DE102004040119A1

DE102004040119A1 - Mittel zur Therapie und Prävention von Prionenerkrankungen

Info

Publication number: DE102004040119A1
Application number: DE102004040119A
Authority: DE
Inventors: Carsten Dr. Korth
Original assignee: DUESSELDORF H HEINE, University of; Heinrich Heine Universitaet Duesseldof
Current assignee: DUESSELDORF H HEINE, University of; Heinrich Heine Universitaet Duesseldof
Priority date: 2004-08-18
Filing date: 2004-08-18
Publication date: 2006-04-27

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Nanopartikeln, Derivaten oder physiologisch verträglichen Salzen davon zur Inaktivierung von Prionen, insbesondere zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Prionenerkrankungen.

Description

Die Erfindung betrifft die Therapie und die Prävention von Prionenerkrankungen. Des weiteren werden Mittel zur Inaktivierung von Prionen bereitgestellt.
Unter dem Begriff "Prionenerkrankungen" oder transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE) werden eine Reihe von übertragbaren, neurodegenerative Erkrankungen zusammengefaßt, von denen die Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung (CJD) beim Menschen oder Scrapie sowie BSE (Bovine Spongiforme Enzephalopathie) bei Tieren besonders bekannt sind. Das infektiöse Agens – das Prion – besteht aus einer fehlgefalteten Form (PrP^Sc) eines normalen Zellmembranproteins, des Prionproteins PrP^c. Die fehlgefaltete Form vermag durch noch nicht aufgeklärte molekulare Mechanismen die normale Form in die fehlgefaltete umzufalten und so neurotoxisches prp^Sc zu vermehren. Es gibt keine Therapie für Prionenerkrankungen, so dass es nach einem kurzen Krankheitsverlauf unweigerlich zum Tod kommt.
Beim Menschen werden sporadische, genetische (familiäre) oder infektiöse Formen von CJD unterschieden. Die häufigste Form der menschlichen Prionenerkrankung ist die sporadische CJD. Sie entsteht wahrscheinlich durch eine spontane Umfaltung des normalen Form PrP^c in die fehlgefaltete Form prp^Sc oder durch eine somatische Mutation, die die spontane Umfaltung in die fehlgefaltete Form begünstigt. Durch die fehlgefaltete Form wird anschließend im Körper eine langsam verlaufende Kettenreaktion ausgelöst, bei der immer mehr PrP^c in prp^Sc umgefaltet wird.
Der genaue Mechanismus der Übertragung von Prionen von Mensch zu Mensch oder Tier zu Mensch ist noch nicht aufgeklärt. Es ist jedoch bekannt, dass sich Prionen effizient über einen direkten Kontakt zum Zentralnervensystem verbreiten. Bei oraler Applikation des infektiösen Materials muss im Vergleich dazu die infektiöse Dosis 109 mal so gross sein, um die gleiche Wirkung zu erzielen.
Hirngewebe von Patienten mit sporadischer oder genetischer Creutzfeld-Jakob-Erkrankung ist daher infektiös. Mittlerweile weiß man jedoch, dass eine infektiöse Übertragungen auch durch die Aufnahme BSE-verseuchter Nahrungsmittel verursacht werden kann. Diese Infektion wird mit einer neuen Form der CJD, der varianten CJD, verbunden. Andere Übertragungen menschlicher Prionen auf Menschen wurden bei Dura- oder Corneatransplantationen, bei Infusionen von aus kontaminierten Hypophysen gewonnenem Wachtumshormon oder bei der Verwendung kontaminierter Elektroden beobachtet.
Die Übertragung von CJD über andere chirurgisch-invasive Eingriffe wie Bluttransfusionen ist unklar. Für einen solchen Übertragungsweg sprechen Einzelbefunde und Ergebnisse aus Mausexperimenten. Bislang konnte jedoch keine Regelmäßigkeit abgeleitet werden. In der Praxis ist allerdings zur Risikovermeidung eine zuverlässige Dekontamination (Desinfektion) potentiell infektiöser Instrumente notwendig.
Der Infektionsweg über das Zentralnervensystem wird experimentell ausgenutzt, wenn in einem Prionen-Infektiositäts-Bioassay Prion-infiziertes Gewebe direkt in ein Maushirn eingebracht wird.
Aufgrund der physikalischen Einzigartigkeit des Krankheitserregers muss die Dekontamination von Prionen auf besondere Art erfolgen: herkömmliche Erregerdekontamination – wie sie etwa für Bakterien oder Viren verwendet wird (z.B. Formalindämpfe, 120 Grad, 20 Minuten) – reichen nicht aus. Erst ein vierstündiges Autoklavieren bei 134 °C (3 bar) oder eine Dekontamination in 1 N Natronlauge inaktiviert Prionen zuverlässig.
Die unklaren Übertragungsmechanismen der Prionen, die die Möglichkeit offenlassen, dass eine Ansteckung durch kontaminierte, ausgetauschte biologische Materialien oder Instrumente erfolgen kann, machen eine effiziente Prävention notwendig. Die einzig bisher bekannten wirkungsvollen Inaktivierungen mittels 3 bar-Autoklavierung oder Behandlung mit 1 N Natronlauge sind jedoch für viele Instrumente schädigend und deshalb nicht praktikabel.

In der Vergangenheit wurde daher an der Entwicklung alternativer Konzepte der Prionen-Inaktivierung gearbeitet. Aus der internationalen Offenlegungsschrift WO 03/077835 A2 ist es beispielweise bekannt, für die Inaktivierung von Prionen eine Formulierung aus einem "aktiven Agens" und einem pH-Wert einzusetzen, der außerhalb des physiologischen Bereichs liegt. Als einsetzbares aktives Agens wird u.a. Alkylsulfat beansprucht oder Salze davon.

Die deutsche Offenlegungsschrift DE 102 48 276 A1 schlägt vor, eine Kombination eines anionaktiven Tensids und einer oder mehrerer Säuren einzusetzen. Beide Komponenten wirken bei der Prionen-Inaktivierung synergistisch, da jeweils eine Komponente allein – also entweder nur die Applikation von Säuren oder nur der Tenside – in ihrer Wirkung mangelhaft sind.

Des weiteren ist keine wirksame Pharmakotherapie der Prionenerkrankung bekannt, selbst wenn in letzter Zeit einige vielversprechende Medikamente entdeckt worden sind. Ein Problem bei der Therapie letztlich aller neurodegenerativen Erkrankungen ist, dass betroffene Patienten erst zum Zeitpunkt bestehender Symptome einen Arzt aufsuchen. Zu diesem Zeitpunkt besteht jedoch schon eine struktureller Schaden im Zentralnervensystem, der nach heutigem Kenntnisstand irreversibel ist. Eine wirksame Therapie von Prionenerkrankungen muss also einer hochsensitiven Diagnostik folgen, die schon bei asymptomatischen Individuen beginnt.

Es liegt somit der vorliegenden Erfindung vor allem die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Therapie und Diagnose von Prionenerkrankungen bereitzustellen. Ebenso soll ein Verfahren zur Inaktivierung von Prionen vorgeschlagen werden, das insbesondere auch zur Desinfektion bzw. Dekontamination von medizinisch eingesetzten Instrumenten und Geräten geeignet ist.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von Nanopartikeln. Bei Nanopartikeln im Sinne der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Atom- oder Molekülverbindungen mit einer durchschnittliche Größe im Nanometer-Bereich. Diese Nanopartikel weisen vorzugsweise eine Oberflächenladung auf. Sie können jedoch auch neutral sein. Dann sind sie jedoch vorzugsweise polar, oder aber doch wenigstens gut polarisierbar. Vorzugsweise bestehen die Nanopartikel aus miteinander chemisch gebundenen Atomen, die über kovalente oder elektrovalente (elektrostatische) Bindungen oder durch koordinative Bindungen (Komplexverbindung) miteinander verbunden sind.

Dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt dabei im Kern der Gedanke zugrunde, durch die Einwirkung der Nanopartikel die Konformation der fehlgefalteten Prionproteine so zu ändern, dass sie eine Fehlfaltung der gesunden ("normalen") Prionproteine nicht mehr initiieren können. Dies kann z.B. durch die Denaturierung der Prionen erfolgen. Damit verlieren die Prionen ihre Infektiösität. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht so eine Inaktivierung der zuvor infektiösen Prionen. Dieses Prinzip liegt sowohl der therapeutischen als auch der Desinfektions- oder Dekontaminationswirkung der erfindungsgemäßen Verwendung zugrunde.

Es hat sich überraschender Weise gezeigt, dass für die erfindungsgemäße Wirkung der einsetzbaren Nanopartikel keine Absenkung oder Erhöhung des pH-Werts der umgebenden Lösung auf einen Wert außerhalb des physiologischen Bereichs (pH > 5 und < 9) erforderlich ist. Dies hat den unmittelbaren Vorteil, dass mit diesem Konzept nicht nur die Behandlung von Oberflächen von Geräten und Instrumenten zu Zwecken der Desinfektion weitgehend schonend möglich ist, sondern auch die Behandlung infizierter Patienten (Menschen oder Tieren) machbar wird. Ebenso können Diagnoseverfahren etabliert werden unter Verwendung lebender Zell- oder Gewebekulturen.

Die erfindungsgemäß bevorzugten Nanopartikel weisen unter den jeweiligen Bedingungen ihres Einsatzes (z.B. in der Desinfektionslösung oder unter physiologischen Bedingungen des Patienten-Körpers) eine Oberflächenladung auf oder aber sind polar bzw. polarisierbar. Die Gesamtladung kann dabei negativ oder positiv sein. Es wird vermutet, dass die erfindungsgemäße Wirkung darauf beruht, dass das Nanopartikel aufgrund seiner geeigneten Größe und seiner Ladungsstruktur bzw. Verteilung (Polarität) an das Prion bindet und damit eine sterische Änderung der Proteinstruktur bewirkt (Konformationsänderung).

Die erfindungsgemäß bezweckte Wechselwirkung zwischen dem Nanopartikel und dem Prion hat daher im wesentlichen zwei Voraussetzungen; nämlich einerseits eine ausreichend geringe Größe des Nanopartikels und andererseits eine ausreichend hohe Polarität (bzw. Polarisierbarkeit) oder Ladung des Nanopartikels. Die Begriffe Polarität und Polarisierbarkeit werden nachfolgend mit von dem Begriff "Ladung" erfasst.

Die effektive Ladung des Nanopartikels für die Wechselwirkung mit dem Prion ist nicht nur durch den pH-Wert der Umgebungslösung, sondern u. a. auch von der Ionenstärke der Lösung beeinflußbar. So werden mit zunehmender Ionenstärke der Umgebungslösung mehr Einzelladungen auf der Oberfläche des Nanopartikels "abgesättigt" kompensiert, so dass die Interaktionsmöglichkeiten des Nanopartikels mit dem Prion abnehmen können. Unter Umständen kann jedoch ein Nanopartikel selbst bei einer suboptimalen Ionenstärke noch die erfindungsgemäße Wirkung zeigen; dann nämlich, wenn er aufgrund seiner übrigen Eigenschaften (vornehmlich seiner jeweili gen Größe) effizient die strukturelle Stabilität des Prions beeinträchtigen kann. Ebenso kann ein Nanopartikel einer nicht optimalen Größe gleichwohl Prionen inaktivierend sein, sofern die Umgebung z.B. eine ausreichend geringe Ionenstärke aufweist, so dass der Nanopartikel eine hohe Oberflächenladung zeigt.

Vorteilhafterweise haben die erfindungsgemäß einsetzbaren Nanopartikel eine wenigstens teilweise globuläre oder sphärische Gestalt. Dabei wird unter "sphärisch" oder "globulär" jede Struktur verstanden, die – unter Berücksichtigung der Elektronenwolke – eine im wesentlichen kugelförmige äußere Oberfläche aufweist. In diesem Sinne handelt es sich auch bei einer polyedrischen Cluster-Verbindung um ein globuläres Nanopartikel.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die Nanopartikel eine Größe von bis zu 20 nm auf. Besonders bevorzugt sind Nanopartikel mit einem Durchmesser von bis zu 10 nm. Es hat sich allerdings gezeigt, dass Partikel mit einer Größe von bis zu 5 nm besonders geeignet sind.

In einer vorteilhaften Ausführungsform werden Nanopartikel eingesetzt, die von Atomen gebildet werden, die miteinander über chemische Bindungen gebunden sind. Dabei handelt es sich demnach um Atome oder Moleküle, die beispielsweise über metallische Bindungen, Ionenbindungen oder kovalente Bindungen oder koordinative Bindung interagieren. Die Ladungen auf den Oberflächen können jedoch – wie z.B. beim kolloidalen Gold – auch durch Adsorption von Ionen auf der Oberfläche begründet sein.

Beispiele für bevorzugt einsetzbare Nanopartikel sind:

A. Metallverbindungen:

1. Cluster: a) klassische Metallcluster (Verbindungen mit zwei oder mehr direkt verknüpften Metallatomen) b) nicht klassische Metallcluster ("oligonucleare Werner-Komplexe"), mindestens drei Metallatome sind cyclisch über Liganden und ohne direkten Metall-Metall-Kontakt verbunden.
2. Metallkolloide: a) Metallhydroxid wie z.B. Fe(OH)₃, Cd(OH)₂, Al(OH)₃ Cr(OH)₃ oder Metalloxid wie z.B. TiO₂, ZrO₂, CeO₂. b) Metall wie z.B. Au, Ag, Pt und Metallsulfide wie As₂S₃ und Sb₂S₃.

B. Nicht-Metall-Verbindungen z.B.

1. Borate
2. Silikate
3. Polyoxometallate, z.B. von Molybdän, Wolfram, Vanadium, Niob oder Tantal
4. organische Übergangsmetallverbindungen (z.B. mehrkernige geladene Übergangsmetallcarbonyle

C. organisch-chemische Nanopartikel: z.B. Polycyclisch Aromatisierte Wasserstoffe, Fullerene, makrocyclische Verbindungen, Dendrimere

Um die gewünschte Ladung zu erhalten, können die Nanopartikel bzw. ihre Liganden entsprechend modifiziert oder derivatisiert werden.

Sollen die erfindungsgemäß einsetzbaren Nanopartikel zu therapeutischen Zwecken eingesetzt werden, kann es erforderlich sein, sie in physiologisch verträgliche und unbedenkliche Salze zu überführen. Das können beispielweise Salze mit Mineralsäuren, Carbonsäuren oder Sulfonsäuren sein. Es können aber auch Salze mit Basen so z.B. Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- oder Kaliumsalze), Erdalkalisalzen, Ammoniumsalze oder organischen Aminen gebildet werden (Diethylamin, Triethylamin).

Erfindungsgemäß können auch Derivate, Isomere, Hydrate oder Metabolite sowie Pro-Drugs der geeigneten Nanopartikel oder deren Salze eingesetzt werden. Unter Pro-Drugs wird dabei eine Verbindung verstanden, die – unter Umständen zuvor selber nicht aktiv – erst nach einer metabolischen Umsetzung die eigentlich therapeutisch aktive Substanz freigibt bzw. in diese überführt wird. Nachfolgend werden alle diese im Ergebnis auf die erfindungsgemäß einsetzbaren Nanopartikel zurückgehenden bzw. davon abgeleiteten Verbindungen als "Derivate" zusammengefaßt.

Es hat sich experimentell gezeigt, dass sich die erfindungsgemäße Wirkung beispielsweise durch die Verwendung kolloidalen Golds erzielen läßt. Zum experimentellen Nachweis der gewünschten Wirkung wurden mit Scrapie infizierte Maus-Neuroblastenzellen über einen Zeitraum von wenigen Tagen mit kolloidalem Gold behandelt, anschließend lysiert und mit Protease K verdaut. In nachfolgenden Western Blots wurde gezeigt, dass die Menge des fehlgefalteten PrP^sc im Vergleich zur Kontrolle deutlich reduziert war. Da eine Resistenz gegen Protease-Verdau ein typisches Merkmal des PrP^sc darstellt, zeigt der erfolgreiche Verdau mit Protease K, dass diese Resistenz wieder verloren ging. Diese Änderung hängt – diesen Schluß lassen die Versuche zu – kausal mit der Behandlung der Mauszellen mit kolloidalem Gold zusammen.

Bevorzugt wird das kolloidale Gold mit einem mittleren Durchmesser von 5 nm eingesetzt. Es ist jedoch auch der Einsatz von deutlich kleineren Nanopartikeln (z.B. mit einem mittleren Durchmesser von nur 0,5 bis 2,5 nm) möglich.

Diese Goldkolloide wurden nach der Methode von Slot und Geuze hergestellt (Slot, J.W., and Geuze, H.J., Eur. J. Cell Biol., 38, 87 (1985)). Diese Methode beruht darauf, Au³⁺ (als HAuCl₄) mit Tanninsäure und Citrat zu reduzieren. Die daraus resultierenden Goldkolloide sind u.a. dadurch gekennzeichnet, dass sie auf ihrer Oberfläche negative Ladungen tragen durch die Adsorption von Cl^-, Citrat oder AuCl₂ ^--Ionen.

Auch nach einer Behandlung der Mauszellen mit kolloidalem Silber zeigte sich das gleiche Ergebnis. Auch hier konnte ein Abbau des fehlgefalteten PrP^sc durch Protease K Verdau festgestellt werden.

Das erfindungsgemäße Prinzip kann auch zur Desinfektion oder Dekontamination medizinischer Geräte, z.B. eines chirurgischen Instruments, dienen. Dazu kann das Gerät über einen längeren Zeitraum in eine Lösung enthaltend die Nanopartikel eingetaucht werden. Bei größeren Einrichtungen – z.B. Operationstischen oder dergleichen – kann eine zeitweise oder permanente Beschichtung der Einrichtung mit der Desinfektionslösung sinnvoll sein. Der für die effektive und sichere Dekontamination erforderliche Zeitraum hängt im einzelnen ab von der Auswahl der verwendeten Nanopartikel und der verwendeten Lösung. Er kann von dem Fachmann ohne weiteres ermittelt werden. Um die Effizienz zu steigern, können der Desinfektionslösung im Einzelfall auch Zusatzstoffe – wie beispielsweise Tenside – hinzugesetzt werden.

Ebenso kann das erfindungsgemäße Prinzip auch zur Prävention der Kontamination von Instrumenten mit Prionen genutzt werden. Dazu können die Oberflächen der Instrumente mit den erfindungsgemäß verwendbaren Nanopartikeln beschichtet werden. Das Beschichten kann dazu beispielweise durch ein Eintauchen der Instrumente in eine Lösung enthaltend die Nanopartikel erfolgen. Damit kann die Kontamination der verwendeten Geräte vermieden werden.

Um das erfindungsgemäße Konzept auch für eine möglichst frühzeitige Diagnose einsetzen zu können, kann eine Patientenprobe mit geeigneten Nanopartikeln behandelt und anschließend auf ihren Gehalt an Prionen untersucht werden. Durch einen Vergleich mit einer unbehandelten Probe oder einem zuvor festgelegten Standard läßt sich eine Aussage über den Infektionszustand treffen.

Ausführungsbeispiele
1. Behandlung Scrapie-infizierter Maus Neuroblastenzellen
1.
Western Blot von Protease-verdauten Lysaten von ScN2a Zellen, die mit kolloidalem Gold behandelt wurden.
Maus Neuroblastomzellen (Neuro2a; ATCC CCL 131) wurden mit Mausadaptiertem Scrapie infiziert (ScN2a; (Bosque and Prusiner, 2000)) und in MEM (Minimal Essential Medium; Gibco 21090-022) mit 10% fötalem Kälberserum und 10 mM Streptomycin-Penicillin gehalten. Die Zellen wurden nach Korth et al. (2001) behandelt: eine konfluente 10 cm Platte wurde mit Trypsin gesplittet und in 5 ml Medium aufgenommen, davon wurde 1 Tropfen (ca. 10-50.000 Zellen) in eine mit 4 ml gefüllte 60 mm Zellkulturschale ausgesät. Aus der originalverpackten kolloidalen Goldlösung wurden dann die angegebenen Endkonzentrationen direkt in das Medium pipettiert.
Alle zwei Tage wurden das Medium und die kolloidale Goldlösung gewechselt. Am sechsten Tag wurde die Platte mit Phosphate-Buffered Saline (PBS) gewaschen und mit 500 μl Lyse-Puffer (0.5% Triton-X-100, 0.5% Deoxycholsäure, 50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl) lysiert. Davon wurden 400 μl mit 20 μg/ml Protease K (Merck, Darmstadt) für 30 min bei 37 °C verdaut. Diese Reaktion wurde mit 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) gestoppt und anschließend für 45 min bei 4 °C und 100.000 x g in einer Optima Tischultrazentrifuge (TLA 55 Rotor) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet in 2x Aufnahme-Puffer (50% Glycerol, 1 Bromphenolblau, 2% β-Mercaptoethanol, 2% SDS) aufgenommen, gekocht und eine SDS-Gelelektrophorese und ein Western Blot nach Standardprotokollen durchgeführt (Sambrook et al., 1989).
Eine Ultrazentrifugation bei 1.000.000 x g (OptimaMax, BeckmanCoulter), 1h, 4 °C, wurde durchgeführt, um die feste Phase des Kolloidalen Golds von der flüssigen Phase zu trennen. Dies gelang jedoch nicht vollständig ( 1).
Die Prion infizierten ScN2a Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen kolloidalen Golds 5 nm (Sigma G1402) behandelt (Spur 1 und 2). In einem weiteren Experiment wurde das kolloidale Gold ultrazentrifugiert (1h bei 1.000.000 x g in einer Beckman Optima Ultrazentrifuge) und in Überstand und Pellet fraktioniert. Der Überstand (Spuren 3 und 4) und das in Salzlösung resuspendierte Pellet (Spuren 5 und 6) wurde ebenfalls zu den ScN2a Zellen dazugegeben. Außerdem wurde kolloidales Gold 10 nm mit den ScN2a Zellen inkubiert (Spuren 7 und 8). Als Kontrolle dienten unbehandelte ScN2a Zellen (Spur 9).
Im Western Blot ist das Protease verdaute PrP^Sc im aufgetragenen Lysat dargestellt, das von einem anti-PrP Antikörper erkannt wurde.
Das Experiment zeigt, dass 5 nm kolloidales Gold (Sigma G1402) Prionen inhibiert (inaktiviert).
2. Ultrazentrifugations-Versuche
2:
Western Blot vom Pellet von ultrazentrifugierten ScN2a Zelllysaten in Anwesenheit kolloidalen Goldes (5nm).
Außerdem wurde diese Ultrazentrifugation verwendet um festzustellen, ob PrP Isoformen direkt an kolloidales Gold binden (2). Für dieses Experi ment wurden ScN2a Zelllysate in Lyse-Puffer (0.5% Triton-X-100, 0.5% Deoxycholsäure, 50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl) suspendiert, und 200 μl kolloidales Gold (Sigma G1402) dazugegeben. Nach einer 1-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde entweder sofort ein Proteaseverdau (Protease K 20 μg/ml, 1h, 37 °C) und anschließend die Ultrazentrifugation bei 100.000 x g (TLA-55 in einer Optima, BeckmanCoulter, USA) durchgeführt, oder umgekehrt (siehe 2). Der Überstand wurde entfernt, das Pellet resuspendiert und ein Western Blot durchgeführt.
Der Blot zeigt:
Ultrazentrifugation bei 100.000 x g für 1h von lysierten ScN2a Zellen in Abwesenheit (Spur 1), oder Anwesenheit von 200 ml (Spur 2), oder 300 ml (Spur 3) kolloidalem Gold 5nm. Es kommt zu einer unspezifischen Pelletierung unlöslichen PrP (Puffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0.5% Triton X 100, 0.5% Deoxycholat, pH 8.0) bei der Ultrazentrifugierung (Spuren 1 bis 3). Das unspezifisch pelletierende PrP ist PrP^c, da ein Proteaseverdau nicht das charakteristische PrP^Sc Fragment übrig lässt. (Spur 4). Wenn das Lysat zuerst Protease verdaut wird, und dann ultrazentrifugiert wird, findet sich charakteristischerweise das Protease resistente PrP^Sc Fragment (Spur 5). Wenn dieser Proteaseverdau vor der Ultrazentrifugation in Anwesenheit von kolloidalem Gold durchgeführt wird, ist die Fraktion des Protease resistenten PrP^Sc deutlich erniedrigt (Spur 6), was auf einen Clearing-Effekt des kolloidalen Goldes 5 nm auf PrP^Sc hinweist.
3. Versuche an Hamsterhirnhomogenaten
3:
Western Blot von Hamsterhirnhomogenaten, die mit Gold behandelt wurden zum PrP^Sc-Nachweis
Normales oder Scrapie infiziertes (263K Strain) Hamsterhirn wurden in einem Dounce-Handhomogenisator in Lyse-Puffer (0.5% Triton-X-100, 0.5% Deoxycholsäure, 50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl) 10%ig homogenisiert. Anschließend wurde ein Proteaseverdau (Protease K 20 μg/ml, 1h, 37 °C) in Anwesenheit oder Abwesenheit von kolloidalem Gold 5 nM (Sigma G1402) durchgeführt und die Probe dann im Western Blot dargestellt.
Der Blot zeigt:
Normales Hamsterhirn ohne Proteasebehandlung (Spur 1) und nach Proteasebehandlung (Spur 2); Scrapie infiziertes Hamsterhirn ohne Protease(Spur 3) und nach Proteasebehandlung (Spur 4). Proteasebehandlung von Hamsterhirn in Anwesenheit von kolloidalem Gold 5nm (Spuren 5 und 6), oder bei Vorinkubation der Protease mit kolloidalem Gold (Spur 7).
Das Experiment zeigt, dass auch bei Scrapie infiziertem Hamsterhirn die Menge des PrP^Sc durch Ko-Inkubation mit kolloidalem Gold 5 nm vermindert werden kann (vergleiche Spure 4 ohne Gold mit Spur 5 mit Gold).
Die in 2 und 3 präsentierten Resultate lassen den Schluss zu, dass kolloidales Gold direkt auf die krankheits-spezifische Form PrP^Sc (Prionen) wirkt und diese möglicherweise denaturiert
4. Wirkung kolloidalen Silbers
4:
Western Blot von Protease verdauten Lysaten von ScN2a Zellen, die mit kolloidalem Silber (PurestColloids, USA) behandelt wurden.
Prioninfizierte ScN2a Zellen wurden gemäss einem bekannten Protokoll (siehe oben) mit 40 ml Silver Colloid behandelt (links: Kontrolle; rechts behandelte Zellen nach 1 Woche). Die Behandlung mit SilverColloid reduziert die Menge an Protease resistentem PrP^Sc deutlich.
Referenzen:
Bosque, P. J., and Prusiner, S. B. (2000). Cultured cell sublines highly susceptible to prion infection. J Virol 74, 4377-4386.
Korth, C., May, B. C. H., Cohen, F. E., and Prusiner, S. B. (2001). Acridine and phenothiazine derivatives as pharmacotherapeutics for prion disease. Proc Natl Acad Sci USA 98, 9836-9841.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Claims

Verwendung von Nanopartikeln, Derivaten oder physiologisch verträglichen Salzen davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Prionenerkrankungen.
Verwendung von Nanopartikeln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel so ausgewählt sind, dass sie mit den die Prionenerkrankung auslösenden Prionen interagieren.
Verwendung von Nanopartikeln nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel im wesentlichen sphärisch sind.
Verwendung von Nanopartikeln nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel geladen, polar oder polarisierbar sind.
Verwendung von Nanopartikeln nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel einen mittleren Durchmesser von bis zu 20 nm, vorzugsweise bis zu 10 nm, besonders bevorzugt bis etwa 5 nm aufweisen.
Verwendung von Nanopartikeln nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel aus der Gruppe folgender Verbindungen ausgewählt sind: Metallcluster-Verbindungen (klassische oder nicht-klassische Cluster-Verbindungen), Metallkolloide (Metallhydroxidsole, Metalloxidsole, Metallsole) Nicht-Metall-Verbindungen (z.B. Borate, Silikate,), Polyoxometallate, organische Übergangsmetallverbindungen oder organisch-chemische Verbindungen.
Verwendung von Nanopartikeln nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Nanopartikeln um kollodiales Gold handelt.
Verwendung von Nanopartikeln nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das kolloidale Gold eine negative Oberflächenladung aufweist.
Verwendung von Nanopartikeln nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das kolloidale Gold durch Reduktion von Au⁺Ionen durch Tanninsäure und/oder Citrat erhältlich ist.
Mittel zur Inaktivierung infektiöser Prionen enthaltend Nanopartikel, Derivate oder Salze davon, gekennzeichnet durch einen pH-Wert > 5 und < 9, vorzugsweise von etwa 7.
Mittel zur Inaktivierung infektiöser Prionen enthaltend Nanopartikel, Derivate oder Salze davon, dadurch gekennzeichnet, dass die die Nanopartikel bildenden Atome chemisch miteinander verbunden sind.
Mittel nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel so ausgewählt sind, dass sie mit den die Prionenerkrankung auslösenden Prionen interagieren.
Mittel nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel aus der Gruppe folgender Verbindungen ausgewählt sind: Metallcluster-Verbindungen (klassische oder nichtklassische Cluster-Verbindungen), Metallkolloide (Metallhydroxidsole, Metalloxidsole, Metallsole) Nicht-Metall-Verbindungen (z.B. Borate, Silikate,), Polyoxometallate, organische Übergangsmetallverbindungen oder organisch-chemische Verbindungen.
Verwendung eines Mittels nach einem der Ansprüche 10 bis 13 zur Dekontamination medizinischer Geräte, Instrumente sowie Einrichtungen von infektiösen Prionen.
Verfahren zur Dekontamination medizinischer Geräte, Instrumente oder Einrichtungen von infektiösen Prionen, dadurch gekennzeichnet, dass die Geräte, Instrumente oder Einrichtungen mit einem Mittel nach einem der Ansprüche 10 bis 13 solange behandelt werden, dass die infektiösen Prionen inaktiviert sind.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Geräte, Instrumente oder Einrichtungen in eine Lösung enthaltend ein Mittel nach einem der Ansprüche 10 bis 13 getaucht oder damit überschichtet oder beschichtet werden.
Verfahren zur Diagnose von Prionenerkrankungen bei einem tierischen oder menschlichen Patienten, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a.) Entnehmen einer Probe biologischen Materials aus dem Patienten, b.) Inkubation der Probe mit einer in einem der Ansprüche 1 bis 9 genannten Nanopartikel oder einem Mittel nach einem der Ansprüche 10 bis 13, c) Darstellen des Gehalts an Prionen d) Vergleichen der Testergebnisse mit einem unbehandelten Patientenprobe oder mit einem zuvor definierten Standard.
Medizinischer Geräte, Instrumente oder Einrichtungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einer der in den Ansprüchen 1 bis 9 genannten Nanopartikel beschichtet oder mit einem der in den Ansprüchen 10 bis 13 genannten Mitteln behandelt wurden.
Medizinischer Geräte, Instrumente oder Einrichtungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie in ein Mittel nach einem der Ansprüche 10 bis 13 getaucht wurden.