CN102725639A - 蛋白质聚集物与单体分离中作为结合试剂的带正电物质 - Google Patents

蛋白质聚集物与单体分离中作为结合试剂的带正电物质 Download PDF

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Abstract

本发明提供检测样品中聚集物存在的方法，通过：将怀疑含聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述聚集物(如果有)的条件下接触；通过所述聚集物与所述试剂的结合，检测所述样品中聚集物(如果有)的存在；其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。还提供检测寡聚体存在的方法。提供了用于所述方法的组合物。

Description

蛋白质聚集物与单体分离中作为结合试剂的带正电物质
背景技术
蛋白质错折叠是细胞中的正常现象。然而，错折叠蛋白倾向于自我结合，形成不同大小和结构的蛋白聚集物。由于持续性错折叠蛋白可导致毒性聚集物，细胞含有减少细胞中错折叠蛋白量的途径和机制。错折叠蛋白中间体由辅助中间体正确折叠的分子伴侣识别。如果错折叠蛋白逃避分子伴侣的修正，泛素-蛋白体途径通常将它们降解。
错折叠蛋白积聚与多种疾病相关联。蛋白质构象病包括多种临床非相关疾病，如感染性海绵状脑病、阿尔茨海默病、ALS和糖尿病，所述疾病由正常蛋白异常构象转化成致病性构象异构体引起。此转化可进而导致伴有后续组织沉积的致病性构象异构体自结合成较小的聚集物如寡聚体或较大的聚集物如原纤维，并推测引起周围组织损伤。
已证实难以检测活对象和获自活对象的样品中的构象病蛋白聚集物。确认病人中存在聚集物的现行技术是粗糙和侵入性的。例如，组织病理学检测需要的活检对所述对象有风险。组织病理学本身易产生抽样误差，因为根据取活检的区域可能错过聚集的致病性构象异构体的损伤和沉积。因此，在对象死亡前明确诊断和舒缓治疗这些病症仍是尚未解决的挑战。
β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集物，主要是Aβ1-40(Aβ40)和1-42(Aβ42)的沉积与阿尔茨海默病(AD)全面相关并被认为是该疾病的最佳标记物。然而，AD的唯一确定性试验是免疫组化染色来自死后脑样品的纤维Aβ聚集物斑。目前，对于AD没有FDA批准的生前诊断试验。血浆或CSF样品可用于生前试验。一些生前AD试验着重于脑脊液(CSF)并尝试定量可溶性单体Aβ42。然而，该生物标记仅用作AD的间接检测。
近期的文献提示Aβ的小型、可溶性、非纤维寡聚体可能是直接引起阿尔茨海默病表型的神经毒剂(Hoshi等，PNAS，2003，100，6370；Lambert等，PNAS，1998，95，6448)。此外，使用针对Aβ42产生的抗体发现取自阿尔茨海默病患者脑脊液(CSF)中的Aβ寡聚物质水平比取自健康对照对象的CSF高(Georganopoulou等，PNAS，2005，102，2273)。然而迄今尚未报道能结合寡聚体的小分子。
因此，可直接从CSF或其它体液如血浆特异性检测聚集Aβ的试验会具有很大优势。早期检测聚集物如可溶性Aβ寡聚体可更快和更有效诊断阿尔茨海默病并评估其潜在疗法。
还需要能直接从体液样品检测其它构象病蛋白致病性聚集物的试验，因为它们也可更快和更早诊断并评估这些构象病的潜在疗法。
此外，生产多肽的质量控制也受益于使用特异性结合聚集物的试剂。由于多肽如重组胰岛素或治疗性抗体一般以较高水平生产，易于形成聚集物。因此，需要能特异性结合聚集物的试剂以将其从所需多肽制品中去除。
优选实施方式的概述
本文所述的发明通过提供用聚集物特异性结合试剂检测样品中聚集物存在的方法来满足这些需求。在优选实施方式中，所述方法检测寡聚体的存在。
因此，一方面包括检测样品中聚集物存在的方法，包括步骤：将怀疑含聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物；并通过所述聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述样品中聚集物的存在(如果有)，其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且在附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
另一方面包括检测样品中聚集物存在的方法，包括步骤：将怀疑含聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物；将所述复合物与构象蛋白特异性结合试剂在允许结合的条件下接触；并通过所述聚集物与所述构象蛋白特异性结合试剂的结合，检测所述样品中聚集物的存在(如果有)，其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且在附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。在某些实施方式中，所述方法还包括在形成所述复合物后去除未结合样品。在某些实施方式中，所述构象蛋白特异性结合试剂是抗体。在优选实施方式中，所述聚集物包含Aβ蛋白且所述构象蛋白特异性结合试剂是抗Aβ抗体。
另外一方面包括检测样品中聚集物存在的方法，包括步骤：将怀疑含聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成第一复合物；去除未结合样品；从所述第一复合物脱离所述聚集物从而提供脱离的聚集物；将所述脱离的聚集物与第一构象蛋白特异性结合试剂在允许结合形成第二复合物的条件下接触；并通过检测所述第二复合物的形成，检测所述样品中聚集物的存在(如果有)；其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且在附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。在某些实施方式中，所述第一构象蛋白特异性结合试剂与固体支持物偶联。在某些实施方式中，通过使所述第一复合物接触异硫氰酸胍或者使所述复合物接触高pH或低pH，从所述第一复合物中脱离所述聚集物。在优选实施方式中，所述聚集物包括Aβ蛋白且所述构象蛋白特异性结合试剂是抗Aβ抗体。
另一方面提供检测样品中聚集物存在的方法，包括步骤：将怀疑含聚集物的样品与构象蛋白特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物；去除未结合样品；将所述复合物与所述聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，其中所述试剂包括可检测标记；并通过所述聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述样品中聚集物的存在(如果有)；其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且在附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。在某些实施方式中，所述构象蛋白特异性蛋白与固体支持物偶联。
另外一方面提供检测样品中聚集物存在的方法，包括步骤：提供含聚集物特异性结合试剂的固体支持物；将所述固体支持物与可检测带标记配体结合，其中所述聚集物特异性结合试剂与所述可检测带标记配体的结合亲合力弱于所述试剂与所述聚集物的结合亲合力；将怀疑含聚集物的样品与所述固体支持物在允许聚集物(存在于所述样品中时)结合所述试剂并替代所述配体的条件下组合；并检测所述聚集物与所述聚集物特异性结合试剂间形成的复合物；其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且在附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
另一方面提供减少多肽样品中聚集物量的方法，包括步骤：将怀疑含聚集物的多肽样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物；回收未结合的多肽样品；其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且在附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
另外一方面提供区分样品中聚集物和单体的方法，包括步骤：将怀疑含聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物；并通过所述聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，区分所述样品中的聚集物和单体(如果有)；其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且在附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
另一方面提供评价对象患构象病可能性是否增加的方法，包括步骤：将来自怀疑患构象病对象的生物样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合致病性聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物；通过所述致病性聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述生物样品中致病性聚集物的存在(如果有)；如果所述生物样品中致病性聚集物含量高于没有构象病患者样品中的聚集物含量，确定所述对象患有构象病的可能性增加；其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且在附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
另一方面提供评价构象病治疗有效性的方法，包括步骤：将接受构象病治疗患者的生物样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合致病性聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物；通过所述致病性聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述样品中致病性聚集物的存在(如果有)；如果所述生物样品中致病性聚集物含量低于对照中的致病性聚集物含量，确定所述治疗有效，其中所述对照是构象病治疗前所述患者生物样品中的致病性聚集物含量，其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且在附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
另外一方面包括检测样品中寡聚体存在的方法，包括步骤：提供怀疑含寡聚体的样品，其中所述样品缺乏寡聚体外的聚集物；将所述样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述寡聚体的条件下接触，如果存在所述寡聚体则形成复合物；并通过所述寡聚体与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述样品中寡聚体的存在(如果有)；其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约2000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且在附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
另一方面包括检测样品中寡聚体存在的方法，包括步骤：提供怀疑含寡聚体的样品；从所述样品中去除寡聚体之外的聚集物；将所述样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述寡聚体的条件下接触，如果存在所述寡聚体则形成复合物；并通过所述寡聚体与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述样品中寡聚体的存在(如果有)；其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约2000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且在附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。在某些实施方式中，通过离心去除聚集物。
另外一方面包括检测样品中寡聚体存在的方法，包括步骤：将怀疑含寡聚体的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述寡聚体的条件下接触，如果存在所述寡聚体则形成复合物；将所述复合物与第二试剂接触，其中所述试剂优先结合寡聚体或寡聚体外的聚集物；并通过所述寡聚体与所述第二试剂的结合或不结合，检测所述样品中寡聚体的存在(如果有)；其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约2000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且在附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。在包括检测寡聚体存在的方面的某些实施方式中，寡聚体外的聚集物包括原纤维。
在上述方面的某些实施方式中，感兴趣的(例如待检测、减少或区分的)所述聚集物、致病性聚集物或寡聚体为可溶性。
在上述方面的某些实施方式中，所述方法还包括用去污剂处理所述聚集物特异性结合试剂与所述聚集物或寡聚体之间形成的复合物。在某些实施方式中，在接触步骤后进行处理步骤。在某些实施方式中，所述去污剂是中性去污剂。在某些实施方式中，包括正和负电荷。在某些优选实施方式中，所述去污剂包括长碳链。在一些优选实施方式中，所述去污剂选自聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、n-十四烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸酯、n-十六烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸酯、n-十二烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸酯、氨基磺基甜菜碱-14，3-[N，N-二甲基(3-十四酰氨丙基)氨基]丙磺酸酯、氨基磺基甜菜碱-16，3-[N，N-二甲基-N-(3-棕榈酰胺丙基)氨基]-丙-1-磺酸酯、4-n-辛基苯甲酰氨-丙基-二甲氨基磺基甜菜碱和N，N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱。
在上述方面的某些实施方式中，所述固体支持物选自：硝酸纤维素、聚苯乙烯胶乳、聚氟乙烯、重氮化纸、尼龙膜、活化珠、磁响应珠、氧化钛、二氧化硅、多糖珠、多糖膜、琼脂糖、玻璃、聚丙烯酸、聚乙二醇、聚乙二醇-聚苯乙烯杂合物、可控孔度玻璃、载玻片、金珠和纤维素。在某些实施方式中，聚集物特异性结合试剂带可检测标记。在某些实施方式中，所述样品是包括身体组织或液体的生物样品。在某些实施方式中，所述生物样品包括全血、血液部分、血液组分、血浆、血小板、血清、脑脊液(CSF)、骨髓、尿液、泪液、乳液、淋巴液、器官组织、脑组织、神经系统组织、肌肉组织、非神经系统组织、活检、尸检、脂肪活检、细胞、粪便、胎盘、脾组织、淋巴组织、胰腺组织、支气管肺泡灌洗液或滑液。在优选的实施方式中，所述样品包括脑脊液(CSF)。在某些实施方式中，所述样品包括多肽。
在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+2、至少约+3、至少约+4、至少约+5、至少约+6和至少约+7的净电荷。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约90nmol净电荷、每平方米至少约120nmol净电荷、每平方米至少约500nmol净电荷、每平方米至少约1000nmol净电荷、每平方米至少约2000nmol净电荷、每平方米至少约3000nmol净电荷、每平方米至少约4000nmol净电荷、或每平方米至少约5000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。在优选的实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约6000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂对聚集物的结合亲和性和/或亲合力比对单体的结合亲和性和/或亲合力至少高约2倍。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括至少一个带正电官能团，其pKa比所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH高至少约1pH单位。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂的所述至少一个带正电官能团在所有官能团中最接近所述固体支持物。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括疏水性官能团。在一些实施方式中，所述疏水性官能团是芳族疏水性官能团。在其它实施方式中，疏水性官能团是脂肪族疏水性官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括唯一的带正电官能团和至少一个疏水性官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括至少一个带正电官能团和唯一的疏水性官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括唯一的带正电官能团和唯一的疏水性官能团。在一些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括至少一个为L-异构体的氨基酸。在一些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括至少一个为D-异构体的氨基酸。
在某些实施方式中，所述聚集物是非致病性的。在某些实施方式中，所述非致病性聚集物是酵母朊蛋白sup35或激素。在某些实施方式中，所述非致病性聚集物是多肽的聚集物。在其它实施方式中，所述聚集物是致病性的。在某些实施方式中，所述致病性聚集物是与先兆子痫、滔蛋白病变、TDP-43蛋白质病或丝氨酸病变(serpinopathy)相关的聚集物。在某些实施方式中，所述致病性聚集物是与淀粉样病相关的聚集物。在某些实施方式中，所述淀粉样病选自系统性淀粉样变性、AA淀粉样变性病、共核蛋白病、阿尔茨海默病、朊病毒病、ALS、免疫球蛋白相关疾病、血清淀粉样蛋白A相关疾病、亨廷顿氏病、帕金森病、II型糖尿病、透析相关性淀粉样变和脑淀粉样血管病。在优选的实施方式中，所述致病性聚集物是与阿尔茨海默病相关的聚集物。在某些另外优选的实施方式中，所述致病性聚集物是与脑淀粉样血管病相关的聚集物。在某些实施方式中，所述与阿尔茨海默病或脑淀粉样血管病相关的聚集物包括β-淀粉样(Aβ)蛋白。在一些实施方式中，所述Aβ蛋白是Aβ40。在其它实施方式中，所述Aβ蛋白是Aβ42。在某些实施方式中，所述与阿尔茨海默病相关的聚集物包括tau蛋白。在某些实施方式中，所述致病性聚集物包括糊精。在某些实施方式中，所述致病性聚集物包括淀粉样A蛋白。在某些实施方式中，所述致病性聚集物包括α-突触核蛋白。
在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括至少一个氨基酸，其在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少+1净电荷的氨基酸。在某些实施方式中，所述至少一个氨基酸在生理pH下带正电。在某些实施方式中，所述至少一个氨基酸是选自赖氨酸和精氨酸的天然氨基酸。在某些实施方式中，所述至少一个氨基酸是选自鸟氨酸、甲基赖氨酸、二氨基丁酸、高精氨酸和4-氨甲基苯丙氨酸的非天然氨基酸。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括疏水性氨基酸。在某些实施方式中，所述疏水性氨基酸是芳族疏水性氨基酸。在某些实施方式中，所述疏水性氨基酸是脂肪族疏水性氨基酸。在某些实施方式中，所述疏水性氨基酸选自色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、高苯丙氨酸、苯甘氨酸、4-氯苯丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、噻吩丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氨基苯丙氨酸、五氟苯丙氨酸、2-萘基丙氨酸、p-联苯丙氨酸、苯乙烯基丙氨酸、取代的苯丙氨酸、卤化苯丙氨酸、氨基异丁酸、丙烯基甘氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、1-萘基丙氨酸、吡啶丙氨酸和1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸。在优选的实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自下组的肽：KKKFKF(SEQ ID NO：1)、KKKWKW(SEQ ID NO：2)、KKKLKL(SEQ ID NO：3)、KKKKKK(SEQ ID NO：4)、KKKKKKKKKKKK(SEQ ID NO：5)、AAKKAA(SEQ ID NO：32)、AAKKKA(SEQ ID NO：33)、AKKKKA(SEQ ID NO：34)、AKKKKK(SEQ ID NO：35)、FKFKKK(SEQ IDNO：36)、kkkfkf(SEQ ID NO：37)、FKFSLFSG(SEQ ID NO：38)、DFKLNFKF(SEQ ID NO：39)、FKFNLFSG(SEQ ID NO：40)、YKYKKK(SEQ ID NO：41)、KKFKKF(SEQ ID NO：42)、KFKKKF(SEQ ID NO：43)、KIGVVR(SEQ ID NO：44)、AKVKKK(SEQ ID NO：45)、AKFKKK(SEQ ID NO：46)、RGRERFEMFR(SEQ ID NO：47)、YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：48)、FFFKFKKK(SEQ IDNO：49)、FFFFFKFKKK(SEQ ID NO：50)、FFFKKK(SEQ ID NO：51)和FFFFKK(SEQ ID NO：52)。在一些优选的实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自下组的肽：F-fdb-F-fdb-fdb-fdb(SEQ ID NO：53)、FoFooo(SEQ ID NO：54)、单Boc-乙二胺+BrCH2CO-KKFKF(SEQ ID NO：55)、三乙胺+BrCH2CO-KKFKF(SEQ ID NO：56)、四甲基乙二胺+BrCH2CO-KKFKF(SEQ ID NO：57)和SEQ ID NO：58-66。在一些优选的实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自下组的肽KFYLYAIDTHRM(SEQ ID NO：6)、KIIKWGIFWMQG(SEQ ID NO：7)、NFFKKFRFTFTM(SEQ ID NO：8)、MKFMKMHNKKRY(SEQ ID NO：67)、LTAVKKVKAPTR(SEQ ID NO：68)、LIPIRKKYFFKL(SEQ ID NO：69)、KLSLIWLHTHWH(SEQ ID NO：70)、IRYVTHQYILWP(SEQ ID NO：71)、YNKIGVVRLFSE(SEQ ID NO：72)、YRHRWEVMLWWP(SEQ ID NO：73)、WAVKLFTFFMFH(SEQ ID NO：74)、YQSWWFFYFKLA(SEQ ID NO：75)、WWYKLVATHLYG(SEQ ID NO：76)、QTLSLHFQTRPP(SEQ ID NO：77)、TRLAMQYVGYFW(SEQ ID NO：78)、RYWYRHWSQHDN(SEQ ID NO：79)、AQYIMFKVFYLS(SEQ ID NO：80)、TGIRIYSWKMWL(SEQ ID NO：81)、SRYLMYVNIIYI(SEQ ID NO：82)、RYWMNAFYSPMW(SEQ ID NO：83)、NFYTYKLAYMQM(SEQ ID NO：84)、MGYSSGYWSRQV(SEQ ID NO：85)、YFYMKLLWTKER(SEQ ID NO：86)、RIMYLYHRLQHT(SEQ ID NO：87)、RWRHS SFYPIWF(SEQ ID NO：88)、QVRIFTNVEFKH(SEQ ID NO：89)和RYLHWYAVAVKV(SEQ ID NO：90)的肽。在一些优选的实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自SEQID NO：9-14和91-96的类肽。在优选的实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自下组的类肽：
Figure BPA00001563392200101
Figure BPA00001563392200111
Figure BPA00001563392200121
其中R和R’是任何基团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括
Figure BPA00001563392200122
其中R和R’是任何基团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括树突
Figure BPA00001563392200123
在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自胺基、烷基、杂环、环烷、胍、醚、烯丙基和芳族的官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自萘、苯酚、苯胺、苯基、取代的苯基、硝基苯基、卤化苯基、联苯、苯乙烯基、二苯基、苄磺酰胺、氨甲基苯基、噻吩、吲哚、萘基、呋喃和咪唑的芳族官能团。在某些实施方式中，所述卤化苯基是氯苯基或氟苯基。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自伯胺、仲胺、叔胺和季胺的胺基官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自异丁基、异丙基、仲丁基、甲基和辛基的烷基官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自四氢呋喃、吡咯烷和哌啶的杂环官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自环丙基和环己基的环烷官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括重复基序。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括其间隔与所述聚集物带负电基团相同的带正电基团。
在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15。在某些实施方式中，所述聚集物包括糊精，其中所述聚集物特异性结合试剂包括SEQ ID NO：15，且其中所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约8000nmol-约15000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。在某些实施方式中，所述聚集物包括α-突触核蛋白，其中所述聚集物特异性结合试剂包括SEQ ID NO：15，且其中所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约8000nmol-约15000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。在某些实施方式中，所述聚集物包括淀粉样A蛋白，其中所述聚集物特异性结合试剂包括SEQ ID NO：15，且其中所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约8000nmol-约15000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。在某些实施方式中，还包括去污剂处理的步骤，所述去污剂是n-十四烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸酯，其中所述聚集物是含有Aβ40蛋白的致病性聚集物，其中所述聚集物特异性结合试剂包括SEQ ID NO：15，且其中所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约8000nmol-约15000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。在某些实施方式中，所述样品包括脑脊液(CSF)。
另一方面包括肽聚集物特异性结合试剂，其中所述试剂包括选自下组的氨基酸序列：KKKFKF(SEQ ID NO：1)、KKKWKW(SEQ ID NO：2)、KKKLKL(SEQ ID NO：3)、KKKKKKKKKKKK(SEQ ID NO：5)、AAKKAA(SEQ ID NO：32)、AAKKKA(SEQ ID NO：33)、AKKKKA(SEQ ID NO：34)、AKKKKK(SEQID NO：35)、FKFKKK(SEQ ID NO：36)、kkkfkf(SEQ ID NO：37)、FKFSLFSG(SEQ ID NO：38)、DFKLNFKF(SEQ ID NO：39)、FKFNLFSG(SEQ ID NO：40)、YKYKKK(SEQ ID NO：41)、KKFKKF(SEQ ID NO：42)、KFKKKF(SEQID NO：43)、KIGVVR(SEQ ID NO：44)、AKVKKK(SEQ ID NO：45)、AKFKKK(SEQ ID NO：46)、RGRERFEMFR(SEQ ID NO：47)、FFFKFKKK(SEQ ID NO：49)、FFFFFKFKKK(SEQ ID NO：50)、FFFKKK(SEQ ID NO：51)和FFFFKK(SEQ ID NO：52)。另外一方面包括肽聚集物特异性结合试剂，其中所述试剂包括由KKKKKK氨基酸序列组成的肽。另一方面包括肽聚集物特异性结合试剂，其中所述试剂包括选自下组的氨基酸序列：F-fdb-F-fdb-fdb-fdb(SEQ ID NO：53)、FoFooo(SEQ ID NO：54)、单Boc-乙二胺+BrCH2CO-KKFKF(SEQ ID NO：55)、三乙胺+BrCH2CO-KKFKF(SEQ IDNO：56)、四甲基乙二胺+BrCH2CO-KKFKF(SEQ ID NO：57)和SEQ ID NO：58-66。另一方面包括类肽聚集物特异性结合试剂，其中所述试剂包括选自SEQ ID NO：9-14和91-95的类肽。另一方面包括类肽聚集物特异性结合试剂，其中所述试剂包括选自下组的类肽：
Figure BPA00001563392200141
其中R和R’是任何基团。另一方面包括树突聚集物特异性结合试剂，其中所述试剂包括
在某些实施方式中，所述试剂包括疏水性官能团。在某些实施方式中，所述疏水性官能团是芳族疏水性官能团。在某些实施方式中，所述疏水性官能团是脂肪族疏水性官能团。在某些实施方式中，所述试剂包括选自胺基、烷基、杂环、环烷、胍、醚、烯丙基和芳族的官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自萘、苯酚、苯胺、苯基、取代的苯基、硝基苯基、卤化苯基、联苯、苯乙烯基、二苯基、苄磺酰胺、氨甲基苯基、噻吩、吲哚、萘基、呋喃和咪唑的芳族官能团。在某些实施方式中，所述卤化苯基是氯苯基或氟苯基。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自伯胺、仲胺、叔胺和季胺的胺基官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自异丁基、异丙基、仲丁基、甲基和辛基的烷基官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自四氢呋喃、吡咯烷和哌啶的杂环官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自环丙基和环己基的环烷官能团。在某些实施方式中，所述试剂带可检测标记。
另一方面包括含固体支持物和上述方面的聚集物特异性结合试剂的组合物。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附着，其中所述组合物对聚集物的结合优于对单体。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约90nmol净电荷、每平方米至少约120nmol净电荷、每平方米至少约500nmol净电荷、每平方米至少约1000nmol净电荷、每平方米至少约2000nmol净电荷、每平方米至少约3000nmol净电荷、每平方米至少约4000nmol净电荷、或每平方米至少约5000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，其中所述组合物对聚集物的结合优于对单体。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约6000nmol净电荷、每平方米至少约7000nmol净电荷、每平方米至少约8000nmol净电荷、或每平方米至少约9000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，其中所述组合物对聚集物的结合优于对单体。在某些实施方式中，所述固体支持物选自下组：硝酸纤维素、聚苯乙烯胶乳、聚氟乙烯、重氮化纸、尼龙膜、活化珠、磁响应珠、氧化钛、二氧化硅、多糖珠、多糖膜、琼脂糖、玻璃、聚丙烯酸、聚乙二醇、聚乙二醇-聚苯乙烯杂合物、可控孔度玻璃、载玻片、金珠和纤维素。
另一方面包括含A组合物的组合物，所述组合物含有固体支持物和聚集物特异性结合试剂，其中所述聚集物特异性结合试剂包括
Figure BPA00001563392200181
其中所述固体支持物还包括珠。
另一方面包括含固体支持物和肽聚集物特异性结合试剂的组合物，其中所述试剂包括选自下组的氨基酸序列：KFYLYAIDTHRM(SEQ ID NO：6)、KIIKWGIFWMQG(SEQ ID NO：7)、MKFMKMHNKKRY(SEQ ID NO：67)、LTAVKKVKAPTR(SEQ ID NO：68)、LIPIRKKYFFKL(SEQ ID NO：69)、KLSLIWLHTHWH(SEQ ID NO：70)、IRYVTHQYILWP(SEQ ID NO：71)、YNKIGVVRLFSE(SEQ ID NO：72)、YRHRWEVMLWWP(SEQ ID NO：73)、WAVKLFTFFMFH(SEQ ID NO：74)、YQSWWFFYFKLA(SEQ ID NO：75)，其中所述固体支持物包括珠。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附着，其中所述组合物对聚集物的结合优于对单体。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约90nmol净电荷、每平方米至少约120nmol净电荷、每平方米至少约500nmol净电荷、每平方米至少约1000nmol净电荷、每平方米至少约2000nmol净电荷、每平方米至少约3000nmol净电荷、每平方米至少约4000nmol净电荷、或每平方米至少约5000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，其中所述组合物对聚集物的结合优于对单体。
另一方面包括含上述组合物的试剂盒。在某些实施方式中，所述试剂盒还包括使用该试剂盒检测聚集物的说明。
另一方面包括的试剂盒含有：固体支持物；聚集物特异性结合试剂，其中所述聚集物特异性结合试剂包括选自下组的氨基酸序列：YGRKKRRQRRR、KFYLYAIDTHRM(SEQ ID NO：6)、KIIKWGIFWMQG(SEQ ID NO：7)、NFFKKFRFTFTM(SEQ ID NO：8)、MKFMKMHNKKRY(SEQ ID NO：67)、LTAVKKVKAPTR(SEQ ID NO：68)、LIPIRKKYFFKL(SEQ ID NO：69)、KLSLIWLHTHWH(SEQ ID NO：70)、IRYVTHQYILWP(SEQ ID NO：71)、YNKIGVVRLFSE(SEQ ID NO：72)、YRHRWEVMLWWP(SEQ ID NO：73)、WAVKLFTFFMFH(SEQ ID NO：74)、YQSWWFFYFKLA(SEQ ID NO：75)、WWYKLVATHLYG(SEQ ID NO：76)、QTLSLHFQTRPP(SEQ ID NO：77)、TRLAMQYVGYFW(SEQ ID NO：78)、RYWYRHWSQHDN(SEQ ID NO：79)、AQYIMFKVFYLS(SEQ ID NO：80)、TGIRIYSWKMWL(SEQ ID NO：81)、SRYLMYVNIIYI(SEQ ID NO：82)、RYWMNAFYSPMW(SEQ ID NO：83)、NFYTYKLAYMQM(SEQ ID NO：84)、MGYSSGYWSRQV(SEQ ID NO：85)、YFYMKLLWTKER(SEQ ID NO：86)、RIMYLYHRLQHT(SEQ ID NO：87)、RWRHSSFYPIWF(SEQ ID NO：88)、QVRIFTNVEFKH(SEQ ID NO：89)和RYLHWYAVAVKV(SEQ ID NO：90)，其中所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且所述聚集物特异性结合试剂附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体；以及使用所述试剂盒检测聚集物的说明。
另一方面包括的试剂盒含有：固体支持物；聚集物特异性结合试剂，其中所述聚集物特异性结合试剂包括
Figure BPA00001563392200201
，其中所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且其中所述聚集物特异性结合试剂在附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体；以及使用所述试剂盒检测聚集物的说明。
在所述组合物或试剂盒的某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附着，其中所述组合物对聚集物的结合优于对单体。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约90nmol净电荷、每平方米至少约120nmol净电荷、每平方米至少约500nmol净电荷、每平方米至少约1000nmol净电荷、每平方米至少约2000nmol净电荷、每平方米至少约3000nmol净电荷、每平方米至少约4000nmol净电荷、或每平方米至少约5000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，其中所述组合物对聚集物的结合优于对单体。
一个优选的方面提供检测样品中含Aβ的聚集物存在的方法，包括步骤：将怀疑含包括Aβ的聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成第一复合物；去除未结合样品；从所述第一复合物中脱离所述聚集物从而提供脱离的聚集物；将所述脱离的聚集物与偶联于固体支持物的第一抗Aβ抗体在允许结合形成第二复合物的条件下接触；通过使用可检测带标记第二抗Aβ抗体检测所述第二复合物的形成，测得所述样品中聚集物的存在(如果有)；其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且在附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自下组的类肽：
Figure BPA00001563392200211
其中R和R’是任何基团。
在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自下组的肽：KKKFKF(SEQ ID NO：1)、KKKWKW(SEQ ID NO：2)、KKKLKL(SEQ ID NO：3)、FKFKKK(SEQ ID NO：36)、FFFKFKKK(SEQ ID NO：49)、FFFFFKFKKK(SEQ ID NO：50)、FFFKKK(SEQ ID NO：51)、FFFFKK(SEQ ID NO：52)、KKFKKF(SEQ ID NO：42)、KFKKKF(SEQ ID NO：43)、kkkfkf(SEQ ID NO：37)、KIGVVR(SEQ ID NO：44)、MKFMKMHNKKRY(SEQ ID NO：67)、LIPIRKKYFFKL(SEQ ID NO：69)、RGRERFEMFR(SEQ ID NO：47)以及SEQID NO 53、55、56和58-66。
附图简要说明
图1显示所测试的潜在聚集物特异性结合试剂。各聚集物特异性结合试剂的序列/名称与各分子假定净电荷(根据pH 7时的官能团pKa)一起表示。“R”基团的结构可见图2。
图2显示展示马来酰亚胺的珠通过迈克尔加成反应与硫化肽结合的反应。
图3显示错折叠蛋白测定(MPA)的步骤。
图4显示具有不同电荷、支架和疏水性的聚集物特异性结合试剂捕获寡聚体的能力测试结果。A部分显示完全负、完全正和中性肽以及含疏水或脂肪族残基的肽，以及类肽和树突。B部分显示具有多种电荷和疏水性的组合的肽以及类肽。y轴表示来自β淀粉样蛋白ELISA的相对光单位。
图5证明寡聚体捕获随着配体密度非线性增加。A部分显示将3微升珠加入各样品时的上样密度与捕获效率，B部分显示将15微升珠加入各样品时的上样密度与捕获效率。
图6显示2种带正电肽KKKKKK和KKKKKKKKKKKK在寡聚体捕获试验中的比较。
图7显示E22G球聚体结构的分析。A部分显示E22G和野生型球聚体的SDS-PAGE分析。B部分显示所述2种球聚体的尺寸排阻色谱。
图8显示测试PSR1和谷胱甘肽阴性对照捕获E22G和野生型球聚体的结合试验。
图9显示E22K球聚体的SDS-PAGE分析。A部分显示无交联的E22K和野生型球聚体的分析。B部分显示交联的球聚体分析。
图10显示测试PSR1和谷胱甘肽阴性对照捕获E22K、E22G和野生型球聚体的结合试验。
图11显示测试额外类肽聚集物特异性结合试剂捕获寡聚体的能力。
图12显示各种类肽聚集物特异性结合试剂的球聚体捕获。
图13显示直接偶联于珠的PSR1(A部分)和结合链霉亲和素包被珠的生物素-PSR1(B部分)的球聚体捕获。
图14显示生物素化衍生物与链霉亲和素衍生磁珠的结合反应。
图15A显示第1批，本研究制备的对照类肽(PSR1类似物，带负电PSR1，全正电对照)。图15B显示第1批，制备用于检测电荷以及电荷模式要求的类肽。
图16显示第1批类肽捕获的朊病毒聚集物。数据一式三份显示。
图17显示第2批类肽捕获的朊病毒聚集物。数据一式三份显示。
图18A显示由图15所示类肽捕获来自阿尔茨海默病脑匀浆(ADBH)的Aβ(1-42)聚集物。图18B显示由图15所示带正电类肽捕获来自ADBH的Aβ(1-42)聚集物。
图19显示PSR1和从ADBH捕获Aβ聚集物的全正电物质的检测分析极限。
图20显示PSR1珠、谷胱甘肽对照珠、7+和7-类肽珠捕获的总Tau信号。
图21显示MPA信号的倍数变化不随着PSR1包被浓度线性变化。
图22A显示由图15所示类肽从ADBH捕获Aβ(1-40)聚集物。图18B显示由图15所示带正电类肽从ADBH捕获Aβ(1-40)聚集物。
图23显示肽聚集物特异性结合试剂KKKFKF和KKKLKL以及类肽聚集物特异性结合试剂PSR1的电荷密度实验。所示PSR1结果是偶联于珠的PSR1和偶联于纤维素的PSR1。
图24显示错折叠蛋白测定(MPA)区分来自对照和病患者的脑匀浆的能力。A部分显示5个正常(N)和11个vCJD患者样品中的朊病毒聚集物捕获。ANOVA显示这16个样品不来自单个群体。B部分显示4个正常(N)和10个AD患者样品中的Tau和Aβ1-42聚集物捕获。ANOVA显示这14个样品不来自单个群体。2幅图的y轴都是靶标记物ELISA试验中检测的相对光单位。
图25显示着眼于电荷对寡聚体捕获影响的研究结果。将0或1ng/mL Aβ42寡聚体加入CSF并用携带潜在六肽聚集物特异性结合试剂的珠捕获。黑柱显示寡聚体捕获，条纹和白柱显示来自CSF的单体Aβ40和42的背景捕获。x轴显示六肽序列(PSR1，SEQ ID NO：15，显示用于参比)。y轴显示Aβ免疫测定的相对光单位。
图26显示图25中六肽试剂的电荷与寡聚体捕获信号比较。根据单独官能团的pKa相对所述测定缓冲液pH来计算电荷。
图27显示具有不同取向和单体手性的潜在聚集物特异性结合试剂。
图28显示图27所示试剂的取向和手性研究结果。Aβ42寡聚体加入CSF并用携带图27中潜在聚集物特异性结合试剂的珠捕获。黑柱显示寡聚体捕获，条纹和白柱显示来自CSF的单体Aβ40和42的背景捕获。x轴显示试剂序列。y轴显示Aβ免疫测定的相对光单位。
图29显示着眼于疏水性残基对寡聚体捕获影响的研究结果。Aβ42寡聚体加入CSF并用携带潜在六肽聚集物特异性结合试剂的珠捕获。浅色柱显示寡聚体捕获，深色柱显示来自CSF的单体Aβ42的背景捕获。x轴显示六肽序列。y轴显示Aβ免疫测定的相对光单位。
图30A-C显示着眼于芳族残基对寡聚体捕获影响的研究结果。Aβ42寡聚体加入CSF并用携带潜在六肽聚集物特异性结合试剂的珠捕获。图30A显示XKXKKK形式的肽，其中X是x轴上所示残基(显示PSR1用于参比)。y轴显示Aβ免疫测定的相对光单位。黑柱显示寡聚体捕获，白柱显示来自CSF的单体Aβ42的背景捕获。图30B显示KKKXKX形式的肽，其中X是x轴上所示残基(显示PSR1用于参比)。y轴显示Aβ免疫测定的相对光单位。横条纹柱显示寡聚体捕获，黑、白和斑点柱显示来自CSF的单体Aβ42和40的背景捕获。图30C显示XKXKKK形式的肽，其中X是x轴上所示残基。y轴显示Aβ免疫测定的相对光单位。浅色柱显示寡聚体捕获，深色柱显示来自CSF的单体Aβ42的背景捕获。
图31显示着眼于不同类型芳族残基对寡聚体捕获影响的研究结果。Aβ42寡聚体加入CSF并用携带含噻吩环、带电芳族的潜在聚集物特异性结合试剂和PSR1的珠捕获。横条纹柱显示寡聚体捕获，黑、白和斑点柱显示来自CSF的单体Aβ42和40的背景捕获。x轴显示结合试剂。y轴显示Aβ免疫测定的相对光单位。
图32显示着眼于带电残基性质对寡聚体捕获影响的研究结果。Aβ42寡聚体加入CSF并用携带含二氨基丁酸(fdb)、鸟氨酸(Orn，侧链纳入所述肽主链)的潜在聚集物特异性结合试剂和PSR1的珠捕获，所述试剂具有。第1柱显示寡聚体捕获，第2-4柱显示来自CSF的单体Aβ42和40的背景捕获。x轴显示所述试剂。y轴显示Aβ免疫测定的相对光单位。
图33A-C显示其它带正电聚集物特异性结合试剂的测试结果。Aβ42寡聚体加入CSF并用携带潜在聚集物特异性结合试剂的珠捕获。对于图33A和33B，通过斜条纹柱显示寡聚体捕获，实心柱显示来自CSF的单体Aβ42的背景捕获。x轴显示所述试剂。y轴显示Aβ免疫测定的相对光单位。对于图33C，测试将0.5ng/mL寡聚体(第1柱)、0.05ng/mL寡聚体(第2柱)和0ng/mL寡聚体(第3柱)加入CSF的捕获。x轴显示所述试剂(编码和结构参见表13和14)。y轴显示Aβ免疫测定的相对光单位。
图34显示2种相同肽阵列(各为～1120个12聚体肽)，用3ng/mL单体或寡聚Aβ1-42孵育以鉴定能优先结合寡聚Aβ1-42的肽。用识别所述肽N末端的抗Aβ抗体(6E10)通过蛋白质印迹检测结合的Aβ1-42。检测到显著量的肽结合寡聚体，但不结合单体。仅很少肽(画圈)同时识别单体和寡聚Aβ，而没有强选择性。Aβ肽捕获相关的信号用柯达(Kodak)图片站软件定量，所述肽按净强度从最高到最低排列。顶部5-10％的肽被认为是顶级结合剂。
图35显示通过在NMPA中的1％TW20或1％ZW 3-14清洗减少NMPA背景。ASR1与不同基质(TBSTT和CSF)孵育。孵育后，在有或没有1％TW20或1％ZW 3-14情况下清洗所述下拉珠。x轴显示NMPA中的下拉基质和下拉式清洗后采用的去污剂。y轴显示Aβ免疫测定的相对光单位。
图36显示用去污剂清洗的NMPA背景减少和灵敏度改善。Aβ42寡聚体加入TBSTT或CSF并用ASR1孵育。孵育后用含或不含1％去污剂的洗液清洗下拉珠。上和下图的x轴显示加标的寡聚体水平。上图的y轴显示Aβ免疫测定的相对光单位。下图的y轴显示Aβ免疫测定中Aβ42的S/N比。
图37显示去污剂结构和名称。
图38显示多种Aβ42聚集物的天然凝胶分析。
图39显示由PSR1和Ac-FKFKKK捕获AD CSF中的Aβ40聚集物。
图40描述通过错折叠蛋白测定检测阿尔茨海默病CSF和正常CSF以16,000g离心10分钟或134,000g离心1小时的上清液和沉淀中的Aβ40寡聚体含量。图例：小方格：Aβ40总量；大方格：16,000g上清液；水平线：16,000g沉淀；垂直线：134,000g上清液，对角线：134,000g沉淀。
图41显示脾中淀粉样变性病的组织学评价。所示为刚果红染料染色的不同程度脾淀粉样沉积的典型示例。淀粉样在偏振光下研究时显示绿色双折射。1+，在小囊处有很薄的灶沉积(A)，2+，在脾的限定区域中更显著的毛囊周淀粉样沉积(B和C)，3+，在大部分或所有小囊周围有适度淀粉样沉积(D)，4+，位于小囊周围的广泛淀粉样沉积但通常形成连续浸润(E和F)。(x25)
图42证明PSR1包衣珠能捕获AA相关部分。(A-C)PSR1耗尽输入(A)、洗脱物(B)和珠(C)部分上用单克隆抗小鼠SAA抗体的免疫印迹。此错折叠蛋白测定(MPA)用3或9uL PSR1包衣珠进行，采用来自患脾AA小鼠(AA)和对照未处理小鼠(Ctrl)的1、4或8uL 10％w/v脾匀浆作为输入。(D)通过夹心ELISA检测SAA相关物质。检测限下的值表示为0ug/mL。
图43显示AA MPA测定的优化。所示为对输入、PSR1耗尽的输入珠和洗脱部分使用多克隆抗小鼠SAA/AA抗体(“AA138”)的免疫印迹。用6uLPSR1包衣珠和10％w/v脾匀浆进行MPA，所述匀浆对应于来自患脾AA小鼠(AA+)，用单次AgNO3注射攻击的对照小鼠(AgNO3引发)和对照未处理小鼠(未处理)的50ug总蛋白作为输入。肌动蛋白用作上样对照。
图44证明AA聚集物变性会阻止AA相关部分的检测。显示通过夹心ELISA对洗脱部分检测SAA相关物质。通过以下过程完成变性(denat-AA)：将来自患脾AA小鼠的9uL 10％w/v脾匀浆与13.5uL变性缓冲液混合并室温或37℃以750rpm孵育10或30分钟，然后用5.4uL中和缓冲液中和。缓冲对照(buff-AA)如下制备：将来自患脾AA小鼠的9uL 10％w/v脾匀浆与13.5uL变性缓冲液和5.4uL中和缓冲液混合。用上述4种变性样品以及缓冲AA样品、未变性的含AA样品(undenat-AA)、来自对照AgNO3-处理小鼠的未变性脾匀浆(undenat-AgNO3)和来自对照未处理小鼠的未变性脾匀浆(undenat-BL6)进行MPA。
图45显示PSR1珠在缓冲液(A)和血浆(B)中对体外合成糊精原纤维的结合都优于对糊精单体。
图46描述来自II型糖尿病患者胰腺组织的糊精聚集物不能通过ELISA检测(天然)，除非它们用变性剂处理(变性)。来自正常非患病者的胰腺组织中仅发现较低水平的糊精。图例：圆圈：正常，天然；正方形：II型糖尿病，天然；三角形；正常，变性；倒三角：II型糖尿病，变性。
图47证明PSR1对糊精原纤维的检测优于来自胰腺组织的单体。图例：圆圈：正常，天然；正方形：II型糖尿病，天然；三角形；正常，变性；倒三角：II型糖尿病，变性。
图48证明II型糖尿病胰腺组织中的糊精原纤维在血浆中结合PSR-1，但不结合谷胱甘肽或5L(PSR1的负形式)对照珠。图例：圆圈：5L珠；正方形：谷胱甘肽珠；三角形：PSR1珠。
图49显示α-突触核蛋白(aSyn)原纤维未通过ELISA测得。图例：实心圆，变性原纤维；空心圆，天然。
图50显示PSR1珠能捕获加入CSF或血浆的α-突触核蛋白原纤维而对照珠不能。图例：实心正方形：CSF中的PSR1-aSyn原纤维；空心正方形：CSF中的CTRL-aSyn原纤维；实心三角形：血浆中的PSR1-aSyn原纤维；空心倒三角形：血浆中的aSyn原纤维。
图51显示PSR1在CSF和血浆中对α-突触核蛋白原纤维的结合优于对单体。图例：实心正方形：CSF中的aSyn原纤维；空心正方形：CSF中的变性aSyn；实心三角形：血浆中的天然aSyn原纤维；空心三角形：血浆中的变性aSyn。
图52描述不同条件下从PSR1珠洗脱的α-突触核蛋白量。图例：浅色柱：GdnSCN；深色柱：NaOH。
图53描述Tg(SHaPrP)小鼠的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活图。(A)Tg(SHaPrP)小鼠用效价范围为10-2-10-12的连续10倍稀释的10％(重量/体积)263K仓鼠脑匀浆接种以评估朊病毒。(B)用i.c.接种含PSR1珠的Tg(SHaPrP)小鼠的生物测定，所述珠已与来自263K朊病毒症状性仓鼠的合并感染性朊病毒血浆一起孵育。在263K朊病毒接种后指定天数将仓鼠放血并处死。如图所示，小鼠用PBS或TBSTT中的5.25或10.5μl珠接种。
图54描述来自Tg(SHaPrP)小鼠的脑切片的病理学。小鼠接种有263K朊病毒感染的仓鼠脑匀浆(B)，接种有PSR1珠，所述珠用来自收集池2(117-118dpi)(C)和收集池1(143-154dpi)的血浆孵育。(D)显示由苏木精和曙红染色所示的液泡，由PrP抗体SAF84显现PrPSc沉积，由针对GFAP的抗体证实星形细胞性胶质增生。非接种小鼠(A)未显示空泡形成、PrPSc沉积或胶质增生迹象。采用组织印迹分析显示蛋白酶K消化后的PrPSc沉积并用POM1染色。
图55描述蛋白酶K消化来自Tg(SHaPrP)小鼠脑匀浆的蛋白质印迹分析。(A-C)在皮内(i.c.)接种PSR1珠的Tg(SHaPrP)中存在蛋白酶K抗性物质，所述珠用来自收集池1(143-154dpi；小鼠#1-9)和收集池2(117-118dpi；小鼠#1-3)的血浆孵育。对照样品：“非(no)”标记为来自健康小鼠的脑匀浆；“263”为来自接种有263朊病毒小鼠的脑匀浆。分子量标准以千道尔顿表示。小鼠#1用PBS中的10.5μl珠接种，小鼠2-4用PBS中的5.25μl珠，小鼠#5和6用TBSTT中的10.5μl珠，小鼠#7和8用TBSTT中的5.25μl珠，小鼠1-3(117-118dpi)用TBSTT中的10.5μl珠。
表格简要说明
表1列出示例性构象病和相关构象蛋白质。
表2列出制备ASB试剂的示例性肽序列。
表3列出适于制备ASB试剂的示例性类肽区。
表4提供表3所用缩写。
表5提供表3所列类肽序列的相关结构。
表6提供实施例3所测试类肽的特征信息。
表7显示链霉亲和素磁珠捕获的总朊病毒信号，所述珠偶联有递增密度的PSR1(+++A+A)。
序列表的简要说明
SEQ ID NO：1-8提供用于制备ASB试剂的示例性肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9-29提供用于制备ASB试剂的示例性类肽的带修饰氨基酸序列。
发明详述
本发明涉及发现以某些电荷密度附于固体支持物时对聚集物的结合优于对单体的试剂。这些聚集物可与构象病如阿尔茨海默病、糖尿病、系统性淀粉样变性等相关。
对聚集物的结合优于对单体的试剂的发现允许利用这些试剂开发用于构象病或其它用途的检测试验、诊断试验和纯化或分离方法。
不希望受到任何理论约束，据信这些ASB试剂优先结合和检测聚集物的能力是由于该聚集物内单体单元的重复性质。
许多聚集物共有类似的物理性质。例如，朊病毒的聚集物PrPSc表现出下列特征：β-片层含量增加(PrPC中的～3％增至PrPSc中的＞40％)和PrPSc纤维由沿纤维轴垂直取向的β-片层组成。Aβ肽聚集物共有类似的β-片层结构(Luhrs等，2005，PNAS 102：17342)。申请者认为与这些重复蛋白表面的结合是本发明聚集物特异性试剂附于固体支持物时对聚集物的结合优于对单体的机制。
本发明的ASB试剂具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。不想受到任何具体理论的约束，申请者认为所述ASB试剂的正电荷使它们通过该ASB试剂的正电荷和聚集物上负电荷间的离子相互作用来结合所述聚集物。这些负电荷可由所述聚集物中错折叠构象异构体的已暴露带负电残基或由所述聚集物含有的盐、脂质或其它物质上的负电荷来提供。尽管离子相互作用是关键，所述聚集物的结构和大小也在结合中起作用，因为ASB试剂能优先结合具有暴露正电荷的聚集物。
此外，随着固体支持物上的ASB试剂电荷密度增加，ASB试剂显示对聚集物相较单体的优先增加。不想受到任何具体理论的约束，申请者认为电荷密度增加能使所述ASB试剂以更高亲合力结合含有序结构的聚集物，所述结构具有重复模式的暴露负电荷。
这些ASB试剂不必是较大结构或其它类型支架分子的一部分以显示对聚集物的优先结合。本领域普通技术人员显然了解，示例性ASB试剂提供本发明可用ASB试剂的出发点(例如，就大小或序列特征而言)，可进行许多改良以产生具有更多所需特性(例如，更高亲和性、更大稳定性、更大溶解度、更少蛋白酶敏感性、更高特异性、更易合成等)的ASB试剂。
一般，本文所述ASB试剂在以某些电荷密度附于固体支持物时对聚集物的结合能优于对单体。因此，这些试剂可容易检测几乎任何生物或非生物样品中的聚集物存在，包括活或死亡脑、脊髓、脑脊液、或其它神经系统组织以及血液和脾。因此，所述ASB试剂用于广泛的分离、纯化、检测、诊断和治疗应用。
除非另有说明，本发明的实施采用本领域技术范围内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法。这些技术在文献中充分阐明。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)，第18版(宾夕法尼亚州伊斯顿：麦克出版公司(Mack Publishing Company)，1990)；Methods In Enzymology(《酶学方法》，S.Colowick和N.Kaplan编，学术出版社公司(Academic Press，Inc.))；Handbook of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986，布莱克威尔科学出版公司(Blackwell Scientific Publications))；Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》，第2版，1989)；Handbook of Surface and Colloidal Chemistry(《表面和胶体化学手册》，Birdi，K.S.编，CRC出版社(CRC Press)，1997)；Short Protocols in MolecularBiology(《精编分子生物学实验指南》)，第4版(Ausubel等编，1999，约翰威利出版社(John Wiley&Sons))；Molecular Biology Techniques：An IntensiveLaboratory Course(《分子生物学技术：详细实验课程》，Ream等编，1998，学术出版社)；PCR(Introduction to Biotechniques Series)(《PCR(生物技术入门丛书)》)，第2版(Newton和Graham编，1997，施普林格出版社(SpringerVerlag))；Peters和Dalrymple，Fields Virology(《病毒学领域》第2版)，Fields等(编)，B.N.雷文出版社(Raven Press)，纽约州纽约。
应理解本发明的试剂和方法不限于具体制剂或过程参数，因为其当然可以变化。也要理解本文所用术语仅用于描述本发明具体实施方式的目的，而不用于限制。
I.定义
为了促进理解本发明，下面讨论本申请所用的选定术语。
由于蛋白质错折叠，蛋白质可以大于1种的构象存在。本文所用的术语“构象异构体”指具有某一构象的蛋白单体。例如，体内大部分蛋白以正确折叠的构象异构体存在。本公开涉及构象异构体所用的术语“天然”或“细胞性”指正确折叠的蛋白构象异构体。蛋白还可以错折叠的构象异构体存在。在许多情况中，这些错折叠的构象异构体是致病性的。本文所用的术语“致病性”可指所述蛋白或构象异构体确实引起疾病或可简单指所述蛋白或构象异构体与疾病相关并因此在疾病发生时存在。表1右栏中列出存在致病性构象异构体的蛋白示例。因此，与本公开相关使用的致病性蛋白或构象异构体不必是作为特定疾病诱因的蛋白并因而可以是或不是感染性的。用于构象异构体的术语“非致病性”指其存在不与疾病相关的蛋白天然构象异构体。与具体疾病例如阿尔茨海默病相关的致病性构象异构体可描述为“致病性阿尔茨海默病构象异构体”。
在一些情况中，蛋白的非天然构象异构体不与疾病相关联。例如，酵母朊病毒如Sup35p可作为非天然构象异构体存在于酵母细胞中，但对所述酵母细胞的活力或生存力没有影响。形成不与疾病相关的非天然构象异构体的其它蛋白示例是curlin(大肠杆菌(E.coli))，chaplins(天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor))，朊病毒Het-s(柄孢霉(Podospora anserina))，疟疾外壳蛋白，一些蜘蛛中的蜘蛛丝，黑素细胞蛋白Pmel 17，组织型纤溶酶原激活剂(tPA)，和激素如ACTH、β内啡肽、促乳素和生长激素。
与上述非天然构象异构体相反，一些蛋白可在体内不以非天然构象异构体存在，但仍能在体外形成非天然构象异构体。这类能形成非天然构象异构体的一些蛋白示例是肌红蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶的p85α亚基的SH3结构域、酰基磷酸酶和HypF-N(大肠杆菌)。
本文所用的术语“聚集物”指含有大于1个拷贝的蛋白非天然构象异构体的复合物，其由所述构象异构体间的非天然相互作用产生。聚集物可包含同一蛋白的多个拷贝、超过1种蛋白的多个拷贝和额外的组分，所述组分包括但不限于糖蛋白、脂蛋白、脂质、聚糖、核酸和盐。聚集物可存在于如内含体、斑块或聚集体的结构中。一些聚集物示例是无定形聚集物、寡聚体和原纤维。无定形聚集物通常是无序且不溶的。本文所用的“寡聚体”包含大于1个拷贝的蛋白非天然构象异构体。通常，它们含有至少2个单体，但不超过1000个单体，或在一些情况中，不超过106个单体。寡聚体包括小胶束聚集物和初纤维。小胶束聚集物通常是可溶、有序和球形结构。初纤维通常也是可溶、有序的聚集物，具有β-片层结构。初纤维一般是曲线结构且含有至少10个单体，或在一些情况中，至少20个单体。原纤维通常是不溶且高度有序的聚集物。原纤维通常包含成百上千个单体。原纤维包括例如淀粉样，其表现出交叉-β片层结构且可通过刚果红染色时的苹果绿双折射和偏振光下观察来鉴定。聚集物如无定形聚集物、寡聚体和原纤维包含在一个样品中时，可通过离心分离。例如，14,000xg离心10分钟通常仅去除很大的聚集物，如较大原纤维和无定形聚集物(10-1000MDa)，100,000xg离心1小时通常去除大于1MDa的聚集物，如较小原纤维和无定形聚集物。聚集物的大小和溶解度会影响分离所需沉降速度。
本发明的聚集物可包含上述任何蛋白，所述蛋白以或能以非天然构象异构体存在。在许多情况中，所述聚集物与疾病相关。这类疾病和其相关构象蛋白的示例列于表1。在其它情况中，聚集物与用于药物或其它工业用途的蛋白高产量相关。例如，蛋白如重组胰岛素或治疗性抗体在以高水平生产时往往会聚集。还发现聚集物可采用分泌颗粒中的天然贮存形式(Science，2009，325：328)。
术语“聚集物特异性结合试剂”或“ASB试剂”指任何类型的试剂，包括但不限于肽和类肽，其以某些电荷密度附于固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。所述结合可能是由于亲和性、亲合力或特异性增加。例如，在某些实施方式中，本文所述聚集物特异性结合试剂优先结合聚集物，然而也能以较弱但仍可检测的水平结合单体。通常，弱结合或背景结合易与优选和感兴趣聚集物相互作用区分，例如通过使用合适对照。一般，本发明方法所用的聚集物特异性结合试剂在存在过量单体时结合聚集物。优选地，ASB试剂结合聚集物的亲和性/亲合力比单体的结合亲和性/亲合力高至少约2倍。
“PSR1”是ASB试剂的一个示例。PSR1包含SEQ ID NO：15的序列。SEQID NO：15的结构示于表5。
如果聚集物特异性结合试剂特异性、非特异性或以一些特异性和非特异性的组合结合，认为所述聚集物特异性结合试剂与另一肽或蛋白“结合”。如果试剂结合聚集物的亲和性、亲合力大于单体和/或特异性高于单体，认为所述试剂“优先结合”聚集物。术语“优先地结合”、“优先结合”、“选择地结合”、“选择性结合”和“选择性捕获”在本文中互换使用。
“构象蛋白”指蛋白的天然和错折叠构象异构体。
许多构象蛋白是构象病蛋白。“构象病蛋白”指与构象病相关的天然和致病性蛋白错折叠构象异构体，其中所述蛋白的结构改变(例如错折叠)从而导致形成聚集物如不需要的可溶性寡聚体或淀粉样原纤维。构象病蛋白的示例包括但不限于阿尔茨海默病蛋白如Aβ和tau；朊病毒蛋白如PrPSc和PrPC，帕金森病蛋白如α-突触核蛋白，淀粉样变性病蛋白如淀粉样A蛋白，糖尿病蛋白糊精。下文显示具有相关蛋白的疾病非限制性列表，所述蛋白有2个或更多不同构象。
表1
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本文所用的“构象病蛋白”不限于具有本文所述恰当序列的多肽。显然该术语涵盖任何已鉴定或未鉴定种类或疾病(例如阿尔茨海默病、帕金森病等)的构象病蛋白。
“构象蛋白特异性结合试剂”或“CPSB试剂”指与特定蛋白的超过1种构象异构体相互作用的任何试剂类型。优选地，构象蛋白特异性结合试剂与构象蛋白的天然和错折叠构象异构体都结合。在一些情况中，所述构象蛋白特异性结合试剂可结合蛋白单体和聚集物。在某些情况中，CPSB试剂识别聚集物结构而无论蛋白序列如何。一个这种CPSB试剂的示例是A11抗体，其识别Aβ聚集物、PrP、和α-突触核蛋白(Kayed等，2003，Science 300：486)。在其它情况中，所述CPSB试剂仅识别Aβ聚集物。然而，在许多情况中，所述CPSB试剂仅结合蛋白单体。在本发明采用CPSB试剂作为捕获剂的方法中，所述CPSB必须结合聚集物。在本发明采用CPSB试剂检测聚集物的方法中，不要求所述CPSB结合聚集物。如果其不结合聚集物，需要使聚集物变性以进行检测。通常，CPSB试剂是单克隆或多克隆抗体。
术语“朊病毒”、“朊病毒蛋白”、“PrP蛋白”和“PrP”在本文中互换使用，指聚集物(不同地称为痒病蛋白、致病性蛋白形式、致病性同种型、致病性朊病毒和PrPSc)和非聚集物(不同地称为细胞蛋白形式、细胞同种型、非致病性同种型、非致病性朊病毒蛋白和PrPC)以及可能没有致病性构象和正常细胞构象的朊病毒蛋白的变性形式和各种重组形式。所述聚集物与人和动物中的疾病状态(海绵状脑病)相关。所述非聚集物在动物细胞中正常存在且在合适条件下可转变成致病性PrPSc构象。朊病毒在多种哺乳动物中天然产生，包括人、绵羊、牛和小鼠。
术语“阿尔茨海默病(AD)蛋白”或“AD蛋白”在本文中互换使用，指聚集物(不同地称为致病性蛋白形式、致病性同种型、致病性阿尔茨海默病蛋白、阿尔茨海默病构象异构体)和非聚集物(不同地称为正常细胞形式、非致病性同种型、非致病性阿尔茨海默病蛋白)以及可能没有致病性构象或正常细胞构象的阿尔茨海默病蛋白的变性形式和各种重组形式。示例性阿尔茨海默病蛋白包括Aβ和tau蛋白。
本文所用的术语“淀粉样-β”、“β淀粉样蛋白”、“Abeta”、“Aβ”、“Aβ42”、“Aβ40”、“Aβx-42”、“Aβx-40”和“Aβ40/42”指β淀粉样肽，其是在淀粉样前体蛋白(APP)切割后胞外发现的至多长43个氨基酸的家族。术语Aβ一般用于指任何形式的β淀粉样肽。术语“Aβ40”指“Aβx-40”。术语“Aβ42”指“Aβx-42”。术语“Aβ1-42”指对应于APP的氨基酸1-42的片段。术语“Aβ1-40”指对应于APP的氨基酸1-40的片段。术语Aβ40/42用于指Aβ40和Aβ42同种型。″球聚体″指由Aβ42形成的可溶性寡聚体(Barghorn等，Journal of Neurochemistry，2005)。
本文所用的术语″糖尿病蛋白″指聚集物(不同地称为致病性蛋白形式、致病性同种型、致病性糖尿病蛋白)和非聚集物(不同地称为正常细胞形式、非致病性同种型、非致病性糖尿病蛋白)以及可能没有致病性构象或正常细胞构象的糖尿病蛋白的变性形式和各种重组形式。示例性II型糖尿病蛋白是糊精，其也称为胰岛淀粉样多肽(IAPP)。
当“分离的”指多核苷酸或多肽时，表示指定分子与天然存在所述分子的整个生物体分开、离散，或当所述多核苷酸或多肽非天然存在时，充分不含其它生物大分子从而该多核苷酸或多肽可用于其预期目的。
“类肽”一般用于指含至少1个、优选2个或更多氨基酸取代的肽模拟物，优选N取代的甘氨酸。类肽描述于美国专利号5,811,387。本文所用的“类肽试剂”是具有氨基末端区、羧基末端区和至少一个在所述氨基末端区与所述羧基末端区之间的“类肽区”的分子。所述氨基末端区指试剂的氨基末端侧，其通常不含有任何N取代甘氨酸。所述氨基末端区可以是H、烷基、取代的烷基、酰基、氨基保护基团、氨基酸、肽等。所述羧基末端区指类肽的羧基末端区域，其不含有任何N取代甘氨酸。所述羧基末端区可包括H、烷基、烷氧基、氨基、烷氨基、二烷氨基、羧基保护基团、氨基酸、肽等。
“类肽区”所指区域起始于并包括最接近氨基末端的N取代甘氨酸，结束于并包括最接近羧基末端的N取代甘氨酸。所述类肽区一般指其中至少3个氨基酸由N取代甘氨酸替换的试剂部分。
“生理pH”指约5.5-约8.5；或约6.0-约8.0；或通常约6.5-约7.5的pH。
“脂肪族”指直链或支链烃部分。脂肪族基团可包括杂原子和羰基部分。
“氨基酸”指20个天然存在和遗传编码的α-氨基酸或其受保护衍生物中任一种，以及非天然或非α-氨基酸。氨基酸的受保护衍生物可在氨基部分、羧基部分或侧链部分上含有1个或多个保护基团。氨基保护基团的示例包括甲酰基、三苯甲基、苯二甲酰亚氨基、三氯乙酰基、氯乙酰基、溴乙酰基、碘乙酰基，和尿烷型保护基如苄氧羰、4-苯基苄氧羰基、2-甲基苄氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基、4-氟苄氧羰基、4-氯苄氧羰基、3-氯苄氧羰基、2-氯苄氧羰基、2，4-二氯苄氧羰基、4-溴苄氧羰基、3-溴苄氧羰基、4-硝基苄氧羰基、4-氰基苄氧羰基、叔丁氧基羰基、2-(4-联苯基)-异丙氧羰基、1，1-二苯乙-1-氧羰基、1，1-二苯丙-1-氧羰基、2-苯丙-2-氧羰基、2-(p-甲苯酰基)-丙-2-氧羰基、环戊氧基-羰基、1-甲基环戊氧基羰基、环己氧基羰基、1-甲基环己氧基羰基、2-甲基环己氧基羰基、2-(4-甲苯酰基磺酰基)-乙氧羰基、2-(甲磺酰基)乙氧羰基、2-(三苯基膦)-乙氧羰基、芴甲氧羰基(“FMOC”)、2-(三甲硅烷基)乙氧羰基、烯丙氧基羰基、1-(三甲硅烷基甲基)丙-1-烯氧羰基、5-苯草酰甲氧羰基(benzisoxalylmethoxycarbonyl)、4-乙酰氧基苄氧羰、2，2，2-三氯乙氧羰基、2-乙炔基-2-丙氧羰基、环丙甲氧基羰基、4-(癸氧基)苄氧羰、异冰片氧基羰基、1-哌啶氧基羰基等；苯甲酰甲磺酰基、2-硝基苯硫基、二苯基磷氧等氨基保护基团。羧基保护基团的示例包括甲基、p-硝基苄基、p-甲苄基、p-甲氧苄基、3，4-二甲氧苄基、2，4-二甲氧苄基、2，4，6-三甲氧苄基、2，4，6-三甲苄基、戊甲苄基、3，4-亚甲基二氧苄基、二苯甲基、4，4’-二甲氧二苯甲基、2，2’，4，4’-四甲氧二苯甲基、t-丁基、t-戊基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4，4’-二甲氧基三苯甲基、4，4’，4”-三甲氧基三苯甲基、2-苯丙-2-基、三甲硅烷基、t-叔丁基二甲基硅烷基、苯甲酰甲基、2，2，2-三氯乙基、β-(二(n-丁基)甲基甲硅烷基)乙基、p-甲苯磺酰乙基、4-硝基苄基磺酰乙基、烯丙基、肉桂基、1-(三甲硅烷基甲基)丙-1-烯-3-基等部分。所用保护基团的种类不重要，只要衍生的保护基团可在合适位点选择性去除而不破坏剩余分子。保护基团的更多示例参见E.Haslam，Protecting Groups in Organic Chemistry(《有机化学中的保护基团》，J.G.W.McOmie编，1973)的第2章；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，ProtectiveGroups in Organic Synthesis(《有机合成中的保护基团》，1991)的第7章，所述公开各通过引用全文纳入本文。
“N取代甘氨酸”指具有式-(NR-CH2-CO)-的残基，其中各R是非氢部分。
还包括N取代甘氨酸的盐、酯和保护形式(例如有Fmoc或Boc的N保护等)。
产生包括N取代甘氨酸在内的氨基酸取代物的方法公开于美国专利号5,811,387等，其通过引用全文纳入本文。
“亚基”指能连接其它亚基形成链例如肽的分子。氨基酸和N取代甘氨酸是示例性亚基。某一亚基连接其它亚基时，可称为“残基”。
II.用于本发明方法的试剂
用于本发明的聚集物特异性结合试剂(“ASB试剂”)是以某些电荷密度附于固体支持物时对聚集物的结合优于对单体的试剂。
通常，ASB试剂在样品接触所述ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。优选这些ASB试剂是肽或修饰肽，包括通常称为类肽的那些。
在某些实施方式中，这种ASB试剂是聚阳离子型。更优选，所述ASB试剂在样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+2的净电荷、至少约+3的净电荷、至少约+4的净电荷、至少约+5的净电荷、至少约+6的净电荷、至少约+7的净电荷、至少约+8的净电荷、至少约+9的净电荷、至少约+10的净电荷、至少约+11的净电荷、或至少约+12的净电荷。所述ASB试剂可具有高于约+1的任何净电荷。一般，随着所述ASB试剂的净电荷增加，该试剂对聚集物相较单体的结合偏好增加。
优选地，所述ASB试剂以下列电荷密度附于固体支持物：每平方米至少约60nmol净电荷、每平方米至少约90nmol净电荷、每平方米至少约120nmol净电荷、每平方米至少约500nmol净电荷、每平方米至少约1000nmol净电荷、每平方米至少约2000nmol净电荷、每平方米至少约3000nmol净电荷、每平方米至少约4000nmol净电荷、每平方米至少约5000nmol净电荷、每平方米至少约6000nmol净电荷、每平方米至少约7000nmol净电荷、每平方米至少约8000nmol净电荷、每平方米至少约9000nmol净电荷、每平方米至少约10,000nmol净电荷、每平方米至少约12,000nmol净电荷、每平方米至少约13,000nmol净电荷、每平方米至少约14,000nmol净电荷、每平方米至少约15,000nmol净电荷、每平方米至少约16,000nmol净电荷、每平方米至少约18,000nmol净电荷、每平方米至少约20,000nmol净电荷、每平方米至少约40,000nmol净电荷、每平方米至少约60,000nmol净电荷、每平方米至少约80,000nmol净电荷、每平方米至少约100,000nmol净电荷、每平方米至少约500,000nmol净电荷、每平方米至少约1,000,000nmol净电荷、每平方米至少约2,000,000nmol净电荷、每平方米至少约2,400,000nmol净电荷、每平方米至少约2,800,000nmol净电荷、每平方米至少约3,000,000nmol净电荷、每平方米至少约4,000,000nmol净电荷、每平方米至少约5,000,000nmol净电荷、每平方米至少约5,400,000nmol净电荷、每平方米至少约6,000,000nmol净电荷、每平方米至少约6,600,000nmol净电荷、或每平方米至少约7,000,000nmol净电荷。
在某些实施方式中，所述ASB试剂以下列电荷密度附于固体支持物：每平方米至少约10nmol净电荷、每平方米至少约12nmol净电荷、每平方米至少约20nmol净电荷、每平方米至少约30nmol净电荷、每平方米至少约40nmol净电荷、每平方米至少约50nmol净电荷、每平方米至少约60nmol净电荷、每平方米至少约70nmol净电荷、每平方米至少约80nmol净电荷、每平方米至少约90nmol净电荷、每平方米至少约100nmol净电荷、每平方米至少约110nmol净电荷、每平方米至少约120nmol净电荷、每平方米至少约150nmol净电荷、每平方米至少约200nmol净电荷、每平方米至少约250nmol净电荷、每平方米至少约300nmol净电荷、每平方米至少约350nmol净电荷、每平方米至少约400nmol净电荷、或每平方米至少约450nmol净电荷。申请者认为以此较低范围电荷密度附于固体支持物的ASB试剂可能仅对原纤维的结合优于对单体，而不是对较小聚集物的结合优于对单体。
在优选的实施方式中，所述ASB试剂对聚集物的结合亲和性和/或亲合力比对单体的结合亲和性和/或亲合力至少高约2倍、至少高约2.5倍、至少高约3倍、至少高约3.5倍、至少高约4倍、至少高约4.5倍、至少高约5倍、至少高约5.5倍、至少高约6倍、至少高约6.5倍、至少高约7倍、至少高约7.5倍、至少高约8倍、至少高约8.5倍、至少高约9倍、至少高约9.5倍、至少高约10倍、或至少高约20倍。
在优选的实施方式中，所述ASB试剂含有其pKa比样品接触该ASB试剂的pH高至少1pH单位、至少约2pH单位、至少约3pH单位、或至少约4pH单位的至少一个带正电官能团。样品通常在生理pH下接触所述ASB试剂。然而，在某些实施方式中，所述pH可比生理pH低或高而不对样品有害。在这种实施方式中，所述样品可在pH约1、pH约2、pH约3、pH约4、pH约5、pH约6、pH约7、pH约8、pH约9、或pH约10下接触所述ASB试剂。
在一些实施方式中，所述ASB试剂还包含疏水性官能团。所述疏水性官能团可以是例如芳族或脂肪族疏水性官能团。
在某些实施方式中，所述ASB试剂可包含官能团如胺基、烷基、杂环、环烷、胍、醚、烯丙基和芳族。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自下组的芳族官能团：萘、苯酚、苯胺、苯基、取代的苯基、硝基苯基、卤化苯基、联苯、苯乙烯基、二苯基、苄磺酰胺、氨甲基苯基、噻吩、吲哚、萘基、呋喃和咪唑。在某些实施方式中，所述卤化苯基是氯苯基或氟苯基。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自伯胺、仲胺、叔胺和季胺的胺基官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自异丁基、异丙基、仲丁基、甲基和辛基的烷基官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自四氢呋喃、吡咯烷和哌啶的杂环官能团。在某些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂包括选自环丙基和环己基的环烷官能团。这种芳族官能团包括萘、苯酚和苯胺。在更多实施方式中，所述ASB试剂包括重复基序。在其它实施方式中，所述ASB试剂包括其间隔与所述聚集物带负电基团相同的带正电基团。
A.ASB肽试剂
在优选的实施方式中，ASB试剂是肽。通常，ASB肽试剂在样品接触该ASB试剂的pH下含有至少+1净电荷、至少+2净电荷、至少+3净电荷、至少+4净电荷、至少+5净电荷、至少+6净电荷、至少+7净电荷、至少+8净电荷、至少+9净电荷、至少+10净电荷、至少+11净电荷、或至少+12净电荷。在优选的实施方式中，所述至少一个氨基酸也在生理pH下带正电。在优选的实施方式中，所述至少一个氨基酸是天然氨基酸如赖氨酸或精氨酸。在其它实施方式中，所述至少一个氨基酸是非天然氨基酸如鸟氨酸、甲基赖氨酸、二氨基丁酸、高精氨酸和4-氨甲基苯丙氨酸。在优选的实施方式中，所述ASB试剂包含疏水性氨基酸。所述疏水性氨基酸可以是脂肪族疏水性氨基酸。在优选的实施方式中，所述疏水性氨基酸是色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、高苯丙氨酸、苯甘氨酸、4-氯苯丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、噻吩丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氨基苯丙氨酸、五氟苯丙氨酸、2-萘基丙氨酸、p-联苯丙氨酸、苯乙烯基丙氨酸、取代的苯丙氨酸、卤化苯丙氨酸、氨基异丁酸、丙烯基甘氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、1-萘基丙氨酸、吡啶丙氨酸或1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸。
ASB肽试剂可包括对本文所列特定ASB肽试剂的修饰，如缺失、添加和取代(一般保守性质)，只要所述肽维持所需特征。在某些实施方式中，优选保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代在其侧链相关的氨基酸家族内发生。遗传编码的氨基酸一般分成4个家族：(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电极性＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时可一起分类为芳族氨基酸。例如，合理预测用异亮氨酸或缬氨酸独立取代亮氨酸，用谷氨酸独立取代天冬氨酸，用丝氨酸独立取代苏氨酸，或用结构相关氨基酸的类似保守性取代氨基酸，对生物活性不会有重大影响。这些修饰可以是有意为之，如通过定点突变，或可以是偶然的，如通过产生蛋白的宿主突变或PCR扩增引起的错误。此外，完成的修饰具有一种或多种以下效果：提高对聚集物的亲和性、亲合力、和/或特异性；增加稳定性和对蛋白酶抗性。
ASB试剂可包含一种或多种氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)、有取代连接的肽以及本领域已知的其它天然或非天然产生(例如合成)的修饰。因此，将合成肽、二聚体、多聚体(例如，串联重复、多抗原肽(MAP)形式、线性相连的肽)，环状、分支分子等视为肽。这也包括含一种或多种N取代甘氨酸残基的分子(“类肽”)和其它合成氨基酸或肽。(参见例如美国专利号5,831,005；5,877,278；和5,977,301；Nguyen等(2000)Chem Biol.7(7)：463-473；和Simon等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(20)：9367-9371的类肽描述)。
这些和其它氨基酸类似物和肽模拟物的综述参见Nguyen等(2000)ChemBiol.7(7)：463-473；Spatola，A.F，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins(《氨基酸、肽和蛋白的化学和生物化学》)，B.Weinstein编，纽约的马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker)，第267页(1983)。还参见Spatola，A.F.，Peptide Backbone Modifications(general review)(《肽主链修饰(综述)》)，Vega Data，第1卷第3期，(1983年3月)；Morley，Trends Pharm Sci(综述)，第463-468页(1980)；Hudson，D.等，Int J Pept Prot Res，14：177-185(1979)(--CH2NH--，CH2CH2--)；Spatola等，Life Sci，38：1243-1249(1986)(--CH2--S)；Hann J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，307-314(1982)(--CH--CH--，顺式和反式)；Almquist等，J Med Chem，23：1392-1398(1980)(--COCH2--)；Jennings-White等，Tetrahedron Lett，23：2533(1982)(--COCH2--)；Szelke等，欧洲申请EP 45665CA：97：39405(1982)(--CH(OH)CH2--)；Holladay等，Tetrahedron Lett，24：4401-4404(1983)(--C(OH)CH2--)；和Hruby，Life Sci，31：189-199(1982)(--CH2--S--)。
显然，天然氨基酸和非天然氨基酸类似物的任何组合也可用于制成本文所述ASB试剂。通常遇到的非基因编码的氨基酸类似物包括但不限于：鸟氨酸(Orn)；氨基异丁酸(Aib)；苯并噻吩基丙氨酸(BtPhe)；合欢氨酸(Abz)；t-丁基甘氨酸(Tle)；苯甘氨酸(PhG)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；1-萘基丙氨酸(1-Nal)；2-噻吩丙氨酸(2-Thi)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；N-甲基异亮氨酸(N-MeIle)；高精氨酸(Har)；Nα-甲基精氨酸(N-MeArg)；磷酸酪氨酸(pTyr或pY)；甲酸(Pip)；4-氯苯丙氨酸(4-ClPhe)；4-氟苯丙氨酸(4-FPhe)；1-氨基环丙烷羧酸(1-NCPC)；4-氨甲基苯丙氨酸(AmF)；和肌氨酸(Sar)。ASB试剂使用的任意氨基酸可以是D-异构体，或更常是L-异构体。
可用于形成本文所述ASB试剂的其它非天然产生氨基酸类似物包括类肽和/或拟肽化合物如在生物学功能上等价的氨基酸的磺酸和硼酸类似物也用于本发明化合物，且包括具有一个或多个酰胺键任选由电子等排体取代的化合物。在本发明中，例如--CONH-可由--CH2NH--、--NHCO--、--SO2NH--、--CH2O--、--CH2CH2--、--CH2S--、--CH2SO--、--CH--CH--(顺式或反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和1，5-二取代的四唑替换，从而由这些电子等排体连接的自由基可保持与经--CONH--连接的自由基的类似方向。本文所述ASB试剂中的一个或多个残基可包括N取代的甘氨酸残基。
因此，所述试剂还可包括一个或多个N取代的甘氨酸残基(具有一个或多个N取代的甘氨酸残基的肽可称为“类肽”)。例如，在某些实施方式中，本文所述任何ASB试剂的一个或多个脯氨酸残基由N取代的甘氨酸残基替换。适合此方面的具体N取代甘氨酸包括但不限于：N-(S)-(1-苯乙基)甘氨酸；N-(4-羟苯基)甘氨酸；N-(环丙甲基)甘氨酸；N-(异丙基)甘氨酸；N-(3，5-二甲氧苄基)甘氨酸；和N-丁基甘氨酸。其它N取代的甘氨酸还可适合替换本文所述ASB试剂序列中的一个或多个氨基酸残基。
本文所述ASB试剂可以是单体、多聚体、环状分子、分支分子、接头等。也考虑本文所述任何序列的多聚体(即二聚体、三聚体等)或其生物学功能等价物。所述多聚体可以是同多聚体，即由相同单体构成，例如各单体是同一肽序列。或者，所述多聚体可以是异多聚体，意味着不是所有构成该多聚体的单体都相同。
多聚体可通过单体彼此直接结合或单体与基质直接结合形成，包括例如多抗原肽(MAPS)(例如对称性MAPS)、附于聚合物支架如PEG支架的肽和/或有或没有间隔单元而串联连接的肽。
或者，连接基团可加入单体序列以将单体连接在一起并形成多聚体。采用连接基团的多聚体的非限制性例子包括用甘氨酸接头的串联重复；MAPS经接头与基质结合和/或线性连接的肽经接头与支架结合。连接基团可包括采用本领域技术人员已知的双功能间隔单元(同双功能或异双功能)。举例而非限制性的，采用试剂如琥珀酰亚胺基-4-(p-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、琥珀酰亚胺基-4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸酯等将这种间隔单元一起纳入连接肽的多种方法描述于Pierce Immunotechnology Handbook(《皮尔斯免疫技术手册》，皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.)，现为伊利诺伊州罗克维尔的赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))且可获自西格玛化学公司(SigmaChemical Co.，密苏里州圣路易斯)和奥德里奇化学公司(Aldrich ChemicalCo.，威斯康星州密尔沃基，现为西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密苏里州圣路易斯)并描述于“Comprehensive Organic Transformations(《综合有机转化》)”，VCK-Verlagsgesellschaft，魏茵海姆/德国(1989)。可用于将单体序列连接在一起的一个连接基团示例是--Y1--F--Y2，其中Y1和Y2相同或不同且是具有0-20个、优选0-8个、更优选0-3个碳原子的烯烃基，F是一个或多个官能团如--O--、--S--、--S--S--、--C(O)--O--、--NR--、--C(O)--NR--、--NR--C(O)--O--、--NR--C(O)--NR--、--NR--C(S)--NR--、--NR--C(S)--O--。Y1和Y2可任选由羟基、烷氧基、羟烷基、烷氧基烷基、氨基、羧基、羧氧烷基等取代。应理解单体的任何合适原子可结合连接基团。
此外，本文所述ASB试剂可以是直链、支链或环状。单体单元可环化或可一起连接以提供直链或支链形式、环形式(例如大环)、星状形式(树状聚合物)或球形式(例如富勒烯)的多聚体。技术人员易识别多种可形成自本文所述单体序列的聚合物。在某些实施方式中，所述多聚体是环二聚体。采用如上相同术语，所述二聚体可以是同二聚体或异二聚体。
无论是单体或多聚体的环形式可通过上述任何连接制备，例如但不限于：(1)通过氮和C末端羰基间的直接酰胺键形成或通过中间的间隔基团如与ε-氨基羧酸缩合来环化N末端胺基和C末端羧酸；(2)通过2条残基侧链间的键形成例如在天冬氨酸或谷氨酸侧链与赖氨酸侧链间形成酰胺键，或通过2条半胱氨酸侧链或青霉胺与半胱氨酸侧链或2条青霉胺侧链间的二硫键形成来环化；(3)通过侧链(例如天冬氨酸或赖氨酸)分别与N末端胺基或C末端羧基间的酰胺键形成来环化；和/或(4)通过中间的短碳间隔基团来连接2条侧链。
此外，本文所述ASB试剂还可包括额外的肽或非肽组分。额外肽组分的非限制性例子包括间隔残基，例如2个或更多甘氨酸(天然或衍生)残基或在残基一个或两个末端上的氨基己酸接头，其可协助溶解所述肽试剂，例如酸性残基如天冬氨酸(Asp或D)。在某些实施方式中，例如，所述肽试剂合成为多抗原肽(MAP)。通常，多个拷贝的肽试剂(例如2-10拷贝)直接在MAP载体上合成，如分支赖氨酸或其它MAP载体核心。参见例如Wu等(2001)J AmChem Soc.2001123(28)：6778-84；Spetzler等(1995)Int J Pept Protein Res.45(1)：78-85。
本文所述ASB试剂可包含的非肽组分(例如化学部分)的非限制性例子包括位于所述肽试剂的任一末端或内部的一个或多个可检测标记、标签(例如生物素、His-标签、寡核苷酸)、染料、结合对成员等。非肽组分还可直接或经间隔区(例如酰胺基)结合(例如，通过共价结合一个或多个标记)到化合物上通过定量结构-活性数据和/或分子建模预测为非干扰的位置。本文所述ASB试剂还可包括化学部分如淀粉样特异性染料(例如刚果红、硫磺素等)。化合物的衍生(例如标记、环化、结合化学部分等)应基本不干扰(且可甚至提高)所述试剂的结合性质、生物学功能和/或药理活性。
可采用本领域技术人员已知的标准方法制备上述肽，包括但不限于从重组构建物表达和肽合成。
B.用作ASB试剂基础的优选肽示例
用于制备本发明聚集物特异性结合试剂的肽的非限制性例子优选获自表2所示序列。表中的肽用常规的一字母氨基酸编码表示，左侧为氨基末端且右侧为羧基末端。
表中的任何序列可任选在氨基和/或羧基末端包括Gly接头(Gn，其中n＝1、2、3或4)。通常，氨基己酸(Ahx)用作接头。表中的任何序列还可任选包括氨基和/或羧基末端的加帽基团。这种加帽基团的一个示例是乙酰基。所述加帽基团优选不带负电。
表2：用于制备ASB试剂的肽序列
  肽序列  SEQ ID NO
  KKKFKF   1
  KKKWKW   2
  KKKLKL   3
  KKKKKK   4
  KKKKKKKKKKKK   5
  KFYLYAIDTHRM   6
  KIIKWGIFWMQG   7
  NFFKKFRFTFTM   8
  AAKKAA   32
  AAKKKA   33
  AKKKKA   34
  AKKKKK   35
  FKFKKK   36
  kkkfkf   37
  FKFSLFSG   38
  DFKLNFKF   39
  FKFNLFSG   40
  YKYKKK   41
  KKFKKF   42
  KFKKKF   43
  KIGVVR   44
  AKVKKK   45
  AKFKKK   46
  肽序列  SEQ ID NO
  RGRERFEMFR   47
  YGRKKRRQRRR   48
  FFFKFKKK   49
  FFFFKFKKK   50
  FFFKKK   51
  FFFFKK   52
  F-fdb-F-fdb-fdb-fdb   53
  FoFooo   54
  单Boc-乙二胺+BrCH2CO-KKFKF   55
  三乙胺+BrCH2CO-KKFKF   56
  四甲基乙二胺+BrCH2CO-KKFKF   57
  Ala-AmF-AmF-Phe-AmF-Ala   58
  XKXKKK  X＝Thi，噻吩丙氨酸   59
  KKKXKX  X＝4-Cl Phe，4-氯苯丙氨酸   60
  KKKXKX  X＝4-NO2，4-硝基苯丙氨酸   61
  XKXKKK  X＝F5Phe，五氟苯丙氨酸   62
  XKXKKK  X＝Nap，2-萘基丙氨酸   63
  XKXKKK  X＝Bip，p-联苯丙氨酸   64
  XKXKKK  X＝Sty，苯乙烯基丙氨酸   65
  XKXKKK  X＝Tic，1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸   66
  MKFMKMHNKKRY   67
  LTAVKKVKAPTR   68
  LIPIRKKYFFKL   69
  KLSLIWLHTHWH   70
  IRYVTHQYILWP   71
  YNKIGVVRLFSE   72
  YRHRWEVMLWWP   73
  WAVKLFTFFMFH   74
  YQSWWFFYFKLA   75
  WWYKLVATHLYG   76
  QTLSLHFQTRPP   77
  TRLAMQYVGYFW   78
  RYWYRHWSQHDN   79
  AQYIMFKVFYLS   80
  TGIRIYSWKMWL   81
  SRYLMYVNIIYI   82
  RYWMNAFYSPMW   83
  NFYTYKLAYMQM   84
  MGYSSGYWSRQV   85
  YFYMKLLWTKER   86
  RIMYLYHRLQHT   87
Figure BPA00001563392200481
C.类肽ASB试剂
在特别优选的实施方式中，所述ASB试剂是类肽。制备类肽的方法公开于美国专利号5,811,387和5,831,005以及本文所述方法。优选的类肽描述于下。ASB类肽试剂可包括对本文所列特定ASB类肽试剂的修饰，如缺失、添加和取代(一般是保守性质)，只要所述类肽维持所需特征。
优选的类肽序列
表3列出适合制备用于本发明的ASB试剂的示例性类肽区(氨基到羧基方向)。表4提供表3所用缩写。表5提供各序列的相关结构。下文描述特定ASB试剂的制备。
表3：用于ASB试剂的代表性类肽试剂
  类肽区序列  SEQ ID NO：
  Nab-Nab-Nab-Nst-Nab-Nst   9
  Nae-Nae-Nae-Nbn-Nae-Nbn   10
  Nab-Nab-Nab-Noc-Nab-Noc   11
Figure BPA00001563392200491
表4：表3的缩写
  类肽残基缩写   氨基酸取代物
  Nab   N-(4-氨丁基)甘氨酸
  Nae＝Nea   N-(4-氨乙基)甘氨酸
  Nall   N-丙烯基甘氨酸
  Namp   N-(哌啶-4-基甲基)甘氨酸
  Napp   3-(2-氧吡咯烷-1-基)丙基)甘氨酸
  Nbn   N-苄基甘氨酸
  Nbsa   N-(4-氨磺酰苯乙基)甘氨酸
  Nbzp   2-(4-苯甲酰苄基)甘氨酸
  NChm   N-(环己基甲基)甘氨酸
  Ncpm   N-(环丙甲基)甘氨酸
  Ncpm   N-(环丙甲基)甘氨酸
  Ndmb   N-(3，5-二甲氧苄基)甘氨酸
  Ndpc   N-(2，2-二苯乙基)甘氨酸
  Nffb   N-(3，4-二氟苄基)甘氨酸
  Nfur   N-(3-呋喃甲基)甘氨酸
  Ngab   N-(4-羧乙基)甘氨酸
  Ngb   N-(4-胍基丁基)甘氨酸
  Nglu   N-(2-羧乙基)甘氨酸
  Nglu   N-(2-羧乙基)甘氨酸
  类肽残基缩写   氨基酸取代物
  Nhpe＝Ntyr   N-(2-(4-羟苯基)乙基)甘氨酸
  Nhph   N-(4-羟苯基)甘氨酸
  Nhrg＝Ngb   N-(4-胍基丁基)甘氨酸
  Nhye   N-(2-羟乙基)甘氨酸
  Nip   N-异丙基甘氨酸
  Nlys   N-(4-氨丁基)甘氨酸
  Nmba   N-(4-甲氧苄基)甘氨酸
  Nme   N-(2-甲氧乙基)甘氨酸
  Nmpe   N-(2-(4-甲氧苯基)乙基)甘氨酸
  Nnm   N-((8’-萘基)甲基)甘氨酸
  Noc   N-(辛基)甘氨酸
  Noct   N-辛基甘氨酸
  Nspe   (S)-N-(1-苯乙基)甘氨酸
  Nst   N-(甲基茋)甘氨酸
  Nstl   N-(甲基茋)甘氨酸
  Nthf   N-四氢糠甘氨酸
  Ntrp   N-(2-3’-吲哚乙基)甘氨酸
  Ntyr   N-(2-(4-羟苯基)乙基)甘氨酸
表5：表3的类肽区相关结构
Figure BPA00001563392200521
Figure BPA00001563392200531
Figure BPA00001563392200541
在一个特别优选的实施方式中，所述ASB试剂包含PSR1的结构：
Figure BPA00001563392200542
其中R和R’可以是任何基团。
D.来自其它支架的ASB试剂
在发明的某些实施方式中，所述ASB试剂在肽和类肽以外包括带正电的有机分子支架。在优选的实施方式中，所述ASB试剂是树突。在一个特别优选的实施方式中，所述ASB试剂包括结构
Figure BPA00001563392200551
E.鉴定用于本发明方法的ASB试剂
用于本发明方法的ASB试剂以某些电荷密度附于固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。此性质可采用任何已知结合试验测试，例如标准免疫测定如ELISA、蛋白质印迹等；标记的肽；ELISA样测定；和/或基于细胞的测定，具体有以下关于“通过聚集物与ASB试剂的结合来检测聚集物”的部分所述测定。
测试用于本发明方法的ASB试剂特异性的一种便捷方法是选择同时含聚集物和单体的样品。通常这些样品包括来自患病动物的组织。已知特异性结合聚集物的本文所述ASB试剂附于固体支持物(通过本领域熟知的方法并如下进一步描述)并用于分离(“下拉”)聚集物与其它样品组分，获得与固体支持物上试剂-蛋白结合相互作用数量直接相关的定量值。此结果可与结合特异性未知的ASB试剂作比较以确定这种试剂是否优先结合聚集物。
III.通过聚集物与ASB试剂的结合来检测聚集物
所述ASB试剂可用于多种测定以筛选样品(例如生物样品如血液、脑、脊髓、CSF或器官样品)，例如用于检测这些样品中聚集物的存在或缺失。与许多现有试剂不同，本文所述ASB试剂可在几乎所有类型的生物或非生物样品中检测，所述生物样品包括血样、血制品、CSF或活检样品。
所述检测方法可用于例如诊断与聚集物相关的疾病和对对聚集物存在或缺失的了解有重要性的任何其它情况。
聚集物特异性结合试剂用作捕获或检测试剂
用于本发明方法的ASB试剂通常在样品接触所述ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。对于预期含有大于1种构象蛋白聚集物的样品或对于所述方法测定存在哪种类型聚集物目的重要时，聚集物特异性结合试剂应联合CPSB试剂用于检测，CPSB试剂对不同类型构象蛋白有不同结合特异性和/或亲和性。例如，如果所述聚集物特异性结合试剂用作捕获试剂，构象蛋白特异性结合试剂应用作检测试剂，或反之亦然。然而，如果待分析的具体样品预期仅含有一种聚集物或如果对于所述方法测定哪种聚集物存在的目的不重要，则ASB试剂可同时用作捕获和检测试剂。
聚集物特异性结合试剂用作捕获剂的方法
在优选的实施方式中，本发明提供检测样品中聚集物存在的方法，通过将怀疑含聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述聚集物(如果存在)的条件下接触；通过所述聚集物与所述试剂的结合，检测所述样品中聚集物的存在(如果有)；其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
为了用于本发明方法，所述样品可以是已知或怀疑含有某聚集物的任何样品。所述样品可以是生物样品(即从活或曾经存活的生物体中制备的样品)或非生物样品。通常，生物样品包含身体组织或液体。合适的生物样品包括但不限于：全血、血液部分、血液组分、血浆、血小板、血清、脑脊液(CSF)、骨髓、尿液、泪液、乳汁、淋巴液、器官组织、脑组织、神经系统组织、肌肉组织、非神经系统组织、活检、尸检、脂肪活检、细胞、粪便、胎盘、脾组织、淋巴组织、胰腺组织、支气管肺泡灌洗液或滑液。优选的生物样品包括血浆和CSF。在某些实施方式中，所述样品包括多肽。
所述样品在允许所述ASB试剂与聚集物结合的条件下(如果其存在于样品中)接触一种或多种本文所述ASB试剂。本领域普通技术人员能根据本公开确定具体条件。通常，所述样品和ASB试剂在合适缓冲液中以生理pH于适当温度(例如约4-37℃)一起孵育一段合适时间(例如，约1小时-过夜)以允许结合发生。
在所述方法的这些实施方式中，所述聚集物特异性结合试剂是捕获试剂且通过聚集物与该聚集物特异性结合试剂的结合来检测所样品中聚集物的存在。捕获后，通过聚集物特异性结合试剂同时用作捕获和检测试剂来检测所述聚集物的存在。或者，可以有另外的检测试剂，其可以是不同的聚集物特异性结合试剂，优选是一种或多种构象蛋白特异性结合试剂。在优选的实施方式中，所述CPSB试剂是带标记抗体。在优选的实施方式中，捕获步骤后，去除未结合的样品，所述聚集物从其与所述ASB试剂形成的复合物中脱离以提供脱离的聚集物。将所述脱离的聚集物与第一CPSB试剂在允许结合形成第二复合物的条件下接触；通过检测所述第二复合物的形成，检测所述样品中聚集物的存在。在优选的实施方式中，用可检测的带标记第二CPSB试剂检测第二复合物的形成。所述第一CPSB试剂优选偶联于固体支持物。在特别优选的实施方式中，所述聚集物含有Aβ蛋白且所述CPSB试剂是抗Aβ抗体。
采用聚集物特异性结合试剂作为检测剂的方法
在其它实施方式中，本发明提供检测样品中聚集物存在的方法，通过将怀疑含聚集物的样品与结合构象蛋白单体和聚集物的构象蛋白特异性结合试剂在允许所述CPSB试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚合物则形成第一复合物；将第一复合物与ASB试剂在允许结合的条件下接触，通过所述聚集物与所述ASB试剂的结合，检测所述样品中聚集物的存在(如果有)，其中所述ASB试剂在所述样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。通常，在捕获步骤后去除未结合的样品。所述CPSB试剂优选偶联于固体支持物。
A.用于捕获聚集物的试剂
在优选的实施方式中，所述捕获试剂是聚集物特异性结合试剂，其在样品接触所述ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。在其它实施方式中，所述捕获试剂是结合构象蛋白单体和聚集物的构象蛋白特异性结合试剂。
捕获试剂在允许样品中任何聚集物结合所述试剂并形成复合物的条件下接触样品。这种结合条件易由本领域普通技术人员确定并在本文中有进一步描述。通常，所述方法在微量滴定板的孔或小体积塑料管中完成，但任何方便的容器都合适。所述样品一般是液体样品或悬浮液且可在捕获试剂之前或之后加入反应容器。
如果捕获试剂是上述聚集物特异性结合试剂，其优选以每平方米至少约60nmol净电荷偶联于固体支持物。
如果所述捕获试剂是CPSB试剂，其优选偶联于固体支持物，这在下面部分中有进一步详细描述。在一些实施方式中，所述固体支持物在用于样品前结合。固体支持物(例如磁珠)首先与本文所述捕获试剂反应，从而所述捕获试剂充分固定于支持物。然后，已结合捕获试剂的所述固体支持物与怀疑含聚集物的样品在允许所述捕获试剂结合聚集物的条件下接触。
或者，如果所述捕获试剂是CPSB试剂，其可首先与怀疑含聚集物的样品接触，然后附于固体支持物，接着将所述捕获试剂附于所述固体支持物(例如，所述试剂可以是生物素化且所述固体支持物包括与固体支持物相连的亲和素或链霉亲和素)。
在某些实施方式中，所述捕获试剂与所述聚集物形成复合物后，可去除未结合的样品材料(即未结合所述捕获试剂的任何样品组分，包括任何未结合的聚集物)。例如，如果所述捕获试剂偶联于固体支持物，可通过将所述固体支持物与反应溶液(含有未结合的样品材料)分开来减少未结合的材料，例如通过离心、沉淀、过滤、磁力等。所述具有复合物的固体支持物可任选进行一个或多个清洗步骤或在完成所述方法下一步骤前去除任何剩余样品材料。
在一些实施方式中，在去除未结合的样品材料和任合可选的清洗后，所述结合的聚集物从所述复合物中脱离并用任何已知检测方法测定。或者，检测所述复合物中的结合聚集物而不与所述捕获试剂脱离。
B.聚集物的脱离和变性
所述聚集物结合所述捕获试剂形成复合物后，可处理该聚集物以促进其检测。
在一些实施方式中，去除未结合的物质，然后所述聚集物与所述复合物脱离。“脱离”指所述聚集物与所述捕获试剂物理分开，从而所述聚集物可与所述捕获试剂分开检测。例如，可使用低浓度盐酸胍(如0.4-1.0M)或异硫氰酸胍完成所述聚集物与所述复合物的脱离。
当用于所述方法的CPSB试剂仅能检测变性蛋白时，所述脱离的聚集物也变性。“变性”指破坏多肽的天然构象。可实现变性而不与试剂脱离，例如若所述试剂含有共价连接该试剂和聚集物的可激活反应基团(例如光反应基团)。
在优选的实施方式中，所述聚集物同时脱离和变性。
聚集物可使用高浓度的盐或离液剂同时脱离和变性，例如用约3M-约6M胍盐如硫氰酸胍(GdnSCN)或盐酸胍(GdnHCl)。优选地，所述离液剂在进行检测前去除或稀释，因为其可干扰检测试剂的结合。
在其它实施方式中，通过改变pH将所述聚集物同时从所述具有捕获试剂的复合物中脱离并变性，例如通过将pH升至12或以上(“高pH”)或降至2或以下(“低pH”)。优选将所述复合物暴露于高pH。pH在12.0-13.0间一般足够；优选使用12.5-13.0、12.7-12.9、或12.9的pH。或者，可使所述复合物暴露于低pH以将所述致病性蛋白从所述试剂中脱离并变性。对于此替代方式，pH在1.0-2.0间就足够。在一些实施方式中，所述聚集物用pH12.5-13.2处理一段合适时间，例如90℃10分钟。
将第一复合物暴露于高pH或低pH一般仅进行较短时间，例如60分钟，优选不超过15分钟，更优选不超过10分钟。在一些实施方式中，所述暴露在高于室温下进行，例如在约60℃、70℃、80℃或90℃。暴露时间足以脱离所述聚集物后，可通过加入酸性试剂(如果采用高pH脱离条件)或碱性试剂(如果采用低pH脱离条件)重调整pH至中性(即约7.0-7.5的pH)。本领域普通技术人员易确定合适操作方案，且本文描述了实施例。
一般，为影响高pH脱离条件，添加NaOH至浓度约0.05N-约0.2N就足够。优选添加NaOH至浓度约0.05N-约0.15N；更优选使用约0.1N NaOH。一旦实现脱离，可通过加入合适量酸性溶液如磷酸、磷酸二氢钠重调整pH至中性(即约7.0-7.5)。
一般，为影响低pH脱离条件，添加H3PO4至浓度约0.2M-约0.7M就足够。优选添加H3PO4至浓度约0.3M-约0.6M；更优选采用0.5M H3PO4。一旦实现脱离，可通过加入合适量碱性溶液如NaOH或KOH重调整pH至中性(即约7.0-7.5)。
如果需要，也可完成所述聚集物与所述复合物的脱离而不使蛋白变性，例如使用低浓度(如0.4-1.0M)盐酸胍或异硫氰酸胍。从复合物中脱离聚集物而不使蛋白变性的额外条件参见WO2006076497(国际申请PCT/US2006/001090)。或者，如果例如所述试剂修饰成包含能用于共价连接该试剂和聚集物的可激活反应基团(例如光反应基团)，所述捕获聚集物也可变性而不与所述试剂脱离。
脱离后，所述聚集物随之与所述捕获试剂分开。完成此脱离的方式可与上述去除未结合样品材料相似，但保留含有未结合材料的部分(现在是脱离的聚集物)并弃去含所述捕获试剂的部分。
C.检测捕获的聚集物
可用构象蛋白特异性结合试剂完成聚集物检测。在优选地实施方式中，所述CPSB试剂是识别构象蛋白上表位的抗体(单克隆或多克隆)。
还可用ASB试剂完成所述样品中捕获聚集物的检测。这种试剂可用于其中所述捕获试剂是相同或不同聚集物特异性结合试剂或构象蛋白特异性结合试剂的实施方式中。
所述方法采用第一聚集物特异性结合试剂和第二聚集物特异性结合试剂时，所述第一和第二试剂可以相同或不同。“相同”指所述第一和第二试剂的差异仅在于该第二试剂含有可检测标记。例如若所述第一和第二试剂有不同结构或从不同朊病毒区域的片段衍生，则该第一和第二试剂“不同”。
一般检测方法
然后可用任何合适的检测方法鉴定所述捕获试剂和聚集物间的结合。
适用于检测结合的分析方法包括诸如荧光、电子显微镜、原子力显微镜、UV/可见光谱法、FTIR、核磁共振波谱法、拉曼光谱、质谱、HPLC、毛细血管电泳、表面等离子体共振波谱、微机电系统(MEMS)等方法，或任何本领域已知的其它方法。
还可通过使用带标记试剂或抗体检测结合，通常以ELISA形式。适用于本发明的可检测标记包括能检测的任何分子，包括但不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、发色团、荧光半导体纳米微晶体、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如生物素、链霉亲和素或半抗原)等。额外的标记包括但不限于使用荧光的标记，包括能在可检测范围显示荧光的那些物质或其部分。可用于本发明的具体标记示例包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素、FITC、罗丹明、丹磺酰、伞花内酯、二甲基吖啶酯(DMAE)、德州红、氨基苯二酰肼、NADPH和β-半乳糖苷酶。另外，可检测标记可包括能通过核酸检测方法如聚合酶链式反应(PCR)、转录介导的扩增(NASBA)等测定的寡核苷酸标签。优选的可检测标记包括酶，特别是碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)和荧光化合物。如本领域所熟知，酶与可检测底物例如生色底物或荧光底物联用，以产生可检测信号。
除了使用带标签的检测试剂(上述)，可采用免疫沉淀分离出结合聚集物的试剂。优选地，通过加入沉淀强化剂促进免疫沉淀。沉淀强化剂包括可提高或增加与蛋白结合试剂沉淀的部分。这种沉淀强化剂包括聚乙二醇(PEG)、蛋白G、蛋白A等。蛋白G或蛋白A用作沉淀强化剂时，所述蛋白可任选附于珠，优选磁珠。可通过使用离心或使用磁力来进一步增强沉淀。这类沉淀强化剂的使用为本领域已知。
例如，蛋白质印迹通常在获自“下拉”试验的样品(如本文所述)上采用检测SDS-PAGE凝胶中变性蛋白的带标签一抗，其电转印迹至硝酸纤维素或PVDF上。然后用针对标签的探针(例如，链霉亲和素偶联的碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、ECL试剂和/或可扩增寡核苷酸)检测(和/或扩增)所述一抗。还可用检测试剂如具有亲和标签(例如生物素)的肽评价结合，所述试剂用针对亲和标签的探针(例如，链霉亲和素偶联的碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、ECL试剂或可扩增寡核苷酸)标记和扩增。
例如，还可采用基于细胞的试验，其中直接在单独细胞上检测聚集物(例如，使用的荧光标记试剂能基于荧光进行细胞分选、计数或检测特异性标记细胞)。
从检测试剂中扩增信号的试验也已知。其示例是采用生物素和亲和素的试验，酶标记和介导的免疫测定如ELISA试验。进一步示例包括采用分支DNA进行信号扩增(参见例如美国专利号5,681,697；5,424,413；5,451,503；5,4547,025；和6,235,483)；用靶扩增技术如PCR、滚环扩增、第三波侵入(ThirdWave’s invader)(Arruda等，2002 Expert.Rev.Mol.Diagn.2：487；美国专利号6090606、5843669、5985557、6090543、5846717)、NASBA、TMA等(美国专利号6,511,809；EP 0544212A1)；和/或免疫-PCR技术(参见例如美国专利号5,665,539；国际出版物WO 98/23962；WO 00/75663；和WO 01/31056)。
另外，可采用与夹心ELISA相似的微量滴定板方法，例如用本文所述聚集物特异性结合试剂或构象蛋白特异性结合试剂将蛋白(多种)固定于固体支持物(例如微量滴定板的孔，珠等)，使用额外的检测试剂测定所述聚集物，所述检测试剂可包括但不限于具有用于检测聚集物的亲和和/或检测标记如偶联的碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、ECL试剂或可扩增寡核苷酸的另一聚集物特异性结合试剂或构象蛋白特异性结合试剂。
检测脱离的捕获聚集物的优选方法
如果捕获试剂和结合聚集物在检测前脱离，所述脱离的聚集物可在ELISA型试验中检测，采用下文更详细描述的直接ELISA或抗体夹心ELISA型试验。尽管术语“ELISA”用于描述有抗体的检测，所述试验不限于其中抗体经“酶连接”的试验。可用本文所述和免疫测定领域熟知的任何可检测标记对所述检测抗体进行标记。可进行诸如Lau等，PNAS USA 104(28)：11551-11556(2007)所述的ELISA来定量脱离自所述捕获试剂的聚集物量。
可将脱离的聚集物被动包被到固体支持物表面用于标准ELISA。这种被动包被的方法已熟知且通常在pH 8的100mM NaHCO3中于37℃进行数小时或4℃过夜。熟知其它包被缓冲液(例如50mM碳酸盐pH 9.6，10mM TrispH 8或10mM PBS pH 7.2)。所述固体支持物可以是本文所述或本领域熟知的任何固体支持物，但优选固体支持物是微量滴定板，例如96孔聚苯乙桸板。用高浓度离液剂进行脱离时，在包被于固体支持物前通过稀释至少约2倍来降低所述离液剂浓度。用高或低pH进行脱离然后中和时，所述脱离聚集物可用于包被而不需进一步稀释。清洗所述板以去除未结合的材料。
如果要进行标准ELISA，则添加附于固体支持物的可检测标记的结合分子如构象蛋白特异性结合试剂或聚集物特异性结合试剂(与捕获所用相同或不同)。此可检测标记的结合分子能与任何捕获聚集物反应，清洗板并用本领域熟知的方法检测标记分子的存在。检测分子不需特异于所述聚集物，但可结合聚集物和单体，只要所述捕获试剂特异于所述聚集物。在优选的实施方式中，可检测标记的结合分子是抗体。这种抗体包括熟知的抗体以及通过熟知方法产生的抗体，其对构象蛋白的天然和错折叠构象异构体都具有特异性。
在替代的实施方式中，用抗体夹心型ELISA检测脱离的聚集物。在此实施方式中，所述脱离聚集物“重捕获”在具有第一抗体的固体支持物上，所述抗体特异于所述聚集物或构象蛋白。具有重捕获聚集物的固体支持物可任选清洗以去除任何未结合材料，然后在允许第二抗体结合重捕获聚集物的条件下与构象蛋白或聚集物特异性第二抗体接触。
所述第一和第二抗体通常是不同的抗体，优选识别构象蛋白上的不同表位。例如，所述第一抗体识别构象蛋白N末端的表位且所述第二抗体识别N末端以外的表位，或反之亦然。易选择其它的第一和第二抗体组合。在此实施方式中，所述第二抗体而不是第一抗体进行可检测标记。
用离液剂完成聚集物与试剂的脱离时，应在进行检测试验前将所述离液剂去除或稀释至少15倍。用高或低pH以及中和影响所述脱离时，可使用所述脱离聚集物而不需进一步稀释。所述脱离聚集物在进行检测前变性时，所述第一和第二抗体都结合该变性构象异构体。
检测未脱离的捕获聚集物的优选方法
在其它示例性试验中，所述捕获试剂和结合聚集物在检测前不脱离。捕获试剂是偶联于固体支持物的ASB时，含有或怀疑含聚集物的样品可加入所述固体支持物。孵育足够时间以允许任何聚集物结合所述试剂后，清洗所述固体支持物以去除未结合部分，并加入上述可检测标记的第二结合分子如附于固体支持物的构象蛋白特异性结合试剂或者相同或不同的第二聚集物特异性结合试剂。或者，偶联于固体支持物(例如包被于微量滴定板的孔上)的构象蛋白特异性结合试剂用作捕获试剂，用附于固体支持物的聚集物特异性结合试剂完成检测。
D.试验使用的固体支持物
在固体支持物上提供ASB试剂。在某些实施方式中，在固体支持物上提供CPSB试剂。在接触样品前于固体支持物上提供ASB试剂或CPSB试剂，或者在CPSB试剂的情况中，所述试剂可调整用于在接触样品和结合其中任何聚集物后结合所述固体支持物(例如，通过使用生物素化试剂和含亲和素或链霉亲和素的固体支持物)。
用于本发明目的的固体支持物可以是作为不溶性基质的任何材料，其具有可连接或结合感兴趣分子(例如本发明的试剂、构象蛋白、抗体等)的刚性或半刚性表面。示例性固体支持物包括但不限于：基质如硝酸纤维素、聚氯乙烯；聚丙烯、聚苯乙桸、乳胶、聚碳酸酯、尼龙、葡聚糖、几丁质、砂、二氧化硅、浮石、琼脂糖、纤维素、玻璃、金属、聚丙烯酰胺、硅、橡胶、多糖、聚氟乙烯、重氮化纸、活化珠、磁响应珠，和通常用于固相合成、亲和分离、纯化、杂交反应、免疫测定和其它这类应用的任何材料。所述支持物可以是颗粒或采用连续表面形式且包括膜、网、板、团块、玻片、盘、毛细管、中空纤维、针、大头针、芯片、固体纤维、凝胶(例如硅胶)和珠(例如，多孔玻璃珠、硅胶、任选交联有二乙烯苯的聚苯乙桸珠、枝接共聚珠、聚丙烯酰胺珠、乳胶珠、任选交联有N-N’-二-丙烯酰乙二胺的二甲基丙烯酰胺珠、氧化铁磁珠和包被有疏水性聚合物的玻璃粒。
本文所述ASB试剂或CPSB试剂易用标准技术偶联于固体支持物，所述技术通过吸附、偶联或使用结合对来连接例如共价连接所述ASB试剂或CPSB试剂。
通过首先偶联所述ASB试剂或CPSB试剂与蛋白(例如当蛋白具有较好固相-结合性质时)增强所述支持物的固定。合适的偶联蛋白包括但不限于大分子如包括牛血清白蛋白(BSA)在内的血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白和本领域技术人员熟知的其它蛋白。可用于结合分子与支持物的其它试剂包括多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物等。这种分子和偶联这些分子与蛋白的方法为本领域普通技术人员熟知。参见例如Brinkley，M.A，(1992)Bioconjugate Chem，3：2-13；Hashida等，(1984)J.Appl.Biochem，6：56-63；以及Anjaneyulu和Staros(1987)International J.of Peptide and Protein Res.30：117-124。
如果需要，待加入所述固体支持物的所述ASB试剂或CPSB试剂易功能化以产生苯乙烯或丙烯酸盐部分，因而能使所述分子纳入聚苯乙桸、聚丙烯酸盐或其它聚合物如聚酰亚胺、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚乙烯化合物、聚二乙炔、聚亚苯基亚乙烯、多肽、多糖、聚砜、聚吡咯、聚咪唑、聚噻吩、聚醚、环氧树脂、石英玻璃、硅胶、硅氧烷、多聚磷酸酯、水凝聚、琼脂糖、纤维素等。在优选的实施方式中，所述固体支持物是磁珠，更优选是聚苯乙桸/氧化铁珠。
所述ASB试剂或CPSB试剂能通过分子结合对的相互作用附于所述固体支持物。熟知这种结合对且本文他处描述了示例。一个结合对成员通过上述技术偶联于所述固体支持物且另一结合对成员附于所述试剂(在合成前、中或之后)。如此修饰的ASB试剂或CPSB试剂可接触样品，如果存在所述聚集物则在溶液中与之发生相互作用，之后所述固体支持物可接触所述试剂(或试剂-蛋白复合物)。此实施方式的优先结合对包括生物素和亲和素、生物素和链霉亲和素。除了生物素-亲和素、生物素和链霉亲和素，此实施方式的其它合适结合对包括例如抗原-抗体、半抗原-抗体、模拟表位-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-糖类、蛋白A-抗体Fc。熟知这种结合对(参见例如美国专利号6,551,843和6,586,193)，本领域普通技术人员能选择合适结合对并改良用于本发明。所述捕获试剂改良成适于附着上述支持物时，所述样品可在该捕获试剂附于支持物之前或之后与捕获试剂接触。
或者，所述ASB试剂或CPSB试剂能使用本领域熟知的结合化学来共价结合固体支持物。例如，含硫醇的ASB试剂或CPSB试剂可使用本领域已知的标准方法直接附于固体支持物，例如羧化磁珠(参见例如Chrisey，L.A，Lee，G.U.和O’Ferrall，C.E.(1996)Covalent attachment of synthetic DNA toself-assembled monolayer films(合成DNA共价结合自组装的单层膜).NucleicAcids Research 24(15)，3031-3039；Kitagawa，T，Shimozono，T，Aikawa，T，Yoshida，T.和Nishimura，H.(1980).Preparation and characterization ofhetero-bifunctional cross-linking reagents for protein modifications(制备和鉴定用于蛋白修饰的异双功能交联试剂).Chem.Pharm.Bull.29(4)，1130-1135))。羧化磁珠首先用碳二亚胺化学方法偶联于含马来酰亚胺官能的异双功能交联剂(来自皮尔斯生物技术公司的BMPH)。然后，所述巯基化ASB或CPSB试剂共价偶联于BMPH包被珠的马来酰亚胺官能部分。在本发明检测方法的实施方式中使用时，所述固体支持物协助含有所述试剂和聚集物的复合物与未结合样品分离。用于巯基偶联的特别方便的磁珠是来自戴诺公司(Dynal)(现为英杰公司(Invitrogen Corporation)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)的DynabeadsTMM-270羧酸。所述ASB或CPSB试剂可包括接头，例如一个或多个氨基己酸部分。
E.聚集物的优选检测方法
优选的实施方式描述于下。
在优选的实施方式中，本发明的方法用ASB试剂捕获和检测聚集物，该试剂在所述样品接触所述ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体，所述方法包括将怀疑含聚集物的样品与所述ASB试剂在允许该ASB试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物；通过所述聚集物与所述ASB试剂的结合，检测所述样品中聚集物的存在(如果有)。可测定所述聚集物的结合，例如，通过脱离复合物并用CPSB试剂检测聚集物。
在一个实施方式中，待捕获的聚集物是与阿尔茨海默病相关的聚集物，如Aβ40、Aβ42或tau。在这种情况中，所述样品优选是血浆或脑脊液。所述ASB试剂优选衍生自SEQ ID NO：1-8，且包括类肽试剂如：
Figure BPA00001563392200661
Figure BPA00001563392200671
Figure BPA00001563392200681
Figure BPA00001563392200691
，其中R和R’可以是任何基团。
在其它的优选实施方式中，本发明的方法用ASB试剂捕获所述聚集物，所述试剂在所述样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体，并用CPSB试剂检测所述聚集物。所述方法包括将怀疑含聚集物的样品与ASB试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成第一复合物；将所述第一复合物与CPSB试剂在允许结合的条件下接触；通过所述聚集物与所述CPSB结合试剂的结合，检测所述样品中聚集物的存在(如果有)。通常，在所述第一复合物形成后和该第一复合物接触CPSB试剂前，去除未结合的样品。所述CPSB结合试剂可以是标记的抗构象蛋白抗体。
在另一优选的实施方式中，本发明的方法用ASB试剂捕获和检测所述聚集物的存在，所述试剂在所述样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。所述方法包括将怀疑含聚集物的样品与ASB试剂在允许所述ASB试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成第一复合物；去除未结合的样品材料；从所述第一复合物中脱离所述聚集物从而提供脱离聚集物；将所述脱离聚集物与第一CPSB试剂在允许结合形成第二复合物的条件下接触；通过检测所述第二复合物的形成，检测所述样品中聚集物的存在(如果有)。所述第二复合物的形成优选用可检测标记的第二CPSB试剂测得，所述第一CPSB试剂优选偶联于固体支持物。
在一替代方式中，本发明提供用第一ASB试剂捕获聚集物的方法，所述试剂在所述样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体，用本文所述第二ASB试剂检测所述聚集物。所述方法包括将怀疑含聚集物的样品与第一ASB试剂在允许所述第一试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成第一复合物；将怀疑含聚集物的样品与第二ASB试剂在允许所述第二试剂结合所述第一复合物中聚集物的条件下接触，其中所述第二试剂具有可检测标记；通过所述聚集物与第二试剂的结合，检测样品中聚集物的存在(如果有)。
在另一替代方式中，本发明提供用CPSB试剂捕获聚集物并用ASB试剂检测聚集物的方法，所述ASB试剂在所述样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。所述方法包括(a)将怀疑含聚集物的样品与CPSB试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物；(b)去除未结合的样品材料；(c)将所述复合物与ASB试剂在允许所述ASB试剂结合所述聚集物的条件下接触，其中该ASB试剂包括可检测标记；通过所述聚集物与所述ASB试剂的结合，检测样品中聚集物的存在(如果有)；其中所述ASB试剂在所述样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
在所有上述方法中，“未结合样品”指所述接触步骤中未捕获的样品内的组分。所述未结合样品可通过本领域熟知方法去除，例如通过清洗、离心、过滤、磁性分离和这些技术的组合。优选地，在本发明方法中，通过用缓冲液清洗复合物和/或磁性分离来去除未结合样品。
在优选的实施方式中，本发明方法用于检测构象病，包括系统性淀粉样变性、滔蛋白病变、共核蛋白病和先兆子痫。
F.检测寡聚体的方法
本文所述发明提供检测寡聚体的方法。在优选的实施方式中，本发明提供检测样品中寡聚体存在的方法：提供怀疑含寡聚体的样品，其中所述样品缺乏寡聚体外的聚集物，将所述样品与ASB试剂在允许所述试剂结合所述寡聚体的条件下接触，如果存在所述寡聚体则形成复合物，通过所述寡聚体与所述ASB试剂的结合，检测所述样品中寡聚体的存在(如果有)，其中所述ASB试剂在所述样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约2000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
为用于检测寡聚体的方法，所述样品可以是已知或怀疑含有某一聚集物的任何样品。所述样品可以是生物样品(即从活或曾经存活的生物体中制备的样品)或非生物样品。通常，生物样品包含身体组织或液体。合适的生物样品包括但不限于：全血、血液部分、血液组分、血浆、血小板、血清、脑脊液(CSF)、骨髓、尿液、泪液、乳液、淋巴液、器官组织、脑组织、神经系统组织、肌肉组织、非神经系统组织、活检、尸检、脂肪活检、细胞、粪便、胎盘、脾组织、淋巴组织、胰腺组织、支气管肺泡灌洗液或滑液。优选的生物样品包括血浆和CSF。在某些实施方式中，所述样品包括多肽。
在替代的实施方式中，本发明提供检测样品中寡聚体存在的方法：提供怀疑含寡聚体的样品，从所述样品中去除寡聚体外的聚集物，将所述样品与ASB试剂在允许所述试剂结合所述寡聚体的条件下接触，如果存在所述寡聚体则形成复合物，通过所述寡聚体与所述ASB试剂的结合，检测所述样品中寡聚体的存在(如果有)，其中所述ASB试剂在所述样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约2000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。在优选的实施方式中，通过离心从所述样品中去除寡聚体外的聚集物。
在另一实施方式中，本发明提供检测样品中寡聚体存在的方法：将怀疑含寡聚体的样品与ASB试剂在允许所述试剂结合所述寡聚体的条件下接触，如果存在所述寡聚体则形成复合物，将所述复合物接触第二试剂，其中所述试剂优先结合寡聚体或寡聚体外的聚集物，通过所述寡聚体与所述第二试剂的有或没有结合，检测所述样品中寡聚体的存在(如果有)，其中所述ASB试剂在所述样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约2000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。在优选的实施方式中，所述第二试剂是A11抗体，其识别寡聚体而不识别原纤维。
在检测寡聚体存在方法的优选实施方式中，寡聚体以外的聚集物包括原纤维。
从样品中去除非寡聚体聚集物的方法
可通过本领域已知的任何方法从样品中去除非寡聚体聚集物。通常，非寡聚体聚集物如无定形聚集物和原纤维可通过离心从样品中去除。本领域实践者所用的优选离心条件可变化(Philo，AAPS J，2006，8(3)Art.65)。然而，14,000xg离心10分钟通常仅去除很大的聚集物，包括较大原纤维和一些无定形聚集物(10-1000MDa)，100,000xg离心1小时通常去除大于1MDa的聚集物，包括较小原纤维和无定形聚集物。聚集物的大小、溶解度和离子强度以及样品的浓度、温度和pH会影响分离所需的离心加速和速度(Sipe，J.(编)，2005，Amyloid Proteins：The Beta Sheet Conformation and Disease(淀粉样蛋白：β片层构象和疾病)，410-425，Wiley-VCH；Stine等，JBC，2003，278，11612-22)。
G.构象病的检测方法
构象病
本发明涉及用聚集物特异性结合试剂检测非天然构象异构体聚集物的方法，用于评价聚集物介导疾病的可能性是否增加，和评价聚集物介导疾病的治疗有效性。构象病蛋白和其对应疾病包括表1所列的那些。
本发明的构象病包括与形成2种或更多不同构象的蛋白相关的任何疾病。本文特别感兴趣的包括淀粉样病，其都显示交叉β片层特征，如阿尔兹海默病、系统性淀粉样变性、滔蛋白病变和共核蛋白病。其它感兴趣的疾病是糖尿病和多聚谷氨酰胺病，以及非淀粉样蛋白质病如丝氨酸病变。
在某些实施方式中，本发明方法还包括使用构象蛋白特异性结合试剂(“CPSB试剂”)以捕获或检测单体和聚集物。所用的具体CPSB试剂取决于所检测蛋白。例如，若待诊断的构象病是阿尔兹海默病，则所述CPSB试剂可以是同时识别阿尔兹海默病蛋白Aβ的单体和聚集物的抗体。
致病性阿尔兹海默病聚集物的检测方法
提供了检测致病性阿尔兹海默病聚集物的方法，所述聚集物包含错折叠的构象异构体如Aβ40、Aβ42或tau。
在特别优选的实施方式中，这些方法用ASB试剂捕获致病性阿尔兹海默病聚集物，所述试剂在所述样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体，用CPSB试剂检测捕获的聚集物。
所述方法具体包括：将怀疑含致病性阿尔兹海默病聚集物的样品与ASB试剂在允许所述ASB试剂结合所述致病性阿尔兹海默病聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成第一复合物；去除未结合的样品材料；从所述第一复合物中脱离所述致病性阿尔兹海默病聚集物从而提供脱离的致病性阿尔兹海默病聚集物；将所述脱离的致病性阿尔兹海默病聚集物与CPSB试剂在允许结合形成第二复合物的条件下接触；通过检测所述第二复合物的形成，检测所述样品中致病性阿尔兹海默病聚集物的存在(如果有)。所述第一复合物中的致病性阿尔兹海默病聚集物优选用约0.05N NaOH或约0.1N NaOH在约90℃或约80℃脱离和变性，然后接触所述CPSB试剂。所述致病性阿尔兹海默病聚集物含有Aβ40或Aβ42时，优选以约0.1N NaOH在约80℃脱离和变性约30分钟。优选使用夹心ELISA。
可用IV(B)部分所述方法完成脱离和/或变性。一般，通过pH从低到高或由高到低改变，使所述致病性阿尔兹海默病聚集物同时脱离和变性。
在优选的实施方式中，所述ASB试剂获自SEQ ID NO：1-8或类肽，包括
Figure BPA00001563392200741
Figure BPA00001563392200751
其中R和R’可以是任何基团，所述试剂偶联于固体支持物如磁珠。
所述CPSB试剂优选是偶联于固体支持物如微量滴定板的抗阿尔兹海默病蛋白抗体，优选用第二可检测标记的CPSB试剂测定所述第二复合物的形成。所述致病性阿尔兹海默病聚集物含有Aβ40或Aβ42时，优选的抗阿尔兹海默病蛋白抗体包括特异于Aβ40C末端的抗体11A50-B 10(科文斯公司(Covance))；特异于Aβ42C末端的抗体12F4(科文斯公司)；特异于Aβ氨基酸18-22的4G8；特异于Aβ氨基酸1-10的20.1；和特异于Aβ氨基酸3-8的6E10。在特别优选的实施方式中，12F4或11A50-B10是ELISA板上的捕获抗体且14G8用作第二可检测标记的CPSB试剂。所述样品优选是血浆或脑脊液(CSF)。
因此，在特别优选的实施方式中，检测致病性阿尔兹海默病聚集物存在的方法包括但不限于以下步骤：将怀疑含致病性阿尔兹海默病聚集物的血浆或CSF样品与偶联磁珠的PSR1在允许所述PSR1结合致病性阿尔兹海默病聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成第一复合物；去除未结合的样品材料；通过改变pH从所述第一复合物中脱离和/或变性所述致病性阿尔兹海默病聚集物从而提供脱离的致病性阿尔兹海默病聚集物；将所述脱离的致病性阿尔兹海默病聚集物与结合固体支持物的抗阿尔兹海默病蛋白抗体在允许结合形成第二复合物的条件下接触；通过用第二标记的抗阿尔兹海默病蛋白抗体孵育，检测所述第二复合物的形成。
H.竞争试验
在一些方面，本发明的方法通过竞争性结合检测聚集物。检测方法可用于确定弱结合ASB结合试剂的配体何时被聚集物取代。吸附于固体支持物上的ASB试剂与结合所述ASB试剂的可检测标记配体联合，所述配体结合ASB试剂的结合亲合力弱于所述聚集物结合该ASB试剂的结合亲合力。检测配体-ASB试剂复合物。然后加入样品。对于所述ASB试剂，所述可检测标记的配体的结合亲合力弱于所述聚集物的结合亲合力，因此所述聚集物会取代标记的配体且结合所述ASB试剂的标记配体检测量减少表明该ASB试剂与所述样品中聚集物之间形成复合物。
因此，在某些实施方式中，通过如下步骤检测聚集物的存在：提供含ASB试剂的固体支持物；组合所述固体支持物与可检测标记的配体，其中所述ASB试剂对可检测标记配体的结合亲合力弱于该ASB试剂对聚集物的结合亲合力；将怀疑含聚集物的样品与固体支持物在允许所述聚集物存在于样品时结合所述ASB试剂并取代所述配体的条件下组合；检测所述ASB试剂和所述来自样品的聚集物之间形成的复合物；其中所述ASB试剂在所述样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
IV.其它方法
一般，本文所述ASB试剂在以某些电荷密度附于固体支持物时能优先结合构象蛋白聚集物。因此，这些试剂可容易检测几乎任何生物或非生物样品中的聚集物存在，包括活或死亡脑、脊髓、或其它神经系统组织以及血液。样品可包含重组或合成的多肽。因此，所述试剂用于广泛的分离、纯化、检测、诊断和治疗应用。
例如，附于亲和支持物的ASB试剂可用于分离聚集物。ASB试剂可通过例如吸附、共价连接等附于固体支持物，从而所述试剂保留其聚集物选择性结合活性。任选地，可包括间隔基团，例如使所述ASB试剂的结合位点仍然可及。然后，可用固定的ASB试剂结合来自生物样品如血液、血浆、脑、脊髓和其它组织的聚集物。通过例如pH变化从所述支持物中回收结合的试剂或复合物，或所述聚集物可与所述复合物脱离。
因此，在某些实施方式中，本发明提供减少多肽样品中聚集物量的方法：将怀疑含聚集物的多肽样品与ASB试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物，回收未结合的多肽样品，其中所述ASB试剂在所述样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。在某些实施方式中，所述方法还包括检测复合物的存在以确定样品是否含有聚集物。通过使带可检测标记的第二聚集物特异性结合试剂或带可检测标记的构象蛋白特异性结合试剂与所述聚集物结合，可实现所述复合物的检测。重组或合成蛋白生成对于许多工业如制药、生物燃料、医学和其它生命科学研究至关重要。这种多肽样品可包含例如生产用于药物用途的蛋白，如重组胰岛素和治疗性抗体。这些多肽可以高水平生成，从而所述多肽聚集物倾向于以相对高速率形成。本发明提供的减少多肽样品中聚集物量的方法用于这些生产用于药物用途的蛋白的质量控制和生产用于其它工业的蛋白的质量控制。
在其它实施方式中，本发明提供区分样品中聚集物和单体的方法：将怀疑含聚集物的样品与ASB试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物；通过所述聚集物与所述试剂的结合，区分所述聚集物和单体；其中所述ASB结合试剂在所述样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。在优选的实施方式中，通过使带可检测标记的第二聚集物特异性结合试剂或带可检测标记的构象蛋白特异性结合试剂与所述聚集物结合，检测所述聚集物与所述试剂的结合。在复合物形成后和用标记试剂检测聚集物前，可去除未结合的样品。或者，所述复合物可脱离以提供脱离聚集物，然后所述脱离聚集物可结合第一CPBS试剂以形成第二复合物，检测所述第二复合物的形成。在某些实施方式中，用可检测标记的第二CPBS试剂检测第二复合物。在某些实施方式中，所述第一CPSB偶联于固体支持物。
在某些实施方式中，本发明提供评价对象患构象病可能性是否增加的方法：将怀疑患构象病的生物样品与ASB试剂在允许所述试剂结合致病性聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物；通过所述致病性聚集物与所述试剂的结合，检测所述生物样品中致病性聚集物的存在(如果有)；如果所述生物样品中致病性聚集物含量高于没有构象病对象样品中的聚集物含量，确定所述对象患有构象病的可能性增加；其中所述ASB试剂在所述样品接触该ASB试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。在优选的实施方式中，通过使带可检测标记的第二聚集物特异性结合试剂或带可检测标记的构象蛋白特异性结合试剂与所述聚集物结合，检测所述聚集物与所述试剂的结合。在复合物形成后和用标记试剂检测聚集物前，可去除未结合的样品。或者，所述复合物可脱离以提供脱离聚集物，然后所述脱离聚集物可结合第一CPBS试剂以形成第二复合物，检测所述第二复合物的形成。在某些实施方式中，用可检测标记的第二CPBS试剂检测第二复合物。在某些实施方式中，所述第一CPSB偶联于固体支持物。
在其它实施方式中，本发明提供评价构象病治疗有效性的方法：将接受构象病治疗患者的生物样品与ASB试剂在允许所述试剂结合致病性聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物；通过所述致病性聚集物与所述试剂的结合，检测所述样品中致病性聚集物的存在(如果有)；如果所述生物样品中致病性聚集物含量低于构象病治疗前取自患者的生物样品中致病性聚集物含量，确定所述治疗有效；其中所述ASB试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。在优选的实施方式中，通过使带可检测标记的第二聚集物特异性结合试剂或带可检测标记的构象蛋白特异性结合试剂与所述聚集物结合，检测所述聚集物与所述试剂的结合。在复合物形成后和用标记试剂检测聚集物前，可去除未结合的样品。或者，所述复合物可脱离以提供脱离聚集物，然后所述脱离聚集物可结合第一CPBS试剂以形成第二复合物，检测所述第二复合物的形成。在某些实施方式中，用可检测标记的第二CPBS试剂检测第二复合物。在某些实施方式中，所述第一CPSB偶联于固体支持物。
使用本文所述试剂的一些变化和组合可用于本发明方法。
V.组合物和药盒
本发明提供含聚集物特异性结合试剂和固体支持物的组合物。因此，在优选的实施方式中，本发明提供肽聚集物特异性结合试剂，其中所述试剂包含KKKFKF、KKKWKW、KKKLKL或KKKKKKKKKKKK的氨基酸序列。在某些实施方式中，本发明提供肽聚集物特异性结合试剂，其中所述试剂包含由KKKKKK组成的肽。
在优选的实施方式中，本发明提供类肽聚集物特异性结合试剂，其中所述试剂包括
Figure BPA00001563392200801
其中R和R’是任何基团。
在某些实施方式中，本发明提供树突聚集物特异性结合试剂，其附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体，其中所述试剂包括
Figure BPA00001563392200812
本发明组合物的聚集物特异性结合试剂还可包含疏水性官能团。所述疏水性官能团可以是例如芳族或脂肪族疏水性官能团。在某些实施方式中，所述ASB试剂可包含官能团如胺基、烷基、杂环、环烷、胍、醚、烯丙基和芳族。这种芳族官能团包括萘、苯酚、苯胺、苯基、取代的苯基、硝基苯基、卤化苯基、联苯、苯乙烯基、二苯基、苄磺酰胺、氨甲基苯基、噻吩、吲哚、萘基、呋喃和咪唑。在某些实施方式中，所述ASB试剂包括重复基序。在其它实施方式中，所述ASB试剂进行可检测标记。
本发明还提供含固体支持物和上述聚集物特异性结合试剂的组合物。在优选的实施方式中，所述肽、类肽或树突聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约60nmol净电荷、每平方米至少约90nmol净电荷、每平方米至少约120nmol净电荷、每平方米至少约500nmol净电荷、每平方米至少约1000nmol净电荷、每平方米至少约2000nmol净电荷、每平方米至少约3000nmol净电荷、每平方米至少约4000nmol净电荷、每平方米至少约5000nmol净电荷、或每平方米至少约6000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，所述组合物附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
所述固体支持物可以是作为不溶性基质的任何材料，其具有可连接或结合感兴趣分子(例如本发明的试剂、构象蛋白、抗体等)的刚性或半刚性表面。示例性固体支持物包括但不限于：底物如硝酸纤维素、聚氯乙烯；聚丙烯、聚苯乙桸、乳胶、聚碳酸酯、尼龙、葡聚糖、几丁质、砂、二氧化硅、浮石、琼脂糖、纤维素、玻璃、金属、聚丙烯酰胺、硅、橡胶、多糖、聚氟乙烯、重氮化纸、活化珠、磁响应珠，和通常用于固相合成、亲和分离、纯化、杂交反应、免疫测定和其它这类应用的任何材料。所述支持物可以是颗粒或采用连续表面形式且包括膜、网、板、团块、玻片、盘、毛细管、中空纤维、针、大头针、芯片、固体纤维、凝胶(例如硅胶)和珠(例如，多孔玻璃珠、硅胶、任选交联有二乙烯苯的聚苯乙桸珠、枝接共聚珠、聚丙烯酰胺珠、乳胶珠、任选交联有N-N’-二-丙烯酰乙二胺的二甲基丙烯酰胺珠、氧化铁磁珠和包被有疏水性聚合物的玻璃粒。
本发明还提供用于实施本发明方法的药盒。通常，所述药盒包含前2段所述的组合物。
实施例
描述下列非限制性实施例用于说明。
实施例1测试试剂捕获聚集物的能力的试验
此实施例描述设计用于测试试剂结合聚集物能力的试验。
为评价这些试剂捕获蛋白聚集物的能力，采用前述错折叠蛋白测或MPA(Lau等，2007，PNAS，104：11551)(图3)。在此试验中，感兴趣的捕获试剂附于珠，所述珠用含正常单体和聚集蛋白混合物的感兴趣样品孵育以允许捕获，然后进行清洗以去除未结合的物质。此富集步骤后，采用洗脱缓冲液使捕获的物质从珠脱离并使任何聚集物变形。然后，所洗脱物质用于感兴趣蛋白特异性的夹心ELISA。用作有效捕获试剂的强聚集物结合试剂显示含单体和聚集物混合物的样品中有高信号，但仅含有生理水平单体蛋白的对照样品中没有。
实施例2描述采用此试验测试不同性质的试剂在加有寡聚β-淀粉样1-42(Barghorn等，Journal of Neurochemistry，2005中称为“球聚体”)的CSF中相对单体β-淀粉样1-42优先结合球聚体的能力。实施例3描述采用此试验测试多种类肽试剂在加有患病脑匀浆的缓冲液、CSF、或血浆中优先结合疾病相关聚集物的能力。实施例4描述采用此试验测试类肽试剂在来自病患的脑匀浆中相对正常对应单体优先结合多种疾病相关聚集物的能力。
实施例2评估试剂的结合能力
此实施例证明不同捕获试剂性质对其相较单体优先结合寡聚体能力的影响。具有总体正电荷和固体支持物上高电荷密度的试剂显示优先结合寡聚体的能力增加。此外，加入疏水性残基到所述试剂改善了优先结合，而试剂的具体支架不重要，只要其带正电荷。
蛋白聚集物可通过多种机制如离子键、氢键和疏水相互作用来结合捕获试剂。设计电荷、疏水性、和支架(树状聚合物、肽、类肽)变化广泛的一系列潜在聚集物特异性结合试剂以测试这些可能的结合模式(图1)。所述试剂通过以下方法偶联于磁性Dynal M270珠(图2)。
展示羧酸的珠用EDC和BMPH处理以产生展示马来酰亚胺的珠，通过迈克尔加成反应将硫化肽(或其它硫化有机分子)加成到该珠上。展示羧酸的Dynal M270磁化珠(30mg/mL珠)进行涡旋并置于15ml离心管(falcon)。将管放入磁体内，移出上清。用pH 5的0.1M MES缓冲液清洗珠2次，然后去除清洗缓冲液。加入偶联溶液(含33mM BMPH、130mM EDC的MES缓冲液)，管室温晃动30分钟。在1x MES，1x Tris，pH 7.5中清洗后，珠用Tris缓冲液(50mM Tris缓冲液，pH 7.5)淬灭15分钟。然后珠在磷酸盐缓冲液中清洗2次，加至含5mM硫化配体的脱气磷酸盐中。珠旋转21小时，然后在0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7，1x PBS中清洗并储存。
为制备球聚体，用六氟异丙醇孵育来单体化β淀粉样蛋白(1-42)。通过真空离心去除六氟异丙醇。然后，将DMSO、PBS和2％SDS加入样品。涡旋样品并超声处理，然后37℃孵育。6小时后，用水稀释样品，涡旋，37℃再孵育19小时。135000x g下4℃超高速离心样品1小时，保留上清。球聚体加标至CSF中用于试验。
偶联各种试剂的等分珠加入96孔板的孔内。将含球聚体加标CSF的Tris缓冲液加入各孔，板在37℃振荡孵育1小时。对于阴性对照，采用正常CSF，认为其仅含β淀粉样蛋白单体。用TBST清洗缓冲液洗涤珠，用变性溶液(通常是0.1-0.15N NaOH)洗脱结合物质。将重调缓冲液加入洗脱物，然后通过β淀粉样蛋白(1-42)特异性夹心ELISA检测β淀粉样蛋白。
电荷
首先，确定基于电荷的相互作用能否允许寡聚体捕获。测试含有带负电残基(例如天冬氨酸，D)、带正电残基(例如赖氨酸，K)和中性残基(例如组氨酸，H)的肽。代表性结果示于图4A。带负电(DDDDDD)和中性(HHHHHH)肽提供很少的寡聚物质富集，而带正电(KKKKKK)肽提供显著捕获。推测寡聚体上的带负电残基(或盐、脂质、或其它结合寡聚体的物质)与带正电的捕获肽相互作用。
疏水相互作用
尽管正电荷足以单独富集寡聚体，仍测试疏水相互作用以确定其是否提供额外的捕获效力。全部带正电的肽KKKKKK与含芳族疏水残基(例如色氨酸，W或苯丙氨酸，F)和脂肪族残基(例如亮氨酸，L)的肽作比较。肽KKKFKF和KKKWKW提供的捕获效率相较带脂肪族疏水残基或无疏水残基的对应肽增加(图4B)，证明加入芳族疏水残基改善了捕获。
替代的支架
为评价所述富集方法是否限于肽支架或其它带正电有机分子支架是否也能富集寡聚体，测试2种额外的支架：类肽和树突。类肽是N取代甘氨酸的直链聚合物，因此保留与肽类似的间隔，但是非手性且往往在溶液的构象不同于肽。树突是分支聚合物，与肽的结构相似性很小。在NMPA试验中，图1所示带正电的类肽和树突都能富集寡聚体(图4A)，证明肽支架对于捕获不重要。
为研究不同疏水性和电荷对类肽支架捕获寡聚体能力的影响，用掺杂球聚体-的CSF测试另一组类肽。图11显示所测试其它类肽的结构和电荷。均二苯乙烯和辛基类肽具有的疏水单体不同于初始PSR1类肽(苄基由较大的芳族均二苯乙烯或脂肪族辛基链取代)。短链和胍类肽具有的阳离子基团不同于初始类肽。短链类肽在侧链胺基和类肽主链间有乙基而不是丁基间隔区，胍具有比初始类肽更碱性的侧链。双重和三重类肽长度相对PSR1增加，因此每个配体有更多电荷。图12显示用这些类肽试剂的MPA试验结果。所有其它类肽与PSR1相似地捕获球聚体。
亲合力
上述结果显示净正电荷对于有效捕获重要，而特异性支架不太重要。因此，推测一种主要结合形式是通过离子相互作用。单独离子相互作用相对较弱，因而寡聚体和捕获试剂间的相互作用可具有亲合力成分，其中捕获效力是基于多个配体的组合强度。在这种情况中，表面上的配体密度是重要的。
为评价此可能性，制备一系列结合不同带正电类肽量的珠，从而各珠有不同的电荷密度展示。为测定配体加载量，采用胺基定量。将等分的珠置于磁场内，移出上清。将含80％苯酚的乙醇、含0.2mM KCN的吡啶/水、含6％茚三酮的乙醇加入各管。涡旋等分样品并100℃加热7分钟。冷却至室温后，加入60％乙醇。管放入磁场内，测定570nm处上清的吸光度。根据比尔定律测定珠的加载，使用15000M-1cm-1的消光系数。
将珠(3ul或15ul)加入样品，所述样品含有0.5ng/mL掺入球聚体的CSF中。如图5所见，捕获随着配体密度非线性增加，从而存在寡聚体捕获所需的最低密度。对于PSR1，优先结合球聚体的此界限是～5nmol配体/mg珠。鉴于每克珠有约2-5m2表面积，该值为约1500nmol配体/m2，或大致6000nmol正电荷/m2，假设所有胺基在pH 7.4分析条件下质子化。
完成额外的试验以评价捕获试剂结合效力与特异性捕获寡聚体所需最小电荷间的关系。制备一系列携带捕获试剂(肽KKKFKF，肽KKKLKL或类肽PSR1)的珠，加载密度范围为～6000nmol/m2-～15000nmol/m2。方法与上面2段所述相同，但采用1ng/mL球聚体并加入3μl珠。与上述关于电荷密度的初始试验类似，寡聚体捕获随着电荷密度呈指数式增加(图23)。在测试的最低加载密度(～6000nmol/m2)，仍能区分别背景和捕获的寡聚体。对于高效试剂如肽KKKFKF，估计少至500nmol/m2配体或2000nmol正电荷/m2足以选择性捕获寡聚体。
用偶联其它固体支持物的试剂，能观测到基于亲合力的捕获。PSR1用下段所示操作方案与纤维素膜偶联，在所述膜上可达到高许多的加载水平。PSR1加载增加比珠高约100x，继续提高PSR1在溶液中优先结合寡聚体的能力(图23)。
对于在膜上直接偶联类肽/肽：纤维素膜(沃特曼(Whatman)50)浸入10∶1∶90的表溴醇∶高氯酸∶二
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烷溶液，并室温孵育1-3小时。用甲醇清洗并干燥后，通过在纯三氧癸二胺中70C孵育1小时，胺化所述膜。清洗后，淬灭(在3M NaOMe中)膜，清洗并再次干燥。通过点上1ul 0.4M FmocGly溶液并孵育20分钟来标定点，所述溶液经含HOBT和DIC的NMP预活化。重复偶联且膜先用含2％乙酸酐的DMF和后用含2％乙酸酐/2％DIEA的DMF覆盖。膜用DMF清洗，用含4％DBU的DMF(2x 10-20分钟)去保护，DMF和甲醇清洗，然后干燥。将活化的马来酰亚胺丙酸(0.4M，有HOBt和DIC)加入膜上的点，重复偶联，用NMP、水和甲醇清洗膜。将含10mM硫化类肽的DMF/磷酸盐缓冲液的等分样(2ul)加至膜。重复硫化类肽添加，淬灭(用BME)并清洗(水、甲醇、DMF、和甲醇)膜，最后干燥待用。
为进一步探测此电荷密度效果，增加单个配体上的电荷以确定电荷/配体的增加是否能弥补表面电荷减少。比较2个带正电肽KKKKKK(加载水平：3.1nmol/mg珠)和KKKKKKKKKKKK(加载水平：1.6nmol/mg珠)(图6)。如果珠上的配体加载伴随减少，则每个配体的电荷数加倍(从6到12)不必定使捕获效力加倍。
亲合力和固体支持物选择
还通过比较PSR1类肽试剂的2个不同固体支持物，检测亲合力在寡聚体捕获中的作用。PSR1直接偶联于磁珠时，类肽配体的密度为～3.5μmol/m2，因此电荷密度为～14μmol电荷/m2。相反，结合于链霉亲和素包被磁珠的生物素-PSR1的密度为～0.033μmol/m2，因此电荷密度为～0.12μmol电荷/m2。比较这2种PSR1珠的寡聚体捕获能力以评价电荷密度水平不同的珠的效果。
等量的PSR1和2种不同输入水平：3或30μl直接偶联于PSR1的珠(30mg/ml，“PSR1珠”)或者10或100μl结合生物素-PSR1的链霉亲和素珠(10mg/ml，“b-PSR1珠”)用于MPA试验，使用80μl掺有球聚体的CSF和20μl 5x TBSTT的混合物。球聚体以其天然构象(“天然glob”)或作为单体(“变性glob”)加入用作阴性对照。球聚体在5M GdnSCN中室温变性30分钟。尽管使用等量的珠，但PSR1珠的电荷密度比b-PSR1珠高约1000倍。
PSR1珠显示对球聚体更高的灵敏度和特异性，而低密度b-PSR1珠显示有限的特异性和灵敏度(图13A和B)，进一步表明电荷密度对寡聚体捕获至关重要。
实施例3用各种含不同电荷的类肽聚集物特异性结合试剂和在不同电 荷密度下检测原纤维
此实施例描述用类肽试剂捕获原纤维聚集物。与实施例2所作结论相似，固体支持物上的总体正电荷和高电荷密度对于类肽试剂更加优先结合原纤维聚集物而不是单体至关重要。
制备作为生物素化衍生物的化合物，其可结合链霉亲和素衍生的磁珠用以测试(参见图14)。用亚单体法制备类肽，基本如前面Zuckermann等(J.Am.Chem.Soc.(1992)114：10646-10647；J.Am.Chem.Soc.(2003)125：8841-8845；J.Pept.Prot.Res.(1992)40：498)所述并通过HPLC纯化(图15，表6)。
缩写类肽以描述其亚单体的顺序和特性。类肽亚单体表示为：“+”指示在pH 7带正电荷的亚单体；“-”指示在pH 7带负电荷的亚单体；“A”指示芳族亚单体；“P”指示极性不带电亚单体。序列以N-＞C标注且包括生物素-(氨基己酸)2接头。“带正电”的“+”表示碱性官能团，预期在实施例所用条件下带正电。
表6.类肽的特征信息
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分析HPLC-MS：安捷伦(Agilent)1100，流速0.8ml/分钟，5-95％MeCN/H2O/TFA超过3分钟，100x 2.1mm 5μm海波西尔(Hypersil)ODS柱，214nm UV检测6分钟，注明MS模式。
制备HPLC：流速30ml/分钟，梯度如下，MeCN/H2O/TFA超过16分钟，30x 50mm SF C18柱，沃特世(Waters)探测器，214nm UV检测16分钟。
下拉朊病毒聚集物
图15a所示3种生物素化类肽类似物偶联到链霉亲和素衍生的磁珠上。还测试2种已知的珠偶联物-直接包被有PSR1(阳性对照)或谷胱甘肽(阴性对照)的Dynal M270珠。用错折叠蛋白测定分析5种珠偶联物(图3)。将所述5种珠偶联物加入96孔板的孔。来自感染朊病毒的仓鼠的10％脑匀浆(w/v)用作样品，已知这是错折叠形式朊病毒蛋白PrpSc的大聚集物的丰富来源。脑匀浆各以300、100和0nL/mL的3种水平加入缓冲液、脑脊液(CSF)和血浆。将脑匀浆溶液加入珠并旋转孵育一段时间，通常在37℃1小时。施加磁力于样品以从上清中分离珠所结合物质。去除上清后，用洗脱缓冲液使聚集物变性并将洗脱物质从珠脱离。然后，洗脱物质用于感兴趣蛋白特异性的夹心ELISA试验。
PrpSc捕获实验的结果示于图16。谷胱甘肽珠或不带电的珠(PAPAPA)中没有观察到信号。使用PSR1包被珠、PSR1的生物素化类似物(+++A+A)、含有6个正电荷的类肽(++++++)时在100或300ng/mL掺入水平观察到信号。用于缓冲液中所进行试验的这3种类肽-珠偶联物间信号没有显著差异，但PSR1包被珠和++++++在另2种基质中的信号相对PSR1的生物素化类似物(+++A+A)有适度增加。在无掺入样品中没有观察到信号。生物素化PSR1(+++A+A)和前述直接包被有PSR1的珠中观察到类似的捕获PrpSc信号/噪音水平，证明图14所示的库形式。携带6个正电荷的类肽也有效捕获PrpSc。
图15b所示的生物素化类肽类似物偶联于链霉亲和素衍生的磁珠上。如上所述测试来自感染朊病毒的仓鼠的脑匀浆，但仅研究0和300ng/mL掺入水平。这些实验的结果示于图17(数据一式三份显示)。所示数据是相对于缓冲液中包被有PSR1的珠(阳性对照，+++A+A)。总体正电荷最高的4种类肽提供的信号与含PSR1的缓冲液相当，而负电荷或中性电荷、两性离子类肽显示显著较低的信号。观察到掺入CSF或血浆的样品相对缓冲液试验信号减少，但正电荷类肽仍显示显著捕获。所带总体正电荷为+4和+7的类肽有效捕获PrpSc。对于携带3个芳族和4个正亚单体的类肽，亚单体的顺序不显著影响信号。
下拉Aβ聚集物
采用与上述朊病毒试验类似的方法评价类肽-珠偶联物的Aβ聚集物捕获。来自阿尔茨海默病患者的10％脑匀浆(w/v)用作阳性对照，因为已知这些样品富含Aβ(1-40)、Aβ(1-42)和tau的大聚集物。
对于Aβ(1-42)，将10nL 10％脑匀浆加入各孔，检测来自平行试验的信号(图18A)。来自这些实验的总体趋势显示与上述朊病毒捕获试验类似的倾向。具有低总体正电荷的类肽中观察到低信号，缓冲液中的捕获效力最强。为进一步研究带正电类肽捕获Aβ(1-42)的效力，进行着重于总体带正电类肽的第二实验(图18B)。在含有不同顺序的3个芳族和4个正电荷的类肽间观察到很少的序列特异性，然而有6个正电荷的类肽在血浆和CSF中提供的信号都大于有4个正电荷的类肽。
在CSF和血浆中观察到+++A+A(生物素化PSR1)与+++++++的Aβ(1-42)捕获的检测极限类似(图19)(CSF中的1.3和1.6nL/试验，血浆中的3.8和2.5nL/试验)。
所带总体正电荷为+4和+7的类肽在缓冲液中有效捕获Aβ(1-42)，在CSF和血浆中程度较低。对于有3个芳族和4个正亚单体的类肽，亚单体的顺序不显著影响信号。对+++A+A(生物素化PSR1)和+++++++观察到类似检测极限。
对于Aβ(1-40)，将1μL 10％脑匀浆加入各孔并检测来自平行试验的信号(图22A)。在此数据中观察到较大的信号变化，这些实验的总体趋势显示与朊病毒研究类似的倾向。一般，观察到用带较高正电类肽的试验对于缓冲液和CSF的信号更高。
-A-A-A-和---AAA-的结果与显示优先结合聚集物需要正电荷的先前发现不一致。然而，鉴于平行试验中的可重复性较差，此结果不具结论性且需要进一步确认。
为进一步研究带正电类肽捕获Aβ(1-40)的效力，进行着重于总体带正电类肽的第二实验(图22B)。使用带7个正电荷类肽的试验的信号与含4个正电荷的类肽一样高或比其更高。所带总体正电荷为+4到+7的类肽在缓冲液中有效捕获Aβ(1-40)，在CSF和血浆中捕获程度较低。对于有3个芳族和4个正亚单体的类肽，亚单体的顺序不显著影响信号。
下拉Tau聚集物
采用与上述朊病毒试验类似的方法评价类肽-珠偶联物的tau捕获。来自阿尔茨海默病(AD)患者脑的10％脑匀浆用作阳性对照，因为已知这些样品富含Aβ(1-40)、Aβ(1-42)和tau的大聚集物。作为对照，结果与正常脑匀浆作比较，正常脑匀浆应具有最低tau聚集物。比较包被有PSR1(+++A+A)的珠和包被有生物素化谷胱甘肽+++++++和-------的珠，显示PSR1(+++A+A)和(+++++++)在AD样品中的信号高于正常脑匀浆(NBH)，而2种样品中谷胱甘肽对照和-------类肽都具有类似信号。PSR1(+++A+A)具有最高信号(图20)。
检测珠上的PSR1密度在结合致病性朊病毒聚集物中的影响
由于假设上述实验中的分析物是蛋白聚集物，研究PSR1的捕获效力随着珠表面密度而变化。链霉亲和素磁珠用含不同比例的生物素化PSR1(+++A+A)和中性电荷对照类肽(PAPAPA)的溶液处理。从珠中洗去未结合的类肽后，混合珠与掺入叙利亚仓鼠脑匀浆的人血浆，所掺匀浆含有致病性朊病毒聚集物。洗去过量蛋白，从珠中洗脱朊病毒聚集物并用朊病毒蛋白特异性ELISA检测(图3)。如所预期，偶联有中性电荷对照类肽(PAPAPA)的珠在ELISA中产生最小信号，而仅偶联PSR1(+++A+A)的珠产生～35倍高的信号。与寡聚体试验中观察到的电荷密度要求一致，Bio-PSR1(+++A+A)电荷密度和信号间未见线性关联(表7和图21)。PSR1偶联物浓度从0增加到50％(～60nmol电荷/m2)产生4倍S/N增加，而进一步增加25％(～30nmol电荷/m2)到75％(～90nmol电荷/m2)产生几乎27倍的S/N增加。PSR1(+++A+A)偶联物浓度进一步增加到100％(～120nmol电荷/m2)比75％的读数产生适度的S/N增加。
表7.偶联PSR1(+++A+A)密度递增的链霉亲和素磁珠所捕获的总朊病毒信号
Figure BPA00001563392200911
实施例4：检测患者样品中的聚集物蛋白
此实施例证明图1所述类肽捕获试剂PSR1能在一些与错折叠蛋白聚集物相关疾病中区分单体和聚集物。
根据实施例1所述方法完成实验。将75nL 10％AD脑匀浆掺入1xTBSTT并用3ul PSR1珠孵育1小时。然后清洗PSR1珠，洗脱结合的Aβ42或tau聚集物，分别通过Aβ42和tau特异性夹心ELISA检测。
脑匀浆中的聚集物捕获
对获自苏黎世大学附属医院阿古兹博士(Adriano Aguzzi)的对照，变异型克雅氏病(vCJD)或阿尔茨海默病(AD)患者的脑匀浆进行NMPA。对于vCJD，检测朊病毒蛋白。对于AD，检测Aβ(1-42)和Tau。结果显示PSR1清楚区分对照与vCJD或AD样品(图24)。
实施例5：确定E22在球聚体捕获的作用
此实施例证明聚集物的电荷、结构和大小有助于其被附于珠的类肽聚集物特异性结合试剂识别。
如上所述，聚集物特异性结合试剂和聚集物间的电荷相互作用是结合机制的重要组成。实施例2证明带正电试剂提供显著的寡聚体捕获。因此，寡聚体上表面暴露的带负电残基可能参与结合这些试剂。β淀粉样原纤维和N-Met前球聚体的结构研究表明带负电E22残基是表面暴露的(Luhrs等，PNAS，2005；Yu等，Biochemistry，2009)。因此，进行研究以确定暴露的E22是否对于带正电捕获试剂PSR1捕获β淀粉样蛋白至关重要。
生成3种β淀粉样1-42肽来测试E22的作用：野生型肽，含有北极型突变E22G带中性电荷的突变肽，含有意大利型突变E22K带正电荷的突变肽。合成肽可市售获自艾纳斯拜公司(Anaspec)。
突变肽根据实施例3所述方法寡聚化。
E22G球聚体的SDS-PAGE和大小排阻色谱证明其结构与野生型球聚体类似(图7)。通过4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE(英杰公司)以120V用1.5-2小时分离寡聚体，凝胶用考马斯蓝染色。通过PBS中Superdex200柱上的SEC分离寡聚体，运行流速为1mL/分钟。收集1mL部分，由Aβ42特异性ELISA分析。
采用NMPA评估PSR1捕获E22G球聚体的能力。所用方法描述于实施例2。电中性E22G球聚体不为PSR1捕获(图8)，表明电荷相互作用是识别错折叠蛋白的关键因素。
评估E22K球聚体并通过SDS-PAGE与野生型比较。E22K球聚体形成SDS不稳定寡聚体，由约55千道尔顿的野生型带减少所指示(图9A)。寡聚体与戊二醛的交联显示E22K球聚体的分子量高于野生型(图9B)。
与电中性E22G突变球聚体相反，PSR1有效捕获带正电E22K球聚体(图10)。此结果证明结构和大小也有助于PSR1识别错折叠蛋白，蛋白结构上的带电表面对PSR1结合的作用大于净电荷。
实施例6：评估额外试剂的结合能力
此实施例显示其它带电和疏水试剂种类的结合能力且进一步证明不同捕获试剂性质对其结合优先结合寡聚体而不是单体的能力的影响。寡聚体捕获随着阳离子残基增加而呈指数增加，捕获对珠表面电荷分布的依赖性高于手性和取向，这一起表明结合是多模式相互作用。试剂的芳香性/疏水性增加可改善寡聚体捕获，但需电荷与疏水性之间的平衡以保持特异性。
材料和方法
如下所示设计一系列新的潜在聚集物特异性结合试剂，所述试剂如实施例2所述偶联于磁性Dynal M270珠。通常，7-12nmol配体(各候选聚集物特异性结合试剂)包被在1mg珠上。
将等分的珠(通常3ul)加入96孔板的孔，然后加入样品(有或没有掺入Aβ1-42球聚体(一种Aβ42寡聚体模型)的80∶20CSF∶TBSTT，通常125ul)。将板密封，37℃振荡孵育1小时。用去污剂(通常是聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯和n-十四烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸内酯)的水溶液清洗板以去除未结合的物质并去除剩余缓冲液。将变性溶液(通常是0.1-0.15NNaOH)加入各孔，板振荡加热至80℃持续30分钟。板冷却到室温后，加入中和缓冲液(通常是含0.12-0.18M NaH2PO3的0.4％吐温20)，板在室温短暂振荡。用Aβ42特异性ELISA或来自MSD公司(Meso Scale Discovery，马里兰州盖瑟斯堡)的MSD
Figure BPA00001563392200931
96孔MULTI-SPOT
Figure BPA00001563392200932
人/啮齿类动物[4G8]Aβ三重超灵敏测定分析板洗脱物。对于Aβ42特异性试验，样品从珠中洗脱，将检测抗体(4G8HRP)加入携带Aβ42特异性抗体12F4的板。板孵育1小时，清洗，加入底物(来自马里兰州罗克维尔的赛默飞世尔公司的SuperSignal WestFemto最高灵敏度底物)，测量发光。根据生产商说明以类似方式进行MSD板测定。
结果
正电荷数对寡聚体捕获的影响
在此实验中，鉴定特定支架内的优选电荷数。使用Ala/Lys肽框架，其中每包含一个Lys残基使肽净电荷增加+1。制备电荷递增(+1→+6)的6个六肽AAAKAA、AAKKAA、AAKKKA、AKKKKA、AKKKKK和KKKKKK，偶联于珠上。测试这些珠捕获以1ng/mL掺入CSF的Aβ1-42寡聚体的能力，结果示于图25。球聚体捕获水平(“421ng/ml”或实心柱)与无掺入的CSF中检测的Aβ1-42背景信号(“420ng/ml”)和无掺入的CSF中检测的Aβ1-40背景信号(“400ng/ml”)或掺入AB42寡聚体的CSF(“401ng/ml”)作比较。此实验中评估的各试剂偶联磁珠时的电荷密度示于下表8。
表8.带正电肽试剂的电荷密度
Figure BPA00001563392200933
此实验的结果显示球聚体捕获随着阳离子残基而增加(实心柱)，而来自CSF的背景Aβ1-42或1-40信号仍相对较低。这些研究表明此框架中的肽需要至少+2电荷以及～2-3μmol电荷/m2的电荷密度以捕获寡聚体。
基于此结果，还可研究电荷如何影响捕获。通过对pH 7的理论肽净电荷与捕获作图(如图26所示)，显示电荷与捕获间存在指数关系，表明电荷增加会显著改善捕获。还显示“信号”(Aβ1-42球聚体捕获水平)和“噪音”(Aβ1-40单体捕获水平)都随着电荷增加而增加，信号∶噪音的比例随着电荷增加而提高(参见下表9，“42∶40”柱)。
表9.Ala/Lys支架的带正电肽试剂捕获的信号与噪音水平
Figure BPA00001563392200951
“42”列中的数字代表获自掺入Aβ1-42球聚体的CSF样品用各肽试剂捕获的平均RLU。“40”列中的数字代表获自掺入Aβ1-40球聚体的CSF样品用各肽试剂捕获的平均RLU。“42∶40”列显示“42”与“40”的比例。
除了Ala/Lys支架，研究的另一具有+2净电荷但没有芳族残基的试剂是KIGVVR。与上述Ala/Lys支架上类似的实验在这一试剂上与PSR1并行进行。结果显示KIGVVR以与PSR1球聚体捕获水平相似的高水平捕获Aβ1-42球聚体，其在掺入Aβ1-40的CSF中具有与PSR1相似的低水平单体Aβ1-40噪音，在无掺入样品中有低背景。
手性、电荷相对珠的取向、主链取向对寡聚体捕获的影响
根据上述实验，看来Ala/Lys肽捕获的球聚体少于PSR1。PSR1也是阳离子且具有6个残基，但有2个特征区分其与Ala/Lys框架肽：2个芳族残基，以及不同的主链。为更好理解这些特征中哪个影响捕获效率，我们分开研究了这些特征中的每一个。
为鉴定优选的支架，研究PSR1和其肽类似物KKKFKF，并生成KKKFKF衍生物。设计与KKKFKF具有同一总体电荷模式的5种不同肽试剂以研究手性、电荷相对珠的取向、主链取向的影响(图27)。一种肽kkkfkf具有D异构体氨基酸而不是正常的L异构体。用与上面就带Ala/Lys支架的试剂所述相似的方法对这些试剂进行球聚体捕获试验。肽以约4-5nmol/mg珠或约4.8-6μmol/m2电荷偶联于磁珠。PSR1以约12nmol/mg珠或约14μmol/m2电荷偶联。测试结果示于图28，信号与噪音比较示于下表10。
表10.KKKFKF支架中带正电肽试剂捕获的信号与噪音
Figure BPA00001563392200961
试验结果显示尽管所有这些试剂都能捕获球聚体，电荷最接近珠的试剂(连接-KKKFKF、FKFKKK-连接和连接-kkkfkf)显著优于其余珠KKKFKF-连接和连接-FKFKKK(图28)。捕获改善一般独立于手性(比较连接-kkkfkf与连接-KKKFKF)和主链取向(比较连接-KKKFKF与FKFKKK-连接)。总体上，这种不依赖于取向和手性但依赖于相对珠的电荷密度表明，球聚体以多模式方式与试剂相互作用，而不是传统的小分子-蛋白“锁和钥匙”相互作用。
疏水性/芳族残基的影响
鉴于主链的改变仅适度影响捕获，我们接着研究芳族残基的效力，首先如上所示比较2种不同支架的+4六肽/六类肽试剂。这些试剂的RLU水平和信号∶噪音比的比较示于下表11。
表11.比较有或没有疏水/芳族残基的支架的+4六肽/六类肽试剂
根据此比较，看来+4Ala/Lys肽(AKKKKA)相较含芳族残基的其它试剂具有显著较低的球聚体捕获效率和更低的信号∶噪音比(表11)。这表明芳族和/或疏水残基对捕获效率有益。
为比较芳族与非芳族残基对聚集物结合的益处，设计额外的肽并在球聚体捕获试验中比较。试剂和试验结果示于图29。各试剂的右柱代表从掺入4ng/mL球聚体的样品中捕获并检测的Aβ1-42球聚体水平。结果显示芳族残基(由AKFKKK和FKFKKK的Phe代表)产生的球聚体捕获相对非芳族残基提高，尽管含非芳族疏水残基如脂肪族残基的试剂也捕获球聚体(图29)。值得注意的是，如AKFKKK所证明，即使肽中仅存在一个芳族残基就能显著增加球聚体捕获。
为进一步研究对疏水/芳族残基的要求，我们研究了一系列以带电残基更少和疏水含量更高为特征的肽。结果示于下表12。从中可观察到最疏水和带电最少的肽有效捕获球聚体(FKFSLFSG、FKFNLFSG和IRYVTHQYILWP)，但它们也捕获显著量的背景单体物质，表明此相互作用的特异性低于带电/疏水性质更平衡的肽。
表12.分析具有高疏水/芳族含量的试剂
总体上，这些结果表明珠结合试剂与寡聚体间的结合机制取决于亲合力。最优捕获效率用产生带电核心和疏水外部的偶联物实现，但这些试剂的确切序列/结构不太重要。支架变化(即肽相比类肽)和手性对于结合的重要性低于电荷分布，因此，具有D、L、天然氨基酸、非天然氨基酸、肽模拟物或具有相似带电和疏水特性的有机分子可显示类似的寡聚体捕获能力。最后，疏水含量增加使捕获效率提高，但降低对寡聚体形式的特异性，因此维持电荷与特异性之间的平衡对于有效寡聚体选择试剂重要。
多种测试的芳基
将多种替代的天然或非天然芳族残基引入肽支架以产生额外的聚集物结合试剂，如上所述测定新试剂的球聚体结合。
此研究所用肽支架是Ac-FKFKKK-连接(更具体为Ac-FKFKKK-Ahx-Ahx-Cys-NH2)，其结构如下所示。
苯丙氨酸形式：Ac-FKFKKK-连接
Figure BPA00001563392200981
苯丙氨酸用不同试剂中的不同类型芳族残基取代，由以下各天然或非天然残基表示。
Figure BPA00001563392200982
Figure BPA00001563392200991
还研究了肽支架Ac-KKKFKF-连接(更具体为Ac-KKKFKF-Ahx-Ahx-Cys-NH2)。苯丙氨酸用不同试剂中的不同类型芳族残基取代，由以下各非天然残基表示。
Figure BPA00001563392200992
这些带取代芳族残基的试剂的球聚体结合试验结果示于图30A、30B和30C。结果显示所有类型的取代芳族残基都能用于特异球聚体捕获。由此实验中各种试剂的捕获和检测水平的相似范围所反映的相对较平坦结构-活性关系，确认了此肽支架通常改善球聚体捕获。
设计另一肽试剂以在同一残基-带电芳族中掺入正电荷和芳族残基。此非天然肽的序列是Ala-AmF-AmF-Phe-AmF-Ala(AmF＝4-甲氨基苯丙氨酸，带电芳族残基)。肽结构如下所示。
Figure BPA00001563392200993
如上所述对此“带电芳族”试剂进行球聚体结合试验，结果示于图31。此实验再次证明带正电和芳族残基以及其结构灵活性的重要性。
芳族间隔的影响
生成一系列具有不同芳族间隔的肽试剂并在球聚体捕获试验中测试聚集物结合能力。这些试剂的序列分别包括KKKFKF、KKFKKF、KFKKKF和FKFKKK。检测的类似水平结果表明芳族间隔在聚集物捕获中作用极微(数据未显示，但所有这些试剂特异性捕获球聚体)。
伯胺间隔的影响
还研究伯胺间隔对聚集物捕获的影响。生成2种肽，一种含短链Lys类似物Fmoc-2，4-二氨基丁酸(“fdb”，具有α伯胺)，另一种含δ伯胺(δ氨基酸2，5-二氨基戊酸，缩写为“o”)。肽与带Ahx-Ahx-Cys-NH2接头的磁珠偶联，在球聚体捕获试验中测试聚集物结合能力。2种肽结构如下所示。
带不同间隔伯胺的球聚体捕获试验结果示于图32。从此结果看出带较短链Lys类似物从而伯胺更紧密的肽比具更远间隔伯胺的δ肽更有效，尽管它们都特异性捕获球聚体。
季胺加成
用4种含Ac-KKKFKF和3种结构如下所示(带仲胺的对照和2种不同季胺)的肽研究季胺加成到支架。肽偶联于带Ahx-Ahx-Cys-NH2接头的磁珠，如上所述测定球聚体捕获。检测的类似水平结果表明包含单一季胺在聚集物捕获中作用极微(数据未显示，但所有这些试剂特异性捕获球聚体)。
Figure BPA00001563392201011
测试的其它聚集物结合试剂
生成如表13和表14所示的一些其它肽试剂和类肽试剂并在上述球聚体捕获试验中测试。除了中性的Nbn-Nhye-Ndpc-Ngab-Nthf-Ncpm(118-6)，2张表中列出的所有其它肽和类肽试剂特异性捕获球聚体(参见图33A、33B和33C)。
表13：制备ASB试剂的其它肽和类肽序列
  肽/类肽序列   SEQ ID NO
  FFFKFKKK   49
  FFFFFKFKKK   50
  FFFKKK   51
  FFFFKK   52
  YGRKKRRQRRR   48
  RGRERFEMFR   47
  Nea-Ndpc-Napp-Nffb-Nme-Nthf   91
  Nall-Nhpe-Ncpm-Nchm-Ngab   92
  Nmba-Nfur-Nbn-Nlys-Nea-Nbsa   93
  Namp-Ncpm-Nhye-Nffb-Nlys-Nchm   94
  Nglu-Nlys-Nhpe-Nbsa-Nme-Nea   95
  (Nlys-Nspe-Nspe)4   96
  Nbn-Nhye-Ndpc-Ngab-Nthf-Ncpm   97
表14：制备ASB试剂的其它类肽序列的结构和净电荷
Figure BPA00001563392201031
实施例7：在膜阵列上筛选潜在的新聚集物特异性结合试剂
除了设计用于候选聚集物特异性结合试剂的肽或类肽序列，还测试纤维素膜中上所点的随机肽序列是否对聚集物的特异性结合超出单体。发现许多肽在此研究中特异性结合聚集物。
制成展示1120个随机12聚体肽的纤维素膜购自英属哥伦比亚大学的肽中心(加拿大温哥华，其服务目前通过http://www.kinexus.ca/可得)。该膜上的肽加载密度不易获得。然而，使用与生产商所述类似的膜阵列合成法，我们测得肽加载密度为约2-4mmol配体/m2，意味着带最低正电荷数+1的肽可能以2-4mmol净电荷/m2的相同密度包被于膜阵列上。我们用于包被随机肽的阵列合成法如下描述。
纤维素膜(沃特曼50)浸入10∶1∶90的表溴醇∶高氯酸∶二恶烷溶液，并室温孵育1-3小时。用甲醇清洗并干燥后，通过在纯三氧癸二胺中70C孵育1小时，胺化所述膜。清洗后，淬灭(在3M NaOMe中)膜，再次清洗并干燥。通过点上1ul 0.4M FmocGly溶液并孵育20分钟来标定点，所述溶液经含HOBT和DIC的NMP预活化。重复偶联且膜先用含2％乙酸酐的DMF和后用含2％乙酸酐/2％DIEA的DMF覆盖。膜用DMF清洗，用含4％DBU的DMF(2x10-20分钟)去保护，DMF和甲醇清洗，然后干燥。然后用标准固相合成法附着后续氨基酸，使用的循环包括：1)将活化Fmoc氨基酸溶液点到膜上，2)用乙酸酐覆盖，3)用DBU去保护。对最终的膜进行覆盖，DMF和甲醇清洗，干燥待用。
购自英属哥伦比亚大学的膜在1％牛奶溶液中孵育60分钟，清洗4次各10分钟，然后接触含3ng/mL Aβ1-42球聚体(“寡聚体”样品)或3ng/mL Aβ1-42单体(“单体”样品，如实施例2所述制备)的TBST溶液60分钟。清洗后，膜在稀释于1％牛奶的抗Aβ抗体(6E10)溶液中孵育60分钟。清洗后，膜接触稀释于1％牛奶的二抗(山羊抗小鼠-HRP)60分钟。清洗步骤后，化学发光底物(来自马里兰州罗克维尔赛默飞世尔公司的DURA WEST)加入阵列并在柯达(Kodak)成像仪上取图像。所得图像示于图34，在膜上的头等特异性结合剂中特异性结合球聚体的带正电肽如表15所示。表15也包括一些尽管不在头等特异性结合剂中但在膜上特异性结合球聚体的肽，因为它们之后在磁珠上确认。
表15：纤维素膜上特异性结合Aβ42球聚体的带正电肽
Figure BPA00001563392201051
表15选定的肽根据上述相同操作方案偶联于DYNAL珠，使用肽氨基末端的接头Ac-Cys-Lys-Ahx-Ahx。对于仅有一个带正电残基的肽，珠上这些试剂的电荷密度低至约4000nmol/m2，对于有超过1个带正电残基的肽则成比例提高。测试肽偶联珠在含生理水平Aβ40和42的CSF中结合Aβ42球聚体的能力。确认在珠上测试的表15所列全部序列包被珠时特异性结合Aβ42球聚体(表15，数据未显示)。
实施例8：用去污剂处理减少CSF中的结合背景
在此实施例中，研究来自生物样品如CSF对聚集物检测的潜在干扰，通过测试捕获后清洗步骤中的各种去污剂发现降低这种干扰的溶液。
首先，用PSR1偶联珠比较掺入正常CSF(来自健康人的合并CSF样品)的Aβ42球聚体与掺入缓冲液(TBSTT)的球聚体的检测极限(LoD)。结果显示掺入CSF时球聚体的LoD为约10pM，或掺入缓冲液时为约5pM，表明CSF样品具有高结合背景(数据未显示)。
其次，采用2种中性去污剂聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(作为吐温20来自密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司)和n-十四烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸内酯(作为两性洗涤剂3-14来自新泽西洲吉布斯敦EMD化学公司(EMD Chemicals))处理掺入球聚体的CSF样品，所述样品已接触PSR1珠。对于各试验，将30μl PSR1珠(以约7-12nmol PSR1配体/mg DYNAL珠包被，除非另有说明其用于此实施例和以下实施例)和70μl1X TBSTT的混合物立即用移液管吸入下拉板的各孔中。在磁性分离器上去除液体。加入50微升5X TBSTT到各孔。通过750rpm短暂振荡使珠悬浮。再添加200μl无球聚体的TBSTT或CSF样品到各孔。封闭下拉板并在500rpm振荡下37℃孵育1小时。孵育后，在板清洗仪上用TBST清洗珠8次。洗板后，在磁性分离器上从珠中去除剩余TBST缓冲液。然后，用100μl的TBS，1％吐温20或1％两性洗涤剂3-14以750rpm室温孵育珠30分钟，然后在板清洗仪上用TBST再洗8次。在磁性分离器上去除剩余TBST后，珠中加入20μl变性溶液，通常是0.1-0.15N NaOH。板用铝箔板密封器覆盖并在750rpm振荡下80℃孵育30分钟。孵育后，板冷却至室温，各孔加入20微升中和溶液，通常是0.12-0.18M NaH2PO4+0.4％吐温20，板在750rpm振荡下室温孵育5分钟。从洗脱物中磁性分离珠后，将上清转移到前面封闭的MSD ELISA板。根据生产商说明进行MSD Aβ三重试验。从CSF样品测得的Aβ42和Aβ40背景水平示于图35。结果显示用吐温20或两性洗涤剂3-14清洗使正常CSFAβ42的检测减少到PSR1仅用TBSTT缓冲液孵育时观察到的背景水平。它们还显著减少正常CSF Aβ40的检测，两性洗涤剂3-14看来在减少正常CSFAβ40检测水平方面优于吐温20。
其次，研究去污剂处理在掺入球聚体的样品中的作用。各种浓度的Aβ42球聚体(0-25pg/mL)掺入到200ul TBSTT或CSF。CSF样品与50ul 5xTBSTT混合，然后样品接触30μl PSR1珠。如上所述进行捕获、清洗和检测步骤。掺入不同基质并用不同清洗缓冲液处理的球聚体Aβ42检测水平结果，以及计算的信号/噪音(其中信号是样品的RLU且噪音是来自等同处理样品但未掺入球聚体的信号)如图36所示。结果显示在PSR1下拉后用两性洗涤剂3-14或吐温20处理掺入球聚体的CSF样品，改善球聚体检测的信号/噪音。
计算基于S/N＝2的MPA球聚体检测LoD以及在25.3pg/mL球聚体掺入水平的信号/噪音比并示于下表16。计算结果表明两性洗涤剂3-14和吐温20还使CSF中的球聚体LoD显著降至缓冲液中的球聚体LoD。
表16：捕获后用不同清洗缓冲液处理样品的球聚体检测RLU和计算的LoD及S/N
Figure BPA00001563392201071
最后，根据此实施例所述方法测试多种去污剂，发现一些会减少CSF样品的背景Aβ聚集物结合。测试的去污剂和其结构示于图37。下表17小结了测试结果和计算的信号/噪音。
表17：捕获后用不同去污剂处理的样品的球聚体检测RLU和计算的S/N
Figure BPA00001563392201081
a：Aβ42球聚体掺入/未掺入的S/N＝(有0.5ng/mL球聚体的样品的Aβ42RLU)/(有0ng/mL球聚体的样品的Aβ42RLU)
b：Aβ42球聚体掺入/Aβ40的S/N＝(有0.5ng/mL球聚体的Aβ42RLU)/(有0ng/mL球聚体的样品和有0.5ng/mL球聚体的样品的平均Aβ40RLU)
结果显示具有较长碳链的两性洗涤剂(两性洗涤剂3-14和3-16)更显著改善Aβ42球聚体检测的信号/噪音比。在另一实验中，具有较长碳链的两性洗涤剂特别是两性洗涤剂3-16，在AD CSF中更加显著改善Aβ40聚集物捕获S/N(数据未显示)。
以下去污剂减少CSF样品的背景Aβ聚集物结合并导致Aβ42球聚体掺入/Aβ40的S/N大于1.0。
吐温20(聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯)、两性洗涤剂3-14(n-十四烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸内酯)、两性洗涤剂3-16(n-十六烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸内酯)、两性洗涤剂3-12(n-十二烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸内酯)、ASB-14(氨基磺基甜菜碱-14，3-[N，N-二甲基(3-十四酰氨丙基)氨基]丙磺酸内酯)、ASB-16(氨基磺基甜菜碱-16，3-[N，N-二甲基-N-(3-棕榈酰胺丙基)氨基]-丙-1-磺酸内酯)、ASB-C8苯酚(4-n-辛基苯甲酰氨-丙基-二甲氨基磺基甜菜碱)和EMPIGEN BB(N，N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱)。它们都可获自西格玛奥德里奇公司和/或EMD化学公司。
实施例9：聚集物特异性结合试剂的构象特异性
此实施例描述PSR1和PSR1肽类似物-Ac-FKFKKK的构象特异性。
材料和方法
如前所述制备Ab42聚集物：根据Stine等(JBC 2003，278，第11612页)制备原纤维，根据Barghorn等(J Neurology 200595第834页)制备球聚体，根据Lambert等(PNAS 1998，95第6448页)制备ADDL，根据Noguchi等(JBC2009 284第32895页)制备ASPD。正常CSF合并自临床表征性非痴呆患者CSF样品。AD CSF合并自临床表征性AD患者样品。阿尔茨海默病脑匀浆(ADBH)通过超声波处理含临床诊断AD患者脑样品的0.2M蔗糖(1∶10w/v)制备。
对于天然凝胶，各样品上样到4-20％梯度凝胶并在天然条件下运行5小时，考马斯染色处理(简单蓝色安全染色(simply Blue Safe Stain))。
对于捕获试验(错折叠蛋白测定)，将等分的珠(30ul)加入96孔板，再加入125ul 80∶20CSF∶TBSTT中的样品。封闭板并在37C振荡孵育1小时。用TBST清洗板且去除剩余缓冲液。添加变性溶液(0.1N NaOH)到各孔，板振荡加热至80C持续30分钟。板冷却到室温后，加入中性缓冲液(0.12MNaH2PO3-0.4％TW20)，板在室温短暂振荡。用三重MSD(MesoscaleDiscovery)ELISA试剂盒分析试验的Aβ。根据生产商操作方案检测洗脱自珠的样品中的Aβ。
对于检测极限(LoD)研究，将各聚集物的连续稀释掺入CSF并根据上述操作方案分析。LoD定义为超过背景水平2x。
为区分AD和正常CSF，根据上述操作方案分析合并的正常CSF或合并的阿尔茨海默病患者CSF。
结果
选择7种具有不同大小和形状的Aβ物质用于结合研究
表18 Aβ物质
  模型   组分   大小   形状   参考
  单体   Aβ42   ～5KDa   无结构？   N/A
  球聚体 Aβ42，DMSO，SDS   ～60KDa   球状   Barghorn等
  ADDL   Aβ42，介质？   KDa-MDa   胶束，纤维状   Klein等
  ASPD   Aβ42，介质？   KDa-MDa   胶束，纤维状   Hoshi等
  原纤维   Aβ42   MDa   纤维状   多项
  ADBH Aβ40，Aβ42，+？   MDa   纤维状？   N/A
天然凝胶分析
进行天然凝胶分析以鉴定不同Aβ物质(图38)。所有的测试聚集物具有中等同质性。所有都包含一定量的单体。除了球聚体外都具有不进入凝胶的大物质。球聚体显示为最小的测试模型。ASPD和ADDL显示相似性质。
试剂的捕获概况
用错折叠蛋白测定的捕获研究显示PSR1能捕获多种聚集物构象和大小。所有聚集物种类都由PSR1以亚fmol水平捕获。
表19 PSR1对聚集物的LoD
Figure BPA00001563392201101
ASR1和Ac-FKFKKK普遍以相似的结合优先性结合测试的所有不同聚集物种类。LoD的实际数量取决于CSF和聚集物批次。
表20试剂对聚集物的LoD
LoD证明捕获较大纤维状物质＞较小寡聚体物质＞＞单体的优先性。此模式反映了用3ul PSR1珠和1ng/mL聚集物测试这些物质时观察到的捕获选择性。
表21试剂对聚集物的LoD
Figure BPA00001563392201111
区分AD和正常CSF
测试试剂以鉴定用于区分AD和正常CSF的试剂。参见图39。PSR1和Ac-FKFKKK都显示在阳性的合并AD CSF中的Aβ40信号高于未匹配的正常合并，表明该试剂体内捕获AD CSF中存在的Aβ40聚集物。Ac-FKFKKK提供最大的信号变化。
实施例10：通过差异离心分析AD CSF中Aβ40寡聚体的大小
此实施例描述通过PSR1从阿尔茨海默病中捕获的聚集物的物理性质鉴定。
材料和方法
AD CSF或正常的合并CSF无掺入物质、掺入5ng/mL球聚体或200nL/mL ADBH(有或没有超声处理)，在4C 16,000xg离心10分钟或134,000xg离心1小时。将上清和团块部分取至分开的管(团块在CSF中重构至体积与初始样品相同)并进行错折叠蛋白测定(MPA)。
错折叠蛋白测定：100ul样品用25ul 5xTBSTT缓冲液(250mM Tris、750mM NaCl、5％吐温、5％曲通X-100pH 7.5)和30ul PSR1珠37C孵育1小时。珠用TBST洗6x，然后用1％两性洗涤剂3-14孵育30分钟，再用TBST洗。Aβ肽用0.15M NaOH室温洗脱30分钟，然后用0.18M NaH2PO4+0.5％吐温20中和洗脱物，根据生产商说明通过Mesoscale公司的三重Aβ免疫试验检测。
结果
确定已知大小的各种聚集物的表现以提供用于阿尔茨海默CSF中发现的聚集物的分子量参比。尽管聚集物溶解度未必与分子量呈线性关系(且根据聚集物构象而变化)，但这些研究提供一些聚集物大小的参考框架。来自未经超声处理的阿尔茨海默病脑匀浆(ADBH)的Aβ原纤维在16,000g和134,000g都沉淀。这些聚集物在TSK4000柱空体积附近洗脱且可能大于1MDa。来自超声处理ADBH的一些Aβ聚集物部分在16,000g可溶，但在134,000g沉淀。大小排阻色谱估计这些聚集物为约0.5-1MDa。球聚体(估计为约54KDa)在16,000g和134,000g都可溶。
AD CSF中的内源Aβ40寡聚体在134,000g离心1小时后留在溶液中，表明它们可能小于在经超声处理ADBH样品中所见0.5-1MDa的“中间大小”聚集物。这些数据表明AD CSF中所见寡聚体与组织中(ADBH)沉积的聚集物相比溶解度有不同表现，提示它们尺寸更小。
实施例11：在有脾AA的小鼠中检测AA蛋白
此实施例证明PSR1优先结合血清淀粉样A聚集物，所述聚集物在AA淀粉样变性和某些慢性炎症病例中发生。
材料和方法
动物
采用近交的8-10周龄C57BL/6J小鼠。所有小鼠维持于无特定病原体条件下。饲养和实验操作是根据瑞士动物福利法且符合苏黎士州立兽医办公室的规章。
诱导淀粉样变性
淀粉样促进因子(AEF)如前所述[1]提取自淀粉样沉积的肝，用于在4组不同小鼠中诱导淀粉样物质。各小鼠在尾静脉以静脉注射接受20ug蛋白提取物，通过伴随皮下注射0.2ml 1％硝酸银(AgNO3)来刺激全身炎症。在第7、14和21天每周一次给予进一步炎症刺激。在第5、9、16和23天的数个时间点处死小鼠。对照小鼠仅接受一次硝酸银注射且在16小时后处死。
组织学
脾在10％中性缓冲福尔马林中固定并在石蜡中包埋。刚果红染色后在5um切片中研究淀粉样物质的存在[2]，淀粉样物质的量根据以下标准定量：0；没有；1+痕量淀粉样物质；2+小淀粉样沉积；3+中等淀粉样沉积；4+大量淀粉样物质[1]。
组织制备
使用超声组织匀浆器在PBS，pH 7.4中制备10％脾匀浆。匀浆在200xg离心1分钟，上清用于基于PSR1珠的捕获试验。对于免疫印迹分析，PBS不溶性组织团块在8M尿素中室温在轮上溶解24小时。
从脾匀浆中基于PSR1珠捕获AA物质
PSR1偶联珠用1ml TBS-TT(TBS，1％曲通X，1％吐温20)洗2次，然后用总体积100μl的含10％脾匀浆的TBS-TT在750rpm振荡下37℃孵育1小时。通过用1ml TBS-T(TBS，0.05％吐温20)洗5次，从珠中去除未结合的物质。然后，珠重悬于50ul TBS-T，捕获的蛋白用75ul变性缓冲液(1M NaOH pH12.3)分别在750rpm或1200rpm振荡下37℃或80℃洗脱10分钟。因此，样品用30ul 1M NaH2PO4，pH 4.3分别在750rpm或1200rpm振荡下37℃或80℃中和10分钟。从珠中吸出150ul洗脱物，用来自三德达有限公司(Tridelta Ltd.)的小鼠SAA ELISA或通过免疫印迹分析SAA/AA蛋白的存在。测试了3、6和9ul PSR-1珠以及1、4和8ul 10％脾匀浆和其比例。
免疫印迹
样品加热至95℃持续5分钟，然后经10-20％Tris-Tricine(三羟甲基甲基甘氨酸)预制凝胶(英杰公司)电泳，接着通过湿印迹转至硝酸纤维素膜。为检测小鼠SAA/AA蛋白，采用2种不同一抗：抗小鼠SAA抗体(1∶1000；三德达有限公司)和多克隆抗小鼠SAA/AA抗体(1∶1000)，后者由GunillaWestermark教授(瑞典乌普萨拉大学)友情提供。二抗分别是山羊抗大鼠-HRP(1∶8000)和山羊抗兔-HRP(1∶10000)。用SuperSignal West Pico化学发光底物(皮尔斯公司)显现蛋白带并在Stella检测器(雷泰公司(Raytest))中暴露印迹。
结果
PSR1包被珠能捕获AA相关部分：
为测试PSR1包被珠能否捕获AA相关部分，用3或9uL PSR1包被珠(30mg/mL)进行MPA，使用来自患脾AA小鼠(由刚果红染色进行组织学评价的评分为3+，图41)的1、4或8uL 10％w/v脾匀浆和对照未处理小鼠作为输入。使用抗小鼠SAA抗体对珠、洗脱物和PSR1耗尽的输入部分进行蛋白质印迹分析，显示仅在含AA样品的洗脱物、珠部分中有短片段，其电泳迁移率与分子量标记的一种7kDa组分相似(图42a-c)。还通过小鼠SAA夹心ELISA，测试用3uL PSR1珠进行MPA的洗脱物部分。仅在含AA样品的洗脱物中能检测到SAA(图42d)。
在一些试验管中，捕获AA部分的洗脱不是最优的，也能在珠部分的免疫印迹上测得信号(图42c)。因此，测试更严谨的洗脱条件(80℃和1200rpm)。这些条件产生AA捕获部分的完全洗脱(图43)。来自淀粉样阴性但AgNO3致敏动物的脾匀浆或来自未处理动物的脾匀浆进行MPA测定时洗脱物中未检测到信号(图43)，前一种脾匀浆在循环中具有很高水平的全长SAA。重要的是，对于此免疫印迹，采用另一抗小鼠SAA抗体去除来自淀粉样阳性样品的洗脱物中的一些较短AA片段。
这些实验表明PSR1包被珠能捕获AA相关部分。
AA聚集物的变性阻止AA相关部分的检测：
为测试AA相关部分的PSR1捕获是否限于聚集物，对变性、缓冲和未变性的含AA样品，以及来自对照AgNO3处理小鼠和对照未处理小鼠的脾匀浆进行MPA。通过ELISA测试洗脱物部分。仅在来自未变性或缓冲的含AA样品的洗脱物中能测得SAA(图44)。这些数据表明输入物质的变性通过防止由/从PSR1包被珠捕获和/或洗脱AA相关部分来干扰MPA，PSR1珠对这些部分的捕获在测试条件下是聚集物特异性的。
参考文献
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实施例12：检测糊精聚集物
此实施例证明PSR1优先结合在II型糖尿病中发展的糊精聚集物。更具体地，此实施例描述PSR1如何优先结合糊精原纤维而不是单体，无论糊精是体外生成或提取自胰腺组织。
材料和方法
通过在10mM Tris缓冲液(pH7.5)中以100uM重构单体糊精肽并室温孵育超过3天，体外生成糊精原纤维。在蔗糖溶液中制备10％胰腺组织匀浆。通过合并1体积样品与9体积6M硫氰酸胍并室温孵育至少30分钟，使样品变性。
通过Linco人糊精(总)ELISA试剂盒(密理博公司(Millipore)，目录号EZHAT-51K)检测样品中的单体糊精，通过MPA(错折叠蛋白测定)使用PSR1珠检测聚集的糊精。为运行PSR1，将天然或变性样品(体外模型或组织)掺入缓冲液或正常人血浆，接触PSR1或阴性对照珠。孵育后，清洗珠，洗脱结合于珠上的聚集糊精，由6M硫氰酸胍变性。然后，洗脱物稀释到样品缓冲液中，用上述Linco人糊精(总)ELISA试剂盒通过ELISA检测。
结果
体外合成糊精
图45A和B证明MPA在缓冲液和血浆中都检测糊精体外原纤维，但不检测单体。
来自胰腺组织的内源糊精
来自II型糖尿病患者的胰腺组织相较正常胰腺组织含有高浓度的聚集糊精。然而，此聚集糊精不能直接由ELISA检测，除非样品变性成单体形式(参见图46)。
当运行MPA试验时，在掺入人血浆的II型糖尿病患者胰腺组织中测得聚集的糊精。样品变性使聚集的糊精转变成单体破坏MPA的检测(图47)。
在II型糖尿病患者胰腺组织中检测到聚集的糊精是由于PSR1特异性结合糊精原纤维。图48显示掺入血浆的相同II型糖尿病胰腺组织结合PSR1，但不结合具有中性谷胱甘肽或类肽(5L)的对照珠，该类肽是PSR1的带负电形式。
实施例13：检测α-突触核蛋白
此实施例证明PSR1优先结合在帕金森病以及其它共核蛋白病如高雪氏症、多系统萎缩、路易体痴呆中发展的α-突触核蛋白聚集物。
材料和方法
ELISA
如J.Biological Chem.(1999)274，28期第19509-19512页所报道制备糊精原纤维。为变性原纤维，样品用5.4M硫氰酸胍室温处理30分钟。然后，样品稀释成指定浓度，根据生产商说明通过夹心ELISA(英杰公司；目录号KHB0061)检测α-突触核蛋白。
错折叠蛋白测定
通过用带纤维状α-突触核蛋白的3ul PSR1珠孵育来测试PSR1珠对聚集的α-突触核蛋白的特异性，所述蛋白经或未经化学变性剂预处理(5.4M硫氰酸胍室温30分钟)。α-突触核蛋白以指定浓度稀释于125ul 80％CSF或含血浆的TBSTT(50mM Tris，150mM NaCl，1％曲通X-100，1％吐温20)。样品在37C和550rpm孵育1小时，然后用TBS 0.05％吐温20缓冲液洗。用4ul 6M硫氰酸胍从珠中洗脱结合的α-突触核蛋白(室温30分钟)，用246ul ELISA稀释缓冲液稀释，然后通过夹心ELISA(英杰公司；目录号KHB0061)检测。还用对照珠(偶联谷胱甘肽的Dynal珠)检测α-突触核蛋白原纤维与珠的非特异性结合。
结果
PSR1珠结合α-突触核蛋白原纤维
α-突触核蛋白(aSyn)原纤维不由夹心ELISA(英杰公司；目录号KHB0061)检测，除非它们用变性剂预处理，所述变性剂使隐藏在原纤维内的抗体表位暴露。仅能测得胍处理的α-突触核蛋白原纤维，表明变性为聚集物组成单体的最优检测所必需。由于难以变性含低浓度聚集物的大体积样品，PSR1是捕获并富集这些聚集物的有用工具。参见图49。
相较偶联有谷胱甘肽分子的对照珠(CTRL)，用于错折叠蛋白测定(MPA)的PSR1珠特异性结合稀释于CSF或血浆的α-突触核蛋白(aSyn)原纤维。参见图50。
用于错折叠蛋白测定的PSR1珠优先结合稀释于CSF或血浆的α-突触核蛋白原纤维(天然aSyn原纤维)，但不结合用化学变性剂预处理原纤维而产生的α-突触核蛋白单体(变性aSyn)。PSR1能从含过量aSyn单体蛋白的生物基质中捕获和富集低水平aSyn原纤维，证明对聚集的aSyn的显著选择性。参见图51。
α-突触核蛋白原纤维的MPA测定洗脱条件的优化
为优化在MPA测定中使用PSR1珠检测α-突触核蛋白原纤维的条件，测试不同洗脱条件1)6M GdnSCN 30分钟和2)0.10N NaOH 10分钟。0.1NNaOH洗脱10分钟表现优于硫氰酸胍洗脱。参见图52。
实施例14：PSR1-朊病毒的小鼠感染性
此实施例证明PSR1优先结合朊病毒蛋白的感染形式。
材料和方法
制备仓鼠血浆
处于1个月断奶期的叙利亚金仓鼠腹膜内接种100μl感染263K的1％仓鼠脑匀浆(w/v)或100μl 1％未感染仓鼠脑匀浆，前一种脑匀浆预计为107LD50感染单位(Kimberlin和Walker，1986)。之后，在接种后0、30、50和80天处死仓鼠，通过心脏穿刺在EDTA-抗凝剂存在下收集血。也在出现共济失调、弱理毛、食欲不振临床体征的症状期处死动物并取样。单独血样以950xg离心10分钟，上清部分中的血浆转至另一管并-80℃冷冻。
基于珠的PrPSc捕获
对于灵敏度试验，将30μl连续10倍稀释的含263K感染10％脑匀浆的PBS脑内接种到Tg(SHaPrP)小鼠中(组＝4-8)(Scott等，1989)。
对于PSR1捕获试验，来自11只在接种后143天和154天处死的有症状仓鼠的血浆合并成库1，来自14只在接种后104-106天处死的有症状仓鼠的血浆合并成库2，来自20只在接种后50天处死的症状发生前仓鼠的血浆合并成库3，来自15只在接种后117-118天处死的有症状仓鼠的血浆合并成库4。21μl PSR1偶联珠((Lau等，2007)；Gao等.2010，论文投稿)在1ml PBS(8mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4，137mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.4)中洗5次，然后用500μl收集的仓鼠血浆在振荡器上4℃孵育过夜。
通过用1ml PBS或TBSTT洗5次，从珠中去除未结合的物质。珠重悬于60μl或120μl PBS，分别将30μl重悬浮的珠脑内接种到Tg(SHaPrP)小鼠，所述小鼠的组中至少有4只小鼠。
每2天监控小鼠，根据包括共济失调、颤动和后腿轻瘫在内的临床标准诊断TSE(传染性海绵状脑病)。在绝症发病时，处死Tg(SHaPrP)小鼠。小鼠维持于常规条件下，所有实验根据苏黎世州的动物福利法进行。
组织学和免疫组化染色
在带正电硅烷化载玻片上切割2μm厚切片，用苏木精和曙红染色，或用PrP的抗体(SAF84)、星形细胞的抗体(GFAP)免疫染色。对于PrP染色，切片去石蜡，在98％甲酸中孵育6分钟，然后在蒸馏水中洗5分钟。
切片在高压锅中于柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)内加热至100℃，冷却3分钟至室温，在蒸馏水中洗5分钟。在自动NEXES免疫组化染色设备(文塔纳医疗系统公司(Ventana Medical Systems)，瑞士)上用IVIEW DAB检测试剂盒(文塔纳公司)进行免疫组化染色。蛋白酶1(文塔纳公司)孵育16分钟后，切片用抗PrP SAF-84(SPI bio；1∶200)孵育32分钟。用苏木精复染切片。类似进行用于星形细胞的GFAP免疫组化(兔抗小鼠GFAP多克隆抗体1∶1000持续24分钟；DAKO)，然而通过在EDTA缓冲液(pH＝8.0)中加热至100℃进行抗原修复。
用根据Taraboulos等，1992的改良标准操作进行组织印迹分析。10μm厚冷冻切片装于载玻片上并立即压至硝酸纤维素膜(Protran，Schleicher和Schuell)，用裂解缓冲液(10mM Tris，100mM NaCl，0.05％吐温20，pH 7.8)浸透并空气干燥。蛋白转移后，切片在TBST中再水化1小时，然后以20、50和100μg/mL在含100mM NaCl和0.1％苄泽35的10mM Tris-HCl pH 7.8中37℃蛋白酶K消化4小时。膜在TBST中洗3次后，用含3M硫氰酸胍的10mM Tris-HCl，pH 7.8室温进行变性步骤10分钟。洗膜并用5％脱脂牛奶(TBST中)封闭，用1∶10000的抗PrP抗体POM-1(表位在球状结构域中，氨基酸121-231)4℃孵育过夜(Polymenidou等，2008)。再次清洗印迹并加入碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠抗体(DAKO，1∶2000)。另外用TBST和B3缓冲液(100mM Tris，100mM NaCl，100mM MgCl2，pH 9.5)进行清洗步骤，然后是45分钟的BCIP/NBT(罗氏(Roche))显影步骤。显色步骤用蒸馏水终止。干燥印迹并用奥林巴斯(Olympus)SZX12双目镜和奥林巴斯相机拍摄照片。
蛋白质印迹
用Precellys24(贝尔丁公司(Bertin))在0.32M蔗糖中制备10％脑匀浆。50-90μg蛋白提取物用含50μg/mL蛋白酶K的DOC/NP-400.5％在37℃消化45分钟。通过加入3μl完全蛋白酶抑制剂混合物和8μl基于十二烷基月桂烷硫酸酯(LDS)的样品缓冲液来终止反应。样品加热至95℃持续5分钟，然后经12％Bis-Tris预制胶(英杰公司)电泳，接着通过湿印迹转至硝酸纤维素膜。通过用抗PrP POM1抗体(1∶10000)4℃孵育过夜来检测蛋白。对于二次检测，使用HRP偶联的抗小鼠IgG抗体(Zymed，英杰公司)。用ECL检测试剂盒(皮尔斯公司)显现信号。
结果
在Tg(SHaPrP)中测定263K仓鼠品系效价的灵敏度试验
为对PSR1珠从血浆中捕获的朊病毒感染性生成标准曲线，我们将来自10(重量/体积)％263K仓鼠脑匀浆的10倍连续稀释物以终点形式脑内接种到Tg(SHaPrP)小鼠，所述小鼠32倍过量表达仓鼠朊病毒(Scott等，1989)(图53，表22)。40-98天的平均接种时间后，以10-2-10-8稀释接种的小鼠发展出临床体征。由于尚未到达终点，进行进一步稀释以获得完整标准曲线。
表22：Tg(SHaPrP)中263K接种物终点效价小结
Figure BPA00001563392201191
Figure BPA00001563392201201
a稀释起始于10％脑匀浆。
Tg(SHaPrP)小鼠中用来自朊病毒感染仓鼠的血浆包被PSR1珠的生物测定
PSR1珠用合并自症状发生前或有症状组的263K朊病毒感染仓鼠的血浆样品孵育(表23)，皮内(i.c.)接种到Tg(SHaPrP)小鼠中。用来自症状小鼠血浆库的珠接种的小鼠在接种后74-94天的平均孵育时间发展出疾病(图54，表23)。用获自症状发生前仓鼠的珠接种的小鼠在接种后56和85天发展出疾病(图54，表23)。观察到的孵育时间与10-7-10-8感染性稀释的30μl 263K仓鼠脑匀浆相关。
通过组织病理学和免疫组化分析(图54)以及在组织印迹和蛋白质印迹分析中检测蛋白酶K耐受性物质(图55)体现临床上患病小鼠中朊病毒病的发生。
这些数据显示PSR1珠从感染朊病毒的血样中捕获朊病毒传染性并以高效率传至Tg(SHaPrP)小鼠。
表23：接种有血浆包被PSR1珠的Tg(SHaPrP)小鼠的生物测定小结
Figure BPA00001563392201202
参考文献
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Figure IPA00001563391700011
Figure IPA00001563391700021
Figure IPA00001563391700031
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Figure IPA00001563391700301

Claims (133)

1.一种检测样品中聚集物存在的方法，所述方法包括步骤：
将怀疑含聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物；和
通过所述被疑存在的聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述聚集物的存在；
其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，
以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和
附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
2.一种检测样品中聚集物存在的方法，所述方法包括步骤：
将怀疑含聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在的聚集物结合形成复合物的条件下接触；
将所述复合物与构象蛋白特异性结合试剂在允许结合的条件下接触；和
通过所述被疑存在的聚集物与所述构象蛋白特异性结合试剂的结合，检测所述聚集物的存在；
其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，
以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和
附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在形成所述复合物后去除未结合的样品。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述构象蛋白特异性结合试剂是抗体。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述聚集物包括Aβ蛋白且所述构象蛋白特异性结合试剂是抗Aβ抗体。
6.一种检测样品中聚集物存在的方法，所述方法包括步骤：
将怀疑含聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在的聚集物结合形成第一复合物的条件下接触；
去除未结合样品；
从所述第一复合物中脱离所述聚集物从而提供脱离聚集物；
将所述脱离聚集物与第一构象蛋白特异性结合试剂在允许结合形成第二复合物的条件下接触；和
通过检测所述第二复合物的形成，检测所述被疑存在聚集物的存在；
其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，
以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和
附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二复合物的形成用带可检测标记的第二构象蛋白特异性结合试剂检测。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一构象蛋白特异性结合试剂与固体支持物偶联。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚集物通过将所述第一复合物接触异硫氰酸胍而从所述第一复合物脱离。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚集物通过将所述复合物接触高pH或低pH而从所述第一复合物脱离。
11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚集物包括Aβ蛋白且所述构象蛋白特异性结合试剂是抗Aβ抗体。
12.一种检测样品中聚集物存在的方法，所述方法包括步骤：
将怀疑含聚集物的样品与构象蛋白特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在聚集物结合形成复合物的条件下接触；
去除未结合样品；
将所述复合物与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，其中所述试剂包括可检测标记；和
通过所述被疑存在聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述聚集物的存在；
其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，
以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和
附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述构象蛋白特异性蛋白与固体支持物偶联。
14.一种检测样品中聚集物存在的方法，所述方法包括步骤：
提供含聚集物特异性结合试剂的固体支持物；
将所述固体支持物与带可检测标记的配体结合，其中所述聚集物特异性结合试剂与所述带可检测标记配体的结合亲合力弱于所述试剂与所述聚集物的结合亲合力；
将所述怀疑含聚集物的样品与所述固体支持物在允许所述聚集物存在于所述样品时能结合所述试剂并替代所述配体的条件下组合；
检测所述聚集物与所述聚集物特异性结合试剂间形成的复合物；
其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，
以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和
附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
15.一种减少多肽样品中聚集物量的方法，所述方法包括步骤：
将怀疑含聚集物的多肽样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在聚集物结合形成复合物的条件下接触；和
回收未结合的多肽样品；
其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，
以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和
附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
16.一种区分样品中聚集物和单体的方法，所述方法包括步骤：
将怀疑含聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在的聚集物结合形成复合物的条件下接触；
通过所述被疑存在的聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，区分所述聚集物和单体；
其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，
以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和
附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
17.一种评价对象患构象病可能性是否增加的方法，所述方法包括步骤：
将来自怀疑患构象病对象的生物样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与被疑存在的致病性聚集物结合形成复合物的条件下接触；
通过被疑存在的所述致病性聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述致病性聚集物的存在；
如果所述生物样品中致病性聚集物含量高于没有构象病患者样品中的聚集物含量，确定所述对象患有构象病的可能性增加；
其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，
以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和
附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
18.一种评价构象病治疗有效性的方法，所述方法包括步骤：
将接受构象病治疗患者的生物样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与被疑存在的致病性聚集物结合形成复合物的条件下接触；
通过所述被疑存在的致病性聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述致病性聚集物的存在；
如果所述生物样品中致病性聚集物含量低于对照中的致病性聚集物含量，确定所述治疗有效，其中所述对照是构象病治疗前所述患者生物样品中的致病性聚集物含量，
其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，
以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和
附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约90nmol净电荷、或每平方米至少约120nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约500nmol净电荷、每平方米至少约1000nmol净电荷、每平方米至少约2000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物或致病性聚集物可溶。
22.一种检测样品中寡聚体存在的方法，所述方法包括步骤：
提供怀疑含寡聚体的样品，其中所述样品缺乏寡聚体外的聚集物；
将所述样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在的寡聚体结合形成复合物的条件下接触；
通过所述被疑存在的寡聚体与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述寡聚体的存在；
其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，
以每平方米至少约2000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和
附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
23.一种检测样品中寡聚体存在的方法，所述方法包括步骤：
提供怀疑含寡聚体的样品；
从所述样品中去除寡聚体之外的聚集物；
将所述样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在寡聚体结合形成复合物的条件下接触；
通过所述被疑存在的寡聚体与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述寡聚体的存在；
其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，
以每平方米至少约2000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和
附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述聚集物通过离心移出。
25.一种检测样品中寡聚体存在的方法，所述方法包括步骤：
将怀疑含寡聚体的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在的寡聚体结合形成复合物的条件下接触；
将所述复合物与第二试剂接触，其中所述试剂优先结合寡聚体或寡聚体外的聚集物；
通过所述被疑存在的寡聚体与所述第二试剂的结合或不结合，检测所述寡聚体的存在；
其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，
以每平方米至少约2000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和
附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
26.如权利要求22-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述寡聚体外的聚集物包括原纤维。
27.如权利要求22-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述寡聚体可溶。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述聚集物特异性试剂与所述聚集物或寡聚体间形成的所述复合物用去污剂处理的步骤。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述处理步骤在所述接触步骤后进行。
30.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述去污剂是中性去污剂。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述去污剂包括正和负电荷。
32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述去污剂包括长碳链。
33.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述去污剂选自聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、n-十四烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸内酯、n-十六烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸内酯、n-十二烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸内酯、氨基磺基甜菜碱-14，3-[N，N-二甲基(3-十四酰氨丙基)氨基]丙磺酸内酯、氨基磺基甜菜碱-16，3-[N，N-二甲基-N-(3-棕榈酰胺丙基)氨基]-丙-1-磺酸内酯、4-n-辛基苯甲酰氨-丙基-二甲氨基磺基甜菜碱和N，N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其特征在于，所述固体支持物选自：硝酸纤维素、聚苯乙烯胶乳、聚氟乙烯、重氮化纸、尼龙膜、活化珠、磁响应珠、氧化肽、二氧化硅、多糖珠、多糖膜、琼脂糖、玻璃、聚丙烯酸、聚乙二醇、聚乙二醇-聚苯乙烯杂合物、可控孔度玻璃、载玻片、金珠和纤维素。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂被可检测标记。
36.如权利要求1-14或16-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品是包括身体组织或液体的生物样品。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述生物样品包括全血、血液部分、血液组分、血浆、血小板、血清、脑脊液(CSF)、骨髓、尿液、泪液、乳液、淋巴液、器官组织、脑组织、神经系统组织、肌肉组织、非神经系统组织、活检、尸检、脂肪活检、细胞、粪便、胎盘、脾组织、淋巴组织、胰腺组织、支气管肺泡灌洗液或滑液。
38.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述样品包括脑脊液(CSF)。
39.如权利要求1-14或19-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品包括多肽。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+2、至少约+3、至少约+4、至少约+5、至少约+6和至少约+7的净电荷。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约3000nmol净电荷、每平方米至少约4000nmol净电荷、或每平方米至少约5000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。
42.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约6000nmol净电荷、每平方米至少约7000nmol净电荷、每平方米至少约8000nmol净电荷、或每平方米至少约9000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。
43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂对聚集物的结合亲和性和/或亲合力比对单体的结合亲和性和/或亲合力至少高约2倍。
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括至少一个pKa比所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH高至少约1pH单位的带正电官能团。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述至少一个带正电官能团在所述聚集物特异性结合试剂的所有官能团中最接近所述固体支持物。
46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括疏水性官能团。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述疏水性官能团是芳族疏水性官能团。
48.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述疏水性官能团是脂肪族疏水性官能团。
49.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括唯一的带正电官能团和至少一个疏水性官能团。
50.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括至少一个带正电官能团和唯一的疏水性官能团。
51.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括唯一的带正电官能团和唯一的疏水性官能团。
52.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括至少一个为L-异构体的氨基酸。
53.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括至少一个为D-异构体的氨基酸。
54.如权利要求1-16或19-53中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物为非致病性。
55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述非致病性聚集物是酵母朊蛋白sup35或激素。
56.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述非致病性聚集物是多肽的聚集物。
57.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物为致病性。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述致病性聚集物是与先兆子痫、滔蛋白病变、TDP-43蛋白质病或丝氨酸病变相关的聚集物。
59.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述致病性聚集物是与淀粉样病相关的聚集物。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述淀粉样病选自系统性淀粉样变性、AA淀粉样变性病、共核蛋白病、阿尔茨海默病、朊病毒病、ALS、免疫球蛋白相关疾病、血清淀粉样蛋白A相关疾病、亨廷顿氏病、帕金森病、II型糖尿病、透析相关性淀粉样变和脑淀粉样血管病。
61.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述致病性聚集物是与阿尔茨海默病相关的聚集物。
62.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述致病性聚集物是与脑淀粉样血管病相关的聚集物。
63.如权利要求61或62所述的方法，其特征在于，所述与阿尔茨海默病或脑淀粉样血管病相关的聚集物包括β-淀粉样(Aβ)蛋白。
64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述Aβ蛋白是Aβ40。
65.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述Aβ蛋白是Aβ42。
66.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述与阿尔茨海默病相关的聚集物包括tau蛋白。
67.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述致病性聚集物包括糊精。
68.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述致病性聚集物包括淀粉样A蛋白。
69.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述致病性聚集物包括α-突触核蛋白。
70.如权利要求1-67中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少+1净电荷的至少一个氨基酸。
71.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述至少一个氨基酸在生理pH带正电。
72.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述至少一个氨基酸是选自赖氨酸和精氨酸的中性氨基酸。
73.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述至少一个氨基酸是选自鸟氨酸、甲基赖氨酸、二氨基丁酸、高精氨酸和4-氨甲基苯丙氨酸的非天然氨基酸。
74.如权利要求1-73中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括疏水性氨基酸。
75.如权利要求74所述的方法，其特征在于，所述疏水性氨基酸是芳族疏水性氨基酸。
76.如权利要求74所述的方法，其特征在于，所述疏水性氨基酸是脂肪族疏水性氨基酸。
77.如权利要求74所述的方法，其特征在于，所述疏水性氨基酸选自色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、高苯丙氨酸、苯甘氨酸、4-氯苯丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、噻吩丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氨基苯丙氨酸、五氟苯丙氨酸、2-萘基丙氨酸、p-联苯丙氨酸、苯乙烯基丙氨酸、取代的苯丙氨酸、卤化苯丙氨酸、氨基异丁酸、丙烯基甘氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、1-萘基丙氨酸、吡啶丙氨酸和1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸。
78.如权利要求1-77中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括选自KKKFKF(SEQ ID NO：1)、KKKWKW(SEQ ID NO：2)、KKKLKL(SEQ ID NO：3)、KKKKKK(SEQ ID NO：4)、KKKKKKKKKKKK(SEQ ID NO：5)、AAKKAA(SEQ ID NO：32)、AAKKKA(SEQ ID NO：33)、AKKKKA(SEQ ID NO：34)、AKKKKK(SEQ ID NO：35)、FKFKKK(SEQ ID NO：36)、kkkfkf(SEQ ID NO：37)、FKFSLFSG(SEQ ID NO：38)、DFKLNFKF(SEQ ID NO：39)、FKFNLFSG(SEQ ID NO：40)、YKYKKK(SEQ ID NO：41)、KKFKKF(SEQ ID NO：42)、KFKKKF(SEQ ID NO：43)、KIGVVR(SEQ ID NO：44)、AKVKKK(SEQ ID NO：45)、AKFKKK(SEQ ID NO：46)、RGRERFEMFR(SEQ ID NO：47)、YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：48)、FFFKFKKK(SEQ ID NO：49)、FFFFFKFKKK(SEQ ID NO：50)、FFFKKK(SEQ ID NO：51)和FFFFKK(SEQ ID NO：52)的肽。
79.如权利要求1-77中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括选自F-fdb-F-fdb-fdb-fdb(SEQ ID NO：53)、FoFooo(SEQID NO：54)、单Boc-乙二胺+BrCH2CO-KKFKF(SEQ ID NO：55)、三乙胺+BrCH2CO-KKFKF(SEQ ID NO：56)、四甲基乙二胺+BrCH2CO-KKFKF(SEQ ID NO：57)和SEQ ID NO：58-66的肽。
80.如权利要求1-77中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括选自KFYLYAIDTHRM(SEQ ID NO：6)、KIIKWGIFWMQG(SEQ ID NO：7)、NFFKKFRFTFTM(SEQ ID NO：8)、MKFMKMHNKKRY(SEQ ID NO：67)、LTAVKKVKAPTR(SEQ ID NO：68)、LIPIRKKYFFKL(SEQ ID NO：69)、KLSLIWLHTHWH(SEQ ID NO：70)、IRYVTHQYILWP(SEQ ID NO：71)、YNKIGVVRLFSE(SEQ ID NO：72)、YRHRWEVMLWWP(SEQ ID NO：73)、WAVKLFTFFMFH(SEQID NO：74)、YQSWWFFYFKLA(SEQ ID NO：75)、WWYKLVATHLYG(SEQ ID NO：76)、QTLSLHFQTRPP(SEQ ID NO：77)、TRLAMQYVGYFW(SEQ ID NO：78)、RYWYRHWSQHDN(SEQ IDNO：79)、AQYIMFKVFYLS(SEQ ID NO：80)、TGIRIYSWKMWL(SEQID NO：81)、SRYLMYVNIIYI(SEQ ID NO：82)、RYWMNAFYSPMW(SEQ ID NO：83)、NFYTYKLAYMQM(SEQ ID NO：84)、MGYS SGYWSRQV(SEQ ID NO：85)、YFYMKLLWTKER(SEQ ID NO：86)、RIMYLYHRLQHT(SEQ ID NO：87)、RWRHSSFYPIWF(SEQ IDNO：88)、QVRIFTNVEFKH(SEQ ID NO：89)和RYLHWYAVAVKV(SEQ ID NO：90)的肽。
81.如权利要求1-77中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括选自下组的类肽：
Figure FPA00001563392100121
Figure FPA00001563392100131
Figure FPA00001563392100141
其中R和R’是任何基团。
82.如权利要求1-77中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括选自SEQ ID NO：9-14和91-96的类肽。
83.如权利要求1-77中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括
Figure FPA00001563392100142
其中R和R’是任何基团。
84.如权利要求1-83中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括树突
85.如权利要求1-84中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括选自胺基、烷基、杂环、环烷、胍、醚、烯丙基和芳族的官能团。
86.如权利要求1-85中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括选自萘、苯酚、苯胺、苯基、取代的苯基、硝基苯基、卤化苯基、联苯、苯乙烯基、二苯基、苄磺酰胺、氨甲基苯基、噻吩、吲哚、萘基、呋喃和咪唑的芳族官能团。
87.如权利要求86所述的方法，其特征在于，所述卤化苯基是氯苯基或氟苯基。
88.如权利要求1-85中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括选自伯胺、仲胺、叔胺和季胺的胺基官能团。
89.如权利要求1-85中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括选自异丁基、异丙基、仲丁基、甲基和辛基的烷基官能团。
90.如权利要求1-85中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括选自四氢呋喃、吡咯烷和哌啶的杂环官能团。
91.如权利要求1-85中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括选自环丙基和环己基的环烷官能团。
92.如权利要求1-91中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括重复基序。
93.如权利要求1-92中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括与所述聚集物带负电基团有相同间隔的带正电基团。
94.如权利要求1-93中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15。
95.如权利要求1、6、12、14和16中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物包括糊精，其中所述聚集物特异性结合试剂包括SEQ ID NO：15，且其中所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约8000nmol-约15000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。
96.如权利要求1、6、12、14和16中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物包括α-突触核蛋白，其中所述聚集物特异性结合试剂包括SEQID NO：15，且其中所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约8000nmol-约15000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。
97.如权利要求1、6、12、14和16中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物包括淀粉样A蛋白，其中所述聚集物特异性结合试剂包括SEQID NO：15，且其中所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约8000nmol-约15000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。
98.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述去污剂是n-十四烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸内酯，其中所述聚集物是含有Aβ40蛋白的致病性聚集物，其中所述聚集物特异性结合试剂包括SEQ ID NO：15，且其中所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约8000nmol-约15000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。
99.如权利要求98所述的方法，其特征在于，所述样品包括脑脊液(CSF)。
100.一种肽聚集物特异性结合试剂，其中所述试剂包括选自下组的氨基酸序列：KKKFKF(SEQ ID NO：1)、KKKWKW(SEQ ID NO：2)、KKKLKL(SEQ ID NO：3)、KKKKKKKKKKKK(SEQ ID NO：5)、AAKKAA(SEQID NO：32)、AAKKKA(SEQ ID NO：33)、AKKKKA(SEQ ID NO：34)、AKKKKK(SEQ ID NO：35)、FKFKKK(SEQ ID NO：36)、kkkfkf(SEQID NO：37)、FKFSLFSG(SEQ ID NO：38)、DFKLNFKF(SEQ ID NO：39)、FKFNLFSG(SEQ ID NO：40)、YKYKKK(SEQ ID NO：41)、KKFKKF(SEQ ID NO：42)、KFKKKF(SEQ ID NO：43)、KIGVVR(SEQID NO：44)、AKVKKK(SEQ ID NO：45)、AKFKKK(SEQ ID NO：46)、RGRERFEMFR(SEQ ID NO：47)、FFFKFKKK(SEQ ID NO：49)、FFFFFKFKKK(SEQ ID NO：50)、FFFKKK(SEQ ID NO：51)和FFFFKK(SEQ ID NO：52)。
101.一种肽聚集物特异性结合试剂，其中所述试剂包括由氨基酸序列KKKKKK(SEQ ID NO：4)组成的肽。
102.一种肽聚集物特异性结合试剂，其中所述试剂包括选自下组的氨基酸序列：F-fdb-F-fdb-fdb-fdb(SEQ ID NO：53)、FoFooo(SEQ ID NO：54)、单Boc-乙二胺+BrCH2CO-KKFKF(SEQ ID NO：55)、三乙胺+BrCH2CO-KKFKF(SEQ ID NO：56)、四甲基乙二胺+BrCH2CO-KKFKF(SEQ ID NO：57)和SEQ ID NO：58-66。
103.一种肽聚集物特异性结合试剂，其中所述试剂包括选自下组的类肽：
Figure FPA00001563392100171
Figure FPA00001563392100191
其中R和R’是任何基团。
104.一种类肽聚集物特异性结合试剂，其中所述试剂包括选自SEQ ID NO：9-14和91-95的类肽。
105.如权利要求100-104中任一项所述的聚集物特异性结合试剂，其特征在于，所述试剂包括疏水性官能团。
106.如权利要求105所述的聚集物特异性结合试剂，其特征在于，所述疏水性官能团是芳族疏水性官能团。
107.如权利要求105所述的聚集物特异性结合试剂，其特征在于，所述疏水性官能团是脂肪族疏水性官能团。
108.如权利要求100-107中任一项所述的聚集物特异性结合试剂，其特征在于，所述试剂包括选自胺基、烷基、杂环、环烷、胍、醚、烯丙基和芳族的官能团。
109.如权利要求100-108中任一项所述的聚集物特异性结合试剂，其特征在于，所述试剂包括选自萘、苯酚、苯胺、苯基、取代的苯基、硝基苯基、卤化苯基、联苯、苯乙烯基、二苯基、苄磺酰胺、氨甲基苯基、噻吩、吲哚、萘基、呋喃和咪唑的芳族官能团。
110.如权利要求109所述的聚集物特异性结合试剂，其特征在于，所述卤化苯基是氯苯基或氟苯基。
111.如权利要求100-108中任一项所述的聚集物特异性结合试剂，其特征在于，所述试剂包括选自伯胺、仲胺、叔胺和季胺的胺基官能团。
112.如权利要求100-108中任一项所述的聚集物特异性结合试剂，其特征在于，所述试剂包括选自异丁基、异丙基、仲丁基、甲基和辛基的烷基官能团。
113.如权利要求100-108中任一项所述的聚集物特异性结合试剂，其特征在于，所述试剂包括选自四氢呋喃、吡咯烷和哌啶的杂环官能团。
114.如权利要求100-108中任一项所述的聚集物特异性结合试剂，其特征在于，所述试剂包括选自环丙基和环己基的环烷官能团。
115.如权利要求100-114中任一项所述的聚集物特异性结合试剂，其特征在于，所述试剂被可检测标记。
116.一种含固体支持物和权利要求100-115所述聚集物特异性结合试剂的组合物。
117.一种含固体支持物和聚集物特异性结合试剂的组合物，其中所述聚集物特异性结合试剂包含
Figure FPA00001563392100201
其中所述固体支持物还包括珠。
118.一种含固体支持物和肽聚集物特异性结合试剂的组合物，其中所述试剂包括选自下组的氨基酸序列：KFYLYAIDTHRM(SEQ ID NO：6)、KIIKWGIFWMQG(SEQ ID NO：7)、MKFMKMHNKKRY(SEQ ID NO：67)、LTAVKKVKAPTR(SEQ ID NO：68)、LIPIRKKYFFKL(SEQ ID NO：69)、KLSLIWLHTHWH(SEQ ID NO：70)、IRYVTHQYILWP(SEQ IDNO：71)、YNKIGVVRLFSE(SEQ ID NO：72)、YRHRWEVMLWWP(SEQ ID NO：73)、WAVKLFTFFMFH(SEQ ID NO：74)、YQSWWFFYFKLA(SEQ ID NO：75)，其中所述固体支持物还包括珠。
119.如权利要求116-118中任一项所述的组合物，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，其中所述组合物对聚集物的结合优于对单体。
120.如权利要求116-118中任一项所述的组合物，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约90nmol净电荷、每平方米至少约120nmol净电荷、每平方米至少约500nmol净电荷、或每平方米至少约1000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，其中所述组合物对聚集物的结合优于对单体。
121.如权利要求116-118中任一项所述的组合物，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约2000nmol净电荷、每平方米至少约3000nmol净电荷、每平方米至少约4000nmol净电荷、或每平方米至少约5000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，其中所述组合物对聚集物的结合优于对单体。
122.如权利要求116-118中任一项所述的组合物，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约6000nmol净电荷、每平方米至少约7000nmol净电荷、每平方米至少约8000nmol净电荷、或每平方米至少约9000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，其中所述组合物对聚集物的结合优于对单体。
123.如权利要求116-122中任一项所述的组合物，其特征在于，所述固体支持物选自下组：硝酸纤维素、聚苯乙烯胶乳、聚氟乙烯、重氮化纸、尼龙膜、活化珠、磁响应珠、氧化钛、二氧化硅、多糖珠、多糖膜、琼脂糖、玻璃、聚丙烯酸、聚乙二醇、聚乙二醇-聚苯乙烯杂合物、可控孔度玻璃、载玻片、金珠和纤维素。
124.一种含权利要求116-123中任一项所述组合物的试剂盒。
125.如权利要求124所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括使用所述试剂盒检测聚集物的说明。
126.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
固体支持物；
聚集物特异性结合试剂，其中所述聚集物特异性结合试剂包括选自下组的氨基酸序列：YGRKKRRQRRR、KFYLYAIDTHRM(SEQ ID NO：6)、KIIKWGIFWMQG(SEQ ID NO：7)、NFFKKFRFTFTM(SEQ ID NO：8)、MKFMKMHNKKRY(SEQ ID NO：67)、LTAVKKVKAPTR(SEQ IDNO：68)、LIPIRKKYFFKL(SEQ ID NO：69)、KLSLIWLHTHWH(SEQID NO：70)、IRYVTHQYILWP(SEQ ID NO：71)、YNKIGVVRLFSE(SEQ ID NO：72)、YRHRWEVMLWWP(SEQ ID NO：73)、WAVKLFTFFMFH(SEQ ID NO：74)、YQSWWFFYFKLA(SEQ ID NO：75)、WWYKLVATHLYG(SEQ ID NO：76)、QTLSLHFQTRPP(SEQ IDNO：77)、TRLAMQYVGYFW(SEQ ID NO：78)、RYWYRHWSQHDN(SEQ ID NO：79)、AQYIMFKVFYLS(SEQ ID NO：80)、TGIRIYSWKMWL(SEQ ID NO：81)、SRYLMYVNIIYI(SEQ ID NO：82)、RYWMNAFYSPMW(SEQ ID NO：83)、NFYTYKLAYMQM(SEQID NO：84)、MGYSSGYWSRQV(SEQ ID NO：85)、YFYMKLLWTKER(SEQ ID NO：86)、RIMYLYHRLQHT(SEQ ID NO：87)、RWRHS SFYPIWF(SEQ ID NO：88)、QVRIFTNVEFKH(SEQ ID NO：89)和RYLHWYAVAVKV(SEQ ID NO：90)，其中所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且所述聚集物特异性结合试剂附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体；和
使用所述试剂盒检测聚集物的说明。
127.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
固体支持物；
聚集物特异性结合试剂，其中所述聚集物特异性结合试剂包括
Figure FPA00001563392100221
Figure FPA00001563392100231
其中所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，且其中所述聚集物特异性结合试剂附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体；和
使用所述试剂盒检测聚集物的说明。
128.如权利要求126或127所述的试剂盒，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约90nmol净电荷、每平方米至少约120nmol净电荷、每平方米至少约500nmol净电荷、或每平方米至少约1000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。
129.如权利要求126或127所述的试剂盒，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约2000nmol净电荷、每平方米至少约3000nmol净电荷、每平方米至少约4000nmol净电荷、或每平方米至少约5000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。
130.如权利要求126或127所述的试剂盒，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约6000nmol净电荷、每平方米至少约7000nmol净电荷、每平方米至少约8000nmol净电荷、或每平方米至少约9000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。
131.一种检测样品中含Aβ的聚集物存在的方法，所述方法包括步骤：
将怀疑含包括Aβ的聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在的聚集物结合形成复合物的条件下接触；
去除未结合样品；
从所述第一复合物中脱离所述聚集物从而提供脱离聚集物；
将所述脱离聚集物与偶联固体支持物的第一抗Aβ抗体在允许结合形成第二复合物的条件下接触；和
通过使用带可检测标记的第二抗Aβ抗体检测所述第二复合物的形成，测得所述被疑存在的聚集物的存在；
其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH下具有至少约+1的净电荷，
以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和
附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。
132.如权利要求131所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括选自下组的类肽：
Figure FPA00001563392100241
Figure FPA00001563392100251
其中R和R’是任何基团。
133.如权利要求131所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括选自下组的肽：KKKFKF(SEQ ID NO：1)、KKKWKW(SEQ IDNO：2)、KKKLKL(SEQ ID NO：3)、FKFKKK(SEQ ID NO：36)、FFFKFKKK(SEQ ID NO：49)、FFFFFKFKKK(SEQ ID NO：50)、FFFKKK(SEQ ID NO：51)、FFFFKK(SEQ ID NO：52)、KKFKKF(SEQID NO：42)、KFKKKF(SEQ ID NO：43)、kkkfkf(SEQ ID NO：37)、KIGVVR(SEQ ID NO：44)、MKFMKMHNKKRY(SEQ ID NO：67)、LIPIRKKYFFKL(SEQ ID NO：69)、RGRERFEMFR(SEQ ID NO：47)以及SEQ ID NO 53、55、56和58-66。
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