JP2012162571A - プリオンに特異的なペプトイド試薬 - Google Patents

プリオンに特異的なペプトイド試薬 Download PDF

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Abstract

【課題】プリオンに特異的なペプトイド試薬の提供。
【解決手段】本発明は、コンフォメーション病タンパク質の非病原型に比べて、コンフォメーション病タンパク質の病原型と優先的に反応するペプトイド試薬に関する。前記ペプトイド試薬は、アミノ末端基領域、カルボキシ末端基領域、およびアミノ末端基領域とカルボキシ末端基領域との間に少なくとも１つのペプトイド領域を含み、前記ペプトイド領域は３〜約３０個のＮ−置換グリシンおよび随意に１つまたはそれ以上のアミノ酸を含む。本発明は、ペプトイドを用いてプリオンを検出し、単離する方法、およびプリオン関連疾患の処置および予防においてプリオンを用いる方法にも関する。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、プリオンの検出および単離、並びにプリオン関連疾患の処置および予防において有効なペプトイド試薬に関する。本発明は、ペプトイド試薬を含む複合体、組成物およびキット、並びにこれらを調製する方法にも関する。
（背景）
プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）は、機能が不確かな３３−３５ｋＤのタンパク質であり、ヒトにおいては、染色体２０の短腕上の遺伝子により転写される。２７−３０ｋＤのプロテアーゼ耐性コア（プリオン、スクレイピータンパク質、またはＰｒＰＳｃ）は、「プリオン病」に関与するいくつかのイソ型を有する機能性成分である。「プリオン病」は、タンパク質コンフォメーション病である。
タンパク質コンフォメーション病は、タンパク質の異常な構造転位（ＰｒＰＣなどのコンフォメーション病タンパク質）により生じ、タンパク質の異常な構造転位が順番に異常なタンパク質型（例えば、ＰｒＰＳｃ）の自己会合を引き起こし、その結果組織沈着および損傷を起こす。プリオン（ＰｒＰＳｃ）は、正常なＰｒＰＣのα−らせん構造よりむしろ実質的にプリーツシート・コンフォメーションを有し、検出可能な核酸が欠如し、一般に、免疫反応を発現しない。一般に、タンパク質コンフォメーション病は、潜伏期間の長さの変動に従って、通常、診断から死亡へ急速に進行する、著しく類似した臨床所見を共有する。
ヒトでは、プリオン病は、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン−ストロイスラーシャインカー症候群、致死性家族性不眠症、およびクールー病を含む「伝達性海綿状脳症」（ＴＳＥ）とも呼ばれる（例えば、非特許文献１：非特許文献２を参照のこと）。動物では、ＴＳＥはシープ・スクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、伝達性ミンク脳症、および捕捉ミュールジカおよびヘラジカの慢性消耗性疾患を含む（非特許文献３）。伝達性海綿状脳症は、霊長類、げっ歯類、および遺伝子導入マウスを含む実験動物に実験的に接種した時に疾患に感染させるプリオンタンパク質の異常な（ベータに富むプロテイナーゼＫ耐性）コンフォメーションが存在するという同じ特質により特徴づけられる。
最近、ＢＳＥの急速な蔓延およびこの蔓延とヒトのＴＳＥ発生の増加との相関関係が、ヒト以外の哺乳類のＴＳＥの検出に関する関心を高めている。これらの疾患に偶発的に感染すると悲劇的な結果（例えば、非特許文献４；非特許文献５を参照のこと）、除染の難しさ（非特許文献６）となり、さらに、ＢＳＥの心配（非特許文献７）があるため、ＴＳＥにかかっているヒトおよび動物を識別する診断テストおよび感染した被験者の治療の両方を得ることが急がれている。
プリオンは、細菌、ウイルス、およびウイロイドとは全く異なる。支配的な仮説は、他のすべての感染性病原体と異なり、感染は、鋳型として作用し、正常なプリオン・コンフォメーションを正常ではない異常なコンフォメーションに転換するプリオンタンパク質の異常なコンフォメーションにより引き起こされるというものである。プリオンタンパク質の特徴は、１９８０年代初頭に初めて明らかにされた。（例えば、非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０を参照のこと）。完全なプリオンタンパク質コード化遺伝子のクローンが作られて以来、トランスジェニック動物において遺伝子配列が決定され、発現された。（例えば、非特許文献１１を参照のこと。）
プリオン病の重要な特徴は、正常な型のプリオンタンパク質（細胞性または非病原性またはＰｒＰＣ）から、異常な形をしたタンパク質（ＰｒＰＳｃ）を形成することである。（例えば、非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５参照のこと。）ＰｒＰＣの非疾患型が主としてアルファ−らせん状に折り畳まれているのに比べて、ＰｒＰＳｃは実質的にβ−シート構造をしていることが、光学分光法および結晶学的研究により明らかにされている。（例えば、非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７を参照のこと。）構造的変化に続いて生化学特性の変化が起こり、即ちＰｒＰＣは非変性洗剤に可溶であり、ＰｒＰＳｃは不溶であり、ＰｒＰＣはプロテアーゼにより容易に消化され、一方、ＰｒＰＳｃは部分的に耐性であり、「ＰｒＰｒｅｓ」（非特許文献１７、非特許文献１８）「ＰｒＰ２７−３０」（２７−３０ｋＤＡ）または「ＰＫ耐性」（プロテイナーゼＫ耐性）型として知られているアミノ末端基で切断されたフラグメントを形成することになる。さらに、ＰｒＰＳｃは、ＰｒＰＣを病原性コンフォメーションに転換することができる。例えば、非特許文献１９；非特許文献２０を参照のこと。
生体中および生体から得られた試料のコンフォメーション病タンパク質の病原性イソ型の検出が、困難であることが判明している。したがって、被験者が死亡する前の、これらの伝達性でアミロイドを含む状態の確定診断および緩和治療は、実質的には未解決の難問となっている。脳生検組織の病理学検査は、被験者にとってリスクがあるが、生検試料が採取される場所によっては病変およびアミロイド沈着を避けることができる。また、動物、患者、および医療職員には生検に関わるリスクがある。さらに、動物の脳テストの結果は、動物が食料供給に入るまでは、通常、得られない。また、通常、プリオン・ペプチドに対して発生した抗体は、変性したＰｒＰＳｃおよびＰｒＰＣの両方を認識するが、伝染性（変性していない）ＰｒＰＳｃを優先的に認識することはできない。（例えば、非特許文献２１を参照のこと）。
ＴＳＥの多数のテストが利用可能である（非特許文献２２，非特許文献２３；非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６を参照のこと）。しかし、これらのすべては、脳組織の試料を利用しており、死後のテストとしてのみ適切である。大抵が時間がかかる可能性のある試料のプロテイナーゼＫ処置を必要とし、その上、ＰｒＰＣの不完全な消化により誤って正の結果をもたらすことがあり、ＰＫ感受性のＰｒＰＳｃの消化により誤って負の結果をもたらすことがある。
Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら、ｅｄｓ．（１９９４）．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．；Ｍｅｄｏｒｉら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９９２）３２６：４４４−９ Ｇａｊｄｕｓｅｋ、「Ｓｕｂａｃｕｔｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ：Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｅｓ Ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓ」Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，（１９９０）（ｐｐ．２２８９−２３２４） Ｇａｊｄｕｓｅｋ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｍｙｌｏｉｄｓ，ａｎｄ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ Ｐｒｉｏｎｓ Ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｉｎ，Ｐｕｂ．（１９９６） Ｂｒｏｗｎら、Ｌａｎｃｅｔ（１９９２）３４０：２４−２７ Ａｓｈｅｒら、Ｉｎ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓａｆｅｔｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ，Ｍｉｌｌｅｒ ｅｄ．，（１９８６）（ｐｐ．５９−７１）Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄ．Ｊ．（１９９５）３１１：１４１５−１４２１ Ｂｏｌｔｏｎ，ＭｃＫｉｎｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１８：１３０９−１３１１ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，Ｂｏｌｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２）２１：６９４２−６９５０ ；ＭｃＫｉｎｌｅｙ，Ｂｏｌｔｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９８３）３５：５７−６２ Ｂａｓｌｅｒ，Ｏｅｓｃｈら、Ｃｅｌｌ（１９８６）４６：４１７−４２８ Ｚｈａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）３６（１２）：３５４３−３５５３ Ｃｏｈｅｎ＆Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）６７：７９３−８１９ Ｐａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：１０９６２−１０９６６ Ｓａｆａｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：２０２７６−２０２８４ Ｗｉｌｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９（２００１）９：３５６３−３５６８ Ｐｅｒｅｔｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）２７３：６１４−６２２ Ｃｏｈｅｎ＆Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｎ Ｐｒｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｓ．Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．（１９９９）５（ｐｐ：１９１−２２８） Ｂａｌｄｗｉｎら、（１９９５） Ｋａｎｅｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１１１６０−１１１６４ Ｃａｕｇｈｅｙ、Ｂｒ Ｍｅｄ Ｂｕｌｌ．（２００３）６６：１０９−２０ Ｍａｔｓｕｎａｇａら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００１）４４：１１０−１１８ Ｓｏｔｏ，Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００４）２：８０９ Ｂｉｆｆｉｇｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（２００２）１０１：７９ Ｓａｆａｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００２）２０：１１４７ Ｓｃｈａｌｌｅｒら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．（１９９９）９８：４３７ Ｌａｎｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（２００３）４９：１７７４
したがって、種々の試料、例えば、生体、血液供給物、家畜ならびにヒトおよび動物へ供給する他の食料から得られた試料中の病原性プリオンタンパク質の存在を検出する組成物および方法を求めるニーズがある。プリオン関連疾患を診断し、治療するための方法および組成物を求めるニーズもある。本発明は、これら、並びに他の重要な目的に関する。
（発明の要旨）
本発明は、プリオンタンパク質などのコンフォメーション病タンパク質と反応し、コンフォメーション病タンパク質の非病原型に比べて病原型と優先的に反応し、下記化学式を有するペプトイド試薬に関する。
Ｘａ−（Ｑ）ｎ−Ｘｂ
式中、各Ｑは独立にアミノ酸またはＮ−置換グリシンであり、−（Ｑ）ｎ−はペプトイド領域を規定しており、
Ｘａは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アシル、アミノ（Ｃ１−６）アシル、アミノ酸、アミノ保護基、または２〜約１００個のアミノ酸のポリペプチドであり、Ｘａはリンカー部分を介して随意に連連結される共役部分により随意に置換され、
Ｘｂは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、カルボキシ保護基、アミノ酸、または２〜約１００個のアミノ酸のポリペプチドであり、Ｘｂはリンカー部分を介して随意に結合される共役部分により随意に置換され、
ｎは３〜約３０であり、
ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の少なくとも約５０％はＮ−置換グリシンを含む。
本発明は、ポリイオンであり、生理的に適切なｐＨにおいて正味荷電を有するペプトイド試薬にも関する。一部の実施形態では、ペプトイド試薬は生理的に適切なｐＨにおいて少なくとも３＋または少なくとも４＋の荷電などの正味正荷電を有する。正味荷電は、ペプトイド試薬の１つ以上のＮ−置換グリシンから生じ得る。
本発明は、コンフォメーション病タンパク質の非病原型に比べて、コンフォメーション病タンパク質の病原型と優先的に反応するペプトイド試薬にさらに関し、この試薬は、アミノ末端基領域、カルボキシ末端基領域、およびアミノ末端基領域とカルボキシ末端基領域との間に少なくとも１つのペプトイド領域を有し、ペプトイド領域は３〜約３０個のＮ−置換グリシンおよび随意に１つ以上のアミノ酸を含む。
本発明は、コンフォメーション病タンパク質の非病原型に比べてコンフォメーション病タンパク質の病原型と優先的に反応するペプトイド試薬をさらに供給し、該試薬は３〜１５個の連結するＮ−置換グリシンを含むペプトイド領域を含み、該ペプトイド領域は生理的に適切なｐＨにおいて正味荷電を有する。一部の実施形態では、生理的に適切なｐＨにおいて、正味荷電は少なくとも３＋または少なくとも４＋の正味荷電などの正味正荷電である。一部の実施形態では、生理的に適切なｐＨにおいて、ペプトイド試薬は２＋〜６＋、３＋〜５＋、または４＋の正味荷電を有する。
本発明のペプトイド試薬は、治療薬組成物または予防薬組成物の成分として、試料中の病原性プリオンを単離または検出するツール、および／またはプリオン特異性抗体を発生させるためのツールを含む広範囲の用途で使用することができる。例えば、ＰｒＰＣに比べてＰｒＰＳＣと優先的に反応するペプトイド試薬は、例えば、疾患の診断または献血された血液または臓器提供された臓器の選別の場合、生体またはかっての生体から得られた試料中の病原型の直接検出に有効である。本発明のペプトイド試薬は、複合体を形成する試料において何らかのＰｒＰＳＣに特異的に結合させるために使用することができる。該複合体は、ＵＶ／可視分光法、ＦＴＩＲ、核磁気共鳴分光法、ラマン分光法、質量分析法、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動法、表面プラズモン共鳴分光法、マイクロ−エレクトロ−メカニカル・システム（ＭＥＭＳ）などの方法により直接検出できるか、または複合体中または複合体から解離後のＰｒＰＳＣへの追加のプリオン特異性試薬（例えば、第２ペプトイド試薬またはプリオン結合試薬（本明細書で規定された））の結合により検出することができる。
したがって、本発明は、試料中に病原性プリオンの存在を検出する方法に関し、該方法は、本発明の第１ペプトイド試薬と試料とを、もし病原性プリオンが存在するならば、これにペプトイド試薬が結合できる条件下で、接触させて複合体を形成させる工程と、複合体の形成を検出する工程とを含み、該複合体の形成は、病原性プリオンの存在を示している。
試料中の病原性プリオンの検出方法は、本発明の第１ペプトイド試薬と試料とをもし病原性プリオンが存在するならば、これに第１ペプトイド試薬ができるような条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、第１複合体の病原性プリオンに第２ペプトイド試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された、本発明の第２ペプトイド試薬と第１複合体とを接触させて、第２複合体を形成させる工程と、第２複合体の形成を検出する工程とをも含むことができ、該第２複合体の形成は、病原性プリオンの存在を示している。
別の実施形態では、この方法は、本発明の第１ペプトイド試薬と試料とをもし病原性プリオンが存在するならばこれに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、結合していない試料を除去する工程と、第１複合体の病原性プリオンに第２ペプトイド試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された、本発明の第２ペプトイド試薬と第１複合体とを接触させ第２複合体を形成させる工程と、第２複合体の形成を検出する工程とを含み、該第２複合体の形成は、病原性プリオンの存在を示している。第１ペプトイド試薬は、随意に固体支持体を含み、この支持体は未結合試料から第１複合体の分離を助長する。
さらに、本発明の検出方法は、本発明の第１ペプトイド試薬と試料とを、もし病原性プリオンが存在するならば、これに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、結合していない試料を除去する工程と、病原性プリオンを第１複合体から解離させて、それによって解離された病原性プリオンを提供する工程と、解離された病原性プリオンに第２ペプトイド試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された、本発明の第２ペプトイド試薬と解離された病原性プリオンとを接触させて第２複合体を形成させる工程と、第２複合体の形成を検出する工程とを含み、該第２複合体の形成は、病原性プリオンの存在を示している。
試料中の病原性プリオンを検出する方法はさらに、本発明の第１ペプトイド試薬と試料とを、もし病原性プリオンが存在するならば、これに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、第１複合体の病原性プリオンにプリオン結合試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された、プリオン結合試薬と第１複合体とを接触させて、第２複合体を形成させる工程と第２複合体の形成を検出する工程とを含み、第２複合体の形成は、病原性プリオンの存在を示している。
別の実施形態では、この方法は、本発明の第１ペプトイド試薬と試料とを、もし病原性プリオンが存在するならば、これに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、結合していない試料を除去する工程と、第１複合体の病原性プリオンにプリオン結合試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された、プリオン結合試薬と第１複合体とを接触させて、第２複合体を形成させる工程と、第２複合体の形成を検出する工程とを含み、第２複合体の形成は、病原性プリオンの存在を示している。第１ペプトイド試薬は、随意に固体支持体を含み、この支持体は結合していない試料から第１複合体の分離を助長する。
さらに、本発明の検出方法は、本発明の第１ペプトイド試薬と試料とを、もし病原性プリオンが存在するならば、これに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、結合していない試料を除去する工程と、病原性プリオンを第１複合体から解離させる工程と、それによって、解離された病原性プリオンを提供する工程と、解離された病原性プリオンにプリオン結合試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された、プリオン結合試薬と解離された病原性プリオンとを接触させて第２複合体を形成させる工程と、第２複合体の形成を検出する工程とを含み、第２複合体の形成は病原性プリオンの存在を示している。
別の実施形態では、本発明の検出方法は、本発明の第１ペプトイド試薬と試料とを、もし病原性プリオンが存在するならば、これに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、結合していない試料を除去する工程と、病原性プリオンを第１複合体から解離させる工程と、それによって、解離された病原性プリオンを提供する工程と、解離された病原性プリオンにプリオン結合試薬が結合できる条件下で、プリオン結合試薬と解離された病原性プリオンとを接触させて第２複合体を形成する工程と、必要に応じて検出可能に標識された第２プリオン結合試薬を用いて第２複合体の形成を検出する工程とを含み、第２複合体の形成は、病原性プリオンの存在を示している。
その上、この検出方法は、プリオン結合試薬と試料とを、もし病原性プリオンが存在するならばこれに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、未結合の試料を除去する工程と、第１複合体の病原性プリオンにペプトイド試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された、請求項１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬と第１複合体とを接触させて第２複合体を形成させる工程と、第２複合体の形成を検出する工程とを含み、第２複合体の形成は前記病原性プリオンの存在を示している。プリオン結合試薬は、固体支持体上に随意に供給される。さらに、この検出方法は、本発明のペプトイド試薬を含む固体支持体を供給し、固体支持体と、検出可能に標識されたリガンドとを、検出可能に標識されたリガンドがペプトイド試薬に結合できる条件下で合わせ、第１複合体を形成させる工程であって、支持体のペプトイド試薬は、病原性プリオンに対するよりもリガンドに対してより弱い結合親和性を有する工程と、病原性プリオンが試料中に存在するならば、第１複合体のペプトイド試薬に病原性プリオンが結合できる条件下で第１複合体と試料を合わせる工程と、それにより第１複合体の検出可能に標識されたリガンドを置換する工程と、ペプトイド試薬と病原性プリオンとを含む第２複合体を形成する工程と、第２複合体の形成を検出する工程とを含み、第２複合体の形成が病原性プリオンの存在を示している。
本発明は、試料中に病原性プリオンの存在を検出する方法をさらに提供し、第１ペプトイド試薬と試料とを、もし病原性プリオンが存在するならばこれにペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて複合体を形成させる工程と、複合体から未結合の試料を除去する工程と、病原性プリオンを複合体から解離して、それによって解離された病原性プリオンを提供する工程と、第２固体支持体に解離された病原性プリオンが付着できるような条件下で、固体支持体と解離された病原性プリオンとを接触させる工程と、必要に応じて検出可能に標識されたプリオン結合試薬を用いて、付着し解離された病原性プリオンを検出する工程を含み、プリオン結合試薬の結合は病原性プリオンの存在を示している。一部の実施形態では、解離は、複合体を高ｐＨまたは低ｐＨに曝露することによって実行される。一部の実施形態では、この方法は、解離後高ｐＨまたは低ｐＨを中和する工程をさらに含む。一部の実施形態では、解離された病原性プリオンは変性される。
本発明は、試料中の病原性プリオンの存在を検出する方法をさらに提供し、第１ペプトイド試薬と試料とを、もし病原性プリオンが存在するならばこれに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、第１複合体から未結合の試料を除去する工程と、病原性プリオンを第１複合体から解離して、それによって解離された病原性プリオンを提供する工程と、解離された病原性プリオンが第１抗プリオン抗体に結合できる条件下で、解離された病原性プリオンを第１抗プリオン抗体を含む第２固体支持体と接触させて第２複合体を形成させる工程と、必要に応じて検出可能に標識された第２抗プリオン抗体を用いて第２複合体の解離された病原性プリオンを検出する工程とを含み、第２抗プリオン抗体の結合が病原性プリオンの存在を示している検出方法。一部の実施形態では、解離は第１複合体を高ｐＨまたは低ｐＨに曝露することによって実行される。一部の実施形態では、この方法は、解離後高ｐＨまたは低ｐＨを中和する工程をさらに含む。別の実施形態では、解離された病原性プリオンは変性される。
プリオン結合試薬を利用する上の方法のすべてにおいて、プリオン結合試薬は、例えば、抗プリオン抗体である。
本発明は、動物のプリオン関連感染を処置または予防する方法をさらに提供する。
本発明は、さらに、試料中のプリオンの検出または単離に関する。
本発明は、血液または食品などの実質的にプリオンを含まない試料の供給に関する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
コンフォメーション病タンパク質の非病原型に比べてコンフォメーション病タンパク質の病原型と優先的に反応するペプトイド試薬であって、該ペプトイド試薬は下記化学式を有し、
Ｘ ａ −（Ｑ） ｎ −Ｘ ｂ
式中、各Ｑは独立にアミノ酸またはＮ−置換グリシンであり、−（Ｑ） ｎ −はペプトイド領域を規定しており、
Ｘ ａ は、Ｈ、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アシル、アミノ（Ｃ １−６ ）アシル、アミノ酸、アミノ保護基、または２〜約１００個のアミノ酸のポリペプチドであり、式中、Ｘ ａ はリンカー部分を介して随意に連結される共役部分により随意に置換され、
Ｘ ｂ は、Ｈ、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシル、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、カルボキシ保護基、アミノ酸、または２〜約１００個のアミノ酸のポリペプチドであり、式中、Ｘ ｂ はリンカー部分を介して随意に連結される共役部分により随意に置換され、および
ｎは３〜約３０であり、
式中、該ペプトイド領域−（Ｑ） ｎ −の少なくとも約５０％はＮ−置換グリシンを含むペプトイド試薬。
（項目２）
前記Ｎ−置換グリシンは、化学式
−（ＮＲ−ＣＨ ２ −ＣＯ）−
を有し、式中、各Ｒは（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルキル、ハロ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルケニル、（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルキニル、（Ｃ ６ −Ｃ １０ ）シクロアルキル−アリール、アミノ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、アンモニウム（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルコキシ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルキル、カルバミル、カルバミル（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、アミジノ、アミジノ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、チオール、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキルチオール、２−１０個の炭素原子のアルキルチオアルキル、Ｎ−含有ヘテロシクリル、Ｎ−含有ヘテロシクリル（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、イミダゾリル、４−１０個の炭素原子のイミダゾリルアルキル、ピペリジル、５−１０個の炭素原子のピペリジルアルキル、インドリル、９−１５個の炭素原子のインドリルアルキル、ナフチル、１１−１６個の炭素原子のナフチルアルキル、およびアリール（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、から独立に選択され、式中各Ｒ部分は、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルコキシから独立に選択される１−３個の置換基で随意に置換されている項目１に記載のペプトイド試薬。
（項目３）
Ｘ ｂ がリンカー部分を介して随意に連結される共役部分により随意に置換されたアミノ酸である項目１に記載のペプトイド試薬。
（項目４）
ｎが約５〜約１５である項目１に記載のペプトイド試薬。
（項目５）
各ＱがＮ−置換グリシンである項目１に記載のペプトイド試薬。
（項目６）
前記ペプトイド領域−（Ｑ） ｎ −が生理的に適切なｐＨにおいてポリイオン性である項目１に記載のペプトイド試薬。
（項目７）
前記ペプトイド領域−（Ｑ） ｎ −が生理的に適切なｐＨにおいて少なくとも３＋の正味荷電を有する項目１に記載のペプトイド試薬。
（項目８）
前記Ｎ−置換グリシンが、化学式−（ＮＲ−ＣＨ ２ −ＣＯ）−を有し、式中、Ｒは（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルキル、ハロ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルケニル、（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルキニル、（Ｃ ６ −Ｃ １０ ）シクロアルキル−アリール、アミノ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、アンモニウム（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルコキシ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルキル、カルバミル、カルバミル（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、アミジノ、アミジノ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、チオール、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキルチオール、２−１０個の炭素原子のアルキルチオアルキル、Ｎ−含有ヘテロシクリル、Ｎ−含有ヘテロシクリル（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、イミダゾリル、４−１０個の炭素原子のイミダゾリルアルキル、ピペリジル、５−１０個の炭素原子のピペリジルアルキル、インドリル、９−１５個の炭素原子のインドリルアルキル、ナフチル、１１−１６個の炭素原子のナフチルアルキル、およびアリール（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、から独立に選択され、式中各Ｒ部分は、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルコキシから独立に選択される１−３個の置換基で随意に置換されており、前記ペプトイド領域−（Ｑ） ｎ −は少なくとも３個のＮ−置換グリシンを含み、式中Ｒは生理的に適切なｐＨにおいて荷電している部分である、項目１に記載のペプトイド試薬。
（項目９）
前記荷電Ｎ−置換グリシンは、アミノ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、アンモニウム（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、アミジノ、アミジノ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、Ｎ−含有ヘテロシクリル、Ｎ−含有ヘテロシクリル（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、から独立に選択される荷電Ｒ部分を含み、式中各Ｒ部分はハロゲン、Ｃ １ −Ｃ ３ メトキシ、およびＣ １ −Ｃ ３ アルキルから独立に選択される１−３個の置換基で随意に置換されている項目８のいずれかに記載のペプトイド試薬。
（項目１０）
前記ペプトイド領域−（Ｑ） ｎ −が、配列番号２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、または２４１を含む項目１に記載のペプトイド試薬。
（項目１１）
前記ペプトイド領域−（Ｑ） ｎ −が、配列番号２２９、２３０、２３２、２３３、２３７、２３８、２３９、または２４０を含む項目１に記載のペプトイド試薬。
（項目１２）
前記ペプトイド領域−（Ｑ） ｎ −が、配列番号２３０、２３７、２３８、２３９、または２４０を含む項目１に記載のペプトイド試薬。
（項目１３）
前記ペプトイド領域−（Ｑ） ｎ −が、配列番号２４０を含む項目１に記載のペプトイド試薬。
（項目１４）
少なくとも１つの共役部分を含む項目１に記載のペプトイド試薬。
（項目１５）
前記共役部分がリンカー部分を介して連結されている項目１４に記載のペプトイド試薬。
（項目１６）
前記共役部分が架橋剤または結合剤である項目１４に記載のペプトイド試薬。
（項目１７）
前記共役部分がビオチンまたはメルカプト基を含む項目１４に記載のペプトイド試薬。
（項目１８）
前記コンフォメーション病タンパク質が、プリオン関連疾患のコンフォメーション病タンパク質であり、該コンフォメーション病タンパク質の病原型がＰｒＰ Ｓｃ であり、該コンフォメーション病タンパク質の非病原型がＰｒＰ Ｃ である項目１に記載のペプトイド試薬。
（項目１９）
前記ペプトイド試薬が、前記コンフォメーション病タンパク質の非病原型に対する親和性よりも少なくとも約１０倍大きい親和性で、該コンフォメーション病タンパク質の病原型と相互作用する項目１に記載のペプトイド試薬。
（項目２０）
ＰｒＰ Ｃ に比べてＰｒＰ Ｓｃ と優先的に反応するペプトイド試薬であって、該ペプトイド試薬は、下記化学式を有し、
Ｘ ａ −（Ｑ） ｎ −Ｘ ｂ
式中、各Ｑは独立に下記化学式を有するＮ−置換グリシンであり、
−（ＮＲ−ＣＨ ２ −ＣＯ）−
式中、各Ｒは（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルキル、ハロ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルケニル、（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルキニル、（Ｃ ６ −Ｃ １０ ）シクロアルキル−アリール、アミノ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、アンモニウム（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルコキシ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルキル、カルバミル、カルバミル（Ｃ ２ −Ｃ ６ ）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、アミジノ、アミジノ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、チオール、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキルチオール、２−１０個の炭素原子のアルキルチオアルキル、Ｎ−含有ヘテロシクリル、Ｎ−含有ヘテロシクリル（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、イミダゾリル、４−１０個の炭素原子のイミダゾリルアルキル、ピペリジル、５−１０個の炭素原子のピペリジルアルキル、インドリル、９−１５個の炭素原子のインドリルアルキル、ナフチル、１１−１６個の炭素原子のナフチルアルキル、およびアリール（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、から独立に選択され、式中各Ｒ部分は、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルコキシから独立に選択される１−３個の置換基で随意に置換されており、−（Ｑ） ｎ −がペプトイド領域を規定しており、
Ｘ ａ は、Ｈ、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アシル、アミノ（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アシル、アミノ酸、アミノ保護基、または２〜約１００個のアミノ酸のポリペプチドであり、式中、Ｘ ａ はリンカー部分を介して随意に連結する共役部分により随意に置換され、
Ｘ ｂ は、Ｈ、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシル、（Ｃ １ −Ｃ ６ ）アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、カルボキシ保護基、アミノ酸、または２〜約１００個のアミノ酸のポリペプチドであり、式中、Ｘ ｂ はリンカー部分を介して随意に連結される共役部分により随意に置換され、および
ｎは４、５、６、７、または８であり、
式中該ペプトイド領域−（Ｑ） ｎ −は生理的に適切なｐＨにおいて少なくとも３＋の正味荷電を有するペプトイド試薬。
（項目２１）
以下：
Figure 2012162571
Figure 2012162571
Figure 2012162571
から選択される、ペプトイド試薬。
（項目２２）
以下：
Figure 2012162571
Figure 2012162571
またはこれらの塩から選択される、ペプトイド試薬。
（項目２３）
項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬および病原性プリオンを含む複合体。
（項目２４）
固体支持体に連結される項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬を含む組成物。
（項目２５）
項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬および試料を含む組成物。
（項目２６）
前記試料が生物学的試料である項目２５の組成物。
（項目２７）
試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、項目１〜２２のいずれか１つに記載の第１ペプトイド試薬と該試料とを、該病原性プリオンが存在する場合、これに該ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて複合体を形成させる工程と、該複合体の形成を検出する工程とを含み、該複合体の形成は該病原性プリオンの存在を示す、方法。
（項目２８）
試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、項目１〜２２のいずれか１つに記載の第１ペプトイド試薬と該試料とを、該病原性プリオンが存在する場合、これに該第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、該第１複合体の該病原性プリオンに本発明の第２ペプトイド試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された該第２ペプトイド試薬と該第１複合体を接触させて第２複合体を形成させる工程と、該第２複合体の形成を検出する工程とを含み、該第２複合体の形成は該病原性プリオンの存在を示す、方法。
（項目２９）
試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、項目１〜２２のいずれか１つに記載の第１ペプトイド試薬と該試料とを、該病原性プリオンが存在する場合、これに該第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、該第１複合体から未結合の試料を除去する工程と、該第１複合体の該病原性プリオンに本発明の第２ペプトイド試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された該第２ペプトイド試薬と該第１複合体を接触させて第２複合体を形成させる工程と、該第２複合体の形成を検出する工程とを含み、該第２複合体の形成は該病原性プリオンの存在を示す、方法。
（項目３０）
試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、項目１〜２２のいずれか１つに記載の第１ペプトイド試薬と該試料とを、該病原性プリオンが存在する場合、これに該第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、該第１複合体から未結合の試料を除去する工程と、該病原性プリオンを該第１複合体から解離させて、それによって解離された病原性プリオンを提供する工程と、該解離された病原性プリオンに項目１に記載の第２ペプトイド試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された該第２ペプトイド試薬と該解離された病原性プリオンとを接触させて第２複合体を形成させる工程と、該第２複合体の形成を検出する工程とを含み、該第２複合体の形成は該病原性プリオンの存在を示す、方法。
（項目３１）
試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、項目１〜２２のいずれか１つに記載の第１ペプトイド試薬と該試料とを、該病原性プリオンが存在する場合、これに該第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、該第１複合体の該病原性プリオンにプリオン結合試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された該プリオン結合試薬と該第１複合体とを接触させて第２複合体を形成させる工程と、該第２複合体の形成を検出する工程とを含み、該第２複合体の形成は該病原性プリオンの存在を示す、方法。
（項目３２）
試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、項目１〜２２のいずれか１つに記載の第１ペプトイド試薬と該試料とを、該病原性プリオンが存在する場合、これに該第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、該第１複合体から未結合の試料を除去する工程と、該第１複合体の該病原性プリオンにプリオン結合試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された該プリオン結合試薬と該第１複合体とを接触させて第２複合体を形成させる工程と、該第２複合体の形成を検出する工程とを含み、該第２複合体の形成は該病原性プリオンの存在を示す、方法。
（項目３３）
試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、項目１〜２２のいずれか１つに記載の第１ペプトイド試薬と該試料とを、該病原性プリオンが存在する場合、これに該第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、該第１複合体から未結合の試料を除去する工程と、該病原性プリオンを該第１複合体から解離させて、それによって解離された病原性プリオンを提供する工程と、該解離された病原性プリオンにプリオン結合試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された該プリオン結合試薬と該解離された病原性プリオンとを接触させて第２複合体を形成させる工程と、該第２複合体の形成を検出する工程とを含み、該第２複合体の形成は該病原性プリオンの存在を示す、方法。
（項目３４）
試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、項目１〜２２のいずれか１つに記載の第１ペプトイド試薬と該試料とを、該病原性プリオンが存在する場合、これに該第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、該第１複合体から未結合の試料を除去する工程と、該病原性プリオンを該第１複合体から解離させて、それによって解離された病原性プリオンを提供する工程と、該解離された病原性プリオンにプリオン結合試薬が結合できる条件下で、該プリオン結合試薬と該解離された病原性プリオンとを接触させて第２複合体を形成させる工程と、必要に応じて検出可能に標識された第２プリオン結合試薬を用いて該第２複合体の形成を検出する工程とを含み、該第２複合体の形成は該病原性プリオンの存在を示す、方法。
（項目３５）
試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、プリオン結合試薬と該試料とを、該病原性プリオンが存在する場合、これに該プリオン結合試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、該第１複合体から未結合の試料を除去する工程と、該第１複合体の該病原性プリオンに項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された該ペプトイド試薬と該第１複合体とを接触させて第２複合体を形成させる工程と、該第２複合体の形成を検出する工程とを含み、該第２複合体の形成は該病原性プリオンの存在を示す、方法。
（項目３６）
前記プリオン結合試薬が抗プリオン抗体を含む項目３１〜３５のいずれか１つに記載の方法。
（項目３７）
試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、項目１〜２２のいずれか１つに記載の第１ペプトイド試薬と該試料とを、該病原性プリオンが存在する場合、これに該第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて複合体を形成させる工程と、該複合体から未結合の試料を除去する工程と、該病原性プリオンを該複合体から解離して、それによって解離された病原性プリオンを提供する工程と、第２固体支持体に該解離された病原性プリオンが付着できるような条件下で、該第２固体支持体と該解離された病原性プリオンとを接触させる工程と、必要に応じて検出可能に標識されたプリオン結合試薬を用いて、該付着し解離された病原性プリオンを検出する工程を含み、該プリオン結合試薬の結合は該病原性プリオンの存在を示す、方法。
（項目３８）
前記解離する工程が、前記複合体を高ｐＨまたは低ｐＨに曝露することによって実行される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記解離する工程後、前記高ｐＨまたは低ｐＨを中和する工程をさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記解離された病原性プリオンが変性される、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記プリオン結合試薬が抗プリオン抗体を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、項目１〜２２のいずれか１つに記載の第１ペプトイド試薬と該試料とを、該病原性プリオンが存在する場合、これに該第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で接触させて第１複合体を形成させる工程と、該第１複合体から未結合の試料を除去する工程と、該病原性プリオンを該第１複合体から解離して、それによって解離された病原性プリオンを提供する工程と、該解離された病原性プリオンが第１抗プリオン抗体に結合できる条件下で、該解離された病原性プリオンと該第１抗プリオン抗体を含む第２固体支持体とを接触させて第２複合体を形成させる工程と、必要に応じて検出可能に標識された第２抗プリオン抗体を用いて該第２複合体の該解離された病原性プリオンを検出する工程とを含み、該第２抗プリオン抗体の結合が該病原性プリオンの存在を示す、方法。
（項目４３）
前記解離する工程が、前記第１複合体を高ｐＨまたは低ｐＨに曝露することによって実行される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記解離する工程後、前記高ｐＨまたは低ｐＨを中和する工程をさらに含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記解離された病原性プリオンが変性される、項目４２に記載の方法。
（項目４６）
前記第１プリオン結合試薬が抗プリオン抗体を含む項目４２に記載の方法。
（項目４７）
第２プリオン結合試薬が抗プリオン抗体を含む項目４２に記載の方法。
（項目４８）
試料中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬を含む固体支持体と、検出可能に標識されたリガンドとを、該検出可能に標識されたリガンドが該ペプトイド試薬に結合できる条件下で合わせ、第１複合体を形成させる工程であって、ここで該固体支持体の該ペプトイド試薬は該病原性プリオンよりも該リガンドに対してより弱い結合親和性を有する、工程と、該病原性プリオンが該試料中に存在する場合、該第１複合体の該ペプトイド試薬に該病原性プリオンが結合できる条件下で該第１複合体と該試料を合わせ、それにより該第１複合体の該検出可能に標識されたリガンドを置換し、該ペプトイド試薬と該病原性プリオンとを含む第２複合体を形成する工程と、該第２複合体の形成を検出する工程とを含み、該第２複合体の形成が該病原性プリオンの存在を示す、方法。
（項目４９）
項目１〜２２のいずれか１つに記載の治療上有効量の１つまたはそれ以上のペプトイド試薬を動物に投与することを含むプリオン関連疾患を処置または予防する方法。
（項目５０）
動物のプリオン関連疾患を処置または予防する方法であって、
該動物における１つまたはそれ以上の病原性プリオンの存在を決定する工程と、
（ａ）項目１〜２２のいずれか１つに記載の治療上有効量の１つまたはそれ以上のペプトイド試薬を該動物に投与する工程、または
（ｂ）治療上有効量の１つまたはそれ以上の従来の薬剤を該動物に投与する工程と、
を包含する、方法。
（項目５１）
動物のプリオン関連疾患の感染部位を決定する方法であって、
（ａ）項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬を該動物に投与する工程であって、該ペプトイド試薬が造影剤に連結されている、工程と
（ｂ）該造影剤を検出する工程であって、該造影剤の検出により該感染部位を決定する、工程と、
を包含する、方法。
（項目５２）
動物のプリオン関連疾患を処置または予防する方法であって、
（ａ）項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬を含む治療上有効量の第１用量を該動物に投与する工程と、
（ｂ）該動物に免疫反応を誘発するのに十分な量で、項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬を含む第２用量を該動物に投与する工程と、
を包含する、方法。
（項目５３）
動物のプリオン関連疾患を処置または予防するための、項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬の使用。
（項目５４）
動物のプリオン関連疾患を処置または予防する薬剤を調製するための、項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬の使用。
（項目５５）
動物のプリオン関連疾患の感染部位を決定するための、項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬の使用。
（項目５６）
試料から病原性プリオンを単離するための方法であって、
（ａ）該試料中に存在する場合、該病原性プリオンを項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬に結合させることができる条件下で、該ペプトイド試薬を含む固体支持体を該試料と接触させて複合体を形成する工程と、
（ｂ）該複合体から結合していない試料を除去し、それにより単離された病原性プリオンを提供する工程と、
を包含する、方法。
（項目５７）
試料中の病原性プリオンの量を低減するための方法であって、
（ａ）該試料中に存在する場合、該病原性プリオンを固体支持体の項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬に結合させることができる条件下で、該ペプトイド試薬を含む固体支持体を該試料と接触させて複合体を形成する工程と、
（ｂ）該複合体から結合していない試料を分離し、それにより低減させた量の該病原性プリオンを有する該試料を提供する工程と、
を包含する、方法。
（項目５８）
前記回収した試料中の病原性プリオンの量が検出可能なレベル未満に低減される、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記病原性プリオンの量が約９５〜１００％低減される、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
病原性プリオンを実質的に含まない血液供給物を調製する方法であって、
（ａ）複数の血液試料において病原性プリオンの有無を検出する工程であって、該検出する工程が、存在する場合、該病原性プリオンの項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬への結合を含む、工程と、
（ｂ）該病原性プリオンが検出されない該試料を合わせ、それにより該病原性プリオンを実質的に含まない該血液供給物を提供する工程と、
を包含する、方法。
（項目６１）
病原性プリオンを実質的に含まない食料供給物を調製する方法であって、
（ａ）複数の食料試料において病原性プリオンの有無を検出し、該検出する工程が、存在する場合、該病原性プリオンの項目１〜２２のいずれか１つに記載のペプトイド試薬への結合を含む、工程と、
（ｂ）該病原性プリオンが検出されない該試料を合わせ、それにより該病原性プリオンを実質的に含まない食料供給物を提供する工程と、
を包含する、方法。
ヒト血漿試料におけるＰｒＰＣのＥＬＩＳＡ検出。図１Ａは血漿を増量した場合のＥＬＩＳＡ（ＲＬＵ）測定を示している。図１Ｂは組み換えＰｒＰタンパク質の既知量を用いたＥＬＩＳＡ（ＲＬＵ）測定の標準曲線を示している。 図２ ヒト（配列番号１）およびマウス（配列番号２）のプリオンタンパク質のアミノ酸配列を示している。 図３ ヒト（配列番号３）、シリア・ハムスター（ハムスター）（配列番号４）、ウシ（配列番号５）、ヒツジ（配列番号６）、マウス（配列番号７）、ヘラジカ（配列番号８）、ファロージカ（ファロー）（配列番号９）、ミュールジカ（ミュール）（配列番号１０）、およびオジロジカ（白）（配列番号１１）からのプリオンタンパク質のアラインメントを示している。ヘラジカ、ファロージカ、ミュールジカ、およびオジロジカのみが２つの残基、Ｓ／Ｎ１２８およびＱ／Ｅ２２６において互いに異なる（肉太文字で示した）。 図４ ｖＣＪＤおよびｓＣＪＤの変性プロフィールを示している。
（詳細な説明）
定義
次のような選択用語が、本明細書の文脈において使われる。使われた形に関係なく、用語の複数形と単数形の両方が含まれる。
病原性プリオンタンパク質の型（スクレーピータンパク質、病原性タンパク質型、病原性イソ型、病原性プリオンおよびＰｒＰＳｃとも呼ばれる）と非病原性プリオン型（細胞タンパク質型、細胞イソ型、非病原性イソ型、非病原性プリオンタンパク質、およびＰｒＰＣとも呼ばれる）の両方、並びに病原性コンフォメーションまたは正常な細胞コンフォメーションのいずれも有しないプリオンタンパク質の変性型および種々の組み換え型を意味する「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「ＰｒＰタンパク質」および「ＰｒＰ」は互換性がある。
「コンフォメーション病タンパク質」は、タンパク質の構造が変わり（例えば、異常な折り畳み構造または凝集したタンパク質）、ベータプリーツ・シートとの関連における不要な原線維またはアミロイド重合などの異常なコンフォメーションをもたらす、コンフォメーション病と関連するタンパク質の病原性および非病原性のタンパク質の型を意味している。コンフォメーション病タンパク質の例には、ＰｒＰＳｃとＰｒＰＣなどのプリオンタンパク質および免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）、即ちアミロイド沈着症などのコンフォメーション病と関連している抗体分子のタンパク質成分、のアミノ酸変化が無制限に含まれる。２つ以上の異なるコンフォメーションを仮定している付随タンパク質を有する疾患の非限定的なリストを以下に示している。
Figure 2012162571
 用語「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「ＰｒＰタンパク質」、「ＰｒＰ」または「コンフォメーション病タンパク質」の使用は、本明細書に記載されたポリペプチドに対して正確な配列を有するポリペプチドに限定されることを意味しない。これらの用語が、識別されたか、または識別されていない種（例えば、ヒト、ウシ）あるいは疾患（例えば、アルツハイマ病、パーキンソン病など）のいずれかからのコンフォメーション病タンパク質を包含していることは明らかである。また、共同所有の特許出願である、２００４年８月１３日に出願された米国特許出願第１０／９１７，６４６号、２００５年２月１１日に出願された米国特許出願第１１／０５６，９５０号、および２００４年８月１３日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６３６３号を参照のこと。これらの特許はすべて、”Ｐｒｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ”と題し、引用により全体が本明細書に組み込まれている。当業者であれば、この開示の教示および当該技術分野を考慮して、例えば、配列比較プログラム（例えば、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ））または構造的特徴またはモチーフの識別およびアラインメントを用いて他の何らかのプリオンタンパク質における本明細書で開示された配列に対応する領域を決めることができる。
「病原性」は、このタンパク質が実際にこの疾患を生じるか、またはこのタンパク質がこの疾患と関連しており、したがって、この疾患が存在するときに存在することを意味している。したがって、本明細書で使われている病原性タンパク質は、必ずしも疾患の特定の原因物質であるタンパク質ではない。タンパク質の病原型は、感染性であるか、または感染性ではない。病原性コンフォメーション病タンパク質の１例はＰｒＰＳｃである。したがって、用語「非病原性」は、通常は疾患を生じないか、通常は疾患を生じることと関係がないタンパク質を意味している。非病原性コンフォメーション病タンパク質の１例は、ＰｒＰＣである。
タンパク質、例えば、タンパク質フラグメントと相互作用するペプトイド試薬に関連して「相互作用する」は、ペプトイド試薬が、プリオンタンパク質に、特異的に、非特異的に結合し、または一部の組み合わせではプリオンタンパク質への特定および非特定の結合を意味する。ペプトイド試薬は、もし非病原性イソ型に対するよりも病原型に対してより大きな親和性および／または選択性を持って結合するならば、病原性プリオンタンパク質と「優先的に相互作用する」と言われる。病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用するペプトイド試薬は、本明細書では、病原性プリオン特異性ペプトイド試薬とも呼ばれる。一部の実施形態では、増加した親和性および／または特異性は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍である。選択的な相互作用は、必ずしも、特定のアミノ酸またはアミノ酸代替物および／または各ペプチドのモチーフの間の相互作用を必要としない。例えば、一部の実施形態では、本発明のペプトイド試薬は病原性イソ型と優先的に相互作用するが、それにも関わらず、弱いが検出可能なレベル（例えば、興味のあるポリペプチドに対して示した結合の１０％以下）において非病原性イソ型と結合することができる。通常、弱い結合またはバックグラウンド結合は、例えば、適切なコントロールの使用により興味のある化合物またはポリペプチドとの選択的な相互作用から容易に識別できる。一般に、本発明のペプトイドは、非病原型が１０６倍過剰に存在しても病原性プリオンと結合する。
コンフォメーション病タンパク質と相互作用するペプトイド試薬に関する「親和性」または「結合親和性」は、結合の強度を意味し、解離定数（Ｋｄ）として定量的に表すことができる。結合親和性は、当業者には周知の技法を用いて測定することができる。
「プリオン関連疾患」は、全体または一部が、病原性プリオンタンパク質（例えば、ＰｒＰＳｃ）、例えば、限定はしないが、スクレーピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ネコ科の海綿状脳症、クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、新変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）、慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）、ゲルストマン−ストロイスラーシャインカー病（ＧＳＳ）、および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）により生じた疾患を意味している。
用語「変性される」または「変性した」は、タンパク質構造に適用した時には普通の意味を有し、タンパク質がその本来の第２および第３の構造を失ったことを意味している。病原性プリオンタンパク質については、「変性した」病原性プリオンタンパク質は、もはや本来の病原性コンフォメーションを保持しておらず、したがって、このタンパク質はもはや「病原性」ではない。変性した病原性プリオンタンパク質は、変性した非病原性プリオンタンパク質に類似または同一のコンフォメーションを有する。しかし、本明細書では明確にするために、用語「変性した病原性プリオンタンパク質」は、病原性イソ型としてペプトイド試薬により捕捉され、次いで変性される病原性プリオンタンパク質を意味するのに使われることとなる。
「生理的に適切なｐＨ」は、約５．５〜約８．５、または約６．０〜約８．０、または通常約６．５〜約７．５のｐＨを意味している。
「脂肪族基」は、直鎖または分岐炭化水素部分を意味している。脂肪族基は、ヘテロ原子およびカルボニル部分を含むことができる。
「アルキル」は、単独で用いても、または別の基の一部として用いても、脂肪族炭化水素鎖を意味し、特に明記しない限り、１〜６、１〜５、１〜４、または１〜３個の炭素原子を含む直鎖および分岐鎖を含むが、これらに限定されない。例えば、用語「アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、などを包含する。
「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を有する、例えば、２〜７、２〜６、２〜５、または２〜４個の炭素原子を含むアルキル基を意味し、例えば、ビニル、アリル、２−メチル−アリル、４−ブテ−３−ニル、４−ヘキセ−５−ニル、３−メチル−ブテ−２−ニルなどを含むがこれらに限定されない。
「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を有し、例えば、２〜７、２〜６、２〜５、または２〜４個の炭素原子を含むアルキル基を意味している。アルキニル基の例には、エチニル、プロピニル、などがある。
「アルコキシ」は、単独で用いても、または別の基の一部として用いても、化学式−Ｏ−アルキルの基、例えば、メトキシのその普通の意味を有し、アルキルは本明細書で規定されたとおりである。
「ハロ」または「ハロゲン」は、単独または別の基の一部として用いた場合、ＶＩＩ族元素、例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩのその普通の意味を有する。
「アリール」は、単独または別の基の一部として用いた場合、芳香族炭化水素系を意味し、１、２または３環、例えば、フェニル、ベンジル、ナフチル、ナフタレン、アントラセン、フェナントレニル、アントラセニル、ピレニル、などの６〜２０、６〜１４、または６〜１０個の環状炭素原子からなる。アリールの定義には、１つ以上の縮合非芳香族カーボシクリルまたはヘテロシクリル環、例えば、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレンおよびインダンを含む芳香族系も含まれる。縮合非芳香族環を含むアリール基は、芳香族部分または非芳香族部分を介して結合することができる。
「アリール−アルキル」または「アラルキル」は、化学式−アルキル−アリール基を意味し、式中アリールおよびアルキルは本明細書の定義を有する。
「アリールオキシ」は、化学式−Ｏ−アリールの基、例えば、ヒドロキシフェニルのその普通の意味を有し、アリールは本明細書で規定されたとおりである。
「アラルコキシ」は、化学式−Ｏ−アルキル−アリール基、例えば、メトキシフェニルのその普通の意味を有し、アルコキシおよびアリールは本明細書で規定されたとおりである。
「シクロアルキル」は、単独で用いても、または別の基の一部として用いても、環状アルキル、アルケニル、またはアルキニル基、例えば、モノ、ビ−、トリ−環状、縮合、架橋またはスピロ飽和炭化水素部分、例えば、３〜１０個の炭素原子の、例えば、シクロプロピルのその普通の意味を有する。用語「シクロアルキル−アリール」は、化学式−アリール−シクロアルキルの基を意味し、アリールおよびシクロアルキルは本明細書で規定されたとおりである。「シクロアルキルアルキル」は、化学式−アルキル−シクロアルキルの基、例えば、シクロプロピルメチルまたはシクロヘキシルメチル基を意味し、アルキルおよびシクロアルキルは本明細書で規定されたとおりである。
本明細書で使われている「ヘテロアリール」基は、硫黄、酸素または窒素などの少なくとも１つのヘテロ原子を環形成メンバーとして有するヘテロ芳香族を意味している。ヘテロアリール基には、単環系および多環系（例えば、２、３または４個の縮合環を有する）がある。ヘテロアリール基には，ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、フリル（フラニル）、キノリル、イソキノリル、チエニル、イミダゾリル、チアゾリル、インドリル、ピリル、オキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンズチアゾリル、イソキサゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、インダゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、プリニル、カルバゾリル、ベンズイミダゾリル、インドリニル、などの非限定的な例がある。一部の実施形態では、ヘテロアリール基は、１から約２０個までの炭素原子を有し、別の実施形態では、約３から約２０個までの炭素原子を有する。一部の実施形態では、ヘテロアリール基は、３〜約１４、３〜約７、または５〜６個の環形成原子を含む。一部の実施形態では、ヘテロアリール基は、１〜約４、１〜約３、または１〜２個のヘテロ原子を有する。
本明細書で使われている「ヘテロシクロアルキル」は、環状化されたアルキル、アルケニル、およびアルキニル基を含む非芳香族複素環を意味し、環形成炭素原子の１つ以上がＯ、ＮまたはＳ原子などのヘテロ原子により置換される。「ヘテロシクロアルキル」基の例には、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペラジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、２，３−ジヒドロベンゾフリル、１，３−ベンゾジオキソール、ベンゾ−１，４−ジオキサン、ピペリジニル、ピロリジニル、イソキサゾリジニル、イソチアゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、イミダゾリジニル、などがある。ヘテロシクロアルキルの定義には、非芳香族ヘテロサイクリック環、例えば、フタルイミジル、ナフタルイミジル、ならびにインドレンおよびイソインドレン基などの複素環のベンゾ誘導体に縮合した（即ち、共通した結合を有する）１つ以上の芳香族環を有する部分も含まれる。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキル基は、１から約２０個までの炭素原子を有し、別の実施形態では、約３から約２０個までの炭素原子を有する。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキル基は、３〜約１４、３〜約７、または５〜６個の環形成原子を含む。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキル基は、１〜約４、１〜約３、または１〜２個のヘテロ原子を有する。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキル基は、０〜３個の二重結合を有する。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキル基は、０〜２個の二重または三重結合を含む。
「ヘテロアリールアルキル」は、化学式−アルキル−ヘテロアリールの基を意味し、アルキルおよびヘテロアリールは本明細書で規定されたとおりである。
「アシル」は、化学式−Ｃ（Ｏ）−アルキルの基を意味する。一部の実施形態では、アシル基は、１〜１０、１〜８、１〜６、または１〜４の炭素原子を有する。
「アミノアシル」は、化学式−Ｃ（Ｏ）−アルキル−アミノの基を意味し、アルキルは本明細書で規定されたとおりである。
「アルキルアミノ」は、化学式−ＮＨ−アルキルの基を意味し、アルキルは本明細書で規定されたとおりである。
「ジアルキルアミノ」は、化学式−Ｎ（アルキル）２の基を意味し、アルキルは本明細書で規定されたとおりである。
「ハロアルキル」は、１つ以上のハロゲンにより置換されたアルキル基を意味し、アルキルおよびハロゲンは本明細書で規定されたとおりである。
「アルコキシアルキル」は、化学式−アルキル−アルコキシの基を意味し、アルキルおよびアルコキシは本明細書で規定されたとおりである。
「カルボキシアルキル」は、化学式−アルキル−ＣＯＯＨの基を意味し、アルキルは本明細書で規定されたとおりである。
「カルバミル」は、化学式−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２の基を意味する。
「カルバミルアルキル」は、化学式−アルキル−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２の基を意味し、アルキルは本明細書で規定されたとおりである。
「グアニジノアルキル」は、化学式−アルキル−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２の基を意味し、アルキルは本明細書で規定されたとおりである。
「チオール」は、化学式−ＳＨの基を意味している。
「アルキルチオール」は、化学式−Ｓ−アルキルの基を意味し、アルキルは本明細書で規定されたとおりである。
「アルキルチオアルキル」は、化学式−アルキル−Ｓ−アルキル意味し、アルキルは本明細書で規定されたとおりである。
「イミダゾリルアルキル」は、化学式−アルキル−イミダゾリルの基を意味し、アルキルは本明細書で規定されたとおりである。
「ピペリジルアルキル」は、化学式−アルキル−ピペリジニルの基を意味し、アルキルは本明細書で規定されたとおりである。
「ナフチルアルキル」は、化学式−アルキル−ナフチルの基、例えば、（８’−ナフチル）メチルを意味し、ナフチルはその通常の意味を有し、アルキルは本明細書で規定されたとおりである。
「インドリルアルキル」は、化学式−アルキル−インドールの基、例えば、３’−インドリルエチル、および３’−インドリルメチルを意味し、インドールは、その通常の意味を有し、アルキルは本明細書で規定されたとおりである。
「Ｎ−含有ヘテロシクリル」は、少なくとも１つの環形成Ｎ原子を含む、何らかのヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキル基を指すことを意味している。Ｎ−含有ヘテロシクリル基の例には、ピリジニル、イミダゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリル、インドリル、などがある。
「Ｎ−含有ヘテロシクリルアルキル」は、Ｎ−含有ヘテロシクリルアルキルにより置換されたアルキルを指すことを意味している。
「アミノ」および「１級アミノ」はＮＨ２を意味している。「２級アミノ」は、ＮＨＲを意味し、「３級アミノ」はＮＲ２を意味し、Ｒは何らかの適切な置換基である。
「アンモニウム」は、−Ｎ（Ｒ）３ ＋を指すものとし、Ｒはアルキル、シクロアルキル、アリール、シクロアルキルアルキル、アリールアルキルなどの何らかの適切な部分である。
「アミノ酸」は、天然に存在し、遺伝学的にコード化された２０のα−アミノ酸またはそれらの保護された誘導体のいずれかを指している。アミノ酸の保護された誘導体は、アミノ部分、カルボキシ部分、または側鎖部分に１つ以上の保護基を含むことができる。
アミノ保護基の例には、ホルミル、トリチル、フタルイミド、トリクロロアセチル、クロロアセチル、ブロモアセチル、ヨードアセチル、およびベンジルオキシカルボニル、４−フェニルベンジルオキシカルボニル、２−メチルベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、４−フルオロベンジルオキシカルボニル、４−クロロベンジルオキシカルボニル、３−クロロベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、４−ブロモベンジルオキシカルボニル、３−ブロモベンジルオキシカルボニル、４−ニトロベンジルオキシカルボニル、４−シアノベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、２−（４−キセニル）−イソブロポキシカルボニル、１，１−ジフェニルエタ−１−イルオキシカルボニル、１，１−ジフェニルプロパ−１−イルオキシカルボニル、２−フェニルプロパ−２−イルオキシカルボニル、２−（ｐ−トルイル）−プロパ−２−イルオキシカルボニル、シクロペンタニルオキシ−カルボニル、１−メチルシクロペンタニルオキシカルボニル、シクロヘキサニルオキシカルボニル、１−メチルシクロヘキサニルオキシカルボニル、２−メチルシクロヘキサニルオキシカルボニル、２−（４−トルイルスルホニル）−エトキシカルボニル、２−（メチルスルホニル）エトキシカルボニル、２−（トリフェニルホスフィノ）−エトキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル（「ＦＭＯＣ」）、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、１−（トリメチルシリルメチル）プロパ−１−エニルオキシカルボニル、５−ベンズイソキサリルメトキシカルボニル、４−アセトキシベンジルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、２−エチニル−２−プロポキシカルボニル、シクロプロピルメトキシカルボニル、４−（デシルオキシ）ベンジルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、１−ピペリジルオキシカルボニルなどのウレタン型保護基；ベンゾイルメチルスルホニル基、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィン・オキサイド、および同じようなアミノ保護基がある。
カルボキシ保護基の例には、メチル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−メチルベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、２，４−ジメトキシベンジル、２，４，６−トリメトキシベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル、ペンタメチルベンジル、３，４−メチレンジオキシベンジル、ベンズヒドリル、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル、２，２’，４，４’−テトラメトキシベンズヒドリル、ｔ−ブチル、ｔ−アミル、トリチル、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、４，４’，４”−トリメトキシトリチル、２−フェニルプロパ−２−イル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、フェナシル、２，２，２−トリクロロエチル、ベータ−（ジ（ｎ−ブチル）メチルシリル）エチル、ｐ−トルエンスルホニルエチル、４−ニトロベンジルスルホニルエチル、アリル、シナミル、１−（トリメチルシリルメチル）プロパ−１−エン−３−イル、および同じような部分がある。
用いた保護基の種類は、誘導体化保護基が、残りの分子を混乱させることなく、適切なポイントで優先的に除去できる限り重要ではない。保護基の別の例は、Ｅ．Ｈａｓｌａｍ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｊ．Ｇ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，ｅｄ．，１９７３），ａｔ Ｃｈａｐｔｅｒ２；およびＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（１９９１），ａｔ Ｃｈａｐｔｅｒ７，にある。これらの文献各々の開示は、引用により全体が本明細書に組み込まれている。
「ペプトイド」は、一般に、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上のアミノ酸置換基、好ましくはＮ−置換グリシンを含むペプチド模倣体を指すように使われる。ペプトイドは、とりわけ、米国特許第５，８１１，３８７号に記載されている。
「Ｎ−置換グリシン」は、化学式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−の残基を意味し、式中、各Ｒは（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）シクロアルキル−アリール、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アンモニウム（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、カルバミル、カルバミル（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミジノ、アミジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、チオール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオール、２−１０個の炭素原子のアルキルチオアルキル、Ｎ−含有ヘテロシクリル、Ｎ−含有ヘテロシクリル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、イミダゾリル、４−１０個の炭素原子のイミダゾリルアルキル、ピペリジル、５−１０個の炭素原子のピペリジルアルキル、インドリル、９−１５個の炭素原子のインドリルアルキル、ナフチル、１１−１６個の炭素原子のナフチルアルキル、およびアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、から独立に選択されるものなどのような非水素部分であり、式中各Ｒ部分は、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシから独立に選択される１−３個の置換基で随意に置換されている。
−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−の一部の実施形態では、Ｒは（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）シクロアルキル−アリール、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、カルバミル、カルバミル（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、チオール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオール、２−１０個の炭素原子のアルキルチオアルキル、イミダゾリル、４−１０個の炭素原子のイミダゾリルアルキル、ピペリジル、５−１０個の炭素原子のピペリジルアルキル、インドリル、９−１５個の炭素原子のインドリルアルキル、ナフチル、１１−１６個の炭素原子のナフチルアルキル、ジフェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、式中各Ｒ部分は、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシから独立に選択される１−３個の置換基で随意に置換されている。
−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−の一部の実施形態では、Ｒは（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、９−１５個の炭素原子のインドリルアルキル、１１−１６個の炭素原子のナフチルアルキル、ジフェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシから独立に選択される１−３個の置換基で置換されている。
−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−の一部の実施形態では、Ｒは生理的に適切なｐＨで荷電している部分である。生理的に適切なｐＨで正に荷電したＲの例には、例えば、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アンモニウム（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミジノ、アミジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｎ−含有ヘテロシクリル、およびＮ−含有ヘテロシクリル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルがあり、式中各Ｒ部分は、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３メトキシ、およびＣ１−Ｃ３アルキルから独立に選択される１−３個の置換基で随意に置換されている。
−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−の一部の実施形態では、Ｒは生理的に適切なｐＨにおいて中性である部分である。生理的に適切なｐＨにおいて中性のＲの例には、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）シクロアルキル−アリール、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、２−１０個の炭素原子のアルキルチオアルキル、ジフェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよびアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルがある。別の例には、エチル、プロパ−１−イル、プロパ−２−イル、１−メチルプロパ−１−イル、２−メチルプロパ−１−イル、３−フェニルプロピ−１−イル、３−メチルブチル、ベンジル、４−クロロ−ベンジル、４−メトキシ−ベンジル、４−メチル−ベンジル、２−メチルチオエタ−１−イル、および２，２−ジフェニルエチルがある。
−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−の一部の実施形態では、Ｒはアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（例えば、アミノブチル）である。
Ｎ−置換グリシンの別の例には、Ｒがエチル、プロパ−１−イル、プロパ−２−イル、１−メチルプロパ−１−イル、２−メチルプロパ−１−イル、３−フェニルプロピ−１−イル、３−メチルブチル、ベンジル、４−ヒドロキシベンジル、４−クロロ−ベンジル、４−メトキシ−ベンジル、４−メチル−ベンジル、２−ヒドロキシエチル、メルカプトエチル、２−アミノエチル、３−プロピオン酸、３−アミノプロピル、４−アミノブチル、２−メチルチオエタ−１−イル、カルボキシメチル、２−カルボキシエチル、カルバミルメチル、２−カルバミルエチル、３−グアニジノプロパ−１−イル、イミダゾリルメチル、２，２−ジフェニルエチルまたはインドル−３−イル−エチルであるものがある。
Ｎ−置換グリシンの塩類、エステル類、および保護型（例えば、ＦｍｏｃまたはＢｏｃなどでＮ−保護された）も含まれる。
Ｎ−置換グリシンを含むアミノ酸代替物を作る方法は、とりわけ、米国特許第５，８１１，３８７号で開示され、この特許は引用により全体が本明細書に組み込まれている。
「モノマー」または「サブユニット」は、他のモノマーに連結して鎖、例えば、ペプチドを形成することができる分子を指している。アミノ酸およびＮ−置換グリシンは、モノマーの実例である。他のモノマーと連結した場合、モノマーは「残基」と呼ばれる。
本明細書で使われている「ペプトイド試薬」は、１つ以上の残基が、本明細書で説明したＮ−置換グリシンを含み、コンフォメーション病タンパク質の病原型、特に病原性プリオンタンパク質と優先的に反応するペプチド様のポリマーを指している。Ｎ−置換グリシンの各々を、随意にアミノ酸および／または他のアミノ酸代替物と共に直鎖または分岐鎖内に連結すると、本明細書で説明した「ペプトイド試薬」を作ることができる。これらの連結は、通常ペプチド結合（即ち、アミド）を構成する。
「ペプチド」は、ペプチド結合、即ち１つのアミノ酸のアミノ基が別のアミノ酸のカルボキシル基に連結することにより、接続された少なくとも２つのアミノ酸を含むアミド化合物を意味している。ペプチドは、本明細書では「オリゴペプチド」または「ポリペプチド」と互換性があるものとして使われ、これらの用語の使用により特定のサイズのポリマーを意味することはない。本発明で使用するのに適した非制限的な長さのペプチドには、長さ３〜５残基、長さ６〜１０残基（またはこれらの間のいずれかの整数）、長さ１１〜２０残基（またはこれらの間のいずれかの整数）、長さ２１〜７５残基（またはこれらの間のいずれかの整数）、長さ７５〜１００残基（またはこれらの間のいずれかの整数）、または長さが１００より大きい残基のポリペプチドがある。通常、本発明で有用なペプチドは意図した用途に適した最大長を有することができる。このペプチドは、長さが、約２と約１００との間の残基、約２と約５０との間の残基、約２と約２０との間の残基、約２と約１０との間の残基、約２と約８との間の残基、または約２と約５との間の残基の間にある。
ペプチド中のアミノ酸とそのアミノ酸代替物との間の「類似性」は、正確である必要はない。例えば、Ｎ−置換グリシン残基（例えば、−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−）を用いてリジンを置換してもよく、式中Ｒは、アミノメチル、２−アミノエチル、３−アミノプロピル、４−アミノブチル、５−アミノペンチル、または６−アミノヘキシルなどのアミノアルキルである。セリンは、例えば、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、などのヒドロキシアルキル基で置換することができる。一般に、最初のアプローチとして、普通のアミノ酸は、類似の特性、例えば、疎水性、親水性、極性、非極性、芳香族性など、の側鎖を有するＮ−置換グリシン似体で置換することができる。アミノ酸置換ペプチドのさらなるテストおよび最適化は、本明細書で開示された方法により行うことができる。
「共役部分」は、ペプトイド試薬に共有結合した分子である。共役部分の例には、エフェクタ分子、基質、標識、架橋剤、結合剤、ポリマー足場材料、抗原、スペーサ分子などがある。ペプチドおよびその類似体への共役基の結合は、先行技術において十分記録されている。共役部分は、ペプトイド試薬に直接または連結部分を介して結合させることができる。この種の実施形態では、共役部分は、アミノ末端基領域またはカルボキシ末端基領域においてペプトイド試薬に結合する。別の実施形態では、共役部分はアミノ末端基サブユニットまたはカルボキシ末端基サブユニットなどの末端基サブユニットに結合する。この種の実施形態では、共役部分は、架橋剤または結合剤である。一部の実施形態では、共役部分はビオチンまたはメルカプト基を含む。一部の実施形態では、共役部分は検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、ペプトイド試薬は２個以上の共役基を含む。
用語「標識」、「標識付の」、「検出可能な標識」、「検出可能なように標識された」は、放射性同位元素、蛍光体、発光体、化学発光体、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、発光団、染料、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチンまたはハプテン）、蛍光ナノ粒子、金ナノ粒子、などを含むがこれらに限定されない。用語「蛍光体」は、蛍光プローブなどの検出できる範囲で蛍光を示しうる物質またはその一部を指している。本発明で使用できる標識の特定の例には、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、アクリジニウムエステル、ＮＡＤＰＨ、ベータ・ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ、グルコース・オキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびウレアーゼがあるが、これらに限定されない。標識は、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ−Ｈｉｓタグ）、抗体、あるいは増幅可能なまたはそうでなければ検出可能なオリゴヌクレオチドでもよい。
用語「エフェクタ化合物」は、生物学的受容体部位に結合し、そのように結合した後に生化学事象を生じるあらゆる化合物を含む。したがって、エフェクタ化合物は、治療薬並びに殺虫剤を含むがこれらに限定されない。
用語「架橋剤」は、他の分子またはポリマー性足場と共有結合を形成しうる官能基を有する部分を指している。架橋剤の例には、１つ以上の末端基メルカプト、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、および類似の官能基を有するものを含む。一部の実施形態では、架橋剤は、少なくとも１つのメルカプト官能基を有する。
用語「結合剤」は、非共有相互作用を介して別の分子と、またはポリマー足場材料などの物質と結合しうる部分を指している。結合剤の一例は、ビオチンまたはその誘導体である。
「リンカー部分」、「連結部分」または「リンカー」は、共役部分をペプトイド試薬に連結する部分を指している。一部の実施形態では、リンカー部分は化学式−｛ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）｝ｐ−との連結領域を少なくとも１つ有する基であり、式中ｍは１〜１０であり、ｐは１〜５である。一部の実施形態では、リンカー部分はアミノヘキサン酸（Ａｈｘ）の残基またはそのフラグメントを少なくとも１つ含む。この種の部分は、プリオンタンパク質とペプトイド試薬との相互作用をさらに強め、および／またはプリオンタンパク質の検出能力をさらに強める。
ペプトイド試薬
本発明は、プリオンタンパク質などのコンフォメーション病タンパク質と反応するペプトイド試薬、およびペプトイド試薬を含む複合体、組成物およびキット、ならびにこれらを用いてＰｒＰＳｃなどのコンフォメーション病タンパク質を検出し、単離する方法を提供する。本発明のペプトイド試薬は、タンパク質コンフォメーション病、例えば、ＴＳＥなどのプリオン疾患の処置および予防、並びに病原性プリオンを実質的に含まない血液または食料を供給する方法において利用することができる。
本発明は、下記化学式を有するコンフォメーション病タンパク質の非病原型に比べて、コンフォメーション病タンパク質の病原型と優先的に反応する、ペプトイド試薬を提供する、
Ｘａ−（Ｑ）ｎ−Ｘｂ
式中、各Ｑは独立にアミノ酸またはＮ−置換グリシンであり、−（Ｑ）ｎ−はペプトイド領域を規定し、
Ｘａは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アシル、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アシル、アミノ酸、アミノ保護基、または２〜約１００個のアミノ酸のポリペプチドであり、Ｘａはリンカー部分を介して随意に結合される共役部分により随意に置換され、
Ｘｂは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、カルボキシ保護基、アミノ酸、または２〜約１００個のアミノ酸のポリペプチドであり、Ｘｂはリンカー部分を介して随意に結合される共役部分により随意に置換され、
ｎは３〜約３０（即ち、ｎは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上であり）、
ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の少なくとも約５０％はＮ−置換グリシンを含む。
一部の実施形態では、各Ｑは独立にＮ−置換グリシンである。
一部の実施形態では、ペプトイド試薬はＸａ−（Ｑ）ｎ−Ｘｂの化学式有し、ｎは約４〜約３０、好ましくは約５〜約３０であり、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の少なくとも約５０％はＮ−置換グリシンを含む。ただし、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、
（ａ）−ＡＡＢＡ−；
（ｂ）−ＡＡＢＡＢ−；
（ｃ）−ＡＢＡＣＣ−；
（ｄ）−ＡＡＡＡＡ−；
（ｅ）−ＡＢＣＢＡ−；
（ｆ）−ＡＡＢＣＡ−；または
（ｇ）−ＡＢＡＢＡ−；
から独立に選択される少なくとも１つの小区域を含むという条件付である。式中、Ａ、ＢおよびＣは、各々異なるＮ−置換グリシンである。
一部の実施形態では、Ｘａは、（Ｃ１−Ｃ６）アシルまたはアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アシルであり、各々は、連結部分を介して随意に結合している共役部分により随意に置換されている。
一部の実施形態では、Ｘａは、（Ｃ１−Ｃ６）アシルまたはアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アシルであり、各々は、架橋試薬または結合試薬から選択される共役部分により随意に置換され、各々はリンカー部分を介して随意に結合している。
一部の実施形態では、Ｘａは、（Ｃ１−Ｃ６）アシルまたはアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アシルであり、各々は、ビオチンまたはメルカプトから選択される共役部分により随意に置換され、該共役部分は連結部分を介して随意に結合している。
一部の実施形態では、Ｘｂは、リンカー部分を介して随意に結合している共役部分により随意に置換されたアミノ酸である。
一部の実施形態では、Ｘｂは、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノである。
一部の実施形態では、Ｘｂはアミノである。
一部の実施形態では、ｎは、約５〜約１５、５〜約１０、または６である。
一部の実施形態では、ｎは、４〜１０、４〜８、５〜７または６である。
一部の実施形態では、Ｘｂは、共役部分により随意に置換されたアミノ酸であり、ｎは６である。
一部の実施形態では、リンカー部分は、化学式−｛ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）｝ｐ−を有する領域を含む。
一部の実施形態では、ｍは１〜１０である。
一部の実施形態では、ｍは１〜８である。
一部の実施形態では、ｍは５である。
一部の実施形態では、ｐは１〜５である。
一部の実施形態では、ｐは１〜３である。
一部の実施形態では、ｐは１または２である。
一部の実施形態では、Ｘｂは、リンカー部分を介して随意に結合している共役部分により随意に置換されたアミノ酸であり、ｎは６である。
一部の実施形態では、Ｘｂは、アミノ、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであり、Ｘａは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アシル、アミノ（Ｃ１−６）アシル、アミノ酸、またはアミノ保護基であり、Ｘａは、共役部分により置換され、該共役部分はリンカー部分を介して随意に連結され、ｎは６である。
一部の実施形態では、Ｘｂは、アミノ、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであり、Ｘａは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アシル、アミノ（Ｃ１−６）アシル、アミノ酸、またはアミノ保護基であり、Ｘａは、架橋剤または結合剤から選択される共役部分により置換され、該共役部分はリンカー部分を介して随意に結合しており、ｎは６である。
一部の実施形態では、Ｘｂは、アミノ、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであり、Ｘａは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アシル、アミノ（Ｃ１−６）アシル、アミノ酸、またはアミノ保護基であり、Ｘａは、ビオチンまたはメルカプトを含む共役部分により置換され、共役部分はリンカー部分を介して随意に連結しており、該リンカー部分の少なくとも一部は化学式−｛ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）｝ｐ−を有し、ｎは６であり、ｍは１〜１０であり、ｐは１〜５である。
一部の実施形態では、各Ｑは独立にアミノ酸または化学式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−を有するＮ−置換グリシンであり、式中各Ｒは、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）シクロアルキル−アリール、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アンモニウム（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、カルバミル、カルバミル（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミジノ、アミジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、チオール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオール、２−１０個の炭素原子のアルキルチオアルキル、Ｎ−含有ヘテロシクリル、Ｎ−含有ヘテロシクリル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、イミダゾリル、４−１０個からなる炭素原子のイミダゾリルアルキル、ピペリジル、５−１０個の炭素原子のピペリジルアルキル、インドリル、９−１５個の炭素原子のインドリルアルキル、ナフチル、１１−１６個からなる炭素原子のナフチルアルキル、およびアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立に選択され、式中各Ｒ部分は、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシから独立に選択される１−３個の置換基で随意に置換されている。
一部の実施形態では、各Ｑは独立にアミノ酸または化学式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−を有するＮ−置換グリシンであり、式中各Ｒは、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）シクロアルキル−アリール、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、カルバミル、カルバミル（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、チオール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオール、２−１０個の炭素原子のアルキルチオアルキル、イミダゾリル、４−１０個の炭素原子のイミダゾリルアルキル、ピペリジル、５−１０個の炭素原子のピペリジルアルキル、インドリル、９−１５個の炭素原子のインドリルアルキル、ナフチル、１１−１６個の炭素原子のナフチルアルキル、ジフェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立に選択され、式中各Ｒ部分は、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシから独立に選択される１−３個の置換基で随意に置換されている。
一部の実施形態では、各Ｑは独立にアミノ酸または化学式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−のＮ−置換グリシンであり、式中各Ｒは、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、９−１５個の炭素原子のインドリルアルキル、１１−１６個の炭素原子のナフチルアルキル、ジフェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立に選択され、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシから独立に選択される１−３個の置換基で置換されている。
一部の実施形態では、各Ｑは独立にアミノ酸またはＮ−（４−アミノブチル）グリシン、Ｎ−（１−フェニルエチル）グリシン、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン、Ｎ−（２−［４−メトキシフェニル］エチル）グリシン、Ｎ−（２−メトキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）グリシン、またはＮ−ベンジルグリシンから選択されるＮ−置換グリシンである。
一部の実施形態では、各Ｑは独立にアミノ酸またはＮ−（４−アミノブチル）グリシンまたはＮ−ベンジルグリシンから選択されるＮ−置換グリシンである。
一部の実施形態では、各Ｑは独立にＮ−置換グリシンである。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、少なくとも３または少なくとも４個のＮ−置換グリシンを含み、該グリシンは生理的に適切なｐＨにおいて荷電している。一部の実施形態では、この荷電は正である。一部の実施形態では、ペプトイド領域の残りのＮ−置換グリシンは生理的に適切なｐＨにおいて中性である。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、２〜６、３〜５、または４個のＮ−置換グリシンを含み、該グリシンは生理的に適切なｐＨにおいて荷電している。一部の実施形態では、この荷電は正である。一部の実施形態では、ペプトイド領域の残りのＮ−置換グリシンは生理的に適切なｐＨにおいて中性である。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の２個のＮ−置換グリシン残基が、生理的に適切なｐＨにおいて正に荷電しており、ペプトイド領域の残りのＮ−置換グリシン残基が生理的に適切なｐＨにおいて中性である。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の３個のＮ−置換グリシン残基が、生理的に適切なｐＨにおいて正に荷電しており、ペプトイド領域の残りのＮ−置換グリシン残基が生理的に適切なｐＨにおいて中性である。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の４個のＮ−置換グリシン残基が、生理的に適切なｐＨにおいて正に荷電しており、ペプトイド領域の残りのＮ−置換グリシン残基が生理的に適切なｐＨにおいて中性である。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の５個のＮ−置換グリシン残基が、生理的に適切なｐＨにおいて正に荷電しており、ペプトイド領域の残りのＮ−置換グリシン残基が生理的に適切なｐＨにおいて中性である。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は生理的に適切なｐＨにおいてポリイオン性である。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は生理的に適切なｐＨにおいてポリカチオン性である。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は生理的に適切なｐＨにおいてポリアニオン性である。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は生理的に適切なｐＨにおいて少なくとも３＋の正味荷電を有する。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は生理的に適切なｐＨにおいて少なくとも４＋の正味荷電を有する。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は生理的に適切なｐＨにおいて２＋〜６＋の正味荷電を有する。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は生理的に適切なｐＨにおいて３＋〜５＋の正味荷電を有する。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は生理的に適切なｐＨにおいて４＋の正味荷電を有する。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、生理的に適切なｐＨにおいて正に荷電している少なくとも３個のＮ−置換グリシンを含む。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、生理的に適切なｐＨにおいて正に荷電している少なくとも４個のＮ−置換グリシンを含む。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、生理的に適切なｐＨにおいて正に荷電している２〜６個のＮ−置換グリシンを含む。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、生理的に適切なｐＨにおいて正に荷電している３〜５個のＮ−置換グリシンを含む。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、生理的に適切なｐＨにおいて正に荷電している４個のＮ−置換グリシンを含む。
一部の実施形態では、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−のＮ−置換グリシンは化学式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−を有し、式中Ｒは、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）シクロアルキル−アリール、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アンモニウム（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、カルバミル、カルバミル（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミジノ、アミジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、チオール、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオール、２−１０個の炭素原子のアルキルチオアルキル、Ｎ−含有ヘテロシクリル、Ｎ−含有ヘテロシクリル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、イミダゾリル、４−１０個の炭素原子のイミダゾリルアルキル、ピペリジル、５−１０個の炭素原子のピペリジルアルキル、インドリル、９−１５個の炭素原子のインドリルアルキル、ナフチル、１１−１６個の炭素原子のナフチルアルキル、およびアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立に選択され、式中各Ｒ部分は、ハロゲン、ヒドロキシおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシから独立に選択される１−３個の置換基で随意に置換され、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、少なくとも３、少なくとも４、２〜６、３〜５、または４個のＮ−置換グリシンを含み、式中Ｒは生理的に適切なｐＨにおいて荷電している部分である。
一部の実施形態では、ペプトイド試薬のＮ−置換グリシンはすべて連続する。
一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、少なくとも１つの共役部分を含む。
一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、リンカー部分を介して結合した少なくとも１つの共役部分を含む。
本発明は、コンフォメーション病タンパク質の非病原型に比べてコンフォメーション病タンパク質の病原型と優先的に反応するペプトイド試薬をさらに提供し、該ペプトイド試薬はアミノ末端基領域、カルボキシ末端基領域、およびアミノ末端基領域とカルボキシ末端基領域との間に少なくとも１つのペプトイド領域を含み、該ペプトイド試薬が約３〜約３０個のＮ−置換グリシンおよび随意に１つ以上のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプトイド領域は、約４〜約３０個、または約５〜約３０個のＮ−置換グリシンを含む。一部の実施形態では、ペプトイド領域は、約４〜約３０個、または約５〜約３０個のＮ−置換グリシンおよび
（ａ）−ＡＡＢＡ−；
（ｂ）−ＡＡＢＡＢ−；
（ｃ）−ＡＢＡＣＣ−；
（ｄ）−ＡＡＡＡＡ−；
（ｅ）−ＡＢＣＢＡ−；
（ｆ）−ＡＡＢＣＡ−；または
（ｇ）−ＡＢＡＢＡ−；
から選択されるペプトイド小区域を含み、式中Ａ、ＢおよびＣは、各々異なるＮ−置換グリシンであり、各小区域配列は、アミノ末端基からカルボキシ末端基の方向に左から右へ読む。
一部の実施形態では、ペプトイド領域は、約５０〜約１００％、約７５〜約１００％、または１００％のＮ−置換グリシンを含む。
一部の実施形態では、ペプトイド領域は、サブユニットの数で約５〜約５０、約５〜約３０、約５〜約１５、約５〜約７、または６個のサブユニット長である。
一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、全長で、約５〜約５０、約５〜約３０、約５〜約１５、または約６〜約９個のサブユニットを有する。
一部の実施形態では、少なくとも１つのペプトイド領域は、ペプトイド試薬の全長の約５０％より大きく、約７５％より大きく、または約９０％より大きい。
一部の実施形態では、Ｎ−置換グリシンはすべてペプトイド領域において連結する。
一部の実施形態では、ペプトイド領域のＮ−置換グリシンは、化学式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−を有し、式中Ｒは本明細書を通して規定されたとおりである。
一部の実施形態では、ペプトイド領域は、生理的に適切なｐＨにおいてポリイオン性であり、荷電したペプトイド領域については本明細書をとおして説明したいずれかの実施形態に記載の特性を有する。
本発明は、コンフォメーション病タンパク質の非病原型に比べてコンフォメーション病タンパク質の病原型と優先的に反応するペプトイド試薬をさらに提供し、該試薬は３〜１５個の連結するＮ−置換グリシンを含むペプトイド試薬を含み、該ペプトイド領域は生理的に適切なｐＨにおいて正味の荷電を有する。一部の実施形態では、正味荷電は、生理的に適切なｐＨにおいて少なくとも３＋または少なくとも４＋などの正味の正荷電である。一部の実施形態では、ペプトイド試薬自身は、生理的に適切なｐＨにおいて２＋〜６＋、３＋〜５＋、または４＋の正味荷電を有する。
一部の実施形態では、ペプトイド領域の連結するＮ−置換グリシンの少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４個が生理的に適切なｐＨにおいて荷電している。別の実施形態では、ペプトイド領域の連結するＮ−置換グリシンの少なくとも２個が、１級アミノ、２級アミノ、３級アミノ、アンモニウム（４級アミノ）、グアニジノ、アミジノ、またはＮ−含有ヘテロシクリルから選択される少なくとも１つの部分を含む。
さらに別の実施形態では、ペプトイド領域の連結するＮ−置換グリシンの少なくとも２個が、１級アミノ、２級アミノ、アンモニウム、グアニジノ、アミジノ、またはＮ−含有ヘテロシクリルから選択される少なくとも１つのＮ−置換基を含む。
さらに別の実施形態では、連続するＮ−置換グリシンの少なくとも２個が、本明細書で提示された定義によるＲ基であるＮ−置換基を含む。
さらに別の実施形態では、ペプトイド試薬は、６個の連結するＮ−置換グリシンのペプトイド領域を含み、ペプトイド試薬自身は、生理的に適切なｐＨにおいて３＋または４＋の正味荷電を有する。
本発明は、ペプトイド試薬を作り、病原性プリオンタンパク質を検出するためにペプトイド試薬を用いる方法、ペプトイド試薬を用いて病原性プリオンタンパク質を単離する方法、試料から病原性プリオンタンパク質を除去または低減する方法、および種々の方法を行うためのコンポーネントを含むキットも提供する。
「ペプトイド試薬」は、アミノ末端基領域、カルボキシ末端基領域およびアミノ末端基領域とカルボキシ末端基領域との間にある少なくとも１つの「ペプトイド領域」を有するペプトイド分子を指している。アミノ末端基領域は、通常Ｎ−置換グリシンを全く含まない該試薬のアミノ末端側の領域を指している。アミノ末端基領域は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アシル、アミノ保護基、アミノ酸、ペプチド、などでよい。一部の実施形態では、アミノ末端基領域は、Ｘａに相当する。カルボキシ末端基領域は、Ｎ−置換グリシンを含まないペプトイドのカルボキシ末端基上の領域を指している。カルボキシ末端基領域は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ保護基、アミノ酸、ペプチドなどを含む。一部の実施形態では、カルボキシ末端基領域はＸｂに相当する。一部の実施形態では、ペプトイド試薬の全長は、約５〜約５０サブユニット、約５〜約３０サブユニット、約５〜約１５サブユニット、または約６〜約９サブユニットである。一部の実施形態では、ペプトイド試薬はカルボキシ末端基アミドである。ペプトイド領域は、一般に、ペプトイド試薬の一部を指し、該試薬ではその中の少なくとも３個のアミノ酸がＮ−置換グリシンで置換されている。
「ペプトイド領域」（本明細書では「−（Ｑ）ｎ−」とも表される）は、アミノ末端基に最も近いＮ−置換グリシンを含み該グリシンで始まり、カルボキシ末端基に最も近いＮ−置換グリシンを含み該グリシンで終わる。一部の実施形態では、ペプトイド領域は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のＮ−置換グリシンを含む。一部の実施形態では、ペプトイド領域は、約２５〜約１００％、約５０〜約１００％、約７５〜約１００％のＮ−置換グリシンを含む。一部の実施形態では、ペプトイド領域は、１００％のＮ−置換グリシンを含む。一部の実施形態では、ペプトイド領域は、該ペプトイド試薬の全長の約５０％より大きい（例えば、約５０−１００％）。一部の実施形態では、ペプトイド領域は、該ペプトイド試薬の全長の約６０％より大きい（例えば、約６０−１００％）。一部の実施形態では、ペプトイド領域は、該ペプトイド試薬の全長の約７５％より大きい（例えば、約７５−１００％）。一部の実施形態では、ペプトイド領域は、該ペプトイド試薬の全長の約９０％より大きい（例えば、約９０−１００％）。一部の実施形態では、ペプトイド領域は、該ペプトイド試薬の全長の１００％である。
一部の実施形態では、ペプトイド領域は少なくとも３個のＮ−置換グリシンを含む。一部の実施形態では、ペプトイド領域は少なくとも４個のＮ−置換グリシンを含む。一部の実施形態では、ペプトイド領域は少なくとも５個のＮ−置換グリシンを含む。一部の実施形態では、ペプトイド領域は少なくとも６個のＮ−置換グリシンを含む。一部の実施形態では、ペプトイド領域は３〜約３０、約５〜約３０個のＮ−置換グリシン、および随意に１つ以上のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプトイド領域は、約５〜約５０、５〜約３０、５〜約１５、５〜約１０、５〜約９、５〜約８、５〜約７個のサブユニット長である。一部の実施形態では、ペプトイド領域は、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のサブユニット長である。一部の実施形態では、ペプトイド領域は６個のサブユニット長である。一部の実施形態では、ペプトイド領域のＮ−置換グリシンのすべては連結する。一部の実施形態では、ペプトイド領域のサブユニットのすべては、Ｎ−置換グリシンである。
別の実施形態では、ペプトイド試薬は、４〜１２、４〜１０、４〜９、４〜８、５〜７、または６個の連結するＮ−置換グリシンのペプトイド領域を含む。
一部の実施形態によれば、ペプトイド領域は生理的に適切なｐＨにおいてポリイオン性である。用語「ポリイオン性」は、ペプトイド領域が、生理的に適切なｐＨにおいて荷電している２個以上の残基を含むことを意味している。一部の実施形態では、ペプトイド領域は生理的に適切なｐＨにおいて、ペプトイド試薬はポリカチオン性またはポリアニオン性である。別の実施形態では、ペプトイド領域は、生理的に適切なｐＨにおいて、少なくとも３＋または少なくとも４＋の正味荷電を有する。さらに別の実施形態では、ペプトイド領域は、生理的に適切なｐＨにおいて２＋〜６＋、３＋〜５＋、または４＋の正味荷電を有する。
荷電しているＮ−置換グリシン残基の非限定的な例には、Ｎ−（５−アミノペンチル）グリシン、Ｎ−（４−アミノブチル）グリシン、Ｎ−（３−アミノプロピル）グリシン、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン、Ｎ−（５−グアニジノペンチル）グリシン、Ｎ−（４−グアニジノブチル）グリシン、Ｎ−（３−グアニジノプロピル）グリシン、およびＮ−（２−グアニジノエチル）グリシンがある。
一部の実施形態では、ペプトイド領域は、生理的に適切なｐＨにおいて正に荷電している少なくとも３または少なくとも４個のＮ−置換グリシンを含む。
一部の実施形態では、ペプトイド領域は、生理的に適切なｐＨにおいて正に荷電している２〜６、３〜５、または４個のアミノＮ−置換グリシンを含む。
一部の実施形態では、ペプトイド領域は、化学式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−を有し、残基の少なくとも３、少なくとも４、２〜６、３〜５、または４個が、生理的に適切なｐＨにおいて荷電している。
一部の実施形態では、ペプトイド領域の荷電残基が、化学式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−を有し、式中Ｒはアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アンモニウム（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、グアニジノ、グアニジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミジノ、アミジノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｎ−含有ヘテロシクリル、およびＮ−含有ヘテロシクリル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立に選択され、式中各Ｒ部分は、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ３）メトキシ、および（Ｃ１−Ｃ３）アルキルから独立に選択される１−３個の置換基で随意に置換される。一部の実施形態では、Ｒはアミノブチルなどのアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである。
一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、生理的に適切なｐＨにおいて少なくとも３＋または少なくとも４＋の正味荷電を有する。さらに別の実施形態では、ペプトイド試薬は、生理的に適切なｐＨにおいて２＋〜６＋、３＋〜５＋、または４＋の正味荷電を有する。
ペプトイド試薬のペプトイド領域は少なくとも１つのペプトイド小区域を含み、該小区域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２以上の残基の連結するＮ−置換グリシンの配列を指している。一部の実施形態では、ペプトイド領域は、
（ａ）−ＡＡＢＡ−；
（ｂ）−ＡＡＢＡＢ−；
（ｃ）−ＡＢＡＣＣ−；
（ｄ）−ＡＡＡＡＡ−；
（ｅ）−ＡＢＣＢＡ−；
（ｆ）−ＡＡＢＣＡ−；または
（ｇ）−ＡＢＡＢＡ−；
から独立に選択される少なくとも１つのペプトイド小区域を含む。
Ａ、ＢおよびＣは、各々異なるＮ−置換グリシンを表している。例えば、小区域に存在している各Ａは特定のＮ−置換グリシンを指し、小区域に存在している各Ｂは別の特定のＮ−置換グリシンを指しているが、ＡとＢとは互いに異なる。したがって、ＣはＡかＢのいずれかと異なるＮ−置換グリシンである。小区域配列は、アミノからカルボキシ方向に、即ち左から右へ、読むことを意味している。一部の実施形態では、Ａが疎水性残基である場合は、Ｂは親水性残基であり、逆の場合も同じである。一部の実施形態では、ペプトイド小区域は均一であり、即ちただ１つの型のＮ−置換グリシンを含む。一部の実施形態では、Ａが脂肪族残基である場合は、Ｂは環状残基である。一部の実施形態では、Ｂが脂肪族残基である場合は、Ａは環状残基である。一部の実施形態では、ＡとＢとの両方が脂肪族である。一部の実施形態では、ＡとＢとは脂肪族であり、Ｃは環状である。一部の実施形態では、Ｎ−置換グリシンはすべて小区域−ＡＡＢＡ−、例えば、−（Ｎ−（２−メトキシエチル）グリシン）２−Ｎ−（４−アミノブチル）グリシン−（Ｎ−（２−メトキシエチル）グリシン）−などの脂肪族であり、式中ＡはＮ−（２−メトキシエチル）グリシンであり、ＢはＮ−（４−アミノブチル）グリシンである。
一部の実施形態では、ペプトイド領域は、トリペプトイド、即ち３個の連結するＮ−置換グリシンである。トリペプトイドペプトイド小区域の例には、−（Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）グリシン）２−Ｎ−（４−グアニジノブチル）グリシン、−Ｎ−（４−アミノブチル）グリシン−（Ｖ）２−があり、式中ＶはＮ−ベンジルグリシンまたはＮ−（２−メトキシエチル）グリシン−、Ｎ−ベンジルグリシン−Ｗ−Ｎ−ベンジルグリシンであり、式中ＷはＮ−（４−アミノブチル）グリシンまたはＮ−（２−メトキシエチル）グリシン、および−Ｎ−（４−アミノエチル）グリシン−（Ｎ−（２−（４−メトキシフェニル）エチル）グリシン）２−である。一部の実施形態では、トリペプトイド小区域は、少なくとも１つの脂肪族残基および１つの環状残基、例えば、（Ａ）２−Ｂ、Ｂ２−Ａ、またはＢ−Ａ−Ｂを含み、式中Ａは脂肪族残基、Ｂは環状残基である。
一部の実施形態では、ペプトイド領域はＮ−（４−アミノブチル）グリシン−（Ｓ）−Ｎ−（１−フェニルエチル）グリシン・ジペプトイドなどのジペプトイドである。
一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、本明細書で後に示す、配列番号２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、または２４１から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、配列番号２２９、２３０、２３２、２３３、２３４、２３５、２３７、２３８、２３９、または２４０から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、配列番号２２９、２３０、２３５、２３７、２３８、２３９、または２４０から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、配列番号２３０、２３７、２３８、２３９、または２４０から選択される配列を含む。一部の実施形態では、本発明は、ペプトイド試薬Ｉ、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、またはＸＩＩｂを含む。一部の実施形態では、本発明は、ペプトイド試薬ＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、またはＸＩＩｂを含む。
本発明のペプトイド試薬は、コンフォメーション病タンパク質のペプチド・フラグメントのアミノ酸をＮ−置換グリシンにより置換することによりコンセプトを巧みに処理することができる。親ペプチド・フラグメントは、コンフォメーション病タンパク質に結合できるのが好ましい。親ペプチド・フラグメントの例には、下記配列番号の配列を有するものがある。
Figure 2012162571
Figure 2012162571
 一部の実施形態では、ペプチド・フラグメントの少なくとも１つの非プロリン残基は、Ｎ−置換グリシンにより置換され、ペプトイド試薬を形成する。一部の実施形態では、ペプチド・フラグメントの少なくとも３個のアミノ酸残基が、各々、Ｎ−置換グリシンにより置換され、ペプトイド試薬を形成する。一部の実施形態では、少なくとも５個のアミノ酸残基がＮ−置換グリシンにより置換される。
一部の実施形態では、コンフォメーション病タンパク質はプリオンタンパク質である。例えば、ペプチド・フラグメントは、２００４年８月１３日に出願された共同所有の特許出願である米国特許出願第１０／９１７，６４６号、２００５年２月１１日に出願された米国特許出願第１１／０５６，９５０号、および２００４年８月１３日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６３６３号の配列番号２に示されたマウスのプリオン配列に従って番号を付けられた残基２３−４３または８５−１５６（例えば、２３−３０、８６−１１１、８９−１１２、９７−１０７、１１３−１３５、および１３６−１５６）に対応するこれらの領域のいずれかから導くことができ、これらの特許の発明の名称はすべて、”Ｐｒｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ”であり、各特許は引用により全体が本明細書に組み込まれている。
一部の実施形態では、ペプトイド・フラグメントは、配列番号１４、５０、５１、５２、１２、７２、６８または１１５〜２１９のいずれか１つから選択される。一部の実施形態では、ペプトイド・フラグメントは、配列番号１４、５０、５１、５２、または１６１〜２１９のいずれか１つから選択される。一部の実施形態では、ペプトイド・フラグメントは、配列番号１２、７２、６８または１１５〜１６０のいずれか１つから選択される。一部の実施形態では、ペプトイド・フラグメントは、配列番号１４、５０、または６８のいずれか１つから選択される。
出発点として、ペプチド・フラグメント中のアミノ酸残基は、置換スキームに従ってＮ−置換グリシンにより置換することができ、疎水性アミノ酸残基は疎水性Ｎ−置換グリシンにより置換され、親水性アミノ酸残基は親水性Ｎ−置換グリシンにより置換される。一部の実施形態では、ペプチドのアミノ酸モノマーは、次の置換スキームに従ってＮ−置換グリシンにより置換することができ、修飾ペプチドを形成する。
（ａ）Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、およびＶａｌはＮ−（アルキル）グリシン、Ｎ−（アラルキル）グリシン、またはＮ−（ヘテロアリールアルキル）グリシンにより置換することができる、
（ｂ）Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒは、Ｎ−（ヒドロキシアルキル）グリシン、Ｎ−（アルコキシ）グリシン、Ｎ−（アミノアルキル）グリシンまたはＮ−（グアニジノアルキル）グリシンにより置換することができる。
（ｃ）Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒは、Ｎ−（アラルキル）グリシン、Ｎ−（ヘテロアリールアルキル）グリシン、Ｎ−（ヒドロキシアラルキル）グリシン、またはＮ−（アルコキシアラルキル）グリシンにより置換することができ、および
（ｄ）Ａｒｇ、Ｈｉｓ、およびＬｙｓは、Ｎ−（アミノアルキル）グリシンまたはＮ−（グアニジノアルキル）グリシンにより置換することができる。
修飾ペプチドは、本明細書で説明した方法によりプリオンタンパク質の病原型への結合についてテストすることができる。上のスキームによるアミノ酸モノマーの追加置換は、Ｎ−置換グリシンを用いて行うことができ、適切な結合が得られるまで再テストすることができる（即ち、プリオンの病原型と優先的に反応するペプトイド試薬）。
ペプトイドを作る方法は、米国特許第５，８１１，３８７号および米国特許第５，８３１，００５号において開示され、これらの特許の各々は引用により全体並びに本明細書で開示された方法が本明細書に組み込まれている。
本発明のペプトイド試薬は、モノマー、マルチマー、環状分子、分岐分子、リンカーなどを含む。本明細書で説明したいずれかの配列のマルチマー（即ち、ダイマー、トリマーなど）または生物学的機能がマルチマーと同等なことも考慮されている。マルチマーは、同一のモノマーから構成されたホモマルチマーでもよく、例えば、各モノマーは以下で説明する配列番号２２９などの同じペプトイド配列である。あるいは、マルチマーは、マルチマーが含むすべてのモノマーが同一でないヘテロマルチマーもありうる。
マルチマーは、モノマーを互いに直接結合して形成するか、または基質にモノマーを直接結合して形成することができ、例えば、多抗原性ペプチド（ＭＡＰＳ）（例えば、対称性ＭＡＰＳ）、ＰＥＧ足場材料などのポリマー足場材料に結合したペプチドおよび／またはスペーサ・ユニット有り無しの両方で直列に連結したペプチドがある。あるいは、リンカーをモノマーに加え、モノマーを結合させてマルチマーを形成することができる。リンカーを用いたマルチマーの非限定的な例には、例えば、グリシンリンカーを用いたタンデムリピート、リンカーを介して基質に結合したＭＡＰＳおよび／またはリンカーを介して足場材料に結合した直線的に連結したペプチドがある。当業者には周知のように、２官能性スペーサユニット（ホモ２官能性またはヘテロ２官能性のいずれか）を用いてリンカー部分を含めてもよい。
一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、プリオン関連疾患のコンフォメーション病タンパク質と反応するが、コンフォメーション病タンパク質の病原型はＰｒＰＳＣであり、コンフォメーション病タンパク質の非病原型はＰｒＰＣである。一部の実施形態では、ペプトイド試薬は１つ以上の種からのＰｒＰＳＣに対して特異的であり、例えば、ペプトイド試薬は２つ以上のヒト、ウシ、ヒツジ、シカ、ヘラジカ、ヤギ、マウス、またはハムスターからのプリオンタンパク質に対して特異的である。一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、単一種からのＰｒＰＳＣに対して特異的である。
一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、コンフォメーション病タンパク質の非病原型に関する親和性よりも、少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、または１０００倍大きい親和性を有するコンフォメーション病タンパク質の病原型と反応する。一部の実施形態では、親和性は、コンフォメーション病タンパク質の非病原型に関する親和性よりも、少なくとも約１０倍大きい。一部の実施形態では、親和性は少なくとも１００倍大きい。
本発明は、本明細書で説明した１つ以上のペプトイド試薬およびプリオンタンパク質を含む複合体をさらに提供する。一部の実施形態では、該複合体は本明細書で説明したペプトイド試薬および病原性プリオンを含む。一部の実施形態では、病原性プリオンはＰｒＰＳＣである。一部の実施形態では、複合体は病原性プリオンおよび／またはペプトイド試薬、プリオン結合試薬または随意に標識されたリガンドを含む。本明細書で使われている用語「複合体」は、プリオン、病原性および非病原性試薬、およびペプトイド試薬および／またはプリオン結合試薬との間の会合体を意味する。したがって、複合体は、必ずしもプリオンとペプトイド試薬との間の会合体ではなく、プリオンとプリオン結合試薬との間の会合体でもよい。複合体内の分子は、例えば、イオン性、疎水性、水素の各結合、ファンデルワールスなどの十分な分子間力により一緒に結合され、本明細書で使われている説明した方法および組成物では複合体を単一ユニットとして機能させることができる。
組成物
本発明は、本明細書で説明した本発明のペプトイド試薬を含む組成物をさらに提供する。一部の実施形態では、該組成物は、ペプトイド試薬および生物学的試料などの試料を含む。生物学的試料は、生命体またはかっての生命体から作られた試料である。生物学的試料の非限定的な例は、臓器（例えば、脳、肝臓、および腎臓）、細胞、全血、血液画分、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脳組織、神経系組織、筋肉組織、筋肉および脂肪組織（例えば、肉）、骨髄、尿、涙、非神経系組織、ビーフ、ポークまたは子牛の肉などの生命体またはかっての生命体から得られる食料のほか、および植物性素材などの他の有機物質である。生物学的試料は、献血または選別、生検、解剖、または検視、または動物の選択および食肉処理および仕上げ製品の品質保証テストなどの食料調製の間の処理または操作などの健康に関連した操作の間に得ることができる。
本発明は、固体支持体および少なくとも１つの本発明のペプトイド試薬を含む組成物も提供する。固体支持体は、例えば、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、ポリフッ化ビニル、ジアゾ紙、ナイロン膜、活性ビーズ、および／または磁気反応ビーズ、またはポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン・ラテックス、ポリカーボネート、ナイロン、デキストラン、キチン、砂、シリカ、軽石、アガロース、セルロース、ガラス、金属、ポリアクリルアミド、シリコン、ゴム、または多糖類；ジアゾ紙；または固相合成、親和性分離、精製、交配反応、免疫アッセイおよび他のこの種の用途に使われるあらゆる物質がありうる。支持体は、微粒子または連続表面の形態とすることができ、膜、メッシュ、プレート、ペレット、スライド、ディスク、毛細管、中空繊維、針、ピン、チップ、中実繊維、ゲル（例えば、シリカゲル）およびビーズ（例えば、気孔ガラスビーズ、シリカゲル、ジビニルベンゼンで随意に架橋したポリスチレンビーズ、グラフトコポリビーズ、ポリアクリルアミド・ビーズ、ラテックス・ビーズ、Ｎ−Ｎ’−ビスアクリロイルエチレンジアミンで随意に架橋したジメチルアクリルアミド・ビーズ、酸化鉄磁気ビーズ、および疎水性ポリマーで被覆したガラスビーズ）を含む。一部のこのような実施形態では、固体支持体は、ニトロセルロース、ポリスチレン・ラテックス、ポリフッ化ビニル、ジアゾ紙、ナイロン膜、活性ビーズ、および磁気反応ビーズからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ペプトイド試薬を含む組成物は、薬学的組成物であり、即ち薬学的に許容でき、薬理学的に許容できる。一部の実施形態では、この組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容できる担体または賦形剤をさらに含む。薬学的な担体は、固体でも液体でもよい。固体担体は、香料添加剤、甘味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、結合剤、または錠剤崩壊剤としても作用できる１つ以上の物質を含むことができる。薬学的な担体は、封入物質でもよい。粉末では、担体は微粉砕されたペプトイド試薬と混合している微粉砕固体を含む。適切な担体は、通常、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマ、脂質集合体（油滴またはリポソームなどの）などの大きく、徐々に代謝される巨大分子、および不活性なウイルス粒子である。この種の担体は、当業者にはよく知られている。
賦形剤は、嵩を大きくし、満足な処理および圧縮特性を与え、溶解速度の制御に役立ち、および／またはそうでなければコア物質に望ましい物理特性を追加する成分である。例えば、賦形剤は、ワシントンＤ．Ｃ．のアメリカ薬学協会、およびロンドンの英国薬学協会の薬学的賦形剤ハンドブック（ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｉｐｉｅｎｔ）（１９８６）において説明された当業者には周知の希釈剤、結合剤、潤滑剤および崩壊剤である。このハンドブックは引用により全体が本明細書に組み込まれている。適切な賦形剤には、例えば、ヒプロメローズ、ＨＰＣ、ＨＥＣ、カルボキシメチルセルロース、微晶質セルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、およびそれらの誘導体および塩類などのセルロース性物質、ＰＥＧなどの他の有機化合物、タルク、ラクトース、ならびにスクロース、グルコース、フルクトース、マルトースなどの他の糖類、ならびにマルトデキストリン、アカシア、デキストリン、アルギン酸、エチルセルロース樹脂、ゼラチン、グァーガム、メチルセルロース、アルファ化澱粉、アルギン酸ナトリウム、澱粉、ゼイン、ポリビニルピロリドン、ビニルピロリドン−酢酸ビニル・コポリマ、酢酸ビニル−クロトン酸コポリマおよびエチルアクリレート−メタクリレート酸コポリマ；プロピレングリコール、グリセリン、トリメチロールプロパン、ＰＥＧポリマー、ジブチルセバケート、アセチレート化モノグリセリド、ジエチルフタレート、トリアセチン、グリセリルトリアセテート、アセチルトリエチルサイトレートおよびトリエチルサイトレートなどの可塑剤；ならびにタルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、水素化植物油、ラウリル硫酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、安息香酸ナトリウムと酢酸ナトリウムとの混合物などの潤滑油、塩化ナトリウム、ロイシン、および（登録商標）Ｃａｒｂｏｗａｘ４０００がある。
本発明の医薬組成物は、他の分子、例えば、抗原および免疫グロブリン、サイトカイン、リンフォカイン、およびケモカイン、例えば、以下に限定されるものではないが、インターロイキン２（ＩＬ−２）、修飾ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５−ｓｅｒ１２５）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、アルファ−またはガンマ−インターフェロン、ケモカインＩＰ−１０、およびＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、およびＭＩＰ１−βなどのβケモカインと併用して投与することもできる。併用して投与した場合、該組成物は他の分子と同時にまたは逐次的に投与することができ、もし同時に投与投与する場合は、該組成物および他の分子を含む混合物などの単回投与ユニットとして、または該組成物または他の分子のいずれかを含む各ユニットを、別々の異なる投与ユニットとして投与することができる。
本明細書で説明した医薬組成物は、治療上有効量のペプトイド試薬を含むことができる。本明細書で使われている「治療上有効な量」は、医薬が投与される哺乳類、例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳類などの感染しているか、いないか、さらされているか、いないかとは無関係に、動物において保護および／または治療の反応を誘起する量を意味している。治療上有効な量は、他にも因子があるが、特に処置される動物、処置される動物の年齢および全身状態、抗体を合成するための該動物の免疫系の能力、望ましい保護の度合い、処置される状態の重篤さ、選択される特定の組成物および、投与モードにより変動する。普通の技量の医師でも、治療上有効な量、並びに最高の臨床効果を達成するための適切な用量および投与（単数または複数）の頻度を決めることができる。例えば、本発明の組成物は、単回に、または複数回の投与計画の一部として投与することができ、さらに、毎日、週１回、月１回、年１回、半年に１回、２年に１回などの頻度で投与することもできる。医薬組成物は、例えば、筋肉注射で、筋肉内に、粘膜内に、皮下に、皮内に、皮膚を介して経皮的に、膣内に、腹腔内に、直腸内に、経口で、鼻から、直腸に、眼球に、腸に、および／または静脈内に、など制限なしに種々のモードにより投与することができる。組成物は、投与に適合させることができ、例えば、経口投与は錠剤またはカプセルの型、随意に腸溶性コートを施したり、液体、または制御放出にすることができ、鼻内投与の場合は、鼻腔用スプレー、点鼻薬、ゲルまたは粉末の型にすることができる。投与計画は、第１投与と第２投与とを含めてもよい。主要投与などの第１投与およびブースターなどの第２投与は、粘膜に、非経口で、またはそれらの組み合わせで投与することもできる。投与ルートの例は示されているが、適切な投与ルート、および用量は、一般に、ケース・バイ・ケースで担当医が決める。この種の判断は当業者には日常の判断である（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９８），Ｆａｕｃｉら、ｅｄｓ．１４ｔｈ ｅｄ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌを参照のこと。）
検出
本発明は、プリオンタンパク質、特に病原性プリオンタンパク質の存在を検出する方法をさらに提供する。この検出方法は、病原性プリオン型と優先的に反応する本発明のペプトイド試薬の特性に依存する。これらの検出方法は、例えば、試料中のコンフォメーション病タンパク質、特に病原性プリオンタンパク質を検出する方法、プリオン関連疾患（例えば、ヒトまたはヒト以外の動物）を診断する方法、実質的にＰｒＰＳｃを含まない輸血、血液製品供給、または食料供給を保証する方法、移植用臓器または組織の試料を分析する方法、手術道具および手術用機器の汚染除去、ならびに病原性プリオンの有無に関する認識が重要である他の何らかの状況を監視する方法と共に用いることができる。
したがって、本発明は、試料中の病原性プリオンの存在を検出する方法に関し、該方法は、もし存在するならば病原性プリオンにペプトイド試薬の結合を可能にする条件下で試料を本発明の第１ペプトイド試薬と接触させて複合体を形成する工程と、複合体の形成を検出する工程とを含み、該複合体の形成は病原性プリオンの存在を示している。ペプトイド試薬を病原性プリオンに結合させる典型的な条件は、本明細書の実施例で説明している。他の適切な結合条件は、当業者が容易に決めることができる。
試料中の病原性プリオンの検出方法は、もし存在するならば病原性プリオンに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で、試料を本発明の第１ペプトイド試薬と接触させて第１複合体を形成する工程と、第１複合体の病原性プリオンに第２ペプトイド試薬を結合させて第２複合体を形成させることができるような条件下で、必要に応じて検出可能に標識された本発明の第２ペプトイド試薬と第１複合体を接触させて第２複合体を形成する工程と、第２複合体の形成を検出する工程とを含むこともでき、第２複合体の形成は病原性プリオンの存在を示している。第２複合体は、第２ペプトイド試薬および病原性プリオン、および随意に、第１ペプトイド試薬を含むことができる。
別の実施形態では、この方法は、もし存在するならば病原性プリオンに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で、試料を本発明の第１ペプトイド試薬と接触させて複合体を形成する工程と、結合していない試料をすべて除去する工程と、第１複合体の病原性プリオンに第２ペプトイド試薬を結合させ第２複合体を形成することができるような条件下で、必要に応じて検出可能に標識された本発明の第２ペプトイド試薬と第１複合体とを接触させて第２複合体を形成する工程と、第２複合体の形成を検出する工程とを含み、第２複合体の形成は病原性プリオンの存在を示している。第１ペプトイド試薬は、固体支持体を随意に含み、該支持体は結合していない試料から第１複合体を分離する際に役立つ。
さらに、本発明の検出方法は、もし存在するならば病原性プリオンに第１ペプトイド試薬の結合を可能にする条件下で、試料を本発明の第１ペプトイド試薬と接触させて第１複合体を形成する工程と、結合していない試料を除去し、病原性プリオンを第１複合体から解離し、それによって解離された病原性プリオンを供給し、第２ペプトイド試薬の解離された病原性プリオンへの結合を可能にする条件下で、第２複合体を形成し、必要に応じて検出可能に標識された、本発明の第２ペプトイド試薬と解離された病原性プリオンとを接触させて第２複合体を形成し、第２複合体の形成を検出する工程とを含み、第２複合体の形成が病原性プリオンの存在を示している。第１複合体の解離は、タンパク質結合相互作用を妨害する従来の方法、例えば、塩またはカオトロピック剤の添加、温度の上昇、洗剤または変性剤の添加、および機械的妨害により達成することができ、本明細書で説明した高ｐＨまたは低ｐＨにおける処理を含めてもよい。
試料中の病原性プリオンの検出方法は、もし存在するならば病原性プリオンに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で、試料を本発明の第１ペプトイド試薬と接触させて第１複合体を形成する工程と、第１複合体の病原性プリオンにプリオン結合試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識されたプリオン結合試薬（本明細書で説明されている）と第１複合体とを接触させて第２複合体を形成させる工程と、第２複合体の形成を検出する工程とを含み、第２複合体の形成が病原性プリオンの存在を示している。第２複合体は、プリオン結合試薬および病原性プリオン、あるいは随意に、第１ペプトイド試薬を含むことができる。
別の実施形態では、この方法は、もし存在するならば、病原性プリオンに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で、試料を本発明の第１ペプトイド試薬と接触させて第１複合体を形成する工程と、結合していない試料をすべて除去する工程と、第１複合体の病原性プリオンにプリオン結合試薬を結合させ第２複合体を形成する条件下で、必要に応じて検出可能に標識されたプリオン結合試薬と第１複合体を接触させる工程と、第２複合体の形成を検出する工程とを含み、第２複合体の形成は病原性プリオンの存在を示している。第１ペプトイド試薬は、固体支持体を随意に含み、該支持体は結合されていない試料から第１複合体を分離する際に役立つ。
さらに、本発明の検出方法は、もし存在するならば病原性プリオンに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で、試料を本発明の第１ペプトイド試薬と接触させて第１複合体を形成する工程と、結合していない試料を除去する工程と、病原性プリオンを第１複合体から解離し、それによって解離された病原性プリオンを提供する工程と、解離された病原性プリオンにプリオン結合試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識されたプリオン結合試薬と解離された病原性プリオンとを接触させて第２複合体を形成する工程と、第２複合体の形成を検出する工程とを含み、第２複合体の形成が病原性プリオンの存在を示している。
別の実施形態では、本発明の検出方法は、もし存在するならば病原性プリオンに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で、試料を本発明の第１ペプトイド試薬と接触させて第１複合体を形成する工程と、結合していない試料を除去する工程と、病原性プリオンを第１複合体から解離させて、それによって解離された病原性プリオンを提供する工程と、解離された病原性プリオンにプリオン結合試薬が結合できる条件下で、プリオン結合試薬と解離された病原性プリオンとを接触させて第２複合体を形成する工程と、第２プリオン結合試薬を用いて第２複合体の形成を検出する工程とを含み、第２複合体の形成は病原性プリオンの存在を示している。
解離された病原性プリオンは、第１複合体から解離中または解離後および第２複合体の形成前に変性されるのが好ましい。通常、複合体から病原性プリオンの解離を生じさせる因子（例えば、カオトロピック剤、熱、高ｐＨまたは低ｐＨ）は、病原性プリオンタンパク質の変性を促進するが、もし望ましいならば、複合体からの病原性プリオンの解離は、例えば、低濃度（例えば、０．４〜１．０Ｍ）のグアニジニウム塩化水素、グアニジニウム・イソチオシアネートを用いて、タンパク質を変性せずに達成することができる。プリオンタンパク質を変性せずに複合体から病原性プリオンを解離する追加の条件については国際公開第２００６０７６４９７号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１０９０号）を参照のこと。
別の実施形態では、この検出方法は、もし存在するならば病原性プリオンに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で、試料を本発明の第１ペプトイド試薬と接触させて第１複合体を形成する工程と、結合していない試料を除去する工程と、第１複合体の病原性プリオンにペプトイド試薬が結合できる条件下で、必要に応じて検出可能に標識された本発明のペプトイド試薬と該複合体とを接触させて第２複合体を形成する工程と、第２複合体の形成を検出する工程とを含み、第２複合体の形成は、病原性プリオンの存在を示している。プリオン結合試薬は、固体支持体上に随意に供給される。
一部の実施形態では、解離工程は、塩またはグアニジニウム・チオシアネート（ＧｄｎＳＣＮ）もしくはグアニジニウム塩化水素（ＧｄｎＨＣｌ）などのカオトロピック剤と結合病原性プリオンタンパク質とを接触させる工程を含む。ＧｄｎＳＣＮまたはＧｄｎＨＣｌの適切な濃度の例は、約３Ｍと約６Ｍとの間にある。
一部の実施形態では、解離工程は、結合病原性プリオンタンパク質の高ｐＨまたは低ｐＨへの露出を含み、それによって、解離された病原性プリオンタンパク質は変性される。例えば、ｐＨは１２より上か、２より下にあってもよい。一部の実施形態では、ｐＨは１２．５と１３．０との間にあってもよい。高いｐＨは、ＮａＯＨを添加して０．０５〜０．１５Ｎの濃度にすることにより得られる。高ｐＨまたは低ｐＨへの露出は、１５分程度または１０分程度行われてもよい。一部の実施形態では、高ｐＨまたは低ｐＨは、リン酸またはそのナトリウム塩の添加により７．０と７．５との間に中和される。
「プリオン結合試薬」は、いくつかのコンフォメーションのプリオンタンパク質に結合する試薬であり、例えば、プリオン結合試薬は、プリオンタンパク質の１つ以上の変性型、即ち、ＰｒＰＣ型（非病原性イソ型）またはＰｒＰＳｃ（病原性イソ型）に結合してもよい。この種のプリオン結合試薬は、１つより多いこれらのプリオンタンパク質型に結合するであろう。プリオン結合試薬は説明されており、例えば、抗プリオン抗体（Ｐｅｒｅｔｚら、１９９７ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：６１４；Ｐｅｒｅｔｚら、２００１
Ｎａｔｕｒｅ ４１２：７３９；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、１９９８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９４１３；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ２００５ ４：８０５；米国特許第４，８０６，６２７号；米国特許第６，７６５，０８８号；および米国特許第６，５３７，５４８号）、モチーフ・グラフトしたハイブリッド・ポリペプチド（国際公開第０３／０８５０８６号を参照のこと）、特定のカチオン性またはアニオン性ポリマー（国際公開第０３／０７３１０６号を参照のこと）、「増殖触媒」である特定のペプチド（国際公開第０２／０９７４４４号を参照のこと）、プリオン特異性ペプチド試薬（例えば、国際公開第２００６／０７６６８７号および米国特許出願公開第２００６００３５２４２号を参照のこと）およびプラスミノーゲンを含む。プリオン結合試薬を利用する方法のすべてにおいて、好ましいプリオン結合試薬は抗プリオン抗体である。
さらに、この検出方法は、本発明のペプトイド試薬を含む固体支持体を提供する工程と、該支持体を検出できるように標識されたリガンドと合体する工程を含むことができ、該支持体のペプトイド試薬は、第１複合体を形成するために、病原性プリオンに対するよりもリガンドに対してより弱い結合親和性を有する工程と、もし試料中に存在するならば、第１複合体のペプトイド試薬に病原性プリオンが結合できる条件下で、試料を第１複合体と合体させる工程と、それにより第１複合体の検出できるように標識されたリガンドを置換する工程と、ペプトイド試薬および病原性プリオンを含む第２複合体を形成する工程と、第２複合体の形成を検出する工程とを含むことができ、第２複合体の形成は病原性プリオンの存在を示している。
試料中に病原性プリオンの存在を検出する方法において使用する場合、該試料は、病原性プリオンタンパク質を含むことが知られているか、含む疑いがあるものでよい。一部の実施形態では、試料は、病原性プリオン、例えば、ＰｒＰＳｃを含む疑いがある。一部の実施形態では、試料は生物学的試料（即ち、生命体またはかっての生命体から調製された試料）、または非生物学的試料である。一部の実施形態では、試料は生物学的試料である。生物学的試料の非限定的な例は、臓器（例えば、脳、肝臓、および腎臓）、細胞、全血、血液画分、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脳組織、神経系組織、筋肉組織、筋肉および脂肪組織（例えば、肉）、骨髄、尿、涙、非神経系組織、生命体またはかっての生命体から得られる食料、ならびに植物性素材などの他の有機物質である。一部の実施形態では、生物学的試料は、全血、血液画分、血液成分、血漿、血小板または血清を含む。一部の実施形態では、生物学的試料は、生検、解剖、または検視から得られる。一部の実施形態では、試料は非生物学的試料である。非生物学的試料の非限定的な例は、医薬品、化粧品、およびパーソナル・ケア製品、ならびに生命体またはかっての生命体から得られたものではない食料等である。試料は、その中およびペプトイド試薬に存在するかもしれない病原性プリオンタンパク質とペプトイド試薬との間の接触を保証するために普通の方法（例えば、加熱、粉砕、超音波処理、特定の消化酵素への露出）で予備処理してよい。
本発明の検出方法は、本明細書で説明したペプトイド試薬のいずれかを利用することができる。一部の実施形態では、本発明の検出方法は、プリオンタンパク質などのコンフォメーション病タンパク質と反応し、コンフォメーション病タンパク質の非病原型に比べて病原型と優先的に反応する、下記化学式を有するペプトイド試薬を利用し、
Ｘａ−（Ｑ）ｎ−Ｘｂ
式中、各Ｑは独立にアミノ酸またはＮ−置換グリシンであり、−（Ｑ）ｎ−はペプトイド領域を規定しており、
ＸａはＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アシル、アミノ（Ｃ１−６）アシル、アミノ酸、アミノ保護基、または２〜１００個のアミノ酸のポリペプチドであり、式中、Ｘａはリンカー部分を介して随意に結合される共役部分により随意に置換される、
ＸｂはＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、カルボキシ保護基、アミノ酸、または２〜１００個のアミノ酸のポリペプチド、式中、Ｘｂはリンカー部分を介して随意に結合する共役部分により随意に置換され、ｎは３〜約３０であり、式中ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−の少なくとも約５０％はＮ−置換グリシンを含む。
この種の実施形態では、ｎは約４〜約３０、好ましくは約５〜約３０であり、ペプトイド領域−（Ｑ）ｎ−は、
（ａ）−ＡＡＢＡ−；
（ｂ）−ＡＡＢＡＢ−；
（ｃ）−ＡＢＡＣＣ−；
（ｄ）−ＡＡＡＡＡ−；
（ｅ）−ＡＢＣＢＡ−；
（ｆ）−ＡＡＢＣＡ−；または
（ｇ）−ＡＢＡＢＡ−；
から独立に選択される少なくとも１つの小区域を含み、式中、Ａ、ＢおよびＣは、各々異なるＮ−置換グリシンである。
検出方法の一部の実施形態では、該ペプトイド試薬はアミノ末端基領域、カルボキシ末端基領域、およびアミノ末端基領域とカルボキシ末端基領域との間に少なくとも１つのペプトイド領域を含み、該ペプトイド領域が約３〜約３０個のＮ−置換グリシンおよび随意に１つ以上のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプトイド領域は、
（ａ）−ＡＡＢＡ−；
（ｂ）−ＡＡＢＡＢ−；
（ｃ）−ＡＢＡＣＣ−；
（ｄ）−ＡＡＡＡＡ−；
（ｅ）−ＡＢＣＢＡ−；
（ｆ）−ＡＡＢＣＡ−；または
（ｇ）−ＡＢＡＢＡ−；
から選択されるペプトイド小区域を含み、式中Ａ、ＢおよびＣは、各々異なるＮ−置換グリシンである。
本発明の検出方法の一部の実施形態では、ペプトイド試薬はコンフォメーション病タンパク質の３〜３０個のアミノ酸ペプチド・フラグメントのペプトイド類似体を含み、該フラグメントは配列番号
Figure 2012162571
 からなる配列の群から選択され、ここで
（ａ）ペプチド・フラグメントの少なくとも１つの非プロリン残基は、Ｎ−置換グリシンにより置換され、ペプトイド類似体を形成し、または
（ｂ）ペプチド・フラグメントの少なくとも５個のアミノ酸残基が、各々、Ｎ−置換グリシンにより置換され、ペプトイド類似体を形成する。
上の方法の一部の実施形態では、ペプチド残基のいずれか１つ以上のアミノ酸残基のＮ−置換グリシンによる置換は、次の置換スキームに対応する。
ｉ）Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｒｏおよびＶａｌはＮ−（アルキル）グリシン、Ｎ−（アラルキル）グリシン、またはＮ−（ヘテロアリールアルキル）グリシンにより置換することができる、
ｉｉ）Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒは、Ｎ−（ヒドロキシアルキル）グリシン、Ｎ−（アルコキシ）グリシン、またはＮ−（グアニジノアルキル）グリシンにより置換することができ、
ｉｉｉ）Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒは、Ｎ−（アラルキル）グリシン、Ｎ−（ヘテロアリールアルキル）グリシン、Ｎ−（ヒドロキシアラルキル）グリシン、Ｎ−（アルコキシアラルキル）グリシンにより置換することができ、および
ｉｖ）Ａｒｇ、Ｈｉｓ、およびＬｙｓは、Ｎ−（アミノアルキル）グリシンまたはＮ−（グアニジノアルキル）グリシンにより置換することができる。
この種の実施形態では、ペプトイド試薬は、上で説明したコンフォメーション病タンパク質の５〜３０個のアミノ酸ペプチド・フラグメントからなるペプトイド類似体を含む。
試料中の病原性プリオンの存在を検出する方法の一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、例えば、配列番号２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、および２４１からなる群から選択される配列を有する本明細書で説明した配列を含む。一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、配列番号２２９、２３０、２３２、２３３、２３４、２３５、２３７、２３８、２３９、または２４０から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、配列番号２２９、２３０、２３５、２３７、２３８、２３９、または２４０から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、配列番号２３０、２３７、２３８、２３９、または２４０から選択される配列を含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、ペプトイド試薬Ｉ、ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、またはＸＩＩｂの１つ以上を利用している。一部の実施形態では、本発明の方法は、ペプトイド試薬ＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、またはＸＩＩｂの１つ以上を利用している。一部の実施形態では、この方法において使われるペプトイド試薬は、配列番号２２９、２３６、２３１、２３２、２３３、２３４または２３５から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ペプトイド試薬は、配列番号２３０、２３７、２３８、２３９、または２４０から選択される配列を含む。この種の実施形態では、ペプトイド試薬は配列番号２３０、２３７または２４０を含む。この種の実施形態では、ペプトイド試薬は配列番号２４０を含む。
一部の実施形態では、試料中の病原性プリオンの存在を検出する方法は、もし存在するならば病原性プリオンタンパク質への第１ペプトイド試薬の結合を可能にする条件下で、第１ペプトイド試薬と試料とを接触させて第１ペプトイド試薬および病原性プリオンを含む複合体を形成し、次いで、病原性プリオンがあれば、第１ペプトイド試薬への病原性プリオンの結合により試料中の病原性プリオンの存在を検出する工程を含む。第１ペプトイド試薬への病原性プリオンの結合は、複合体の形成を検出することにより検出され、複合体の形成は病原性プリオンの存在を示している。一般に、この方法の好ましい実施形態では、第１ペプトイド試薬および病原性プリオンタンパク質を含む複合体は、検出する前に、試料の残り（即ち、結合していない試料）から分離される。複合体の形成は、複合体中の病原性プリオンを検出することにより、または複合体（結合していない試料から分離後）を解離し、解離された病原性プリオンを検出することにより検出することができる。解
離された病原性プリオンは、病原性コンフォメーション中に存在していることもあれば、存在していないこともある。一部の実施形態では、解離された病原性プリオンは変性プリオン・コンフォメーションにある。解離された病原性プリオンは、当該技術分野で周知の方法、例えば、抗プリオン抗体を結合することにより検出することができる。抗プリオン抗体は、適切なプリオンイソ型に対して特異的であり、本明細書でさらに説明する。異なるプリオンイソ型を認識する抗体は、当該技術分野で説明されている（例えば、米国特許第５，８４６，５３３、６，７６５，０８８、６，２６１，７９０、４，８０６，６２７、６，１６５，７８４、６，５２８，２６９号、欧州特許第８９１５５２、９０９３８８号、Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ２００５ ４：８０５を参照のこと）。
上の方法の好ましい実施形態では、病原性プリオンは、カオトロピック剤を用いたペプトイド試薬により、または本明細書で説明した高ｐＨまたは低ｐＨ処理を用いることにより複合体から解離される。
さらに、試料中の病原性プリオンを検出する方法は、まずプリオン特異性ペプトイド試薬を用いて複合体を形成し、次いで、分析方法を用いて複合体を検出することができる。分析方法は、ＵＶ／可視分光法、ＦＴＩＲ、ＮＭＲ分光法、ラマン分光法、質量分析法、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動法、表面プラズモン共鳴分光法、マイクロ−エレクトロ−メカニカル・システム（ＭＥＭＳ）、または当該技術分野で周知の他の方法などの方法を含めてもよい。
一部の実施形態では、ペプトイド試薬またはプリオン結合試薬は、検出可能な標識を含む。本発明において使用するのに適した検出可能な標識は、例えば、本明細書の上で規定した検出可能な分子を含む。一部の実施形態では、この標識は、酵素、放射性同位元素、毒素または蛍光プローブを含む。さらに、検出可能な標識には、オリゴヌクレオチド・タグがあり、該タグはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、分岐ＤＮＡ（ｂ−ＤＮＡ）、核酸配列をベースとする増幅（ＮＡＳＢＡ）、などを含む核酸検出の方法により検出することができる。好ましい検出可能な標識には、酵素、特にアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、および蛍光化合物がある。当該技術分野でよく知られているように、酵素は、検出可能な基質、例えば、発色性基質または蛍光発生基質と併用して検出可能な信号を発生する。
本発明の検出方法の一部の実施形態では、１つ以上のペプトイド試薬が固体支持体に連結される。本発明では、固体支持体は、不溶性マトリックスであればなんでもよく、重要な分子（例えば、本発明のペプトイド試薬、プリオンタンパク質、抗体など）が連結または結合できる剛性または半剛性表面があればよい。典型的な固体支持体には、上ですでに説明したものがあるが、これらに限定されない。本明細書で説明したペプトイド試薬は、支持体に共有結合で、または吸着、カップリングにより、または結合ペアの使用により結合することができる。例えば、ペプトイド試薬は、当該技術分野で周知の技法を用いて固体支持体に容易に連結することができる。支持体への固定は、タンパク質が優れた固相結合特性を有する場合などのタンパク質にペプトイド試薬をまず連結することにより強められる。適切なカップリングタンパク質には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミンなどの巨大分子、および当業者に周知の他のタンパク質があるが、これらに限定されない。ペプトイド試薬は、分子の結合ペアの反応を介して固体支持体に連結することもできる。結合ペアの１つは、固体支持体に連結され、結合ペアのもう１つはペプトイド試薬に結合する（合成前、中、または後）。例えば、支持体は、アビジンまたはストレプトアビジンを含むことができ、ペプトイド試薬はビオチンを含むことができる。ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジンに加えて、ペプトイドを支持体に結合する他の適切な結合ペアには、抗原−抗体、ハプテン−抗体、ミメトープ−抗体、受容体−ホルモン、受容体−リガンド、作動薬−拮抗薬、レクチン−炭水化物、タンパク質Ａ−抗体Ｆｃがあるが、これらに限定されない。この種の結合ペアは、よく知られており（例えば、米国特許第６，５５１，８４３および６，５８６，１９３号を参照のこと）、当業者は適切な結合ペアを選択し、これらを本発明で使用するのに適合させる能力がある。一方、ペプトイド試薬は、当該技術分野でよく知られている共役化学を用いて固体支持体に共有結合させることができる。チオール含有ペプトイド試薬は、当該技術分野で周知の標準方法を用いて、固体支持体、例えば、カルボキシル化磁気ビーズに直接結合される（例えば、Ｃｈｒｉｓｅｙ，Ｌ．Ａ．，Ｌｅｅ，Ｇ．Ｕ．ａｎｄ Ｏ’Ｆｅｒｒａｌｌ，Ｃ．Ｅ．（１９９６）．Ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ｔｏ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｆｉｌｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４（１５），３０３１−３０３９；Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｔ．，Ｓｈｉｍｏｚｏｎｏ，Ｔ．，Ａｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．（１９８０）．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏ−ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２９（４），１１３０−１１３５を参照のこと）。カルボキシル化磁気ビーズは、まず、ヘテロ２官能性架橋剤に連結され、該架橋剤はカーボジイミドの化学を用いたマレイミド官能基（Ｐｉｅｒｃｅ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．からのＢＭＰＨ）を含む。チオール化ペプチドまたはペプトイドは、次いで、ＢＭＰＨ被覆ビーズのマレイミド官能基に共有結合する。本発明の検出方法の実施形態で用いた場合、固体支持体は、本発明のペプトイド試薬および結合していない試料からの病原性プリオンを含む複合体の分離で役立つ。チオール・カップリングの場合、特に便利な磁気ビーズは、Ｄｙｎａｌからの（登録商標）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄである。ペプトイド試薬は、リンカー、例えば、１つ以上のアミノヘキサン酸部分も含めてもよい。
試料中の病原性プリオンの存在を検出する方法の一部の実施形態では、この方法は、もし存在するならば病原性プリオンに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で、試料を本発明の第１ペプトイド試薬と接触させて第１複合体を形成する工程と、第１複合体の病原性プリオンに第２ペプトイド試薬が結合できる条件下で、検出できるように標識された本発明の第２ペプトイド試薬と第１複合体を接触させる工程と、次いで、第２ペプトイド試薬に病原性プリオンが結合できる検出する工程とを含む。一部の実施形態では、第２ペプトイド試薬への病原性プリオンタンパク質の結合は、第２複合体の形成を検出することにより検出することができ、第２複合体の形成は病原性プリオンの存在を示している。一部の実施形態では、ペプトイド試薬は異なっている。一部の実施形態では、第１および第２ペプトイド試薬は同じである。一部の実施形態では、第１ペプトイド試薬はビオチンを含む。別の実施形態では、第１ペプトイド試薬は固体支持体に連結している。
本発明の検出方法の一部の実施形態では、この方法は、もし存在するならば病原性プリオンに第１ペプトイド試薬が結合できる条件下で、試料を本発明の第１ペプトイド試薬と接触させて第１複合体を形成する工程と、試料中に存在する、例えば、非病原性プリオンを含めてもよい結合していない試料を除去する工程と、病原性プリオンを第１複合体から解離させて、それによって解離された病原性プリオンを提供する工程と、解離された病原性プリオンに第２ペプトイド試薬が結合できる条件下で、検出できるように標識された本発明の第２ペプトイド試薬と解離された病原性プリオンとを接触させて第２複合体を形成する工程と、第２複合体の形成を検出する工程とを含み、第２複合体の形成は病原性プリオンの存在を示している。この実施形態では、解離された病原性プリオンは病原性コンフォメーションを保持する。
一般に、「解離病原性プリオン」または「解離プリオン」には、病原性コンフォメーションを保持するプリオンタンパク質、並びに変性された病原性プリオンタンパク質を含めてもよい。これは、変性プリオンは、病原性コンフォメーションまたは正常な細胞コンフォメーションのいずれも有さず、感染のおそれもないからである。
一方、本発明のペプトイド試薬は、病原性プリオンタンパク質を直接捕捉して第１複合体を形成するのに使われ、第１複合体が、上で説明したように、結合していない試料物質から分離される場合は、必要に応じて検出可能に標識された、プリオン結合試薬は、病原性プリオンが第１複合体内に結合している間、または第１複合体からプリオンタンパク質の解離後のいずれかに病原性プリオンの検出に使用することができる。本明細書ですでに説明したように、プリオン結合試薬は、いくつかのコンフォメーションに結合する試薬であり、例えば、プリオン結合試薬はプリオンタンパク質の１つ以上の変性型、即ち、ＰｒＰＣ型（非病原性イソ型）、またはＰｒＰＳｃ（病原性イソ型）に結合してよい。この種のプリオン結合試薬は、１つより多いこれらのプリオンタンパク質型に結合するであろう。プリオン結合試薬は説明されており、該試薬には、例えば、抗プリオン抗体（Ｐｅｒｅｔｚら、１９９７ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：６１４；Ｐｅｒｅｔｚら、２００１
Ｎａｔｕｒｅ ４１２：７３９；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、１９９８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９４１３；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ２００５ ４：８０５；米国特許第４，８０６，６２７号；米国特許第６，７６５，０８８号；および米国特許第６，５３７，５４８号）、モチーフ・グラフトされたハイブリッド・ポリペプチド（国際公開第０３／０８５０８６号を参照のこと）、特定のカチオン性またはアニオン性ポリマー（国際公開第０３／０７３１０６号を参照のこと）、「増殖触媒」である特定のペプチド（国際公開第０２／０９７４４４号を参照のこと）、プリオン特異性ペプチド試薬（例えば、国際公開第２００６／０７６６８７号および米国特許出願公開第２００６００３５２４２号を参照のこと）およびプラスミノーゲンがある。使われた特定のプリオン結合試薬が、プリオンの変性型に結合するならば、第１複合体の病原性プリオンタンパク質は、プリオン結合試薬により検出する前に変性されることは明らかである。プリオン結合試薬、特に抗プリオン抗体、は特定の動物種からのプリオンタンパク質に対して選択的であってよい。したがって、プリオン・コンフォメーションに対する特異性および種特異性の観点では、適切な結合特性を有するプリオン結合試薬が選択されるのは明らかであろう。
本発明のペプトイド試薬は、したがって、試料中の病原性プリオンの「捕捉」試薬としてか、または捕捉された病原性プリオンの「検出」試薬として使用することができる。ペプトイド試薬が病原性プリオンの捕捉のために使われる場合は、捕捉されたプリオンは試料の残り（ペプトイド試薬を用いて形成された複合体により）から除去することができ、ペプトイド試薬へ複合体化する間、または複合体の解離後のいずれかに、該プリオンは普通の手段（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタン・ブロット、免疫沈殿、など）により検出することができる。捕捉されたプリオンは、代わりに、検出できるように標識を付けられている第２ペプトイド試薬を用いて検出することができる。
ＥＬＩＳＡ
試料中の病原性プリオンを検出する特に好ましい方法は、本発明のペプトイド試薬の使用と改良されたＥＬＩＳＡ技法とを組み合わせる方法である。このアッセイは、プリオンタンパク質の病原型と非病原型との間の差異を見分けるペプトイド試薬のパワーを改良されたＥＬＩＳＡ技法と組み合わせる。ペプトイド試薬は病原性プリオンと優先的に反応するので、これらの試薬は試料中に存在する病原性プリオンを分離し、濃縮するのに使われる。通常、病原性イソ型のＮ−末端基消化さえ生じる、病原性イソ型と非病原性イソ型との間の差異を見分けるためにプロテイナーゼＫによる消化を利用する方法とは異なり、本発明の方法においてペプトイド試薬を使用することは、病原性プリオンタンパク質全長の分離を生じる結果になる。したがって、プリオンタンパク質のＮ−末端基端部におけるエピトープ、例えば、残基２３−９０の領域におけるエピトープを認識する抗プリオン抗体、並びにプリオンタンパク質の他の領域のエピトープを認識する抗プリオン抗体は、検出に使用することができる。大抵の種からのプリオンタンパク質のＮ−末端基領域は、リピート配列を含む（オクタリピートＧＱＰＨＧＧＧＳ／Ｗの４コピーまたはウシＰｒＰの５コピー）。この領域内の抗体結合は、アッセイの感度が向上すると生じる結合活性の上昇を示す。
上で説明したペプトイド試薬を用いて非病原性イソ型（これは多くの生物学的試料に存在する）から病原性プリオンタンパク質が一旦分離されると、病原性プリオンタンパク質は、ペプトイド試薬から解離することができ、本明細書で説明した多数のＥＬＩＳＡフォーマットにおいて検出することができる。病原性プリオンは、ペプトイド試薬からの解離プロセスにおいて変性されるが、必ずそのようになるわけではない。ＥＬＩＳＡを行う前に捕捉されたＰｒＰＳｃを変性されるのが好ましい。何故ならば、親和性の高い抗プリオン抗体の多くは、ＰｒＰの変性型に結合し、変性ＰｒＰに結合する多くの抗プリオン抗体が知られており、商業的に利用できるからである。病原性プリオンの解離および変性は、高濃度のカオトロピック剤、例えば、グアニジニウム・チオシアネートまたはグアニジニウムＨＣｌなどの３Ｍ〜６Ｍのグアニジニウム塩を用いて達成することができる。ＥＬＩＳＡを行う前にカオトロピック剤を除去するか、希釈しなければならない。何故ならば、カオトロピック剤は、ＥＬＩＳＡで使われる抗プリオン抗体の結合を妨害するからである。これは、洗浄工程を追加したり、試料の容積を大きくすることが必要になり、これらは両方とも、アッセイを迅速に行ったり、処理量を多くしたい場合には望ましくない。
本発明者らは、一部の実施形態では、病原性プリオンタンパク質の変性、およびペプトイド試薬からの解離のためにカオトロピック剤を使用する代わりに高ｐＨまたは低ｐＨを使用するのが好ましいことを発見した。病原性プリオンタンパク質はペプトイド試薬から容易に解離したり、ｐＨを１２より上に上げたり（例えば、ＮａＯＨにより）、２より下にする成分（例えば、Ｈ３ＰＯ４）を添加することにより変性される。その上、ＥＬＩＳＡにおいて洗浄を追加したり、試料の量を増やすことなく、直接使用することができるので、適切な酸または塩基を添加してｐＨを中性に容易に再調整することができる。
このように、本発明は、試料中の病原性プリオンの存在を検出する方法を提供し、この方法は、もし存在するならば病原性プリオンタンパク質にペプトイド試薬が結合できる条件下で、プリオンタンパク質の病原型と優先的に反応するペプトイド試薬と病原性プリオンを含む疑いのある試料を接触させる工程と、結合していない試料物質を除去する工程と、ペプトイド試薬から病原性プリオンを解離する工程と、プリオン結合試薬を用いて解離された病原性プリオンの存在を検出する工程とを含む。使われた特定のプリオン結合試薬がプリオンの変性型に結合するならば、「捕捉された」病原性プリオンタンパク質はプリオン結合試薬を用いて検出する前に変性されるべきであろう。プリオン結合試薬が抗プリオン抗体であれば好ましい。
抗体、修飾抗体およびプリオン、特にＰｒＰＣまたは変性ＰｒＰに結合する他の試薬は、すでに説明し、これらの一部は商業的に利用できる（例えば、抗プリオン抗体 Ｐｅｒｅｔｚら、１９９７ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：６１４；Ｐｅｒｅｔｚら、２００１ Ｎａｔｕｒｅ ４１２：７３９；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、１９９８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９４１３；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、 ２００５ Ｌａｎｃｅｔ ４：８０５；米国特許第６，７６５，０８８号を参照のこと。これらおよびその他の一部は、カリフォルニア州南サンフランシスコ，ＩｎＰｒｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ミシガン州アン・アーバー，Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，チューリッヒ，Ｐｒｉｏｎｉｃｓ ＡＧから商業的に入手できる；修飾抗体の説明については国際公開第０３／０８５０８６号も参照のこと）。この方法で使用するのに適した抗体には、制限なしに、３Ｆ４（米国特許第４，８０６，６２７号），Ｄ１８（Ｐｅｒｅｔｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７ ２７３：６１４），Ｄ１３（Ｐｅｒｅｔｚ １９９７，上記を参照），６Ｈ４（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２００３ ５１：１０６５），ＭＡＢ５２４２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ），７Ｄ９（Ｋａｓｃｓａｋら、１９８７ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３６８８），ＢＤＩ１１５（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ），ＳＡＦ３２，ＳＡＦ５３，ＳＡＦ８３，ＳＡＦ８４（フランスのＳＰＩ Ｂｉｏから入手できるＳＡＦ抗体），１９Ｂ１０（国際公開第２００４／４０３３６２８号），７ＶＣ（国際公開第２００４／４０３３６２８号），１２Ｆ１０（ＳＰＩ Ｂｉｏ），ＰＲＩ３０８（ＳＰＩ Ｂｉｏ），３４Ｃ９（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ ＡＧ），Ｆａｂ ＨｕＭ−Ｐ（Ｐｅｒｅｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ ２００１ ４１２：７３９），ＰＯＭ１〜ＰＯＭ１９（Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、２００５，上記を参照）、Ｆａｂ ＨｕＭ−Ｒ１（Ｐｅｒｅｔｚ １９９７，上記を参照）およびＦａｂ ＨｕＭ−Ｒ７２（Ｐｅｒｅｔｚ
１９９７，上記を参照）を含む。他の抗プリオン抗体は、当該技術分野において周知の方法により容易に作ることができる。好ましい抗プリオン抗体は、病原性プリオンの変性型に結合する抗体であろう。特に好ましい抗プリオン抗体は、プリオンタンパク質のＮ−末端基領域におけるエピトープを認識する抗体であろう。いくつかの抗プリオン抗体は、動物種の一つまたは限定された数からのプリオンタンパク質に対して特異的であり、他は多くの動物種からのプリオンタンパク質を結合することができる。分析する試料およびテストの目的に基づいて適切な抗プリオン抗体を選ぶことは明らかであろう。
好ましい実施形態では、ペプトイド試薬は固体支持体上に供給される。ペプトイド試薬は、試料を接触させる前に固体支持体上に供給することができるか、または試料を接触させ試料中の何らかの病原性プリオンに結合させた後（例えば、ビオチン化ペプトイド試薬およびアビジンまたはストレプトアビジンを含む固体支持体を用いることにより）、ペプトイド試薬を固体支持体に結合するように適合させることができる。
このようにして、本発明は、下記工程を含む試料中の病原性プリオンの存在を検出する方法をさらに提供する。
（ａ）第１固体支持体上に第１ペプトイド試薬を提供する工程と、
（ｂ）病原性プリオンが試料中に存在する場合、ペプトイド試薬に結合して第１複合体を形成させる条件下で、第１固体支持体を試料と接触させる工程と、
（ｃ）結合していない試料物質を除去する工程と、
（ｄ）病原性プリオンタンパク質を第１複合体から解離させる工程と、
（ｅ）プリオン結合試薬を用いて解離された病原性プリオンを検出する工程。
ペプトイド試薬は、本明細書で説明した試薬のいずれかでよく、ペプトイド試薬は配列番号２２９−２４１からなる群から選択される配列から導かれる。プリオン結合試薬については、本明細書でさらに説明する。プリオン結合試薬は、抗プリオン抗体であるのが好ましい。第１固体支持体は磁気ビーズが好ましく、ポリスチレン／酸化鉄ビーズがより好ましい。
固体支持体上にペプトイド試薬を取り付ける方法は、当該技術分野においては従来の方法であり、本明細書でも説明されており、タンパク質およびペプチドを種々の固体表面に取り付ける周知の方法を含む。試料中の病原性プリオンをペプトイド試薬に結合させることが可能な条件下で、ペプトイド試薬を含む固体支持体と試料を接触させ、第１複合体を形成する。この種の結合条件は、当業者により簡単に決められ、本明細書でさらに説明する。通常、この方法は、マイクロタイター・プレートのウエルの中または小さな容量のプラスチック・チューブの中で行われるが、あらゆる便利な容器が適切である。試料は、一般に、液体か懸濁液であり、ペプトイド試薬の前か後に反応容器に加えられる。第１複合体が一旦できると、結合していない試料物質（即ち、結合していない病原性プリオンタンパク質を含む、ペプトイド試薬に結合していない試料のあらゆる成分）は、例えば、遠心分離、沈殿、ろ過、磁力、などにより反応溶液（結合していない試料物質を含む）から固体支持体を分離することにより除去することができる。第１複合体を有する固体支持体は、この方法の次の工程を行う前に、残留試料物質を除去するために、随意に１つ以上の洗浄工程にかけられる。
結合していない試料物質の除去および随意の洗浄に続いて、結合した病原性プリオンタンパク質が第１複合体から解離される。解離は多数の方法で行うことができる。１つの実施形態では、カオトロピック剤、好ましくは、グアニジニウム化合物、例えば、グアニジニウム・チオシアネートまたはグアニジニウム塩化水素が、３Ｍと６Ｍとの間の濃度になるように添加される。このような濃度にてカオトロピック剤を添加すると、ペプトイド試薬から病原性プリオンタンパク質を解離させ、病原性プリオンタンパク質の変性も生じる。
別の実施形態では、解離は、ｐＨを１２以上に上げる（「高いｐＨ」）か、ｐＨを２以下に下げる（「低いｐＨ」）ことにより達成される。第１複合体を高ｐＨまたは低ｐＨにさらすと、ペプトイド試薬から病原性プリオンタンパク質が解離し、病原性プリオンタンパク質を変性させる。この実施形態では、第１複合体は高いｐＨにさらすのが好ましい。一般に、１２．０と１３．０との間のｐＨが十分であり、１２．５と１３．０との間のｐＨを用いるのが好ましく、１２．７〜１２．９のｐＨがより好ましく、１２．９のｐＨが最も好ましい。一方、第１複合体の低ｐＨへの露出は、ペプトイド試薬から病原性プリオンタンパク質を解離し、変性されるのに使用することができる。この場合、１．０と２．０との間のｐＨが十分である。第１複合体の高ｐＨまたは低ｐＨへの露出は、短時間、例えば、６０分、好ましくは１５分程度、より好ましくは、１０分程度行われる。これより長い時間さらすと、病原性プリオンタンパク質の構造が著しく劣化し、検出工程で使われる抗プリオン抗体により認識されたエピトープが破壊される。病原性プリオンタンパク質を解離するのに十分な時間露出後、酸性試薬（高いｐＨ解離条件が使われた場合）または塩基性試薬（低いｐＨ解離条件が使われた場合）のいずれかを添加することにより、ｐＨは中性（即ち、約７．０と７．５との間のｐＨ）に容易に再調整することができる。当業者は、適切なプロトコルを容易に決めることができ、本明細書には実施例が記載されている。
一般に、高いｐＨの解離条件にするためには、約０．０５Ｎ〜約０．２Ｎの濃度になるようにＮａＯＨを添加すれば十分である。好ましくは、ＮａＯＨは０．０５Ｎと０．１５Ｎとの間の濃度になるようにＮａＯＨを添加し、より好ましくは、０．１ＮのＮａＯＨが使われる。ペプトイド試薬から病原性プリオンの解離が一旦達成されると、適量の酸性溶液、例えば、リン酸、リン酸一ナトリウムの添加により、ｐＨは中性（即ち、約７．０と７．５との間）に再調整することができる。
一般に、低いｐＨの解離条件にするためには、約０．２Ｍ〜約０．７Ｍの濃度になるようにＨ３ＰＯ４を添加すれば十分である。好ましくは、Ｈ３ＰＯ４は０．３Ｍと０．６Ｍとの間の濃度になるように添加し、より好ましくは、０．５ＭのＨ３ＰＯ４が使われる。ペプトイド試薬から病原性プリオンの解離が一旦達成されると、適量の塩基性溶液、例えば、ＮａＯＨまたはＫＯＨの添加により、ｐＨは中性（即ち、約７．０と７．５との間）に再調整することができる。
次いで、解離された病原性プリオンタンパク質は、ペプトイド試薬を含む固体支持体から分離される。この分離は、結合していない物質（今は解離された病原性プリオンタンパク質）の部分が保持され、固体支持体物質の部分が廃棄されることを除いて、上で説明した結合していない試料物質の除去に類似した方法で達成することができる。
解離された病原性プリオンタンパク質は、プリオン結合試薬を用いて検出することができる。多数のこの種のプリオン結合剤が知られており、本明細書で説明している。解離された病原性プリオンタンパク質を検出する好ましいプリオン結合試薬は、抗プリオン抗体である。多数の抗プリオン抗体が記載されており、多くが商業的に入手でき、例えば、Ｆａｂ Ｄ１８（Ｐｅｒｅｔｚら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１２：７３９−７４３），３Ｆ４（ミズーリ州セントルイス，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手できる；米国特許第４，８０６，６２７号も参照のこと），ＳＡＦ−３２（ミシガン州アンアーバー，Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ），６Ｈ４（スイス，Ｐｒｉｏｎｉｃｓ ＡＧ；米国特許第６，７６５，０８８号も参照のこと），ＰＯＭ１〜ＰＯＭ１９（Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ２００５，４：８０５）および上に記載され、当該技術分野で周知のその他の抗体がある。解離された病原性プリオンタンパク質は、ＥＬＩＳＡ型アッセイ、即ち、直接ＥＬＩＳＡまたは抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ型アッセイのいずれかで検出することができる。なお、これらのＥＬＩＳＡについては後で詳しく説明する。用語「ＥＬＩＳＡ」は、抗プリオン抗体を用いた検出の説明に使われるが、このアッセイは抗体が「酵素連結」しているものに限定されない。これらの検出抗体は、本明細書で説明し、免疫アッセイの分野で周知の検出可能な標識を付けることができる。
この方法の１つの実施形態では、解離された病原性プリオンタンパク質は、第２固体支持体の表面で受動的に被覆される。この種の受動コーティングの方法は、周知の方法であり、通常、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３において約３７℃で数時間または４℃で一晩、ｐＨ８にて行われる。他のコーティング・バッファーは周知である（例えば、５０ｍＭのカーボネートｐＨ９．６，１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８，または１０ｍＭのＰＢＳ ｐＨ７．２）。第２固体支持体は、本明細書に記載されているか、または当該技術分野で周知の支持体であればよく、好ましくは第２固体支持体はマイクロタイター・プレート、例えば、９６ウエルのポリスチレン・プレートである。解離が高濃度のカオトロピック剤を用いて行われた場合は、第２固体支持体上にコーティングする前に少なくとも約２倍に希釈して、カオトロピック剤の濃度は下げる必要がある。解離が高ｐＨまたは低ｐＨを用いて行われ、次いで、中和した場合は、解離された病原性プリオンタンパク質は、希釈せずにコーティングに使用することができる。
解離された病原性プリオンタンパク質を第２固体支持体上に一旦被覆すると、支持体は洗浄して、固体支持体に付着していない成分を除去することができる。第２固体支持体上に被覆したプリオンタンパク質に抗体を結合させることが可能な条件下で、抗プリオン抗体が添加される。第２固体支持体上にコーティングする前に、解離された病原性プリオンタンパク質が変性されたならば、用いた抗体はプリオンタンパク質の変性型に結合する抗体になるであろう。この種の抗体には、周知の抗体（上で説明した抗体など）、並びにマウス、ウサギ、ラットなどにおいて免疫反応を発現させるために、周知の方法、例えば、ｒＰｒＰ、ＰｒＰＣまたはそれらのフラグメントを用いて作られる抗体がある（米国特許第４，８０６，６２７、６，１６５，７８４、６，５２８，２６９、６，３７９，９０５，６，２６１，７９０、６，７６５，０８８、５，８４６，５３３号，欧州特許第８９１５５２および９０９３８８号を参照のこと）。プリオンタンパク質のＮ−末端基端部においてエピトープを認識する抗プリオン抗体、例えば、残基２３−９０の領域内でエピトープを認識する抗体は特に好ましい。
したがって、本発明は１つの実施形態では、試料中の病原性プリオンの存在を検出する方法を提供し、該方法は下記工程を含む。
（ａ）第１固体支持体上に第１ペプトイド試薬を提供する工程と、
（ｂ）試料中に存在する場合、病原性プリオンが、ペプトイド試薬に結合して第１複合体を形成させる条件下で、第１ペプトイド試薬を試料と接触させる工程と、
（ｃ）結合していない試料物質を除去する工程と、
（ｄ）病原性プリオンタンパク質を第１複合体から解離させる工程と、
（ｅ）解離された病原性プリオンタンパク質を第１固体支持体から分離させる工程と、
（ｆ）解離したプリオンタンパク質を第２固体支持体に付着させることができる条件下で、解離された病原性プリオンタンパク質を第２固体支持体と接触させる工程と、
（ｇ）プリオン結合試薬を用いて第２固体支持体上に付着した病原性プリオンを検出する工程。
この実施形態では、第１固体支持体は好ましくは電磁ビーズであり、第２固体支持体は好ましくはマイクロタイター・プレートであり、プリオン結合試薬は好ましくは抗プリオン抗体、特に３Ｆ４、６Ｈ４、ＳＡＦ３２またはＰｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕ，上記を参照、に記載された１つ以上のＰＯＭ抗体である。プリオン結合試薬は検出できるように標識を付けている。
この方法の別の実施形態では、解離された病原性プリオンタンパク質は、抗体サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを用いて検出される。この実施形態では、解離したプリオンタンパク質は、第１抗プリオン抗体を含む第２固体支持体上で「再捕捉」される。再捕捉されたプリオンタンパク質を有する第２固体支持体は、随意に洗浄して結合していない物質を除去し、次いで、第２抗プリオン抗体を再捕捉されたプリオンタンパク質に結合させることができる条件下で、第２抗プリオン抗体と接触させる。第１および第２抗プリオン抗体は、通常、異なる抗体であり、プリオンタンパク質上の異なるエピトープを認識するのが好ましい。例えば、第１抗プリオン抗体は、プリオンタンパク質のＮ−末端基端部においてエピトープを認識し、第２抗プリオン抗体Ｎ−末端基以外の所でエピトープを認識し、その逆も成り立つ。第１抗体は、例えば、オクタリピート領域（残基２３−９０）においてエピトープを認識するＳＡＦ３２でもよく、第２抗体は、残基１０９−１１２においてエピトープを認識する３Ｆ４でもよく、一方、第１抗体が３Ｆ４であり、第２抗体がＳＡＦ３２であってもよい。第１および第２抗体の他の組み合わせは、容易に選択することができる。この実施形態では、第１ではなく、第２抗プリオン抗体が検出できるように標識を付けることになる。ペプトイド試薬からの病原性プリオンタンパク質の解離がカオトロピック剤を用いて行われる場合は、検出アッセイを行う前に、カオトロピック剤は除去し、少なくとも１５倍に希釈しなければならない。解離が高ｐＨまたは低ｐＨおよび中和を用いて行われる場合は、解離したプリオンは、希釈せずに使用することができる。解離された病原性プリオンタンパク質が、検出を行う前に変性される場合は、第１および第２抗体は両方が変性プリオンタンパク質に結合するであろう。
このようにして本発明は試料中に病原性プリオンの存在を検出する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む。
（ａ）第１固体支持体上に、本明細書で説明した第１ペプトイド試薬を提供する工程と、
（ｂ）試料中に存在する場合、病原性プリオンが、ペプトイド試薬に結合して第１複合体を形成する条件下で、第１ペプトイド試薬を試料と接触させる工程と、
（ｃ）結合していない試料物質を除去する工程と、
（ｄ）病原性プリオンタンパク質を第１複合体から解離させ、それにより病原性プリオンタンパク質が変性される工程と、
（ｅ）解離した変性病原性プリオンタンパク質を第１固体支持体から分離させる工程と、
（ｆ）解離したプリオンタンパク質を第１抗プリオン抗体に結合させることができる条件下で、解離した変性病原性プリオンタンパク質を第１抗プリオン抗体を含む第２固体支持体と接触させる工程と、
（ｇ）第２抗プリオン抗体を有する第２固体支持体上の結合プリオンタンパク質を検出する工程。
この実施形態では、第１固体支持体は好ましくは電磁ビーズであり、第２固体支持体は好ましくはマイクロタイター・プレートまたは電磁ビーズであり、第１および第２抗プリオン抗体は好ましくは異なる抗体であり、第１および第２抗体は好ましくは変性プリオンタンパク質に結合し、好ましくは、第１または第２抗プリオン抗体の少なくとも１つはプリオンタンパク質のＮ−末端基領域におけるエピトープを認識する。一部の実施形態では、第２抗プリオン抗体は検出できるように標識を付け、別の実施形態では、第２抗プリオン抗体は標識付き酵素である。
上で説明した病原性プリオンを検出する方法のいずれかは、プリオン関連疾患を診断する方法において使用することができる。
診断および処置
本発明は、プリオン関連疾患を処置または予防する方法をさらに提供し、この方法は、１つ以上のペプトイド試薬または本明細書で説明した該試薬の組成物を動物に投与することを含む。本発明は、動物のプリオン関連疾患感染のレベルを決める方法も提供し、この方法は、診断を行い、処置または予防の必要性を評価するのに使用することができる。処置または予防が必要であるならば、それがプリオン関連疾患であっても、そうでなくてもよい。即ち、プリオン感染が存在しないと判断されれば、非プリオン関連疾患、障害、健康状態または症状に対する処置または予防が必要になる。この種の処置は、例えば、普通の薬剤でよい。本発明は、プリオン関連疾患の場所を特定する方法も提供する。
本明細書で使われている用語「処置」または「処置している」は、疾患または障害の進行を治療、改善または止めることを意味するか、またはこの種の疾患または障害の１つ以上の症状または副作用を改善するかまたは回復に無かわせることを意味している。
本明細書で使われている用語「投与している」は、ペプトイド試薬またはその組成物を直接投与することを意味し、治療上効果的な量のペプトイド試薬を受け入れる動物に与える。
本明細書で使われているフレーズ「治療上有効な量」は、生物学的または医学的な反応を発現する活性なペプトイド試薬または組成物の量を指し、このような反応は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医が組織、システム、動物、患者またはヒトにおいて求めているもので、次の事項の１つ以上を含む。
（１）疾患を予防、例えば、疾患、状態または障害にかかりやすいが、この疾患の病状または総体症状をまだ経験したり発現していない個体の疾患、状態または障害を予防している、
（２）疾患の抑制、例えば、この疾患の病状または総体症状をまだ経験したり発現している個体の疾患、状態または障害を抑制している、および
（３）疾患の改善、例えば、この疾患の重篤度を低減するなど、疾患、状態または障害の病状または総体症状をまだ経験したり発現している個体の疾患、状態または障害を改善している（即ち、病状および／または総体症状を回復に向かわせる）。
一部の実施形態では、この方法は、動物から試料を取得する工程と、本発明の何らかの検出方法に従って病原性プリオンの存在を検出する工程と、検出された病原性プリオンの有無からプリオン疾患感染のレベルを決定する工程とを含む。
一部の実施形態では、動物のプリオン関連疾患感染の部位を決める方法を提供し、この方法は、本発明のペプトイド試薬またはその組成物を動物に投与する工程と、ペプトイド試薬が造影剤に連結される工程と、造影剤を検出する工程と、それにより動物のプリオン関連疾患の感染を限局化する工程とを含む。
動物のプリオン関連疾患を処置または予防する方法の一部の実施形態では、この方法は、本発明の検出方法により動物の１つ以上の病原性プリオンの存在を決定する工程と、本発明の１つ以上のペプトイド試薬、または該試薬を含む組成物を１つ以上の病原性プリオンが存在するという判断に従って動物に投与する工程、または１つ以上の病原性プリオンが存在しないという判断に従って動物に１つ以上の普通の薬剤を投与する工程とを含む。一部の実施形態では、この方法は、プリオン関連疾患感染が存在するという判断に従い、１つ以上の普通の薬剤を動物に投与する工程を含む。一部の実施形態では、テスト用試料は、臓器、細胞、全血、血液画分、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脳組織、神経系組織、筋肉組織、筋肉および脂肪組織（例えば、肉）、骨髄、尿、涙、非神経系組織を含む。
動物のプリオン関連疾患を処置または予防する方法の一部の実施形態では、この方法は、本発明のペプトイド試薬、または該試薬を含む組成物を含む第１投与を動物に投与する工程と、ペプトイド試薬、または該試薬を含む組成物を、その動物に免疫反応を誘発させるのに十分な量の第２投与を投与する工程とを含む。
本明細書で使われている「免疫反応」は、ペプトイド試薬がワクチン内に存在する時のようにペプトイド試薬に対して、動物における体液性および／または細胞免疫学的反応の発生である。したがって、免疫反応は、一般に、分泌腺、細胞および／または抗体仲介免疫反応の動物における発生を生じる結果になる。通常、この種の反応には、１つ以上の次のような作用、即ち、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭなどの免疫学的クラスのいずれかからの抗体の産生、ＢおよびＴリンパ球の増殖、免疫学的細胞への活性化、増殖および分化信号の供給、およびヘルパーＴ細胞、抑制遺伝子Ｔ細胞、および／または細胞毒性Ｔ細胞の拡張の１つ以上が含まれるがこれらに限定されない。産生された抗体の量は、関与した動物、投与した組成物の投与回数、アジュバントの存在、などにより変わるであろう。
本発明の一部のペプトイド試薬組成物は、アジュバントをさらに含む。動物のプリオン関連疾患を処置または予防する方法のこの種の実施形態では、第１投与および／または第２投与は少なくとも１つのアジュバントを含む。この種の実施形態では、第１および第２両方の投与はアジュバントを含む。本発明の投与および組成物において有効なアジュバントの非限定的な例は、全体が本明細書に組み込まれている国際公開第０５／０１６１２７号に記載されている。
動物のプリオン関連疾患を処置または予防する方法の一部の実施形態では、この動物は病原性プリオンに感染していると診断されている。一部の実施形態では、この動物は、病原性プリオンに感染していると診断された第２動物に近接近していた。「近接近」は、診断された動物と同じ群れまたは動物のコミュニティー、同じ農場、牧場にいた、またはこの動物と共に輸送、処理されたことを意味している。一部の実施形態では、この動物は、病原性プリオンに感染したと診断された第２動物の家族である。一部の実施形態では、この動物は、プリオン関連疾患と関係した症状を呈する。一部の実施形態では、この動物は、プリオン関連疾患のリスクがある。「リスクに」ある動物は、遺伝的にまたはそうでなければ、例えば、環境的に、プリオン関連疾患を発生、感染、受容する、さらされている方向の素因を有する動物である可能性がある。環境的素因には、例えば、プリオン関連疾患にさらされた地理的または物理学的エリアに住んでいる群れまたはコミュニティーにいる動物が含まれる。一部の実施形態では、リスクのある動物は、病原性プリオンに感染したか、または感染した疑いのある動物の子孫である。一部の実施形態では、リスクにある動物は、第２動物から導かれ消化された生物学的物質を有し、第２動物はプリオン関連疾患に感染しているか、またはそのリスクがある。
第１投与を含む組成物は、第２投与の組成物と同じかまたは異なっている。一部の実施形態では、第２投与の組成物は第１投与の組成物と同じかまたは異なっている。一部の実施形態では、第１および第２投与の組成物は、異なっている。一部の実施形態では、この方法は、普通の薬剤の投与をさらに含む。一部の実施形態では、普通の薬剤は、抗体、オリゴヌクレオチド、有機化合物、またはペプチド模倣薬を含む。一部の実施形態では、普通の薬剤は、インターロイキン２（ＩＬ−２）、修飾ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５−ｓｅｒ１２５）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、アルファ−またはガンマ−インターフェロン、ケモカインＩＰ−１０、およびＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、およびＭＩＰ１−βなどのβケモカインを含むがこれらに限定されない抗原または免疫グロブリン、サイトカイン、リンフォカイン、およびケモカインである。
本発明の処置および予防方法のいずれかにおいて、動物は、ヒトまたはヒト以外を含む。ヒト以外の動物では、動物は野生、即ち、飼いならされていない動物、例えば、シカ、ヘラジカ、ムース、アンテロープ、熊、野生羊、ラマ、バイソン、馬、ラバと雄ロバ、ヒョウ、ピューマ、クーガー、虎、ライオン、およびチータなどの大型のネコ、および小型哺乳類、例えば、ウサギ、プレーリードッグ、アライグマ、スカンク、など、または鳥類、または例えば、飼いならされたペット、例えば、ネコ、犬、白イタチ、ウサギ、ラット、またはマウス、家畜、例えば、乳牛、牛、羊、豚、ヤギ、馬、ラバおよび雄ロバ、または鳥類、例えば、ニワトリ、めんどり、アヒル、ガチョウ、七面鳥、および他の家禽類、および研究用動物、例えば、類人猿、猿、およびルーマーなどのヒト以外の霊長類、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどのげっし類を含む飼いならされた動物でよい。本発明で使用するのに適した動物は、年齢はいくつでもよく、大人と新生児を含む。一部の実施形態では、動物は哺乳類である。一部の実施形態では、哺乳類はヒトである。一部の実施形態では、哺乳類はヒト以外である。一部の実施形態では、上で説明した組成物を投与する。一部の実施形態では、哺乳類は、ネコ、イヌ、白イタチ、ウサギ、ラット、マウス、ウシ、去勢ウシ、ヒツジ、子牛、ブタ、ヤギ、馬、ラバ、雄ラバ、シカ、ヘラジカ、熊、バイソン、クーガー、ピューマ、類人猿、サル、ルーマー、ハムスターまたはモルモットを含む。一部の実施形態では、哺乳類は、ウシ、去勢ウシ、シカ、ヒツジ、子牛、ブタまたはヤギを含む。一部の実施形態では、この組成物は、筋肉注射で、粘膜内に、鼻から、皮下に、皮内に、経皮的に、膣内に、直腸内に、経口でまたは静脈内に投与される。
単離，低減および除去
本発明は、試料から病原性プリオンを単離または試料中の病原性プリオンの量を低減する方法も提供する。
試料から病原性プリオンを単離する方法は、本発明のペプトイド試薬を含む固体支持体を提供する工程と、もし試料中に存在するならば、病原性プリオンをペプトイド試薬に結合させることができる条件下で、固体支持体を試料と接触させて複合体を形成する工程と、結合していない試料を除去する工程と、それにより単離された病原性プリオンを提供する工程とを含む。一部の実施形態では、この方法は、複合体から病原性プリオンを解離する工程を含む。
試料中の病原性プリオンの量を低減する方法は、本発明のペプトイド試薬を含む固体支持体を提供する工程と、もし試料中に存在するならば、病原性プリオンをペプトイド試薬に結合させることができる条件下で、固体支持体を試料と接触させる工程と、結合していない試料を回収する工程と、それにより病原性プリオンの量が低減した試料を提供する工程とを含む。一部の実施形態では、病原性プリオンの量は、検出可能なレベル以下に下げられる。一部の実施形態では、病原性プリオンの量は、約８０〜１００、約８５〜１００、約９０〜１００または約９５〜１００％だけ下げられる。
本発明は、実質的に病原性プリオンを含まない血液供給物を調製する方法を提供し、この血液供給物は、血液バンクからの血液供給物または手術する前に患者自身から集めた血液、例えば、手術中の自己血輸血などの集めた血液試料を含む。血液供給物は、例えば、制限なしに、全血、血漿、血小板または血清を含むことができる。一部の実施形態では、この方法は、本発明の検出方法により複数の試料中の病原性プリオンの有無を検出する工程と、病原性プリオンが検出されない試料を合体する工程と、それにより実質的に病原性プリオンを含まない血液供給物を提供する工程とを含む。一部の実施形態では、本発明の検出方法は、もし存在するならば病原性プリオンにペプトイド試薬を結合させて複合体を形成する工程と、ペプトイド試薬に結合させることにより試料中の病原性プリオンの存在を検出する工程とを含み、複合体の形成は病原性プリオンの存在を示している。一部の実施形態では、この複合体は、ペプトイド試薬を含み、病原性プリオンタンパク質は、検出する前に、試料の残り（即ち、結合していない試料）から分離される。一部の実施形態では、複合体の形成は、複合体中に病原性プリオンを検出するか、または複合体を解離し（結合していない試料から分離後）、次いで、解離された病原性プリオンを検出することにより、検出することができる。
本発明は、実質的に病原性プリオンを含まない供給用肉（例えば、ヒトまたは動物が消費するために使われる、ウシ、ヒツジまたはブタの筋肉および脂肪組織（即ち、肉）、例えば、ビーフ、子羊の肉、マトンまたはポーク）などの食料供給物を調製する方法も提供する。一部の実施形態では、この方法は、本発明の検出方法による複数の試料の中の病原性プリオンの有無を検出し、次いで、病原性プリオンが検出されない試料を合体し、それにより実質的に病原性プリオンを含まない食料供給物を提供する工程を含む。一部の実施形態では、食料供給物は、食料供給物に入る予定の生命体またはかっての生命体あるいは供給用に入れる予定の食料から集める。一部の実施形態では、本発明の検出方法は、もし存在すれば、病原性プリオンにペプトイド試薬を結合することを可能にして複合体を形成し、次いで、ペプトイド試薬へのその結合により試料中の病原性プリオンの存在を検出する工程を含む。一部の実施形態では、ペプトイド試薬への病原性プリオンの結合は、複合体の形成を検出することにより検出することができ、複合体の形成は病原性プリオンの存在を示している。一部の実施形態では、複合体はペプトイド試薬を含み、病原性プリオンタンパク質は、検出する前に、試料の残り（即ち、結合していない試料）から分離される。一部の実施形態では、複合体の形成は、複合体中の病原性プリオンを検出することにより、または複合体を解離し（結合していない試料から分離後）、および解離された病原性プリオンを検出することにより検出することができる。
デザイン
本発明のペプトイド試薬をデザインする方法が、本発明によりさらに提供される。出発点として、ペプトイド試薬は、プリオンタンパク質の特定のペプチド・フラグメントの配列（例えば、配列番号１２−２２８を有するペプチド・フラグメント）に基づいて、ペプチド・フラグメントの配列の中のアミノ酸残基をＮ−置換グリシンにより置換することにより、米国特許第５，８１１，３８７、５，８３１，００５、５，８７７，２７８、５，９７７，３０１および６，０３３，６３１号、並びにＳｉｍｏｎら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３６７、に記載された方法を用いた修飾ペプチドの合成、本明細書に記載された方法による病原性プリオンタンパク質への結合に関する修飾ペプチドのテストによりデザインすることができる。なおこれらの特許および文献は引用により全体が本明細書に組み込まれている。追加の置換は、適切なペプチド試薬が実現するまで下の置換スキームにより行うことができる。
さらに、ペプトイド試薬のデザインは、下の実施例５に記載されたｔｈｅ Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｓｕｂｍｏｎｏｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ
Ｐｅｐｔｏｉｄｓ（ペプトイドの固相サブモノマー合成プロトコル）の態様を含む。
一部の実施形態では、本発明のペプトイド試薬を調製する方法は下記の工程を含む。
ａ）プリオンタンパク質のペプチド・フラグメントを供給し、ペプチド・フラグメントの第１アミノ酸を次の置換スキームによりＮ−置換グリシンを用いて置換する工程と、
ｉ）Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、およびＶａｌはＮ−（アルキル）グリシン、Ｎ−（アラルキル）グリシン、またはＮ−（ヘテロアリールアルキル）グリシンにより置換する工程と、
ｉｉ）Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒは、Ｎ−（ヒドロキシアルキル）グリシン、Ｎ−（アルコキシ）グリシン、またはＮ−（グアニジノアルキル）グリシンにより置換する工程と、
ｉｉｉ）Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒは、Ｎ−（アラルキル）グリシン、Ｎ−（ヘテロアリールアルキル）グリシン、Ｎ−（ヒドロキシアラルキル）グリシン、Ｎ−（アルコキシアラルキル）グリシンにより置換する工程と、
ｉｖ）Ａｒｇ、Ｈｉｓ、およびＬｙｓは、Ｎ−（アミノアルキル）グリシンま たはＮ−（グアニジノアルキル）グリシンにより置換する工程と、
ｂ）ペプチド・フラグメントの第２アミノ酸を工程ａ）によるＮ−置換グ リシンを用いて置換する工程と、
ｃ）ペプチド・フラグメントの第３アミノ酸を工程ａ）によるＮ−置換グ リシンを用いて置換する工程と、
ｄ）随意に、工程ｃ）を１−２７回反復する工程と、
それにより、３〜３０個のＮ−置換グリシンを含む、デザインしたペプトイドを供給し、デザインしたペプトイド試薬を合成する工程。
上の方法の一部の実施形態では、ペプチド・フラグメントは、配列番号
Figure 2012162571
Figure 2012162571
 からなる群から選択される配列を有するペプチドを含む。
上の方法の一部の実施形態では、ペプチド・フラグメントは、配列番号
Figure 2012162571
 からなる群から選択される配列を有するペプチドを含む。
上の方法の一部の実施形態では、ペプチド・フラグメントは、配列番号
Figure 2012162571
 からなる群から選択される配列を有するペプチドを含む。
上の方法の一部の実施形態では、ペプチド・フラグメントは、配列番号
Figure 2012162571
 からなる群から選択される配列を有するペプチドを含む。
上の方法の一部の実施形態では、ペプチド・フラグメントは、配列番号
Figure 2012162571
 からなる群から選択される配列を有するペプチドを含む。
ペプトイド試薬をデザインする方法の一部の実施形態では、ペプチド・フラグメントは、配列番号１２、１４、５０、５１、５２、６７、６８、７２および１０９からなる群から選択される配列を有するペプチドを含む。
一部の実施形態では、この方法は、ペプトイド試薬に、各々はリンカー部分を介してペプトイド試薬に随意に連結した、エフェクタ分子、基質、または標識から選択される共役部分を追加することをさらに含む。一部の実施形態では、共役部分はビオチンを含む。一部の実施形態では、共役部分はメルカプト基を含む。
他の用途
本発明は、本発明の少なくとも１つのペプトイド試薬を含む固体支持体を提供する。固体支持体は、すでに上で説明したとおりでよい。本発明は、試料中の病原性プリオンの存在を検出するキットを提供する。一部の実施形態では、このキットは本発明のペプトイド試薬を含む。一部の実施形態では、このキットは本発明のペプトイド試薬を含む固体支持体を含む。この試薬は、例えば、無制限に、検出できるように標識された、抗体、発色団、色原体、抗プリオン抗体などのプリオン結合試薬、モチーフ・グラフトしたハイブリッド・ポリペプチド、カチオン性またはアニオン性ポリマー、増殖触媒およびプラスミノーゲンまたはバッファーなどの検出試薬でよい。一部の実施形態では、キットは２つ以上の本発明のペプトイド試薬を含む。一部のキットの実施形態では、正および／または負の対照が随意に含まれる。
本明細書で開示された発明をより効率的に理解できるために、以下に実施例を提示する。これらの実施例は説明のためだけのものであり、何らかの形で本発明を制限するものと解釈してはならない。
実施例１
ペプトイド領域の配列
表１は、本発明のペプトイド試薬を調製するのに適したペプトイド領域（アミノからカルボキシに向けて）の例を示している。表２は表１において使われた略語の手がかりを提示している。表３は各配列の関連構造を提示している。表１の配列を含むペプトイド試薬は、本明細書で説明したアッセイにより、ＰｒＰＳｃへの選択的な結合についてテストした。個々の試薬の調製については、以下で説明する。
表１：本発明のペプトイド試薬の代表的なペプトイド領域
Figure 2012162571
 表２：表１の手がかりとなる略語
Figure 2012162571
Figure 2012162571
 表３：表１のペプトイド領域の関連構造
Figure 2012162571
Figure 2012162571
 実施例２
ペプトイド試薬
次のペプトイド試薬は、米国特許第５，８１１，３８７、５，８３１，００５、５，８７７，２７８、５，９７７，３０１および６，０３３，６３１号、並びにＳｉｍｏｎら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３６７、で開示された手順などのＮ−置換グリシン残基を含むペプトイド分子を調製する合成方法を用いて調製し、これらの特許および文献の各々は引用により全体が本明細書に組み込まれており、実施例５に記載されたプロトコルを用いている。以下の試薬の各々は、本明細書で説明したアッセイによりプリオンタンパク質に対する結合親和性についてテストした。
ペプトイド試薬Ｉ
以下のペプトイド試薬は配列番号２２９を含む。
Figure 2012162571
 質量（理論値）：１０５４．４２、質量（実測値）：１０５４．２。質量の実測はすべてＷａｔｅｒｓ（マサチューセッツ州ミルフォード）のＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ ＬＣ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍで測定した。
ペプトイド試薬ＩＩ
以下のペプトイド試薬は配列番号２３０を含む。
Figure 2012162571
 質量（理論値）：１２９０．７０、質量（実測値）：１２９０．８。
ペプトイド試薬ＩＩＩ
以下のペプトイド試薬は配列番号２３１を含む。
Figure 2012162571
 質量（理論値）：１８６１．３０、質量（実測値）：１８６１．６。
ペプトイド試薬ＩＶ
以下のペプトイド試薬は配列番号２３２を含む。
Figure 2012162571
 ペプトイド試薬Ｖ
以下のペプトイド試薬は配列番号２３３を含む。
Figure 2012162571
 ペプトイド試薬ＶＩ
以下のペプトイド試薬は配列番号２３４を含む。
Figure 2012162571
 質量（理論値）：１９５６．４９；質量（実測値）：１９５６．２。
ペプトイド試薬ＶＩＩ
以下のペプトイド試薬は配列番号２３５を含む。
Figure 2012162571
 質量（理論値）：１８９６．３９、質量（実測値）：１８９６．４。
ペプトイド試薬ＶＩＩＩ
以下のペプトイド試薬は配列番号２３６を含む。
Figure 2012162571
 質量（理論値）：１７３２．１８、質量（実測値）：１７３２．４。
ペプトイド試薬ＩＸ
以下のペプトイド試薬は配列番号２３７を含む。
Figure 2012162571
 質量（理論値）：１２４８．６５、質量（実測値）：１２４８．４。
ペプトイド試薬Ｘ
以下のペプトイド試薬は配列番号２３８を含む。
Figure 2012162571
 質量（理論値）：１２４８．６５、質量（実測値）：１２４８．４。
ペプトイド試薬ＸＩａおよびＸＩｂ
以下のペプトイド試薬、ＸＩａおよびＸＩｂ、は配列番号２３９を含む。
Figure 2012162571
 ＸＩａ：質量（理論値）：１３０４．７６、質量（実測値）：１３０４．６
ＸＩｂ：質量（理論値）：１１６６．５９、質量（実測値）：１１６６．２。
ペプトイド試薬ＸＩＩａおよびＸＩＩｂ
式ＸＩＩａおよびＸＩＩｂの以下のペプトイド試薬は配列番号２４０を含む。
Figure 2012162571
 ＸＩＩａ：質量（理論値）：１２７６．７１、質量（実測値）：１２７６．６。
ペプトイド試薬ＸＩＩＩ
以下のペプトイド試薬は配列番号２４１を含む。
Figure 2012162571
 質量（理論値）：１２５６．５８、質量（実測値）：１２５６．６。
実施例３
結合アッセイ
プルダウン・アッセイ
実施例２のペプトイド試薬は、磁気ビーズのプルダウン・アッセイを用いて病原性プリオンタンパク質へ特異的に結合するこれらの試薬の能力をテストした。このアッセイでは、ペプトイド試薬は、２つの方法のうちの１つで磁気ビーズに取り付けた。即ち、１）ペプトイド試薬は、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズに取り付けることができるビオチンで標識された、または２）チオール・プロピオン酸を介して、ペプトイドを磁気ビーズに共有結合させた。ビーズへのペプトイド試薬の取り付けモードは、ペプトイド試薬の結合活性化に対してほとんど効果がなかったが、ペプトイド試薬をビーズに共有結合させた場合は、希釈剤として用いた血漿試料からのバックグラウンド干渉はほとんど認められなかった。磁気ビーズは、Ｄｙｎａｌ（ウィスコンシン州ブラウン・ディア）から得た。通常、１０マイクロリットル（１０μｌ）のストレプトアビジンＭ−２８０Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ｃａｔ＃１１２．０５）が、ビオチン化ペプトイド試薬を用いた単一プルダウン反応に使われた。
死亡したＣＪＤ患者および健康な（即ち、ＣＪＤではない）死亡した個体からのヒトの脳ホモジネート（０．２５Ｍスクロース中１０％ｗ／ｖ）は、英国のポッタースバーのＢｌａｎｃｈｅ Ｌａｎｅ Ｓｏｕｔｈ Ｍｉｍｍｓにある国立生物学的製剤研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ：ＮＩＢＳＣ）から得た。本明細書に記載した大抵の実験では、３名のＣＪＤ患者（１人は新変異型患者および２名の孤発性患者）からの試料を合体し、そのヒトの脳ホモジネートについてアッセイを行った。２００μｌのアリコートを、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００および１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５および３７．５ｍＭ ＮａＣｌ）において１：１のｖｏｌ：ｖｏｌで希釈し、これらの試料は、各々、数秒の超音波分解を数回繰り返した。脳ホモジネート・アリコートは、−７０℃に保持した。
ＰｒＰＳｃへのペプトイド試薬の結合性を評価するために、ＣＪＤ脳ホモジネートは健康な個体のヒト血漿へ加えた。一般に、２つの負の対照試料、即ち、１）正常なヒトの血漿、および２）正常な（ＣＪＤでない）ヒトの脳のホモジネートを加えた正常なヒトの血漿、を用いた。ヒト血漿の標準アッセイ濃度は、試料総容積の０から８０％までの範囲で変えた。
典型的なプロトコルでは、１つのプルダウン・テスト（９６のウエルプレートのマイクロタイターの１つのウエルにおいて最後には１００μｌ）について、１０μｌのストレプトアビジンＭ−２８０Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ｃａｔ＃１１２．０５）が使われる。適切な量のビーズは、１％Ｔｗｅｅｎおよび１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＴＢＳＴＴ）を含むＴＢＳを用いて使用する前に１度洗浄する。ビーズペレットは、原液容積の１０倍、即ちＴＢＳＴＴを有する１００μｌの溶液に再懸濁させる。その後、０．１μｌのビオチン化ペプトイド試薬試薬原液（Ｈ２Ｏ中１０ｍＭ）をビーズ溶液に添加し、室温で１時間７５０ｒｐｍ、または３７℃で３０分７５０ｒｐｍ（エッペンドルフ、サーモミキサーＲ）にて混合する。結合していないペプトイドを含む上澄み液は廃棄され、ビーズは、チューブの底にビーズを保持する磁気装置を用いてＴＢＳおよびＴｗｅｅｎ−２０の０．０５％（ＴＢＳＴ）を用いて３度洗浄した。この段階で、ペプトイド試薬で被覆したストレプトアビジン磁気ビーズが得られる。次に、ペプトイド被覆磁気ビーズ（オリジナル出発容積はμｌに相当している）は、最終容積１００μｌにおいて、血漿（最終濃度０−８０％）、１ｘＴＢＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１％Ｔｗｅｅｎ−２０の存在下で、種々の濃度のＣＪＤ１０％脳ホモジネートと混合する。典型的な反応容積は、９６のウエルを有するプレートのウエルにおいて１００μｌである。このプレートは、３７℃で１時間７５０ｒｐｍ（エッペンドルフ、サーモミキサーＲ）にて振とうする。ビーズは、結合していないタンパク質を除去するために、プレート洗浄器ＥＬｘ４０５マグマ（バーモント州ウィヌースキのＢｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ溶液で４回洗浄した。このマイクロタイター・プレート洗浄器は、磁気ビーズ技術を用いる用途用に特別にデザインされている。第２キャリアは、磁気プレートをマイクロプレートのボトムに近接して配置し、臨界吸引サイクルの間に磁気ビーズを確保する。
ＥＬＩＳＡ
プルダウン・アッセイの最終洗浄後、ＰｒＰＳｃはビーズから溶離され、変性され、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定吸着法）フォーマットにおいてモノクローナル（ｍＡｂ）抗プリオン抗体を用いて検出する。１つのアッセイ・フォーマット（間接ＥＬＩＳＡ）では、ＰｒＰＳｃに結合した量に比例する抗プリオン抗体の検出は、一次モノクローナルを認識している二次ポリクローナル抗体で達成される。二次抗体は、酵素アルカリ性ホスファターゼに共役している。化学発光基質を用いて培養した場合は、酵素は化合物を壊し、発光を生じ、発光は標準マイクロプレート化学発光読み取り器により測定される。測定されたユニットは、相対的光ユニット（ＲＬＵ）として規定される。第２フォーマット（直接ＥＬＩＳＡ）では、検出は、アルカリ性ホスファターゼに共役しているモノクローナル（ｍＡｂ）抗プリオン抗体を用いてなされ、したがって、二次抗体は必要ではない。同じ化学発光基質（Ｌｕｍｉｎｇｅｎ，Ｉｎｃ．製のＬｕｍｉ−Ｐｈｏｓ Ｐｌｕｓ）は、両フォーマットで使われる。サンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットも、本明細書で説明したように使用することができる。ＥＬＩＳＡは、あらゆる数のフォーマット、例えば、プレート上、ビーズ上、磁気粒子上で行うことができる。変性され、溶離されたプリオンは、固体支持体上に受動的に被覆されるか、抗体−抗原サンドイッチ型配置に結合され、抗プリオン抗体は固体支持体上に被覆されている。
結果
ＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を下に要約する。
テストした本発明の代表的ペプトイド試薬の大部分は、配列番号６８のペプトイド試薬の結合効率と類似した該効率を有する。以前の研究では、配列番号６８のペプチドは、プリオンタンパク質に対する良好な結合効率を有し（例えば、２００５年２月１１日に出願された米国特許出願第１１／０５６，９５０号を参照のこと）、したがって、本発明のペプトイド試薬の結合効率を測定するための基準として使われた。表４のデータは、ペプトイド試薬（共同所有の出願である２００４年８月１３日に出願された米国特許出願第１０／９１７，６４６号，２００５年２月１１日に出願された米国特許出願第１１／０５６，９５０号，および２００４年８月１３日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６３６３号に記載されている配列番号６８）に比べて種々のペプトイド試薬を用いてプルダウン／ＥＬＩＳＡアッセイで得られた信号を示している。１０％ＣＪＤ脳ホモジネートの１ｕｌ試料からまたは１０％の正常な脳ホモジネートの１ｕｌ試料からの信号を、両方とも７０％血漿において、示している。右端のカラムは、ペプチド配列番号６８アッセイの実験的平均値の％として、ペプトイド試薬アッセイの実験的平均値を報告している。
表４：配列番号６８のペプチドに比べた７０％ヒト血漿における代表的ペプトイド試薬のパーセント結合率
Figure 2012162571
 表５：配列番号６８のペプチドに比べた７０％ヒト血漿における代表的ペプトイド試薬のパーセント結合率
Figure 2012162571
 表６：配列番号６８のペプチドに比べた２０％ヒト血漿における代表的ペプトイド試薬のパーセント結合率
Figure 2012162571
Figure 2012162571
 表４および５に示したように、７０％血漿中ではテストした代表的なペプトイド試薬の多くが、基準ペプチドである配列番号６８よりも結合親和性が大きく、約１０〜２５％大きいことが多い。表４および５は、プリオンタンパク質の病原型に対するペプトイド試薬の特異性も示している（プリオンタンパク質の非病原型のみが正常な脳ホモジネート中に存在すると期待される）。表６は、２０％ヒト血漿中で希釈されたＣＪＤ脳ホモジネートにおけるペプトイド試薬を用いたプルダウン／ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。
表７：配列番号６８のペプチドに比べた７０％ヒト血漿における磁気ビーズに直接結合した代表的ペプトイド試薬のパーセント結合率
Figure 2012162571
 配列番号２４０（ＸＩＩｂ）を含むペプトイド試薬は、磁気ビーズに共有結合し、配列番号６８を含むペプチドも、磁気ビーズに共有結合した。共有結合した試薬が、ビオチン化ペプトイド試薬およびＳＡビーズに結合したペプチドについて、上で説明したプルダウン／ＥＬＩＳＡ反応において使われた。ビーズへの試薬の共有結合は、ビーズが病原性プリオンと優先的に反応する能力にはほとんど影響しなかった。
病原型に対する試薬の特異性
上の表４および５に示したように、ペプトイド試薬は、ＣＪＤ患者からのヒトの脳ホモジネートに存在するＰｒＰＳｃをプルダウンすることができるが、ヒト血漿または対照の正常なヒトの脳ホモジネートに存在するＰｒＰＣをプルダウンすることはない。ペプトイド試薬が、ＣＪＤ脳ホモジネートおよび正常な（即ち、ＣＪＤではない）脳ホモジネートへの結合を比較する追加の実験は、下に示す。
表８ ７０％ヒト血漿における１０％の正常またはＣＪＤの脳ホモジネートの２マイクロリッターへのペプトイド試薬の結合
Figure 2012162571
 表９．７０％ヒト血漿における１０％のＣＪＤの脳ホモジネートの０．１マイクロリッターまたは正常な脳ホモジネートの１マイクロリッターへのペプトイド試薬の結合
Figure 2012162571
 表１０の実験は、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）および孤発性クロイツフェルト・ヤコブ病（ｓＣＪＤ ＢＨ）の混合物よりむしろヒトのｖＣＪＤ脳ホモジネートの試料について行った。
表１０．７０％ヒト血漿における正常またはｖＣＪＤの脳ホモジネートへの磁気ビーズを共有結合させたペプトイド試薬（ＸＩＩｂ）の結合
Figure 2012162571
 表１１．磁気ビーズへ共有結合したペプトイド試薬２４０（ＸＩＩｂ）の結合
Figure 2012162571
 これらの実験の間に特定のヒト血漿試料は、結合反応を妨害し、これらの血漿を希釈剤として用いた場合はより低い信号が得られることが認められた。比較実験は磁気ビーズに共有結合した試薬およびビオチン−ストレプトアビジン結合を介して磁気ビーズに結合した同じペプトイド試薬を用いて行った（表１２対表１３）。共有結合したペプトイド試薬は、希釈剤として用いた血漿試料中の変動に対して敏感ではなかった。
表１２：種々のヒト血漿中でストレプトアビジン磁気ビーズに結合した代表的ビオチン化ペプトイド試薬を用いたプルダウン・アッセイ
Figure 2012162571
 表１３：種々のヒト血漿中で磁気ビーズに直接結合した代表的ペプトイド試薬を用いたプルダウン・アッセイ
Figure 2012162571
 表１２のアッセイは、表１３のアッセイよりも２．５倍多くのＣＪＤ脳ホモジネートを用いた。対照ヒト血漿は、各組の実験の場合と同じであり、妨害物質を含まないことを予め示した。これらの結果は、共有結合したペプトイド試薬は、血漿対照に比べて（および事実対照血漿よりも高い信号を示す）、多数の異なる血漿においてはるかに低い信号を示すＳＡビーズに連結したビオチン化ペプトイドに比べて、異なる血漿が使われた場合、結合の妨害を全く示さない。
ヒト試料の場合上で説明したものと類似したプルダウン／ＥＬＩＳＡアッセイは、マウス、シリア・ハムスターおよびヒツジを含む異なる動物種からの種々の試料について行われた（スクレーピー・シープおよび正常なシープからの脳ホモジネートおよび血液試料の両方についてテストした）。これらの種の各々について、その種からのプリオンタンパク質の病原型が、疾患した動物からの試料では検出されたが、本発明のペプトイド試薬を用いた非疾患動物からは検出されなかった。
実施例４−サンドイッチＥＬＩＳＡ
サンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒト血漿の試料中に存在するＰｒＰＣを測定するために開発された。ヒト血漿中に存在するＰｒＰＣを測定するために、標準曲線（図１Ｂ）を作るために既知量の組み換えヒトＰｒＰ（ｒＰｒＰ）タンパク質を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。ヒト血漿の量を増加させた場合、ＰｒＰＣの量は、ｒＰｒＰを用いた標準曲線（図１Ａ）を用いて決定した。サンドイッチＥＬＩＳＡの場合、９６のウエルがあるマイクロタイター・プレートをｍＡｂ ＳＡＦ３２（「捕捉」抗体と呼ばれた）を用いて被覆した。この抗体は、ヒトＰｒＰ、即ち残基２３−９０のオクタリピートに結合し、次いで、全長ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃ変性残基２３−２３１に結合することとなる。このプレートはカゼインを用いて３７℃で１時間ブロックした。ヒト血漿中のＰｒＰＣのレベルを決めるために、異なる量の血漿をＳＦＡ３２被覆プレートに添加し、振とうせずに３７℃で２時間培養した。プレートを洗浄し、酵素アルカリ性ホスファターゼ（「検出」抗体，３Ｆ４−ＡＰ）に共役した３Ｆ４抗体”（ヒトＰｒＰ残基１０９−１１２を結ぶ抗体）”を、３７℃で１時間添加した。これらのプレートを洗浄し、化学発光基質を添加し、３７℃で３０分後にカウントした。ＰｒＰＣの量を計るために、同じフォーマットのサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて組み換えヒトＰｒＰの濃度を上げながらＳＦＡ３２被覆プレートを培養した。ｒＰｒＰの標準曲線を用いて、このバッチのヒト血漿中のＰｒＰＣの濃度を約４８８ｐｇ／７０μｌであると測定した。
この同じサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、ヒト血漿試料からのＰｒＰＳｃまたはＰｒＰＣをプルダウンするためにペプトイド試薬の特異性を評価した。ペプトイド試薬ＸＩＩｂは、説明した磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０カルボン酸）に共有共役した。ビーズに連結されたペプトイド試薬は、７０ｕｌのヒト血漿、１％のＴｗｅｅｎ−２０、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＴＢＳを含む１００ｕｌのアッセイ中で１時間混合した。ＰｒＰＳｃの特異的なプルダウンを調べるために、ｖＣＪＤと診断された患者から調製された１０％の脳ホモジネート（ＢＨ）を０．０５μｌおよび正常な個体からの対照を添加した血漿を用いて実験を反復した。洗浄後、ビーズは、ＰｒＰＳｃを溶離し、変性されるために１５μｌの３ＭのＧｄｎＳＣＮで処理した。捕捉抗体の変性を予防するために、ＧｄｎＳＣＮを２１０μｌのＨ２Ｏで希釈し、溶液をＳＡＦ３２で被覆したマイクロタイター・プレートに添加し、抗原の総容積を２５０μｌにした。１０％の正常な脳ホモジネート、または１０％のｎＣＪＤの脳ホモジネートのいずれかの０．０５μｌを用いて実験を行った。これらのプレートを洗浄し、ＰｒＰは、化学発光ＡＰ基質（ＬｕｍｉｐｈｏｓＰｌｕｓ）を用いて検出した。血漿中のＰｒＰＣの量は、直接検出した場合（即ち、何らのプルダウンなしに）約８８７ＬＵを測定し、ペプトイド試薬ビーズを用いてプルダウンされたＰｒＰＣの量は、わずか２３ＬＵというバックグラウンド・レベルの寄与に過ぎない。０．０５μｌの正常なＢＨが７０μｌの血漿にスパイクされる場合は同じことが言える。０．０５μｌのｖＣＪＤ ＢＨが７０μｌの血漿にスパイクされる場合は４倍に増加した信号が検出された。標準曲線としてｒＰｒＰを用いると、ペプトイド試薬ビーズは、約４８８ｐｇのＰｒＰＣを含む血漿にスパイクされた場合、４７ｐｇのＰｒＰＳｃをプルダウンし、一方、ペプトイドがわずか７ｐｇのＰｒＰＣを結合したことは、最低７０倍の濃縮を示唆している（表１４）。
表１４．ペプトイド試薬ビーズを用いたＰｒＰＳｃの特定のプルダウン
Figure 2012162571
 実施例５−サンドイッチＥＬＩＳＡを用いたｐＨ変性
カオトロピック剤を用いた解離およびプルダウン・工程後の病原性プリオンの変性の代替法として、解離／変性を生じるために高ｐＨまたは低ｐＨを用いる方法を開発した。この方法の利点は、ＧｄｎＳＣＮを用いる状況とは異なり、ｐＨ変性条件は、反応容積を顕著に増やすことなく、または洗浄工程を追加することなく、ｐＨ変性条件を容易に変更することができることである。
プルダウンは、７０％のヒト血漿を含む１００μｌ溶液においてスパイクされた０．１０μｌのｖＣＪＤの１０％脳ホモジネートの試料と共にペプトイド試薬ＸＩＩｂに連結した磁気ビーズを用いて、実施例４の場合と同様に行った。３７Ｃで１時間混合後、表１５に示した種々のｐＨ条件下で、ビーズを洗浄し、処置した。対照として、３ＭのＧｄｎＳＣＮまたはトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）をｐＨ７．５で用い、ビーズを処置した。室温で１０分間培養後、表に示したように、溶液を約７の中性ｐＨにした。上澄み液をＳＡＦ３２（捕捉抗体）で被覆した９６ウエルのマイクロタイター・プレートに添加し、４℃で１２時間培養した。アルカリ性ホスファターゼで標識された３Ｆ４抗体を、実施例４に記載したとおりに検出に用いた。ビーズの解離および変性の場合に３ＭのＧｄｎＳＣＮを用いて処理したプルダウン試料は、予想どおり、対照血漿ではなく、ｖＣＪＤスパイク血漿から信号を発した。プルダウン試料の、ｐＨ７．５における緩衝液による処理では、予想どおり、ｖＣＪＤスパイク血漿または対照血漿のいずれからも目立った信号はなかった。プルダウン試料は、表に示した種々のｐＨの溶液で処理した。高ｐＨまたは低ｐＨにおけるいくつかの処理では、ビーズからプリオンタンパク質を解離および変性されることができ、ｐＨ１３における処理は、３ＭのＧｄｎＳＣＮと同じ程度に効率的であった。
重要なことは、ＧｄｎＳＣＮ試料の容積（希釈後）は２２５μｌであったが、ｐＨ１３で処理した試料の容積は、中和後わずか７５μｌであったことである。
表１５
Figure 2012162571
Figure 2012162571
 実施例６−直接ＥＬＩＳＡを用いたｐＨ変性
高ｐＨまたは低ｐＨによる解離および変性についても、検出のためのＡＰ標識付き３Ｆ４抗体を用いる直接ＥＬＩＳＡフォーマットを併用してテストした。このプロセスは、中和工程を含む該工程まで実施例５と同様に行った。上澄み液中のＰｒＰは、ＮａＨＣＯ３バッファー中ｐＨ８．９においてマイクロタイター・プレートのウエル上に直接被覆した。これらのプレートは、密封し、４℃で一晩培養した。次の日、プレートは洗浄し、カゼインでブロックし、プレート上のＰｒＰを化学発光基質を用いてＡＰ標識付き３Ｆ４により検出した。結果は表１６に示している。
表１６
Figure 2012162571
Figure 2012162571
 実施例７−磁気ビーズに関するサンドイッチＥＬＩＳＡ
通常、サンドイッチＥＬＩＳＡは、９６のウエルを有するポリスチレン製のマイクロタイター・プレートを用いて行ない、捕捉抗体がプレート上に被覆され、次いで、抗原の結合、洗浄、および検出が同じウエルでなされる。しかし、固相マトリックスとして磁気ビーズを利用する別のフォーマットを使用することができる。このフォーマットでは、捕捉抗体で被覆される磁気ビーズは、まず抗原と混合し、その後検出抗体を添加する。
プレートＥＬＩＳＡを用いる場合に使用するために開発したｐＨにより解離および変性を行う方法が、固体支持体として磁気ビーズと同等に使えるかどうかをテストするために、次のような実験を行った。ペプトイド試薬ＸＩＩｂに連結された磁気ビーズを用いてスパイクしたヒト血漿試料からのＰｒＰＳｃのプルダウンを、前に説明したとおりに行った。プルダウンビーズは、５０μｌの０．１ＮのＮａＯＨを用いて変性し、ＮａＨ２ＰＯ４（２０μｌ）を用いて中和した。上澄み液は、清浄なポリプロピレン・ウエルに移した。
この溶液に、「捕捉」抗体として抗プリオン抗体を被覆した新しい磁気ビーズを添加した。一組のビーズは３Ｆ４抗体で被覆し、別の組のビーズは残基１２１と２３１との間のプリオンタンパク質のＣ末端基の中のエピトープを認識する抗体（Ｃ１７）で被覆した。抗体被覆ビーズおよびプルダウンからの溶離液は２時間培養した。これらのビーズは一度洗浄し、ＡＰ標識付きの検出抗体を添加した。検出抗体（Ｃ２）として用いた抗体は、ＰｒＰのオクタリピート領域、残基２３−９０、に結合している抗体である。これらのビーズおよび検出抗体は、さらに２時間培養した。次いで、ビーズは洗浄し、化学発光ＡＰ基質を添加し、３０分間混合し、化学発光はＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。
プレート・フォーマットにおいて同じ捕捉および検出の各抗体を用いたＥＬＩＳＡは、比較のため行った。結果は表１７に示している。両フォーマットにおいて、１ｎｌの１０％ＢＨ ｖＣＪＤ中のＰｒＰＳｃの存在は、７０μｌの血漿溶液からスパイキングおよびプルダウンの後で検出した。
表１７
Figure 2012162571
 実施例８−ペプトイド試薬をデザインするのに有効なペプチド
本発明のペプトイド試薬を作るのに有効なペプチドの非限定的な例は、表１８に示した配列から導かれる。この表のペプチドは、普通の１字アミノ酸コードにより表され、左はこれらのアミノ末端基、右はカルボキシ末端基を用いて描かれる。この表の配列のいずれかは、アミノ末端基および／またはカルボキシ末端基においてＧｌｙリンカー（Ｇｎ ここでｎ＝１，２，３，または４）を随意に含めてよい。角括弧内のアミノ酸は、別のペプチドにおいてその位置で使用することができる代わりの残基を示している。丸括弧は、そのペプチド試薬からその残基（類）が存在しても、存在しなくてもよいことを示している。「２」がフォローした二重丸括弧（例えば、配列番号１１１）は、その配列が二重括弧の間のペプチドの２つのコピーを含むことを示している。コピー番号記号表示（例えば、配列番号１１１における「Ｋ」）に続く残基は、その残基から二重括弧の間のペプチドの各コピーが延びている残基を示している。したがって、配列番号１１１は、ＱＷＮＫＰＳＫＰＫＴＮペプチド配列（即ち、配列番号１４）のダイマーであり、各々は、リジンのａ−およびｅ−アミノ官能基を介してリジン（Ｋ）残基へのこれらのカルボキシ末端基により連結されている。”ＭＡＰＳ”を含む配列は、複数の抗原部位を有するペプチドを示している。用語「ブランチ」に先行する数はコピー数を示している。したがって、配列番号１１２は、ＧＧＧＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＧの４コピーを含み、この配列は各末端にＧｌｙリンカーを有する配列番号６７であり、一方、配列番号１１３は、ＧＧＧＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＧの８コピーを含み、この配列は、やはり、各末端にＧｌｙリンカーを有する配列番号６７である。
表１８：本発明のペプトイド試薬を作るペプチド配列の例
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 実施例９
ペプトイドの固相サブモノマー合成のプロトコル
一般的実験。溶媒は試薬グレードであり、精製せずにそのまま用いた。ブロモ酢酸は、Ａｌｄｒｉｃｈ（９９％グレード）から入手し、ＤＩＣはＣｈｅｍｉｎｐｌｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手した。すべての反応および洗浄は、特に明記しない限り、３５℃で行った。樹脂の洗浄は、樹脂に洗浄溶媒（通常ＤＭＦまたはＤＭＳＯ）を添加することを意味し、樹脂をかき混ぜるので、均一なスラリーが得られ（通常、約２０秒）、続いて樹脂から溶媒を徹底的に除去する。溶媒は反応容器のフリットボトムを通して真空ろ過によりできるだけ除去し、樹脂を乾燥させる（通常、約１０秒）。樹脂スラリーはフリット容器のボトムを通してアルゴンをバブリングしてかき混ぜた。試薬を溶かすために用いた溶媒は、ハウス・バキュームの下で５分間超音波分解により使用する前に脱ガスする必要がある。洗浄溶媒では、容量を調節して（１〜５ｍＬ）利用できるＤＭＦ、ＤＭＳＯおよびジクロロメタンを含むディスペンサがあると非常に便利である。
ダイマーは長期間貯蔵すると環状化してジケトンピペラジンを形成することができるので、ダイマー段階で合成を止めない方が好ましい。合成を休止するのは、置換洗浄後が好ましい。
最初の樹脂の膨潤およびＦｍｏｃ脱保護。フリット付き反応容器に、１００ｍｇのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ樹脂）を入れる。この樹脂に２ｍＬのＤＭＦを添加し、この溶液を樹脂が膨潤するまで５分間かき混ぜる。必要ならば、樹脂の塊を壊すためにガラス棒を用いてよい。次いで、ＤＭＦを抜き取る。２ｍＬの２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を樹脂に添加し、Ｆｍｏｃ基は取り除く。これを１分間かき混ぜ、次いで液を抜き取る。さらに、２ｍＬの２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を樹脂に添加し、２０分間かき混ぜ、液を抜き取る。次いで、樹脂をＤＭＦ（５×２ｍＬ）で洗浄する。
サブモノマー合成サイクル。次いで、非ブロック化したアミンを１．１３ｍＬの１．２Ｍブロモ酢酸ＤＭＦ溶液を樹脂に添加し、続いて２００μＬ（０．９３当量）の純Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカーボジイミド（ＤＩＣ）を添加してアシル化する。この溶液は３５℃で２０分間かき混ぜ、次いで、液を抜きとる。次いで、この樹脂はＤＭＦ（３×２ｍＬ）で洗浄する。
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 次いで、アシル化工程は、１級アミンを用いた求核移動が行われる。洗浄樹脂に対して０．８５ｍＬのアミン１ＭのＮＭＰ溶液が添加される。この溶液を３５℃で３０分間かき混ぜ、次いで、液が抜かれる。この樹脂は、次いで、ＤＭＦ（３×２ｍＬ）で洗浄する。これにより１つの反応サイクルが完成する。
アシル化／移動サイクルは、望ましいオリゴマーが得られるまで、例えば、３〜約３０回反復される。
ビオチンおよびチオール基共役。随意に、ビオチンはビオチン（０．４Ｍ）およびＨＯＢｔ（０．４Ｍ）のＤＭＳＯ２．０ｍＬ溶液の添加によりＮ−末端基に連結され、次いで、純ＤＩＣの１．０５当量の添加が続く。この反応混合物は３５℃で１時間かき混ぜられ、その後この反応混合物は液を抜かれ、ＤＭＳＯ（２×３ｍＬ）、次いで、ＤＭＦ（３×２ｍＬ）で洗浄した。随意に、システィンの組み込みによりチオール基を組み込んだ。システィンは、アミノ酸カップリング・工程、即ちＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）を、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（０．４Ｍ）およびＨＯＢｔ（０．４Ｍ）ＤＭＦ溶液を２．０ｍＬ添加し、次いで、１．０５当量の純ＤＩＣを添加し、Ｎ−末端に連結することを介して加えた。この反応混合物は、３５℃で１時間かき混ぜ、その後この反応混合物を液抜きし、ＤＭＦ（３×３ｍＬ）で樹脂を洗浄した。Ｆｍｏｃ基は、次いで、２ｍＬの２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を樹脂に添加して除去する。これを１分間かき混ぜ、次いで、液抜きした。別の２ｍＬの２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を樹脂に添加し、２０分かき混ぜ、次いで、液抜きした。この樹脂は、次いで、ＤＭＦ（５×２ｍＬ）で洗浄した。
開裂（５０μｍｏｌの樹脂について）。合成反応および樹脂の洗浄後、この樹脂はジクロロメタン（２×２ｍＬ）で洗浄し、１分間空気乾燥した。乾燥樹脂は、テフロン（登録商標）・マイクロ撹拌バーを含むガラスのシンチレーション小瓶に入れ、次いで、約５ｍＬのＴＦＡ／トリイソプロピルシラン／水 ９５／２．５／２．５（ｖ／ｖ／ｖ）を添加する。この溶液を１５分間撹拌する。各試料の開裂混合物を、２０μｍのポリエチレン・フリットを取り付けた８ｍＬ固相抽出（ＳＰＥ）カラムを通してろ過し５０ｍＬの円錐形ポリプロピレン遠心分離チューブに入れた。この樹脂を、次いで、１ｍＬの９５％ＴＦＡで洗浄し、ろ液を集めた。次いで、ろ液を遠心分離チューブにおいて等容積の水で希釈した。この溶液を、次いで、凍結乾燥し乾燥させた。乾燥生成物を１０ｍＬの１：１アセトニトリル／酸水溶液に溶解し、再び凍結乾燥して乾燥させた。
オリゴマーのキャラクテリゼーション。個々のペプトイド・オリゴマーをＣ−１８カラム（Ｖｙｄａｃ，５μｍ，３００Å，４．５×２５０ｍｍ）で逆相ＨＰＬＣにより分析した。１ｍＬ／ｍｉｎの流速（溶媒Ａ＝０．１％ＴＦＡ水溶液，溶媒Ｂ＝０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液）において、４０分で０〜８０％Ｂの直線的勾配を用いる。主なピークを集め、エレクトロスプレーＭＳ分析を受けて分子量を決める。
ペプトイドの精製。ペプトイドは、生物学者が使用する前に逆相ＨＰＬＣにより精製する。通常、これらの化合物は、Ｃ１８カラムで分析し、精製する。したがって、これらの化合物は、少量の１０％アセトニトリル／水に溶解し、５０×２０ｍｍＩＤ（内径）ＤｕｒａＧｅｌ ＨＳ Ｃ１８カラム（Ｐｅｅｋｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で精製する。３０ｍＬ／ｍｉｎの流速において（溶媒Ａ＝０．１％ＴＦＡ水溶液，溶媒Ｂ＝０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液）、４０分で５〜６５％Ｂの直線勾配が使われる。集めた生成物画分を合体し、凍結乾燥して白い粉末を得る。
実施例１０
ペプトイド試薬ＸＩＩｂのプルダウン効率
ビーズに共有結合したペプトイド試薬ＸＩＩｂの能力は、下で説明したプルダウン・アッセイによりテストした。
ｖＣＪＤまたは正常な脳ホモジネート（ＢＨ）は、１％Ｔｗｅｅｎ２０および１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を有するＴＢＳにおいて５０％プールした正常なヒト血漿にスパイクされた。対照試料は、いずれのＢＨの場合もスパイクされなかった。次いで、各試料（１０％ＢＨの１０ｎｌを含むか全く含まない）１００μｌを、３μｌのＸＩＩｂビーズ（３０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、得られた混合物を７５０ｒｐｍにてコンスタントに振とうしながら３７℃で１時間培養した。これらのビーズは、次に０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳＴを用いて４回洗浄し、ビーズに結合したＰｒＰＳｃは０．１ＮのＮａＯＨを添加して解離させた。変性プリオンタンパク質は、後に０．３ＭのＮａＨ２ＰＯ４により中和し、ＥＬＩＳＡプレートに移動させた。
プルダウン効率は、プルダウン試料からの信号をプルダウンなしにグアニジニウム・チオシアネート（ＧｄｎＳＣＮ）により変性された同一試料からの信号と比較することにより計算した。ｖＣＪＤまたは正常な脳からのプリオンタンパク質を等容積の５％ＢＨおよび６ＭのＧｄｎＳＣＮと混合して変性し、室温で１０分間培養した。次いで、この試料は、単なる対照として用いた、ＴＢＳＴ中でプルダウン試料の同じ濃度へ希釈した。１００μｌの直接変性した各試料は、後に、プルダウン試料と同じＥＬＩＳＡプレートに移動させた。
ＥＬＩＳＡプレートは、０．１ＭＮａＨＣＯ３中２．５μｇ／ｍＬの捕捉抗体３Ｆ４により被覆した。コーティング操作は、４℃で一晩行い、次いで、ＴＢＳＴにより３度洗浄した。このプレートは、次に、３７℃で１時間、ＴＢＳ中１％カゼインによりブロックした。プルダウン試料および直接変性した試料の両方からのプリオンタンパク質は、３００ｒｐｍにてコンスタントに振とうしながら、３Ｆ４と共に３７℃で１時間ＥＬＩＳＡプレート内で培養し、このプレートはＴＢＳＴで６回洗浄した。アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）共役検出抗体は、０．１％カゼインＴＢＳＴ中で０．１μｇ／ｍＬに希釈し、次いで、ＥＬＩＳＡプレートに添加した。このプレートは３７℃で１時間培養し、ＴＢＳＴで６回洗浄した。信号は、強化されたＬｕｍｉ−Ｐｈｏｓ化学発光基質を用いて発生させ、照度計により相対光単位（ＲＬＵ）で読みとった。
結果は表１９に示している。脳組織からのプリオンタンパク質は、３ＭのＧｄｎＳＣＮにより完全に変性し、その抗体により検出することができる。この実験では、ＸＩＩｂビーズを用いてプリオンタンパク質プルダウンにより発生した信号を、ＧｄｎＳＣＮにより直接変性したタンパク質から得られた信号と比較した。データは、プルダウンおよび直接変性した試料のバックグラウンド（ＢＨなし）は、それぞれ、９．０および７．７ＲＬＵであることを示した。直接変性した１０ｎＬの１０％の正常ＢＨは、１４．６ＲＬＵの信号を有し、正常な脳におけるＰｒＰｃレベルを反映している。一方では、プルダウン法により検出された１０ｎＬの１０％正常ＢＨは、９．９ＲＬＵの読みを示し、これはそのバックグラウンドに似ている。これは、ペプトイドＸＩＩｂの特異性を証明した。１０ｎＬの１０％ｖＣＪＤ試料を、プルダウンおよび直接変性法によりテストし、データは５３．０および５６．３ＲＬＵを示し、これはＸＩＩｂビーズのプルダウン効率がほぼ１００％に達したことを意味している。
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 実施例１１
プリオン・ストレインの区別
折り畳まれているものを開く際の熱力学的特性の違いを測定することにより、プリオン・ストレイン間の構造的な差を検出することができる。化学的変性剤の濃度を上げてＰｒＰＳｃを培養すると各ストレインの特徴であるプリオン配座異性体の変性プロフィールを得ることができる。以前の研究は、変性剤で処理後畳まれたま残っているＰｒＰＳｃの比率を測定するためにプロテイナーゼＫ（ＰＫ）抵抗を用いた。ここでは、ペプトイド試薬ＸＩＩｂが、折り畳まれたＰｒＰＳｃとそうでないＰｒＰＳｃとを区別するのに使用できるか、したがって、変性プロフィールが普通の方法では測定できないＰＫ感受性ストレインにおけるコンフォメーション状態の測定を可能にするかどうかをテストした。
ｖＣＪＤストレインの変性プロフィールを作るために、ｖＣＪＤ脳ホモジネート（ＮＩＢＳＣ ＣＪＤ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ）は、試料を希釈し、ペプトイド試薬ＸＩＩｂを用いたプルダウン（実施例３および下のＸＩＩｂプルダウンの説明を参照のこと）にかける前に種々のグアニジン塩化水素を用いて培養した。次いで、ＸＩＩｂに結合した物質は溶離し、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにより検出した。変性剤の各濃度におけるＰｒＰＳｃプルダウンのグラフ表示によると、グアニジン塩化水素の濃度は、ＸＩＩｂによりプルダウンされ折り畳まれたＰｒＰＳｃの画分と逆比例した。形成されたデータ点は、単一シグモイド曲線は１つの主要な遷移において折り畳まれていない脳ホモジネートにおける１つのＰｒＰＳｃ配座異性体の存在を示唆している（図４の白丸（○）を参照のこと）。したがって、ＸＩＩｂは、化学的変性剤を用いて処置すると分裂するＰｒＰＳｃについて構造上のエピトープを認識していると考えられている。孤発性ＣＪＤストレイン（ｓＣＪＤ，ＮＩＢＳＣ ＣＪＤ資料館）を分析して、ｖＣＪＤストレインに比べた場合、ＸＩＩｂにより認識された構造上のエピトープは、ｓＣＪＤストレインにおいてより安定であると考えられていることを示しているｖＣＪＤ（図４，灰色の点を参照のこと）の変性プロフィールの右にシフトした類似のシグモイド曲線を得た。各ストレインを分析して、ＰｒＰＳｃの相対的なコンフォメーション安定性の目安として、即ち、ＧｄｎＨＣｌ濃度は最高変性の半分（ＧｄｎＨＣｌ１／２）に存在する、１つの固有値を有する曲線を定義することができる等価なパターンを一貫して得た。ｖＣＪＤの変性プロフィールは、１．６ＭのＧｄｎＨＣｌのＧｄｎＨＣｌ１／２を有した。対照的に、ｓＣＪＤ脳ホモジネートは、２．０ＭのＧｄｎＨＣｌのＧｄｎＨＣｌ１／２を有するグアニジン変性に対してより安定であった。したがって、ＸＩＩｂは、プリオン・ストレインの間のコンフォメーション変動性を分析するツールとして使用することができる。
ＸＩＩｂプルダウン
感染脳ホモジネート（７５−２００ｎＬ，１０％）は、室温で１時間、０〜４Ｍの濃度範囲のグアニジン溶液中で変性した。変性後、すべての試料は、ＴＢＳＴＴ中で０．１Ｍグアニジン塩化水素の最終濃度に調節し、折り畳まれたＰｒＰＳｃは、標準プルダウン操作を用いてＸＩＩｂビーズによりプルダウンした。プルダウンした物質は、溶離し、Ｃ１７捕捉抗体および３Ｆ４−ＡＰ検出抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡにより三重に測定した。
当業者が認識しているように、本発明の意図から逸脱することなく本発明の好ましい実施形態を、数多く、変更および修飾することができる。この種の変化はすべて本発明の範囲に入る。本、この特許文書で言及したことを含む、特許、出願、および印刷された刊行物の各々は、引用により全体が本明細書に組み込まれている。
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  1. 本願明細書に記載された発明。
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