CN101356186A - 朊病毒-特异性拟肽试剂 - Google Patents

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CN101356186A CNA2006800331296A CN200680033129A CN101356186A CN 101356186 A CN101356186 A CN 101356186A CN A2006800331296 A CNA2006800331296 A CN A2006800331296A CN 200680033129 A CN200680033129 A CN 200680033129A CN 101356186 A CN101356186 A CN 101356186A
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Abstract

本发明涉及相比构象疾病蛋白的非致病形式优先与构象疾病蛋白的致病形式相互作用的拟肽试剂，其中，所述拟肽试剂包含氨基－末端区域、羧基－末端区域、和至少一个位于所述氨基－末端区域和所述羧基－末端区域之间的拟肽区域，其中所述拟肽区域包含3至约30个N－取代的甘氨酸和任选的一个或多个氨基酸。本发明还涉及将所述拟肽用于检测和分离朊病毒以及用于治疗和预防朊病毒－相关疾病的方法。

Description

朊病毒-特异性拟肽试剂
发明领域
本发明涉及用于检测和分离朊病毒以及用于治疗和预防朊病毒-相关疾病的拟肽试剂。本发明还涉及包含该拟肽试剂的复合物、组合物和试剂盒以及它们的制备方法。
发明背景
朊病毒蛋白(PrPC)是一种功能不确定的33-35kD蛋白质，在人类中，它由染色体20短臂上的基因转录。27-30kD的蛋白酶-抗性核心(朊病毒、羊搔痒症蛋白、或PrPSc)是其功能性组分，它的一些同种型造成了“朊病毒病”(属于蛋白质构象疾病)。
蛋白质构象疾病源自于蛋白质(构象疾病蛋白，如PrPC)的构象转变异常，进而导致异常蛋白质形式(例如，PrPSc)自发结合从而造成组织沉积和损伤。朊病毒(PrPSc)具有基本呈褶状的片层构象而非正常PrPC的α-螺旋结构，缺乏可检测的核酸，且通常不引发免疫应答。通常，蛋白质构象疾病在临床表现上惊人相似，通常经历时间长度不同的潜伏期后从诊断快速发展为死亡。
在人类中，朊病毒疾病-也称为“传染性海绵样脑病”(TSE)-包括克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、Gerstmann-Straussler-Scheinker综合征(GSS)、致命性家族性失眠症和库鲁病(参见，例如，Isselbacher等编，1994，Harrison′s Principles of InternalMedicine(哈里森内科学原理)，纽约麦基山公司(New York：McGraw-Hill，Inc.)；Medori等，(1992)N.Engl.J.Med.326：444-9)。在动物中，TSE包括绵羊搔痒症、牛海绵样脑病(BSE)、传染性水貂脑病和捕获的黑尾鹿和麇鹿的慢性消耗性疾病(Gajdusek，(1990)，Subacute Spongiform Encephalopathies：Transmissible Cerebral AmyloidosesCaused by Unconventional Viruses(亚急性海绵样脑病：非寻常病毒导致的传染性大脑淀粉样变性)，刊于Fields编的Virology(病毒学)第2289-2324页，纽约莱文出版社公司(Raven Press，Ltd.))。传染性海绵样脑病的特征是有相同的特点：存在构象异常的朊病毒蛋白(富含β-折叠(beta-rich)，蛋白酶K耐受)，当将其接种于实验动物(包括灵长类动物、啮齿类动物和转基因小鼠)中时能传染疾病。
近年来，BSE的快速传播及其与人TSE发生率升高有关导致对检测非人哺乳动物TSE的兴趣明显上升。偶然传染这些疾病的悲剧性后果(参见，例如Gajdusek，Infectious Amyloids，and Prusiner Prions(传染性淀粉样变性和Prusiner朊病毒)，刊于Fields等编的Fields Virology(菲尔兹病毒学)，利雷出版社(Lippincott-Ravin，Pub.)，费城，(1996)；Brown等，(1992)，Lancet，340：24-27)、消除污染困难(Asher等，(1986)，第59-71页，刊于Miller编的Laboratory Safety：Principles and Practices(实验室安全：原理和规范)，第59-71页，Am.Soc.Microb.)和对BSE的关注(British Med.J.(1995)311：1415-1421)迫切需要建立能鉴定患TSE的人和动物的诊断检验及受感染对象的治疗方法。
朊病毒与细菌、病毒和类病毒差别显著。主要的假说是它与所有其它传染性病原体不同，朊病毒蛋白的异常构象导致了感染，该蛋白起着模板作用并将正常朊病毒构象转变为异常构象。20世纪80年代早期首次表征了朊病毒蛋白(参见，例如Bolton，McKinley等，(1982)，Science，218：1309-1311；Prusiner，Bolton等，(1982)，Biochemistry，21：6942-6950；McKinley，Bolton等，(1983)，Cell，35：57-62)。自那时起已克隆、测序并在转基因动物中表达了完整的朊病毒蛋白编码基因。(参见，例如Basler，Oesch等，(1986)，Cell，46：417-428)
朊病毒疾病的关键特征是正常形式的朊病毒蛋白(细胞性或非致病性，PrPC)形成了形状异常的蛋白(PrPSc)。参见，例如Zhang等，(1997)，Biochem.，36(12)：3543-3553；Cohen和Prusiner，(1998)，Ann Rev.Biochem.，67：793-819；Pan等，(1993)，Proc NatlAcad Sci USA，90：10962-10966；Safar等，(1993)，J Biol Chem，268：20276-20284。光谱学和晶体学研究表明与主要为α-螺旋折叠非疾病形式相比，PrPSc基本上是β-片层结构。参见，例如Wille等，(2001)，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，99：3563-3568；Peretz等，(1997)，J.Mol.Biol.，273：614-622；Cohen和Prusiner，第5章：Structural Studiesof Prion Proteins(朊病毒蛋白的结构研究)，刊于S.Prusiner编的PRION BIOLOGYAND DISEASES(朊病毒生物学和疾病)，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社，1999，第191-228页)。看来结构发生变化后生化特性也改变：PrPC可溶于非变性洗涤剂，PrPSc不可溶；蛋白酶易消化PrPC，而PrPSc部分耐受，形成称为“PrPres”(Baldwin等，(1995)；Cohen和Prusiner，(1995))、“PrP 27-30”(27-30kDa)或“PK-耐受”(蛋白酶K耐受)形式的氨基-末端截短片段。此外，PrPSc可将PrPC转变为致病性构象。参见，例如Kaneko等，(1995)，Proc.Nat′l Acad.Sci USA，92：11160-11164；Caughey，(2003)，Br Med Bull.，66：109-20。
已证实难于在活对象中和从活对象取得的样品中检测到构象疾病蛋白的致病性同种型。因此，在对象死亡前对这些传染性和含淀粉样蛋白的疾病的明确诊断和治标疗法基本上是仍未解决的难题。脑组织活检的组织病理学检验对于对象有风险，可能会因活组织检查样品的获取部位而错失检测到病损和淀粉样沉积。而且，风险还涉及活组织检查的动物、患者和卫生保健人员。此外，除非动物已变为食物供应，否则通常不能获得动物脑检验的结果。另外，产生的大多数抗朊病毒肽抗体通常能识别变性的PrPSc和PrPC，但不能识别传染性(未变性的)PrPSc。(参见，例如Matsunaga等，(2001)，PROTEINS：Structure，Function and Genetics(蛋白质：结构、功能和遗传学)，44：110-118)。
可用许多TSE检验(参见，Soto，C.，(2004)，Nature Reviews Microbiol.，2：809；Biffiger等，(2002)，J.Virol.Meth.，101：79；Safar等，(2002)，Nature Biotech.，20：1147；Schaller等，Acta Neuropathol.，(1999)，98：437；Lane等，(2003)，Clin.Chem.，49：1774)。然而，所有这些检验利用脑组织样品并只适用于死后检验。大多数这些检验也需要用蛋白酶K处理样品，这样做耗时，PrPC消化不完全可导致假阳性结果以及消化对蛋白酶敏感的PrPSc可导致假阴性结果。
因此，需要能检测各种样品，例如取自血液供给，农用动物和其它人和动物食品供给的活对象的样品中是否存在致病性朊病毒蛋白的组合物和方法。此外，需要能诊断和治疗朊病毒相关疾病的方法和组合物。本发明涉及这些以及其他的重要内容。
发明概述
本发明涉及相比构象疾病蛋白如朊病毒蛋白的非致病形式优选与其致病形式相互作用的拟肽试剂，该试剂具有以下结构式：
Xa-(Q)nXb
式中：
各Q独立为氨基酸或N-取代的甘氨酸，而-(Q)n-定义了拟肽区域；
Xa是H、(C1-C6)烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、(C1-C6)酰基、氨基(C1-6)酰基、氨基酸、氨基保护基、或含有2至约100个氨基酸的多肽，其中，Xa任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代；
Xb是H、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、(C1-C6)烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羧基保护基、氨基酸、或含有2至约100个氨基酸的多肽，其中，Xb任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代；和
n是3至约30；
其中，至少约50％的拟肽区域-(Q)n-包含N-取代的甘氨酸。
本发明还涉及在生理相关pH下是多离子的并具有净电荷的拟肽试剂。一些实施方式中，拟肽试剂在生理相关pH下带有净正电荷，如至少3+或至少4+电荷。所述净电荷可来源于拟肽区域的一个或多个N-取代的甘氨酸。
本发明还涉及相比构象疾病蛋白的非致病形式优先与构象疾病蛋白的致病形式相互作用的拟肽试剂，其中所述试剂包含氨基-末端区域、羧基-末端区域、和至少一个位于所述氨基-末端区域和所述羧基-末端区域之间的拟肽区域，其中所述拟肽区域包含3至约30个N-取代的甘氨酸和任选的一个或多个氨基酸。
本发明还提供了一种相比构象疾病蛋白的非致病形式优先与构象疾病蛋白的致病形式相互作用的拟肽试剂，其中所述试剂包含含有3-15个毗连的N-取代甘氨酸的拟肽区域，且其中所述拟肽区域在生理相关pH下带有净电荷。一些实施方式中，所述净电荷是净正电荷，如在生理相关pH下具有至少3+或至少4+净电荷。一些实施方式中，所述拟肽试剂在生理相关pH下具有2+至6+、3+至5+、或4+净电荷。
本发明的拟肽试剂可用于诸多应用，包括作为分离致病性朊病毒或检测样品中的致病性朊病毒的工具、作为治疗性或预防性组合物的组分和/或用于产生朊病毒-特异性抗体。例如，相比PrPC优先与PrPSc相互作用的拟肽试剂可用于直接检测获自活的或曾经活的对象的样品中的致病形式，例如，用以诊断疾病或者用以筛选捐献的血液样品或筛选用于器官捐献的器官。本发明的拟肽试剂可用于特异性结合样品中的任何PrPSc从而形成复合物。该复合物可通过诸如UV/可见光谱学、FTIR、核磁共振波谱法、拉曼光谱、质谱、HPLC、毛细管电泳、表面等离振子共振谱、微-电-机械系统(MEMS)的方法直接检测，或者可通过使其他朊病毒-特异性试剂(例如，第二拟肽试剂或朊病毒-结合试剂(如文中所定义))与复合物中的或复合物解离后产生的PrPSc结合来检测。
因此，本发明涉及一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括在允许所述拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成复合物，并检测该复合物的形成，该复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。
检测样品中的致病性朊病毒的方法还可包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成第一复合物，在允许本发明第二拟肽试剂与第一复合物中的致病性朊病毒结合的条件下使第一复合物接触任选可检测标记的所述第二拟肽试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。
在进一步的实施方式中，所述方法包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去任何未结合样品，在允许本发明第二拟肽试剂与第一复合物中的致病性朊病毒结合的条件下使第一复合物接触任选可检测标记的所述第二拟肽试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。第一拟肽试剂任选包含辅助第一复合物与未结合样品分离的固相支持体。
此外，本发明的检测方法可包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去未结合样品，从第一复合物中解离出致病性朊病毒从而提供解离的致病性朊病毒，在允许本发明第二拟肽试剂与解离的致病性朊病毒结合的条件下使解离的致病性朊病毒接触任选可检测标记的所述第二拟肽试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。
检测样品中的致病性朊病毒的方法还可包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成第一复合物，在允许朊病毒-结合试剂与第一复合物中的致病性朊病毒结合的条件下使第一复合物接触任选可检测标记的朊病毒-结合试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。
在进一步的实施方式中，所述方法包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去任何未结合样品，在允许朊病毒-结合试剂与第一复合物中的致病性朊病毒结合的条件下使第一复合物接触任选可检测标记的朊病毒-结合试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在致病性朊病毒。第一拟肽试剂任选包含辅助第一复合物与未结合样品分离的固相支持体。
此外，本发明的检测方法可包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去未结合样品，从第一复合物中解离出致病性朊病毒从而提供解离的致病性朊病毒，在允许朊病毒-结合试剂与解离的致病性朊病毒结合的条件下使解离的致病性朊病毒接触任选可检测标记的朊病毒-结合试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。
在进一步的实施方式中，本发明的检测方法可包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明的第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去未结合样品，从第一复合物中解离出致病性朊病毒从而提供解离的致病性朊病毒，在允许朊病毒-结合试剂与解离的致病性朊病毒结合的条件下使解离的致病性朊病毒接触朊病毒-结合试剂以形成第二复合物，并采用任选可检测标记的第二朊病毒-结合试剂检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。
此外，检测方法可包括在允许朊病毒-结合试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触朊病毒-结合试剂以形成第一复合物，除去未结合样品，在允许所述拟肽试剂与第一复合物中致病性朊病毒结合的条件下使所述复合物接触任选可检测标记的本发明拟肽试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。所述朊病毒-结合试剂任选提供在固相支持体上。再者，所述检测方法可包括提供包含本发明拟肽试剂的固相支持体，在允许可检测标记的配体结合拟肽试剂的条件下混合所述固相支持体与可检测标记的配体以形成第一复合物，其中所述支持体上的拟肽试剂对配体的结合亲和力弱于对致病性朊病毒的，在允许样品中如果存在的致病性朊病毒与第一复合物中的拟肽试剂结合的条件下混合样品与第一复合物，从而替代了所述第一复合物中可检测标记的配体并形成包含所述拟肽试剂和所述致病性朊病毒的第二复合物，检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。
本发明还提供了检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使样品接触本发明第一拟肽试剂以形成复合物，除去复合物中未结合的样品，从所述复合物中解离所述致病性朊病毒从而提供解离的致病性朊病毒，在允许所述解离的致病性朊病毒附着于第二固相支持体的条件下使所述解离的致病性朊病毒接触第二固体支持体；并用任选可检测标记的朊病毒-结合试剂检测附着的解离的致病性朊病毒，其中，所述朊病毒-结合试剂的结合表明存在所述致病性朊病毒。一些实施方式中，通过使所述复合物接触高pH或低pH进行所述解离。一些实施方式中，该方法还包括在所述解离之后中和所述高pH或所述低pH的步骤。一些实施方式中，解离的致病性朊病毒是变性的。
本发明还提供了检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使样品接触本发明第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去第一复合物中未结合的样品，从第一复合物中解离出致病性朊病毒从而提供解离的致病性朊病毒，在允许所述解离的致病性朊病毒与第一抗-朊病毒抗体结合的条件下使所述解离的致病性朊病毒接触第二固相支持体以形成第二复合物，其中所述第二固相支持体包含所述第一抗-朊病毒抗体；并用任选可检测标记的第二抗-朊病毒抗体检测所述第二复合物中所述解离的致病性朊病毒，其中，所述第二抗-朊病毒抗体的结合表明存在所述致病性朊病毒。一些实施方式中，通过使所述第一复合物接触高pH或低pH进行所述解离。一些实施方式中，该方法还包括在所述解离之后中和所述高pH或所述低pH的步骤。在进一步的实施方式中，所述解离的致病性朊病毒是变性的。
在所有上述采用朊病毒-结合试剂的方法中，所述朊病毒-结合试剂可以是，例如，抗-朊病毒抗体。
本发明还提供了治疗或预防动物的朊病毒-相关感染的方法。
本发明还涉及检测或分离样品中的朊病毒。
本发明还涉及提供基本不含朊病毒的样品供给，如血液或食品供给。
附图简述
图1.人血浆样品中PrPC的ELISA检测。图1A显示了表明血浆中含量增加的ELISA(RLU)测量结果。图1B显示了采用已知量的重组PrP蛋白获得的ELISA(RLU)测量结果的标准曲线。
图2.该图描绘了人(SEQ ID NO：1)和小鼠(SEQ ID NO：2)朊病毒蛋白的氨基酸序列。
图3.该图描绘了人(SEQ ID NO：3)、叙利亚仓鼠(仓鼠)(SEQ ID NO：4)、牛(SEQID NO：5)、绵羊(SEQ ID NO：6)、小鼠(SEQ ID NO：7)、麇鹿(SEQ ID NO：8)、扁角鹿(扁角)(SEQ ID NO：9)、黑尾鹿(黑尾)(SEQ ID NO：10)和白尾鹿(白)(SEQ IDNO：11)的朊病毒蛋白的比对。麇鹿、扁角鹿、黑尾鹿和白尾鹿彼此只在S/N128和Q/E226(黑体表示)这两个残基上有差别。
图4.该图描绘了vCJD和sCJD的变性曲线。
发明详述
定义
下文讨论本文所用的以下选择的术语。无论讨论何种形式都将包括复数和单数形式。
术语“朊病毒”、“朊病毒蛋白”、“PrP蛋白”和“PrP”可互换使用，指致病性朊病毒蛋白形式(各称为搔痒症蛋白、致病性蛋白形式、致病性同种型、致病性朊病毒和PrPSc)和非致病性朊病毒形式(各称为细胞蛋白形式、细胞同种型、非致病性同种型、非致病性朊病毒蛋白和PrPC)以及可能不具有致病性构象或正常细胞构象的朊病毒蛋白的变性形式或各种重组形式。
“构象疾病蛋白”指构象疾病相关蛋白质的致病或非致病蛋白形式，其中，蛋白质的结构被改变(例如，错误折叠或聚集)，从而导致异常构象，如β折叠片中出现不希望的原纤维或淀粉样聚合。构象疾病蛋白的例子包括但不限于：朊病毒蛋白如PrPSc和PrPC以及免疫球蛋白轻链可变区(VL)(为抗体分子的蛋白质组分)的氨基酸改变，它与淀粉样变性等构象疾病有关。疾病与估计有两种或多种不同构象的相关蛋白质的不完全列表如下。
 疾病   构象疾病蛋白
 朊病毒疾病(例如，克罗伊茨费尔特-雅各布病、搔痒症、牛海绵样脑病)   PrPSc
 阿尔茨海默病   APP，A*肽，*1-抗胰凝乳蛋白酶，tan，非-A*组分
 ALS   SOD和神经微丝
 皮克病   皮克体
 帕金森病   Lewy体
 I型糖尿病   胰岛淀粉样多肽
 多发性骨髓瘤-浆细胞不调症   IgGL-链
 家族性淀粉样多发性神经病(familial amyloidotic polyneuropathy)   运甲状腺素蛋白
 甲状腺髓样瘤   原降钙素
 慢性肾功能衰竭   B2-小球蛋白
 充血性心力衰竭   心房钠尿因子
 老年心脏和全身性淀粉样变性(senile cardiac and systemic amyloidosis)   运甲状腺素蛋白
 慢性炎症   血清淀粉样蛋白A
 动脉粥样硬化   ApoA1
 家族性淀粉样变性   凝溶胶蛋白
术语“朊病毒”、“朊病毒蛋白”、“PrP蛋白”、“PrP”或“构象疾病蛋白”的使用不限于具有本文所述确切序列的多肽。不难明白这些术语包括任何已鉴定或未鉴定的物种(例如，人、牛)或疾病(例如，阿耳茨海默病、帕金森病等)的构象疾病蛋白。也可参见以下名称均为“Prion-Specific Peptide Reagents(朊病毒-特异性肽试剂)”的共有专利申请：2004年8月13日提交的美国系列号10/917,646；2005年2月11日提交的美国系列号11/056,950；2004年8月13日提交的PCT申请PCT/US2004/026363，所有申请通过引用全文纳入本文。本领域普通技术人员通过本文和本领域的指导能采用例如序列比较程序(例如，局部序列比对基本检索工具(BLAST))或鉴定和比对结构特征或基序来确定任何其它朊病毒蛋白中对应于本文所述序列的区域。
“致病性”可表示蛋白实际上导致了疾病或表示该蛋白与疾病有关，因此存在疾病时即存在该蛋白。因此，本文所用的致病性蛋白不一定是作为疾病特定致病因子的蛋白。蛋白质的致病性形式可以是或不是传染性的。致病性构象疾病蛋白的一个例子是PrPSc。因此，术语“非致病性”描述了通常不造成疾病或者通常与造成疾病无关的蛋白质。非致病性构象疾病蛋白的一个例子是PrPC。
提及拟肽试剂与蛋白质如蛋白质片段相互作用时，“相互作用”表示拟肽试剂特异性地、非特异性地或以特异性和非特异性的某种组合结合于朊病毒蛋白。如果拟肽试剂与致病形式结合的亲和力和/或特异性大于非致病性同种型则称为“优先与致病性朊病毒蛋白相互作用”。优选与致病性朊病毒蛋白的拟肽试剂在文中也称为致病性朊病毒-特异性拟肽试剂。一些实施方式中，亲和力和/或特异性提高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约500倍或者至少约1000倍。应理解，优先相互作用不必要求各肽的具体氨基酸或氨基酸取代残基和/或基序之间相互作用。例如，一些实施方式中，本发明拟肽试剂优先与致病同种型相互作用，尽管如此，它仍能结合非致病性同种型，其水平较弱但仍可检测(例如，为与感兴趣多肽的结合的10％或更低)。通常，例如通过采用合适的对照，弱结合(或背景结合)不难与感兴趣化合物或多肽的优先相互作用相区分。通常，本发明拟肽能在有超过106倍的非致病形式存在下与致病性朊病毒结合。
“亲和力”或“结合亲和力”用于指拟肽试剂与构象疾病蛋白相互作用时的结合强度，其可用解离常数(Kd)量化表示。可用本领域的一般技术人员熟知的技术来确定结合亲和力。
“朊病毒-相关疾病”指完全或部分由致病性朊病毒蛋白(例如，PrPSc)导致的疾病，例如但不限于：搔痒、牛海绵样脑病(BSE)、疯牛病、猫海绵样脑病、库鲁病、克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、新变体克罗伊茨费尔特-雅各布病(nvCJD)、慢性消耗性疾病(CWD)、Gerstmann-Strassler-Scheinker病(GSS)和致命性家族性失眠症(FPI)。
术语“变性”或“变性的”当用于蛋白质结构时具有常规含义，表示蛋白质已经丧失其天然的二级和三级结构。就致病性朊病毒蛋白而言，“变性的”致病性朊病毒蛋白不再保留天然致病构象因此该蛋白质不再“致病”。变性的致病性朊病毒蛋白的构象类似于或等同于变性的非致病性朊病毒蛋白。然而，出于在文中清楚表示的目的，术语“变性的致病性朊病毒蛋白”用来指被拟肽试剂作为致病性同种型捕获且随后变性的致病性朊病毒蛋白。
“生理相关pH”指约5.5至约8.5；或约6.0至约8.0；或者通常约6.5至约7.5的pH。
“脂肪族”指直链或支链烃分子。脂肪族基团可包含杂原子和羰基部分。
“烷基”无论单独使用或作为其他基团的一部分均指脂肪族烃链，包括但不限于含有1-6、1-5、1-4或1-3个碳原子的直链和支链(烷基)，除非另有说明。例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基等都包括在术语“烷基”当中
“烯基”用来表示含有至少1个双键、例如2-7、2-6、2-5或2-4个碳原子的烷基，其中包括，例如但不限于，乙烯基，烯丙基，2-甲基-烯丙基，4-丁-3-烯基，4-己-5-烯基，3-甲基-丁-2-烯基等。
“炔基”用来表示含有至少1个碳碳三键、例如2-7、2-6、2-5或2-4个碳原子的烷基。示例性的炔基包括乙炔基、丙炔基等。
“烷氧基”无论是单独使用或作为其他基团的一部分都表示式-O-烷基的基团，例如，甲氧基，其中的烷基如文中所定义。
“卤代”或“卤素”当单独使用或作为其他基团的一部分时表示VII族元素，例如，F、Cl、Br和I。
“芳基”当单独使用或作为其他基团的一部分时表示例如有6-20、6-14或6-10个环碳原子的、例如有1、2或3个环的芳烃系统，其例子包括苯基、苄基、萘基、萘、蒽、菲基、蒽、芘基等。芳基的定义还包括含有一个或多个稠合的非芳香性碳环基或杂环基环的芳香系统，例如，1，2，3，4-四氢化萘和茚满。含有稠合的非芳香性环的芳基可通过芳香性部分或非芳香性部分连接。
“芳基-烷基”或“芳烷基”表示式-烷基-芳基的基团，其中芳基和烷基具有文中的定义。
“芳氧基”常规是指结构式为-O-芳基的基团，例如，羟基苯基，其中的芳基如文中所定义。
“芳烷氧基”常规是指结构式为-O-烷基-芳基的基团，例如，甲氧基苯基，其中的烷氧基和芳基如文中所定义。
“环烷基”无论是单独使用或作为其他基团的一部分其常规含义均为环状烷基、烯基或炔基，例如，3-10个碳原子的单环-、双环-、三-环的、稠合的、桥接的或螺环的饱和烃部分，例如环丙基。术语“环烷基-芳基”用来表示式-芳基-环烷基的基团，其中芳基和环烷基如文中所定义。“环烷基烷基”用来表示式-烷基-环烷基的基团，例如，环丙基甲基或环己基甲基，其中烷基和环烷基如文中所定义。
文中，“杂芳基”指含有至少1个杂环原子如硫、氧或氮的芳香性杂环。杂芳基包括单环和多环(例如，含有2、3或4个稠环)系统。杂芳基的例子包括但不限于：吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、吡咯基、噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、异噁唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、吲唑基、1，2，4-噻二唑基、异噻唑基、苯并噻吩基、嘌呤基、咔唑基、苯并咪唑基、二氢吲哚基等。一些实施方式中，杂芳基含有1至约20个碳原子，而在进一步的实施方式中含有约3至约20个碳原子。一些实施方式中，杂芳基含有3至约14、3至约7、或5-6个成环原子。一些实施方式中，杂芳基含有1至约4、1至约3、或1-2个杂原子。
文中，“杂环烷基”指包含环化的烷基、烯基和炔基，且其中有一个或多个成环碳原子被诸如O、N或S原子之类的杂原子替代的非芳香性杂环。示例性的“杂环烷基”包括吗啉代、硫代吗啉代、哌嗪基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、2，3-二氢苯并呋喃基、1，3-苯并间二氧杂环戊烯、苯并-1，4-二噁烷、哌啶基、吡咯烷基、异噁唑烷基、异噻唑烷基、吡唑烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、咪唑烷基等。杂环烷基的定义还包括具有与非芳香性杂环稠合(即共用一根键)的一个或多个芳环的部分，例如，邻苯二甲酰亚胺基、萘二甲酰亚胺基以及杂环如吲哚烯(indolene)和异吲哚烯(isoindolene)基的苯并衍生物。一些实施方式中，杂环烷基含有1至约20个碳原子，而在进一步的实施方式中含有约3至约20个碳原子。一些实施方式中，杂环烷基含有3至约14、3至约7、或5至6个成环原子。一些实施方式中，杂环烷基含有1至约4、1至约3、或1至2个杂原子。一些实施方式中，杂环烷基含有0至3个双键。一些实施方式中，杂环烷基含有0至2个双键或三键。
“杂芳基烷基”指结构式为-烷基-杂芳基的基团，其中烷基和杂芳基如文中所定义。
“酰基”指结构式为-C(O)-烷基的基团。一些实施方式中，酰基含有1-10、1-8、1-6、或1-4个碳原子。
“氨酰基”指结构式为-C(O)-烷基-氨基的基团，其中烷基如文中所定义。
“烷基氨基”指结构式为-NH-烷基的基团，其中烷基如文中所定义。
“二烷基氨基”指结构式为-N(烷基)2的基团，其中烷基如文中所定义。
“卤代烷基”指被一个或多个卤素取代的烷基，其中烷基和卤素如文中所定义。
“烷氧基烷基”指结构式为-烷基-烷氧基的基团，其中烷基和烷氧基如文中所定义。
“羧基烷基”指结构式为-烷基-COOH的基团，其中烷基如文中所定义。
“氨甲酰基”指结构式为-C(O)NH2的基团。
“氨甲酰基烷基”指结构式为-烷基-C(O)NH2的基团，其中烷基如文中所定义。
“胍基烷基”指结构式为-烷基-NHC(＝NH)NH2的基团，其中烷基如文中所定义。
“巯基(thiol)”指结构式为-SH的基团。
“烷硫基(alkylthiol)”指结构式为-S-烷基的基团，其中烷基如文中所定义。
“烷硫基烷基(alkylthioalkyl)”指结构式为-烷基-S-烷基的基团，其中烷基如文中所定义。
“咪唑基烷基”指结构式为-烷基-咪唑基的基团，其中烷基如文中所定义。
“哌啶基烷基”指结构式为-烷基-哌啶基的基团，其中烷基如文中所定义。
“萘基烷基”指结构式为-烷基-萘基的基团，例如(8’-萘基)甲基，其中萘基具有其常规含义，烷基如文中所定义。
“吲哚基烷基”指结构式为-烷基-吲哚的基团，例如3’-吲哚基乙基和3’-吲哚基甲基，其中吲哚具有其常规含义，烷基如文中所定义。
“含氮杂环基”是指含有至少1个成环N原子的任何杂芳基或杂环烷基。示例性的含氮杂环基包括吡啶基、咪唑基、哌啶基、哌嗪基、吡咯基、吲哚基，等等。
“含氮杂环基烷基”是指被含N杂环基烷基取代的烷基。
“氨基”和“伯氨基”指NH2。“仲氨基”指NHR，而“叔氨基”指NR2，其中的R是任何合适的取代基。
“铵”是指-N(R)3 +基团，其中的R可以是任何合适的部分，如烷基、环烷基、芳基、环烷基烷基、芳基烷基等。
“氨基酸”指20种天然形成并由基因编码的α-氨基酸中的任何一种或其受保护的衍生物。受保护的氨基酸衍生物可在氨基部分、羧基部分或侧链部分上含有一个或多个保护基。
氨基-保护基的例子包括：甲酰基，三苯甲基，苯二甲酰亚氨基，三氯乙酰基，氯乙酰基，溴乙酰基，碘乙酰基，以及尿烷类型的封端基团如苄氧基羰基，4-苯基苄氧基羰基，2-甲基苄氧基羰基，4-甲氧基苄氧基羰基，4-氟苄氧基羰基，4-氯苄氧基羰基，3-氯苄氧基羰基，2-氯苄氧基羰基，2，4-二氯苄氧基羰基，4-溴苄氧基羰基，3-溴苄氧基羰基，4-硝基苄氧基羰基，4-氰基苄氧基羰基，叔-丁氧基羰基，2-(4-联苯基)-异丙氧基羰基，1，1-二苯基乙-1-基氧基羰基，1，1-二苯基丙-1-基氧基羰基，2-苯基丙-2-基氧基羰基，2-(对-甲苯酰基)-丙-2-基氧基羰基，环戊烷基氧基-羰基，1-甲基环戊烷基氧基羰基，环己烷基氧基羰基，1-甲基环己烷基氧基羰基，2-甲基环己烷基氧基羰基，2-(4-甲苯酰基磺酰基)-乙氧基羰基，2-(甲基磺酰基)乙氧基羰基，2-(三苯基膦基)-乙氧基羰基，芴基甲氧基羰基(“FMOC”)，2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基，烯丙氧基羰基，1-(三甲基甲硅烷基甲基)丙-1-烯基氧基羰基，5-苯并异草酰甲氧基羰基，4-乙酰氧基苄氧基羰基，2，2，2-三氯乙氧基羰基，2-乙炔基-2-丙氧基羰基，环丙基甲氧基羰基，4-(癸基氧基(decycloxy))苄氧基羰基，异冰片基氧基羰基，1-哌啶基氧基羰基等；苯甲酰基甲基磺酰基，2-硝基苯基亚磺酰基，二苯基膦氧化物和类似的氨基-保护基。
羧基-保护基的例子包括：甲基，对-硝基苄基，对-甲基苄基，对-甲氧基苄基，3，4-二甲氧基苄基，2，4-二甲氧基苄基，2，4，6-三甲氧基苄基，2，4，6-三甲基苄基，五甲基苄基，3，4-亚甲二氧基苄基，二苯甲基，4，4’-二甲氧基二苯甲基，2，2’，4，4’-四甲氧基二苯甲基，叔丁基，叔戊基，三苯甲基，4-甲氧基三苯甲基，4，4’-二甲氧基三苯甲基，4，4’，4”-三甲氧基三苯甲基，2-苯基丙-2-基，三甲基甲硅烷基，叔丁基二甲基甲硅烷基，苯甲酰甲基，2，2，2-三氯乙基，β-(二(正丁基)甲基甲硅烷基)乙基，对-甲苯磺酰基乙基，4-硝基苄基磺酰基乙基，烯丙基，肉桂基，1-(三甲基甲硅烷基甲基)丙-1-烯-3-基和类似的部分。
对采用的保护基的种类没有要求，只要衍生的保护基能在合适的点上选择性地除去且不会打断分子的其余部分即可。保护基进一步的例子可在E.Haslam的《有机化学保护基》(Protecting Groups in Organic Chemistry)(J.G.W.McOmie编，1973)一书第2章以及T.W.Greene和P.G.M.Wuts的《有机合成保护基》(Protective Groups inOrganic Synthesis)(1991)一书第7章中找到，它们各自的内容通过引用全文纳入本文。
“拟肽”通常用来表示含有至少1个、优选2个或多个替代氨基酸，优选N-取代的甘氨酸的肽模拟物。拟肽描述于美国专利号5,811,387。
“N-取代的甘氨酸”指结构式-(NR-CH2-CO)-所示的残基，其中各R是非氢部分，如独立选自以下的那些：(C2-C6)烷基，卤代(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C6-C10)环烷基-芳基，氨基(C1-C6)烷基，铵(C1-C6)烷基(ammonium(C1-C6)alkyl)，羟基(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基，羧基，羧基(C2-C6)烷基，氨甲酰基，氨甲酰基(C2-C6)烷基，胍基，胍基(C1-C6)烷基，脒基，脒基(C1-C6)烷基，巯基，(C1-C6)烷硫基，2-10个碳原子的烷硫基烷基，含N杂环基，含氮杂环基(C1-C6)烷基，咪唑基，4-10个碳原子的咪唑基烷基，哌啶基，5-10个碳原子的哌啶基烷基，吲哚基，9-15个碳原子的吲哚基烷基，萘基，11-16个碳原子的萘基烷基，和芳基(C1-C6)烷基；其中各R部分可任选被1-3个独立选自卤素、羟基或(C1-C6)烷氧基的取代基取代。
在-(NR-CH2-CO)-的一些实施方式中，R是(C2-C6)烷基，卤代(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C6-C10)环烷基-芳基，氨基(C1-C6)烷基，羟基(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基，羧基，羧基(C2-C6)烷基，氨甲酰基，氨甲酰基(C2-C6)烷基，胍基，胍基(C1-C6)烷基，巯基，(C1-C6)烷硫基，2-10个碳原子的烷硫基烷基，咪唑基，4-10个碳原子的咪唑基烷基，哌啶基，5-10个碳原子的哌啶基烷基，吲哚基，9-15个碳原子的吲哚基烷基，萘基，11-16个碳原子的萘基烷基，二苯基(C1-C6)烷基或芳基(C1-C6)烷基；其中各R部分可任选被1-3个独立选自卤素、羟基或(C1-C6)烷氧基的取代基取代。
在-(NR-CH2-CO)-的一些实施方式中，R是(C2-C6)烷基，氨基(C1-C6)烷基，羟基(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基，胍基(C1-C6)烷基，9-15个碳原子的吲哚基烷基，11-16个碳原子的萘基烷基，二苯基(C1-C6)烷基或芳基(C1-C6)烷基，可任选被1-3个独立选自卤素、羟基或(C1-C6)烷氧基的取代基取代。
在-(NR-CH2-CO)-的一些实施方式中，R是在生理相关pH下荷电的部分。在生理相关pH下带正电荷的R的例子包括，例如，氨基(C1-C6)烷基，铵(C1-C6)烷基，胍基，胍基(C1-C6)烷基，脒基，脒基(C1-C6)烷基，含氮杂环基，和含N杂环基(C1-C6)烷基，其中各R部分任选被1-3个独立选自卤素、C1-C3甲氧基或C1-C3烷基的取代基取代。
在-(NR-CH2-CO)-的一些实施方式中，R是在生理相关pH下呈中性的部分。在生理相关pH下呈中性的R的例子包括，例如，(C2-C6)烷基，卤代(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C6-C10)环烷基-芳基，(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基，2-10个碳原子的烷硫基烷基，二苯基(C1-C6)烷基，和芳基(C1-C6)烷基。进一步的例子包括乙基，丙-1-基，丙-2-基，1-甲基丙-1-基，2-甲基丙-1-基，3-苯基丙-1-基，3-甲基丁基，苄基，4-氯-苄基，4-甲氧基-苄基，4-甲基-苄基，2-甲基硫代乙-1-基和2，2-二苯基乙基。
在-(NR-CH2-CO)-的一些实施方式中，R是氨基(C1-C6)烷基(例如，氨基丁基)。
N-取代的甘氨酸进一步的例子所包括的基团中，R是乙基，丙-1-基，丙-2-基，1-甲基丙-1-基，2-甲基丙-1-基，3-苯基丙-1-基，3-甲基丁基，苄基，4-羟基苄基，4-氯-苄基，4-甲氧基-苄基，4-甲基-苄基，2-羟乙基，巯基乙基，2-氨基乙基、3-丙酸，3-氨基丙基，4-氨基丁基，2-甲基硫代乙-1-基，羧基甲基，2-羧基乙基，氨甲酰基甲基，2-氨甲酰基乙基，3-胍基丙-1-基，咪唑基甲基，2，2-二苯基乙基或吲哚-3-基-乙基。
还包括N-取代甘氨酸的盐、酯和受保护的形式(例如，用Fmoc或Boc等进行N-保护)。
制造替代氨基酸，包括N-取代的甘氨酸的方法描述于美国专利号5,811,387，其内容通过引用全文纳入本文。
“单体”或“亚单位”指可与其他单体相连形成链(如肽链)的分子。氨基酸和N-取代的甘氨酸是示例性单体。当与其他单体相连时，单体可被称为“残基”。
“拟肽试剂”在文中指肽-样聚合物，其中一个或多个残基包括如文中进一步描述的N-取代的甘氨酸，且它优先与构象疾病蛋白的致病形式，尤其是与致病性朊病毒蛋白相互作用。将各个N-取代的甘氨酸任选与氨基酸和/或其他替代氨基酸一起连接成直链或支链可得到如本文所述的“拟肽试剂”。这种连接通常构成肽键(即酰胺)。
“肽”指包含至少两个通过肽键连接的氨基酸的酰胺化合物，即通过一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间的键连接。本文所用的肽可与“寡肽”或“多肽”互换，采用这些术语时未暗示特定大小的聚合物。对适用于本发明的肽的长度没有限制，包括长度为3-5个残基、长度为6-10个残基(或其间的任何整数)的肽、长度为11-20个残基(或其间的任何整数)的肽、长度为21-75个残基(或其间的任何整数)的肽、长度为75-100个残基(或其间的任何整数)的肽、或者长度在100个残基以上的多肽。通常，用于本发明的肽具有适合预定用途的最大长度。肽的长度可以在约2和约100、约2和约50、约2和约20、约2和约10、约2和约8、或约2和约5个残基之间。
肽中的氨基酸与其替代氨基酸之间的“类似处”不必很严格。例如，可用N-取代的甘氨酸残基(例如，-(NR-CH2-CO)-)代替赖氨酸，其中R是氨基烷基，如氨基甲基、2-氨基乙基、3-氨基丙基、4-氨基丁基、5-氨基戊基或6-氨基己基。丝氨酸可用例如羟基烷基如羟甲基、2-羟乙基、3-羟丙基、2-羟丙基等来代替。通常，首先用具有类似特性，如疏水性、亲水性、极性、非极性、芳香性等的侧链的N-取代甘氨酸类似物来代替常规氨基酸。再通过本文所述方法进一步测试和优化氨基酸取代的肽。
“结合部分”是共价结合于拟肽试剂的分子。示例性的结合部分包括效应分子、底物、标记、交联剂、结合剂、聚合物支架、抗原性试剂、间隔分子等。结合基团与肽及其类似物的连接在现有技术中已经有详细论述。结合部分可直接连接到拟肽试剂或通过连接部分连接。在一些这样的实施方式中，结合部分结合于拟肽试剂的氨基-末端区域或羧基-末端区域。在进一步的实施方式中，结合部分结合于末端亚单位如氨基-末端亚单位或羧基-末端亚单位。在一些这样的实施方式中，所述结合部分是交联剂或结合剂。一些实施方式中，结合部分包含生物素或巯基。一些实施方式中，结合部分包含可检测标记。一些实施方式中，拟肽试剂包含两个或多个结合物。
术语“标记”、“标记的”、“可检测标记”和“可检测标记的”指能够检测的分子，包括但不限于放射性同位素、荧光剂、发光剂、化学发光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、生色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素或半抗原)、荧光毫微粒、金毫微粒等。术语“荧光剂”指能够在可检测范围内显示出荧光的物质或其部分，如荧光团。可用于本发明的标记的具体例子包括但不限于：荧光黄、罗丹明、丹酰、伞形酮、得克萨斯红、鲁米诺、吖啶酯、NADPH、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶和脲酶。标记也可以是表位标签(例如，His-His标签)、抗体、或者是可扩增或可检测的寡核苷酸。
术语“效应化合物”包括结合于生物受体位点并在结合后影响生化事件的任何化合物。因此，效应化合物包括药物以及杀虫剂，但不限于此。
术语“交联剂”指具有能够与其他分子或聚合支架形成共价键的官能团的部分。交联剂的例子包括那些具有一个或多个末端巯基、羟基、氨基、羧基和类似官能团的部分。一些实施方式中，交联剂具有至少1个巯基官能团。
术语“结合剂”指能够通过非共价相互作用结合其他分子或基质(如聚合支架)的部分。结合剂的例子是生物素或其衍生物。
“接头部分”、“连接部分”或“接头”指将结合部分固定于拟肽试剂的部分。一些实施方式中，接头部分是具有至少一个结构式为-{NH(CH2)mC(O)}p-的连接区域的基团，其中m是1-10，p是1-5。一些实施方式中，接头部分包含至少一个氨基己酸(Ahx)残基或其片段。这种部分可进一步增强拟肽试剂与朊病毒蛋白的相互作用和/或进一步增强朊病毒蛋白的检测。
拟肽试剂
本发明提供了与构象疾病蛋白如朊病毒蛋白相互作用的拟肽试剂，含有该拟肽试剂的复合物、组合物和试剂盒，以及用它们来检测和分离构象疾病蛋白如PrPSc的方法。本发明的拟肽试剂可用于治疗和预防蛋白质构象疾病，例如朊病毒疾病如TSE，并可用于提供基本上不含致病性朊病毒的血液或食品供给的方法。
本发明提供了一种相比构象疾病蛋白的非致病形式优先与构象疾病蛋白的致病形式相互作用的拟肽试剂，它具有以下结构式：
Xa-(Q)n-Xb
式中：
各Q独立为氨基酸或N-取代的甘氨酸，而-(Q)n-限定了拟肽区域；
Xa是H、(C1-C6)烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、(C1-C6)酰基、氨基(C1-6)酰基、氨基酸、氨基保护基、或含有2至约100个氨基酸的多肽，其中，Xa任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代；
Xb是H、(C1-C6)烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、(C1-C6)烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羧基保护基、氨基酸、或含有2至约100个氨基酸的多肽，其中，Xb任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代；和
n是3至约30(即n是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，或者更大)；
其中，至少约50％的拟肽区域-(Q)n-包含N-取代的甘氨酸。
一些实施方式中，各Q独立为N-取代的甘氨酸。
一些实施方式中，拟肽试剂具有结构式Xa-(Q)n-Xb，式中n是约4至约30，优选约5至约30，且其中至少约50％的拟肽区域-(Q)n-包含N-取代的甘氨酸，前提是，拟肽区域-(Q)n-包含至少1个独立选自以下的亚区域：
(a)-AABA-；
(b)-AABAB-；
(c)-ABACC-；
(d)-AAAAA-；
(e)-ABCBA-；
(f)-AABCA-；或
(g)-ABABA-；
其中，A、B和C是各不相同的N-取代的甘氨酸。
一些实施方式中，Xa是(C1-C6)酰基或氨基(C1-6)酰基，各自任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代。
一些实施方式中，Xa是(C1-C6)酰基或氨基(C1-6)酰基，各自任选被选自交联剂或结合剂的结合部分所取代，所述交联剂或结合剂各自任选通过接头部分连接。
一些实施方式中，Xa是(C1-C6)酰基或氨基(C1-6)酰基，各自任选被选自生物素或巯基的结合部分所取代，所述结合部分任选通过接头部分连接。
一些实施方式中，Xb是任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代的氨基酸。
一些实施方式中，Xb是氨基，烷基氨基，二烷基氨基。
一些实施方式中，Xb是氨基。
一些实施方式中，n为约5至约15；5至约10；或6。
一些实施方式中，n是4至10，4至8，5至7，或6。
一些实施方式中，Xb是任选被结合部分取代的氨基酸，n是6。
一些实施方式中，接头部分包含具有结构式为-{NH(CH2)mC(O)}p-的区域。
一些实施方式中，m是1-10。
一些实施方式中，m是1-8。
一些实施方式中，m是5。
一些实施方式中，p是1-5。
一些实施方式中，p是1-3。
一些实施方式中，p是1或2。
一些实施方式中，Xb是任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代的氨基酸，n是6。
一些实施方式中，Xb是氨基、烷基氨基或二烷基氨基；Xa是H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)酰基、氨基(C1-6)酰基、氨基酸或氨基保护基，其中，Xa任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代；且n是6。
一些实施方式中，Xb是氨基、烷基氨基或二烷基氨基；Xa是H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)酰基、氨基(C1-6)酰基、氨基酸或氨基保护基，其中Xa被选自交联剂或结合剂的结合部分所取代，其中所述结合部分任选通过接头部分连接；且n是6。
一些实施方式中，Xb是氨基、烷基氨基或二烷基氨基；Xa是H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)酰基、氨基(C1-6)酰基、氨基酸或氨基保护基，其中，Xa被选自生物素或巯基的结合部分所取代，其中所述结合部分任选通过接头部分连接，其中所述接头部分的至少一部分具有结构式-{NH(CH2)mC(O)}p-；n是6；m是1-10；p是1-5。
一些实施方式中，各Q独立为氨基酸或式-NR-CH2-CO)-所示的N-取代的甘氨酸，其中各R独立选自：(C2-C6)烷基，卤代(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C6-C10)环烷基-芳基，氨基(C1-C6)烷基，铵(C1-C6)烷基，羟基(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基，羧基，羧基(C2-C6)烷基，氨甲酰基，氨甲酰基(C2-C6)烷基，胍基，胍基(C1-C6)烷基，脒基，脒基(C1-C6)烷基，巯基，(C1-C6)烷硫基，2-10个碳原子的烷硫基烷基，含氮杂环基，含氮杂环基(C1-C6)烷基，咪唑基，4-10个碳原子的咪唑基烷基，哌啶基，5-10个碳原子的哌啶基烷基，吲哚基，9-15个碳原子的吲哚基烷基，萘基，11-16个碳原子的萘基烷基，和芳基(C1-C6)烷基；其中各R部分任选被1-3个独立选自卤素、羟基和(C1-C6)烷氧基的取代基取代。
一些实施方式中，各Q独立为氨基酸或式-(NR-CH2-CO)-所示的N-取代的甘氨酸，其中各R独立选自：(C2-C6)烷基，卤代(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C6-C10)环烷基-芳基，氨基(C1-C6)烷基，羟基(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基，羧基，羧基(C2-C6)烷基，氨甲酰基，氨甲酰基(C2-C6)烷基，胍基，胍基(C1-C6)烷基，巯基，(C1-C6)烷硫基，2-10个碳原子的烷硫基烷基，咪唑基，4-10个碳原子的咪唑基烷基，哌啶基，5-10个碳原子的哌啶基烷基，吲哚基，9-15个碳原子的吲哚基烷基，萘基，11-16个碳原子的萘基烷基，二苯基(C1-C6)烷基或芳基(C1-C6)烷基；其中各R部分任选被1-3个独立选自卤素、羟基或(C1-C6)烷氧基的取代基取代。
一些实施方式中，各Q独立为氨基酸或式-(NR-CH2-CO)-所示的N-取代的甘氨酸，其中各R独立选自：(C2-C6)烷基，氨基(C1-C6)烷基，羟基(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基、胍基(C1-C6)烷基，9-15个碳原子的吲哚基烷基，11-16个碳原子的萘基烷基，二苯基(C1-C6)烷基或芳基(C1-C6)烷基，并可被1-3个独立选自卤素、羟基或(C1-C6)烷氧基的取代基取代。
一些实施方式中，各Q独立为氨基酸或选自以下的N-取代的甘氨酸：N-(4-氨基丁基)甘氨酸，N-(1-苯基乙基)甘氨酸，N-(2-氨基乙基)甘氨酸，N-(2-[4-甲氧基苯基]乙基)甘氨酸，N-(2-甲氧基乙基)甘氨酸，N-(2-羟乙基)甘氨酸，N-((1H-吲哚-3-基)甲基)甘氨酸，或N-苄基甘氨酸。
一些实施方式中，各Q独立为氨基酸或选自N-(4-氨基丁基)甘氨酸或N-苄基甘氨酸的N-取代的甘氨酸。
一些实施方式中，各Q独立为N-取代的甘氨酸。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-包含至少3个或至少4个在生理相关pH下带有电荷的N-取代甘氨酸。一些实施方式中，电荷是正电荷。一些实施方式中，拟肽区域其余的N-取代甘氨酸在生理相关pH下呈中性。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-包含2-6、3-5或4个在生理相关pH下带有电荷的N-取代甘氨酸。一些实施方式中，电荷是正电荷，一些实施方式中，拟肽区域其余的N-取代甘氨酸在生理相关pH下呈中性。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-中2个N-取代甘氨酸残基在生理相关pH下带有正电荷，而拟肽区域其余的N-取代甘氨酸残基在生理相关pH下呈中性。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-中3个N-取代甘氨酸残基在生理相关pH下带有正电荷，而拟肽区域其余的N-取代甘氨酸残基在生理相关pH下呈中性。一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-中的4个N-取代甘氨酸残基在生理相关pH下带有正电荷，而拟肽区域其余的N-取代甘氨酸残基在生理相关pH下呈中性。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-中5个N-取代甘氨酸残基在生理相关pH下带有正电荷，而拟肽区域其余N-取代甘氨酸残基在生理相关pH下呈中性。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-在生理相关pH下是多离子的。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-在生理相关pH下是多阳离子的。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-在生理相关pH下是多阴离子的。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-在生理相关pH下具有至少3+净电荷。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-在生理相关pH下具有至少4+净电荷。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-在生理相关pH下具有2+至6+净电荷。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-在生理相关pH下具有3+至5+净电荷。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-在生理相关pH下具有4+净电荷。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-包含至少3个在生理相关pH下带有正电荷的N-取代甘氨酸。
一些实施方式中，其中所述拟肽区域-(Q)n-包含至少4个在生理相关pH下带有正电荷的N-取代甘氨酸。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-包含2-6个在生理相关pH下带有正电荷的N-取代甘氨酸。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-包含3-5个在生理相关pH下带有正电荷的N-取代甘氨酸。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-包含4个在生理相关pH下带有正电荷的N-取代甘氨酸。
一些实施方式中，拟肽区域-(Q)n-中N-取代甘氨酸具有结构式-(NR-CH2-CO)-，其中R独立选自：(C2-C6)烷基，卤代(C1-C6)烷基，(C2-C6)烯基，(C2-C6)炔基，(C6-C10)环烷基-芳基，氨基(C1-C6)烷基，铵(C1-C6)烷基，羟基(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基，羧基，羧基(C2-C6)烷基，氨甲酰基，氨甲酰基(C2-C6)烷基，胍基，胍基(C1-C6)烷基，脒基，脒基(C1-C6)烷基，巯基，(C1-C6)烷硫基，2-10个碳原子的烷硫基烷基，含氮杂环基，含氮杂环基(C1-C6)烷基，咪唑基，4-10个碳原子的咪唑基烷基，哌啶基，5-10个碳原子的哌啶基烷基，吲哚基，9-15个碳原子的吲哚基烷基，萘基，11-16个碳原子的萘基烷基，和芳基(C1-C6)烷基；其中各R部分任选被1-3个独立选自卤素、羟基和(C1-C6)烷氧基的取代基取代，且拟肽区域-(Q)n-包含至少3个、至少4个、2-6个、3-5个、或4个N-取代的甘氨酸，其中R是在生理相关pH下带有电荷的部分。
一些实施方式中，拟肽区域中所有N-取代的甘氨酸是毗连的。
一些实施方式中，拟肽试剂包含至少1个结合部分。
一些实施方式中，拟肽试剂包含至少1个通过接头部分结合的结合部分。
本发明还提供了一种相比构象疾病蛋白的非致病形式优先与构象疾病蛋白的致病形式相互作用的拟肽试剂，其中所述拟肽试剂包含氨基-末端区域、羧基-末端区域，和至少一个位于所述氨基-末端区域和所述羧基-末端区域之间的拟肽区域，其中所述拟肽区域包含约3至约30个N-取代的甘氨酸并任选包含一个或多个氨基酸。一些实施方式中，拟肽区域包含约4至约30个或约5至约30个N-取代的甘氨酸。在一些这样的实施方式中，所述拟肽区域包含约4至约30个或约5至约30个N-取代的甘氨酸和选自以下的拟肽亚区域：
(a)-AABA-；
(b)-AABAB-；
(c)-ABACC-；
(d)-AAAAA-；
(e)-ABCBA-；
(f)-AABCA-；或
(g)-ABABA-；
其中，A、B和C是各自不同的N-取代甘氨酸，且各亚区域序列从左到右是从氨基-末端到羧基-末端的方向。一些实施方式中，拟肽区域包含约50-100％、约75-100％、或100％N-取代的甘氨酸。一些实施方式中，拟肽区域的长度为约5至约50、约5至约30、约5至约15、约5至约7、或6个亚单位。
一些实施方式中，拟肽试剂的总长为约5至约50、约5至约30、约5至约15、或约6至约9个亚单位。
一些实施方式中，至少1个拟肽区域占该拟肽试剂总长的约50％以上、约75％以上、或约90％以上。
一些实施方式中，所有N-取代的甘氨酸在拟肽区域中是毗连的。
一些实施方式中，拟肽区域中N-取代的甘氨酸具有结构式-(NR-CH2-CO)-，其中R如文中所定义。
一些实施方式中，拟肽区域在生理相关pH下是多离子的，并具有通篇任何一个实施方式所述带有电荷的拟肽区域的特征。
本发明还提供了一种相比构象疾病蛋白的非致病形式优先与构象疾病蛋白的致病形式相互作用的拟肽试剂，其中所述试剂包含拟肽区域，该区域含有3-15个毗连的N-取代甘氨酸，且其中所述拟肽区域在生理相关pH下具有净电荷。一些实施方式中，所述净电荷是净正电荷，如在生理相关pH下具有至少3+或至少4+净电荷。一些实施方式中，拟肽试剂本身在生理相关pH下具有2+至6+、3+至5+、或4+净电荷。
一些实施方式中，拟肽区域中至少2个、至少3个、或至少4个毗连的N-取代甘氨酸在生理相关pH下带有电荷。在进一步的实施方式中，拟肽区域中至少2个毗连的N-取代甘氨酸包含至少一个选自伯氨基、仲氨基、叔氨基、铵(季氨基)、胍基、脒基或含氮杂环基的部分。
再在进一步的实施方式中，拟肽区域中至少2个毗连的N-取代甘氨酸包含至少1个选自伯氨基、仲氨基、铵、胍基、脒基或含氮杂环基的N-取代基。
再在进一步的实施方式中，至少2个毗连的N-取代甘氨酸包含N-取代基，其中的R基团如本文提供的定义。
再在进一步的实施方式中，该拟肽试剂包含含有6个毗连的N-取代甘氨酸的拟肽区域，且该拟肽试剂本身在生理相关pH下具有3+或4+净电荷。
本发明还提供了制造拟肽试剂的方法以及用拟肽试剂检测致病性朊病毒蛋白的方法、用拟肽试剂分离致病性朊病毒蛋白的方法、除去或减少样品中的致病性朊病毒蛋白的方法、和含有进行各种方法的组分的试剂盒。
“拟肽试剂”指具有氨基-末端区域、羧基-末端区域、和至少1个位于氨基-末端区域和羧基-末端区域之间的“拟肽区域”的拟肽分子。所述氨基-末端区域指位于试剂氨基-末端侧的区域，通常不含有任何N-取代的甘氨酸。所述氨基-末端区域可以是H、烷基、取代的烷基、酰基、氨基保护基、氨基酸、肽，等等。一些实施方式中，氨基-末端区域对应于Xa。所述羧基-末端区域指位于拟肽羧基-末端的区域，它不含任何N-取代的甘氨酸。羧基-末端区域可包括H、烷基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基保护基、氨基酸、肽，等等。一些实施方式中、羧基-末端区域对应于Xb。一些实施方式中，拟肽试剂的总长为约5至约50个亚单位；约5至约30个亚单位；约5至约15个亚单位；或约6至约9个亚单位。一些实施方式中，拟肽试剂是以羧基为末端的酰胺。所述拟肽区域通常指拟肽试剂中至少有3个氨基酸被N-取代的甘氨酸替代的部分。
“拟肽区域”(在文中也称为“-(Q)n-”)可被鉴定为起始于靠近氨基-末端的N-取代甘氨酸(包括该N-取代甘氨酸)，结束于靠近羧基-末端的N-取代甘氨酸(包括该N-取代甘氨酸)的区域。一些实施方式中，拟肽区域包含至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、或100％的N-取代甘氨酸。一些实施方式中、拟肽区域包含约25至约100％；约50至约100％；约75至约100％的N-取代甘氨酸。一些实施方式中，拟肽区域包含100％的N-取代甘氨酸。一些实施方式中，拟肽区域占拟肽试剂总长的约50％以上(例如，约50-100％)。一些实施方式中，拟肽区域占拟肽试剂总长的约60％以上(例如，约60-100％)。一些实施方式中，拟肽区域占拟肽试剂总长的约75％以上(例如，约75-100％)。一些实施方式中，拟肽区域占拟肽试剂总长的约90％以上(例如，约90-100％)。一些实施方式中，拟肽区域占拟肽试剂总长的100％。
一些实施方式中，拟肽区域包含至少3个N-取代的甘氨酸。一些实施方式中，拟肽区域包含至少4个N-取代的甘氨酸。一些实施方式中，拟肽区域包含至少5个N-取代的甘氨酸。一些实施方式中，拟肽区域包含至少6个N-取代的甘氨酸。一些实施方式中，拟肽区域包含3至约30、约5至约30个N-取代的甘氨酸；和任选的一个或多个氨基酸。一些实施方式中，拟肽区域的长度为约5至约50、5至约30、5至约15、5至约10、5至约9、5至约8、或5至约7个亚单位。一些实施方式中，拟肽区域的长度为约3、4、5、6、7、8、9、或10个亚单位。一些实施方式中，拟肽区域的长度为6个亚单位。一些实施方式中，拟肽区域中所有的N-取代甘氨酸是毗连的。一些实施方式中，拟肽区域中所有的亚单位是N-取代的甘氨酸。
在进一步的实施方式中，拟肽试剂包含含有4-12、4-10、4-9、4-8、5-7、或6个毗连的N-取代甘氨酸的拟肽区域。
根据一些实施方式，所述拟肽区域在生理相关pH下可以是多离子的。术语“多离子的”是指该拟肽区域包含2个或多个在生理相关pH下带有电荷的残基。一些实施方式中，拟肽区域在生理相关pH下是多阳离子的或多阴离子的。在进一步的实施方式中，拟肽区域在生理相关pH下具有至少3+或至少4+净电荷。再在进一步的实施方式中，拟肽区域在生理相关pH下具有2+至6+、3+至5+、或4+净电荷。
带有电荷的N-取代甘氨酸残基的非限制性例子包括：N-(5-氨基戊基)甘氨酸，N-(4-氨基丁基)甘氨酸，N-(3-氨基丙基)甘氨酸，N-(2-氨基乙基)甘氨酸，N-(5-胍基戊基)甘氨酸，N-(4-胍基丁基)甘氨酸，N-(3-胍基丙基)甘氨酸，和N-(2-胍基乙基)甘氨酸。
一些实施方式中，拟肽区域包含至少3个或至少4个在生理相关pH下带有正电荷的N-取代甘氨酸。一些实施方式中，拟肽区域包含2-6个、3-5个、或4个在生理相关pH下带有正电荷的N-取代甘氨酸。
一些实施方式中，拟肽区域包含具有结构式-(NR-CH2-CO)-的残基，其中至少3个、至少4个、2-6个、3-5个、或4个残基在生理相关pH下带有电荷。
一些实施方式中，拟肽区域中带有电荷的残基具有结构式-(NR-CH2-CO)-，其中R独立选自氨基(C1-C6)烷基、铵(C1-C6)烷基、胍基、胍基(C1-C6)烷基、脒基、脒基(C1-C6)烷基、含氮杂环基或含氮杂环基(C1-C6)烷基，其中各R部分任选被1-3个独立选自卤素、C1-C3甲氧基或C1-C3烷基的取代基取代。一些实施方式中，R是氨基(C1-C6)烷基如氨基丁基。
一些实施方式中，拟肽试剂在生理相关pH下具有至少3+或至少4+净电荷。再在进一步的实施方式中，拟肽试剂在生理相关pH下具有2+至6+、3+至5+、或4+净电荷。
拟肽试剂的拟肽区域包含至少1个拟肽亚区域，所述拟肽亚区域是指由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个或者更多残基构成的毗连的N-取代甘氨酸序列。一些实施方式中，拟肽区域包含至少1个独立选自以下的拟肽亚区域：
(a)-AABA-；
(b)-AABAB-；
(c)-ABACC-；
(d)-AAAAA-；
(e)-ABCBA-；
(f)-AABCA-；或
(g)-ABABA-。
A、B和C各自代表不同的N-取代甘氨酸。例如，出现在亚区域内的各个A代表一种具体的N-取代甘氨酸，而出现在亚区域内的各个B代表另一种具体的N-取代甘氨酸，但A和B相互不同。因此，C是不同于A或B的N-取代甘氨酸。亚区域序列从左向右是氨基到羧基的方向。一些实施方式中，当A是疏水残基时则B是亲水残基，反之亦然。一些实施方式中，拟肽亚区域是同质的，即仅包含一种类型的N-取代甘氨酸。一些实施方式中，当A是脂肪族残基时B是环状残基。一些实施方式中，当B是脂肪族残基时A是环状残基，一些实施方式中，A和B都是脂肪族的。一些实施方式中，A和B是脂肪族的而C是环状的。一些实施方式中，例如对于亚区域-AABA-而言所有N-取代的甘氨酸都是脂肪族的，例如，-(N-(2-甲氧基乙基)甘氨酸)2-N-(4-氨基丁基)甘氨酸-(N-(2-甲氧基乙基)甘氨酸)-，其中A是N-(2-甲氧基乙基)甘氨酸，而B是N-(4-氨基丁基)甘氨酸。
一些实施方式中，拟肽区域包含三拟肽(tripeptoidd)，即3个毗连的N-取代甘氨酸。示例性三拟肽的拟肽亚区域包含-(N-(2-(4-羟苯基)乙基)甘氨酸)2-N-(4-胍基丁基)甘氨酸-，-N-(4-氨基丁基)甘氨酸-(V)2-，其中V是N-苄基甘氨酸或N-(2-甲氧基乙基)甘氨酸，-N-苄基甘氨酸-W-N-苄基甘氨酸-，其中W是N-(4-氨基丁基)甘氨酸或N-(2-甲氧基乙基)甘氨酸，以及-N-(4-氨基乙基)甘氨酸-(N-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)甘氨酸)2-。一些实施方式中，三拟肽亚区域包含至少1个脂肪族和1个环状残基，例如，(A)2-B、B2-A、或B-A-B，其中A是脂肪族残基，B是环状残基。
一些实施方式中，拟肽亚区域是二拟肽(dipeptoid)，如N-(4-氨基丁基)甘氨酸-(S)-N-(1-苯基乙基)甘氨酸二拟肽。
一些实施方式中，拟肽试剂包含选自SEQ ID NO：229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240或241的序列，如下所示。一些实施方式中，拟肽试剂包含选自SEQ ID NO：229、230、232、233、234、235、237、238、239或240的序列。一些实施方式中，拟肽试剂包含选自SEQ ID NO：229、230、235，237、238、239或240的序列。一些实施方式中，拟肽试剂包含选自SEQ ID NO：230、237、238、239或240的序列。一些实施方式中，本发明包含拟肽试剂I、II、VII、IX、X、XIa、XIb、XIIa或XIIb。一些实施方式中、本发明包含拟肽试剂II、IX、X、XIa、XIb、XIIa或XIIb。
就概念上而言，可用N-取代的甘氨酸代替构象疾病蛋白肽片段中的氨基酸以工程构建本发明的拟肽试剂。优选地，母体肽片段能够结合构象疾病蛋白。示例性的母体肽片段包括具有以下序列的那些：SEQ ID Nos.12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、135、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227和228。
一些实施方式中，肽片段中的至少1个非脯氨酸残基被N-取代的甘氨酸替代以形成拟肽试剂。一些实施方式中，肽片段中的至少3个氨基酸残基各自被N-取代的甘氨酸替代以形成拟肽试剂。一些实施方式中，肽片段中的至少5个氨基酸残基被N-取代的甘氨酸替代。
在一些这样的实施方式中，构象疾病蛋白是朊病毒蛋白。例如，肽片段可来源于与残基23-43或85-156相对应的那些区域中的任何一个(例如，23-30，86-111，89-112，97-107，113-135，和136-156)，这些残基按照以下名称均为“Prion-Specific PeptideReagents(朊病毒-特异性肽试剂)”的共有专利申请中SEQ ID NO：2所示小鼠朊病毒序列进行编号：2004年8月13日提交的美国系列号10/917,646；2005年2月11日提交的美国系列号11/056,950；2004年8月13日提交的PCT申请PCT/US2004/026363，所有申请通过引用全文纳入本文。
一些实施方式中，肽片段选自SEQ ID Nos.14、50、51、52、12、72、68或115-219中的任何一个。一些实施方式中，肽片段选自SEQ ID Nos.14、50、51、52或161-219中的任何一个。一些实施方式中，肽片段选自SEQ ID Nos.12、72、68或115-160中的任何一个。一些实施方式中，肽片段选自SEQ IDNos.14、50或68中的任何一个。
作为起点，可按照替代方案用N-取代的甘氨酸替代肽片段中的氨基酸残基，在该方案中，疏水氨基酸残基可用疏水N-取代的甘氨酸替代，而亲水氨基酸残基可用亲水N-取代的甘氨酸替代。一些实施方式中，可按照以下替代方案用N-取代的甘氨酸替代肽中的氨基酸单体以形成修饰的肽：
(a)Ala、Gly、Ile、Leu、Pro和Val可被N-(烷基)甘氨酸、N-(芳烷基)甘氨酸或N-(杂芳基烷基)甘氨酸替代；
(b)Asp、Asn、Cys、Gln、Glu、Met、Ser和Thr可被N-(羟基烷基)甘氨酸、N-(烷氧基)甘氨酸、N-(氨基烷基)甘氨酸或N-(胍基烷基)甘氨酸替代；
(c)Phe、Trp和Tyr可被N-(芳烷基)甘氨酸、N-(杂芳基烷基)甘氨酸、N-(羟基芳烷基)甘氨酸或N-(烷氧基芳烷基)甘氨酸替代；和
(d)Arg、His和Lys可被N-(氨基烷基)甘氨酸或N-(胍基烷基)甘氨酸替代。
可按照本文所述方法测试修饰的肽与朊病毒蛋白致病形式的结合情况。根据上述方案，可用N-取代的甘氨酸对氨基酸单体进行其它替代并重复测试直到获得合适的结合情况(即得到优先与朊病毒的致病形式相互作用的拟肽试剂)。
制造拟肽的方法描述于美国专利5,811,387和5,831,005以及其中描述的方法，各专利通过引用全文纳入本文。
本发明的拟肽试剂包括单体、多聚体、环化分子、分支分子、接头，等等。还包括本文所述任何序列或其生物功能等价物的多聚体(即二聚体、三聚体等)。所述多聚体可以是同聚体，即由相同单体构成，例如各单体都是相同的拟肽序列，如下述SEQID NO：229。或者，所述多聚体可以是异聚体，即构成多聚体的所有单体都不同。
可通过将单体直接彼此连接或与基质连接来形成多聚体，包括例如多抗原肽(MAPS)(如对称的MAPS)、与聚合物支架如PEG支架相连的肽和/或含或不含间隔臂单元的串联连接肽。或者，可将接头加入单体从而将各单体连接成多聚体。利用连接基团的多聚体的非限制性例子包括利用甘氨酸接头的串联重复；通过接头与基质连接的MAPS和/或通过接头与支架相连的线性连接肽。本领域技术人员已知连接基团可包括利用双功能间隔臂单元(同双功能或异双功能)。
一些实施方式中，拟肽试剂与朊病毒-相关疾病的构象疾病蛋白相互作用，其中，构象疾病蛋白的致病形式是PrPSc，而构象疾病蛋白的非致病形式是PrPC。一些实施方式中，拟肽试剂对一种以上物种的PrPSc具有特异性，例如，所述拟肽试剂可对人、牛、绵羊、鹿、麇鹿、山羊、小鼠或仓鼠中两种或多种的朊病毒蛋白具有特异性。一些实施方式中，拟肽试剂对单一物种的PrPSc具有特异性。
一些实施方式中，拟肽试剂与构象疾病蛋白的致病形式相互作用的亲和力比与构象疾病蛋白的非致病形式相互作用的亲和力高至少约2倍；5倍；10倍；20倍；50倍；100倍；200倍；500倍；或1000倍。一些实施方式中，亲和力比与构象疾病蛋白的非致病形式相互作用的亲和力高至少约10倍。一些实施方式中，亲和力高至少100倍。
本发明还提供了一种包含本文所述一种或多种拟肽试剂和朊病毒蛋白的复合物。一些实施方式中，所述复合物包含本文所述的拟肽试剂和致病性朊病毒。一些实施方式中，所述致病性朊病毒是PrPSc。一些实施方式中，所述复合物包含任选标记的致病性朊病毒和/或拟肽试剂、朊病毒-结合试剂或配体。文中，术语“复合物”是指致病性或非致病性朊病毒与拟肽试剂和/或朊病毒-结合试剂之间发生结合。因此，复合物不一定是朊病毒和拟肽试剂之间的结合，也可以是朊病毒和朊病毒-结合试剂之间的结合。复合物内的分子将通过足够大的分子间作用力如离子力、疏水作用力、氢键、范德华力等结合在一起，因而对于本文所述的方法和组合物，该复合物能够作为一个单元而起作用。
组合物
本发明还提供了一种包含本文所述的本发明拟肽试剂的组合物。一些实施方式中，所述组合物包含拟肽试剂和样品如生物样品。生物样品是从活的或曾经活过的生物制备的样品。生物样品的非限制性例子有器官(例如脑、肝脏和肾脏)、细胞、全血、血液成分、血液组分、血浆、血小板、血清、脑脊液(CSF)、脑组织、神经系统组织、肌肉组织、肌肉和脂肪组织(例如，肉)、骨髓、尿、眼泪、非神经系统组织、来源于活的或曾经活过的生物的食物如牛肉、猪肉或小牛肉以及任何其他有机物质如植物材料。生物样品可在健康相关过程中获得，如献血或血液筛选、活检、尸体解剖或尸检，或在食物制备工艺或过程中获得，如动物的选择和屠宰以及最终产品的质检。
本发明还提供了一种包含固相支持体和至少一种本发明拟肽试剂的组合物。所述固相支持体可以是，例如，硝酸纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶、聚氟乙烯、重氮化纸、尼龙膜、活性珠和/或磁性反应珠、或聚氯乙烯；聚丙烯、聚苯乙烯乳胶、聚碳酸酯、尼龙、葡聚糖、几丁质、沙子、二氧化硅、浮石粉、琼脂糖、纤维素、玻璃、金属、聚丙烯酰胺、硅、橡胶或多糖；重氮化纸；或任何用于固相合成、亲和分离、纯化、杂交反应、免疫测定和其他此类应用的材料。支持体可以是颗粒或者可以采取连续表面形式，包括膜、筛网、平板、小球、载玻片、平皿、毛细管、中空纤维、针头、大头针、芯片、固体纤维、凝胶(例如硅胶)和珠(例如多孔玻璃珠、硅胶、任选与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯珠、接枝共聚珠、聚丙烯酰胺珠、乳胶珠、任选与N-N′-二-丙烯酰基乙二胺交联的二甲基丙烯酰胺珠、氧化铁磁珠和用疏水性聚合物包被的玻璃颗粒)。在一些这样的实施方式中，固相支持体选自硝酸纤维素、聚苯乙烯乳胶、聚氟乙烯、重氮化纸、尼龙膜、活性珠或磁性反应珠。
一些实施方式中，包含拟肽试剂的组合物是药物组合物，即在药学上和药理学上是可接受的。一些实施方式中，该组合物还包含至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。药物载体可以是固体或液体。固体载体可包括可能同时作为调味剂、甜味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填充剂、助流剂、压缩助剂、粘合剂或片剂崩解剂的一种或多种物质；它还可以是成胶囊材料。在粉剂中，载体包括与细碎的拟肽试剂混合的细碎固体。合适的载体通常是较大的代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。本领域普通技术人员熟知这种载体。
赋形剂是一种提供体积、赋予令人满意的加工和压缩特性、帮助控制溶出率、和/或给予核心材料其他所需物理特性的成分。本领域普通技术人员熟知诸如稀释剂、粘合剂、润滑剂和崩解剂等赋形剂，例如，《药物赋形剂手册》(Handbook ofPharmaceutical Excipients)，美国制药协会(American Pharmaceutical Association)，华盛顿，哥伦比亚特区，以及《大不列颠药物科学》(The Pharmaceutical Society of GreatBritain)，英国伦敦(1986)所述的，这些书籍通过引用全文纳入本文。合适的赋形剂包括，例如，纤维性材料如羟丙甲纤维素(Hypromellose)、HPC、HEC、羧甲基纤维素、微晶纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素以及它们的衍生物和盐；其他有机化合物，如PEG、滑石、乳糖和其他糖类如蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖，以及麦芽糖糊精、阿拉伯胶、糊精、藻酸、乙基纤维素树脂、明胶、瓜耳胶、甲基纤维素、PEG化淀粉、藻酸钠、淀粉、玉米蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯吡咯烷-乙酸乙烯酯共聚物、乙酸乙烯酯-巴豆酸共聚物和丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物；增塑剂如丙二醇、甘油、三羟甲基丙烷、PEG聚合物、癸二酸丁二酯、乙酰单甘油酯、酞酸二乙酯、三醋精、三醋酸甘油酯、柠檬酸乙酰基三乙酯和柠檬酸三乙酯；和润滑剂，如滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、氢化植物油、月桂基硫酸镁、苯甲酸钠、苯甲酸钠和乙酸钠的混合物、氯化钠、亮氨酸和卡波蜡(Carbowax？4000。
本发明的药物组合物可与其他分子组合施用，其他分子有例如抗原和免疫调节剂，如免疫球蛋白、细胞因子、淋巴因子和趋化因子，包括但不限于白介素2(IL-2)、修饰的IL-2(cys125-ser125)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素12(IL-12)、α-或γ-干扰素、细胞因子IP-10，以及β细胞因子如RANTES、MIP1-α和MTP1-β。当组合施用时，可与其他分子同时或依次施用该组合物；且如果同时施用，可以作为单一剂量单位如含有该组合物和其他分子的混合物，或是作为单独且不同的剂量单位，各单位包含组合物或其他分子。
本文所述的药物组合物可包含治疗有效量的拟肽试剂。文中，“治疗有效量”是指将在施用了该药物组合物的未感染、感染、接触或未接触(感染因子)的动物，如哺乳动物，例如人或非人哺乳动物中诱导预防性和/或治疗性反应的用量。治疗有效量将依据被治疗的动物、被治疗动物的年龄和全身情况、动物免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、所治疗症状的严重性、所选择的具体组合物及其给药模式等因素而有所不同。一般医务人员可确定治疗有效量以及实现最佳临床效果的合适剂量和给药频率。例如，本发明的组合物可作为单剂量或作为给药方案如多剂量的一部分施用，并且可每天一次、每周一次、每月一次、每年一次、半年一次、一年两次等(频率)施用。药物组合物可通过各种模式施用，例如但不限于：肌肉内、粘膜内、皮下、真皮内、透皮、经皮、阴道内、腹膜内、直肠内、经口、经鼻、经直肠、经眼、经肠和/或静脉内。组合物可以是适合给药的(形式)；例如，对于口服给药，它可采取片剂或胶囊(任选包有肠衣)、液体或控释的形式；而对于鼻内给药，它可采取鼻喷剂、鼻滴剂、凝胶或粉剂的形式。剂量方案可包括第一剂和第二剂。第一剂(例如初敏剂)第二剂(例如加强剂)可通过粘膜、肠胃外或以其组合方式给予。尽管提供了给药途径的例子，合适的给药途径以及剂量通常由主治医师根据各个病例而确定。本领域普通技术人员能常规作出这种决定(参见，例如，Fauci等编的《哈里森内科学原则》(Harrison’s Principles of Internal Medicine)(1998)，第14版，纽约，麦基山出版社(McGraw Hill))。
检测
本发明还提供了检测是否存在朊病毒蛋白，尤其是致病性朊病毒蛋白的方法。该检测方法依赖于本发明的拟肽试剂优先与致病性朊病毒形式相互作用的特性。该检测方法可与例如以下方法一起采用：检测样品中的构象疾病蛋白尤其是致病性朊病毒蛋白的方法，诊断朊病毒-相关疾病(例如，人或非人动物中的)的方法，确保基本不含PrPSc的血液供给、血液制品供给或食品供给的方法，分析供移植的器官和组织样品的方法，监测手术工具和设备消毒的方法，以及了解是否存在致病性朊病毒非常重要的任何其他情况。
因此，本发明涉及一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括在允许所述拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成复合物，并检测该复合物的形成，该复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。本文实施例描述了允许拟肽试剂与致病性朊病毒结合的典型条件在。其他合适的结合条件是本领域普通技术人员容易确定的。
检测样品中的致病性朊病毒的方法还可包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成第一复合物，在允许本发明第二拟肽试剂与第一复合物中的致病性朊病毒结合的条件下使第一复合物接触任选可检测标记的所述第二拟肽试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。所述第二复合物可包含所述第二拟肽试剂和所述致病性朊病毒及任选的第一拟肽试剂。
在进一步的实施方式中，所述方法包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去任何未结合样品，在允许本发明第二拟肽试剂与第一复合物中的致病性朊病毒结合的条件下使第一复合物接触任选可检测标记的所述第二拟肽试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。第一拟肽试剂任选包含辅助第一复合物与未结合样品分离的固相支持体。
此外，本发明的检测方法可包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去未结合样品，从第一复合物中解离出致病性朊病毒从而提供解离的致病性朊病毒，在允许本发明第二拟肽试剂与解离的致病性朊病毒结合的条件下使解离的致病性朊病毒接触任选可检测标记的所述第二拟肽试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。可通过任何常规的打断蛋白质结合性相互作用的方法实现第一复合物的解离，例如，加入盐或离液剂、升温、加入洗涤剂或变性剂并机械断裂，还可包括本文所述在高或低pH下处理。
检测样品中的致病性朊病毒的方法还可包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明的第一拟肽试剂以形成第一复合物，在允许朊病毒-结合试剂与第一复合物中的致病性朊病毒结合的条件下使第一复合物接触任选可检测标记的朊病毒-结合试剂(文中所述)以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。所述第二复合物可包含朊病毒-结合试剂和致病性朊病毒，并任选包含第一拟肽试剂。
在进一步的实施方式中，所述方法包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去任何未结合样品，在允许朊病毒-结合试剂与第一复合物中的致病性朊病毒结合的条件下使第一复合物接触任选可检测标记的朊病毒-结合试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。第一拟肽试剂任选包含辅助第一复合物与未结合样品分离的固相支持体。
此外，本发明的检测方法可包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去未结合样品，从第一复合物中解离出致病性朊病毒从而提供解离的致病性朊病毒，在允许朊病毒-结合试剂与解离的致病性朊病毒结合的条件下使解离的致病性朊病毒接触任选可检测标记的朊病毒-结合试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。
在进一步的实施方式中，本发明的检测方法可包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去未结合样品，从第一复合物中解离出致病性朊病毒从而提供解离的致病性朊病毒，在允许朊病毒-结合试剂与解离的致病性朊病毒结合的条件下使解离的致病性朊病毒接触朊病毒-结合试剂以形成第二复合物，并采用任选可检测标记的第二朊病毒-结合试剂检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。
优选在从第一复合物解离期间或之后以及在第二复合物形成之前，使所述解离的致病性朊病毒变性。通常，实现致病性朊病毒从复合物中解离的试剂(例如，离液剂、加热、高或低pH)可促进致病性朊病毒蛋白变性；然而，如果需要的话，无需使蛋白质变性便可使致病性朊病毒从复合物中解离，例如采用低浓度(例如，0.4-1.0M)盐酸胍或异硫氰酸胍。从复合物中解离致病性朊病毒而不使朊病毒蛋白变性的其他条件参见WO2006076497(国际申请PCT/US2006/001090)。
在其他实施方式中，所述检测方法包括在允许朊病毒-结合试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触朊病毒-结合试剂以形成第一复合物，除去未结合样品，在允许本发明拟肽试剂与第一复合物中的致病性朊病毒结合的条件下使所述复合物接触任选可检测标记的所述拟肽试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。可任选在固相支持体上提供所述朊病毒-结合试剂。
一些实施方式中，解离步骤包括使结合的致病性朊病毒蛋白接触盐或离液剂，例如硫氰酸胍(GdnSCN)或盐酸胍(GdnHCl)。GdnSCN或GdnHCl的合适浓度的例子为约3M和约6M之间。
一些实施方式中，解离步骤包括使结合的致病性朊病毒蛋白接触高或低pH，从而使解离的致病性朊病毒蛋白变性。例如，pH可以高于12或低于2。一些实施方式中，pH在12.5和13.0之间。可通过加入NaOH使其浓度达到0.05N至0.15N以获得高pH。高或低pH的接触时间可不超过15分钟或不超过10分钟。一些实施方式中，例如通过加入磷酸或其钠盐将高或低pH中和至7.0和7.5之间。
“朊病毒-结合试剂”是与某种构象的朊病毒蛋白结合的试剂，例如，朊病毒-结合试剂可与朊病毒蛋白的变性形式、PrPC形式(非致病性同种型)或PrPSc形式(致病性同种型)中的一种或多种结合。一些此类朊病毒-结合试剂将结合一种以上的这些朊病毒蛋白形式。朊病毒-结合试剂已有描述，包括例如抗-朊病毒抗体(描述于Peretz等，1997 J.Mol.Biol.273：614；Peretz等，2001 Nature 412：739；Williamson等，1998 JVirol.72：9413；Polymenidou等，The Lancet 2005 4：805；美国专利号4,806,627；美国专利号6,765,088；和美国专利号6,537548)、基序接枝的杂交多肽(参见，W003/085086)、某些阳离子或阴离子聚合物(参见，WO03/073106)、某些可作为“增长催化剂(propagation catalyst)”的肽(参见，WO02/097444)、朊病毒特异性肽试剂(参见，例如，WO2006/076687和US20060035242)以及血纤蛋白溶解酶原。在所有利用朊病毒-结合试剂的方法中，优选的朊病毒-结合试剂是抗-朊病毒抗体。
再者，所述检测方法可包括提供包含本发明拟肽试剂的固相支持体，将所述固相支持体与可检测标记的配体混合以形成第一复合物，其中所述支持体上的拟肽试剂对配体的结合亲和力弱于对致病性朊病毒的，在允许样品中如果存在的致病性朊病毒与第一复合物中的拟肽试剂结合的条件下将样品与第一复合物混合，从而替代所述第一复合物中可检测标记的配体并形成包含所述拟肽试剂和所述致病性朊病毒的第二复合物，检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。
对于在检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法中的应用，所述样品可以是已知含有或怀疑含有致病性朊病毒蛋白的任何样品。一些实施方式中，所述样品怀疑含有致病性朊病毒，例如，PrPSc。一些实施方式中，所述样品是生物样品(即从活的或曾经活过的生物制备的样品)或非-生物样品。一些实施方式中，所述样品是生物样品。生物样品的非限制性例子有器官(例如脑、肝脏和肾脏)、细胞、全血、血液成分、血液组分、血浆、血小板、血清、脑脊液(CSF)、脑组织、神经系统组织、肌肉组织、肌肉和脂肪组织(例如，肉)、骨髓、尿、眼泪、非神经系统组织、来源于活的或曾经活过的生物的食物、以及任何其他有机物质如植物材料。一些实施方式中，生物样品包括全血、血液成分、血液组分、血浆、血小板或血清。一些实施方式中，生物样品可从活检、尸体解剖或尸检获得。一些实施方式中，所述样品是非生物的。非生物样品的非限制性例子包括药物、化妆品和个人护理产品，以及不来源于活的或曾经活过的生物的食品，等等。样品可用常规方法(例如，加热、研磨、超声、接触某些消化酶类)预处理以确保样品中可能存在的致病性朊病毒蛋白能与拟肽试剂接触。
本发明的检测方法可采用文中所述的任何拟肽试剂。一些实施方式中，本发明的检测方法采用了相比构象疾病蛋白的非致病形式优先与构象疾病蛋白的致病形式相互作用的拟肽试剂，所述构象疾病蛋白例如是朊病毒蛋白，所述拟肽试剂具有以下结构式：
Xa-(Q)n-Xb
式中：
各Q独立为氨基酸或N-取代的甘氨酸，-(Q)n-定义了拟肽区域；
Xa是H、(C1-C6)烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、(C1-Cδ)酰基、氨基(C1-6)酰基、氨基酸、氨基保护基、或含有2至约100个氨基酸的多肽，其中，Xa任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代；
Xb是H、(C1-C6)烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、(C1-C6)烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羧基保护基、氨基酸、或含有2至约100个氨基酸的多肽，其中，Xb任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代；n是3至约30；其中至少约50％的拟肽区域-(Q)n-包含N-取代的甘氨酸。
在一些这样的实施方式中，n是约4至约30，优先约5至约30，且拟肽区域-(Q)n-包含至少一个独立选自以下的亚区域：
(a)-AABA-；
(b)-AABAB-；
(c)-ABACC-；
(d)-AAAAA-；
(e)-ABCBA-；
(f)-AABCA-；或
(g)-ABABA-；
其中A、B和C是各不相同的N-取代甘氨酸。
在检测方法的一些实施方式中，所述拟肽试剂包含氨基-末端区域、羧基-末端区域、和至少一个位于所述氨基-末端区域和所述羧基-末端区域之间的拟肽区域，其中的拟肽区域包含约3至约30个N-取代的甘氨酸并任选包含一个或多个氨基酸。在一些这样的实施方式中，所述拟肽区域包含选自以下的拟肽亚区域：
(a)-AABA-；
(b)-AABAB-；
(c)-ABACC-；
(d)-AAAAA-；
(e)-ABCBA-；
(f)-AABCA-；和
(g)-ABABA-；
其中A、B和C是各不相同的N-取代甘氨酸。
在本发明检测方法的一些实施方式中，拟肽试剂包含由构象疾病蛋白中3-30个氨基酸的肽片段的拟肽类似物，其中所述肽片段选自由以下序列构成的组：SEQ IDNos.12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、135、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227和228，其中：
(a)肽片段中的至少1个非脯氨酸残基被N-取代的甘氨酸替代以形成拟肽类似物；或
(b)肽片段中的至少5个氨基酸残基被N-取代的甘氨酸替代以形成拟肽类似物。
在上述方法的一些实施方式中，按照以下替代方案用N-取代的甘氨酸替代肽片段中的任何一个或多个氨基酸残基：
i)用N-(烷基)甘氨酸、N-(芳烷基)甘氨酸或N-(杂芳基烷基)甘氨酸代替Ala、Gly、Ile、Leu、Pro和Val；
ii)用N-(羟基烷基)甘氨酸、N-(烷氧基)甘氨酸、N-(氨基烷基)甘氨酸或N-(胍基烷基)甘氨酸代替Asp、Asn、Cys、Gln、Glu、Met、Ser和Thr；
iii)用N-(芳烷基)甘氨酸、N-(杂芳基烷基)甘氨酸、N-(羟基芳烷基)甘氨酸或N-(烷氧基芳烷基)甘氨酸代替Phe、Trp和Tyr；和
iv)用N-(氨基烷基)甘氨酸或N-(胍基烷基)甘氨酸代替Arg、His和Lys。
在一些这样的实施方式中，所述拟肽试剂包含由构象疾病蛋白中5-30个氨基酸的肽片段的拟肽类似物，如上所述。
在检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法的一些实施方式中，拟肽试剂包含本文所述的序列，如具有选自SEQ ID NOs：229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240或241的序列。一些实施方式中，拟肽试剂包含选自SEQ ID NO：229、230、232、233、234、235、237、238、239或240的序列。一些实施方式中，拟肽试剂包含选自SEQ ID NO：229、230、235、237、238、239或240的序列。一些实施方式中，拟肽试剂包含选自SEQ ID NO：230、237、238、239或240的序列。一些实施方式中，本发明的方法利用了拟肽试剂I、II、VII、IX、X、XIa、XIb、XII或XIIb中的一种或多种。一些实施方式中，本发明的方法利用了拟肽试剂II、IX、X、XIa、XIb、XIIa或XIIb中的一种或多种。一些实施方式中，用于该方法的拟肽试剂包含选自SEQ ID NOs：229、236、231、232、233、234或235的序列。一些实施方式中，拟肽试剂包含选自SEQ ID NOs：230、237、238、239或240的序列。在一些这样的实施方式中，拟肽试剂包含SEQ ID NO：230、237或240。一些这样的实施方式中，拟肽试剂包含SEQ ID NO：240。
一些实施方式中，检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法包括在允许第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触本发明第一拟肽试剂以形成包含第一拟肽试剂和致病性朊病毒蛋白的复合物，通过致病性朊病毒与第一拟肽试剂的结合来检测样品中可能存在的任何致病性朊病毒。可通过检测复合物的形成来检测致病性朊病毒与第一拟肽试剂的结合，该复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。通常，在该方法优选的实施方式中，在检测之前可将包含第一拟肽试剂和致病性朊病毒蛋白的复合物与剩余的样品(即未结合样品)分离。可通过检测复合物中的致病性朊病毒或通过解离复合物(与未结合的样品分离之后)并检测解离的致病性朊病毒来检测复合物的形成。解离的致病性朊病毒可以是或不是致病性构象的。一些实施方式中，解离的致病性朊病毒为变性的朊病毒构象。解离的致病性朊病毒可采用本领域已知的方法检测，如与适当的朊病毒同种型的特异性抗-朊病毒抗体结合，该方法将在本文中进一步描述。识别不同朊病毒同种型的抗体在本领域中已有描述(参见，例如，美国专利号5,846,533；6,765,088；6,261,790；4,806,627；6,165,784；6,528,269；EP891552，EP909388；Polymenidou等，The Lancet 2005 4：805)。
在上述方法的优选实施方式中，采用离液剂或采用如本文所述的高或低pH处理使致病性朊病毒从含有拟肽试剂的复合物中解离出来。
此外，检测样品中的致病性朊病毒的方法首先是与朊病毒-特异性拟肽试剂形成复合物，随后可通过分析方法检测该复合物。所述分析方法可包括例如UV/可见光谱法、FTIR、核磁共振波谱法、拉曼光谱、质谱法、HPLC、毛细管电泳、表面等离振子共振光谱法、微-电-机械系统(MEMS)之类的方法，或本领域已知的任何其他方法。
一些实施方式中，拟肽试剂或朊病毒-结合试剂包含可检测标记。适用于本发明的可检测标记包括，例如，任何能够检测的分子，如上文所述的。一些实施方式中，标记包括酶、放射性同位素、毒素或荧光团。此外，可检测标记可包括寡核苷酸标签，该标签可通过包括例如聚合酶链式反应(PCR)、转录介导的扩增(TMA)、分支DNA(b-DNA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)等在内的核酸检测法来检测。优选的可检测标记包括酶，尤其是碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)和荧光化合物。本领域熟知，酶可与可检测底物如生色底物或发荧光底物组合使用以产生可检测的信号。
在本发明所述检测方法的一些实施方式中，一种或多种拟肽试剂可连接于固相支持体。出于本发明的目的，固相支持体可以是任何不可溶的并可具有刚性或半刚性表面的材料，感兴趣的分子(例如，本发明的拟肽试剂、朊病毒蛋白、抗体等)可结合于或连接于所述表面。示例性的固相支持体包括但不限于上文中所述的那些。文中所述的拟肽试剂可共价连接于所述支持体，或通过吸附、偶联或采用结合对而连接于所述支持体。例如，采用本领域熟知的技术可将拟肽试剂方便地偶联于固相支持体。先偶联拟肽试剂与蛋白质(例如，当蛋白质具有更好的固相结合特性时)可促进其在支持体上固定。合适的偶联蛋白包括但不限于大分子，例如血清白蛋白，包括牛血清白蛋白(BSA)、匙孔
Figure A20068003312900521
血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白和本领域技术人员熟知的其它蛋白。也可通过结合对分子的相互作用使拟肽试剂连接于固相支持体。该结合对的一个成员偶联于固相支持体，而该结合对的另一个成员连接于拟肽试剂(在合成之前、之间或之后)。例如，支持体可包含抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，而拟肽试剂可包含生物素。除了生物素-抗生物素蛋白和生物素-链霉抗生物素蛋白，用于将拟肽连接于支持体的其他合适结合对包括但不限于：抗原-抗体、半抗原-抗体、模拟表位(mimetope)-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、A蛋白-抗体Fc。这种结合对是熟知的(参见，例如，美国专利号6,551,843和6,586,193)，本领域普通技术人员完全能选择合适的结合对并使其适用于本发明。或者，可采用本领域熟知的偶联化学方法使拟肽试剂共价连接于固相支持体。采用本领域已知的标准技术可将含有巯基的拟肽试剂直接连接于诸如羧化的磁珠等固相支持体(参见，例如Chrisey，L.A.，Lee，G.U.和O′Ferrall，CE.，(1996)，Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayer films(合成DNA与自身装配的单层膜共价连接)，Nucleic Acids Research，24(15)，3031-3039；Kitagawa，T.，Shimozono，T.，Aikawa，T.，Yoshida，T.和Nishimura，H.，(1980)，Preparation and characterization of hetero-bifunctional cross-linking reagents for proteinmodifications(制备和表征用于蛋白质修饰的异双功能交联剂)，Chem.Pharm.Bull.，29(4)，1130-1135)。首先采用碳二亚胺化学方法将羧化的磁珠与含马来酰亚胺官能团的异双功能交联接头(购自皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology Inc.)的BMPH)偶联。然后将巯基化的肽或拟肽与BMPH包被珠的马来酰亚胺官能团共价偶联。当用于本发明所述检测方法的实施方式时，固相支持体有助于将含有本发明拟肽试剂和致病性朊病毒蛋白的复合物与未结合样品分离。用于巯基偶联的特别方便的磁珠是戴纳尔公司(Dynal)的戴纳珠M-270羧酸(
Figure A20068003312900531
M-270Carboxylic Acid)。该拟肽试剂也可包含接头，例如，一个或多个氨基己酸部分。
在检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法的一些实施方式中，该方法包括在允许本发明第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触所述第一拟肽试剂以形成第一复合物，然后在允许本发明第二拟肽试剂与第一复合物中的致病性朊病毒结合的条件下使第一复合物接触可检测标记的所述第二拟肽试剂以形成第二复合物，然后检测所述致病性朊病毒与所述第二拟肽试剂的结合。一些实施方式中，可通过检测所述第二复合物的形成来检测所述致病性朊病毒蛋白与所述第二拟肽试剂的结合，所述第二复合物的形成表明存在致病性朊病毒。一些实施方式中，拟肽试剂不同。一些实施方式中，所述第一和所述第二拟肽试剂相同。一些实施方式中，第一拟肽试剂包含生物素。在进一步的实施方式中，第一拟肽试剂连接于固相支持体。
在本发明所述检测方法的一些实施方式中，该方法包括在允许本发明第一拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触该第一拟肽试剂以形成第一复合物；除去未结合样品，未结合样品中可能包含例如样品中存在的非致病性朊病毒；从第一复合物中解离出致病性朊病毒，从而提供解离的致病性朊病毒；在允许本发明第二拟肽试剂与解离的致病性朊病毒结合的条件下使解离的致病性朊病毒接触可检测标记的所述第二拟肽试剂以形成第二复合物；并检测所述第二复合物的形成，所述第二复合物的形成表明存在致病性朊病毒。该实施方式中，解离的致病性朊病毒保留了致病构象。
通常，“解离的致病性朊病毒”或“解离的朊病毒”可包含保留了致病构象的朊病毒蛋白以及变性的致病性朊病毒蛋白，其中，变性的朊病毒可能不具有致病构象或者正常的细胞构象，并且可能不是感染性的。
或者，当将本发明的拟肽试剂用于直接捕获致病性朊病毒蛋白以形成第一复合物并将第一复合物与未结合样品材料分离时，如上所述，任选可检测标记的朊病毒-结合试剂可用于检测致病性朊病毒，检测可在致病性朊病毒结合在第一复合物中时进行或在将朊病毒蛋白从第一复合物中解离后进行。如上所述，朊病毒-结合试剂是结合某些构象的朊病毒蛋白的试剂，例如，朊病毒-结合试剂可与朊病毒蛋白的变性形式、PrPC形式(非致病性同种型)或PrPSc形式(致病性同种型)中的一种或多种结合。一些此类朊病毒-结合试剂将结合一种以上的这些朊病毒蛋白形式。朊病毒-结合试剂已有描述，包括例如抗-朊病毒抗体(描述于Peretz等，1997 J.Mol.Biol.273：614；Peretz等，2001 Nature 412：739；Williamson等，1998 J Virol.72：9413；Polymenidou等，The Lancet 2005 4：805；美国专利号4,806,627；美国专利号6,765,088；和美国专利号6,537548)、基序接枝的杂交多肽(参见，W003/085086)、某些阳离子或阴离子聚合物(参见，WO03/073106)、某些可作为“增长催化剂”的肽(参见，WO02/097444)、朊病毒特异性肽试剂(参见，例如，WO2006/076687和US20060035242)以及血纤蛋白溶解酶原。如果所用的特定朊病毒-结合试剂结合朊病毒的变性形式，则明显先应使第一复合物中的致病性朊病毒蛋白变性再用该朊病毒-结合试剂检测。朊病毒结合试剂，尤其是抗-朊病毒抗体，对于特定动物种类的朊病毒蛋白具有选择性。因此就朊病毒构象的特异性和物种特异性而言，显然应选择具有合适结合特性的朊病毒结合试剂。
本发明的拟肽试剂因此可被用作样品中致病性朊病毒的“捕获”试剂或作为捕获的致病性朊病毒的“检测”试剂，或者同时作为捕获和检测试剂。当用拟肽试剂捕获致病性朊病毒时，可从剩余样品中除去捕获的朊病毒(通过与拟肽试剂形成复合物)，并可通过常规方法(例如，ELISA、Western印迹、免疫测定等)在朊病毒仍与拟肽试剂形成复合物时或已经从复合物解离之后对其进行检测。或者可利用可检测标记的第二拟肽试剂检测捕获的朊病毒。
ELISA
特别优选的检测样品内的致病性朊病毒的方法包括组合使用本发明拟肽试剂和改进的ELISA技术。该试验将拟肽试剂区分朊病毒蛋白致病和非致病形式的能力与改进的ELISA技术相结合。由于拟肽试剂优先与致病性朊病毒蛋白相互作用，所以这些试剂可用于分离和浓缩样品中存在的任何致病性朊病毒。不同于用蛋白酶K消化来区分致病性和非致病性同种型的方法(通常这种方法甚至会导致致病性同种型的一些N-末端被消化)，在本发明方法中采用拟肽试剂可分离出全长的致病性朊病毒蛋白。因此，识别朊病毒蛋白N-末端表位(例如残基23-90区域内的表位)的抗-朊病毒抗体以及识别朊病毒蛋白其他区域内的表位的抗-朊病毒抗体可用于检测。大多数种类来源的朊病毒蛋白的N-末端区域含有重复序列(4拷贝的八重复GQPHGGGS/W或5拷贝的牛PrP)。结合在该区域内的抗体可显示亲合力提高，从而提高试验的灵敏度。
一旦如上所述采用拟肽试剂将致病性朊病毒蛋白与非致病性同种型(存在于多数生物样品中)分离，可解离致病性朊病毒蛋白与拟肽试剂并采用本文所述的多种ELISA方式进行检测。在与拟肽试剂解离时致病性朊病毒通常被变性，尽管这不是必须的。优选先使捕获的PrPSc变性再进行ELISA，因为大多数高亲和力的抗-朊病毒抗体结合PrP的变性形式，许多结合变性PrP的抗-朊病毒抗体是已知的并可通过商业获得。可采用高浓度的离液剂如3M至6M的胍盐如硫氰酸胍或盐酸胍实现致病性朊病毒的解离和变性。必须先除去或稀释离液剂再进行ELISA，因为离液剂会干扰用于ELISA的抗-朊病毒抗体的结合。这样就导致了额外的洗涤步骤或使样品体积过大，二者都对高通量快速测定不利。
本发明人发现，在一些实施方式中，作为采用离液剂使致病性朊病毒蛋白变性并与拟肽试剂解离的优选替代方法是采用高或低pH。加入能将pH升至12以上的成分(例如，NaOH)或降至2以下的成分(例如，H3PO4)有助于致病性朊病毒蛋白与拟肽试剂解离和变性。此外，加入少量合适的酸或碱可方便地将pH重新调至中性，因此无需额外的洗涤也不会明显增加样品体积便可直接用于ELISA。
因此，本发明提供了一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：在允许拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒蛋白结合的条件下使怀疑含有致病性朊病毒的样品接触优先与朊病毒蛋白的致病形式相互作用的拟肽试剂；除去未结合样品材料；将致病性朊病毒与拟肽试剂解离；并用朊病毒-结合试剂检测是否存在解离的致病性朊病毒。显然，如果所用的具体朊病毒-结合试剂结合了朊病毒的变性形式，则“捕获的”致病性朊病毒蛋白应先变性再用朊病毒-结合试剂检测。优选地，所述朊病毒-结合试剂是抗-朊病毒抗体。
结合朊病毒尤其是结合PrPC或变性PrP的抗体、修饰的抗体或其他试剂已有描述，且其中一些可通过商业获得(参见，例如，Peretz等，1997 J.Mol.Biol.273：614；Peretz等，2001 Nature 412：739；Williamson等，1998 J.Virol.72：9413；Polymenidou等，2005 Lancet 4：805；美国专利号6,765,088中描述的抗-朊病毒抗体。这些试剂中的一些以及其他试剂可通过商业获得，其中包括加州南旧金山的英普生物技术公司(InPro Biotechnology，South San Francisco，CA)，密歇根州安阿伯的鳄鱼化学品公司(Cayman Chemicals，Ann Arbor MI)；苏黎士的普莱尼克公司(Prionics AG，Zurich)；修饰抗体的描述也可参见WO 03/085086)。用于该方法的合适抗体包括但不限于：3F4(US 4,806,627)，D18(Peretz等，J.Mol Biol.1997 273：614)，D13(Peretz 1997，同上)，6H4(Liu等，J.Histochem.Cytochem.2003 51：1065)，MAB5242(开米康公司(Chemicon))，7D9(Kascsak等，1987 J.Virol.61：3688)，BDI115(生物设计供给公司(Biodesign International))，SAF32，SAF53，SAF83，SAF84(购自法国SPI生物制品公司(SPI Bio，France)的SAF抗体)，19B10(WO2004/4033628)，7VC(WO2004/4033628)，12F10(SPI生物制品公司)，PRI308(SPI生物制品公司)，34C9(普莱尼克公司)，Fab HuM-P(Peretz等，Nature 2001 412：739)，POM 1到POM 19(Polymenidou等，2005，同上)Fab HuM-R1(Peretz 1997，同上)，以及Fab HuM-R72(Peretz 1997，同上)。采用本领域熟知的方法可以方便地产生其他抗-朊病毒抗体。优选的抗-朊病毒抗体将是能够结合致病性朊病毒变性形式的抗体。特别优选的抗-朊病毒抗体是能够识别朊病毒蛋白N-末端区域中表位的抗体。一些抗-朊病毒抗体对一种或有限数目动物种类的朊病毒蛋白具有特异性，而其他一些能够结合许多动物种类的朊病毒蛋白。显然，可以根据要分析的样品和测试目的选择适当的抗-朊病毒抗体。
在优选的实施方式中，在固相支持体上提供拟肽试剂。可先在固相支持体上提供拟肽试剂再接触样品，或先接触样品并与其中的任何致病性朊病毒结合再改造拟肽试剂使之适合与固相支持体(例如，通过采用生物素化的拟肽试剂和含有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的固相支持体)结合。
因此，本发明还提供了一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：
(a)在第一固相支持体上提供第一拟肽试剂；
(b)在允许样品中存在的致病性朊病毒蛋白结合拟肽试剂的条件下使第一固相支持体接触样品以形成第一复合物；
(c)除去未结合的样品材料；
(d)从第一复合物中解离出致病性朊病毒蛋白；和
(e)用朊病毒-结合试剂检测解离的致病性朊病毒。
所述拟肽试剂可以是本文所述的那些拟肽试剂中的任何一种，优选地，所述拟肽试剂来源于选自SEQ ID NO：229-241的序列。所述朊病毒结合试剂将在文中进一步描述。优选地，所述朊病毒-结合试剂是抗-朊病毒抗体。第一固相支持体优选是磁珠，更优选是聚苯乙烯/氧化铁珠。
使拟肽试剂连接于固相支持体的方法是本领域的常规方法并将在本文的其他部分中描述，包括熟知的使蛋白质和肽连接于各种固体表面的方法。在允许样品内的任何致病性朊病毒蛋白与拟肽试剂结合的条件下使样品接触含有拟肽试剂的固相支持体以形成第一复合物。这种结合条件是本领域的一般技术人员容易确定的并在文中有进一步的描述。通常，该方法是在微滴定板的孔内或在小体积塑料试管内进行，但任何常规容器也适用。所述样品通常是液体样品或悬浮液并可在拟肽试剂之前或之后加入反应容器中。一旦形成第一复合物，例如可通过离心、沉淀、过滤、磁力等方法将固体支持体与反应溶液(含有未结合的样品材料)分离以除去未结合的样品材料(即未与拟肽试剂结合的任何样品组分，包括任何未结合的致病性朊病毒蛋白)。可任选对带有第一复合物的固相支持体进行一次或多次洗涤步骤以除去任何残余的样品材料，再进行该方法下面的步骤。
除去未结合的样品材料并进行任何任选的洗涤步骤之后，将结合的致病性朊病毒蛋白从第一复合物中解离。解离可通过多种方法实现。在一个实施方式中，加入的离液剂，优选胍盐化合物，例如硫氰酸胍或盐酸胍，的浓度为3-6M。加入这些浓度范围内的离液剂导致致病性朊病毒蛋白与拟肽试剂解离从而使得致病性朊病毒蛋白变性。
在另一实施方式中，解离是通过将pH升至12或以上(“高pH”)或降至2或以下(“低pH”)完成的。使第一复合物接触高或低pH导致致病性朊病毒蛋白与拟肽试剂解离从而使得致病性朊病毒蛋白变性。该实施方式中，优选使第一复合物接触高pH。pH在12.0和13.0之间通常就足够了；优选地，采用的pH范围为12.5-13.0；更优选地，pH为12.7-12.9；最优选地，pH为12.9。或者，可采用使第一复合物接触低pH来使致病性朊病毒蛋白与拟肽试剂解离并变性。在这种替代方法中，pH在1.0和2.0之间就足够了。使第一复合物接触高pH或低pH只需进行较短时间，例如60分钟，优选不超过15分钟，更优选不超过10分钟。接触时间长于此可导致致病性朊病毒蛋白的结构遭到显著破坏从而使得检测步骤所用抗-朊病毒抗体所识别的表位被破坏。接触足以解离致病性朊病毒蛋白的时间后，可通过加入酸性试剂(如果采用高pH解离条件)或碱性试剂(如果采用低pH解离条件)方便地将pH重新调至中性(即pH在约7.0和7.5之间)。本领域普通技术人员可方便地确定合适的方法，其例子如文中所述。
通常，为实现高pH解离条件，加入NaOH至浓度为约0.05N至约0.2N就足够了。优选地，加入NaOH至浓度在0.05N和0.15N之间；更优选地，采用0.1N NaOH。一旦实现致病性朊病毒与拟肽试剂解离，可加入适量酸性溶液如磷酸、磷酸二氢钠将pH重新调至中性(即在约7.0和7.5之间)。
通常，为实现低pH解离条件，加入H3PO4至浓度为约0.2M至约0.7M就足够了。优选地，加入H3PO4至浓度在0.3M和0.6M之间；更优选地，采用0.5M H3PO4。一旦实现致病性朊病毒与拟肽试剂解离，可加入适量碱性溶液如NaOH或KOH将pH重新调至中性(即在约7.0和7.5之间)。
然后将解离的致病性朊病毒蛋白与含有拟肽试剂的固相支持体分离。可通过与上述除去未结合的样品材料类似的方法实现分离，但含有未结合材料(现在是解离的致病性朊病毒蛋白)的部分被保留而固体支持体材料部分被丢弃。
可用朊病毒-结合试剂检测解离的致病性朊病毒蛋白。许多这种朊病毒-结合剂是已知的并如文中所述。优选的检测解离的致病性朊病毒蛋白的朊病毒-结合试剂是抗-朊病毒抗体。许多抗-朊病毒抗体已有描述并有许多可通过商业获得，例如，Fab D18(Peretz等，(2001)Nature 412：739-743)，3F4(购自密苏里州圣路易斯的西格玛化学品公司(Sigma Chemical St Louis MO)；也可参见美国专利号4,806,627)，SAF-32(密歇根州安阿伯的鳄鱼化学品公司)，6H4(苏黎士的普莱尼克公司；也可参见美国专利号6,765,088)，POM 1-19(Polymenidou等，The Lancet 2005 4：805)以及上文描述的和本领域熟知的其他抗体。可采用ELISA类型的试验，包括直接ELISA或抗体夹心ELISA试验，来检测解离的致病性朊病毒蛋白，这些试验将在下文中更加充分地描述。尽管术语“ELISA”用来描述用抗-朊病毒抗体进行检测，但该试验不限于其中抗体是“酶联”的试验。可用如本文所述和免疫测定领域熟知的任何一种可检测标记来标记检测抗体。
在该方法的一个实施方式中，将解离的致病性朊病毒蛋白被动包被在第二固相支持体表面。这种被动包被法是熟知的，且通常在100mM NaHCO3 pH 8下于37℃进行数小时或者于4℃进行过夜。其他包被缓冲液是熟知的(例如，50mM碳酸盐pH9.6，10mM Tris pH 8，或10mM PBS pH 7.2)。所述第二固相支持体可以是文中所述的或本领域熟知的任何固相支持体；优选所述第二固相支持体是微滴定板，例如，96孔聚苯乙烯平板。当采用高浓度离液剂进行解离时，先通过稀释使离液剂的浓度降低至少约2倍再包被所述第二固相支持体。当采用高或低pH进行解离时，中和后便可用解离的致病性朊病毒蛋白进行包被而无需进一步稀释。
一旦将解离的致病性朊病毒蛋白包被于所述第二固相支持体上，可洗涤支持体以除去任何未附着于固体支持体的组分。在允许抗体与包被在所述第二固相支持体上的朊病毒蛋白结合的条件下加入抗-朊病毒抗体。如果解离的致病性朊病毒蛋白先变性再包被于所述第二固相支持体之上，则所用的抗体是能与朊病毒蛋白的变性形式结合的抗体。这种抗体包括熟知的那些(如上述那些)以及通过熟知的方法产生的抗体，所述方法例如采用rPrP、PrPC或其片段在小鼠、家兔、大鼠等中引起免疫反应(参见，美国专利号4,806,627；6，165,784；6,528,269；6,379,905；6,261,790；6,765,088；5,846,533；EP891552B1和EP 909388B1)。特别优选能识别朊病毒蛋白N-末端表位的抗-朊病毒抗体，例如，识别残基23-90区域内表位的抗体。
因此，本发明的一个实施方式提供了一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：
(a)在第一固相支持体上提供第一拟肽试剂；
(b)在允许样品中存在的致病性朊病毒蛋白结合拟肽试剂的条件下使第一拟肽试剂接触样品以形成第一复合物；
(c)除去未结合的样品材料；
(d)从第一复合物中解离出致病性朊病毒蛋白；
(e)将解离的致病性朊病毒蛋白与第一固相支持体分离；
(f)在允许解离的朊病毒蛋白附着于所述第二固相支持体的条件下使解离的致病性朊病毒蛋白接触第二固相支持体；和
(g)用朊病毒-结合试剂检测附着于所述第二固相支持体的致病性朊病毒。
该实施方式中，所述第一固相支持体优选是磁珠；所述第二固相支持体优选是微滴定板；所述朊病毒-结合试剂优选是抗-朊病毒抗体，尤其是3F4、6H4、SAF32或如Polymenidou(同上)所述POM抗体中的一种或多种。所述朊病毒-结合试剂是可检测标记的。
在该方法的另一实施方式中，用抗体夹心类型的ELISA检测解离的致病性朊病毒蛋白。该实施方式中，解离的朊病毒蛋白被“重新捕获”到含有第一抗-朊病毒抗体的第二固相支持体上。可任选洗涤所述带有重新捕获的朊病毒蛋白的第二固相支持体以除去任何未结合的材料，然后在允许第二抗-朊病毒抗体结合重新捕获的朊病毒蛋白的条件下接触所述第二抗-朊病毒抗体。所述第一和第二抗-朊病毒抗体通常是不同的抗体，并且优选识别朊病毒蛋白上的不同表位。例如，第一抗-朊病毒抗体将识别朊病毒蛋白N-末端的表位，而所述第二抗-朊病毒抗体将识别N-末端之外的表位，反之亦然。第一抗体可以是，例如，SAF32，它识别八重复区域(残基23-90)中的表位，而所述第二抗体可以是3F4，它识别残基109-112中的表位；或者，第一抗体可以是3F4而所述第二抗体可以是SAF32。可以方便地选择第一和第二抗体的其他组合。该实施方式中，所述第二抗-朊病毒抗体而非第一抗-朊病毒抗体将被可检测标记。当采用离液剂使致病性朊病毒蛋白与拟肽试剂解离时，必须先除去离液剂或稀释至少15倍再进行检测。当采用高或低pH实现解离并中和后，可使用解离的朊病毒而无需进一步稀释。当解离的致病性朊病毒蛋白先变性再检测时，则第一和第二抗体都将结合变性的朊病毒蛋白。
因此，本发明提供了一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：
(a)在第一固相支持体上提供如本文所述的第一拟肽试剂；
(b)在允许样品中存在的致病性朊病毒蛋白结合拟肽试剂的条件下使第一拟肽试剂接触样品以形成第一复合物；
(c)除去未结合的样品材料；
(d)从第一复合物中解离出致病性朊病毒蛋白从而使致病性朊病毒蛋白变性；
(e)将解离的变性致病性朊病毒蛋白与第一固相支持体分离；
(f)在允许解离的朊病毒蛋白结合第一抗-朊病毒抗体的条件下使解离的变性致病性朊病毒蛋白接触第二固相支持体，其中所述第二固相支持体包含第一抗-朊病毒抗体；和
(g)用第二抗-朊病毒抗体检测结合于所述第二固相支持体上的朊病毒蛋白。
该实施方式中，所述第一固相支持体优选是磁珠；所述第二固相支持体优选是微滴定板或磁珠；第一和第二抗-朊病毒抗体优选是不同的抗体；第一和第二抗体优选能结合变性的朊病毒蛋白；优选地，第一或第二抗-朊病毒抗体中至少一种能识别朊病毒蛋白N-末端区域的表位。一些实施方式中，所述第二抗-朊病毒抗体被可检测标记；在进一步的实施方式中，所述第二抗-朊病毒抗体是酶标记的。
上述任何检测致病性朊病毒的方法可用于诊断朊病毒-相关疾病的方法。
诊断和治疗
本发明还提供治疗或预防朊病毒-相关疾病的方法，该方法包括给予动物一种或多种如本文所述的拟肽试剂或其组合物。本发明还提供了确定动物中朊病毒-相关疾病感染水平的方法，该方法可用来作出诊断和评估对治疗或预防的需求。如果需要治疗或预防，则治疗或预防可能是或可能不是针对朊病毒-相关疾病的。即，如果判断不存在朊病毒感染，则可能需要针对非-朊病毒相关疾病、病症或症状的治疗或预防。这种治疗可以是，例如，常规药物。本发明还提供确定朊病毒-相关感染部位的方法。
术语“治疗”在文中表示治愈、缓解或逆转疾病或病症的进程，或者缓解或逆转这种疾病或病症的一种或多种症状或副作用。
术语“施药”在文中表示直接施用拟肽试剂或其组合物，这将为接受施药的动物提供治疗有效量的拟肽试剂。
文中，短语“治疗有效量”指活性拟肽试剂或组合物的用量能够在组织、系统、动物、个体或人中引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生所寻求的生物学或医学反应，所述反应包括以下一种或多种：
(1)预防疾病；例如，在可能有疾病、症状或病症倾向但还未经历或出现疾病的病理学或症候学的个体中防止疾病、症状或病症；
(2)抑制疾病；例如，在经历或出现疾病、症状或病症的病理学或症候学的个体中抑制疾病、症状或病症；和
(3)缓解疾病；例如，在经历或出现疾病、症状或病症的病理学或症候学的个体中缓解疾病、症状或病症(即逆转该病理学和/或症候学)，如降低疾病的严重性。
一些实施方式中，该方法包括获得动物样品；按照本发明所述检测方法检测是否存在致病性朊病毒；和根据存在或不存在所检测的致病性朊病毒来确定朊病毒疾病感染的水平。
一些实施方式中，提供了确定动物内朊病毒-相关疾病感染部位的方法，该方法包括给予所述动物本发明的拟肽试剂或其组合物，其中所述拟肽试剂结合于显象剂；并检测该显像剂，从而能在动物中定位所述朊病毒-相关疾病感染。
在治疗或预防动物的朊病毒-相关疾病的一些实施方式中，该方法包括按照本发明所述检测方法确定动物内是否存在一种或多种致病性朊病毒；在确定存在一种或多种致病性朊病毒之后给动物施用一种或多种本发明的拟肽试剂或包含该拟肽试剂的组合物；或者在确定不存在一种或多种致病性朊病毒之后给动物施用一种或多种常规药物。一些实施方式中，该方法包括在确定存在朊病毒-相关疾病感染之后给动物施用一种或多种常规药物。一些实施方式中，检测样品包括器官物质、细胞、全血、血液成分、血液组分、血浆、血小板、血清、脑脊液(CSF)、脑组织、神经系统组织、肌肉组织、肌肉和脂肪组织、骨髓、尿、眼泪或非神经系统组织。
在治疗或预防动物的朊病毒-相关疾病的一些实施方式中，该方法包括给予所述动物包含本发明所述拟肽试剂或含有该拟肽试剂的组合物的第一剂，并给予所述动物包含本发明所述拟肽试剂或含有该拟肽试剂的组合物第二剂，其用量足以在所述动物体内诱导免疫应答。“免疫应答”在文中表示动物中发生针对拟肽试剂的体液和/或细胞免疫反应，如当疫苗内存在拟肽试剂时。因此，免疫应答通常导致动物内发生分泌型、细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，这种反应包括但不限于一种或多种以下效应：产生任何一种免疫类型的抗体，如免疫球蛋白A、D、E、G或M，B和T淋巴细胞增殖，提供免疫细胞的激活、生长和分化信号，以及辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒T细胞扩增。产生的抗体量取决于若干因素，包括所涉及的动物、施用的化合物的剂数、是否存在佐剂，等等。
本发明的一些拟肽试剂组合物还包含佐剂。在治疗或预防动物中朊病毒-相关疾病的方法的一些实施方式中，第一剂和/或所述第二剂包含至少一种佐剂。在一些这样的实施方式中，第一剂和第二剂都包含佐剂。可用于本发明药剂和组合物的佐剂的非限制性例子包括WO05/016127中描述的那些，将其全文纳入本文。
在治疗或预防动物中朊病毒-相关疾病的方法的一些实施方式中，已诊断出动物受致病性朊病毒感染。一些实施方式中，所述动物已经亲密接触过已被诊断出受致病性朊病毒感染的第二只动物。“亲密接触”指所述动物与确诊的动物在同一牧群或兽群中，在同一个农场、牧场等，或者被一起转移、加工，等等。一些实施方式中，所述动物是已被诊断出受致病性朊病毒感染的第二只动物的家族成员。一些实施方式中，所述动物显示出与朊病毒-相关疾病有关的症状。一些实施方式中，所述动物有患朊病毒-相关疾病的风险。“有风险”的动物可以是在遗传上或其他方面(例如，环境因素)有产生、感染、接受、接触朊病毒-相关疾病倾向的动物。环境倾向包括，例如，生活在地理上或身体上曾经接触过朊病毒-相关疾病的地区的牧群或兽群中的动物。一些实施方式中，有风险的动物是受致病性朊病毒感染或者怀疑受致病性朊病毒感染的动物的后代。一些实施方式中，有风险的动物曾经摄入来源于第二只动物的生物材料，其中所述第二只动物感染了朊病毒-相关疾病或有患朊病毒-相关疾病的风险。
构成第一剂的组合物与构成第二剂的组合物可以相同或不同。一些实施方式中，第二剂中的组合物与第一剂中的组合物相同。一些实施方式中，第一剂和第二剂中的组合物不同。一些实施方式中，该方法还包括施用常规药物。一些实施方式中，常规药物包括抗体、寡核苷酸、有机化合物或肽模拟物。一些实施方式中，常规药物是抗原或免疫调节剂，如免疫球蛋白、细胞因子、淋巴因子和趋化因子，包括但不限于白介素2(IL-2)、修饰的IL-2(cys125-ser125)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素12(IL-12)、α-或γ-干扰素、细胞因子IP-10，以及β细胞因子如RANTES、MIP1-α和MTP1-β。
在任何一种本发明所述治疗和预防方法中的动物包括人和非人。对于非人动物而言，动物可以是野生的，即未驯服的，例如有鹿、麇鹿、驼鹿、羚羊、熊、山羊、骆驼、野牛、马、骡和公驴，大型猫科动物，如豹、美洲狮、美洲豹、虎、狮和猎豹，以及小型哺乳动物，例如家兔、草原犬鼠、浣熊、臭鼬等，或者鸟类；或是驯养动物，包括，例如，驯养的宠物，如猫、狗、雪貂、家兔、大鼠或小鼠，畜牧动物和家畜，如母牛、牛、绵羊、猪、山羊、马、骡和公驴，或是鸟类，如鸡、母鸡、鸭、鹅、火鸡和其他鸡形目的的鸟类，以及实验室动物，例如非人灵长类如猿、猴和狐猴(lumer)，以及啮齿类动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠。适用于本发明的动物可以是任何年龄的，包括成年的和新生的。一些实施方式中，所述动物是哺乳动物。一些实施方式中，所述哺乳动物是人。一些实施方式中，所述哺乳动物不是人。一些实施方式中，组合物按上文所述施用。一些实施方式中，所述哺乳动物包括猫、狗、雪貂、家兔、大鼠、小鼠、母牛、公牛、绵羊、羔羊、猪、山羊、马、骡、公驴、鹿、麇鹿、熊、野牛、美洲豹、美洲狮、猿、猴、狐猴、仓鼠或豚鼠。一些实施方式中，所述哺乳动物包括母牛、公牛、鹿、绵羊、羔羊、猪或山羊。一些实施方式中，所述组合物是肌肉内、粘膜内、鼻内、皮下、真皮内、透皮、阴道内、直肠内、经口或静脉内施用的。
分离、减少和消除
本发明还提供了从样品中分离致病性朊病毒或减少样品中致病性朊病毒含量的方法。
从样品中分离致病性朊病毒的方法包括提供包含本发明拟肽试剂的固相支持体；在允许样品中如果存在的致病性朊病毒结合拟肽试剂的条件下使固相支持体接触样品以形成复合物，然后除去未结合的样品，从而提供分离的致病性朊病毒。一些实施方式中，该方法还包含从复合物中解离致病性朊病毒。
减少样品中致病性朊病毒含量的方法包括提供包含本发明拟肽试剂的固相支持体；然后在允许样品中如果存在的致病性朊病毒结合支持体上的拟肽试剂的条件下使固相支持体接触样品；以及回收未结合的样品，从而提供致病性朊病毒含量减少的样品。一些实施方式中，致病性朊病毒含量降至可检测水平之下。一些实施方式中，致病性朊病毒含量降低约80-100、约85-100、约90-100或约95-100％。
本发明还提供一种制备基本上不含致病性朊病毒的血液供给的方法，其中所述血液供给包括收集的血液样品如血库或在手术前从患者收集的血液样品，如在手术中进行自源性输血(self-sourced transfusion)。血液供给可包括，例如但不限于，全血、血浆、血小板或血清。一些实施方式中，该方法包括按照本发明所述检测方法检测大量样品中是否存在致病性朊病毒，以及合并未检测出致病性朊病毒的样品从而提供基本上不含致病性朊病毒的血液供给。一些实施方式中，本发明检测方法包括使拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合以形成复合物，并通过其与拟肽试剂的结合检测样品中是否存在致病性朊病毒。一些实施方式中，可通过检测复合物的形成来检测致病性朊病毒与拟肽试剂的结合，该复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。一些实施方式中，先将包含拟肽试剂和致病性朊病毒蛋白的复合物与剩余样品(即未结合的样品)分离再检测。一些实施方式中，可通过检测复合物内的致病性朊病毒或通过解离复合物(与未结合的样品分离之后)并检测解离的致病性朊病毒来检测复合物的形成。
本发明还提供一种制备基本上不含致病性朊病毒的食品供给的方法，所述食品供给例如肉食供给(例如，牛、绵羊或猪的肌肉和脂肪组织(即，肉)，例如供人类或动物消费的牛肉、羔羊肉、羊肉或猪肉)。一些实施方式中，该方法包括按照本发明所述检测方法检测大量样品中是否存在致病性朊病毒，合并未检测出致病性朊病毒的样品从而提供基本上不含致病性朊病毒的食品供给。一些实施方式中，所述食品供给收集自将进入食品供应的活的或曾经活的生物，或收集自即将进入食品供应的食物。一些实施方式中，本发明检测方法包括使拟肽试剂与如果存在的致病性朊病毒结合以形成复合物，并通过其与拟肽试剂的结合检测样品中是否存在致病性朊病毒。一些实施方式中，可通过检测复合物的形成来检测致病性朊病毒与拟肽试剂的结合，该复合物的形成表明存在所述致病性朊病毒。一些实施方式中，先将包含拟肽试剂和致病性朊病毒蛋白的复合物与剩余样品(即未结合的样品)分离再检测。一些实施方式中，可通过检测复合物内的致病性朊病毒或通过解离复合物(与未结合的样品分离之后)并检测解离的致病性朊病毒来检测复合物的形成。
设计
本发明还提供设计本发明拟肽试剂的方法。首先可根据朊病毒蛋白某些肽片段(例如含有SEQ ID NO：12-228的肽片段)的序列，用N-取代的甘氨酸替代该序列中的氨基酸残基来设计拟肽试剂，用美国专利号5,811,387，5,831,005，5,877,278，5,977,301和6,033,631以及Simon等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：9367所述的方法合成修饰的肽，通过引用将这些出版物全文纳入本文，通过本文所述的方法检测修饰的肽与致病性朊病毒蛋白的结合情况。可按照下述替代方案作出其它替代直到获得合适的拟肽试剂。
此外，拟肽试剂的设计可包括下面实施例5中所述的“拟肽的固相亚单体合成方案”中所述的多个方面。
一些实施方式中，制造本发明拟肽试剂的方法包括：
a)提供朊病毒蛋白的肽片段；通过以下替代方案用N-取代的甘氨酸代替肽片段的第一个氨基酸：
i)Ala、Gly、Ile、Leu、Pro和Val可被N-(烷基)甘氨酸、N-(芳烷基)甘氨酸或N-(杂芳基烷基)甘氨酸替代；
ii)Asp、Asn、Cys、Gln、Glu、Met、Ser和Thr可被N-(羟基烷基)甘氨酸、N-(烷氧基)甘氨酸、N-(氨基烷基)甘氨酸或N-(胍基烷基)甘氨酸替代；
iii)Phe、Trp和Tyr可被N-(芳烷基)甘氨酸、N-(杂芳基烷基)甘氨酸、N-(羟基芳烷基)甘氨酸或N-(烷氧基芳烷基)甘氨酸替代；和
iv)Arg、His和Lys可被N-(氨基烷基)甘氨酸或N-(胍基烷基)甘氨酸替代；
b)按照步骤a)用N-取代的甘氨酸代替肽片段的第二个氨基酸；
c)按照步骤a)用N-取代的甘氨酸代替肽片段的第三个氨基酸；和
d)任选地将步骤c)重复1-27次，
从而提供包含3-30个N-取代甘氨酸的设计的拟肽试剂；以及合成设计的拟肽试剂。
在上述方法的一些实施方式中，所述肽片段包含具有选自下组的序列的肽：SEQID NOs.12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、135、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227和228。
在上述方法的一些实施方式中，所述肽片段包含具有选自下组的序列的肽：SEQID NOs.66、67、68、72、81、96、97、98、107、108、109、14、35、36、37、40、50、51、77、89、100、101、110、56、57、65、82、84、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、278、279、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和228。
在上述方法的一些实施方式中，所述肽片段包含具有选自下组的序列的肽：SEQID NOs.12、14、50、51、52、68、72、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、135、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218和219。
在上述方法的一些实施方式中，所述肽片段包含具有选自下组的序列的肽：SEQIDNOs.14、50、51、52、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218和219。
在上述方法的一些实施方式中，所述肽片段包含具有选自下组的序列的肽：SEQID NOs.12、68、72、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、135、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159和160。
在拟肽试剂的设计方法的一些实施方式中，所述肽片段包含具有选自下组的序列的肽：SEQ ID NOs.12，14，50，51，52，67，68，72和109。一些实施方式中，所述肽片段包含具有选自SEQ ID NO：14或68的序列的肽。
一些实施方式中，该方法还包含在拟肽试剂中加入选自效应分子、底物或标记的结合部分，所述效应分子、底物或标记各自任选通过接头部分连接于拟肽试剂。一些实施方式中，结合部分包含生物素。一些实施方式中，结合部分包含巯基。
其他应用
本发明还提供一种包含至少一种本发明拟肽试剂的固相支持体。所述固相支持体可如上文所述。本发明还提供一种用于检测样品内是否存在致病性朊病毒的试剂盒。一些实施方式中，所述试剂盒中装有本发明的拟肽试剂。一些实施方式中，所述试剂盒中装有含本发明拟肽试剂的固相支持体。一些实施方式中，所述试剂盒中装有含本发明拟肽试剂的固相支持体以及一种试剂。所述试剂可以是，例如但不限于：检测试剂如可检测标记的-抗体、生色团、发色团，朊病毒-结合试剂如抗-朊病毒抗体、基序接枝的杂交多肽、阳离子或阴离子聚合物、增长催化剂和血纤蛋白溶解酶原，或者缓冲液。一些实施方式中，所述试剂盒中装有两种或多种本发明拟肽试剂。在试剂盒的一些实施方式中，任选包含阳性和/或阴性对照。
为更加充分地理解本文所述的本发明，下面提供了实施例。应理解，这些实施例只是出于举例的目的而并非以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1
拟肽区域的序列
表1列出了适用于制备本发明拟肽试剂的拟肽区域的例子(氨基到羧基方向)。表2提供了表1所用缩写的检索表。表3提供了各序列的相关结构。按照本文所述试验测试出含有表1所列序列的拟肽试剂优先结合PrPSc。下面还描述了具体试剂的制备。
表1：本发明所述拟肽试剂的代表性拟肽区域。
Figure A20068003312900681
表2：表1的缩写检索表
  拟肽残基缩写   氨基酸取代
  Ntyr   N-(2-(4-(羟苯基)乙基)甘氨酸
  Nhph   N-(4-羟苯基)甘氨酸
  Nspe   (S)-N-(1-苯基乙基)甘氨酸
  Nme   N-(2-甲氧基乙基)甘氨酸
  Ncpm   N-(环丙基甲基)甘氨酸
  Ntrp   N-(2-3’-吲哚基乙基)甘氨酸
  Nab   N-(4-氨基丁基)甘氨酸
  Nmpe   N-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)甘氨酸
  Ndmb   N-(3，5-二甲氧基苄基)甘氨酸
  Nbn   N-苄基甘氨酸
  Nhye   N-(2-羟乙基)甘氨酸
  Nip   N-异丙基甘氨酸
  Nnm   N-(8’-萘基)甲基)甘氨酸
  Ngd   N-(4-胍基丁基)甘氨酸
  Nae   N-(4-氨基乙基)甘氨酸
表3：表1所列拟肽区域的相关结构。
Figure A20068003312900691
Figure A20068003312900701
实施例2
拟肽试剂
采用诸如美国专利号5,811,387、5,831,005、5,877,278、5,977,301和6,033,631以及Simon等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：9367中所述的制备含有N-取代的甘氨酸残基的拟肽分子的合成方法来制备以下拟肽试剂，各文献通过引用全文纳入本文，并采用实施例5中所述方案。按照本文所述试验检测下述各试剂对朊病毒蛋白的结合亲和力。
拟肽试剂I
下述拟肽试剂包含SEQ ID NO：229。
Figure A20068003312900702
计算分子量：1054.42；观测分子量：1054.2。所有观测到的分子量测量值采用沃特斯公司(Waters，马萨诸塞州米尔福德)的微质量(Micromass)ZQ LC/MS系统测量。
拟肽试剂II
下述拟肽试剂包含SEQ ID NO：230。
Figure A20068003312900711
计算分子量：1290.70；观测分子量：1290.8。
拟肽试剂III
下述拟肽试剂包含SEQ ID NO：231。
计算分子量：1861.30；观测分子量：1861.6。
拟肽试剂IV
下述拟肽试剂包含SEQ ID NQ：232。
Figure A20068003312900713
拟肽试剂V
下述拟肽试剂包含SEQ ID NQ：233。
Figure A20068003312900714
拟肽试剂VI
下述拟肽试剂包含SEQ H) NO：234。
Figure A20068003312900721
计算分子量：1956.49；观测分子量：1956.2。
拟肽试剂VII
下述拟肽试剂包含SEQ ID NO：235。
Figure A20068003312900722
计算分子量：1896.39；观测分子量：1896.4。
拟肽试剂VIII
下述拟肽试剂包含SEQ ID NO：236。
Figure A20068003312900723
计算分子量：1732.18；观测分子量：1732.4。
拟肽试剂IX
下述拟肽试剂包含SEQ ID NO：237。
Figure A20068003312900724
计算分子量：1248.65；观测分子量：1248.4。
拟肽试剂X
下述拟肽试剂包含SEQ ID NO：238。
Figure A20068003312900731
计算分子量：1248.65；观测分子量：1248.4。
拟肽试剂XIa和XIb
下述拟肽试剂XIa和XIb包含SEQ ID NO：239。
Figure A20068003312900732
XIa：计算分子量：1304.76；观测分子量：1304.6。
XIb：计算分子量：1166.59；观测分子量：1166.2。
拟肽试剂XIIa和XIIb
下述式XIIa和XIIb的拟肽试剂包含SEQ ID NO：240。
Figure A20068003312900733
Figure A20068003312900741
XIIa：计算分子量：1276.71；观测分子量：1276.6。
拟肽试剂XIII
下述拟肽试剂包含SEQ ID NO：241。
Figure A20068003312900742
计算分子量：1256.58；观测分子量：1256.6。
实施例3
结合试验
拉下(Pull-Down)试验
采用磁珠拉下试验来检测实施例2所述拟肽试剂特异性结合致病性朊病毒蛋白的能力。在该试验中，拟肽试剂通过以下两种方式之一连接于磁珠：1)用生物素标记肽试剂，从而使其能够连接于链霉抗生物素蛋白包被的磁珠，或2)通过硫羟丙酸(thiol propionic acid)使拟肽共价结合于磁珠。拟肽试剂连接于珠的方式对拟肽试剂的结合活性几乎没有影响；然而，当拟肽试剂共价连接于珠时，观察到用作稀释剂的血浆样品的背景干扰较小。磁珠获自威斯康星州布朗迪尔的戴纳尔公司(Dynal，Brown Deer，WI)。通常，采用生物素化的拟肽试剂进行一次拉下反应需要10微升(10μl)链霉抗生物素蛋白M-280戴纳珠
Figure A20068003312900743
(目录号112.05)。
从英国普特斯堡南米姆斯布兰彻路的国家生物标准和控制研究所(NIBSC)(National Institute for Biological Standards and Controls，Blanche Lane，South Mimms，Pottersbar，United Kingdom)获得已故CJD患者和健康(即，非-CJD)已故个体的人脑匀浆液(10％w/v，0.25M蔗糖配制)。在本文所述的大多数实验中，混合3名CJD患者(1名nvCJD患者，2名sCJD患者)的样品，对该混合的脑匀浆液样品进行试验。用含1％Triton X100和1％吐温(Tween)-20的TBS缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5和37.5mM NaCl)对各200μl的等份试样作1∶1稀释(体积∶体积)，将样品超声数次，每次数秒钟。脑匀浆液等份试样于-70℃保存。
为评价拟肽试剂与PrPSc的结合，将CJD脑匀浆液掺入健康个体的人血浆。通常采用两个阴性对照样品：1)正常人的血浆和2)掺有正常(非-CJD)人脑匀浆的正常人血浆。人血浆的标准试验浓度为样品总体积的0至最高达80％。
在典型的方案中，1次拉下试验(96孔微滴定板的一个孔中最终有100祃)需要使用10祃链霉抗生物素蛋白M-280戴纳珠(目录号112.05)。使用前用含1％吐温-20和1％Triton X-100的TBS(TBSTT)将适量的珠洗涤一次。将珠团重悬于10倍最初体积(即，100祃)的TBSTT中。之后在珠溶液中加入0.1祃生物素化的拟肽试剂原液(10mM，H2O配制)，并在室温以750rpm(埃彭道夫(Eppendorf)，热混合仪R(ThermomixerR))混合1小时或在37℃以750rpm混合30分钟。弃去含未结合拟肽的上清液并采用能将珠保留在试管底部的磁力装置用TBS和吐温-200.05％(TBST)将珠洗涤3次。该阶段中获得拟肽试剂-包被的链霉抗生物素蛋白磁珠。然后在有血浆(终浓度为0-80％)、1×TBS、1％Triton X100和1％吐温-20存在下将拟肽-包被的磁珠(代表最初起始体积的微升数)与各种浓度的CJD 10％脑匀浆混合，最终体积为100祃。96孔板中各孔的典型反应体积为100祃。在37℃以750rpm(埃彭道夫，热混合仪R)振荡平板1小时。采用平板洗涤器ELx405Magna(佛蒙特州怀诺斯奇的BT仪器公司(Bio-Tek Instruments，Inc.，Winooski，VT))用含0.05％吐温-20的TBS溶液洗涤珠以除去未结合的蛋白质。该微滴定板洗涤器是为磁珠技术专门设计的。第二载体将磁板置于靠近微板底部，从而能在关键的抽吸循环中保护磁珠。
ELISA
在拉下试验最后一步洗涤之后，PrPSc从珠上洗脱下来、变性并以ELISA(酶联免疫吸附试验)方式用单克隆(mAb)抗-朊病毒抗体检测。在一种试验方式(间接ELISA)中，用能识别第一单克隆抗体的第二多克隆抗体检测按比例结合于PrPSc的抗-朊病毒mAb。第二抗体偶联于碱性磷酸酶。当与化学发光底物一起温育时，该酶能打断化合物从而发出可通过标准微板化学发光阅读器测量的光。测量单位定义为相对光单位(RLU)。在第二种方式(直接ELISA)中，采用偶联于碱性磷酸酶的单克隆(mAb)抗-朊病毒抗体进行检测，因此不需要第二抗体。这两种方式采用相同的化学发光底物(流明根公司(Lumingen，Inc.)的Lumi-Phos Plus)。如本文所述，也可采用夹心ELISA方式。可采用任何一种方式，例如用平板、用珠、用磁性颗粒进行ELISA。洗脱下来的变性朊病毒可被动包被到固相支持体上，或者可以抗体-抗原夹心排列的方式结合，固相支持体上包被有抗-朊病毒抗体。
结果
ELISA结合试验的结果总结如下。
经测试，本发明的代表性拟肽试剂中大多数具有与SEQ ID NO：68所示肽类似的结合效率。在之前的研究中，SEQ ID NO：68所示肽对朊病毒蛋白具有良好的结合效率(参见，例如，2005年2月11日提交的美国专利申请序列号11/056,950)，因此其用作测量本发明拟肽试剂的结合功效的基准。表4中的数据显示了与肽试剂(SEQID NO：68，描述于2004年8月13日提交的共有申请美国序列号10/917,646，2005年2月11日提交的美国序列号11/056,950，和2004年8月13日提交的国际申请PCT/US2004/026363)相比，在拉下/ELISA试验中采用各种拟肽试剂获得的信号。显示了均用70％血浆配制的10％CJD脑匀浆1ul样品或10％正常脑匀浆1ul样品的信号。最右边的一栏显示了拟肽试剂试验的实验平均值，表示为实验平均值对肽SEQ IDNO：68试验的百分比。
表4：与SEQ ID NO：68所示肽相比，用70％人血浆配制的代表性拟肽试剂的结合百分数。
  肽或拟肽SEQ ID NO.   对照平均值(1ul 10％正常BH)   实验平均值(1ul 10％CJD BH)   实验SD*   实验平均值(68的％)
  链霉抗生物素蛋白珠(无肽对照)   16.4   21.1   3.7   5.0
  68   19.2   852.7   72.0   100.0
  237   20.1   1039.4   41.0   121.9
  239   16.9   1024.2   41.7   120.1
  240(XIIa)   21.4   1044.4   60.4   122.5
  241   15.4   28.0   1.2   3.3
*SD＝标准偏差
表5：与SEQ ID NO：68所示肽相比，用70％人血浆配制的代表性拟肽试剂的结合百分数。
  肽或拟肽SEQ ID NO.   对照平均值(1ul 10％正常BH)   实验平均值(1ul 10％CJD BH)   实验SD*   实验平均值(68的％)
  链霉抗生物素蛋白珠(无肽对照)   11.2   1.2   2.7
  68   418.4   30.1   100.1
  230(II)   7.02   463.5   24.8   110.8
  237(IX)   9.47   528.8   24.9   126.5
  238(X)   7.28   478.7   44.5   114.5
*SD＝标准偏差
表6：与SEQ ID NO：68所示肽相比，用20％人血浆配制的代表性拟肽试剂的结合百分数。
  肽或拟肽SEQ ID NO.   平均值   SD*   平均值(68的％)
  链霉抗生物素蛋白珠(无肽对照)   2.38   0.82   2.79
  68   84.98   13.55   100.00
  14   4.74   1.23   5.58
  229   88.64   7.19   104.31
  230   106.10   5.58   124.85
  231   1.83   0.43   2.15
  234   8.32   1.33   9.79
  235   8.85   1.93   10.42
  236   1.47   0.30   1.73
*SD＝标准偏差
如表4和5所述，用70％血浆配制时，所测试的代表性拟肽试剂大都具有比基准肽SEQ ID NO.68高的结合亲和力，通常高出约10-25％。表4和5还显示了拟肽试剂对朊病毒蛋白的致病形式(预计正常脑匀浆液中仅存在朊病毒蛋白的非致病形式)具有特异性。表6显示了在用20％人血浆稀释的CJD脑匀浆液中用拟肽试剂进行拉下/ELISA实验的结果。
表7：在70％人血浆中，与SEQ ID NO：68所示肽相比，直接结合于磁珠的代表性拟肽试剂的结合百分数。
  共价结合于磁珠的肽或拟肽SEQ ID NO.   平均值   SD*   平均值(68的％)
  68   137.9   21.29   100.0
  240(XIIb)   174.3   10.51   126.4
*SD＝标准偏差
包含SEQ ID NO：240的拟肽试剂(XIIb)共价结合于磁珠，包含SEQ ID NO：68的肽也共价结合于磁珠。这种共价结合的试剂被用于上述拉下/ELISA反应以代替结合于SA-珠的生物素化的拟肽试剂和肽。试剂与珠共价结合不会显著影响珠优先与致病性朊病毒相互作用的能力。
试剂对致病形式的特异性
如上表4和5所示，拟肽试剂可拉下CJD患者人脑匀浆液中存在的PrPSc但不能拉下人血浆或对照正常人脑匀浆液中存在的任何PrPC。比较拟肽试剂与CJD脑匀浆液和正常(即，非-CJD)脑匀浆液结合情况的其他实验如下所示。
表8.用70％人血浆配制的拟肽试剂与2微升10％正常或CJD脑匀浆液的结合情况。
Figure A20068003312900781
表9.用70％人血浆配制的拟肽试剂与0.1微升10％CJD脑匀浆液或1微升10％正常人脑匀浆液的结合情况。
Figure A20068003312900782
表10的实验采用人vCJD脑匀浆液样品而非vCJD和sCJD BH的混合物进行。
表10.在70％人血浆中，共价结合于磁珠的拟肽试剂240(XIIb)与正常或vCJD脑匀浆液的结合情况。
  拟肽试剂SEQ ID NO：240(XIIb)与以下物质的结合情况   平均值   SD
  7.5nL人vCJD 10％脑匀浆液   121.1   6.7
  2.5nL人vCJD 10％脑匀浆液   57.3   8.2
  0.833nL人vCJD 10％脑匀浆液   49.2   3.4
  15nL人vCJD 10％脑匀浆液   13.2   2.9
表11.共价结合于磁珠的拟肽试剂240(XIIb)的结合情况。
  拟肽试剂SEQ ID NO：240(XIIb)与以下物质的结合情况   平均值   SD
  TBS缓冲液   278.5   43.9
  TBSTT缓冲液   264.3   24.9
  TBSTT与70％人血浆   269.5   32.9
  TBSTT与70％人血浆含20nL 10％正常人脑匀浆液   306.4   41.3
  TBSTT与70％人血浆含20nL 10％人CJD脑匀浆液   1390.8   76.0
在这些实验过程中，观察到某些人血浆样品显然含有一些能干扰结合反应并在将那些血浆用作稀释剂时会导致信号降低的物质。用共价连接于磁珠的拟肽试剂以及通过生物素-链霉抗生物素蛋白结合作用连接于磁珠的相同拟肽试剂进行比较实验(表12和表13)。共价偶联的拟肽试剂对用作稀释剂的血浆样品的变化远不灵敏。
表12：在不同人血浆中，采用结合于链霉抗生物素蛋白磁珠的代表性生物素化拟肽试剂进行的拉下试验。
  拟肽SEQ ID NO：240(XIIa)和人血浆   平均值   SD*   平均值(对照的％)
  对照人血浆   1109.67   80.93   100.0
  人血浆批号KC011886   441.40   38.74   39.78
  人血浆批号KC011892   406.60   64.93   36.64
  人血浆批号KC28719   720.50   102.03   64.93
  人血浆批号KC032907   458.50   151.48   41.32
*SD＝标准偏差
表13：在不同人血浆中，采用直接结合于磁珠的代表性拟肽试剂进行的拉下试验。
  拟肽SEQ ID NO：240(XIIb)和人血浆   平均值   SD*   平均值(对照的％)
  对照人血浆   154.99   52.13   100.0
  人血浆批号KC011886   205.80   12.50   132.78
  人血浆批号KC011892   197.63   11.57   127.51
  人血浆批号KC28719   195.33   33.42   126.03
  人血浆批号KC032907   193.77   30.12   125.02
*SD＝标准偏差
表12的试验采用的CJD脑匀浆液比用于表13所示试验的多2.5倍。各实验中采用相同的对照人血浆，并且前已显示不含干扰物质。结果显示，当采用不同血浆时，与血浆对照相比共价结合的拟肽试剂未显示对于结合有任何干扰(实际显示高于对照血浆的信号)，相比之下与连接于SA-珠的生物素化拟肽在许多不同血浆中显示低得多的信号。
对不同动物种类的各种样品进行的拉下/ELISA试验与上述对人样品进行的试验类似，所述种类包括小鼠、叙利亚仓鼠和绵羊(检测羊搔痒症绵羊和正常绵羊的脑匀浆液和血液样品)。对于这些种类中的每一种，用本发明的拟肽试剂检测患病动物而非未患病动物的样品中的该种类朊病毒蛋白的致病形式。
实施例4-夹心ELISA
建立夹心ELISA以测定人血浆样品中存在的PrPC。为确定人血浆中存在的PrPC水平，我们采用已知量的重组人PrP(rPrP)蛋白进行夹心ELISA以建立标准曲线(图1B)。根据rPrP标准曲线确定增加量的人血浆中PrPC的量(图1A)。为进行夹心ELISA，用mAb SAF32(称为“捕获”抗体)包被96孔微滴定板。该抗体能结合人PrP的八重复区域(残基23-90)，并能结合全长PrPC和变性的PrPSc残基23-231。平板用酪蛋白在37℃封闭1小时。为确定人血浆中PrPC的水平，在SFA32包被的板中加入不同量的血浆并在37℃静置培育2小时。洗涤平板，加入偶联于碱性磷酸酶的3F4抗体(能结合人PrP残基109-112的抗体)(“检测”抗体，3F4-AP)，37℃培育1小时。洗涤平板，加入化学发光底物并在37℃培育30分钟后计算光单位。为测定PrPC的量，我们采用相同方式的夹心ELISA，将SAF-32包被的平板与浓度升高的重组人PrP一起培育。采用rPrP标准曲线，我们测得该批人血浆中PrPC的浓度约为488Pg/70祃。
采用这种相同的夹心ELISA，我们评价了我们的拟肽试剂从人血浆样品中拉下PrPSc或PrPC的特异性。如上所述，拟肽试剂XIIb共价偶联于磁珠(戴纳珠M-270羧酸)。将拟肽试剂偶联的珠与含有70ul人血浆、1％吐温-20、1％Triton X-100和TBS的100ul试验溶液混合1小时。为研究拉下PrPSc的特异性，我们用掺有0.05祃10％脑匀浆液(BH)的血浆重复该实验，所述脑匀浆液是从被诊断出患有vCJD的患者和作为对照的正常个体制备的。洗涤之后，用15祃3M GdnSCN处理珠以洗脱PrPSc并使其变性。为防止捕获抗体变性，用210祃H2O稀释GdnSCN并将溶液加入SAF32包被的微板，从而使抗原的总体积达到250祃。我们用0.05祃10％正常脑匀浆液或10％vCJD脑匀浆液进行该实验。洗涤平板并采用化学发光AP底物(LumiphosPlus)用3F4-AP检测PrP。我们发现尽管直接检测时(即不进行任何拉下)血浆中PrPC的测量值约为887LU，但用拟肽试剂珠拉下的PrPC的数量仅构成23LU的背景水平。当在70祃血浆中掺入0.05祃正常BH时也是如此。当在70祃血浆中掺入0.05祃vCJD BH时可检测出信号提高4倍。采用rPrP作为标准曲线我们发现，当掺入含有约488pgPrPC的血浆时拟肽试剂珠能拉下47pg PrPSc，而拟肽仅结合7pg PrPC，这说明至少富集了70倍(表14)。
表14.用拟肽试剂珠特异性拉下PrPSc
实施例5-pH变性和夹心ELISA
为在拉下步骤之后使致病性朊病毒解离和变性，我们已经开发用离液剂解离的替代方法，即采用高pH或低pH实现解离/变性。与用GdnSCN变性的情况不同，这种方法的优点是可方便地逆转pH变性条件而不会显著增加反应物的体积或引入额外的洗涤步骤。
如实施例4所述，用偶联于拟肽试剂XIIb的磁珠和掺有0.10祃vCJD 10％脑匀浆液的100祃含70％人血浆的溶液样品进行拉下(试验)。37℃混合1小时后，洗涤珠并在表15所列的各种pH条件下处理。作为对照，我们采用3M GdnSCN或pH 7.5的Tris缓冲盐水(TBS)来处理珠。室温培育10分钟后如该表所示将溶液中和至pH约7。将上清液加入SAF32(捕获抗体)包被的96孔微滴定板并在4℃培育12小时。如实施例4所述，用碱性磷酸酶-标记的3F4抗体检测。用3M GdnSCN处理各珠的拉下的样品以进行解离和变性，正如所预计的，掺有vCJD的血浆显示出信号但对照血浆无信号。用pH 7.5的缓冲液处理拉下的样品，正如所料，无论是掺有vCJD的血浆还是对照血浆都不显示明显的信号。用所示各种pH的溶液处理拉下的样品。几种高pH和低pH处理能够从珠上解离朊病毒蛋白并使其变性，在pH 13下处理和3MGdnSCN一样有效。显然，GdnSCN样品的体积(稀释后)为225祃，而用pH 13处理的样品体积在中和后仅为75祃。
表15
Figure A20068003312900821
实施例6-pH变性和直接ELISA
还测试了与直接ELISA方式一起使用高和低pH进行解离和变性，所述ELISA用AP-标记的3F4抗体进行检测。该过程按照实施例5进行到中和步骤(包括中和步骤)。在pH 8.9的NaHCO3缓冲液中将上清液中的PrP直接包被到微滴定板的孔中。密封各板并在4℃培育过夜。第二天洗涤平板，用酪蛋白封闭，并采用化学发光底物用AP-标记的3F4检测平板上的PrP。结果示于表16。
表16
Figure A20068003312900822
实施例7-用磁珠进行夹心ELISA
通常用96孔聚苯乙烯微滴定板进行夹心ELISA，其中，捕获抗体包被到平板上，然后在同一孔中完成抗原结合、洗涤和检测。然而，可采用利用磁珠作为固相基质的另一种方式。在这种方式中，将包被有捕获抗体的磁珠首先与抗原混合，之后再加入检测抗体。
我们进行了以下实验来检测我们为用于平板ELISA而开发的pH解离和变性过程用于以磁珠作为固相支持体时是否同样有效。按照之前的描述用偶联于拟肽试剂XIIb的磁珠从掺料的人血浆样品中拉下PrPSc。用50祃0.1N NaOH使拉下的珠变性并用NaH2PO4(20祃)中和。将上清液转移至干净的聚丙烯孔中。
我们在该溶液中加入未用作为“捕获”抗体的抗-朊病毒抗体包被的新磁珠。一组珠用3F4抗体包被，另一组珠用能识别朊病毒蛋白C-末端中残基121-231之间的表位的抗体(C17)包被。将抗体-包被的珠和拉下处理后的洗脱物培育2小时。将珠洗涤1次并加入AP-标记的检测抗体。用作检测抗体的抗体(C2)是能结合Prp八重复区域(残基23-90)的抗体。将珠和检测抗体再培育2小时。然后洗涤珠并加入化学发光AP底物，混合30分钟并用鲁米诺扫描阿森特仪器(Luminoskan Ascent)(热实验系统公司(Thermo Labsytems))测量化学发光。
采用与平板方式相同的捕获和检测抗体进行ELISA以进行比较。结果示于表17。在这两种方式中，掺料并从70祃血浆溶液拉下后可检测出1nl 10％BH vCJD中存在PrPSc。
表17
Figure A20068003312900831
Figure A20068003312900832
实施例8-对于设计拟肽试剂有用的肽
对于制造本发明拟肽试剂有用的肽的非限制性例子来源于表18中所示序列。该表中的肽用常规的单字母氨基酸代码表示，且它们的氨基末端在左，羧基末端在右。该表中的任何序列可任选在氨基-和/或羧基-末端包含Gly接头(Gn，其中n＝1、2、3或4)。方括号内的氨基酸表示可用于不同肽中该位置的可选残基。圆括号表示该残基在肽试剂内可出现或不出现。后面跟有“2”的双圆括号(例如，SEQ ID NO：111)表示该序列包括该双括号之间的肽的两个拷贝。拷贝数标志后的残基(例如，SEQ IDNO：111中的“K”)表示双括号之间的各肽拷贝通过该残基延伸。因此，SEQ ID NO：111是QWNKPSKPKTN肽序列(即，SEQ ID NO：14)的二聚体，各序列通过它们羧基-末端经赖氨酸的a-和e-氨基官能团连接到赖氨酸(K)残基。包含“MAPS”的序列表示该肽具有多个抗原性位点。术语“分支”之前的数值表示拷贝数。因此，SEQ IDNO：112含有4个GGGKKRPKPGGWNTGGG拷贝，其是在各末端带有Gly接头的SEQ ID NO：67，而SEQ ID NO：113含有8个GGGKKRPKPGGWNTGGG拷贝，其也是在各末端带有Gly接头SEQ ID NO：67。
表18：用于制造本发明拟肽试剂的肽序列的例子。
Figure A20068003312900851
Figure A20068003312900871
Figure A20068003312900881
Figure A20068003312900891
实施例9
拟肽的固相亚单体合成方案
常规实验。溶剂为试剂级，无需进一步纯化即可使用。溴乙酸获自阿尔德瑞雀公司(Aldrich)(99％级)，DIC获自切名普莱克斯国际公司(Cheminplex International)。除非另有说明，所有反应和洗涤均在35℃下进行。洗涤树脂是指在树脂中加入洗涤溶剂(通常是DMF或DMSO)，搅拌树脂直到获得均匀的浆料(通常需要20秒)，然后彻底排出树脂中的溶剂。最好经反应容器的烧结底部通过真空过滤除去溶剂，直到树脂变干(通常约10秒钟)。通过烧结容器的底部向上鼓入氩气来搅拌树脂浆料。用来溶解试剂的溶剂在使用前应在真空室下超声5分钟以使其脱气。至于洗涤溶剂，利用含DMF、DMSO和二氯甲烷的体积可调节(1-5mL)的分配器将十分方便。
优选在二聚体阶段不停止合成，因为二聚体经长时间储存可环化形成二酮哌嗪。优选在置换洗涤后终止合成。
最初的树脂溶胀和Fmoc去保护。在烧结反应容器中加入100mg Fmoc-Rink酰胺树脂(每克树脂0.50mmol)。在树脂中加入2mL DMF并将该溶液搅拌5分钟以溶胀树脂。如果需要的话用玻璃棒来弄碎大的树脂块。然后排出DMF。然后在树脂中加入2mL 20％的哌啶DMF溶液以除去Fmoc基团。将其搅拌1分钟然后排干。再在树脂中加入2mL 20％的哌啶DMF溶液并搅拌20分钟，然后排干。然后用DMF(5×2mL)洗涤树脂。
亚单体合成循环。然后在树脂中加入1.13mL 1.2M溴乙酸的DMF溶液，然后加入200礚(0.93当量)纯N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)以酰化去封闭的胺。将该溶液在35℃搅拌20分钟，然后排干。然后用DMF(3×2mL)洗涤树脂。
Figure A20068003312900901
步骤1                           步骤2
酰化步骤之后用伯胺进行亲核置换。在经洗涤的树脂中加入0.85mL 1M胺的NMP溶液。将该溶液在35℃搅拌30分钟，然后排干。然后用DMF(3×2mL)洗涤树脂。这样完成一个反应循环。
重复酰化/置换循环直到获得所需寡聚体，例如可重复3至约30次。
生物素和巯基偶联。可任选通过加入2.0mL生物素(0.4M)和HOBt(0.4M)的DMSO溶液，然后加入1.05当量纯DIC从而将生物素偶联到N-末端。将反应混合物在35℃搅拌1小时，之后排干反应混合物并依次用DMSO(2×3mL)和DMF(3×2mL)洗涤树脂。任选通过掺入半胱氨酸引入巯基，半胱氨酸是通过以下氨基酸偶联步骤加入的：通过加入2.0mL Fmoc-Cys(Trt)(0.4M)和HOBt(0.4M)的DMF溶液，然后加入1.05当量纯DIC以将Fmoc-Cys(Trt)(诺华生化公司(NovaBiochem))偶联到N-末端。将反应混合物在35℃搅拌1小时，之后将反应混合物排干并用DMF(3×3mL)洗涤树脂。然后在树脂中加入2mL 20％的哌啶DMF溶液以除去Fmoc基团。将其搅拌1分钟然后排干。再在树脂中加入2mL 20％的哌啶DMF溶液并搅拌20分钟，然后排干。然后用DMF(5×2mL)洗涤树脂。
切割(对50μmol树脂而言)。合成反应和树脂洗涤之后用二氯甲烷(2×2mL)洗涤树脂并空气干燥1分钟。将干燥的树脂置于含有特氟隆微搅拌棒的玻璃闪烁管内并加入约5mL TFA/三异丙基硅烷/水 95/2.5/2.5(v/v/v)。将该溶液搅拌15分钟。通过填装有20μm聚乙烯玻璃料(frit)的8mL固相提取(SPE)柱将各样品的切割混合物过滤到50mL的聚丙烯锥形离心管中。然后用1mL 95％的TFA洗涤树脂并合并滤液。然后在离心管中用等体积的水稀释滤液。然后将该溶液冷冻并冻干。再干燥的产物溶于10mL 1∶1的酸性乙腈/水(acetonitrile/water acid)并再次冻干。
寡聚体表征。用C-18柱(Vydac，5μm，300
Figure A20068003312900911
4.5×250mm)通过反相HPLC分析各拟肽寡聚体。采用40分钟0-80％B线性梯度，流速为1毫升/分钟(溶剂A＝0.1％TFA水溶液，溶剂B＝0.1％TFA乙腈溶液)。收集主峰并对其进行电喷雾MS分析以确定分子量。
拟肽纯化。拟肽先经反相HPLC纯化再为生物学家所用。通常用C18柱分析和纯化这些化合物。因此，将这些化合物溶于少量10％乙腈/水并用50×20mm IDDuraGel HS C18柱(皮克科技公司(Peeke Scientific))纯化。采用40分钟5-65％B线性梯度，流速为30毫升/分钟(溶剂A＝0.1％TFA水溶液，溶剂B＝0.1％TFA乙腈溶液)。将合并的产物组分合并，冻干成白色粉末。
实施例10
拟肽试剂XIIb的拉下效率
通过下述拉下试验检测拟肽试剂XIIb共价结合于珠的能力。
将vCJD或正常脑匀浆液(BH)掺入用含1％吐温20和1％Triton-X 100的TBS配制的50％收集的正常人血浆。对照样品什么都不掺。然后将100μL各样品(含或不含10nL 10％的BH)与3礚XIIb-珠(30mg/mL)混合并将所得混合物在37℃孵育1小时，孵育的同时以750rpm匀速振荡。之后用含0.05％吐温20的TBST洗涤珠4次，加入0.1N NaOH以解离与珠结合的PrPSc。然后用0.3M NaH2PO4中和变性的朊病毒蛋白并转移至ELISA板。
将拉下样品的信号与用硫氰酸胍(GdnSCN)变性但未进行任何拉下(处理)的相同样品的信号进行比较以计算拉下效率。将5％BH与6M GdnSCN等体积混合，室温孵育10分钟以使vCJD或正常脑的朊病毒蛋白变性。然后用TBST将样品稀释至与拉下样品相同的浓度，仅用TBST作为对照。之后将100礚直接变性的各样品转移至与拉下样品的同一ELISA平板上。
ELISA板用捕获抗体3F4(2.5ug/mL，0.1M NaHCO3配制)包被。包被过程在4℃进行过夜，然后用TBST洗涤三次。然后在37℃用TBS配制的1％酪蛋白封闭平板1小时。37℃将拉下样品和直接变性样品的朊病毒蛋白在3F4包被的ELISA板中孵育1小时，并以300rpm匀速振荡，然后用TBST洗涤平板6次。用TBST配制的0.1％酪蛋的将碱性磷酸酶(AP)偶联的检测抗体稀释至0.1礸/mL，然后加到ELISA板中。随后37℃孵育平板1小时并用TBST洗涤6次。用增强的Lumi-Phos Plus化学发光底物产生信号，通过光度计读取相对光单位(RLU)。
结果示于表19。脑组织的朊病毒蛋白可用3M GdnSCN完全变性并通过其抗体检测。在该实验中，我们比较了用XIIb-珠拉下的朊病毒蛋白产生的信号与通过GdnSCN直接变性的蛋白质获得的信号。数据显示，拉下样品和直接变性样品的背景(无BH)分别为9.0和7.7RLU。直接变性的10nL 10％正常BH的信号为14.6RLU，这反映了正常脑组织的PrPC水平。同时，通过拉下方法检测的10nL 10％正常BH显示的读数为9.9RLU，与其背景类似。这证明了拟肽XIIb的特异性。当通过拉下方法和直接变性方法检测10nL 10％vCJD样品时，显示的数据为53.0和56.3RLU，这意味着XIIb-珠的拉下效率达到几乎100％。
表19
  vCJD BH(RLU)   正常BH(RLU)   无BH(RLU)
拉下无拉下   ave    sd   ％cv53.0   6.5  12.356.3   2.6  4.6   ave   sd   ％cv9.9   0.8  8.014.6  0.7  4.5   ave  sd   ％cv9.0  1.1  12.37.7  2.3  29.4
实施例11
区分朊病毒蛋白株(strain)
通过测量朊病毒蛋白株不同的解折叠热力学特性，我们可以检测它们之间的结构差异。将PrPSc与浓度升高的化学变性剂一起培育可以得到各蛋白株特征性的朊病毒构象异构体变性曲线。之前的研究采用蛋白酶K(PK)抗性来测量变性处理后保持折叠的PrPSc的比例。这里，检测了拟肽试剂XIIb是否也能用来区分折叠和未折叠的PrPSc，因此能够检测通过常规方法无法测量变性曲线的PK-敏感性蛋白株的构象状态。
为得到vCJD蛋白株的变性曲线，将vCJD脑匀浆液(NIBSC CJD资源中心)与各种浓度的盐酸胍一起培育，然后稀释样品并用拟肽试剂XIIb对其进行拉下试验(参见实施例3和下述XIIb拉下试验)。然后洗脱结合于XIIb的材料并通过夹心ELISA试验检测。各变性剂浓度下PrPSc拉下的图示证明，盐酸胍的浓度与被XIIb拉下的折叠PrPSc部分成反比。数据点形成一条单S形曲线，提示脑匀浆液中存在一种在一次主要转变(one major transition)时未折叠的PrPSc构象异构体(见图4，空心点)。因此，我们认为XIIb能识别PrPSc上的结构表位，通过化学变性处理可破坏该表位。对散发性CJD蛋白株(sCJD，NIBSC CJD资源中心)进行分析得到类似的S形曲线，该曲线向vCJD变性曲线的右侧漂移(见图4，灰色点)，这说明XIIb识别的这种结构表位在sCJD蛋白株中比在vCJD蛋白株中更加稳定。分析各蛋白株始终得到相同的图形，从而可用一个特征值作为PrPSc相对构象稳定性的度量来定义该曲线：半最大变性时的GdnHCl浓度(GdnHCl1/2)。vCJD变性曲线的GdnHCl1/2为1.6M GdnHCl。相反，sCJD脑匀浆液对胍变性更加稳定，GdnHCl1/2为2.0M GdnHCl。因此，XIIb可用作研究朊病毒蛋白株之间构象变化的工具。
XIIb拉下
在室温下用浓度为0-4M的胍溶液使感染性脑匀浆液(75-200nL，10％)变性1小时。变性后，用TBSTT将所有样品的终浓度调至0.1M盐酸胍，并采用标准拉下方法用XIIb-珠拉下折叠的PrPSc。将拉下的材料洗脱，通过夹心ELISA试验用C17捕获抗体和3F4-AP检测抗体进行一式三份的检测。
精通本领域的技术人员知道，可对本发明的优选实施方式作出各种变化和修饰而不背离本发明的精神。因此，所有这种变化都在本发明范围之内。此外，本专利文献中提到的各专利、申请和公开的出版物，包括书籍，都通过引用全文纳入本文。
序列表
<110>希龙公司(Chiron Corporation)
<120>朊病毒-特异性拟肽试剂
<130>20366-047WO1
<150>US 60/715,761
<151>2005-09-09
<150>US 60/726,686
<151>2005-10-14
<150>US 60/758,934
<151>2006-01-13
<160>241
<170>FastSEQ，Windows 4.0版
<210>1
<211>253
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
Met Ala Asn Leu Gly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp
 1               5                  10                  15
Ser Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn
            20                  25                  30
Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg
        35                  40                  45
Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly
    50                  55                  60
Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly
65                  70                  75                  80
Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His
                85                  90                  95
Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met
            100                 105                 110
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr
        115                 120                 125
Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp
    130                 135                 140
Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln
145                 150                 155                 160
Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val
                165                 170                 175
His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr
            180                 185                 190
Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg
        195                 200                 205
Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala
    210                 215                 220
Tyr Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Met Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val
225                 230                 235                 240
Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly
                245                 250
<210>2
<211>254
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>2
Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Mer Trp
 1               5                  10                  15
Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn
            20                  25                  30
Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg
        35                  40                  45
Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp
    50                  55                  60
Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp
65                  70                  75                  80
Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn
                85                  90                  95
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Ala
            100                 105                 110
Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met
        115                 120                 125
Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp
    130                 135                 140
Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn Gln Val
145                 150                 155                 160
Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His
                165                 170                 175
Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr
            180                 185                 190
Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg Val
        195                 200                 205
Val Glu Gln Met Cys Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr
    210                 215                 220
Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ser Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro
225                 230                 235                 240
Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly
                245                 250
<210>3
<211>253
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
Met Ala Asn Leu Gly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp
 1               5                  10                  15
Ser Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn
            20                  25                  30
Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg
        35                  40                  45
Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly
    50                  55                  60
Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly
65                  70                  75                  80
Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His
                85                  90                  95
Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met
            100                 105                 110
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr
        115                 120                 125
Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp
    130                 135                 140
Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln
145                 150                 155                 160
Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val
                165                 170                 175
His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr
            180                 185                 190
Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg
        195                 200                 205
Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala
    210                 215                 220
Tyr Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Met Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val
225                 230                 235                 240
Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly
                245                 250
<210>4
<211>254
<212>PRT
<213>金仓鼠(Mesocricetus auratus)
<400>4
Met Ala Asn Leu Ser Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Ala Met Trp
 1               5                  10                  15
Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn
             20                  25                  30
Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg
        35                  40                  45
Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly
    50                  55                  60
Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly
65                  70                  75                  80
Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His
                85                  90                  95
Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met
            100                 105                 110
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr
        115                 120                 125
Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Met Met His Phe Gly Asn Asp
    130                 135                 140
Trp Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Asn Arg Tyr Pro Asn Gln
145                 150                 155                 160
Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Asn Asn Gln Asn Asn Phe Val
                165                 170                 175
His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr
            180                 185                 190
Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Ile Met Glu Arg
        195                 200                 205
Val Val Glu Gln Met Cys Thr Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala
    210                 215                 220
Tyr Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ala Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro
225                 230                 235                 240
Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Met Val Gly
                245                 250
<210>5
<211>265
<212>PRT
<213>牛(Bos taurus)
<220>
<221>VARIANT
<222>46，155
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>5
Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala
 1               5                  10                  15
Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Xaa Pro Gly
        35                  40                  45
Gly Asn Thr Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro
    50                  55                  60
His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro
65                  70                  75                  80
His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro
                85                  90                  95
His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Thr His Gly Gln Trp Asn
            100                 105                 110
Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val Ala Gly Ala Ala
        115                 120                 125
Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser
    130                 135                 140
Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Xaa Asp Tyr Glu Asp Arg
145                 150                 155                 160
Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg
                165                 170                 175
Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val
            180                 185                 190
Asn Ile Thr Val Lys Glu His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu
        195                 200                 205
Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln
    210                 215                 220
Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg
225                 230                 235                 240
Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile
                245                 250                 255
Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly
            260                 265
<210>6
<211>256
<212>PRT
<213>绵羊(Ovis aries)
<400>6
Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala
 1               5                  10                  15
Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly
             20                  25                  30
Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly
        35                  40                  45
Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His
    50                  55                  60
Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His
65                  70                  75                  80
Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly
                85                  90                  95
Gly Ser His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
            100                 105                 110
Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gl yAla Val Val Gly Gly Leu
        115                 120                 125
Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe
    130                 135                 140
Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Arg Tyr Ser Asn Gln Asn
                165                 170                 175
Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Gln His Thr Val
            180                 185                 190
Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Ile
        195                 200                 205
Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu
    210                 215                 220
Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser
225                 230                 235                 240
Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly
                245                 250                 255
<210>7
<211>254
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>7
Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp
 1               5                  10                  15
Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn
            20                  25                  30
Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg
        35                  40                  45
Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp
    50                  55                  60
Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp
65                  70                  75                  80
Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn
                85                  90                  95
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Ala
            100                 105                 110
Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met
        115                 120                 125
Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp
    130                 135                 140
Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn Gln Val
145                 150                 155                 160
Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His
                165                 170                 175
Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr
            180                 185                 190
Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg Val
        195                 200                 205
Val Glu Gln Met Cys Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr
    210                 215                 220
Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ser Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro
225                 230                 235                 240
Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly
                245                 250
<210>8
<211>256
<212>PRT
<213>马鹿(Cervus elaphus)
<400>8
Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala
 1               5                  10                  15
Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly
        35                  40                  45
Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His
    50                  55                  60
Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His
65                  70                  75                  80
Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly
                85                  90                  95
Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
            100                 105                 110
Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
        115                 120                 125
Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe
    130                 135                 140
Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Asn Asn Gln Asn
                165                 170                 175
Thr Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Gln His Thr Val
            180                 185                 190
Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met
        195                 200                 205
Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu
    210                 215                 220
Ser Glu Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser
225                 230                 235                 240
Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly
                245                 250                 255
<210>9
<211>256
<212>PRT
<213>扁角鹿(Dama dama)
<400>9
Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala
 1               5                  10                  15
Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly
        35                  40                  45
Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His
    50                  55                  60
Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His
65                  70                  75                  80
Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly
                85                  90                  95
Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
            100                 105                 110
Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
        115                 120                 125
Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Asn Arg Pro Leu Ile His Phe
    130                 135                 140
Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Asn Asn Gln Asn
                165                 170                 175
Thr Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Gln His Thr Val
            180                 185                 190
Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met
       195                 200                 205
Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu
    210                 215                 220
Ser Glu Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser
225                 230                 235                 240
Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly
                245                 250                 255
<210>10
<211>256
<212>PRT
<213>黑尾鹿(Odocoileus hemionus)
<400>10
Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala
 1               5                  10                  15
Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly
        35                  40                  45
Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His
    50                  55                  60
Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His
65                  70                  75                  80
Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly
                85                  90                  95
Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
            100                 105                 110
Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
        115                 120                 125
Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe
    130                 135                 140
Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Asn Asn Gln Asn
                165                 170                 175
Thr Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Gln His Thr Val
            180                 185                 190
Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met
        195                 200                 205
Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu
    210                 215                 220
Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser
225                 230                 235                 240
Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly
                245                 250                 255
<210>11
<211>256
<212>PRT
<213>白尾鹿(Odocoileus virginianus)
<400>11
Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala
 1               5                  10                  15
Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly
        35                  40                  45
Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His
    50                  55                  60
Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His
65                  70                  75                  80
Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly
                85                  90                  95
Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
            100                 105                 110
Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
        115                 120                 125
Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe
    130                 135                 140
Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Asn Asn Gln Asn
                165                 170                 175
Thr Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Gln His Thr Val
            180                 185                 190
Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met
        195                 200                 205
Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu
    210                 215                 220
Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser
225                 230                 235                 240
Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly
                245                 250                 255
<210>12
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>12
Lys Lys Arg Pro Lys
 1               5
<210>13
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>13
Met Ala Asn Leu Gly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp
 1               5                  10                  15
Ser Asp Leu Gly Leu Cys
            20
<210>14
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>14
Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>15
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>15
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val
 1               5                  10                  15
<210>16
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Asn或Thr
<220>
<221>VARIANT
<222>15
<223>Xaa＝Ile或Val
<220>
<221>VARIANT
<222>17
<223>Xaa＝Gln或Glu
<400>16
Asn Gln Asn Asn Xaa Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Xaa Lys
 1               5                  10                  15
Xaa His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn
    20            25
<210>17
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>17
Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp
 1               5                  10
<210>18
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>18
Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp
 1               5
<210>19
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>9
<223>Xaa＝Val或Ile
<220>
<221>VARIANT
<222>11
<223>Xaa＝Met或Ile
<220>
<221>VARIANT
<222>21
<223>Xaa＝Ile或Val
<220>
<221>VARIANT
<222>25
<223>Xaa＝Glu或Gln
<220>
<221>VARIANT
<222>32
<223>Xaa＝Gln或Asp
<220>
<221>VARIANT
<222>36
<223>Xaa＝Gly或Ser
<220>
<221>VARIANT
<222>37
<223>Xaa＝Ser或Ala
<400>19
Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Xaa Lys Xaa Met Glu Arg Val Val
 1               5                  10                  15
Glu Gln Met Cys Xaa Thr Gln Tyr Xaa Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Xaa
            20                  25                  30
Gly Arg Arg Xaa Xaa Ser
        35
<210>20
<211>63
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Asn或Thr
<220>
<221>VARIANT
<222>15，46
<223>Xaa＝Ile或Val
<220>
<221>VARIANT
<222>17
<223>Xaa＝Gln或Glu
<220>
<221>VARIANT
<222>34
<223>Xaa＝Val或Ile
<220>
<221>VARIANT
<222>36
<223>Xaa＝Met或Ile
<220>
<221>VARIANT
<222>50
<223>Xaa＝Glu或Gln
<220>
<221>VARIANT
<222>57
<223>Xaa＝Gln或Asp
<220>
<221>VARIANT
<222>61
<223>Xaa＝Gly或Ser
<220>
<221>VARIANT
<222>62
<223>Xaa＝Ser或Ala
<400>20
Asn Gln Asn Asn Xaa Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Xaa Lys
 1               5                  10                  15
Xaa His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr
            20                  25                  30
Asp Xaa Lys Xaa Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Xaa Thr Gln Tyr
        35                  40                  45
Xaa Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Xaa Gly Arg Arg Xaa Xaa Ser
 50                  55                  60
<210>21
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1
<223>Xaa＝Ala，Val，Thr或Met
<220>
<221>VARIANT
<222>2
<223>Xaa＝Val或Ile
<220>
<221>VARIANT
<222>20
<223>Xaa＝Ile或Met
<400>21
Xaa Xaa Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu
 1               5                  10                  15
Ile Phe Leu Xaa Val Gly
            20
<210>22
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>2
<223>Xaa＝Asn或Ser
<220>
<221>VARIANT
<222>4
<223>Xaa＝Trp Or Tyr
<220>
<221>VARIANT
<222>14
<223>Xaa＝His或Tyr
<220>
<221>VARIANT
<222>25
<223>Xaa＝Met或Val
<220>
<221>VARIANT
<222>27
<223>Xaa＝Gln，Glu或Arg
<220>
<221>VARIANT
<222>29
<223>Xaa＝Ser或Asn
<220>
<221>VARIANT
<222>33
<223>Xaa＝Asn或Thr
<400>22
Gly Xaa Asp Xaa Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Xaa Arg Tyr
 1               5                  10                  15
Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Xaa Asp Xaa Tyr Xaa Asn Gln Asn
            20                  25                  30
Xaa Phe Val His
        35
<210>23
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>2
<223>Xaa＝Asn或Thr
<220>
<221>VARIANT
<222>12
<223>Xaa＝Ile或Val
<220>
<221>VARIANT
<222>14
<223>Xaa＝Gln或Glu
<400>23
Asn Xaa Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Xaa Lys Xaa His Thr
 1               5                  10                  15
Val Thr Thr Thr Thr Lys
            20
<210>24
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>24
Val Tyr Tyr Arg
 1
<210>25
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>11
<223>Xaa＝Met或Val
<220>
<221>VARIANT
<222>13
<223>Xaa＝Gln，Glu或Arg
<400>25
Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Xaa Asp Xaa
 1               5                  10
<210>26
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>26
Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg
 1               5                  10                  15
Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly
            20                  25                  30
Gly
<210>27
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>27
Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly
            20                  25
<210>28
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>26
<223>Xaa＝Gly或Thr
<400>28
Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Xaa Trp Gly Gln Pro His Gly
            20                  25                  30
Gly
<210>29
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>29
Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro
 1               5                  10                  15
Ser Lys Pro Lys Thr Asn
            20
<210>30
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>30
Gly Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10                  15
<210>31
<211>49
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>26
<223>Xaa＝Gly或Thr
<400>31
Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly
 1               5                  10                  15
Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Xaa Trp Gly Gln Pro His
            20                  25                  30
Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His
             35                  40                  45
Gly Gly
<210>32
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>32
Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp
 1               5
<210>33
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>33
Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg
 1               5                  10                  15
Glu Asn Met His Arg
            20
<210>34
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>34
Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg
 1               5                  10                  15
Glu Asn Met Tyr Arg
             20
<210>35
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>35
Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr
 1               5                  10                  15
His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His
            20                  25                  30
Val Gly Gly Gly Gly Cys
        35
<210>36
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>36
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn Gln
 1               5                  10                  15
Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val
            20                  25                  30
<210>37
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>37
Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro
 1               5                  10                  15
Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
<210>38
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1
<223>Xaa＝Met或Leu
<220>
<221>VARIANT
<222>4
<223>Xaa＝Met或Val
<400>38
Xaa Lys His Xaa
    1
<210>39
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>6
<223>Xaa＝Met或Leu
<220>
<221>VARIANT
<222>9
<223>Xaa＝Met或Val
<400>39
Lys Pro Lys Thr Asn Xaa Lys His Xaa
 1               5
<210>40
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>40
Cys Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn Gln Trp
 1               5                  10                  15
Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Cys
<210>41
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>41
Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr
 1               5                  10                  15
Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn
            20                  25
<210>42
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>42
Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu
 1               5                  10                  15
Asn Met Tyr Arg Pro Val Asp
            20
<210>43
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>43
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr
 1               5                  10                  15
Met Leu Gly Ser Ala Met
            20
<210>44
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>44
Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg
 1               5                  10                  15
Glu Asn Met Tyr Arg Gly Gly Gly
            20
<210>45
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>45
Gly Gly Gly Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp Glu Asp Arg
 1               5                  10                  15
Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Gly Gly
            20                  25
<210>46
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>46
Gly Gly Cys Gly Gly Gly Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp
 1               5                  10                  15
Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Gly Gly Gly Cys
            20                  25                  30
<210>47
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>47
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly
 1               5                  10                  15
<210>48
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>48
Gly Gly Leu Gly Gly
 1              5
<210>49
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>49
Leu Gly Ser
 1
<210>50
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>50
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Gly Gly Gly
 1               5                  10
<210>51
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>51
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Gly Gly Gly Gln Trp
 1               5                  10                  15
Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
            20                  25
<210>52
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>52
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly
<210>53
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>53
Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro
 1               5                  10                  15
Ser Lys Pro Lys Thr Asn
            20
<210>54
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>54
Gly Gly Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10                  15
<210>55
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>55
Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
 1               5                  10                  15
Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met
            20                  25
<210>56
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>56
Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
 1               5                  10                  15
Gly Gly
<210>57
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>57
Lys Lys Lys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
 1               5                  10                  15
Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met
            20                  25
<210>58
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>8
<223>Xaa＝Ser或Asn
<400>58
Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Xaa Arg
 1               5
<210>59
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1
<223>Xaa＝Ser或Asn
<220>
<221>VARIANT
<222>4
<223>Xaa＝Met Ile或Leu
<220>
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Ile或Leu
<400>59
Xaa Arg Pro Xaa Xaa His
 1               5
<210>60
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>8
<223>Xaa＝Ser或Asn
<220>
<221>VARIANT
<222>11
<223>Xaa＝Met，Ile或Leu
<220>
<221>VARIANT
<222>12
<223>Xaa＝Ile或Leu
<400>60
Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Xaa Arg Pro Xaa Xaa His
 1               5                  10
<210>61
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>8
<223>Xaa＝Ser或Asn
<220>
<221>VARIANT
<222>11
<223>Xaa＝Met，Ile或Leu
<220>
<221>VARIANT
<222>12
<223>Xaa＝Ile或Leu
<220>
<221>VARIANT
<222>16
<223>Xaa＝Asn或Ser
<400>61
Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Xaa Arg Pro Xaa Xaa His Phe Gly Xaa
 1               5                  10                  15
Asp
<210>62
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1
<223>Xaa＝Trp或Tyr
<220>
<221>VARIANT
<222>11
<223>Xaa＝His或Tyr
<220>
<221>VARIANT
<222>22
<223>Xaa＝Met或Val
<220>
<221>VARIANT
<222>24
<223>Xaa＝Gln，Glu或Arg
<400>62
Xaa Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Xaa Arg Tyr Pro Asn Gln
 1               5                  10                  15
Val Tyr Tyr Arg Pro Xaa Asp Xaa Tyr
            20                  25
<210>63
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1
<223>Xaa＝Trp或Tyr
<220>
<221>VARIANT
<222>11
<223>Xaa＝His或Tyr
<220>
<221>VARIANT
<222>22
<223>Xaa＝Met或Val
<220>
<221>VARIANT
<222>24
<223>Xaa＝Gln，Glu或Arg
<220>
<221>VARIANT
<222>26
<223>Xaa＝Ser或Asn
<220>
<221>VARIANT
<222>30
<223>Xaa＝Asn或Thr
<400>63
Xaa Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Xaa Arg Tyr Pro Asn Gln
 1               5                  10                  15
Val Tyr Tyr Arg Pro Xaa Asp Xaa Tyr Xaa Asn Gln Asn Xaa
            20                  25                  30
<210>64
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>2
<223>Xaa＝Gln，Glu或Arg
<220>
<221>VARIANT
<222>4
<223>Xaa＝Ser或Asn
<220>
<221>VARIANT
<222>8
<223>Xaa＝Asn或Thr
<400>64
Asp Xaa Tyr Xaa Asn Gln Asn Xaa
 1               5
<210>65
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>65
Lys Lys Lys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
 1               5                  10                  15
Gly Gly
<210>66
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>66
Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser
            20
<210>67
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>67
Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly
 1              5                   10                  15
<210>68
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>68
Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly
 1               5                  10
<210>69
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>69
Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln His Gly Gly Ser Trp Gly Gln Pro
 1               5                  10                  15
His Gly Gly Ser Trp Gly Gln
            20
<210>70
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>70
Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp Gly Gln
 1               5                  10                  15
<210>71
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>71
Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln
 1               5
<210>72
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>72
Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro
 1               5                  10                  15
Lys Pro Gly Gly
            20
<210>73
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>73
Gly Gly Gly Gly Pro Lys Arg Lys Gly Pro Lys
 1               5                  10
<210>74
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>74
Gly Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser
 1               5                  10                  15
<210>75
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>75
Gly Gly Gly Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr
 1               5                  10
<210>76
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>76
Gly Gly Gly Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp Glu Asp Arg
 1               5                  10                  15
Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Gly Gly Cys
            20                  25
<210>77
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>77
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly
<210>78
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>78
Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
 1               5                  10                  15
Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met
            20                  25
<210>79
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>79
Gly Gly Gly Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys
 1               5                  10
<210>80
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>80
Gly Gly Gly Lys Pro Ser Lys Pro Lys
 1               5
<210>81
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>81
Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys
 1               5                  10                  15
Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
            20
<210>82
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>82
Lys Lys Lys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
 1               5                  10                  15
Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Asp Asp Asp
            20                  25
<210>83
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>83
Asp Asp Asp Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
 1               5                  10                  15
Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met
            20                  25
<210>84
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>84
Lys Lys Lys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
 1               5                  10                  15
Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Lys Lys Lys
            20                  25
<210>85
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>85
Gly Gly Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
 1               5                  10
<210>86
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>86
Asp Asp Asp Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
 1               5                  10                  15
Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Asp Asp Asp
            20                  25
<210>87
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>87
Gly Gly Gly Asn Asn Lys Gln Ser Pro Trp Pro Thr Lys Lys
 1               5                  10
<210>88
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>88
Asp Lys Asp Lys Gly Gly Val Gly Ala Gly Ala Ala Val Ala Ala Gly
 1               5                  10                  15
Gly Asp Lys Asp Lys
            20
<210>89
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>89
Gly Gly Gly Gln Ala Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>90
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>90
Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Ala Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>91
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>91
Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Ala Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>92
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>92
Gly Gly Gly Gln Trp Asn Ala Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>93
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>93
Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Ala Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>94
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>94
Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Ala Thr Asn
 1               5                  10
<210>95
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>95
Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Ala Ser Lys Ala Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>96
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>96
Gly Gly Gly Lys Lys Arg Ala Lys Pro Gly Gly
 1               5                  10
<210>97
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>97
Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Ala Gly Gly
 1               5                  10
<210>98
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>98
Gly Gly Gly Lys Lys Arg Ala Lys Ala Gly Gly
 1               5                  10
<210>99
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>99
Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Ala Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>100
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>100
Gly Gly Gly Gln Trp Ala Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>101
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>101
Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ala Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>102
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>102
Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Ala Asn
 1               5                  10
<210>103
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>103
Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Ala
 1               5                  10
<210>104
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>104
Gly Gly Gly Ala Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly
 1               5                  10
<210>105
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>105
Gly Gly Gly Lys Ala Arg Pro Lys Pro Gly Gly
 1               5                  10
<210>106
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>106
Gly Gly Gly Lys Lys Ala Pro Lys Pro Gly Gly
 1               5                  10
<210>107
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>107
Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Ala Pro Gly Gly
 1               5                  10
<210>108
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>108
Gly Gly Gly Lys Lys Ala Pro Lys Ala Gly Gly
 1               5                  10
<210>109
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>109
Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Gly Trp Asn Thr Gly
 1               5                  10                  15
Gly
<210>110
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>110
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Gly Gly Gly Gln Trp
 1               5                  10                  15
Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys
            20                  25                  30
Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
        35
<210>111
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>111
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Gln Trp Asn Lys Pro
 1               5                  10                  15
Ser Lys Pro Lys Thr Asn Lys
            20
<210>112
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>112
Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly
<210>113
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>113
Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly
<210>114
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>114
Lys Lys Lys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu
 1               5                  10                  15
Gly Gly
<210>115
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>14
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>115
Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn
 1               5                  10                  15
Thr Gly Gly
<210>116
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>14
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>116
Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn
 1               5                  10                  15
Thr Gly
<210>117
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>14
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>117
Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn
 1        5                  10                  15
Thr
<210>118
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>14
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>118
Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn
 1               5                  10                  15
<210>119
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>14)
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>119
Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp
 1                   5                  10                  15
<210>120
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>14
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>120
Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa
 1               5                  10
<210>121
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>13
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>121
Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr
 1               5                  10                  15
Gly
<210>122
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>13
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>122
Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr
 1               5                  10                  15
<210>123
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>13
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>123
Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn
 1               5                  10                  15
<210>124
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>13
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>124
Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp
 1               5                  10
<210>125
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>13
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>125
Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa
 1               5                  10
<210>126
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>12
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>126
Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly
 1               5                  10                  15
Gly
<210>127
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>12
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>127
Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly
 1               5                  10                  15
<210>128
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>12
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>128
Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr
 1               5                  10                  15
<210>129
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>12
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>129
Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn
 1               5                  10
<210>130
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>12
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>130
Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp
 1               5                  10
<210>131
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>12
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>131
Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa
 1               5                  10
<210>132
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>11
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>132
Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly Gly
 1               5                  10                  15
<210>133
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>11
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>133
Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly
 1               5                  10                  15
<210>134
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>11)
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>134
Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr
 1               5                  10
<210>135
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>11
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>135
Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn
 1                  5                  10
<210>136
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>11
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>136
Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp
 1               5                  10
<210>137
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>11
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>137
Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa
 1               5                  10
<210>138
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>10
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>138
Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly Gly
 1               5                  10                  15
<210>139
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>10
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>139
Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly
 1               5                  10
<210>140
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>10
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>140
Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr
 1               5                  10
<210>141
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>10
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>141
Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn
 1               5                  10
<210>142
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>10
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>142
Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp
 1               5                  10
<210>143
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>10<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>143
Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa
 1               5                  10
<210>144
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>9
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>144
Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly Gly
 1               5                  10
<210>145
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>9
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>145
Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly
 1               5                  10
<210>146
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>9
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>146
Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr
 1               5                  10
<210>147
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>9
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>147
Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn
 1               5                  10
<210>148
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>9
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>148
Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp
 1               5                  10
<210>149
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>9
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>149
Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa
 1               5
<210>150
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>14
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>150
Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn
 1               5                  10                  15
Thr Gly Gly
<210>151
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>14
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>151
Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn
 1               5                  10                  15
Thr Gly
<210>152
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>14
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>152
Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn
 1               5                  10                  15
Thr
<210>153
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>14
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>153
Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn
 1               5                  10                  15
<210>154
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>14
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>154
Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp
 1               5                  10                  15
<210>155
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>14
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>155
Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa
 1               5                  10
<210>156
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>13
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>156
Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr
 1               5                  10                  15
Gly
<210>157
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>13
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>157
Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr
 1               5                  10                  15
<210>158
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>13
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>158
Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn
 1               5                  10                  15
<210>159
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>13
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>159
Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp
 1               5                  10
<210>160
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>13
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>160
Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa
 1               5                  10
<210>161
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>161
Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
His Met
<210>162
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>162
Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
His
<210>163
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>163
Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
<210>164
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>164
Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
 1               5                  10                  15
<210>165
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>165
Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>166
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>166
His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
 1               5                  10                  15
Met
<210>167
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>167
His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
 1               5                  10                  15
<210>168
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>168
His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
<210>169
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>169
His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
 1               5                  10
<210>170
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>170
His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>171
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>171
Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met
 1               5                  10                  15
<210>172
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>172
Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
 1               5                  10                  15
<210>173
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>173
Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10
<210>174
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>174
Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
 1               5                  10
<210>175
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>175
Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>176
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>176
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met
 1               5                  10                  15
<210>177
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>177
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
 1               5                  10
<210>178
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>178
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1              5                  10
<210>179
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>179
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
 1               5                  10
<210>180
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>180
Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
His Val
<210>181
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>181
His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
 1               5                  10                  15
Val
<210>182
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>182
Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val
 1               5                  10                  15
<210>183
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>183
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val
 1               5                  10                  15
<210>184
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>184
Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
His Met
<210>185
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>185
Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
His
<210>186
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>186
Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
<210>187
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>187
Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
 1               5                  10                  15
<210>188
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>188
Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>189
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>189
His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
 1               5                  10                  15
Met
<210>190
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>190
His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
 1               5                  10                  15
<210>191
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>191
His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
<210>192
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>192
His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
 1               5                  10
<210>193
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>193
His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>194
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>194
Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met
 1               5                  10                  15
<210>195
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>195
Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
 1               5                  10                  15
<210>196
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>196
Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10
<210>197
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>197
Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
 1               5                  10
<210>198
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>198
Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>199
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>199
Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
His Val
<210>200
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>200
His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
 1               5                  10                  15
Val
<210>201
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>201
Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val
 1               5                  10                  15
<210>202
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>202
Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
His Met
<210>203
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>203
Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
His
<210>204
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>204
Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
<210>205
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>205
Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
 1               5                  10                  15
<210>206
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>206
Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>207
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>207
His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
 1               5                  10                  15
Met
<210>208
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>208
His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
 1               5                  10                  15
<210>209
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>209
His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
<210>210
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>210
His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
 1               5                  10
<210>211
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>211
His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>212
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>212
Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met
 1               5                  10                  15
<210>213
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>213
Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
 1               5                  10                  15
<210>214
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>214
Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10
<210>215
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>215
Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met
 1               5                  10
<210>216
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>216
Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>217
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>217
Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys
 1               5                  10                  15
His Val
<210>218
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>218
His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
 1               5                  10                  15
Val
<210>219
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>219
Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val
 1               5                  10                  15
<210>220
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>220
Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln
 1               5                  10                  15
Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln
            20
<210>221
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>221
Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro
 1               5                  10                  15
Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met
            20                  25
<210>222
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>222
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
            20                  25                  30
Met
<210>223
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>11
<223>Xaa＝Asn或Ser
<220>
<221>VARIANT
<222>23
<223>Xaa＝Leu或Met
<220>
<221>VARIANT
<222>26
<223>Xaa＝Val或Met
<400>223
Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Xaa Gln Trp Asn Lys Pro
 1               5                  10                  15
Ser Lys Pro Lys Thr Asn Xaa Lys His Xaa Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
<210>224
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>11，20
<223>Xaa＝Gly或Ser
<400>224
Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln His Gly Xaa Ser Trp Gly Gln Pro
 1               5                  10                  15
His Gly Gly Xaa Trp Gly Gln
            20
<210>225
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>12
<223>Xaa＝Leu或Met
<220>
<221>VARIANT
<222>15
<223>Xaa＝Val或Met
<400>225
Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Xaa Lys His Xaa Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly
<210>226
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>226
Gly Gly Gly Ala Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn
 1               5                  10
<210>227
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>227
Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly
<210>228
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<400>228
Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly
<210>229
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1，2，3，4，5
<223>Xaa＝N-(4-氨基丁基)甘氨酸
<400>229
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5
<210>230
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1，2，5
<223>Xaa＝N-(4-氨基丁基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>3
<223>Xaa＝N-(4-胍基丁基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>4，6
<223>Xaa＝(S)-N-(1-苯基乙基)甘氨酸
<400>230
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5
<210>231
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1，4，7
<223>Xaa＝N-(4-氨基乙基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>2，3，5，6，8，9
<223>Xaa＝N-(2-(4-甲氧基苯基)乙基)甘氨酸
<400>231
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5
<210>232
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1，3，10
<223>Xaa＝N-(2-甲氧基乙基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>2
<223>Xaa＝N-(2-3’-吲哚基乙基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>4，7
<223>Xaa＝N-(4-氨基丁基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>5，8
<223>Xaa＝(S)-N-(1-苯基乙基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>6，9
<223>Xaa＝N-(2-羟基乙基)甘氨酸
<400>232
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>233
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1，3，5，6，8，10，11
<223>Xaa＝(S)-N-(1-苯基乙基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>2，4，7，9
<223>Xaa＝N-(4-氨基丁基)甘氨酸
<400>233
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>234
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1，3，5，6，8，10，11
<223>Xaa＝N-苄基甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>2，4，7，9
<223>Xaa＝N-(4-氨基丁基)甘氨酸
<400>234
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>235
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1，3，6，10，11
<223>Xaa＝N-(2-甲氧基乙基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>2，4，7，9
<223>Xaa＝N-(4-氨基丁基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>5，8
<223>Xaa＝N-((8’-萘基)甲基)甘氨酸
<400>235
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>236
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1，3，5，6，8，10，11
<223>Xaa＝N-(2-甲氧基乙基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>2，4，7，9
<223>Xaa＝N-(4-氨基丁基)甘氨酸
<400>236
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10
<210>237
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1，2，3，5
<223>Xaa＝N-(4-氨基丁基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>4，6
<223>Xaa＝(S)-N-(1-苯基乙基)甘氨酸
<400>237
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5
<210>238
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1，3，4，6
<223>Xaa＝N-(4-氨基丁基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>2，5
<223>Xaa＝(S)-N-(1-苯基乙基)甘氨酸
<400>238
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5
<210>239
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1，2，3，5
<223>Xaa＝N-(4-氨基丁基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>4，6
<223>Xaa＝(S)-N-(1-苯基乙基)甘氨酸
<400>239
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5
<210>240
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1，2，3，5
<223>Xaa＝N-(4-氨基丁基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>4，6
<223>Xaa＝N-苄基甘氨酸
<400>240
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5
<210>241
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的肽
<220>
<221>VARIANT
<222>1，3，5
<223>Xaa＝N-(2-甲氧基乙基)甘氨酸
<220>
<221>VARIANT
<222>2，4，6
<223>Xaa＝N-苄基甘氨酸
<400>241
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5

Claims (52)

1.一种相比构象疾病蛋白的非致病形式优先与构象疾病蛋白的致病形式相互作用的拟肽试剂，该拟肽试剂具有以下结构式：
Xa-(Q)nXb
式中：
各Q独立为氨基酸或N-取代的甘氨酸，而-(Q)n-定义了拟肽区域；
Xa是H、(C1-C6)烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、(C1-C6)酰基、氨基(C1-6)酰基、氨基酸、氨基保护基、或含有2至约100个氨基酸的多肽，其中，Xa任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代；
Xb是H、(C1-C6)烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、(C1-C6)烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羧基保护基、氨基酸、或含有2至约100个氨基酸的多肽，其中，Xb任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代；和
n是3至约30；
其中，至少约50％的拟肽区域-(Q)n-包含N-取代的甘氨酸。
2.如权利要求1所述的拟肽试剂，其特征在于，所述N-取代的甘氨酸具有以下结构式：
-(NR-CH2-CO)-
其中各R独立选自：(C2-C6)烷基、卤代(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C6-C10)环烷基-芳基、氨基(C1-C6)烷基、铵(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基、羧基、羧基(C2-C6)烷基、氨甲酰基、氨甲酰基(C2-C6)烷基、胍基、胍基(C1-C6)烷基、脒基、脒基(C1-C6)烷基、巯基、(C1-C6)烷硫基、2-10个碳原子的烷硫基烷基、含氮杂环基、含氮杂环基(C1-C6)烷基、咪唑基、4-10个碳原子的咪唑基烷基、哌啶基、5-10个碳原子的哌啶基烷基、吲哚基、9-15个碳原子的吲哚基烷基、萘基、11-16个碳原子的萘基烷基、和芳基(C1-C6)烷基；其中各R部分任选被1-3个独立选自卤素、羟基或(C1-C6)烷氧基的取代基取代。
3.如权利要求1所述的拟肽试剂，其特征在于，Xb是任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代的氨基酸。
4.如权利要求1所述的拟肽试剂，其特征在于，n为约5至约15。
5.如权利要求1所述的拟肽试剂，其特征在于，各Q是N-取代的甘氨酸。
6.如权利要求1所述的拟肽试剂，其特征在于，所述拟肽区域-(Q)n-在生理相关pH下是多离子的。
7.如权利要求1所述的拟肽试剂，其特征在于，所述拟肽区域-(Q)n-在生理相关pH下具有至少3+净电荷。
8.如权利要求1所述的拟肽试剂，其特征在于，所述N-取代的甘氨酸具有结构式-(NR-CH2-CO)-，式中，R独立选自：(C2-C6)烷基、卤代(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C6-C10)环烷基-芳基、氨基(C1-C6)烷基、铵(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基、羧基、羧基(C2-C6)烷基、氨甲酰基、氨甲酰基(C2-C6)烷基、胍基、胍基(C1-C6)烷基、脒基、脒基(C1-C6)烷基、巯基、(C1-C6)烷硫基、2-10个碳原子的烷硫基烷基、含氮杂环基、含氮杂环基(C1-C6)烷基、咪唑基、4-10个碳原子的咪唑基烷基、哌啶基、5-10个碳原子的哌啶基烷基、吲哚基、9-15个碳原子的吲哚基烷基、萘基、11-16个碳原子的萘基烷基、和芳基(C1-C6)烷基；其中各R部分任选被1-3个独立选自卤素、羟基和(C1-C6)烷氧基的取代基取代，且所述拟肽区域-(Q)n-包含至少3个N-取代的甘氨酸，其中R是在生理相关pH下带有电荷的部分。
9.如权利要求8所述的拟肽试剂，其特征在于，所述带有电荷的N-取代的甘氨酸包含带有电荷的R部分，该部分独立选自：氨基(C1-C6)烷基、铵(C1-C6)烷基、胍基、胍基(C1-C6)烷基、脒基、脒基(C1-C6)烷基、含氮杂环基、和含氮杂环基(C1-C6)烷基，其中各R部分任选被1-3个独立选自卤素、C1-C3甲氧基或C1-C3烷基的取代基取代。
10.如权利要求1所述的拟肽试剂，其特征在于，所述拟肽区域-(Q)n-包含SEQ IDNO：229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240或241。
11.如权利要求1所述的拟肽试剂，其特征在于，所述拟肽区域-(Q)n-包含SEQ IDNO：229、230、232、233、237、238、239或240。
12.如权利要求1所述的拟肽试剂，其特征在于，所述拟肽区域-(Q)n-包含SEQ IDNO：230、237、238、239或240。
13.如权利要求1所述的拟肽试剂，其特征在于，所述拟肽区域-(Q)n-包含SEQ IDNO：240。
14.如权利要求1所述的拟肽试剂，其包含至少一个结合部分。
15.如权利要求14所述的拟肽试剂，其特征在于，所述结合部分通过接头部分连接。
16.如权利要求14所述的拟肽试剂，其特征在于，所述结合部分是交联剂或结合剂。
17.如权利要求14所述的拟肽试剂，其特征在于，所述结合部分包括生物素或巯基。
18.如权利要求1所述的拟肽试剂，其特征在于，所述构象疾病蛋白是朊病毒-相关疾病的蛋白；所述构象疾病蛋白的致病形式是PrPSc；而所述构象疾病蛋白的非致病形式是PrPC。
19.如权利要求1所述的拟肽试剂，其特征在于，所述拟肽试剂与构象疾病蛋白的致病形式相互作用的亲和力比对构象疾病蛋白的非致病形式的亲和力高至少约10倍。
20.一种相比PrPC优先与PrPSc相互作用的拟肽试剂，其中，所述拟肽试剂具有以下结构式：
Xa-(Q)n-Xb
式中：
各Q独立为下式所示的N-取代的甘氨酸：
-(NR-CH2-CO)-
其中各R独立选自：(C2-C6)烷基、卤代(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C6-C10)环烷基-芳基、氨基(C1-C6)烷基、铵(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基(C1-C6)烷基、羧基、羧基(C2-C6)烷基、氨甲酰基、氨甲酰基(C2-C6)烷基、胍基、胍基(C1-C6)烷基、脒基、脒基(C1-C6)烷基、巯基、(C1-C6)烷硫基、2-10个碳原子的烷硫基烷基、含氮杂环基、含氮杂环基(C1-C6)烷基、咪唑基、4-10个碳原子的咪唑基烷基、哌啶基、5-10个碳原子的哌啶基烷基、吲哚基、9-15个碳原子的吲哚基烷基、萘基、11-16个碳原子的萘基烷基、和芳基(C1-C6)烷基；其中各R部分任选被1-3个独立选自卤素、羟基或(C1-C6)烷氧基的取代基取代；-(Q)n-定义了拟肽区域；
Xa是H、(C1-C6)烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、(C1-C6)酰基、氨基(C1-6)酰基、氨基酸、氨基保护基、或含有2至约100个氨基酸的多肽，其中，Xa任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代；
Xb是H、(C1-C6)烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、(C1-C6)烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羧基保护基、氨基酸、或含有2至约100个氨基酸的多肽，其中，Xb任选被任选通过接头部分连接的结合部分所取代；和
n是4、5、6、7或8；
其中，所述拟肽区域-(Q)n-在生理相关pH下具有至少3+净电荷。
21.一种选自以下的拟肽试剂：
Figure A2006800331290006C1
Figure A2006800331290007C1
22.一种选自以下的拟肽试剂或其盐：
Figure A2006800331290007C2
Figure A2006800331290008C1
23.一种复合物，其包含如权利要求1、10、20和21中任一项所述的拟肽试剂和致病性朊病毒。
24.一种组合物，其包含连接于固体支持体的如权利要求1、10、20和21中任一项所述的拟肽试剂。
25.一种组合物，其包含如权利要求1、10、20和21中任一项所述的拟肽试剂和样品。
26.如权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述样品是生物样品。
27.一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：在允许如权利要求1、10、20和21中任一项所述第一拟肽试剂与如果存在的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触所述拟肽试剂以形成复合物，并检测所述复合物的形成，其中，形成所述复合物表明存在所述致病性朊病毒。
28.一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：在允许如权利要求1、10、20和21中任一项所述第一拟肽试剂与如果存在的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触所述第一拟肽试剂以形成第一复合物，在允许本发明的第二拟肽试剂与所述第一复合物中的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述第一复合物接触任选可检测标记的所述第二拟肽试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，其中，形成所述第二复合物表明存在所述致病性朊病毒。
29.一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：在允许如权利要求1、10、20和21中任一项所述第一拟肽试剂与如果存在的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触所述第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去所述第一复合物中的未结合样品，在允许本发明的第二拟肽试剂与所述第一复合物中的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述第一复合物接触任选可检测标记的所述第二拟肽试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，其中，形成所述第二复合物表明存在所述致病性朊病毒。
30.一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：在允许如权利要求1、10、20和21中任一项所述第一拟肽试剂与如果存在的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触所述第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去所述第一复合物中的未结合样品，从所述第一复合物中解离所述致病性朊病毒从而提供解离的致病性朊病毒，在允许如权利要求1所述的第二拟肽试剂与所述解离的致病性朊病毒结合的条件下使所述解离的致病性朊病毒接触任选可检测标记的所述第二拟肽试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，其中，形成所述第二复合物表明存在所述致病性朊病毒。
31.一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：在允许如权利要求1、10、20和21中任一项所述第一拟肽试剂与如果存在的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触所述第一拟肽试剂以形成第一复合物，在允许朊病毒-结合试剂与所述第一复合物中的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述第一复合物接触任选可检测标记的所述朊病毒-结合试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，其中，形成所述第二复合物表明存在所述致病性朊病毒。
32.一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：在允许如权利要求1、10、20和21中任一项所述第一拟肽试剂与如果存在的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触所述第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去所述第一复合物中的未结合样品，在允许朊病毒-结合试剂与所述第一复合物中的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述第一复合物接触任选可检测标记的所述朊病毒-结合试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，其中，形成所述第二复合物表明存在所述致病性朊病毒。
33.一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：在允许如权利要求1、10、20和21中任一项所述第一拟肽试剂与如果存在的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触所述第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去所述第一复合物中的未结合样品，从所述第一复合物中解离所述致病性朊病毒从而提供解离的致病性朊病毒，在允许朊病毒-结合试剂与所述解离的致病性朊病毒结合的条件下使所述解离的致病性朊病毒接触任选可检测标记的所述朊病毒-结合试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，其中，形成所述第二复合物表明存在所述致病性朊病毒。
34.一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：在允许如权利要求1、10、20和21中任一项所述第一拟肽试剂与如果存在的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触所述第一拟肽试剂以形成第一复合物，除去所述第一复合物中的未结合样品，从所述第一复合物中解离所述致病性朊病毒从而提供解离的致病性朊病毒，在允许朊病毒-结合试剂与所述解离的致病性朊病毒结合的条件下使所述解离的致病性朊病毒接触所述朊病毒-结合试剂以形成第二复合物，并用任选可检测标记的第二朊病毒-结合试剂检测所述第二复合物的形成，其中，形成所述第二复合物表明存在所述致病性朊病毒。
35.一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：在允许朊病毒-结合试剂与如果存在的致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触所述朊病毒-结合试剂以形成第一复合物，除去所述第一复合物中的未结合样品，在允许如权利要求1、10、20和21中任一项所述拟肽试剂与所述第一复合物中的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述第一复合物接触任选可检测标记的所述拟肽试剂以形成第二复合物，并检测所述第二复合物的形成，其中，形成所述第二复合物表明存在所述致病性朊病毒。
36.如权利要求31-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述朊病毒-结合试剂包含抗-朊病毒抗体。
37.一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：在允许如权利要求1、10、20和21中任一项所述第一拟肽试剂与如果存在的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触所述第一拟肽试剂以形成复合物，除去所述复合物中的未结合样品，从所述复合物中解离所述致病性朊病毒从而提供解离的致病性朊病毒，在允许所述解离的致病性朊病毒附着于第二固相支持体的条件下使所述解离的致病性朊病毒接触所述第二固体支持体；并用任选可检测标记的朊病毒-结合试剂检测附着的解离的致病性朊病毒，其中，所述朊病毒-结合试剂的结合表明存在所述致病性朊病毒。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，通过使所述复合物接触高pH或低pH进行所述解离。
39.如权利要求38所述的方法，还包括在所述解离之后中和所述高pH或所述低pH的步骤。
40.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述解离的致病性朊病毒是变性的。
41.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述朊病毒-结合试剂包含抗-朊病毒抗体。
42.一种检测样品中是否存在致病性朊病毒的方法，该方法包括：在允许如权利要求1、10、20和21中任一项所述第一拟肽试剂与如果存在的所述致病性朊病毒结合的条件下使所述样品接触所述第一拟肽试剂形成第一复合物，除去所述第一复合物中的未结合样品，从所述第一复合物中解离所述致病性朊病毒从而提供解离的致病性朊病毒，在允许所述解离的致病性朊病毒与第一抗-朊病毒抗体结合的条件下使所述解离的致病性朊病毒接触第二固相支持体以形成第二复合物，其中所述第二固相支持体包含所述第一抗-朊病毒抗体；并用任选可检测标记的第二抗-朊病毒抗体检测所述第二复合物中的所述解离的致病性朊病毒，其中，所述第二抗-朊病毒抗体的结合表明存在所述致病性朊病毒。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，通过使所述第一复合物接触高pH或低pH进行所述解离。
44.如权利要求43所述的方法，还包括在所述解离之后中和所述高pH或所述低pH的步骤。
45.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述解离的致病性朊病毒是变性的。
46.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述第一朊病毒-结合试剂包含抗-朊病毒抗体。
47.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述第二朊病毒-结合试剂包含抗-朊病毒抗体。
48.一种确定动物中朊病毒-相关疾病感染部位的方法，该方法包括：
(a)给予所述动物如权利要求1、10、20和21中任一项所述的拟肽试剂，其中所述拟肽试剂连接于显像剂；和
(b)检测所述显像剂，其中，检测出所述显像剂确定了所述感染的部位。
49.一种从样品中分离致病性朊病毒的方法，该方法包括：
(a)在允许样品中如果存在的所述致病性朊病毒与如权利要求1、10、20和21中任一项所述拟肽试剂结合的条件下使包含所述拟肽试剂的固相支持体接触所述样品以形成复合物；和
(b)除去所述复合物中的未结合样品，从而提供分离的致病性朊病毒。
50.一种减少样品中致病性朊病毒含量的方法，该方法包括：
(a)在允许所述样品中如果存在的所述致病性朊病毒与固相支持体中如权利要求1、10、20和21中任一项所述拟肽试剂结合的条件下使包含所述拟肽试剂的所述固相支持体接触所述样品以形成复合物；和
(b)将未结合样品与所述复合物分离，从而提供致病性朊病毒含量减少的所述样品。
51.一种制备基本上不含致病性朊病毒的血液供给的方法，该方法包括：
(a)检测大量血液样品中是否存在致病性朊病毒，其中所述检测包括使如果存在的所述致病性朊病毒结合如权利要求1、10、20和21中任一项所述的拟肽试剂；和
(b)混合未检测出致病性朊病毒的所述样品从而提供基本上不含致病性朊病毒的血液供给。
52.一种制备基本上不含致病性朊病毒的食品供给的方法，该方法包括：
(a)检测大量食物样品中是否存在致病性朊病毒，其中所述检测包括使如果存在的所述致病性朊病毒结合如权利要求1、10、20和21中任一项所述的拟肽试剂；和
(b)混合未检测出致病性朊病毒的所述样品从而提供基本上不含致病性朊病毒的所述食品供给。
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