil y convenientemente cuando se agota la capacidad de purificación de la composición. Alternativamente, el cartucho puede ser una parte integral de un dispositivo de purificación, en cuyo caso, todo el dispositivo se reemplaza una vez que la composición de filtración ha agotado su eficacia. Las partículas del soporte con el agente complejador se colocan dentro del cartucho y, luego, se hace circular por el cartucho la disolución que se va a hacer reaccionar con el agente complejador. Las unidades comercialmente disponibles de diálisis, intercambio de sangre u oxigenación se pueden adaptar para usarlas como el dispositivo de purificación.

Métodos de filtración

Otro método que se puede usar para retirar priones de una muestra biológica implica la filtración a través de una membrana. La membrana puede tener el agente complejador de priones conjugado directamente a la membrana, bien en el lado por el que pasará el fluido biológico o, más preferiblemente, en el lado opuesto al que pasará el fluido biológico. Alternativamente, el agente complejador puede estar compartimentado en un área detrás de la membrana que es inaccesible a los componentes más grandes de los materiales biológicos, p. ej., células de la sangre. En el éste último ejemplo, el agente complejador puede unirse a una matriz insoluble detrás de la membrana. La membrana a usar en la presente invención puede estar en forma plana, en forma de una o más fibras huecas y/o en forma de láminas planas. Véase la patente de los EEUU n.º 4361484.

Los materiales adecuados para la membrana incluyen celulosa regenerada, acetato de celulosa, copolímero acrílico sin entretejer, polisulfona, sulfona de poliéter, poliacrilonitrilo, poliamida y similares. El material biológicamente activo se inmoviliza en los poros y/o sobre la superficie del lado de la membrana que mira al lado opuesto al que está el fluido biológico. Así, se evita que los componentes tales como los corpúsculos de sangre entren en contacto con el material activo. Normalmente, los poros de la membrana son de una magnitud del orden de 0,01 a 0,8 micrómetros, preferiblemente 0,15 a 0,45 micrómetros. El soporte de polímero debe ser estable en las condiciones de su uso planificado, a saber, no se debe degradar química o enzimáticamente por la sangre, el soporte y el agente complejador inmovilizado deben ser compatibles con la sangre, y el soporte debe tener unas buenas características de flujo y una baja compresibilidad a los caudales clínicos en el margen de 150 a 250 ml/min.

Por medio de la construcción anterior de la membrana microporosa, a saber, inmovilizar asimétricamente el agente complejador de priones, no hace falta exponer el fluido biológico a cualquier filtración posterior para retirar los posibles restos perjudiciales que permanezcan. De tal modo, tanto la separación como la retirada de las sustancias se pueden realizar en una misma etapa.

La membrana microporosa semipermeable puede estar en forma de fibras individuales que están en haces y encapsuladas dentro de una misma envoltura, con una entrada y salida para el fluido biológico. Los extremos de las fibras están fijados por medio de un aglutinante adecuado para mantener las fibras individuales esencialmente paralelas dentro de la envoltura. Un extremo de las fibras o haces de fibras se proporciona en comunicación con la entrada, mientras que el extremo opuesto se proporciona en comunicación con la salida.

El material biológico se bombea en la envoltura a través de la entrada y a través del hueco longitudinal de las fibras y fuera de la envoltura a través de la espita de salida. Durante el paso por la envoltura, el fluido se expone a variaciones de presión, de manera que sólo una parte de la fracción penetrante fluye en una ruta alternativa a través de las paredes de fibra en cada dirección para entrar en contacto con el material complejador de los priones. Los medios para realizar las variaciones de presión de nuevo se pueden hacer de una cámara de expansión en comunicación con el espacio entre las fibras individuales y los haces de fibras, respectivamente. No se necesita ninguna filtración subsecuente del material biológico para retirar posibles restos perjudiciales, ya que el filtrado se logra automáticamente por medio del paso del fluido a través de las paredes de fibra.

Las variaciones de presión pueden variar de -200 a +200 mmHg, preferiblemente de -100 a + 100 mmHg. Cuanto mayor sea la distancia de difusión de la sangre, por ejemplo, si el agente complejador del prión está unido a una matriz insoluble detrás de la membrana, se requieren unas mayores variaciones de compensación en la presión para lograr el efecto de separación deseado. De un modo correspondiente, la frecuencia de las variaciones de presión puede variar aproximadamente desde 0,05 hasta aproximadamente 10 Hz, preferiblemente de 0,5 a 1 Hz. Tras el paso por la unidad de tratamiento, el material biológico, p. ej., toda la sangre, se puede volver a introducir en el paciente directamente, o se puede almacenar para un uso futuro. La sangre tratada se puede almacenar entera o se puede almacenar en sus varios componentes, p. ej., plasma, plaquetas, eritrocitos, etc. Alternativamente, la sangre se puede separar en sus componentes antes de retirar los priones.

Cuando el agente complejador es un anticuerpo, a menudo, es deseable disponer de medios para formar un segmento espaciador molecular para espaciar el anticuerpo de la pared de lado poroso externo de la membrana de fibra hueca. Se prefiere esta distribución general cuando la masa molecular del antígeno es grande, p. ej., 100000 Da o una masa molecular mayor. Por ejemplo, un grupo metileno de seis u ocho carbonos es un espaciador o "mango" adecuado entre el anticuerpo y la superficie de la membrana. Cuando un antígeno se absorbe rápidamente por la albúmina o reacciona químicamente con más rapidez con albúmina que con el material de la superficie de la membrana de filtración, la molécula espaciadora puede ser una proteína, tal como una albúmina. La superficie externa de una membrana se puede considerar un material relativamente poroso en comparación con el de la superficie interior, que normalmente es la superficie de filtro eficaz de una membrana de ultrafiltración del tipo asimétrico, normalmente llamada anisotrópica. Así, por ejemplo, el lado poroso exterior de una membrana se puede tratar con una disolución salina de albúmina humana al 17%. La albúmina recubrirá las superficies dentro de la zona porosa de la estructura de la membrana (a saber, la zona que subyace a la capa de barrera de la membrana) y, subsecuentemente, se puede depositar una disolución de proteína (p. ej., un anticuerpo de PrP^{Sc}) sobre la albúmina. A menudo, es deseable entrecruzar un poco la proteína (como con una disolución de glutaraldehido diluido u otro agente inductor de entrecruzamiento suave semejante); esto ayuda a sujetar en su sitio el material sobre la superficie de la membrana.

Un enfoque para preparar un cartucho que sea capaz de retirar factores patógenos de la sangre es un sistema de circulación extracorpóreo con membranas de fibra que tengan suficiente permeabilidad para que se pueda retirar el factor patógeno de la sangre a través de la membrana y sobre un anticuerpo soluble e inmovilizado secuestrado en el espacio exterior de las fibras. Esto implica la formación de un conjugado polimérico de gran masa molecular entre el anticuerpo de la PrP^{Sc} y la PrP^{Sc} que no puede cruzar el lado de filtración de la membrana hacia el resto de la muestra biológica, a saber, donde se mantienen las células.

Para formar un agente complejador inmovilizado y soluble, se puede aumentar la masa molecular del agente complejador inmunorreactivo a un tamaño tal que no difunda de la porción porosa exterior de la fibra hacia la sangre a purificar. Esto se puede conseguir haciendo reaccionar químicamente el agente complejador con una sustancia de elevada masa molecular, soluble en agua, como gel de sílice o dextrano o polimerizando el agente complejador inmunorreactivo. El uso de tales anticuerpos que llevan macromoléculas es ventajoso para la elevada tasa de absorción del antígeno debido a un aumento de la tasa de los efectos de polarización en la transferencia de masa y en la cinética de unión.

Alternativamente, la membrana puede estar compuesta de dos mitades de membrana que, generalmente, son idénticas mecánicamente una a otra pero que se pueden construir químicamente de material diferente. En este caso, es suficiente si sólo la mitad de la membrana que mira hacia el otro lado del material biológico es capaz de unirse al agente complejador de los priones. Por ejemplo, las mitades de la membrana se pueden proporcionar en una relación contigua una a otra, en las que el agente complejador de PrP^{Sc} se une preferiblemente en los poros y en ambas superficies de la mitad de la membrana que está en el lado opuesto al material biológico.

El agente complejador (p. ej., NaPTA o anticuerpos anti-PrP^{Sc}) también se puede inmovilizar en la membrana, de manera que la superficie que mira hacía el material biológico esté libre del reactivo de contacto. Con esto se evita el contacto entre los corpúsculos de la sangre y el reactivo y, por lo tanto, las reacciones pirógenas y/o anafilácticas. Así es una forma de inmovilización simétrica, donde en una superficie de la membrana (como también en los poros) se inmoviliza el agente complejador de los priones. La ventaja de inmovilizar dentro de los poros de la membrana es que la superficie microscópica activa puede ser numerosa (> 1000) en comparación a la superficie macroscópica. Como el agente complejador se inmoviliza en la parte de la membrana del lado opuesto al material biológico, el material biológico no entrará en contacto con la sustancia. Consecuentemente, por lo tanto, no es necesario ninguna filtración del material biológico posterior aparte.

Alternativamente, el agente complejador de los priones puede estar unido a una matriz insoluble detrás de la membrana. Con todo, el procedimiento de tratamiento es similar, pero como la distancia de difusión necesaria es aproximadamente 10 veces mayor, puede ser necesario ajustar un flujo algo más real a través de la membrana.

Independientemente de si el agente complejador de los priones está inmovilizado en los poros o inmovilizado a una matriz insoluble detrás de la membrana, el procedimiento de inmovilización se realiza, preferiblemente, de manera que el complejo de priones y el agente complejador permanezcan unidos e inmovilizados, a saber, no aparece en la sangre tras la técnica de purificación. Generalmente, el enlace covalente es la inmovilización más segura. La naturaleza del enlace covalente usado depende del material de membrana escogido y de la naturaleza del agente complejador.

Partículas magnéticas

Los priones también se pueden retirar de materiales biológicos usando partículas magnéticas que comprendan el agente complejador de priones. El principal componente de las partículas magnéticas de la presente invención es un núcleo magnético. El núcleo consiste en partículas de óxido de hierro u otros materiales magnéticos. El agente de unión a la PrP^{Sc} de la invención se puede incorporar directamente en el núcleo magnético o incorporarse indirectamente en el núcleo magnético, p. ej., por medio del uso de un material fibroso y un agente de unión. El material fibroso puede comprender un polímero orgánico en forma de fibras, tal como polímeros de glúcidos, formaldehído de urea o polinonametilen-urea y, particularmente, fibras de celulosa. El agente de unión es un material que se introduce entre el núcleo magnético y las hebras de fibra como un líquido, o en disolución, y se solidifica durante el procedimiento de producción de congelación, polimerización o evaporación de un disolvente. Ejemplos de agentes de unión adecuados son agar, gelatina, una resina de epoxi o alcohol furfurílico de formaldehido de urea.

Las micropartículas magnéticas útiles en el presente método pueden tener diversas formas, que pueden ser regulares o irregulares; preferiblemente, la forma maximiza las áreas de superficie de las micropartículas. Las micropartículas magnéticas deben tener tal tamaño que su separación de la disolución, por ejemplo, por filtración o separación magnética, no sea difícil. Además, las micropartículas magnéticas no deben ser tan grandes que el área de la superficie se minimice o que no sean adecuadas en las operaciones a microescala. Los tamaños adecuados van de un diámetro medio de aproximadamente 0,1 \mum a un diámetro medio de aproximadamente 100 \mum. Un tamaño preferido es de un diámetro medio de aproximadamente 1,0 \mum. Las micropartículas magnéticas adecuadas están disponibles comercialmente en PerSeptive Diagnostics y se denominan BioMag COOH (número de catálogo 8-4125).

Las partículas magnéticas recubiertas de la presente invención se pueden producir agitando o mezclando las partículas del núcleo en una suspensión que comprenda un material fibroso, un agente complejador de priones y un agente de unión. Las fibras unidas a las partículas del núcleo y el agente de unión llenan los intersticios. Luego, el agente de unión se solidifica por uno de los medios que se expusieron anteriormente, de manera que el agente complejador de priones esté accesible en la superficie exterior. Un ejemplo de tal sistema que use partículas del núcleo de óxido de hierro, el material fibroso de fibras de celulosa y agar como el agente de unión se describe en la patente de los EEUU n.º 5705628.

La presente invención también incluye dentro de su alcance una resina magnética compuesta que comprende partículas magnéticas incluidas en una matriz de polímero orgánico que bien contiene, o bien tiene anexados a ella, sitios que son selectivos de priones.

Así, el compuesto puede comprender partículas magnéticas incluidas en una resina polimérica que contiene sitios activos o productos químicos pensados para absorber selectivamente priones. Por ejemplo, la resina polimérica tiene pequeñas partículas de absorbentes específicos unidos a ella. Los absorbentes selectivos pueden ser, por ejemplo, una sal metálica de ácido fosfovolfrámico.

Las partículas magnéticas del compuesto de la presente invención se pueden usar en un método para retirar priones de cualquier muestra biológica que se pueda hacer fluir. La retirada de priones del producto humano se realiza poniendo en contacto la disolución a tratar con partículas de una resina magnética mixta con un agente complejador inmovilizado y separando, por filtración magnética, las partículas de resina magnética mixtas de la disolución. Estas partículas magnéticas se pueden usar una vez y desecharlas, o reciclarlas para usarlas en la purificación de otros productos de la sangre. Las partículas se pueden reciclar sometiendo las partículas de resina magnética mixtas separadas a regeneración mediante una disolución de regeneración adecuada y separando de la disolución de regeneración las partículas de resina magnética del compuesto regeneradas.

Luego, las partículas de resina magnética mixtas con priones unidos se retiran selectivamente de la disolución con filtración magnética que usa técnicas que se conocen en la técnica. A continuación, las partículas de resina magnética mixtas se recuperan del filtro y se retiran los priones de ella mediante una disolución de regeneración adecuada, por ejemplo una disolución ácida. Luego, las partículas de resina magnética mixta limpias se recuperan de la disolución de regeneración por filtración magnética y las partículas limpias se reciclan para un uso adicional.

La purificación del material biológico de un paciente puede ser por medio de una unidad de tratamiento extracorpóreo y, tras el tratamiento, el fluido purificado se puede almacenar o volver a introducir en el paciente. El material biológico se bombea desde, por ejemplo, un paciente hacia una unidad de tratamiento que comprende una membrana semipermeable microporosa que tiene poros de 0,01 a 0,8 \mum, preferiblemente 0,15 a 0,45 \mum. Durante el paso a través de la unidad de tratamiento, el material biológico se expone a variaciones de presión (por ejemplo, de -200 a +200 mmHg, preferiblemente de -100 a +100 mmHg), por lo cual, se hace fluir una fracción penetrante del material biológico, p. ej., el plasma, por una ruta alternativa a través de la pared de la membrana en cada dirección para entrar en contacto con el agente complejador.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los normalmente expertos en la técnica una descripción completa y una explicación de cómo realizar y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni ellos pretenden representar que los experimentos de más abajo son todos o los únicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión en relación con los números usados (p. ej., cantidades, temperatura, etc.) pero se puede dar cuenta de algunos errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique de otra manera, "partes" son partes de peso, "masa molecular" es masa molecular promedio de peso, la temperatura está en grados Celsius y "presión" es la atmosférica o cercana a
ella.

Ejemplo 1

Se usan perlas esféricas compuestas de un derivado de silicato en un aparato metálico cilíndrico de cromatografía. Se preparan las perlas para la cromatografía de afinidad por impregnación de las perlas con PTA antes de colocarlas dentro del aparato en el que se alojará la cromatografía. Se impregnaron perlas de aproximadamente 5 mm con una carga del 25% en peso de H_{3}PW_{12}O_{40} con el método de humedad incipiente. Las perlas recubiertas se secan al horno al vacío para retirar el agua sobrante. Finalmente, estas perlas recubiertas se calcinan a 350ºC durante 1 hora en nitrógeno y 4 horas en aire.

Las perlas esféricas recubiertas se enfrían a aproximadamente 37ºC, se colocan en el aparato de columna de cromatografía y se equilibran con fosfato sódico 20 nM a pH 7. Se añade una preparación de plasma humano a la mezcla, la cual se deja fluir por la columna a una velocidad suficiente para unir los priones al PTA inmovilizado. Luego, se prueba la presencia de priones en una alícuota del plasma purificado mediante análisis de inmunotransferencia.

Ejemplo 2

Se fabrica como se describe en la patente de los EEUU n.º 4361484 una membrana de nilón sustituida con aminas . El anticuerpo selectivo de los priones se liga a la membrana sustituida con aminas para su uso en la filtración. La porción IgG de la molécula \alpha-PrP^{Sc} se inmoviliza en la membrana mediante glutardialdehído. La membrana se trata con una disolución de glutardialdehído al 2,5% en un tampón fosfato a 0,1 M con un pH = 6,8, se enjuaga con agua destilada y se seca. Una disolución que contiene \alpha-PrP^{Sc} se disuelve en un tampón fosfato a 0,1 mM (pH = 6,0, 4ºC) y la disolución se incuba con la membrana tratada. Se deja ligar el anticuerpo con la membrana durante 15 horas a 4ºC. Tras la incubación, se enjuaga la membrana en agua destilada y se recoge la \alpha-PrP^{Sc}sin unir con el primer agua de enjuague para usarla luego.

Luego, la membrana con la \alpha-PrP^{Sc} unida se usa en un aparato de hemofiltración para retirar la proteína PrP^{Sc} de la sangre humana. El filtro unido a la \alpha-PrP^{Sc} se coloca en un dispositivo de hemofiltración, tal como el que se describe en las patentes de EEUU n.º 5858238, 5855782 y 5851394.

Ejemplo 3

Un método para purificar sangre de animal vivo implica pasar la sangre por un dispositivo de desviación extracorpóreo. Un dispositivo de desviación para este propósito se construye con fibras huecas de celulosa que tienen un ID de 200 u y un grosor de la pared interior de 30 micrómetros. El cartucho formado tienen un área total de superficie interior del tubo de 0,6 m^{2}.

Las fibras huecas se perfusionan con una disolución de un anticuerpo anti-PrP^{Sc} en una solución salina tamponada con borato para mantener el pH a 8,5. Tras tres horas de recirculación, el cartucho se lava extensivamente con una solución salina. Se analiza el anticuerpo anti-PrP^{Sc} en la disolución mediante la técnica de inmunodifusión, conocida en la técnica, antes y después de la etapa de recirculación para evaluar el grado de toma del anticuerpo por la pared de la fibra. Posteriormente, el cartucho se seca en una corriente de nitrógeno, se coloca en una bolsa de plástico y se sella.

Un cartucho que contiene 1000 fibras huecas asimétricas que tiene un tamaño de poro de valor discriminatorio en la masa molecular de 500000 Da y un diámetro interior de 150 a 200 \mum se lava bombeando una disolución salina a través de las paredes de fibra desde el exterior en el modo de ultrafiltración "invertido". Después, una disolución de albúmina al 1% en suero humano se bombea a través de la pared de fibra del mismo modo para depositar una capa monomolecular de albúmina en la superficie porosa del lado externo de la membrana tubular. Después, la disolución del anticuerpo anti-PrP^{Sc} se filtra por las paredes de las fibras huecas en la dirección "inversa" para permitir que los anticuerpos se unan directamente en el lado externo de la membrana o muy cerca de la membrana en la región exterior. Se analiza la actividad del anticuerpo anti-PrP^{Sc}en la disolución antes de la filtración y la del filtrado que abandona el lumen. El equilibrio da la cantidad de actividad inmunológica depositada en el cartucho. Después de lavar abundantemente el espacio del lumen de la fibra hueca con estreptomicina y una disolución salina, el cartucho se coloca en una bolsa de plástico y se sella. Los cartuchos preparados así se usan en derivaciones extracorpóreas.

Ejemplo 4

Se recubren perlas de poliestireno super-paramagnético que contienen magnetita (diámetro medio de 8,8 \mum, 67% de contenido magnético , Sigma Chemical Co.) durante una noche a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal contra la PrP^{Sc} nativa. Las perlas resultantes recubiertas con el anticuerpo se colocan en un aparato que comprende un contenedor tal como un cuerpo de jeringuilla que contiene una matriz de soporte rodeada de una bobina de alambre de cobre enrollada helicoidalmente, que se conecta a un suministro adecuado de corriente eléctrica alterna a través de interruptores adecuados.

A las perlas se les añadió una muestra de 10 ml de sangre bovina que contenía proteínas priónicas y se incubaron durante 10 minutos (en presencia del campo magnético aplicado). Se aplicó un campo de C/A (50 Hz, 50 voltios) a la bobina para generar un campo magnético y las perlas magnéticas se aislaron de la sangre. Se comprobó la presencia de priones en las perlas complejadas mediante técnicas de tinción con inmunofluorescencia usando un conjugado FITC fluorescente anti-PrP (Bradsure Biochemicals Ltd.). Los complejos de priones detectables usando el procedimiento indicaron, claramente, que se había logrado la captura específica de los priones.

Claims (8)

1. Un método para retirar priones de un fluido corporal humano, que comprende las etapas de:

poner en contacto un fluido corporal humano en un estado líquido fluible con un sustrato sólido que comprende un agente complejador de priones que se une a la PrP^{Sc} nativa; y

permitir que el fluido corporal humano permanezca en contacto con el sustrato durante un tiempo tal que los priones en el fluido corporal humano se unen al sustrato;

en el que el agente complejador se selecciona del grupo que consiste en un heteropoliácido o sal del mismo, una sal metálica de ácido fosfovolfrámico y un anticuerpo.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el agente complejador es un anticuerpo y el anticuerpo se une selectivamente a la PrP^{Sc}.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el fluido corporal humano comprende sangre humana.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el sustrato está en forma de perlas esféricas que comprenden un metal ferromagnético que tiene un polímero que lo recubre y en el que el agente complejador es una sal metálica de ácido fosfovolfrámico.

5. El método de la reivindicación 4, que además comprende:

retirar el sustrato del contacto con el fluido corporal humano aplicando una energía magnética.

6. Un dispositivo para retirar los priones de una muestra, que comprende:

un polímero insoluble en agua recubriendo un metal ferromagnético; y

un agente complejador de priones recubriendo una superficie del polímero, en el que el agente complejador es una sal metálica de ácido fosfovolfrámico que se une a la PrP^{Sc} nativa.

7. Un dispositivo de flujo para retirar los priones de una muestra líquida, que comprende:

un alojamiento a través del cual fluye una muestra líquida; y

superficies de sustrato que comprenden un agente complejador de priones que es una sal metálica de ácido fosfovolfrámico y que se une a la PrP^{Sc} nativa.

8. El dispositivo de la reivindicación 7, en el que el alojamiento es cilíndrico y el sustrato son perlas de polímero que tienen la sal metálica del ácido fosfovolfrámico recubriendo su superficie.