DE60310240T2 - Entfernung von prionen-infektiosität - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft das Säubern von Substraten, im allgemeinen wiederverwendbaren Substraten, um adsorbierte Prionen-Infektiosität zu entfernen. Sie beinhaltet besonders das Säubern von wiederverwendbaren Chromatographiesäulen, die während der Verfahren angewendet werden, die an der Fraktionierung von Blutplasma beteiligt sind. Jedoch wird sie auch auf das Säubern anderer Substrate, wie beispielsweise chirurgische Instrumente usw., angewendet.
- Es wird angenommen, daß Krankheit im Zusammenhang mit Prionen auf Prionen-Proteine zurückzuführen ist, die veränderte dreidimensionale Struktur aufweisen. Jedoch ist die Identifizierung des infektiösen Prionen-Agens noch nicht schlüssig gelöst. In der vorliegenden Beschreibung beziehen wir uns auf „Prionen-Infektiosität", wie sie das für Krankheit im Zusammenhang mit Prionen (was auch immer das sein mag) verwsachende infektiöse Agens abdeckt. Die hier beschriebenen experimentellen Verfahren messen tatsächlich Prionen-Infektiosität bei Mäusen.
- Es ist bekannt, daß Prionen-Infektiosität durch einen unbekannten Mechanismus stark an Substraten haftet, und Mittel zum zuverlässigen Säubern derartiger Substrate sind bisher unbekannt gewesen, da sie normalerweise nicht den harschen Bedingungen widerstehen, die für die Inaktivierung von Prionen-Agenzien empfohlen werden, wie beispielsweise Behandlung mit 2 M Natriumhydroxid, kombiniert mit Erwärmen auf 121–138°C (Taylor DM. Inactivation of prions by physical and chemical means (Inaktivierung von Prionen durch physikalische und chemische Mittel). J Hospital Infection 1999; 43 Suppl.; S69–76).
- Bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) ist eine tödliche neurodegenerative Erkrankung von Rindvieh, zuerst beschrieben im Vereinigten Königreich 1987. Fälle von BSE sind seitdem in über zwanzig verschiedenen Ländern mit weltweit fast 184000 berichteten Fällen entdeckt worden, von denen 99% im Vereinigten Königreich aufgetreten sind. Es wurde nachfolgend gezeigt, daß das Auftauchen einer neuen neurodegenerativen Krankheit bei Menschen, variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJD) genannt, auf das BSE-Agens, übertragen auf Menschen, wahrscheinlich über die Nahrungsmittelaufnahme von erkranktem tierischen Gewebe, zurückzuführen ist. Bis zum Juni 2002 betrug die Anzahl von bestätigten oder wahrscheinlichen Fällen berichteter vCJD 122 im Vereinigten Königreich, 6 in Frankreich und 1 in Italien. Einzelne Fälle von vCJD sind auch in Irland, Hong Kong und in den USA bei Personen berichtet worden, die früher im Vereinigten Königreich ansässig waren. Jedoch ist mangels eines geeigneten diagnostischen Screeningtests das Vorherrschen asymptomatischer vCJD bei der Bevölkerung des Vereinigten Königreichs oder anderswo nicht bekannt.
- Obwohl andere Formen von Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) durch eine Anzahl medizinischer Prozeduren iatrogen übertragen worden sind, gibt es kein Anzeichen derartiger Übertragung durch Blut, Blutprodukte oder Plasmaderivate. Nichtsdestotrotz hatten Mangel an Wissen über das Vorherrschen asymptomatischer vCJD zusammen mit dem Nachweis abnormalen Prionen-Proteins in lymphoretikulären Geweben von Personen, infiziert mit vCJD, zu der Besorgnis geführt, daß vCJD durch Blutprodukte übertragen werden kann.
- Eine Risikoanalyse, beauftragt durch das UK Department of Health, schlußfolgerte, daß es ein theoretisches Risiko von vCJD, übertragen durch Plasmaderivate, hergestellt aus infizierten Spenden, gab.
- Beträchtliche Arbeit ist bei der Untersuchung von Prionen geleistet worden und allgemeine Hintergrundinformation wird in Stanley B. Prusiner et al. „Some Strategies and Methods for the Study of Prions" („Einige Strategien und Methoden für die Untersuchung von Prionen"), Kapitel 15, Prion Biology and Diseases (Biologie und Krankheiten von Prionen), 1999 Cold Spring Harbor Laboratory Press, bereitgestellt. Eine Bewertung des Potentials von Blutplasmafraktionierungsverfahren, um die verursachenden Mittel von übertragbarer spongiformer Enzephalopathie (TSE), wie beispielsweise CJD oder vCJD, zu entfernen, ist in P. R. Foster, Transfusion Medicine, 1999, 9, 3–14 gegeben, und ein Überblick über Prione and Blutprodukte ist in P. R. Foster, Annals of Medicine 2000; 32: 501–513 gegeben. Die Arbeit, dargestellt in P. R. Foster et al., Vox Sang 2000; 78, 86–95, identifizierte Tiefenfiltration, besonders unter Verwendung eines Tiefenfilters Seitz KS80, als besonders wirksam beim Entfernen von Prionen-Proteinen aus Blutplasmafraktionierungsströmen. Andere Versuche, Prionen-Proteine zu entfernen, sind in der Patentanmeldung PCT/FR97/00465, welche eine Kombination von elektrostatischer Adsorption und Chromatographie anwendet; und in der US-Patentschrift 5808011, welche Prionen-Infektiosität aus einer Lösung durch Adsorption des Prions auf eine Chromatographiesäule durch Verwendung eines pH-Gradienten entfernt, beschrieben.
- So bleibt, wenn es auch ein wachsendes Verständnis der Wege gibt, auf welchen Prionen aus Verfahrensströmen, besonders den an der Blutfraktionierung beteiligten, entfernt werden können, das Schicksal der Prionen-Infektiosität unbestimmt. So gibt es ein ernsthaftes Risiko, daß Prionen-Agenzien, immobilisiert auf Chromatographiesäulen während der Verarbeitung eines Ansatzes von Blutplasma, während der Verarbeitung nachfolgender Ansätze verbleiben können, was zu möglicher Kontamination davon führt. Es ist daher wichtig, imstande zu sein, mit Sicherheit zu wissen, daß wiederverwendbare Chromatographiesäulen (welche eine Wiederverwendungslebenszeit von mehreren Jahren haben können) am Ende des Durchlaufes jedes Ansatzes zuverlässig von Prionen-Infektiosität gesäubert werden können. Weiterhin gibt es eine Besorgnis, daß andere medizinische oder chirurgische Substrate, wie beispielsweise chirurgische Instrumente, ebenfalls beim Übertragen von CJD wirksam sein können. Flechsig, E., et al., Mol. Med Oktober 2001; 7(10): 679–684 berichten, daß Prionen leicht und fest an Edelstahloberflächen gebunden werden und daß Elektroden, intrazerebral bei CJD-Patienten verwendet, trotz versuchter Desinfektion die Krankheit auf zwei weitere Patienten und schließlich auf einen Schimpansen übertrugen. Das UK Department of Health hat auch das Risiko von Prionen-Infektiosität, übertragen auf Patienten über Instrumente, verwendet in der Chirurgie und anderen invasiven medizinischen Prozeduren, bewertet, wobei geschlußfolgert wurde, daß „variant and sporadic CJD may be transmitted on surgical instruments" („variante und sporadische CJD auf chirurgischen Instrumenten übertragen werden kann") und „current procedures for decontaminating surgical instruments between uses cannot be guaranteed to eliminate the abnormal prion proteins that are thought to be responsible for the transmission of CJD." („nicht garantiert werden kann, daß gegenwärtige Verfahrensweisen zum Dekontaminieren chirurgischer Instrumente zwischen Verwendungen die abnormalen Prionen-Proteine beseitigen, von denen man denkt, daß sie für die Übertragung von CJD verantwortlich sind") (CJD Incidents Panel. Management of possible exposure to CJD through medical procedures: a consultation paper. (Gremium zum Auftreten von CJD. Management von möglichem Kontakt mit CJD durch medizinische Prozeduren: ein Konsultationspapier) Department of Health Publications, Oktober 2001).
- In ähnlicher Weise gibt es die Besorgnis, daß Prionen-Krankheiten während einer Augenoperation übertragen werden können, da ophthalmische Instrumente nach dem Säubern mit Debris kontaminiert bleiben können (Dinakaran S, Kayarkar VV. Eye 2002; 16: 281–284). Es gibt daher einen Bedarf, Substrate, beteiligt an medizinischen oder chirurgischen Prozeduren an Patienten, zuverlässig zu säubern, um die Übertragung von mit Prionen zusammenhängender Krankheit zu vermeiden.
- Wir haben jetzt überraschenderweise gefunden, daß die Verwendung konzentrierter Lösungen von Salzen, wie beispielsweise Natriumchlorid, wirksam beim Eluieren oder vollständigen Entfernen adsorbierter Prionen-Infektiosität ist.
- So stellt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Säubern eines Substrats, um adsorbierte Prionen-Infektiosität zu entfernen, bereit, wobei das Substrat ein chromatographisches Material ist; welches Waschen des Substrats mit einer konzentrierten Salzlösung einer Konzentration von mindestens 1,5 M umfaßt, wobei das Salz Natriumchlorid ist.
- So ist gefunden worden, daß Waschen des Substrats, im besonderen einer chromatographischen Säule, mit einer Salzlösung einer Konzentration von mindestens 1,5 M, insbesondere 1,75 M und vorzugsweise mindestens 2,0 M, wirksam beim Entfernen adsorbierter Prionen-Infektiosität ist. Es war ein überraschendes Ergebnis für uns, daß die Prionen-Infektiosität herkömmlichem Ionenaustauschverhalten mit einer Anionenaustauschmatrix zu folgen schien und durch hohe Salzkonzentrationen eluiert werden konnte. Tatsächlich ist dies so unerwartet, daß unser anfängliches Versuchsprotokoll nicht zum Messen von Niveaus der Prionen-Infektiosität, eluiert mit den Salzwaschungen, optimiert war.
- Das Säuberungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann angewendet werden, um Substrate, beteiligt an der Fraktionierung von humanem Plasma, zu behandeln, wie beispielsweise bei P. R. Foster, Transfusion Medicine, 1999, 9, 3–14, beschrieben ist, besonders die Herstellung von Plasmaprodukten einschließlich Albumin, Immunoglobuline, Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Thrombin, Faktor VIII, Fibrinogen, von-Willebrand-Faktor, anti-Thrombin III, alpha-1-Antitrypsin, Faktor XIII, C1-Inhibitor, Transferrin und Mannose bindendes Lectin. Das an der Fraktionierung beteiligte chromatographische Substrat ist gewöhnlich ein Adsorbens des Typs, verwendet für die Reinigung von Proteinen oder anderen Makromolekülen in einem Füllkörperbett, einer Chromatographiesäule oder einem anderen Format (z.B. chargenweise oder fluidisierte Adsorption). Die Erfindung kann auch bei der Herstellung anderer biopharmazeutischer Zubereitungen, hergestellt aus tierischen Substanzen, einschließlich transgenen oder anderen genetisch modifizierten Materials, oder wo vom Menschen oder Tier abgeleitete Substanzen in dem Herstellungsprozeß verwendet werden, wie beispielsweise in einer Säugerzellkultur, angewendet werden.
- Das Verfahren wird im allgemeinen bei Raumtemperatur ausgeführt, aber kann auch bei einer beliebigen Temperatur angewendet werden, die mit dem betreffenden Substrat und Salz verträglich ist, z.B. in dem Temperaturbereich 0°C bis 30°C.
- Das Verfahren kann einen oder mehrere Waschschritte einschließen. Um totaler Prionen-Entfernung sicher zu sein, wird es bevorzugt, unter Verwendung der konzentrierten Salzlösung einen zweiten und gegebenenfalls nachfolgenden Waschschritt zu verwenden. Die Waschlösung kann gewonnen und auf Prionen-Infektiosität getestet werden.
- Dem Waschen mit konzentriertem Salz kann ein weiterer Waschschritt folgen, angewendet als Alkali (wie beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid; oder die analogen Carbonate oder Bicarbonate), im allgemeinen mit einer Konzentration von 0,05 bis 0,5 M. Typischerweise bringt dies den pH auf mindestens 12. Vorzugsweise wird das Substrat bei diesem pH für 0,5 bis 2 Stunden einweichen gelassen. Ein oder mehrere Alkaliwaschschritte können angewendet werden; vorzugsweise abwechselnd mit Waschungen mit konzentriertem Salz.
- Das chromatographische Substrat ist im allgemeinen eine Ionenaustauschersäule des Typs, der herkömmlicherweise bei der Blutplasmafraktionierung verwendet wird, aber kann auch chromatographische Medien einschließen, die in der Affinitätschromatographie, Größenausschlußchromatographie, Immunoaffinitätschromatographie und hydrophoben Interaktionschromatographie verwendet werden (Burnouf T. Chromatography in plasma fractionation: benefits and future trends (Chromatographie bei der Plasmafraktionierung: Vorteile und zukünftige Trends). J Chromatography B 1995; 664: 3–15). Außerdem kann die Erfindung verwendet werden, um Membransysteme zu behandeln, um vor der Wiederverwendung einer Membran, wie beispielsweise bei der Reinigung oder Formulierung von Proteinen durch Ultrafiltration oder durch Diafiltration, Prionenkontamination zu entfernen.
- Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden jetzt nur durch ein Beispiel in der folgenden experimentellen Arbeit beschrieben, welche sich auf die angefügte
1 bezieht. - DESORPTION VON PRIONEN AUS FESTEN PHASEN
- BEISPIEL
- HERSTELLUNG EINER MIKROSOMALEN FRAKTION VON BSE 301V ALS DEM 'SPIKING' (SPICKENDEN) INOKULUM
- Um das Partitionierungsverhalten von Prionen zu untersuchen, wurde ein Aliquot des infektiösen Materials in der Form einer mikrosomalen Fraktion, abgeleitet von BSE-infiziertem Mäusehirn, in die Ausgangs-Faktor-VIII-Lösung gegeben. Die Verfahrensweise für die Herstellung des mikrosomalen Inokulums basierte auf dem Verfahren von Millson et al. (Millson GC, Hunter GD, Kimberlin RH. An experimental examination of the scrapie agent in cell membrane mixtures. (Eine experimentelle Untersuchung des Scrapie-Agens in Zellmembrangemischen). II. The association of scrapie activity with membrane fractions (Die Verbindung von Scrapie-Aktivität mit Membranfraktionen). J Comp Path 1971; 81: 255–265).
- Hirngewebe (3 g), entnommen spät in der klinischen Phase der Krankheit von Inzucht-VM-Mäusen, infiziert mit Mäuse-passagiertem BSE (Stamm 301V), wurde in 27 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert, in einem Dounce-Homogenisierer homogenisiert und mit 2000 U/min für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml PBS resuspendiert und unter den gleichen Bedingungen wieder zentrifugiert. Die aus beiden Prozeduren gewonnen Überstände wurden gesammelt und mit 10000 g für 7 Minuten zentrifugiert, um ungebrochene Zellen, große Fragmente von Zellen, Mitochondrien und Zellkerne zu sedimentieren. Der durchscheinende Überstand wurde sorgfältig entfernt und mit 100000 g für 1 h bei 4°C zentrifugiert, um die mikrosomale Fraktion zu sedimentieren. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 30 ml PBS resuspendiert, um das Inokulum zum 'Spiking' der Ausgangs-Faktor-VIII-Lösung bereitzustellen.
- IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
- Mikrosomales Inokulum (10 ml) wurde in eine Lösung von Faktor VIII (102,7 ml) von intermediärer Reinheit, enthaltend 20 mM Trinatriumcitrat, 2,5 mM Calciumchlorid, 109 mM Natriumchlorid und 4,5% Gew./Vol. Saccharose, gegeben. Polysorbat-80 und Tri(n-butyl)phosphat wurden dann in die Lösung gegeben, um Konzentrationen von 1% Vol./Vol. bzw. 0,3% Vol./Vol. zu erhalten, und das resultierende Gemisch (108,6 ml) wurde vor der Verarbeitung durch Ionenaustauschchromatographie bei 25 ± 1°C für 18 h gerührt.
- Das Ionenaustauschverfahren basierte auf dem Verfahren von Burnouf et al. (Burnouf T., Burnouf-Radosevich M., Huart J. J., Goudemand M. A highly purified Factor VIII:c concentrate prepared from cryoprecipitate by ion-exchange chromatography (Ein hochgereinigtes Faktor-VIII:c-Konzentrat, hergestellt aus Kryopräzipitat durch Ionenaustauschchromatographie). Vox Sang 1991; 60: 8–15). 14 ml DEAE-Toyopearl 650M (TosohBiosep GmbH, Stuttgart, Deutschland) wurden unter Verwendung von 2 M Natriumchlorid in eine Säule mit 10 mm Durchmesser (C10/20, Pharmacia, Upsala, Schweden) gepackt und mit 130 ml Puffer, enthaltend 120 mM Glycin, 16 mM Lysin, 10 mM Trinatriumcitrat, 1 mM Calciumchlorid und 110 mM Natriumchlorid, bei pH 7,0 äquilibriert.
- Lösungsmittel-Detergens-behandelte Faktor-VIII-Lösung (98,6 ml) wurde auf die Säule aufgebracht, gefolgt von 42 ml Äquilibrierungspuffer, und die (unadsorbierte) Durchbruchfraktion (139,8 ml) wurde gesammelt (Fibrinogen-Fraktion). 41 ml Äquilibrierungspuffer, erhöht auf 145 mM Natriumchlorid, wurden dann aufgebracht, und die resultierende Fraktion wurde gesammelt (von-Willebrand-Faktor-Fraktion). Diesem folgten 26 ml Äquilibrierungspuffer, erhöht auf 250 mM Natriumchlorid, was verwendet wurde, um Faktor VIII zu eluieren (Faktor-VIII-Fraktion).
- Nach der Sammlung des Faktor-VIII-Eluats wurde das Chromatographiebett mit Lösungen von 2 M Natriumchlorid, 0,1 M Natriumhydroxid und wieder mit 2 M Natriumchlorid behandelt, mit dem Ziel, Proteine und andere Materialien (z.B. Lipide) zu entfernen, welche an die Ionenaustauschmatrix gebunden blieben. Das Ausmaß, zu welchem Prionen-Infektiosität durch eine von diesen Verfahrensweisen entfernt werden könnte, war nicht bekannt. Daher wurden Proben dieser Fraktionen zur Analyse gesammelt, ebenso wie die Produkteluate. Zuerst wurden 25 ml 2 M Natriumchlorid auf die Säule aufgebracht und das Eluat (15,5 ml) wurde vom Beginn der 'Salzfront' (Erste Waschung mit NaCl) gesammelt. Nachfolgend wurde 0,1 M Natriumhydroxid (70 ml) auf die Säule aufgebracht und ein Eluat (39 ml) gesammelt, wenn der pH von 6,3 bis > 12 zunahm (Waschung mit NaOH). Wenn die Aufbringung von 0,1 M Natriumhydroxid vollständig war, wurde die Säule in Natriumhydroxid für eine Stunde einweichen gelassen und dann einer zweiten Waschung mit 2 M Natriumchlorid (42 ml) unterworfen. Ein Eluatvolumen von 8,1 ml wurde gesammelt, um das in diesem Stadium eluierte Protein zu fangen (Zweite Waschung mit NaCl).
- BESTIMMUNG VON PROTEIN, DAS WÄHREND DES IONENAUSTAUSCHPROZESSES ELUIERT WIRD
- Während der Ionenaustauschprozedur wurde der Ausstoß aus der Säule kontinuierlich durch Messung der optischen Dichte der Lösung in der Anlage bei einer Wellenlänge von 280 nm (OD280) überwacht, um Protein (und anderes OD280-absorbierendes Material) nachzuweisen, das eluiert wird. Das erhaltene OD280-Profil wird in
1 gezeigt. -
1 zeigt die optische Dichte der Lösung, die aus der Ionenaustauschchromatographie von Faktor-VIII-Lösung intermediärer Reinheit, gespickt mit mikrosomaler BSE-301V-Fraktion, eluiert wird. a = Fibrinogen-Fraktion (110 mM NaCl); b = von-Willebrand-Faktor-Fraktion (145 mM NaCl); c = Faktor-VIII-Fraktion (250 mM NaCl); d = Erste Waschung mit Natriumchlorid (2 M NaCl); e = Waschung mit Natriumhydroxid (0,1 M NaOH); f = Zweite Waschung mit Natriumchlorid (2 M NaCl). - Desorption von Protein (oder anderem bei OD280 absorbierenden Material) wurde so beobachtet während:
der Elution der Fibrinogen-Fraktion (mit 110 mM NaCl),
der Elution der von-Willebrand-Faktor-Fraktion (mit 145 mM NaCl),
der Elution der Faktor-VIII-Fraktion (mit 250 mM NaCl),
bei der Ersten Waschung mit Natriumchlorid (mit 2 M NaCl),
bei der Waschung mit Natriumhydroxid (0,1 M NaOH) und
bei der Zweiten Waschung mit Natriumchlorid (mit 2 M NaCl). - Material, eluiert während der ersten Waschung mit 2 M Natriumchlorid, wurde nachfolgend erzeugt, um hohe Prionen-Infektiosität zu haben.
- BESTIMMUNG VON BSE INFEKTIOSITÄT
- Die BSE-Infektiosität von Proben aus dem Ionenaustauschprozeß wurde durch einen Bioassay, ausgeführt am Institute of Animal Health, West Mains Road, Edinburgh, UK, bestimmt. Proben für den Assay wurden in Kochsalzlösung verdünnt und intrazerebral in entwöhnte VM-Mäuse injiziert. Die Tiere wurden sorgfältig für bis zu 547 Tagen beobachtet und für klinische Anzeichen bewertet, wie von Dickinson et al. beschrieben wurde (Dickinson AG, Meikle VM, Fraser IH. Identification of a gene which controls the incubation period of some strains of scrapie agent in mice (Identifizierung eines Gens, welches die Inkubationszeit einiger Stämme von Scrapie-Agens bei Mäusen steuert). J Comp Path 1968; 78: 293–299). BSE-Infektion bei Mäusen mit klinischen Symptomen wurde durch histopathologische Untersuchung auf Hirnvakuolisierung, spezifisch für Prionen-Krankheiten, bestätigt, wie von Bruce beschrieben wurde (Bruce ME. Strain typing studies of scrapie and BSE (Studien zur Stammtypisierung von Scrapie und BSE); in Baker H, Ridley RM, Hrsg.: Methods in Molecular Medicine: Prion Diseases (Methoden in der Molekularmedizin: Prionenkranheiten). Totowa, New Jersey, Humana Press, 1996, S. 223–236).
- ERGEBNISSE
- Die Anzahl von Mäusen, infiziert mit BSE bei verschiedenen Probenverdünnungen, ist in Tabelle 1 angegeben, zusammen mit der für die zu beobachtende Infektion gebrauchten Zeit (mittlere Inkubationszeit). Sowohl das ursprüngliche mikrosomale Inokulum als auch das 'gespickte' Faktor-VIII-Ausgangsmaterial (vor der Zugabe von Lösungsmittel/Detergens) zeigten einen hohen Grad von Infektiosität entsprechend dem Anteil infizierter Mäuse und der relativ kurzen mittleren Inkubationszeit (d.h. 131 Tage bzw. 135 Tage bei 10–2 Probenverdünnung). Nach Zugabe von Lösungsmittel/Detergens zeigte das Faktor-VIII-Ausgangsmaterial einen ähnlichen Grad von Infektiosität (Ergebnis nicht angegeben). Im Gegensatz dazu enthielten die Fibrinogen-Fraktion, die von-Willbrand-Faktor-Fraktion und die Faktor-VIII-Fraktion alle viel weniger Infektiosität, wobei die entsprechenden mittleren Inkubationszeiten von 204 Tagen, 194 Tagen und 166 Tagen in umgekehrter Beziehung zu der Natriumchloridkonzentration stehen, was anzeigt, daß Desorption dieser kleinen Menge von Prionen-Infektiosität herkömmlichem Verhalten für die Desorption von Proteinen von Anionenaustauschern folgte. Alle von den Mäusen, injiziert mit der Ersten Waschung mit NaCl, entwickelten mit einer relativ kurzen mittleren Inkubationszeit eine Infektion, was einen sehr hohen Grad von Prionen-Infektiosität in diesem Eluat demonstrierte. Danach wurde keine Infektiosität in Material, desorbiert von der Säule während entweder der Behandlung mit Natriumhydroxid oder der Zweiten Waschung mit NaCl, nachgewiesen, ungeachtet dessen, daß nach der Behandlung mit Natriumhydroxid weiteres Protein mit 2 M NaCl eluiert wird. Diese Werte demonstrieren deutlich die Wirksamkeit der ersten Waschung mit NaCl beim Entfernen von Prionen-Infektiosität, wobei das meiste von dieser an die feste Phase gebunden blieb, nachdem die Produktfraktionen eluiert worden waren.
- Außerdem demonstriert die nachfolgende Abwesenheit von BSE-Infektiosität nach Behandlung mit 0,1 M NaOH (entweder in der NaOH-Probe oder in der zweiten Waschung mit 2 M NaCl), daß eine Kombination von 2 M NaCl, gefolgt von 0,1 M NaOH, wirksam beim Entfernen aller Infektiosität war, die potentiell in der zweiten Waschung mit 2 M NaCl desorbiert worden sein könnte.
-
Claims (9)
- Verfahren zum Säubern eines Substrats, um adsorbierte Prionen-Infektiosität zu entfernen, wobei das Substrat ein chromatographisches Material ist; welches Waschen des Substrats mit einer konzentrierten Salzlösung einer Konzentration von mindestens 1,5 M umfaßt, wobei das Salz Natriumchlorid ist.
- Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat ein Adsorbens, verwendet bei der Reinigung von Proteinen oder anderen Makromolekülen, ist.
- Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Salzlösung eine Konzentration von mindestens 1,75 M hat.
- Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Verfahren angewendet wird, um ein Substrat, beteiligt an der Fraktionierung von humanem Plasma, zu säubern.
- Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei dem Waschen mit konzentriertem Salz Waschen mit einem Alkali folgt.
- Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Alkali eine Konzentration von 0,05 bis 0,5 M hat.
- Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Alkali den pH in dem Substrat auf mindestens 12 bringt.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei das Substrat mit dem Alkali für 0,5 bis 2 Stunden in Kontakt gebracht wird.
- Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, umfassend ein weiteres Waschen mit konzentriertem Salz.
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