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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Säubern von Substraten, im allgemeinen
wiederverwendbaren Substraten, um adsorbierte Prionen-Infektiosität zu entfernen.
Sie beinhaltet besonders das Säubern
von wiederverwendbaren Chromatographiesäulen, die während der Verfahren angewendet
werden, die an der Fraktionierung von Blutplasma beteiligt sind.
Jedoch wird sie auch auf das Säubern
anderer Substrate, wie beispielsweise chirurgische Instrumente usw.,
angewendet.
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Es
wird angenommen, daß Krankheit
im Zusammenhang mit Prionen auf Prionen-Proteine zurückzuführen ist,
die veränderte
dreidimensionale Struktur aufweisen. Jedoch ist die Identifizierung
des infektiösen Prionen-Agens
noch nicht schlüssig
gelöst.
In der vorliegenden Beschreibung beziehen wir uns auf „Prionen-Infektiosität", wie sie das für Krankheit
im Zusammenhang mit Prionen (was auch immer das sein mag) verwsachende
infektiöse
Agens abdeckt. Die hier beschriebenen experimentellen Verfahren
messen tatsächlich
Prionen-Infektiosität
bei Mäusen.
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Es
ist bekannt, daß Prionen-Infektiosität durch
einen unbekannten Mechanismus stark an Substraten haftet, und Mittel
zum zuverlässigen
Säubern
derartiger Substrate sind bisher unbekannt gewesen, da sie normalerweise
nicht den harschen Bedingungen widerstehen, die für die Inaktivierung
von Prionen-Agenzien empfohlen werden, wie beispielsweise Behandlung
mit 2 M Natriumhydroxid, kombiniert mit Erwärmen auf 121–138°C (Taylor
DM. Inactivation of prions by physical and chemical means (Inaktivierung
von Prionen durch physikalische und chemische Mittel). J Hospital
Infection 1999; 43 Suppl.; S69–76).
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Bovine
spongiforme Enzephalopathie (BSE) ist eine tödliche neurodegenerative Erkrankung
von Rindvieh, zuerst beschrieben im Vereinigten Königreich
1987. Fälle
von BSE sind seitdem in über
zwanzig verschiedenen Ländern
mit weltweit fast 184000 berichteten Fällen entdeckt worden, von denen
99% im Vereinigten Königreich
aufgetreten sind. Es wurde nachfolgend gezeigt, daß das Auftauchen
einer neuen neurodegenerativen Krankheit bei Menschen, variante
Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJD) genannt, auf das BSE-Agens, übertragen
auf Menschen, wahrscheinlich über
die Nahrungsmittelaufnahme von erkranktem tierischen Gewebe, zurückzuführen ist.
Bis zum Juni 2002 betrug die Anzahl von bestätigten oder wahrscheinlichen
Fällen
berichteter vCJD 122 im Vereinigten Königreich, 6 in Frankreich und
1 in Italien. Einzelne Fälle
von vCJD sind auch in Irland, Hong Kong und in den USA bei Personen
berichtet worden, die früher
im Vereinigten Königreich
ansässig
waren. Jedoch ist mangels eines geeigneten diagnostischen Screeningtests
das Vorherrschen asymptomatischer vCJD bei der Bevölkerung
des Vereinigten Königreichs
oder anderswo nicht bekannt.
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Obwohl
andere Formen von Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) durch eine Anzahl
medizinischer Prozeduren iatrogen übertragen worden sind, gibt
es kein Anzeichen derartiger Übertragung
durch Blut, Blutprodukte oder Plasmaderivate. Nichtsdestotrotz hatten
Mangel an Wissen über
das Vorherrschen asymptomatischer vCJD zusammen mit dem Nachweis
abnormalen Prionen-Proteins in lymphoretikulären Geweben von Personen, infiziert
mit vCJD, zu der Besorgnis geführt,
daß vCJD
durch Blutprodukte übertragen
werden kann.
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Eine
Risikoanalyse, beauftragt durch das UK Department of Health, schlußfolgerte,
daß es
ein theoretisches Risiko von vCJD, übertragen durch Plasmaderivate,
hergestellt aus infizierten Spenden, gab.
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Beträchtliche
Arbeit ist bei der Untersuchung von Prionen geleistet worden und
allgemeine Hintergrundinformation wird in Stanley B. Prusiner et
al. „Some
Strategies and Methods for the Study of Prions" („Einige
Strategien und Methoden für
die Untersuchung von Prionen"),
Kapitel 15, Prion Biology and Diseases (Biologie und Krankheiten
von Prionen), 1999 Cold Spring Harbor Laboratory Press, bereitgestellt.
Eine Bewertung des Potentials von Blutplasmafraktionierungsverfahren,
um die verursachenden Mittel von übertragbarer spongiformer Enzephalopathie
(TSE), wie beispielsweise CJD oder vCJD, zu entfernen, ist in P.
R. Foster, Transfusion Medicine, 1999, 9, 3–14 gegeben, und ein Überblick über Prione
and Blutprodukte ist in P. R. Foster, Annals of Medicine 2000; 32:
501–513
gegeben. Die Arbeit, dargestellt in P. R. Foster et al., Vox Sang 2000;
78, 86–95,
identifizierte Tiefenfiltration, besonders unter Verwendung eines
Tiefenfilters Seitz KS80, als besonders wirksam beim Entfernen von
Prionen-Proteinen aus Blutplasmafraktionierungsströmen. Andere Versuche,
Prionen-Proteine zu entfernen, sind in der Patentanmeldung PCT/FR97/00465,
welche eine Kombination von elektrostatischer Adsorption und Chromatographie
anwendet; und in der US-Patentschrift 5808011, welche Prionen-Infektiosität aus einer
Lösung
durch Adsorption des Prions auf eine Chromatographiesäule durch
Verwendung eines pH-Gradienten
entfernt, beschrieben.
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So
bleibt, wenn es auch ein wachsendes Verständnis der Wege gibt, auf welchen
Prionen aus Verfahrensströmen,
besonders den an der Blutfraktionierung beteiligten, entfernt werden
können,
das Schicksal der Prionen-Infektiosität unbestimmt. So gibt es ein
ernsthaftes Risiko, daß Prionen-Agenzien,
immobilisiert auf Chromatographiesäulen während der Verarbeitung eines
Ansatzes von Blutplasma, während
der Verarbeitung nachfolgender Ansätze verbleiben können, was
zu möglicher
Kontamination davon führt.
Es ist daher wichtig, imstande zu sein, mit Sicherheit zu wissen,
daß wiederverwendbare
Chromatographiesäulen
(welche eine Wiederverwendungslebenszeit von mehreren Jahren haben
können)
am Ende des Durchlaufes jedes Ansatzes zuverlässig von Prionen-Infektiosität gesäubert werden
können.
Weiterhin gibt es eine Besorgnis, daß andere medizinische oder
chirurgische Substrate, wie beispielsweise chirurgische Instrumente,
ebenfalls beim Übertragen
von CJD wirksam sein können.
Flechsig, E., et al., Mol. Med Oktober 2001; 7(10): 679–684 berichten,
daß Prionen
leicht und fest an Edelstahloberflächen gebunden werden und daß Elektroden,
intrazerebral bei CJD-Patienten verwendet, trotz versuchter Desinfektion
die Krankheit auf zwei weitere Patienten und schließlich auf
einen Schimpansen übertrugen.
Das UK Department of Health hat auch das Risiko von Prionen-Infektiosität, übertragen
auf Patienten über
Instrumente, verwendet in der Chirurgie und anderen invasiven medizinischen
Prozeduren, bewertet, wobei geschlußfolgert wurde, daß „variant
and sporadic CJD may be transmitted on surgical instruments" („variante
und sporadische CJD auf chirurgischen Instrumenten übertragen
werden kann") und „current
procedures for decontaminating surgical instruments between uses
cannot be guaranteed to eliminate the abnormal prion proteins that
are thought to be responsible for the transmission of CJD." („nicht
garantiert werden kann, daß gegenwärtige Verfahrensweisen
zum Dekontaminieren chirurgischer Instrumente zwischen Verwendungen
die abnormalen Prionen-Proteine beseitigen, von denen man denkt,
daß sie
für die Übertragung
von CJD verantwortlich sind")
(CJD Incidents Panel. Management of possible exposure to CJD through
medical procedures: a consultation paper. (Gremium zum Auftreten
von CJD. Management von möglichem
Kontakt mit CJD durch medizinische Prozeduren: ein Konsultationspapier)
Department of Health Publications, Oktober 2001).
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In ähnlicher
Weise gibt es die Besorgnis, daß Prionen-Krankheiten
während
einer Augenoperation übertragen
werden können,
da ophthalmische Instrumente nach dem Säubern mit Debris kontaminiert
bleiben können
(Dinakaran S, Kayarkar VV. Eye 2002; 16: 281–284). Es gibt daher einen
Bedarf, Substrate, beteiligt an medizinischen oder chirurgischen
Prozeduren an Patienten, zuverlässig
zu säubern,
um die Übertragung von
mit Prionen zusammenhängender
Krankheit zu vermeiden.
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Wir
haben jetzt überraschenderweise
gefunden, daß die
Verwendung konzentrierter Lösungen
von Salzen, wie beispielsweise Natriumchlorid, wirksam beim Eluieren
oder vollständigen
Entfernen adsorbierter Prionen-Infektiosität ist.
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So
stellt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Säubern eines
Substrats, um adsorbierte Prionen-Infektiosität zu entfernen, bereit, wobei
das Substrat ein chromatographisches Material ist; welches Waschen
des Substrats mit einer konzentrierten Salzlösung einer Konzentration von
mindestens 1,5 M umfaßt,
wobei das Salz Natriumchlorid ist.
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So
ist gefunden worden, daß Waschen
des Substrats, im besonderen einer chromatographischen Säule, mit
einer Salzlösung
einer Konzentration von mindestens 1,5 M, insbesondere 1,75 M und
vorzugsweise mindestens 2,0 M, wirksam beim Entfernen adsorbierter
Prionen-Infektiosität
ist. Es war ein überraschendes
Ergebnis für
uns, daß die
Prionen-Infektiosität
herkömmlichem
Ionenaustauschverhalten mit einer Anionenaustauschmatrix zu folgen
schien und durch hohe Salzkonzentrationen eluiert werden konnte.
Tatsächlich ist
dies so unerwartet, daß unser
anfängliches
Versuchsprotokoll nicht zum Messen von Niveaus der Prionen-Infektiosität, eluiert
mit den Salzwaschungen, optimiert war.
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Das
Säuberungsverfahren
der vorliegenden Erfindung kann angewendet werden, um Substrate,
beteiligt an der Fraktionierung von humanem Plasma, zu behandeln,
wie beispielsweise bei P. R. Foster, Transfusion Medicine, 1999,
9, 3–14,
beschrieben ist, besonders die Herstellung von Plasmaprodukten einschließlich Albumin,
Immunoglobuline, Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Thrombin,
Faktor VIII, Fibrinogen, von-Willebrand-Faktor, anti-Thrombin III,
alpha-1-Antitrypsin, Faktor XIII, C1-Inhibitor, Transferrin und
Mannose bindendes Lectin. Das an der Fraktionierung beteiligte chromatographische
Substrat ist gewöhnlich
ein Adsorbens des Typs, verwendet für die Reinigung von Proteinen
oder anderen Makromolekülen
in einem Füllkörperbett,
einer Chromatographiesäule
oder einem anderen Format (z.B. chargenweise oder fluidisierte Adsorption).
Die Erfindung kann auch bei der Herstellung anderer biopharmazeutischer
Zubereitungen, hergestellt aus tierischen Substanzen, einschließlich transgenen
oder anderen genetisch modifizierten Materials, oder wo vom Menschen
oder Tier abgeleitete Substanzen in dem Herstellungsprozeß verwendet
werden, wie beispielsweise in einer Säugerzellkultur, angewendet
werden.
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Das
Verfahren wird im allgemeinen bei Raumtemperatur ausgeführt, aber
kann auch bei einer beliebigen Temperatur angewendet werden, die
mit dem betreffenden Substrat und Salz verträglich ist, z.B. in dem Temperaturbereich
0°C bis
30°C.
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Das
Verfahren kann einen oder mehrere Waschschritte einschließen. Um
totaler Prionen-Entfernung sicher
zu sein, wird es bevorzugt, unter Verwendung der konzentrierten
Salzlösung
einen zweiten und gegebenenfalls nachfolgenden Waschschritt zu verwenden.
Die Waschlösung
kann gewonnen und auf Prionen-Infektiosität getestet werden.
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Dem
Waschen mit konzentriertem Salz kann ein weiterer Waschschritt folgen,
angewendet als Alkali (wie beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid,
Lithiumhydroxid; oder die analogen Carbonate oder Bicarbonate),
im allgemeinen mit einer Konzentration von 0,05 bis 0,5 M. Typischerweise
bringt dies den pH auf mindestens 12. Vorzugsweise wird das Substrat
bei diesem pH für
0,5 bis 2 Stunden einweichen gelassen. Ein oder mehrere Alkaliwaschschritte
können
angewendet werden; vorzugsweise abwechselnd mit Waschungen mit konzentriertem
Salz.
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Das
chromatographische Substrat ist im allgemeinen eine Ionenaustauschersäule des
Typs, der herkömmlicherweise
bei der Blutplasmafraktionierung verwendet wird, aber kann auch
chromatographische Medien einschließen, die in der Affinitätschromatographie,
Größenausschlußchromatographie,
Immunoaffinitätschromatographie
und hydrophoben Interaktionschromatographie verwendet werden (Burnouf
T. Chromatography in plasma fractionation: benefits and future trends
(Chromatographie bei der Plasmafraktionierung: Vorteile und zukünftige Trends).
J Chromatography B 1995; 664: 3–15).
Außerdem
kann die Erfindung verwendet werden, um Membransysteme zu behandeln,
um vor der Wiederverwendung einer Membran, wie beispielsweise bei
der Reinigung oder Formulierung von Proteinen durch Ultrafiltration
oder durch Diafiltration, Prionenkontamination zu entfernen.
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Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden jetzt nur durch ein Beispiel in
der folgenden experimentellen Arbeit beschrieben, welche sich auf
die angefügte 1 bezieht.
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DESORPTION VON PRIONEN
AUS FESTEN PHASEN
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BEISPIEL
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HERSTELLUNG EINER MIKROSOMALEN
FRAKTION VON BSE 301V ALS DEM 'SPIKING' (SPICKENDEN) INOKULUM
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Um
das Partitionierungsverhalten von Prionen zu untersuchen, wurde
ein Aliquot des infektiösen
Materials in der Form einer mikrosomalen Fraktion, abgeleitet von
BSE-infiziertem Mäusehirn,
in die Ausgangs-Faktor-VIII-Lösung
gegeben. Die Verfahrensweise für
die Herstellung des mikrosomalen Inokulums basierte auf dem Verfahren
von Millson et al. (Millson GC, Hunter GD, Kimberlin RH. An experimental
examination of the scrapie agent in cell membrane mixtures. (Eine
experimentelle Untersuchung des Scrapie-Agens in Zellmembrangemischen).
II. The association of scrapie activity with membrane fractions
(Die Verbindung von Scrapie-Aktivität mit Membranfraktionen). J
Comp Path 1971; 81: 255–265).
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Hirngewebe
(3 g), entnommen spät
in der klinischen Phase der Krankheit von Inzucht-VM-Mäusen, infiziert mit Mäuse-passagiertem
BSE (Stamm 301V), wurde in 27 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)
suspendiert, in einem Dounce-Homogenisierer homogenisiert und mit
2000 U/min für
10 Minuten bei 4°C
zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml PBS resuspendiert und unter
den gleichen Bedingungen wieder zentrifugiert. Die aus beiden Prozeduren
gewonnen Überstände wurden
gesammelt und mit 10000 g für
7 Minuten zentrifugiert, um ungebrochene Zellen, große Fragmente
von Zellen, Mitochondrien und Zellkerne zu sedimentieren. Der durchscheinende Überstand
wurde sorgfältig
entfernt und mit 100000 g für
1 h bei 4°C
zentrifugiert, um die mikrosomale Fraktion zu sedimentieren. Der Überstand
wurde verworfen und das Pellet wurde in 30 ml PBS resuspendiert,
um das Inokulum zum 'Spiking' der Ausgangs-Faktor-VIII-Lösung bereitzustellen.
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IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
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Mikrosomales
Inokulum (10 ml) wurde in eine Lösung
von Faktor VIII (102,7 ml) von intermediärer Reinheit, enthaltend 20
mM Trinatriumcitrat, 2,5 mM Calciumchlorid, 109 mM Natriumchlorid
und 4,5% Gew./Vol. Saccharose, gegeben. Polysorbat-80 und Tri(n-butyl)phosphat
wurden dann in die Lösung
gegeben, um Konzentrationen von 1% Vol./Vol. bzw. 0,3% Vol./Vol.
zu erhalten, und das resultierende Gemisch (108,6 ml) wurde vor
der Verarbeitung durch Ionenaustauschchromatographie bei 25 ± 1°C für 18 h gerührt.
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Das
Ionenaustauschverfahren basierte auf dem Verfahren von Burnouf et
al. (Burnouf T., Burnouf-Radosevich
M., Huart J. J., Goudemand M. A highly purified Factor VIII:c concentrate
prepared from cryoprecipitate by ion-exchange chromatography (Ein
hochgereinigtes Faktor-VIII:c-Konzentrat, hergestellt aus Kryopräzipitat
durch Ionenaustauschchromatographie). Vox Sang 1991; 60: 8–15). 14
ml DEAE-Toyopearl
650M (TosohBiosep GmbH, Stuttgart, Deutschland) wurden unter Verwendung
von 2 M Natriumchlorid in eine Säule
mit 10 mm Durchmesser (C10/20, Pharmacia, Upsala, Schweden) gepackt
und mit 130 ml Puffer, enthaltend 120 mM Glycin, 16 mM Lysin, 10
mM Trinatriumcitrat, 1 mM Calciumchlorid und 110 mM Natriumchlorid,
bei pH 7,0 äquilibriert.
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Lösungsmittel-Detergens-behandelte
Faktor-VIII-Lösung
(98,6 ml) wurde auf die Säule
aufgebracht, gefolgt von 42 ml Äquilibrierungspuffer,
und die (unadsorbierte) Durchbruchfraktion (139,8 ml) wurde gesammelt
(Fibrinogen-Fraktion). 41 ml Äquilibrierungspuffer,
erhöht
auf 145 mM Natriumchlorid, wurden dann aufgebracht, und die resultierende
Fraktion wurde gesammelt (von-Willebrand-Faktor-Fraktion).
Diesem folgten 26 ml Äquilibrierungspuffer,
erhöht
auf 250 mM Natriumchlorid, was verwendet wurde, um Faktor VIII zu
eluieren (Faktor-VIII-Fraktion).
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Nach
der Sammlung des Faktor-VIII-Eluats wurde das Chromatographiebett
mit Lösungen
von 2 M Natriumchlorid, 0,1 M Natriumhydroxid und wieder mit 2 M
Natriumchlorid behandelt, mit dem Ziel, Proteine und andere Materialien
(z.B. Lipide) zu entfernen, welche an die Ionenaustauschmatrix gebunden
blieben. Das Ausmaß,
zu welchem Prionen-Infektiosität
durch eine von diesen Verfahrensweisen entfernt werden könnte, war
nicht bekannt. Daher wurden Proben dieser Fraktionen zur Analyse
gesammelt, ebenso wie die Produkteluate. Zuerst wurden 25 ml 2 M
Natriumchlorid auf die Säule
aufgebracht und das Eluat (15,5 ml) wurde vom Beginn der 'Salzfront' (Erste Waschung
mit NaCl) gesammelt. Nachfolgend wurde 0,1 M Natriumhydroxid (70 ml)
auf die Säule
aufgebracht und ein Eluat (39 ml) gesammelt, wenn der pH von 6,3
bis > 12 zunahm (Waschung
mit NaOH). Wenn die Aufbringung von 0,1 M Natriumhydroxid vollständig war,
wurde die Säule
in Natriumhydroxid für
eine Stunde einweichen gelassen und dann einer zweiten Waschung
mit 2 M Natriumchlorid (42 ml) unterworfen. Ein Eluatvolumen von
8,1 ml wurde gesammelt, um das in diesem Stadium eluierte Protein
zu fangen (Zweite Waschung mit NaCl).
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BESTIMMUNG VON PROTEIN,
DAS WÄHREND
DES IONENAUSTAUSCHPROZESSES ELUIERT WIRD
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Während der
Ionenaustauschprozedur wurde der Ausstoß aus der Säule kontinuierlich durch Messung
der optischen Dichte der Lösung
in der Anlage bei einer Wellenlänge
von 280 nm (OD280) überwacht, um Protein (und anderes
OD280-absorbierendes Material) nachzuweisen,
das eluiert wird. Das erhaltene OD280-Profil
wird in 1 gezeigt.
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1 zeigt
die optische Dichte der Lösung,
die aus der Ionenaustauschchromatographie von Faktor-VIII-Lösung intermediärer Reinheit,
gespickt mit mikrosomaler BSE-301V-Fraktion, eluiert wird. a = Fibrinogen-Fraktion
(110 mM NaCl); b = von-Willebrand-Faktor-Fraktion (145 mM NaCl);
c = Faktor-VIII-Fraktion
(250 mM NaCl); d = Erste Waschung mit Natriumchlorid (2 M NaCl);
e = Waschung mit Natriumhydroxid (0,1 M NaOH); f = Zweite Waschung
mit Natriumchlorid (2 M NaCl).
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Desorption
von Protein (oder anderem bei OD280 absorbierenden
Material) wurde so beobachtet während:
der
Elution der Fibrinogen-Fraktion (mit 110 mM NaCl),
der Elution
der von-Willebrand-Faktor-Fraktion (mit 145 mM NaCl),
der Elution
der Faktor-VIII-Fraktion (mit 250 mM NaCl),
bei der Ersten
Waschung mit Natriumchlorid (mit 2 M NaCl),
bei der Waschung
mit Natriumhydroxid (0,1 M NaOH) und
bei der Zweiten Waschung
mit Natriumchlorid (mit 2 M NaCl).
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Material,
eluiert während
der ersten Waschung mit 2 M Natriumchlorid, wurde nachfolgend erzeugt, um
hohe Prionen-Infektiosität
zu haben.
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BESTIMMUNG
VON BSE INFEKTIOSITÄT
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Die
BSE-Infektiosität
von Proben aus dem Ionenaustauschprozeß wurde durch einen Bioassay,
ausgeführt
am Institute of Animal Health, West Mains Road, Edinburgh, UK, bestimmt.
Proben für
den Assay wurden in Kochsalzlösung
verdünnt
und intrazerebral in entwöhnte
VM-Mäuse
injiziert. Die Tiere wurden sorgfältig für bis zu 547 Tagen beobachtet
und für
klinische Anzeichen bewertet, wie von Dickinson et al. beschrieben wurde
(Dickinson AG, Meikle VM, Fraser IH. Identification of a gene which
controls the incubation period of some strains of scrapie agent
in mice (Identifizierung eines Gens, welches die Inkubationszeit
einiger Stämme von
Scrapie-Agens bei Mäusen
steuert). J Comp Path 1968; 78: 293–299). BSE-Infektion bei Mäusen mit
klinischen Symptomen wurde durch histopathologische Untersuchung
auf Hirnvakuolisierung, spezifisch für Prionen-Krankheiten, bestätigt, wie
von Bruce beschrieben wurde (Bruce ME. Strain typing studies of
scrapie and BSE (Studien zur Stammtypisierung von Scrapie und BSE);
in Baker H, Ridley RM, Hrsg.: Methods in Molecular Medicine: Prion
Diseases (Methoden in der Molekularmedizin: Prionenkranheiten).
Totowa, New Jersey, Humana Press, 1996, S. 223–236).
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ERGEBNISSE
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Die
Anzahl von Mäusen,
infiziert mit BSE bei verschiedenen Probenverdünnungen, ist in Tabelle 1 angegeben,
zusammen mit der für
die zu beobachtende Infektion gebrauchten Zeit (mittlere Inkubationszeit).
Sowohl das ursprüngliche
mikrosomale Inokulum als auch das 'gespickte' Faktor-VIII-Ausgangsmaterial (vor der Zugabe von
Lösungsmittel/Detergens)
zeigten einen hohen Grad von Infektiosität entsprechend dem Anteil infizierter
Mäuse und
der relativ kurzen mittleren Inkubationszeit (d.h. 131 Tage bzw.
135 Tage bei 10–2 Probenverdünnung).
Nach Zugabe von Lösungsmittel/Detergens
zeigte das Faktor-VIII-Ausgangsmaterial einen ähnlichen Grad von Infektiosität (Ergebnis
nicht angegeben). Im Gegensatz dazu enthielten die Fibrinogen-Fraktion,
die von-Willbrand-Faktor-Fraktion und die Faktor-VIII-Fraktion alle
viel weniger Infektiosität,
wobei die entsprechenden mittleren Inkubationszeiten von 204 Tagen,
194 Tagen und 166 Tagen in umgekehrter Beziehung zu der Natriumchloridkonzentration
stehen, was anzeigt, daß Desorption
dieser kleinen Menge von Prionen-Infektiosität herkömmlichem
Verhalten für
die Desorption von Proteinen von Anionenaustauschern folgte. Alle von
den Mäusen,
injiziert mit der Ersten Waschung mit NaCl, entwickelten mit einer
relativ kurzen mittleren Inkubationszeit eine Infektion, was einen
sehr hohen Grad von Prionen-Infektiosität in diesem Eluat demonstrierte.
Danach wurde keine Infektiosität
in Material, desorbiert von der Säule während entweder der Behandlung mit
Natriumhydroxid oder der Zweiten Waschung mit NaCl, nachgewiesen, ungeachtet
dessen, daß nach
der Behandlung mit Natriumhydroxid weiteres Protein mit 2 M NaCl
eluiert wird. Diese Werte demonstrieren deutlich die Wirksamkeit
der ersten Waschung mit NaCl beim Entfernen von Prionen-Infektiosität, wobei
das meiste von dieser an die feste Phase gebunden blieb, nachdem
die Produktfraktionen eluiert worden waren.
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Außerdem demonstriert
die nachfolgende Abwesenheit von BSE-Infektiosität nach Behandlung mit 0,1 M
NaOH (entweder in der NaOH-Probe oder in der zweiten Waschung mit
2 M NaCl), daß eine
Kombination von 2 M NaCl, gefolgt von 0,1 M NaOH, wirksam beim Entfernen
aller Infektiosität
war, die potentiell in der zweiten Waschung mit 2 M NaCl desorbiert
worden sein könnte.
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