BRPI0615618A2

BRPI0615618A2 - reagentes peptóides especìficos para prìon

Info

Publication number: BRPI0615618A2
Application number: BRPI0615618-5A
Authority: BR
Inventors: David Peretz; Michael D Connolly; Ronald N Zuckermann; Man Gao; Robert M Shimizu; Gulliver Timoteo
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2005-09-09
Filing date: 2006-09-08
Publication date: 2011-05-24
Also published as: JP2012162571A; US20070087972A1; CA2621767A1; IL189992A0; EP1931695A1; JP5209477B2; KR20080048527A; AU2006287299A1; NZ566020A; ES2404940T3; DK1931695T3; US7834144B2; ZA200802186B; WO2007030804A1; JP2009507833A; EP2383281A3; EP1931695B1; CN101356186A; EP2383281A2; US20120027677A1

Abstract

REAGENTES PEPTóIDES ESPECIFICOS PARA PRION A invenção está relacionada a reagentes peptáldes que interagem preferivelmente com uma forma patogênica de uma proteína de doença conformacional, comparada com uma forma não patogênica da proteína de doença conformacional, em queo reagente peptáide compreende uma região terminal amino, uma região terminal carbóxi e pelo menos uma região peptóide entre a região terminal amino e a região terminal carbóxi, em que a região peptóide compreende 3 a cerca de 30 glicinas N-substituídas e, opcionalmente, um ou mais aminoácidos. A invenção também está relacionada aos métodos de utilização dos peptóides na detecção e no isolamento de prions, e no tratamento e na prevenção de doenças relacionadas a príon.

Description

REAGENTES PEPTÕIDES ESPECÍFICOS PARA PRÍONCAMPO DA INVENÇÃO

A invenção está relacionada aos reagentes peptóidesúteis na detecção e no isolamento de príons, e notratamento e na prevenção de doenças relacionadas a príons.A invenção também está relacionada a complexos, composiçõese kits que compreendem os reagentes peptóides e processospara sua preparação.

FUNDAMENTOS

A proteína de príon (PrPc) é uma proteína de 33-35 kDde função incerta e, em seres humanos, é transcrita por umgene no braço curto do cromossomo 20. O núcleo de 27-30 kDresistente à protease (príon, proteína scrapie, ou PrP ) eo componente funcional, com várias isoformas responsáveispor '"doenças de príon", que são doenças conformacionais deproteína.

Doenças conformacionais de proteína surgem datransição conformacional aberrante de uma proteína (umaproteína de doença conformacional, por exemplo, PrPc), oque, por sua vez, leva à auto-associação das formasaberrantes de proteína (por exemplo, PrPsc) que resulta emdeposição e dano teciduais. Príons (PrPsc) possuem umaconformação de lâminas substancialmente pregueadas (beta)em vez da estrutura de α-hélice de PrPc normal, desprovidade ácido nucléico detectável e, geralmente, não despertamuma resposta imunológica. Em geral, doenças conformacionaisde proteína" compartilham similaridades marcantes em termosdas apresentações clínicas, tipicamente uma progressãorápida do diagnóstico à morte, após períodos variáveis deincubação.Em seres humanos, as doenças de príon, tambémdenominadas "encefalopatias espongiformes transmissíveis"(TSEs), incluem doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), síndromede Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), Insônia FamiliarFatal e Kuru (veja, por exemplo, Isselbacher e cols., eds.(1994). "Harrison's Principies of Internai Medicine". NovaYork: McGraw-Hill, Inc.; Medori e cols. (1992) N. Engl. J.Med. 326: 444-9). Em animais, TSEs incluem scrapie docarneiro, encefalopatia espongiforme bovina (BSE),encefalopatia transmissível da marta, e doença emaciantecrônica de veados de orelhas longas e alces cativos(Gajdusek, (1990). "Subacute Spongiform Encephalopathies:Transmissible Cerebral Amyloidoses Caused by UnconventionalViruses". Em: "Virology", Fields, ed. , Nova York: RavenPress, Ltd. (pp. 2.289-2.324)). As encefalopatiasespongiformes transmissíveis são caracterizadas pelasmesmas características: a presença da conformação anormalda proteína do príon (rica em beta, resistente à proteinaseK) que transmite a doença quando inoculadaexperimentalmente em animais de laboratório, incluindoprimatas, roedores e camundongos transgênicos.

Recentemente, a disseminação rápida de BSE e suacorrelação com a ocorrência elevada de TSEs em sereshumanos levaram a um interesse crescente na detecção deTSEs em mamíferos não humanos. As conseqüências trágicas datransmissão acidental dessas doenças (veja, por exemplo,Gajdusek, "Infectious Amyloids, and Prusiner Prions", Em:uFields Virology". Fields, e cols., eds. Philadelphia:Lippincott-Ravin, Pub. (1996); Brown e cols. Lancet, 340:24-27 (1992)), as dificuldades de descontaminação (Asher ecols. (1986) Em: "Laboratory Safety: Principies andPractices", Miller ed., (pp. 59-71) Am. Soe. Micro.) e aspreocupações sobre a BSE (British Med. J. (1995) 311:1.415-1.421) reforçam a urgência para se obter tanto umteste diagnóstico que identificasse seres humanos e animaiscom TSEs quanto terapias para os indivíduos infectados.

Príons diferem significativamente de bactérias, víruse viróides. A hipótese dominante é que, diferentemente detodos os outros patógenos infecciosos, a infecção é causadapor uma conformação anormal da proteína de príon, que atuacomo um modelo e converte conformações normais de príon nasconformações anormais, aberrantes. Uma proteína de príonfoi caracterizada pela primeira vez no início dos anos 80(veja, por exemplo, Bolton, McKinley e cols. (1982) Science218: 1.309-1.311; Prusiner, Bolton e cols. (1982)Biochemistry 21: 6.942-6.950; McKinley, Bolton e cols.(1983) Cell 35: 57-62). Desde então, os genes que codificama proteína de príon completa foram clonados, seqüenciados eexpressos em animais transgênicos (veja, por exemplo,Basler, Oesch e cols. (1986) Cell 46: 417-428).

A característica fundamental das doenças de príon é aformação da proteína com formato anormal (PrPsc) a partirda forma normal da proteína de príon (celular ou nãopatogênica ou PrPc) (veja, por exemplo, Zhang e cols.(1997) Biochem. 36(12): 3.543-3.553; Cohen & Prusiner(1998) Ann. Rev. Biochem., 67: 793-819; Pan e cols. (1993)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 10.962-10.966; Safar e cols.(1993) J. Biol. Chem. 268: 20.276-20.284). A estruturasubstancialmente em lamina β de PrPsc, quando comparada comas formas de PrPc que não causam doença, dobradaspredominantemente em α-hélice, foi revelada por estudos deespectroscopia óptica e de cristalografia (veja, porexemplo, Wille e cols. (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. USA99: 3.563-3.568; Peretz e cols. (1997) J. Mol. Biol. 273:614-622; Cohen & Prusiner, (1999) "5: Structural Studies ofPrion Proteins". Em: wPrion Biology And Diseases", S.Prusiner, ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring HarborLaboratory Press, (pp: 191-228). As alterações estruturaisparecem ser seguidas por alterações nas propriedadesbioquímicas: PrPc é solúvel em detergentes nãodesnaturantes, PrPsc é insolúvel; PrPc é facilmente digeridopor proteases, enquanto PrPsc é parcialmente resistente,resultando na formação de um fragmento truncado no terminalamino conhecido como forma wPrPres" (Baldwin e cols.(1995); Cohen & Prusiner (1995)), "PrP 27-30" (27-30 kDa)ou "PK-resistente" (resistente à proteinase K) .Adicionalmente, PrPsc pode converter PrPc na conformaçãopatogênica. Veja, por exemplo, Kaneko e cols. (1995) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 92: 11.160-11.164; Caughey (2003) Br.Med. Buli. 66: 109- 20.

A detecção das isoformas patogênicas de proteínas dedoença conformacional em indivíduos vivos e de amostrasobtidas de indivíduos vivos provou-se difícil. Dessa forma,o diagnóstico definitivo e tratamentos paliativos paraessas condições transmissíveis e que contêm amilóide antesda morte do indivíduo permanecem um desafiosubstancialmente ainda não alcançado. 0 examehistopatológico de biópsias cerebrais é arriscado para oindivíduo, e as lesões e os depósitos amilóides podempassar despercebidos, dependendo de onde for retirada aamostra da biópsia. Além disso, há ainda os riscosenvolvidos com as biópsias para animais, pacientes eprofissionais de saúde. Além disso, os resultados de testescerebrais em animais não são normalmente obtidos até que oanimal faça parte de um produto alimentício. Além disso,tipicamente, anticorpos gerados contra peptídeos de príonreconhecem tanto PrPsc desnaturado quanto PrPc, mas sãoincapazes de reconhecer seletivamente PrPsc infeccioso (nãodesnaturado) (veja, por exemplo, Matsunaga e cols. (2 001)Proteins: Structure, Function and Genetics 44: 110-118).

Estão disponíveis diversos testes para TSE (veja Soto,C. (2004) Nature Reviews Microbiol. 2: 809, Biffiger ecols. (2002) J. Virol. Meth. 101: 79; Safar e cols. (2002)Nature Biotech. 20: 1.147, Schaller e cols. ActaNeuropathol. (1999) 98: 437, Lane e cols. (2003) Clin.Chem. 49: 1.774). No entanto, todos esses utilizam amostrasde tecido cerebral e são adequados apenas como testes post-mortem. A maioria desses testes também necessita detratamento por proteinase K das amostras, o que pode serdemorado; a digestão incompleta de PrPc pode levar aresultados falso-positivos; e a digestão de PrPsc sensívelà PK pode gerar resultados falso-negativos.

Dessa forma, continuam sendo necessários métodos ecomposições para a detecção da presença das proteínas depríon patogênico em várias amostras, por exemplo, emamostras obtidas de indivíduos vivos, em suprimentos desangue, em animais de criação, e em outros suprimentosalimentares de humanos e de animais. Também ainda sãonecessários métodos e composições para o diagnóstico etratamento de doenças relacionadas a príons. Esta invençãoé dirigida a essas finalidades, bem como a outrasfinalidades importantes.SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção está relacionada aos reagentespeptóides que interagem com uma proteína de doençaconformacional, por exemplo, uma proteína de príon,preferivelmente com uma forma patogênica comparada com umaforma não patogênica da proteína de doença conformacional,que possui uma fórmula de:

<formula>formula see original document page 7</formula>

em que:

cada Q é independentemente um aminoácido ou umaglicina N-substituída e -(Q)n- define uma região peptóide;Xa é H, (C1-C6) alquil, cicloalquil, aril, aralquil,heteroaril, heteroarilalquil, heterocicloalquil, (C1-C6) acil, amino (C1-C6) acil, um aminoácido, um grupo protetoramino, ou um polipeptídeo de 2 a cerca de 100 aminoácidos,em que Xa é opcionalmente substituído por uma porçãoconjugada que é opcionalmente anexada através de uma porçãoligante;

Xa é H, (C1-C6)alquil, aril, aralquil, heteroaril,heteroarilalquil, heterocicloalquil, amino, alquilamino,dialquilamino, hidroxil, (C1-C6)alcóxi, arilóxi, aralcóxi,um grupo protetor carbóxi, um aminoácido, ou umpolipeptídeo de 2 a cerca de 100 aminoácidos, em que Xb éopcionalmente substituído por uma porção conjugada que éopcionalmente anexada através de uma porção ligante; en é 3 a cerca de 30;

em que pelo menos cerca de 50% da região peptóide -(Q)n- compreende glicinas N-substituídas.A presente invenção também está relacionada aosreagentes peptóides que são poliônicos e possuem uma cargafinal em pH fisiologicamente relevante. Em algumasmodalidades, os reagentes peptóides possuem uma carga finalpositiva em pH fisiologicamente relevante, por exemplo, umacarga de pelo menos 3+ ou pelo menos 4+. A carga final podesurgir de uma ou mais glicinas N-substituídas da regiãopeptóide.

A presente invenção ainda está relacionada a umreagente peptóide que interage preferivelmente com umaforma patogênica de uma proteína de doença conformacionalcomparada com uma forma não patogênica da proteína dedoença conformacional, em que o reagente compreende umaregião terminal amino, uma região terminal carbóxi, e pelomenos uma região peptóide entre a região terminal amino e aregião terminal carbóxi, em que a região peptóidecompreende 3 a cerca de 3 0 glicinas N-substituídas e,opcionalmente, um ou mais aminoácidos.

A presente invenção ainda fornece um reagente peptóideque interage preferivelmente com uma forma patogênica deuma proteína de doença conformacional comparada com umaforma não patogênica da proteína de doença conformacional,em que o reagente compreende uma região peptóide queconsiste em 3 a 15 glicinas N-substituídas contíguas, e emque a região peptóide possui uma carga final em pHfisiologicamente relevante. Em algumas modalidades, a cargafinal é uma carga final positiva, por exemplo, uma cargafinal de pelo menos 3+ ou pelo menos 4 + em pHfisiologicamente relevante. Em algumas modalidades, oreagente peptóide tem uma carga final de 2+ a 6+, 3+ a 5+,ou 4+ em pH fisiologicamente relevante.

Os reagentes peptóides da invenção podem ser usados emuma ampla gama de aplicações, incluindo como ferramentaspara o isolamento de prions patogênicos ou para a detecçãode prions patogênicos em uma amostra, como componentes deuma composição terapêutica ou profilática, e/ou para ageração de anticorpos específicos para prions. Por exemplo,reagentes peptóides que interagem preferivelmente com PrPscquando comparados com PrPc são úteis para a detecção diretade formas patogênicas em amostras obtidas de seres vivos oufalecidos, por exemplo, para o diagnóstico de uma doença oupara o rastreamento de amostras de sangue doado ourastreamento de órgãos para a doação de órgãos. Osreagentes peptóides da invenção podem ser usados para seligar especificamente a qualquer PrPsc na amostra que formeum complexo. 0 complexo pode ser detectado diretamente pormétodos como, por exemplo, espectroscopia UV/Visível, FTIR,espectroscopia por ressonância magnética nuclear,espectroscopia Raman, espectrometria de massa, HPLC,eletroforese capilar, espectroscopia por ressonância porplasmônio de superfície, sistemas micro-eletromecânicos(MEMS), ou pode ser detectado pela ligação de reagentesespecíficos para prions adicionais (por exemplo, um segundoreagente peptóide ou um reagente de ligação de príon (comoaqui definido) ) ao PrPsc no complexo ou após dissociação docomplexo.

Dessa forma, a presente invenção está relacionada a ummétodo para a detecção da presença de um príon patogênicoem uma amostra, que compreende o contato da amostra com umprimeiro reagente peptóide da invenção sob condições quepermitem a ligação do reagente peptóide ao príonpatogênico, se presente, para formar um complexo, e adetecção da formação do complexo, a formação do complexosendo indicativa da presença do príon patogênico.

O método de detecção de príon patogênico em umaamostra também pode compreender o contato da amostra com umprimeiro reagente peptóide da invenção sob condições quepermitem a ligação do primeiro reagente peptóide ao príonpatogênico, se presente, para formar um primeiro complexo,o contato do primeiro complexo com um segundo reagentepeptóide da invenção, opcionalmente marcado de formadetectável, sob condições que permitem a ligação do segundoreagente peptóide ao príon patogênico do primeiro complexopara formar um segundo complexo, e a detecção da formaçãodo segundo complexo, a formação do segundo complexo sendoindicativa da presença do príon patogênico.

Em uma modalidade adicional, o método compreende ocontato da amostra com um primeiro reagente peptóide dainvenção sob condições que permitem a ligação do primeiroreagente peptóide ao príon patogênico, se presente, paraformar um primeiro complexo, a remoção de qualquer amostranão ligada, o contato do primeiro complexo com um segundoreagente peptóide da invenção, opcionalmente marcado deforma detectável, sob condições que permitem a ligação dosegundo reagente peptóide ao príon patogênico do primeirocomplexo para formar um segundo complexo, e a detecção daformação do segundo complexo, a formação do segundocomplexo sendo indicativa da presença do príon patogênico.

O primeiro reagente peptóide opcionalmente compreende umsuporte sólido que ajuda na separação do primeiro complexoda amostra não ligada.

Além disso, o método de detecção da invenção podecompreender o contato da amostra com um primeiro reagentepeptóide da invenção sob condições que permitem a ligaçãodo primeiro reagente peptóide ao príon patogênico, sepresente, para formar um primeiro complexo, a remoção daamostra não ligada, a dissociação do príon patogênico doprimeiro complexo gerando, dessa forma, príon patogênicodissociado, o contato do príon patogênico dissociado com umsegundo reagente peptóide da invenção, opcionalmentemarcado de forma detectável, sob condições que permitem aligação do segundo reagente peptóide ao príon patogênicodissociado, para formar um segundo complexo, e a detecçãoda formação do segundo complexo, a formação do segundocomplexo sendo indicativa da presença do príon patogênico.

O método de detecção de príon patogênico em umaamostra também pode compreender o contato da amostra com umprimeiro reagente peptóide da invenção sob condições quepermitem a ligação do primeiro reagente peptóide ao príonpatogênico, se presente, para formar um primeiro complexo,o contato do primeiro complexo com um reagente de ligaçãode príon, opcionalmente marcado de forma detectável, sobcondições que permitem a ligação do reagente de ligação depríon ao príon patogênico do primeiro complexo para formarum segundo complexo; e a detecção da formação do segundocomplexo, a formação do segundo complexo sendo indicativada presença do príon patogênico.

Em uma modalidade adicional, o método compreende ocontato da amostra com um primeiro reagente peptóide dainvenção sob condições que permitem a ligação do primeiroreagente peptóide ao príon patogênico, se presente, paraformar um primeiro complexo, a remoção de qualquer amostranão ligada, o contato do primeiro complexo com um reagentede ligação de príon, opcionalmente marcado de formadetectável, sob condições que permitem a ligação doreagente de ligação de príon ao príon patogênico doprimeiro complexo para formar um segundo complexo, e adetecção da formação do segundo complexo, a formação dosegundo complexo sendo indicativa da presença do príonpatogênico. 0 primeiro reagente peptóide opcionalmentecompreende um suporte sólido que ajuda na separação doprimeiro complexo da amostra não ligada.

Além disso, o método de detecção da invenção podecompreender o contato da amostra com um primeiro reagentepeptóide da invenção sob condições que permitem a ligaçãodo primeiro reagente peptóide ao príon patogênico, sepresente, para formar um primeiro complexo, a remoção daamostra não ligada, a dissociação do príon patogênico doprimeiro complexo, gerando, dessa forma, príon patogênicodissociado, o contato do príon patogênico dissociado com umreagente de ligação de príon, opcionalmente marcado deforma detectável, sob condições que permitem a ligação doreagente de ligação de príon ao príon patogênicodissociado, para formar um segundo complexo, e a detecçãoda formação do segundo complexo, a formação do segundocomplexo sendo indicativa da presença do príon patogênico.

Em uma modalidade adicional, o método de detecção dainvenção pode compreender o contato da amostra com umprimeiro reagente peptóide da invenção sob condições quepermitem a ligação do primeiro reagente peptóide ao príonpatogênico, se presente, para formar um primeiro complexo,a remoção da amostra não ligada, a dissociação do príonpatogênico do primeiro complexo, gerando, dessa forma,príon patogênico dissociado, o contato do príon patogênicodissociado com um reagente de ligação de príon sobcondições que permitem a ligação do reagente de ligação depríon ao príon patogênico dissociado, para formar umsegundo complexo, e a detecção da formação do segundocomplexo com a utilização de um segundo reagente de ligaçãode príon, opcionalmente marcado de forma detectável, aformação do segundo complexo sendo indicativa da presençado príon patogênico.

Além disso, o método de detecção pode compreender ocontato da amostra com um reagente de ligação de príon sobcondições que permitem a ligação do reagente de ligação depríon ao príon patogênico, se presente, para formar umprimeiro complexo, a remoção da amostra não ligada, ocontato do complexo com um reagente peptóide da invenção,opcionalmente marcado de forma detectável, sob condiçõesque permitem a ligação do reagente peptóide ao príonpatogênico do primeiro complexo para formar um segundocomplexo, e a detecção da formação do segundo complexo, aformação do segundo complexo sendo indicativa da presençado príon patogênico. O reagente de ligação de príon éfornecido opcionalmente em um suporte sólido.

Adicionalmente, o método de detecção pode compreender ofornecimento de um suporte sólido que compreende umreagente peptóide da invenção, a combinação do suportesólido com um ligante marcado de forma detectável, sobcondições que permitem a ligação do ligante marcado deforma detectável ao reagente peptóide, em que o reagentepeptóide do suporte tem uma afinidade de ligação mais fracapelo ligante do que pelo príon patogênico, para formar umprimeiro complexo, a combinação da amostra com o primeirocomplexo sob condições que permitem a ligação do príonpatogênico, se presente na amostra, ao reagente peptóide doprimeiro complexo, substituindo, desse modo, o ligantemarcado de forma detectável do primeiro complexo, eformando um segundo complexo que compreende o reagentepeptóide e o príon patogênico, e a detecção da formação dosegundo complexo, a formação do segundo complexo sendoindicativa da presença do príon patogênico.

A presente invenção ainda fornece métodos para adetecção da presença de um príon patogênico em uma amostra,que compreendem: o contato da amostra com um primeiroreagente peptóide da invenção sob condições que permitem aligação do primeiro reagente peptóide ao príon patogênico,se presente, para formar um complexo, remoção da amostranão ligada do complexo, a dissociação do príon patogênicodo complexo, gerando, dessa forma, príon patogênicodissociado, o contato do príon patogênico dissociado com umsegundo suporte sólido sob condições que permitem que opríon patogênico dissociado seja aderido ao segundo suportesólido; e a detecção do príon patogênico dissociado aderidocom a utilização de um reagente de ligação de príon,opcionalmente marcado de forma detectável, em que a ligaçãodo reagente de ligação de príon indica a presença do príonpatogênico. Em algumas modalidades, a dissociação érealizada por exposição do complexo a um pH elevado ou a umpH reduzido. Em algumas modalidades, o método aindacompreende a etapa de neutralização do pH elevado ou do pHreduzido após a dissociação. Em algumas modalidades, opríon patogênico dissociado é desnaturado.

A presente invenção ainda fornece métodos para adetecção da presença de um príon patogênico em uma amostra,que compreendem o contato da amostra com um primeiroreagente peptóide da invenção sob condições que permitem aligação do primeiro reagente peptóide ao príon patogênico,se presente, para formar um primeiro complexo, a remoção daamostra não ligada do primeiro complexo, a dissociação dopríon patogênico do primeiro complexo, gerando, dessaforma, príon patogênico dissociado, o contato do príonpatogênico dissociado com um segundo suporte sólido, em queo segundo suporte sólido compreende um primeiro anticorpoanti-príon, sob condições que permitem que o príonpatogênico dissociado se ligue ao primeiro anticorpo anti-príon para formar um segundo complexo; e a detecção dopríon patogênico dissociado do segundo complexo com umsegundo anticorpo anti-príon, opcionalmente marcado deforma detectável, em que a ligação do segundo anticorpoanti-príon indica a presença do príon patogênico. Emalgumas modalidades, a dissociação é realizada porexposição do primeiro complexo a um pH elevado ou a um pHreduzido. Em algumas modalidades, o método ainda compreendea etapa de neutralização do pH elevado ou do pH reduzidoapós a dissociação. Em modalidades adicionais, o príonpatogênico dissociado é desnaturado.

Em todos os métodos acima que utilizam reagentes deligação de príon, os reagentes de ligação de príon podemser, por exemplo, anticorpos anti-príon.A invenção ainda fornece métodos para o tratamento oua prevenção de infecção relacionada a príons em animais.

A invenção é ainda dirigida ã detecção ou aoisolamento de príon em uma amostra.

A invenção é ainda dirigida ao fornecimento de umsuprimento de uma amostra substancialmente livre de príonscomo, por exemplo, sangue ou alimentos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Detecção ELISA de PrPc em amostras de plasmahumano. A Figura IA mostra medidas de ELISA (RLU) paraquantidades crescentes de plasma. A Figura IB mostra umacurva-padrão para medidas de ELISA (RLU) usando quantidadesconhecidas de proteína PrP recombinante.

Figura 2. Esta figura representa a seqüência deaminoácidos de proteínas de príon humano (ID. DE SEQ. N°:1) e de camundongo (ID. DE SEQ. N°: 2).

Figura 3. Esta figura representa um alinhamento deproteínas de príon humano (ID. DE SEQ. N°: 3), de hamsterda Síria (hamster) (ID. DE SEQ. N° : 4), bovino (ID. DE SEQ.N°: 5), carneiro (ID. DE SEQ. N°: 6), camundongo (ID. DESEQ. N°: 7), alces (ID. DE SEQ. N° : 8), antílope (fallow)(ID. DE SEQ. N°: 9), veado de orelhas longas (mula) (ID. DESEQ. N°: 10) e veado de cauda branca (branca) (ID. DE SEQ.N°: 11). Alce, Antílope, Veado de Orelhas Longas e Veado deCauda Branca variam entre eles em apenas dois resíduos,S/N128 e Q/E226 (mostrados em negrito).

Figura 4. Esta figura representa os perfis dedesnaturação de vCJD e sCJD.

DESCRIÇÃO DETALHADA

DefiniçõesOs termos selecionados descritos a seguir serãodiscutidos no contexto aqui utilizado. As formas no plurale no singular de um termo estão incluídas,independentemente da forma discutida.

"Príon", "proteína de príon", "proteína PrP" e "PrP"são usados de foram intercambiável para se referir tanto àforma de proteína de príon patogênico (também denominadaproteína scrapie, forma patogênica da proteína, isoformapatogênica, príon patogênico e PrPsc) quanto à forma nãopatogênica de príon (também denominada forma celular daproteína, isoforma celular, isoforma não patogênica,proteína de príon não patogênica e PrPc) , bem como à formadesnaturada e às várias formas recombinantes da proteína depríon que podem ter a conformação patogênica ou aconformação celular normal.

"Doença conformacional de proteína" refere-se àsformas patogênicas e não patogênicas da proteína de umaproteína associada a uma doença conformacional em que aestrutura da proteína foi alterada (por exemplo, dobradaerradamente ou agregada), resultando em uma conformaçãoanormal como, por exemplo, polimerização indesejada defibrila ou amilóide no contexto da lâmina com estruturabeta. Exemplos de proteínas de doença de conformaçãoincluem, sem limitação, proteínas de príon como, porexemplo, PrPsc e PrPc, e variações de aminoácidos do domíniovariável de cadeia leve (VL) de imunoglobulina, ocomponente protéico da molécula de anticorpo, que estãoassociadas às doenças conformacionais como, por exemplo,amiloidose. Uma lista não limitante de doenças comproteínas associadas que presumem duas ou mais conformaçõesdiferentes é mostrada abaixo.

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O uso dos termos "príon", "proteína de príon","proteína PrP", «prp« Qu "proteína de doençaconformacional" não visa a se limitar aos polipeptídeos quepossuem as seqüências exatas aqui descritas. É muitoevidente que os termos englobam proteínas de doençaconformacional de qualquer uma das espécies (por exemplo,humanas, bovinas) ou doenças (por exemplo, doença deAlzheimer, doença de Parkinson etc.) identificadas ou nãoidentificadas. Veja também os pedidos de patentes de co-propriedade U.S. N0 de Série 10/917.646, depositado em 13de agosto de 2004, U.S. N0 de Série 11/056,950, depositadoem 11 de fevereiro de 2005 e Pedido InternacionalPCT/US2004/0263 63, depositado em 13 de agosto de 2004,todos intitulados "Prion-Specific Peptide Reagents", quesão aqui incorporados por referência em suas totalidades.Aqueles habilitados na técnica, à luz dos ensinamentos dapresente revelação e da técnica, podem determinar regiõesque correspondem às seqüências aqui reveladas em quaisqueroutras proteínas de príon, usando, por exemplo, programasde comparação de seqüências (por exemplo, "Basic LocalAlignment Search Tool" (BLAST)) ou a identificação e oalinhamento de características ou motivos estruturais.

"Patogênica" significa que a proteína realmente causaa doença, ou que a proteína está associada à doença e,portanto, está presente quando a doença está presente.Dessa forma, uma proteína patogênica, como aqui usada, nãoé necessariamente uma proteína que é o agente causadorespecífico de uma doença. As formas patogênicas de umaproteína podem ser ou não infecciosas. Um exemplo de umaproteína patogênica de doença conformacional é PrPsc.Conseqüentemente, o termo "não patogênica" descreve umaproteína que normalmente não causa doença ou quenormalmente não está associada à causa da doença. Umexemplo de uma proteína não patogênica de doençaconformacional é PrPc.

O termo "interagir", em relação a um reagente peptóideque interage com uma proteína, por exemplo, um fragmento deproteína, significa que o reagente peptóide se ligaespecificamente, inespecificamente ou em alguma combinaçãode ligação específica e inespecífica à proteína de príon.Um reagente peptóide é considerado como "interagindopreferivelmente" com uma proteína de príon patogênico casoele se ligue com maior afinidade e/ou maior especificidadeà forma patogênica do que às isoformas não patogênicas. Umreagente peptóide que interage preferivelmente com umaproteína de príon patogênico também é aqui denominado umreagente peptóide específico para príon patogênico. Emalgumas modalidades, a afinidade e/ou especificidadeaumentada é pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cercade 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cercade 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menoscerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1.000 vezes.Deve-se entender que uma interação preferencial não exigenecessariamente interação entre um aminoácido específico ouresíduos e/ou motivos substitutos de aminoácidos de cadapeptídeo. Por exemplo, em algumas modalidades, os reagentespeptóides da invenção interagem preferivelmente comisoformas patogênicas, mas, no entanto, podem ser capazesde se ligar às isoformas não patogênicas em um nível maisfraco, embora detectável (por exemplo, 10% ou menos daligação demonstrada ao polipeptídeo de interesse).Tipicamente, ligação fraca, ou ligação de fundo, éfacilmente discernível da interação preferencial com ocomposto ou polipeptídeo de interesse, por exemplo, pelouso de controles apropriados. Em geral, os peptóides dainvenção se ligam aos príons patogênicos na presença de umexcesso de formas não patogênicas de IO6 vezes.

"Afinidade" ou "afinidade de ligação", em termos doreagente peptóide que interage com uma proteína de doençaconformacional, refere-se à potência de ligação, e pode serexpressa quantitativamente como uma constante dedissociação (Kd) · A afinidade de ligação pode serdeterminada com o uso de técnicas bem conhecidas poraqueles habilitados na técnica.

"Doença relacionada a príons" refere-se a uma doençacausada como um todo ou em parte por uma proteína de príonpatogênico (por exemplo, PrPsc) , por exemplo, mas semlimitação, scrapie, encefalopatias espongiformes bovinas(BSE), doença da vaca louca, encefalopatias espongiformesfelinas, kuru, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), novavariante da doença de Creutzfeldt-Jakob (nvCJD), doençaemaciante crônica (CWD), doença de Gerstmann-Strassler-Scheinker (GSS), e insônia fatal familiar (FFI).

0 termo "desnaturar" ou "desnaturada" tem osignificado convencional que é aplicado à estrutura daproteína, e significa que a proteína perdeu suas estruturassecundária e terciária nativas. Com relação à proteína depríon patogênico, uma proteína "desnaturada" de príonpatogênico não retém mais a conformação patogênica nativae, dessa forma, a proteína não é mais "patogênica". Aproteína de príon patogênico desnaturada tem umaconformação similar ou idêntica à proteína não patogênicade príon desnaturada. No entanto, a fim de tornar maisclara essa especificação, o termo "proteína de príonpatogênico desnaturada" será usado para se referir à proteína de príon patogênico que é capturada pelo reagentepeptóide como a isoforma patogênica e subseqüentementedesnaturada.

"pH fisiologicamente relevante" refere-se a um pH decerca de 5,5 a cerca de 8,5; ou de cerca de 6,0 a cerca de 8.0; ou, normalmente, de cerca de 6,5 a cerca de 7,5.

0 termo "alifático" refere-se a uma porçãohidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada. Gruposalifáticos podem incluir heteroátomos e porções carbonil.

0 termo "alquil", seja ele usado isoladamente ou como parte de outro grupo, refere-se a uma cadeia alifática dehidrocarboneto e inclui, sem limitação, cadeias lineares eramificadas contendo dela6, la5, la4, oula3átomos de carbono, a menos que especificado explicitamentede forma diferente. Por exemplo, metil, etil, propil,isopropil, butil, isobutil, terc-butil etc. são englobadospelo termo "alquil".

"Alquenil" significa grupos alquil que contêm pelomenos uma ligação dupla, por exemplo, 2a7, 2a6, 2a5,ou 2 a 4 átomos de carbono, incluindo, por exemplo, semlimitação, vinil, alil, 2-metil-alil, 4-but-3-enil, 4-hex-5-enil, 3-metil-but-2-enil e semelhantes.

"Alquinil" significa grupos alquil que possuem pelomenos uma ligação tripla carbono-carbono, por exemplo, 2 a7, 2a6, 2a5, ou2a4 átomos de carbono. Exemplos degrupos alquinil incluem etinil, propinil, e semelhantes."Alcóxi", seja ele usado isoladamente ou como parte deoutro grupo, tem o seu significado normal de um grupo defórmula -O-alquil, por exemplo, metóxi, em que alquil écomo aqui definido.

"Halo" ou "halogênio", quando usado isoladamente oucomo parte de outro grupo, tem seu significado normal deelementos do Grupo VII, por exemplo, F, Cl, Br e I.

wAril", quando usado isoladamente ou como parte deoutro grupo, significa um sistema aromático hidrocarboneto,por exemplo, de 6 a 20, 6 a 14, ou 6 a 10 átomos de carbonono anel, por exemplo, de 1, 2 ou 3 anéis, por exemplo,fenil, benzil, naftil, naftaleno, antraceno, fenantrenil,antracenil, pirenil e semelhantes. Também estão incluídosna definição de aril sistemas aromáticos contendo um oumais anéis não aromáticos fundidos carbociclil ouheterociclil, por exemplo, 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno eindano. O grupo aril que contém um anel não aromáticofundido pode ser anexado através da porção aromática ou daporção não aromática.

"Aril-alquil" ou "aralquil" significa um grupo defórmula -alquil-aril, em que aril e alquil possuem asdefinições aqui apresentadas.

"Arilóxi" tem o seu significado normal de um grupo defórmula -0-aril, por exemplo, hidroxifenil, em que aril écomo aqui definido.

"Aralcóxi" tem o seu significado normal de um grupo defórmula -O-alquil-aril, por exemplo, metoxifenil, em quealcóxi e aril são como aqui definidos.

"Cicloalquil", seja ele usado isoladamente ou comoparte de outro grupo, tem seu significado normal de umgrupo cíclico alquil, alquenil, ou alquinil, por exemplo,uma porção hidrocarboneto saturada mono, bi-, tricíclica,fundida, em ponte ou espiro, por exemplo, de 3-10 átomos decarbono, por exemplo, ciclopropil. 0 termo "cicloalquil-aril" significa um grupo de fórmula -aril-cicloalquil emque aril e cicloalquil são como aqui definidos."Cicloalquilalquil" significa um grupo de fórmula - alquil-cicloalquil, por exemplo, um grupo ciclopropilmetil ouciclohexilmetil, em que alquil e cicloalquil são como aquidefinidos.

Como aqui usados, grupos "heteroaril" referem-se a umheterociclo aromático que possui pelo menos um membro doanel de heteroátomo, por exemplo, enxofre, oxigênio ounitrogênio. Grupos heteroaril incluem sistemas monocíclicose policíclicos (por exemplo, que possuem 2, 3 ou 4 anéisfundidos). Exemplos de grupos heteroaril incluem, semlimitação, piridil, pirimidinil, pirazinil, piridazinil,triazinil, furil (furanil), quinolil, isoquinolil, tienil,imidazolil, tiazolil, indolil, pirril, oxazolil,benzofuril, benzotienil, benzotiazolil, isoxazolil,pirazolil, triazolil, tetrazolil, indazolil, 1,2,4-tiadiazolil, isotiazolil, benzotienil, purinil, carbazolil,benzimidazolil, indolinil, e semelhantes. Em algumasmodalidades, o grupo heteroaril tem de 1 a cerca de 20átomos de carbono e, em modalidades adicionais, de cerca de3 a cerca de 20 átomos de carbono. Em algumas modalidades,o grupo heteroaril contém 3 a cerca de 14, 3a cerca de 7,ou 5 a 6 átomos formadores de anel. Em algumas modalidades,o grupo heteroaril possui 1 a cerca de 4, Ia cerca de 3,ou 1 a 2 heteroátomos.Como aqui usado, "heterocicloalquil" refere-se aosheterociclos não aromáticos, incluindo grupos alquil,alquenil e alquinil ciclizados, em que um ou mais dosátomos formadores de anel de carbono são substituídos porum heteroátomo, por exemplo, um átomo de O, N, ou S.Exemplos de grupos "heterocicloalquil" incluem morfolino,tiomorfolino, piperazinil, tetrahidrofuranil,tetrahidrotienil, 2,3-diidrobenzofuril, 1,3-benzodioxol,benzo-1,4-dioxano, piperidinil, pirrolidinil,isoxazolidinil, isotiazolidinil, pirazolidinil,oxazolidinil, tiazolidinil, imidazolidinil, e semelhantes.Também estão incluídas na definição de heterocicloalquilporções que possuem um ou mais anéis aromáticos fundidos(ou seja, que possuem uma ligação em comum) ao anelheterocíclico não aromático, por exemplo, derivadosftalimidil, naftalimidil e benzo de heterociclos, porexemplo, grupos indoleno e isoindoleno. Em algumasmodalidades, o grupo heterocicloalquil possui de 1 a cercade 20 átomos de carbono e, em modalidades adicionais, decerca de 3 a cerca de 20 átomos de carbono. Em algumasmodalidades, o grupo heterocicloalquil contém 3 a cerca de14, 3 a cerca de 7, ou 5 a 6 átomos formadores de anel. Emalgumas modalidades, o grupo heterocicloalquil possui 1 acerca de 4, Ia cerca de 3, ou 1 a 2 heteroátomos. Emalgumas modalidades, o grupo heterocicloalquil contém 0 a 3ligações duplas. Em algumas modalidades, o grupoheterocicloalquil contém 0 a 2 ligações duplas ou triplas.

"Heteroarilalqui1" refere-se a um grupo de fórmula -alquil-heteroaril, em que alquil e heteroaril são como aquidefinidos."Acil" refere-se a um grupo de fórmula -C(O)-alquil.Em algumas modalidades, o grupo acil possui de 1 a 10, Ia8, la6, oula4 átomos de carbono.

"Aminoacil" refere-se a um grupo de fórmula -C(O)-alquil-amino, em que alquil é como aqui definido.

"Alquilamino" refere-se a um grupo de fórmula -NH-alquil, em que alquil é como aqui definido.

"Dialquilamino" refere-se ao grupo de fórmulaN(alquil)2, em que alquil é como aqui definido.

"Haloalquil" refere-se a um grupo alquil substituídopor um ou mais halogênios, em que alquil e halogênio sãocomo aqui definidos.

"Alcoxialquil" refere-se a um grupo de fórmulaalquil -alcóxi, em que alquil e alcóxi são como aquidefinidos.

"Carboxialquil" refere-se a um grupo de fórmula -alquil-C00H, em que alquil é como aqui definido.

"Carbamil" refere-se a um grupo de fórmula -C(O)NH2.

"Carbamilalqui1" refere-se a um grupo de fórmula -alquil-C(0)NH2, em que alquil é como aqui definido.

"Guanidinoalquil" refere-se a um grupo de fórmula -alquil-NHC(=NH)NH2, em que alquil é como aqui definido.

"Tiol" refere-se a um grupo de fórmula -SH.

"Alquiltiol" refere-se a um grupo de fórmula -S-alquil, em que alquil é como aqui definido.

"Alquiltioalquil" refere-se a um grupo de fórmula -alquil-S-alquil, em que alquil é como aqui definido.

wImidazolilalqui1" refere-se a um grupo de fórmula -alquil-imidazolil, em que alquil é como aqui definido.

"Piperidilalqui1" refere-se a um grupo de fórmula -alquil-piperidinil, em que alquil é como aqui definido.

"Naftilalquil" significa um grupo de fórmula -alquil-naftil, por exemplo, (8'-naftil)metil, em que naftil temseu significado normal e alquil é como aqui definido.

"Indolilalquil" significa um grupo de fórmula -alquil-indol, por exemplo, 31-indoliletil, e 3'indolilmetil, emque indol tem seu significado normal e alquil é como aquidefinido.

"Heterociclil contendo N" visa a se referir a qualquergrupo heteroaril ou heterocicloalquil contendo pelo menosum átomo de N formador de anel. Exemplos de gruposheterociclil contendo N incluem piridinil, imidazolil,piperidinil, piperazinil, pirrolil, indolil, e semelhantes.

"Heterociclilalquil contendo N" visa a se referir aalquil substituído por heterociclilalquil contendo N.

"Amino" e "amino primário" referem-se a NH2. "Aminosecundário" refere-se a NHR e "amino terciário" refere-se aNR2, em que R é qualquer substituinte adequado.

"Amônio" visa a se referir ao grupo N(R) 3+, em que Rpode ser qualquer porção apropriada, por exemplo, alquil,cicloalquil, aril, cicloalquilalquil, arilalquil etc.

"Aminoácido" refere-se a qualquer um dos vinte a-aminoácidos de ocorrência natural e codificadosgeneticamente ou derivados protegidos destes. Derivadosprotegidos de aminoácidos podem conter um ou mais gruposprotetores na porção amino, porção carbóxi ou porção decadeia lateral.

Exemplos de grupos amino protetores incluem formil,tritil, ftalimido, tricloroacetil, cloroacetil,bromoacetil, iodoacetil e grupos de bloqueio do tipouretano, por exemplo, benziloxicarbonil, 4-fenilbenziloxicarbonil, 2-metilbenziloxicarbonil, 4-metoxibenziloxicarbonil, 4-fluorbenziloxicarbonil, 4-clorobenziloxicarbonil, 3-clorobenziloxicarbonil, 2-clorobenziloxicarbonil, 2,4-diclorobenziloxicarbonil, 4-bromobenziloxicarbonil, 3-bromobenziloxicarbonil, 4-nitrobenziloxicarbonil, 4-cianobenziloxicarbonil, t-butoxicarbonil, 2-(4-xenil)-isopropoxicarbonil, 1,1-difenilet-l-iloxicarbonil, 1,1-difenilprop-l-iloxicarbonil,2 -fenilprop-2 -iloxicarbonil, 2-(p-toluil)-prop-2-iloxicarbonil, ciclopentaniloxi-carbonil, 1-metilciclopentaniloxicarbonil, ciclohexaniloxicarbonil, 1-metilciclohexaniloxicarbonil, 2-metilciclohexaniloxicarbonil, 2-(4-toluilsulfonil)-etoxicarbonil, 2-(metilsulfonil)etoxicarbonil, 2-(trifenilfosfino)-etoxicarbonil, fluorenilmetoxicarbonil("FMOC"), 2-(trimetilsilil)etoxicarbonil, aliloxicarbonil,1(trimetilsililmetil)prop-l-eniloxicarbonil, 5-benzisoxalilmetoxicarbonil, 4-acetoxibenziloxicarbonil,2,2,2 -tricloroetoxicarbonil, 2-etinil-2-propoxicarbonil,ciclopropilmetoxicarbonil, 4-(decicloxi)benziloxicarbonil,isoborniloxicarbonil, 1-piperidiloxicarbonil e semelhantes;grupo benzoilmetilsulfonil, 2-nitrofenilsulfenil, óxido dedifenilfosfino e grupos amino protetores semelhantes.

Exemplos de grupos protetores carbóxi incluem metil,p-nitrobenzil, p-metilbenzil, p-metoxibenzil, 3,4-dimetoxibenzil, 2,4-dimetoxibenzil, 2,4,6-trimetoxibenzil,2,4,6-trimetilbenzil, pentametilbenzil, 3,4-metilenodioxibenzil, benzidril, 4,41-dimetoxibenzidril,2.21.4,41-tetrametoxibenzidril, t-butil, t-amil, tritil, 4-metoxitritil, 4,4'-dimetoxitritil, 4,4',4"-trimetoxitritil,2-fenilprop-2-il, trimetilsilil, t-butildimetilsilil,fenacil, 2,2,2-tricloroetil, .beta.-(di(n-butil)metilsilil)etil, p-toluenossulfoniletil, 4-nitrobenzilsulfoniletil, alil, cinamil, 1-(trimetilsililmetil)prop-l-en-3-il e porções semelhantes.

A espécie do grupo protetor empregado não é crítica,desde que o grupo protetor derivatizado possa ser removidoseletivamente no ponto apropriado, sem romper o restante damolécula. Exemplos adicionais de grupos protetores sãoencontrados em E. Haslam, "Protecting Groups in OrganicChemistry", (J. G. W. McOmie, ed. , 1973), no Capítulo 2; eT. W. Greene e P. G. M. Wuts, "Protective Groups in OrganicSynthesis", (1991), no Capítulo 7, cujas revelações sãoaqui incorporados por referência em suas totalidades.

0 termo "peptóide" é usado de forma geral para sereferir a um mimético de peptídeo que contém pelo menos um,de preferência dois ou mais, substitutos de aminoácidos, depreferência, glicinas N-substituídas. Peptóides sãodescritos, inter alia, na Patente U.S. N0 5.811.387.

"Glicina N-substituída" refere-se a um resíduo dafórmula -(NR-CH2-CO)-, em que cada R é uma porção diferentede hidrogênio, como aquelas selecionadas independentementede (C2-C6) alquil, halo (C1-C6) alquil, (C2-C6) alquenil, (C2-C6)alquinil, (C6-Ci0) cicloalquil-aril, amino (C1-C6) alquil,amônio (Ci-C6) alquil, hidróxi (Ci-C6) alquil, (Ci-C6) alcóxi (C1-C6) alquil, carbóxi, carbóxi (C2-C6) alquil, carbamil,carbamil (C2-C6) alquil, guanidino, guanidino (Ci-C6) alquil,amidino, amidino (Ci-C6) alquil, tiol, (Ci-C6) alquiltiol,alquiltioalquil de 2-10 átomos de carbono, heterociclilcontendo Ν, heterociclil (C1-C6) alquil contendo N,imidazolil, imidazolilalquil de 4-10 átomos de carbono,piperidil, piperidilalquil de 5-10 átomos de carbono,indolil, indolilalquil de 9-15 átomos de carbono, naftil,naftilalquil de 11-16 átomos de carbono e aril(C1-C6)alquil; em que cada porção R é opcionalmente substituídapor 1-3 substituintes selecionados independentemente dehalogênio, hidróxi e (C1-C6) alcóxi.

Em algumas modalidades de -(NR-CH2-CO)-, R é (C2-C6) alquil, halo (C1-C6) alquil, (C2-C6) alquenil, C2-C6) alquinil, (C6-Ci0) cicloalquil-aril, amino (Ci-C6) alquil,hidróxi (C1-C6) alquil, (C1-C6) alcóxi (C1-C6) alquil, carbóxi,carbóxi (C2-C6) alquil, carbamil, carbamil (C2-C6) alquil,guanidino, guanidino (C1-C6) alquil, tiol, (C1-C6) alquiltiol,alquiltioalquil de 2-10 átomos de carbono, imidazolil,imidazolilalquil de 4-10 átomos de carbono, piperidil,piperidilalquil de 5-10 átomos de carbono, indolil,indolilalquil de 9-15 átomos de carbono, naftil,naftilalquil de 11-16 átomos de carbono, difeniKCi-C6) alquil ou aril (C1-C6) alquil; em que cada porção R éopcionalmente substituída por 1-3 substituintesselecionados independentemente de halogênio, hidróxi e (C1-C6) alcóxi.

Em algumas modalidades de -(NR-CH2-CO)-, R é (C2-C6) alquil, amino (C1-C6) alquil, hidróxi (C1-C6) alquil, (C1-C6) alcóxi (C1-C6) alquil, guanidino (C1-C6) alquil,indolilalquil de 9-15 átomos de carbono, naftilalquil de11-16 átomos de carbono, difenil (C1-C6) alquil ou aril(C1-C6)alquil, substituído com 1-3 substituintes selecionadosindependentemente de halogênio, hidróxi ou (C1-C6)alcoxi.Em algumas modalidades de -(NR-CH2-CO)-, R é umaporção que é carregada em pH fisiologicamente relevante.Exemplos de R carregado positivamente em pHfisiologicamente relevante incluem, por exemplo, amino(Ci-C6) alquil, amônio (C1-C6) alquil, guanidino, guanidino(C1-C6) alquil, amidino, amidino (C1-C6) alquil, heterociclilcontendo N, e heterociclil (C1-C6) alquil contendo N, em quecada porção R é opcionalmente substituída por 1-3substituintes selecionados independentemente de halogênio,C1-C3 metóxi e C1-C3 alquil.

Em algumas modalidades de -(NR-CH2-CO)-, R é umaporção que é neutra em pH fisiologicamente relevante.Exemplos de R neutro em pH fisiologicamente relevanteincluem, por exemplo, (C2-C6) alquil, halo (C1-C6) alquil, (C2-C6Jalquenil, (C2-C6) alquinil, (C6-C10) cicloalquil-aril, (C1-C6) alcóxi (C1-C6) alquil, alquiltioalquil de 2-10 átomos decarbono, difenil (C1-C6) alquil e aril (C1-C6) alquil. Exemplosadicionais incluem etil, prop-l-il, prop-2-il, 1-metilprop-1-il, 2-metilprop-l-il, 3-fenilpropi-l-il, 3-metilbutil,benzil, 4-cloro-benzil, 4-metóxi-benzil, 4-metil-benzil, 2-metiltioet-l-il e 2,2-difeniletil.

Em algumas modalidades de -(NR-CH2-CO)-, R é amino(Ci-C6)alquil (por exemplo, aminobutil).

Exemplos adicionais de glicinas N-substituídas incluemaquelas nas quais R é etil, prop-l-il, prop-2-il, 1-metilprop-l-il, 2-metilprop-l-il, 3-fenilpropi-l-il, 3-metilbutil, benzil, 4-hidroxibenzil,4-cloro-benzil, 4-metóxi-benzil, 4-metil-benzil, 2-hidroxietil, mercaptoetil,

2-aminoetil, ácido 3-propiônico, 3-aminopropil, 4-aminobutil, 2metiltioet-l-il, carboximetil, 2-carboxietil,carbamilmetil, 2-carbamiletil, 3-guanidinoprop-l-il;imidazolilmetil, 2,2-difeniletil ou indol-3-il-etil.

Também estão incluídos sais, ésteres e formasprotegidas (por exemplo, N protegido com Fmoc ou Boc etc.)das glicinas N-substituídas.

Métodos para a produção de substitutos de aminoácidos,incluindo glicinas N-substituídas, são revelados, interalia, na Patente U.S. N0 5.811.387, que é aqui incorporadapor referência em sua totalidade.

"Monômero" ou "subunidade" refere-se a uma moléculaque pode ser ligada a outros monômeros para formar umacadeia, por exemplo, um peptídeo. Aminoácidos e glicinas N-substituídas são exemplos de monômeros. Quando ligado aoutros monômeros, um monômero pode ser denominado um"resíduo".

O termo "reagente de peptóide", como aqui usado,refere-se a um polímero semelhante a um peptídeo no qual umou mais resíduos compreendem uma glicina N-substituída,como aqui descrito com mais detalhe, e que interagepreferivelmente com a forma patogênica de uma proteína dedoença conformacional, particularmente com uma proteína depríon patogênico. A ligação de cada uma das glicinas N-substituídas em uma cadeia linear ou ramificadaopcionalmente junto com aminoácidos e/ou outros substitutosde aminoácidos pode produzir "reagentes peptóides", comoaqui descritos. As ligações tipicamente constituem ligaçõespeptídicas (ou seja, amidas).

"Peptídeo" refere-se e um composto amida quecompreende pelo menos dois aminoácidos unidos por umaligação peptídica, ou seja, pela ligação do grupo amino deum aminoácido ao grupo carboxil de outro aminoácido.Peptídeo é aqui usado de forma intercambiável com"oligopeptídeo" ou "polipeptídeo", e não há implicação deum polímero de tamanho específico pelo uso desses termos.Comprimentos não limitantes de peptídeos adequados para usona presente invenção incluem peptídeos de 3 a 5 resíduos decomprimento, 6 a 10 resíduos de comprimento (ou qualquernúmero inteiro entre eles), 11 a 20 resíduos de comprimento(ou qualquer número inteiro entre eles), 21 a 75 resíduosde comprimento (ou qualquer número inteiro entre eles), 75a 100 (ou qualquer número inteiro entre eles) , oupolipeptídeos com mais de 100 resíduos de comprimento.Tipicamente, peptídeos úteis nesta invenção podem ter umcomprimento máximo adequado para a aplicação desejada. 0peptídeo pode ter entre cerca de 2 e cerca de 100, cerca de2 e cerca de 50, cerca de 2 e cerca de 20, cerca de 2 ecerca de 10, cerca de 2 e cerca de 8, ou de cerca de 2 ecerca de 5 resíduos de comprimento.

A "semelhança" entre um aminoácido em um peptídeo eseu substituto de aminoácidos não precisa ser exata. Porexemplo, pode-se substituir lisina com um resíduo deglicina N-substituída (por exemplo, -(NR-CH2-CO)-), em queR é um grupo aminoalquil, por exemplo, aminometil, 2-aminoetil, 3-aminopropil, 4-aminobutil, 5-aminopentil ou 6-aminohexil. Serina pode ser substituída com, por exemplo,grupos hidroxialquil, por exemplo, hidroximetil, 2-hidroxietil, 3-hidroxipropil, 2-hidroxipropil, esemelhantes. Em geral, como uma abordagem inicial, umaminoácido convencional pode ser substituído com um análogode glicina N-substituída que possui uma cadeia lateral decaráter similar, por exemplo, hidrofóbica, hidrofxlica,polar, apoiar, aromática etc. Testes adicionais eotimização do peptídeo com aminoácido substituído podem serfeitos pelos métodos aqui revelados.

Uma "porção conjugada" é uma molécula anexadacovalentemente ao reagente peptóide. Exemplos de porçõesconjugadas incluem moléculas efetoras, substratos,marcadores, agentes de reticulação, agentes de ligação,matriz polimérica, agente antigênico, molécula espaçadora,e semelhantes. A adesão de grupos conjugados aos peptídeose análogos destes é bem documentada na técnicaestabelecida. A porção conjugada pode ser anexadadiretamente ao reagente peptóide ou através de uma porçãode ligação. Em algumas dessas modalidades, a porçãoconjugada é anexada ao reagente peptóide na região terminalamino ou na região terminal carbóxi. Em modalidadesadicionais, a porção conjugada é anexada em uma subunidadeterminal, por exemplo, uma subunidade amino terminal ou umasubunidade carbóxi terminal. Em algumas dessas modalidades,a porção conjugada é um agente de reticulação ou um agentede ligação. Em algumas modalidades, a porção conjugadacompreende biotina ou um grupo mercapto. Em algumasmodalidades, a porção conjugada compreende um marcadordetectável. Em algumas modalidades, o reagente peptóidecompreende dois ou mais conjugados.

Os termos "marcador", "marcado", "marcador detectável"e "marcado de forma detectável" referem-se a uma moléculacapaz de detecção, incluindo, sem limitação, isótoposradioativos, substâncias fluorescentes, luminóforos,quimioluminóforos, enzimas, substratos, co-fatoresenzimáticos, inibidores enzimáticos, cromóforos, corantes,íons de metal, sóis de metal, ligantes (por exemplo,biotina ou haptenos), nanoparticulas fluorescentes,nanopartículas de ouro, e semelhantes. O termo "substânciafluorescente" refere-se a uma substância ou uma porçãodesta que é capaz de exibir f luorescência da faixadetectável como, por exemplo, um fluoróforo. Exemplosespecíficos de marcadores que podem ser usados com ainvenção incluem, sem limitação, fluoresceína, rodamina,dansil, umbeliferona, vermelho Texas, luminol, ésteres deacridínio, NADPH, beta-galactosidase, peroxidase de raiz-forte, glicose oxidase, fosfatase alcalina e urease. Omarcador também pode ser um tag (marcador) de epitopo (porexemplo, um tag His-His), um anticorpo ou umoligonucleotídeo amplificável ou de algum outro mododetectável.

O termo "composto efetor" inclui qualquer composto quese ligue a um sítio de receptor biológico e efetue umevento bioquímico após essa ligação. Dessa forma, compostoefetor inclui fármaco farmacêutico, bem como inseticidas,mas não se limita a esses.

0 termo "agente de reticulação" refere-se às porçõesque possuem funcionalidades capazes de formar ligaçõescovalentes com outras moléculas ou matrizes poliméricas.Exemplos de agentes de reticulação incluem aqueles quepossuem um ou mais mercapto, hidroxil, amino, carboxilterminal, e funcionalidades similares. Em algumasmodalidades, o agente de reticulação tem pelo menos umafuncionalidade mercapto.

O termo "agente de ligação" refere-se a uma porção queé capaz de se ligar, através de interações não covalentes,com outra molécula ou substância, por exemplo, uma matrizpolimérica. Um exemplo de agente de ligação é biotina ouderivado desta.

Uma "porção ligante", "porção de ligação" ou "ligante"refere-se a uma porção que une a porção conjugada aoreagente peptóide. Em algumas modalidades, a porção liganteé um grupo que possui pelo menos uma região de ligação coma fórmula -(NH(CH2)mC(O))p-, em que mélal0epéla5.Em algumas modalidades, a porção ligante compreende pelomenos um resíduo de ácido aminohexanóico (Ahx) ou fragmentodeste. Essas porções podem ainda aumentar a interação doreagente peptóide com as proteínas de príon e/ou aumentarainda mais detecção de proteínas de príon.

Reagentes peptóides

A presente invenção fornece reagentes peptóides queinteragem com proteínas de doença conformacional, porexemplo, proteínas de príon, complexos, composições e kitscontendo os reagentes peptóides e métodos para suautilização para a detecção e o isolamento de proteínas dedoença conformacional, por exemplo, PrPsc. Os reagentespeptóides da invenção podem ser utilizados no tratamento ena prevenção de doenças conformacionais de proteína, porexemplo, doenças de príon, por exemplo, TSEs, bem como emum método para o fornecimento de um produto sangüíneo oualimentício que é substancialmente livre de príonpatogênico.

A invenção fornece um reagente peptóide que interagepreferivelmente com uma forma patogênica de uma proteína dedoença conformacional comparada com uma forma nãopatogênica da proteína de doença conformacional que possuiuma fórmula de:Xa- (Q)n-Xbem que:

cada Q é independentemente um aminoácido ou umaglicina N-substituída e -(Q)n- define uma região peptóide;

Xa é H, (Ci-C6) alquil, cicloalquil, aril, aralquil,heteroaril, heteroarilalquil, heterocicloalquil, (Ci-C6) acil, amino (Ci-6) acil, um aminoácido, um grupo protetoramino ou um polipeptídeo de 2 a cerca de 100 aminoácidos,em que Xa é opcionalmente substituído por uma porçãoconjugada que é opcionalmente anexada através de uma porçãoligante;

Xb é H, (Ci-C6)alquil, aril, aralquil, heteroaril,heteroarilalquil, heterocicloalquil, amino, alquilamino,dialquilamino, hidroxil, (Ci-C6)alcóxi, arilóxi, aralcóxi,um grupo protetor carbóxi, um aminoácido ou um polipeptídeode 2 a cerca de 100 aminoácidos, em que Xb é opcionalmentesubstituído por uma porção conjugada que é opcionalmenteanexada através de uma porção ligante; e

η é 3 a cerca de 3 0 (ou seja, né3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29 ou 30, ou mais);

em que pelo menos cerca de 50% da região peptóide -(Q) n- compreende glicinas N-substituídas.

Em algumas modalidades, cada Q é independentemente umaglicina N-substituída.

Em algumas modalidades, o reagente peptóide possui umafórmula de Xa-(Q)n-Xb, em que η é de cerca de 4 a cerca de30, de preferência, cerca de 5 a cerca de 30, e em que pelomenos cerca de 50% da região peptóide -(Q)n- compreendeglicinas N-substituídas, desde que a região peptóide -(Q)n-compreenda pelo menos uma sub-região selecionadaindependentemente de:

(a) -AABA-;

(b) -AABAB-

(C) -ABACC-;

(d) -AAAAA-;

(e) -ABCBA-;

(f) -AABCA-; ou

(g) -ABABA-;

em que A, B e C são, cada um, glicinas N-substituídasdiferentes.

Em algumas modalidades, Xa é (Ci-C6) acil ou amino(Ci-6)acil, cada um opcionalmente substituído por uma porçãoconjugada que é opcionalmente anexada através de uma porçãoligante.

Em algumas modalidades, Xa é (Ci-C6) acil ou amino(Ci-C6)acil, cada um opcionalmente substituído por uma porçãoconjugada selecionada de um reagente de reticulação ou deligação, cada uma opcionalmente anexada através de umaporção ligante.

Em algumas modalidades, Xa é (Ci-C6) acil ou amino (C1-6)acil, cada um opcionalmente substituído por uma porçãoconjugada selecionada de biotina ou mercapto, em que aporção conjugada é opcionalmente anexada através de umaporção ligante.

Em algumas modalidades, Xb é um aminoácido substituídoopcionalmente por uma porção conjugada que é opcionalmenteanexada através de uma porção ligante.Em algumas modalidades, Xb é amino, alquilamino,dialquilamino.

Em algumas modalidades, Xb é amino.

Em algumas modalidades, η é de cerca de 5 a cerca de15; 5 a cerca de 10; ou 6.

Em algumas modalidades, né4al0, 4a8, 5 a 7 ou 6.

Em algumas modalidades, Xb é um aminoácido substituídoopcionalmente por uma porção conjugada e η é 6.

Em algumas modalidades, a porção ligante contém umaregião que possui a fórmula - {NH (CH2) mC (O) }p.

Em algumas modalidades, m é 1 a 10.

Em algumas modalidades, m é 1 a 8.

Em algumas modalidades, m é 5.

Em algumas modalidades, ρ é 1 a 5.

Em algumas modalidades, pé 1 a 3.

Em algumas modalidades, pé 1 ou 2.

Em algumas modalidades, Xb é um aminoácido substituídoopcionalmente por uma porção conjugada que é opcionalmenteanexada através de uma porção ligante, e η é 6.

Em algumas modalidades, Xb é amino, alquilamino oudialquilamino; Xa é H, (C1-C6) alquil, (C1-C6) acil, amino (C1-6)acil, um aminoácido ou um grupo protetor amino, em que Xaé opcionalmente substituído por uma porção conjugada que éopcionalmente anexada através de uma porção ligante; e η é6.

Em algumas modalidades, Xb é amino, alquilamino oudialquilamino; Xa é H, (C1-C6) alquil, (C1-C6) acil, amino (C1-ε) acil, um aminoácido ou um grupo protetor amino, em que Xaé substituído por uma porção conjugada selecionada de umagente de reticulação ou um agente de ligação, em que aporção conjugada é opcionalmente anexada através de umaporção ligante; e η é 6.

Em algumas modalidades, Xb é amino, alquilamino oudialquilamino; Xb é H, (C1-C6) alquil, (C1-C6) acil, amino (C1-6)acil, um aminoácido ou um grupo protetor amino, em que Xaé substituído por uma porção conjugada que compreendebiotina ou mercapto, em que a porção conjugada éopcionalmente anexada através de uma porção ligante em quepelo menos uma porção da porção ligante tem a fórmula -(NH(CH2)mC(O) }p; η é 6; m é 1 a 10; e ρ é 1 a 5.

Em algumas modalidades, cada Q é independentemente umaminoácido ou uma glicina N-substituída que possui afórmula -(NR-CH2-CO)-, em que cada R é selecionadoindependentemente de (C2-C6) alquil, halo (C1-C6) alquil, (C2-C6)alquenil, (C2-C6) alquinil, (C6-C10) cicloalquil-aril,amino (C1-C6) alquil, amônio (C1-C6) alquil, hidróxi(C1-C6) alquil, (C1-C6) alcóxi (C1-C6) alquil, carbóxi, carbóxi (C2-C6Jalquil, carbamil, carbamil (C2-C6) alquil, guanidino,guanidino (C1-C6) alquil, amidino, amidino (C1-C6) alquil, tiol,(C1-C6Jalquiltiol, alquiltioalquil de 2-10 átomos decarbono, heterociclil contendo N, heterociclil (C1-C6) alquilcontendo N, imidazolil, imidazolilalquil de 4-10 átomos decarbono, piperidil, piperidilalquil de 5-10 átomos decarbono, indolil, indolilalquil de 9-15 átomos de carbono,naftil, naftilalquil de 11-16 átomos de carbono e arilíCi-C6)alquil; em que cada porção R é opcionalmente substituídapor 1-3 substituintes selecionados independentemente dehalogênio, hidróxi e (C1-C6Jalcoxi.

Em algumas modalidades, cada Q é independentemente umaminoácido ou uma glicina N-substituída que possui afórmula -(NR-CH2-CO)-, em que cada R é selecionadoindependentemente de (C2-C6) alquil, halo (C1-C6) alquil, (C2-C6) alquenil, (C2-C6Jalquinilf (C6-C10) cicloalquil-aril,amino (Ci-C6) alquil, hidróxi (C1-C6) alquil, (C1-C6) alcóxi (C1-C6) alquil, carbóxi, carbóxi (C2-C6) alquil, carbamil,carbamil (C2-C6) alquil, guanidino, guanidino (C1-C6) alquil,tiol, (C1-C6) alquiltiol, alquiltioalquil de 2-10 átomos decarbono, imidazolil, imidazolilalquil de 4-10 átomos decarbono, piperidil, piperidilalquil de 5-10 átomos decarbono, indolil, indolilalquil de 9-15 átomos de carbono,naftil, naftilalquil de 11-16 átomos de carbono,difenil (C1-C6) alquil ou aril (C1-C6) alquil; em que cadaporção R é opcionalmente substituído por 1-3 substituintesselecionados independentemente de halogênio, hidróxi e (C1-C6) alcóxi.

Em algumas modalidades, cada Q é independentemente umaminoácido ou uma glicina N-substituída da fórmula - (NR-CH2-CO)-, em que cada R é selecionado independentemente de(C2-C6) alquil, amino (C1-C6) alquil, hidróxi (C1-C6) alquil, (C1-C6) alcóxi (C1-C6) alquil guanidino (C1-C6) alquil, indolilalquilde 9-15 átomos de carbono, naftilalquil de 11-16 átomos decarbono, difenil (C1-C6) alquil ou aril (C1-C6) alquil,substituído com 1-3 substituintes selecionadosindependentemente de halogênio, hidróxi ou (C1-C6Jalcoxi.

Em algumas modalidades, cada Q é independentemente umaminoácido ou é uma glicina N-substituída selecionada de N-(4-aminobutil)glicina, N-(1-feniletil)glicina, N-(2-aminoetil)glicina, N-(2-[4-metoxifenil]etil)glicina, N-(2-metoxietil)glicina, N-(2-hidroxietil)glicina, N-((lH-indol-3-il)metil)glicina ou N-benzilglicina.Em algumas modalidades, cada Q é independentemente umaminoácido ou é uma glicina N-substituída selecionada de N-(4-aminobutil)glicina ou N-benzilglicina.

Em algumas modalidades, cada Q é independentemente umaglicina N-substituída.

Em algumas modalidades, a região peptóide -(Q)n-compreende pelo menos 3 ou pelo menos 4 glicinas N-substituídas que estão carregadas em pH fisiologicamenterelevante. Em algumas modalidades, a carga é positiva. Emalgumas modalidades, as glicinas N-substituídas da regiãopeptóide restantes são neutras em pH fisiologicamenterelevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide -(Q)n-compreende 2a6, 3a5, ou 4 glicinas N-substituídas queestão carregadas em pH fisiologicamente relevante. Emalgumas modalidades, a carga é positiva. Em algumasmodalidades, as glicinas N-substituídas da região peptóiderestantes são neutras em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, dois resíduos de glicina N-substituída da região peptóide -(Q)n- estão carregadospositivamente em pH fisiologicamente relevante, e osresíduos de glicina N-substituída da região peptóiderestantes são neutros em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, três resíduos de glicina N-substituída da região peptóide -(Q)n- estão carregadospositivamente em pH fisiologicamente relevante, e osresíduos de glicina N-substituída da região peptóiderestantes são neutros em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, quatro resíduos de glicina N-substituída da região peptóide -(Q)n- estão carregadospositivamente em pH fisiologicamente relevante, e osresíduos de glicina N-substituída da região peptóiderestantes são neutros em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, cinco resíduos de glicina N-substituída da região peptóide -(Q)n- estão carregadospositivamente em pH fisiologicamente relevante, e osresíduos de glicina N-substituída da região peptóiderestantes são neutros em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide -(Q)n- époliônica em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide -(Q)n- épolicatiônica em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide -(Q)n- épolianiônica em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide -(Q)n- temuma carga final de pelo menos 3+ em pH fisiologicamenterelevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide -(Q)n- temuma carga final de pelo menos 4+ em pH fisiologicamenterelevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide -(Q)n- temuma carga final de 2+ a 6+ em pH f isiologicamenterelevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide -(Q)n- temuma carga final de 3+ a 5+ em pH f isiologicamenterelevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide -(Q)n- temuma carga final de 4+ em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide -(Q)n-compreende pelo menos 3 glicinas N-substituídas que estãocarregadas positivamente em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades a região peptóide -(Q)n-compreende pelo menos 4 glicinas N-substituídas que estãocarregadas positivamente em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide -(Q)n-compreende de 2 a 6 glicinas N-substituídas que estãocarregadas positivamente em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide -(Q)n-compreende de 3 a 5 glicinas N-substituídas que estãocarregadas positivamente em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide -(Q)n-compreende 4 glicinas N-substituídas que estão carregadaspositivamente em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, as glicinas N-substituídas daregião peptóide -(Q)n- possuem a fórmula -(NR-CH2-CO)-, emque R é selecionado independentemente de (C2-C6) alquil,halo (Ci-C6) alquil, (C2-C6) alquenil, (C2-C6) alquinil, (C6-Cio) cicloalquil-aril, amino (Ci-C6) alquil, amônio(Ci-

C6) alquil, hidróxi (Ci-C6) alquil, (C1-C6) alcóxi (Ci-C6) alquil,carbóxi, carbóxi (C2-C6) alquil, carbamil, carbamil(C2-C6) alquil, guanidino, guanidino (C1-C6) alquil, amidino,amidino (C1-C6) alquil, tiol, (C1-C6Jalquiltiol,alquiltioalquil de 2-10 átomos de carbono, heterociclilcontendo N, heterociclil (C1-C6) alquil contendo N,imidazolil, imidazolilalquil de 4-10 átomos de carbono,piperidil, piperidilalquil de 5-10 átomos de carbono,indolil, indolilalquil de 9-15 átomos de carbono, naftil,naftilalquil de 11-16 átomos de carbono e arilíCi-C6)alquil; em que cada porção R é opcionalmente substituídapor 1-3 substituintes selecionados independentemente dehalogênio, hidróxi e (Ci-C6)alcóxi, e a região peptóide -(Q) n~ compreende pelo menos 3, pelo menos 4, 2 a 6, 3 a 5,ou 4 glicinas N-substituídas, em que R é uma porção quepossui carga em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, todas as glicinas N-substituídas da região peptóide são contíguas.

Em algumas modalidades, o reagente peptóide compreendepelo menos uma porção conjugada.

Em algumas modalidades, o reagente peptóide compreendepelo menos uma porção conjugada anexada através de umaporção ligante.

A invenção ainda fornece um reagente peptóide queinterage preferivelmente com uma forma patogênica de umaproteína de doença conformacional comparada com uma formanão patogênica da proteína de doença conformacional em queo reagente peptóide compreende uma região terminal amino,uma região terminal carbóxi e pelo menos uma regiãopeptóide entre a região terminal amino e a região terminalcarbóxi, em que a região peptóide compreende cerca de 3 acerca de 3 0 glicinas N-substituídas e, opcionalmente, um oumais aminoácidos. Em algumas modalidades, a região peptóidecompreende cerca de 4 a cerca de 3 0 ou de cerca de 5 acerca de 30 glicinas N-substituídas. Em algumas dessasmodalidades, a região peptóide compreende cerca de 4 acerca de 30, ou de cerca de 5 a cerca de 3 0 glicinas N-substituídas e uma sub-região peptóide selecionada de:

(a) -AABA-;

(b) -AABAB-;

(C) -ABACC-;

(d) -AAAAA-;(e) -ABCBA-;

(f) -AABCA-; ou

(g) -ABABA-;

em que A, B e C são, cada um, glicinas N-substituídasdiferentes, e cada seqüência da sub-região é lida daesquerda para a direita na direção terminal amino paraterminal carbóxi.

Em algumas modalidades, a região peptóide compreendecerca de 50 a cerca de 100%, cerca de 75 a cerca de 100%,ou 100% de glicinas N-substituídas.

Em algumas modalidades, a região peptóide temcomprimento de cerca de 5 a cerca de 50, cerca de 5 a cercade 30, cerca de 5 a cerca de 15, cerca de 5 a cerca de 7,ou 6 subunidades.

Em algumas modalidades, o reagente peptóide possui umcomprimento total de cerca de 5 a cerca de 50, cerca de 5 acerca de 30, cerca de 5 a cerca de 15, ou de cerca de 6 acerca de 9 subunidades.

Em algumas modalidades, pelo menos uma região peptóideé maior do que cerca de 50%, maior do que cerca de 75%, oumaior do que cerca de 90% do comprimento total do reagentepeptóide.

Em algumas modalidades, todas as glicinas N-substituídas são contíguas na região peptóide.

Em algumas modalidades, as glicinas N-substituídas daregião peptóide possuem a fórmula -(NR-CH2-CO)-, em que R écomo aqui definido.

Em algumas modalidades, a região peptóide é poliônicaem pH fisiologicamente relevante e possui característicasde acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritasao longo deste pedido para regiões peptóides com carga.

A presente invenção ainda fornece um reagente peptóideque interage preferivelmente com uma forma patogênica deuma proteína de doença conformacional comparada com umaforma não patogênica da proteína de doença conformacional,em que o reagente compreende uma região peptóide queconsiste em 3 a 15 glicinas N-substituídas contíguas, e emque a região peptóide possui uma carga final em pHfisiologicamente relevante. Em algumas modalidades, a cargafinal é uma carga final positiva como, por exemplo, umacarga final de pelo menos 3+ ou pelo menos 4+ em pHfisiologicamente relevante. Em algumas modalidades, opróprio reagente peptóide tem uma carga final de 2+ a 6+,3+ a 5+, ou 4+ em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, pelo menos duas, pelo menos 3,ou pelo menos 4 das glicinas N-substituídas contíguas daregião peptóide estão carregadas em pH fisiologicamenterelevante. Em modalidades adicionais, pelo menos duas dasglicinas N-substituídas contíguas da região peptóidecompreendem pelo menos uma porção selecionada de aminoprimário, amino secundário, amino terciário, amônio (aminoquaternário), guanidino, amidino ou heterociclil contendo N.

Ainda em modalidades adicionais, pelo menos duas dasglicinas N-substituídas contíguas da região peptóidecompreendem pelo menos um N-substituinte selecionado deamino primário, amino secundário, amônio, guanidino,amidino, ou heterociclil contendo N.

Ainda em modalidades adicionais, pelo menos duas dasqlicinas N-substituídas contíguas compreendem um N-substituinte que é um grupo R de acordo com as definiçõesaqui fornecidas.

Ainda em modalidades adicionais, o reagente peptóidecompreende uma região peptóide de 6 glicinas N-substituídascontíguas, e o próprio reagente peptóide tem uma cargafinal de 3+ ou 4+ em pH fisiologicamente relevante.

A invenção também fornece métodos para a produção dosreagentes peptóides e para utilização dos reagentespeptóides para a detecção de proteínas de príon patogênico,métodos para o isolamento de proteínas de príon patogênicocom o uso dos reagentes peptóides, métodos para aeliminação ou redução de proteínas de príon patogênico deamostras, e kits contendo componentes para a realização dosvários métodos.

Um "reagente peptóide" refere-se a uma moléculapeptóide que possui uma região terminal amino, uma regiãoterminal carbóxi e pelo menos uma "região peptóide" entre aregião terminal amino e a região terminal carbóxi. A regiãoterminal amino refere-se a uma região no lado do terminalamino do reagente que tipicamente não contém nenhumaglicina N-substituída. A região terminal amino pode ser H,alquil, alquil substituído, acil, um grupo protetor amino,um aminoácido, um peptídeo, ou semelhantes. Em algumasmodalidades, a região terminal amino corresponde a Xa. Aregião terminal carbóxi refere-se a uma região naextremidade do terminal carbóxi do peptóide que não contémnenhuma glicina N-substituída. A região terminal carbóxipode incluir H, alquil, alcóxi, amino, alquilamino,dialquilamino, um grupo protetor carbóxi, um aminoácido, umpeptídeo, ou semelhantes. Em algumas modalidades, a regiãoterminal carbóxi corresponde a Xb. Em algumas modalidades,o reagente peptóide possui um comprimento total de cerca de5 a cerca de 50 subunidades; cerca de 5 a cerca de 30subunidades; cerca de 5 a cerca de 15 subunidades; ou decerca de 6 a cerca de 9 subunidades. Em algumasmodalidades, o reagente peptóide é uma amida do terminalcarbóxi. A região peptóide geralmente refere-se a umaporção do reagente peptóide em que pelo menos três dosaminoácidos nele presentes são substituídos por glicinas Ν-substituídas.

A "região peptóide" (também aqui designada "-(Q)n-")pode ser identificada como a região que começa com e queinclui a glicina N-substituída mais próxima do terminalamino, e que termina com e que inclui a glicina N-substituída mais próxima do terminal carbóxi. Em algumasmodalidades, a região peptóide compreende pelo menos cercade 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%,pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelomenos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% deglicinas N-substituídas. Em algumas modalidades, a regiãopeptóide compreende cerca de 25 ,a cerca de 100%; cerca de50 a cerca de 100%; cerca de 75 a cerca de 100% de glicinasN-substituídas. Em algumas modalidades, a região peptóidecompreende 100% de glicinas N-substituídas. Em algumasmodalidades, a região peptóide é maior do que cerca de 50%(por exemplo, cerca de 50-100%) do comprimento total doreagente peptóide. Em algumas modalidades, a regiãopeptóide é maior do que cerca de 60% (por exemplo, cerca de60-100%) do comprimento total do reagente peptóide. Emalgumas modalidades, a região peptóide é maior do que cercade 75% (por exemplo, cerca de 75-100%) do comprimento totaldo reagente peptóide. Em algumas modalidades, a regiãopeptóide é maior do que cerca de 90% (por exemplo, cerca de90-100%) do comprimento total do reagente peptóide. Emalgumas modalidades, a região peptóide é 100% docomprimento total do reagente peptóide.

Em algumas modalidades, a região peptóide compreendepelo menos 3 glicinas N-substituídas. Em algumasmodalidades, a região peptóide compreende pelo menos 4glicinas N-substituídas. Em algumas modalidades, a regiãopeptóide compreende pelo menos 5 glicinas N-substituídas.

Em algumas modalidades, a região peptóide compreende pelomenos 6 glicinas N-substituídas. Em algumas modalidades, aregião peptóide compreende 3 a cerca de 30; cerca de 5 acerca de 3 0 glicinas N-substituídas; e opcionalmente um oumais aminoácidos. Em algumas modalidades, a região peptóidetem comprimento de cerca de 5 a cerca de 50, 5 a cerca de30, 5 a cerca de 15, 5 a cerca de 10, 5 a cerca de 9, 5 acerca de 8, ou 5 a cerca de 7 subunidades. Em algumasmodalidades, a região peptóide tem comprimento de cerca de3; 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 subunidades. Em algumasmodalidades, a região peptóide tem comprimento de 6subunidades. Em algumas modalidades, todas as glicinas N-substituídas na região peptóide são contíguas. Em algumasmodalidades, todas as subunidades da região peptóide sãoglicinas N-substituídas.

Em modalidades adicionais, o reagente peptóidecompreende uma região peptóide de 4 a 12, 4 a 10, 4 a 9, 4,a 8, 5 a 7, ou 6 glicinas N-substituídas contíguas.

De acordo com algumas modalidades, a região peptóidepode ser poliônica em pH fisiologicamente relevante. 0termo "poliônica" significa que a região peptóidecompreende dois ou mais resíduos que são carregados em pHfisiologicamente relevante. Em algumas modalidades, aregião peptóide é policatiônica ou polianiônica em pHfisiologicamente relevante. Em modalidades adicionais, aregião peptóide tem uma carga final de pelo menos 3+ oupelo menos 4+ em pH fisiologicamente relevante. Ainda emmodalidades adicionais, a região peptóide tem uma cargafinal de 2+ a 6 + , 3+ a 5 + , ou 4+ em pH fisiologicamenterelevante.

Exemplos não limitantes de resíduos de glicina N-substituída que são carregados incluem N-(5-aminopentil)glicina, N-(4-aminobutil)glicina, N-(3-aminopropil)glicina, N-(2aminoetil)glicina, N-(5-guanidinopentil)glicina, N-(4-guanidinobutil)glicina, N-(3-guanidinopropil)glicina, e N-(2-guanidinoetil)glicina.

Em algumas modalidades, a região peptóide compreendepelo menos 3 ou pelo menos 4 glicinas N-substituídas queestão carregadas positivamente em pH fisiologicamenterelevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide compreendede 2 a 6, 3a5, ou 4 amino glicinas N-substituídas queestão carregadas positivamente em pH fisiologicamenterelevante.

Em algumas modalidades, a região peptóide compreenderesíduos que possuem a fórmula -(NR-CH2-CO)-, em que pelomenos 3, pelo menos 4, 2a6, 3a5, ou 4 dos resíduosestão carregados em pH fisiologicamente relevante.

Em algumas modalidades, os resíduos carregados daregião peptóide possuem a fórmula - (NR-CH2-CO)-, em que Ré selecionado independentemente de amino (Ci-C6) alquil,amônio (Ci-C6) alquil, guanidino, guanidino (Ci-C6) alquil,amidino, amidino (Ci-C6) alquil, heterociclil contendo N eheterociclil (Ci-C6) alquil contendo N, em que cada porção Ré opcionalmente substituída por 1-3 substituintesselecionados independentemente de halogênio, Ci-C3 metóxi eCi-C3 alquil. Em algumas modalidades, R é amino(Ci-C6)alquilcomo, por exemplo, aminobutil.

Em algumas modalidades, o reagente peptóide tem umacarga final de pelo menos 3+ ou pelo menos 4+ em pHfisiologicamente relevante. Ainda em modalidadesadicionais, o reagente peptóide tem uma carga final de 2+ a6+, 3+ a 5+, ou 4+ em pH fisiologicamente relevante.

A região peptóide do reagente peptóide compreende pelomenos uma sub-região peptóide, que se refere a umaseqüência de glicinas N-substituídas contíguas de 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 OU mais resíduos. Em algumasmodalidades, a região peptóide compreende pelo menos umasub-região peptóide selecionada independentemente de:

(a) -AABA-;(b) -AABAB-(C) -ABACC- ;(d) -AAAAA-;(e) -ABCBA-(f) -AABCA-(g) ABABA-.

Cada A, B e C representa glicinas N-substituídasdiferentes. Por exemplo, cada A que ocorre na sub-regiãorefere-se a uma glicina N-substituída em particular, e cadaB que ocorre na sub-região refere-se a outra glicina N-substituída em particular, mas AeB são diferentes uns dosoutros. Conseqüentemente, C é uma glicina N-substituída queé diferente de A ou B. A seqüência da sub-região deve ser lida da esquerda para a direita na direção amino paracarbóxi. Em algumas modalidades, quando A for um resíduohidrofóbico, B será um resíduo hidrofílico, e vice-versa.Em algumas modalidades, a sub-região peptóide é homogênea,ou seja, compreende apenas um tipo de glicina Ν-substituída. Em algumas modalidades, quando A for umresíduo alifático, B será um resíduo cíclico. Em algumasmodalidades, quando B for um resíduo alifático, A será umresíduo cíclico. Em algumas modalidades, tanto A quanto Bsão alifáticos. Em algumas modalidades, AeB sãoalifáticos e C é cíclico. Em algumas modalidades, todas asglicinas N-substituídas são alifáticas, por exemplo, para asub-região -AABA-, por exemplo, -(N-(2-metoxietil)glicina) 2-N-(4-aminobutil)glicina-(N-(2-metoxietil)glicina)-, em que A é N-(2-metoxietil)glicina eB é N-(4-aminobutil)glicina.

Em algumas modalidades, a região peptóide compreende atripeptóide, ou seja, três glicinas N-substituídascontíguas. Exemplo de sub-regiões tripeptóides de peptóideincluem -(N-(2-(4-hidroxifenil)etil)glicina) 2-N- (4-guanidinobutil)glicina-, N-(4-aminobutil)glicina (V) 2-, emque V é N-benzilglicina ou N-(2-metoxietil)glicina, -N-benzilglicina-W-N-benzilglicina-, em que W é N-(4-aminobutil)glicina ou N-(2-metoxietil)glicina, e -N-(4-aminoetil)glicina-(N-(2-(4-metoxifenil)etil)glicina) 2- . Emalgumas modalidades, a sub-região tripeptóide compreendepelo menos um resíduo alifático e um resíduo cíclico, porexemplo, (A)2-B, B2-A, ou B-A-B, em que A é um resíduoalifático e B é um resíduo cíclico.

Em algumas modalidades, a sub-região peptóide é umdipeptóide como, por exemplo, um dipeptóide N-(4-aminobutil)glicina-(S)-N-(1-feniletil)glicina.

Em algumas modalidades, o reagente peptóide compreendeuma seqüência selecionada dos ID. DE SEQ. N°: 229, 230,231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240 OU 241,que serão mostrados posteriormente. Em algumas modalidades,o reagente peptóide compreende uma seqüência selecionadados ID. DE SEQ. N°: 229, 230, 232, 233, 234, 235, 237, 238,239 ou 240. Em algumas modalidades, o reagente peptóidecompreende uma seqüência selecionada dos ID. DE SEQ. N° :229, 230, 235, 237, 238, 239 ou 240. Em algumasmodalidades, o reagente peptóide compreende uma seqüênciaselecionada dos ID. DE SEQ. N°: 230, 237, 238, 239 ou 240.Em algumas modalidades a invenção compreende reagentepeptóide I, II, VII, IX, X, XIa, XIb, XIIa ou XIIb. Emalgumas modalidades a invenção compreende reagente peptóideII, IX, X, XIa, XIb, XIIa ou XIIb.

Reagentes peptóides da invenção podem ser projetadosconceitualmente por substituição de aminoácidos de umfragmento peptídico de uma proteína de doençaconformacional com glicinas N-substituídas. De preferência,o fragmento peptídico original é capaz de se ligar a umaproteína de doença conformacional. Exemplos de fragmentospeptídicos originais incluem aqueles que possuem asseqüências dos IDS. DE SEQ. Nos: 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,33, 34, 35 , 36, 37, 38, 39, 40 , 41 CN 43, 44, 45 , 46, 47, 48, 49, 50 , 51, 52, 53, 54, 55 , 56 , 57, 58, 59, 60 , 61, 62, 63, 64, 65 , 66, 67, 68, 69, 70 , 71 , 72, 73, 74, 75 , 76, 77, 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84, 85 , 86 , 87, 88, 89, 90 , 91, 92, 93, 94, 95, 96 , 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 , 134, 135, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227 e 228.

Em algumas modalidades, pelo menos um resíduodiferente de prolina do fragmento peptídico é substituídopor uma glicina N-substituída para formar o reagentepeptóide. Em algumas modalidades, cada um dos pelo menostrês resíduos de aminoácidos do fragmento peptídico ésubstituído por glicinas N-substituídas para formar oreagente peptóide. Em algumas modalidades, pelo menos cincoresíduos de aminoácidos são substituídos por glicinas N-substituídas.

Em algumas dessas modalidades, a proteína de doençaconformacional é uma proteína de príon. Por exemplo, ofragmento peptídico pode ser derivado de qualquer umadaquelas regiões que correspondem aos resíduos 23-43 ou 85-156 (por exemplo, 23-30, 86-111, 89-112, 97-107, 113- 135,e 136-156), numerados de acordo com a seqüência de príon decamundongo mostrada no ID. DE SEQ. N°: 2 dos pedidos depatentes de co-propriedade U.S. N0 de Série 10/917.646,depositado em 13 de agosto de 2004, U.S. N° de Série11/056.950, depositado em 11 de fevereiro de 2005, e PedidoInternacional PCT/US2004/026363, depositado em 13 de agostode 2004, todos intitulados "Prion-Specific PeptideReagents", cada um deles aqui incorporado em suatotalidade.

Em algumas modalidades, o fragmento peptídico éselecionado de qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 14, 50,51, 52, 12, 72, 68 ou 115 até 219. Em algumas modalidades,o fragmento peptídico é selecionado de qualquer um dos IDS.DE SEQ. Nos: 14, 50, 51, 52, ou 161 até 219. Em algumasmodalidades, o fragmento peptídico é selecionado dequalquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 12, 72, 68 ou 115 até160. Em algumas modalidades, o fragmento peptídico éselecionado de qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 14, 50 ou68 .

Como ponto de partida, os resíduos de aminoácidos nofragmento peptídico podem ser substituídos com glicinas N-substituídas de acordo com um esquema de substituição emque resíduos de aminoácidos hidrofóbicos são substituídoscom glicinas N-substituídas hidrofóbicas e resíduos deaminoácidos hidrofílicos são substituídas com glicinas N-substituídas hidrofílicas. Em algumas modalidades,monômeros de aminoácidos de peptídeos podem sersubstituídos com glicinas N-substituídas de acordo com oseguinte esquema de substituição para formar um peptídeomodificado:(a) Ala, Gly, Ile, Leu, Pro e Val podem sersubstituídos por N-(alquil)glicina, N-(aralquil)glicina ouN-(heteroarilalquil)glicina;

(b) Asp, Asn, Cys, Gln, Glu, Met, Ser e Thr podem sersubstituídos por N-(hidroxialquil)glicina, N-(alcóxi)glicina, N-(aminoalquil)glicina ou N-(guanidinoalquil)glicina;

(c) Phe, Trp e Tyr podem ser substituídos por N-(aralquil)glicina, N-(heteroarilalquil)glicina, N-(hidroxiaralquil)glicina, ou N-(alcoxiaralquil)glicina; e

(d) Arg, His e Lys podem ser substituídos por N-(aminoalquil)glicina ou N-(guanidinoalquil)glicina.

O peptídeo modificado pode ser testado quanto àligação à forma patogênica de uma proteína de príon deacordo com métodos aqui descritos. Substituiçõesadicionais, de acordo com o esquema acima, de monômeros deaminoácidos com glicinas N-substituídas podem ser feitas ere-testadas até que seja obtida ligação adequada (ou seja,reagentes peptóides que interagem preferivelmente com aforma patogênica do príon).

Métodos para a produção de peptóides são revelados nasPatentes U.S. Nos 5.811.387 e 5.831.005, cada uma delassendo aqui incorporada por referência em sua totalidade,bem como os métodos aqui revelados.

Um reagente peptóide da invenção compreende monômeros,multímeros, moléculas ciclizadas, moléculas ramificadas,ligantees e semelhantes. Também são contemplados multímeros(ou seja, dímeros, trímeros e semelhantes) de qualquer umadas seqüências aqui descritas ou equivalentesbiologicamente funcionais destas. 0 multímero pode ser umhomomultímero, ou seja, composto por monômeros idênticos,por exemplo, cada monômero é a mesma seqüência peptóide,por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 229, aqui apresentada aseguir. Alternativamente, o multimero pode ser umheteromultímero, ou seja, todos os monômeros quecompreendem o multimero não são idênticos.

Multimeros podem ser formados pela adesão direta dosmonômeros uns aos outros ou a um substrato, incluindo, porexemplo, peptideos antigênicos múltiplos (MAPS) (porexemplo, MAPS simétricos), peptideos anexados a matrizespoliméricas, por exemplo, uma matriz de PEG, e/ou peptideosligados em tandem com ou sem unidades espaçadoras.Alternativamente, pode ser adicionado um espaçador aosmonômeros para uni-los para formar um multimero. Exemplosnão limitantes de multimeros que utilizam liganteesincluem, por exemplo, repetições em tandem que usamligantees de glicina, MAPS anexados através de um ligante aum substrato e/ou peptideos ligados linearmente através deligantees a uma matriz. Porções ligantes podem envolver autilização de unidades espaçadoras bifuncionais (tantohomobifuncionais quanto heterobifuncionais) , como é doconhecimento daqueles habilitados na técnica.

Em algumas modalidades, o reagente peptóide interagecom a proteína de doença conformacional de uma doençarelacionada a príon, em que a forma patogênica da proteínade doença conformacional é PrPsc, e a forma não patogênicada proteína de doença conformacional é PrPc. Em algumasmodalidades, o reagente peptóide é específico para PrPsc demais de uma espécie, por exemplo, o reagente peptóide podeser específico para proteína de príon de dois ou mais dehumanos, vacas, carneiros, veados, alces, cabras,camundongos ou hamsters. Em algumas modalidades, o reagentepeptóide é especifico para PrPsc de uma única espécie.

Em algumas modalidades, o reagente peptóide interagecom a forma patogênica da proteína de doença conformacionalcom uma afinidade de pelo menos cerca de 2 vezes; 5 vezes;10 vezes; 20 vezes; 50 vezes; 100 vezes; 200 vezes; 500vezes; ou 1.000 vezes maior do que para a forma nãopatogênica da proteína de doença conformacional. Em algumasmodalidades, a afinidade é pelo menos cerca de 10 vezesmaior do que aquela para a forma não patogênica da proteínade doença conformacional. Em algumas modalidades, aafinidade é pelo menos 100 vezes maior.

A invenção ainda fornece um complexo que compreende umou mais reagentes peptóides aqui descritos e uma proteínade príon. Em algumas modalidades, o complexo compreende umreagente peptóide aqui descrito e um príon patogênico. Emalgumas modalidades, o príon patogênico é PrPsc. Em algumasmodalidades, o complexo compreende príon patogênico e/ou umreagente peptóide, reagente de ligação ou ligante de príon,que opcionalmente é marcado. Como aqui usado, o termo"complexo" significa um associação entre príon, patogênicoou não patogênico, e um reagente peptóide e/ou um reagentede ligação de príon. Dessa forma, um complexo não énecessariamente uma associação entre um príon e um reagentepeptóide, e pode ser uma associação entre um príon e umreagente de ligação de príon. As moléculas no complexo seligarão em conjunto por forças intermolecularessuficientes, por exemplo, por força iônica, hidrofóbica,ligação de hidrogênio, forças de van der Waals etc., parapermitir que o complexo funcione como uma unidade únicapara as finalidades dos métodos e das composições aquidescritas.

Composições

A presente invenção ainda fornece uma composição quecompreende um reagente peptóide da invenção, como aquidescrito. Em algumas modalidades, a composição compreendeum reagente peptóide e uma amostra, por exemplo, umaamostra biológica. A amostra biológica é uma amostrapreparada a partir de um organismo vivo ou falecido.Exemplos não limitantes de amostras biológicas são órgãos(por exemplo, cérebro, fígado e rim), células, sanguetotal, frações sangüíneas, componentes sangüíneos, plasma,plaquetas, soro, líquido cefalorraquidiano (LCR), tecidocerebral, tecido do sistema nervoso, tecido muscular,tecido muscular e gorduroso (por exemplo, carne), medulaóssea, urina, lágrimas, tecido que não seja do sistemanervoso, alimentos que se originam de um organismo vivo oufalecido, por exemplo, carne de boi, porco ou vitela, equalquer outra matéria orgânica, por exemplo, materiais deplantas. A amostra biológica pode ser obtida durante umprocedimento médico, por exemplo, uma doação ou umrastreamento de sangue, biópsia, autópsia ou necropsia, oudurante um processo ou procedimento durante a reparação dealimentos, por exemplo, seleção e abate de animais e testesde verificação de qualidade de produtos acabados.

A invenção também fornece uma composição quecompreende um suporte sólido e pelo menos um reagentepeptóide da invenção. O suporte sólido pode ser, porexemplo, nitrocelulose, poliestireno, polipropileno, látex,fluoreto de polivinila, papel diazotizado, membranas denáilon, glóbulos ativados e/ou glóbulos magneticamenteresponsivos, ou cloreto de polivinila; polipropileno, látexde poliestireno, policarbonato, náilon, dextrana, quitina,areia, sílica, pedra-pomes, agarose, celulose, vidro,metal, poliacrilamida, silício, borracha oupolissacarideos; papel diazotizado; ou quaisquer materiaisusados para síntese de fase sólida, separações porafinidade, purificações, hibridização reações, imunoensaiose outras aplicações desse tipo. O suporte pode serparticulado ou pode estar na forma de uma superfíciecontínua, e inclui membranas, tramas, placas, péletes,lâminas, discos, capilares, fibras ocas, agulhas, pinos,chips, fibras sólidas, géis (por exemplo, géis de sílica) eglóbulos, (por exemplo, glóbulos de vidro poroso, géis desílica, glóbulos de poliestireno opcionalmenteentrecruzados com divinilbenzeno, glóbulos co-polienxertados, glóbulos de poliacrilamida, glóbulos de látex,glóbulos de dimetilacrilamida opcionalmente entrecruzadoscom N-N1-bis-acriloiletilenodiamina, glóbulos magnéticos deóxido de ferro e partículas de vidro revestidas com umpolímero hidrofóbico). Em algumas dessas modalidades, osuporte sólido é selecionado do grupo que consiste emnitrocelulose, látex de poliestireno, fluoreto depolivinila, papel diazotizado, membranas de náilon,glóbulos ativados e glóbulos magneticamente responsivos.

Em algumas modalidades, a composição que compreende oreagente peptóide é uma composição farmacêutica, ou seja,farmaceuticamente aceitável e farmacologicamente aceitável.

Em algumas modalidades, a composição ainda compreende pelomenos um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.O veículo farmacêutico pode ser um sólido ou um líquido. Umveículo sólido pode incluir uma ou mais substâncias quetambém podem atuar como agente flavorizante, agenteadoçante, lubrificante, solubilizante, agente de suspensão,enchimento, glidante, auxiliares da compressão, aglutinanteou agente de desintegração de comprimidos; ele também podeser um material de encapsulação. Em pós, o veículocompreende um sólido finamente dividido que está misturadocom o reagente peptóide finamente dividido. Veículosadequados são tipicamente macromoléculas grandes, que sãometabolizadas lentamente, por exemplo, proteínas,polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos,aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos,agregados lipídicos (por exemplo, gotículas de óleo oulipossomos) e partículas virais inativadas. Esses veículossão bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Um excipiente é um ingrediente que dá volume,transmite características satisfatórias de processamento ecompressão, ajuda a controlar a taxa de dissolução, e/ou dealgum outro modo fornece características físicas desejáveisadicionais ao material central. Excipientes, por exemplo,são diluentes, aglutinantes, lubrificantes e desintegrantesbem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, comodescrito, por exemplo, no "Handbook of PharmaceuticalExcipients", "American Pharmaceutical Association",Washington, D.C. e "The Pharmaceutical Society of GreatBritain", Londres, Inglaterra (1986), aqui incorporados porreferência em sua totalidade. Excipientes adequadosincluem, por exemplo, material celulósico, tais como,Hipromelose, HPC, HEC, carboximetilcelulose, celulosemicrocristalina, etil celulose, metil celulose, e seusderivados e sais; outros compostos orgânicos, tais comoPEG, talco, lactose e outros açúcares, tais como sacarose,glicose, frutose, maltose, e maltodextrina, acácia,dextrina, ácido alginico, resina de etilcelulose, gelatina,goma guár, metilcelulose, amido pré-gelatinaizado, alginatode sódio, amido, zeina, polivinilpirrolidona, copolímero devinilpirrolidina-acetato de vinila, copolímero de acetatode vinila-ácido crotônico e copolímero de acrilato deetila-ácido metacrilato; plastificantes, tais como,propileno glicol, glicerina, trimetilolpropano, polímerosde PEG, sebacato de dibutila, monoglicerídeos acetilados,dietilftalato, triacetina, gliceriltriacetato, citrato deacetiltrietila e citrato de trietila; e lubrificantes, taiscomo talco, estearato de magnésio, estearato de cálcio,ácido esteárico, óleos vegetais hidrogenados, laurilsulfato de magnésio, benzoato de sódio, uma mistura debenzoato de sódio e acetato de sódio, cloreto de sódio,leucina, e Carbowax® 4000.

Uma composição farmacêutica da invenção também podeser administrada em conjunto com outras moléculas, porexemplo, antígenos e agentes imunorreguladores, tais comoimunoglobulinas, citocinas, linfocinas e quimiocinas,incluindo, sem limitação, interleucina 2 (IL-2), IL-2modificada (cysl25-serl25), fator estimulante de colôniasde macrófagos granulócitos (GM-CSF), interleucina 12 (IL-12), interferon alfa ou gama, quimiocina IP-IO, e 13quimiocinas such as RANTES, ΜΙΡ1-α e MIPl-β. Quandoadministrada em conjunto, a composição pode seradministrada simultaneamente ou seqüencialmente com a outramolécula; e, se simultaneamente, tanto como uma únicaunidade de dosagem como, por exemplo, uma mistura quecompreende a composição e outra molécula, quanto comounidades de dosagem separadas e distintas, cada unidadecompreendendo tanto composição quanto a outra molécula.

Composições farmacêuticas, como aqui descritas, podemcompreender uma quantidade terapeuticamente eficaz doreagente peptóide. Como aqui usado, o termo "quantidadeterapeuticamente eficaz" significa uma quantidade que iráinduzir uma resposta protetora e/ou terapêutica no animalnão infectado, infectado, exposto ou não exposto como, porexemplo, um mamífero, por exemplo, um ser humano ou nãohumano, ao qual é administrada. Uma quantidadeterapeuticamente eficaz irá variar, dependendo do animaltratado, da idade e da condição geral do animal tratado, dacapacidade do sistema imunológico do animal para sintetizaranticorpos, do grau de proteção desejado, da gravidade dacondição tratada, da composição específica selecionada e deseu modo de administração, dentre outros fatores. Osprofissionais de saúde habilitados podem determinar aquantidade terapeuticamente eficaz, bem como a dose e afreqüência de administração para se obter um resultadoclínico ótimo. Por exemplo, a composição da invenção podeser administrada em uma dose única, ou como parte de umregime de administração, por exemplo, doses múltiplas, epode ser administrada diariamente, semanalmente,mensalmente, anualmente, semi-anualmente, bi-anualmente, esemelhantes. Uma composição farmacêutica pode seradministrada por vários modos, por exemplo, mas semlimitação, por via intramuscular, intraraucosa, subcutânea,intradérmica, transdérmica, transcutânea, intravaginal,intraperitoneal, intra-retal, oral, nasal, retal, ocular,intestinal e/ou intravenosa. Uma composição pode seradaptada para administração; por exemplo, paraadministração oral, ela pode estar na forma de comprimidosou cápsulas, opcionalmente com revestimento entérico,líquida ou de liberação controlada; e para administraçãointranasal, ela pode estar na forma de um spray nasal,gotas nasais, gel ou pó. 0 regime de dosagem pode incluiruma primeira dose e uma segunda dose. A primeira dose, porexemplo, uma dose de ataque, e a segunda dose, por exemplo,um reforço, podem ser administradas por via mucosa,parenteral ou uma combinação destas. Embora sejamfornecidos exemplos de vias de administração, a via deadministração e a dosagem apropriadas são geralmentedeterminadas caso a caso pelo médico assistente. Essasdeterminações são rotineiras para aqueles habilitados natécnica (veja, por exemplo, "Harrison's Principies ofInternai Medicine" (1998), Fauci e cols., eds. 14a ed. NovaYork: McGraw Hill).

Detecção

A presente invenção ainda fornece métodos para adetecção da presença de proteínas de príon, particularmenteproteínas de príon patogênico. Os métodos de detecção sebaseiam na propriedade dos reagentes peptóides da invençãopara interagir preferivelmente com formas de príonpatogênico. Os métodos de detecção podem ser usados, porexemplo, com métodos para a detecção de uma proteína dedoença conformacional, especialmente uma proteína de príonpatogênico, em uma amostra, métodos para o diagnóstico deuma doença relacionada a prion (por exemplo, em sereshumanos ou animais não humanos), métodos para assegurar umsuprimento sangüíneo, um suprimento de produtos sangüíneosou de produtos alimentícios substancialmente livres dePrPsc, métodos para a análise de amostras de órgãos etecidos para transplante, métodos para monitoramento dadescontaminação de instrumentos e equipamentos cirúrgicos,bem como outras situações nas quais o conhecimento dapresença ou ausência do príon patogênico é importante.

Dessa forma, a presente invenção está relacionada a ummétodo para a detecção da presença de um príon patogênicoem uma amostra, que compreende o contato da amostra com umprimeiro reagente peptóide da invenção sob condições quepermitem a ligação do reagente peptóide ao príonpatogênico, se presente, para formar um complexo, e adetecção da formação do complexo, a formação do complexosendo indicativa da presença do príon patogênico. Condiçõestípicas que permitem a ligação do reagente peptóide aopríon patogênico são descritas nos exemplos aquiapresentados. Outras condições de ligação adequadas podemser facilmente determinadas por aqueles habilitados natécnica.

0 método de detecção de príon patogênico em umaamostra também pode compreender o contato da amostra com umprimeiro reagente peptóide da invenção sob condições quepermitem a ligação do primeiro reagente peptóide ao príonpatogênico, se presente, para formar um primeiro complexo,o contato do primeiro complexo com um segundo reagentepeptóide da invenção, opcionalmente marcado de formadetectável, sob condições que permitem a ligação do segundoreagente peptóide ao príon patogênico do primeiro complexopara formar um segundo complexo, e a detecção da formaçãodo segundo complexo, a formação do segundo complexo sendoindicativa da presença do príon patogênico. O segundocomplexo pode compreender o segundo reagente peptóide e opríon patogênico e, opcionalmente, o primeiro reagentepeptóide.

Além disso, o método de detecção da invenção podecompreender o contato da amostra com um primeiro reagentepeptóide da invenção sob condições que permitem a ligaçãodo primeiro reagente peptóide ao príon patogênico, sepresente, para formar um primeiro complexo, a remoção daamostra não ligada, a dissociação do príon patogênico doprimeiro complexo gerando, dessa forma, príon patogênicodissociado, o contato do príon patogênico dissociado com umsegundo reagente peptóide da invenção, opcionalmentemarcado de forma detectável, sob condições que permitem aligação do segundo reagente peptóide ao prion patogênicodissociado, para formar um segundo complexo, e a detecçãoda formação do segundo complexo, a formação do segundocomplexo sendo indicativa da presença do prion patogênico.A dissociação do primeiro complexo pode ser obtida porqualquer método convencional para ruptura das interações deligação de proteína, por exemplo, adição de um sal ouagente caotrópico, aumento da temperatura, adição de umdetergente ou desnaturante e ruptura mecânica, e tambémpode compreender tratamento em um pH elevado ou reduzido,como aqui descrito.

O método de detecção de príon patogênico em umaamostra também pode compreender o contato da amostra com umprimeiro reagente peptóide da invenção sob condições quepermitem a ligação do primeiro reagente peptóide ao príonpatogênico, se presente, para formar um primeiro complexo,o contato do primeiro complexo com um reagente de ligaçãode príon (aqui descrito), opcionalmente marcado de formadetectável, sob condições que permitem a ligação doreagente de ligação de príon ao príon patogênico doprimeiro complexo para formar um segundo complexo, e adetecção da formação do segundo complexo, a formação dosegundo complexo sendo indicativa da presença do príonpatogênico. O segundo complexo pode compreender o reagentede ligação de príon e o príon patogênico e, opcionalmente,o primeiro reagente peptóide.

Além disso, o método de detecção da invenção podecompreender o contato da amostra com um primeiro reagentepeptóide da invenção sob condições que permitem a ligaçãodo primeiro reagente peptóide ao príon patogênico, sepresente, para formar um primeiro complexo, a remoção daamostra não ligada, a dissociação do príon patogênico doprimeiro complexo gerando, dessa forma, príon patogênicodissociado, o contato do príon patogênico dissociado com umreagente de ligação de príon, opcionalmente marcado deforma detectável, sob condições que permitem a ligação doreagente de ligação de príon ao príon patogênicodissociado, para formar um segundo complexo, e a detecçãoda formação do segundo complexo, a formação do segundocomplexo sendo indicativa da presença do príon patogênico.

Em uma modalidade adicional, o método de detecção dainvenção pode compreender o contato da amostra com umprimeiro reagente peptóide da invenção sob condições quepermitem a ligação do primeiro reagente peptóide ao príonpatogênico, se presente, para formar um primeiro complexo,a remoção da amostra não ligada, a dissociação do príonpatogênico do primeiro complexo gerando, dessa forma, príonpatogênico dissociado, o contato do príon patogênicodissociado com um reagente de ligação de príon sobcondições que permitem a ligação do reagente de ligação depríon ao príon patogênico dissociado, para formar umsegundo complexo, e a detecção da formação do segundocomplexo com a utilização de um segundo reagente de ligaçãode príon, opcionalmente marcado de forma detectável, aformação do segundo complexo sendo indicativa da presençado príon patogênico.

O príon patogênico dissociado é, de preferência,desnaturado durante ou após a dissociação do primeirocomplexo, e antes da formação do segundo complexo.Tipicamente, os agentes que efetuam a dissociação do príonpatogênico do complexo (por exemplo, agentes caotrópicos,calor, pH elevado ou reduzido) promoverão desnaturação daproteína de príon patogênico; no entanto, se desejável, adissociação do príon patogênico do complexo pode ser obtidasem desnaturação da proteína, por exemplo, com o uso de umaconcentração baixa (por exemplo, 0,4 a 1,0 M) de cloridratode guanidínio ou isotiocioanato de guanidínio. Veja WO2006076497 (Pedido Internacional PCT/US2006/001090) paracondições adicionais para dissociação do príon patogênicodo complexo, sem desnaturação da proteína de príon.

Em outra modalidade, o método de detecção compreende ocontato da amostra com um reagente de ligação de príon sobcondições que permitem a ligação do reagente de ligação depríon ao príon patogênico, se presente, para formar umprimeiro complexo, a remoção da amostra não ligada, ocontato do complexo com um reagente peptóide da invenção,opcionalmente marcado de forma detectável, sob condiçõesque permitem a ligação do reagente peptóide ao prionpatogênico do primeiro complexo para formar um segundocomplexo, e a detecção da formação do segundo complexo, aformação do segundo complexo sendo indicativa da presençado príon patogênico. 0 reagente de ligação de príon éfornecido opcionalmente em um suporte sólido.

Em algumas modalidades, a etapa de dissociaçãocompreende o contato da proteína de príon patogênico ligadacom um sal ou um agente caotrópico como, por exemplo,tiocioanato de guanidínio (GdnSCN) ou cloridrato deguanidínio (GdnHCl). Exemplos de concentrações adequadas deGdnSCN ou GdnHCl estão entre cerca de 3 M e cerca de 6 M.

Em algumas modalidades, a etapa de dissociaçãocompreende a exposição da proteína de príon patogênicoligada a um pH elevado ou reduzido, através do qual aproteína de príon patogênico dissociado é desnaturada. Porexemplo, o pH pode estar acima de 12 ou abaixo de 2. Emalgumas modalidades, o pH está entre 12,5 e 13,0. Um pHelevado pode ser obtido pela adição de NaOH para gerar umaconcentração de 0,05 N a 0,15 Ν. A exposição a um pHelevado ou reduzido pode ser realizada por, no máximo, 15minutos ou, no máximo, 10 minutos. Em algumas modalidades,o pH elevado ou reduzido é neutralizado até entre 7,0 e 7,5como, por exemplo, pela adição de ácido fosfórico ou um salde sódio deste.Um "reagente de ligação de príon" é um reagente que seliga a uma proteína de príon em alguma conformação, porexemplo, o reagente de ligação de príon pode se ligar a umaou mais de uma forma desnaturada da proteína de príon, aforma de PrP (isoforma não patogênica) ou ao PrPsc(isoforma patogênica). Alguns desses reagentes de ligaçãode príon se ligarão a mais de uma dessas formas de proteínade príon. Foram descritos reagentes de ligação de príon, eesses incluem, por exemplo, anticorpos anti-príon(descritos, inter alia, em Peretz e cols. 1997 J. Mol.Biol. 273: 614; Peretz e cols. 2001 Nature 412: 739;Williamson e cols. 1998 J. Virol. 72: 9.413; Polymenidou ecols. The Lancet 2005 4: 805; Patente U.S. N0 4.806.627;Patente U.S. N0 6.765.088; e Patente U.S. N0 6.537.548),polipeptídeos híbridos enxertados com motivo (veja WO03/085086), certos polímeros catiônicos ou aniônicos (vejaWO 03/073106), certos peptídeos que são "catalisadores dapropagação" (veja WO 02/097444), reagentes peptídicosespecíficos para príons (veja por exemplo, WO 2006/076687 eUS 20060035242) e plasminogênio. Em todos os métodos queutilizam um reagente de ligação de príon, reagentes deligação de príon preferidos são anticorpos anti-príon.

Adicionalmente, o método de detecção pode compreendero fornecimento de um suporte sólido que compreende umreagente peptóide da invenção, a combinação do suportesólido com um ligante marcado de forma detectável, em que oreagente peptóide do suporte tem uma afinidade de ligaçãomais fraca pelo ligante do que pelo príon patogênico, paraformar um primeiro complexo, a combinação da amostra com oprimeiro complexo sob condições que permitem a ligação dopríon patogênico, se presente na amostra, ao reagentepeptóide do primeiro complexo substituindo, desse modo, oligante marcado de forma detectável do primeiro complexo eformando um segundo complexo que compreende o reagentepeptóide e o príon patogênico, e a detecção da formação dosegundo complexo, a formação do segundo complexo sendoindicativa da presença do príon patogênico.

Para uso nos métodos para a detecção da presença de umpríon patogênico em uma amostra, a amostra pode serqualquer que sabidamente contém, ou suspeita de conter, umaproteína de príon patogênico. Em algumas modalidades, aamostra é suspeita de conter um príon patogênico, porexemplo, PrPsc. Em algumas modalidades, a amostra é umaamostra biológica (ou seja, uma amostra preparada a partirde um organismo vivo ou falecido) , ou uma amostra nãobiológica. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostrabiológica. Exemplos não limitantes de amostras biológicassão órgãos (por exemplo, cérebro, fígado e rim), células,sangue total, frações sangüíneas, componentes sangüíneos,plasma, plaquetas, soro, líquido cefalorraquidiano (LCR),tecido cerebral, tecido do sistema nervoso, tecidomuscular, tecido muscular e gorduroso (por exemplo, carne),medula óssea, urina, lágrimas, tecido que não seja dosistema nervoso, alimentos que se originam de um organismovivo ou falecido, e qualquer outra matéria orgânica, porexemplo, materiais de plantas. Em algumas modalidades, aamostra biológica compreende sangue total, fraçõessangüíneas, componentes sangüíneos, plasma, plaquetas ousoro. Em algumas modalidades, a amostra biológica é obtidade uma biópsia, autópsia ou necropsia. Em algumasmodalidades, a amostra é não biológica. Exemplos nãolimitantes de amostras não biológicas incluem substânciasfarmacêuticas, cosméticos e produtos de higiene pessoal, ealimentos que não se originam de um organismo vivo oufalecido, e semelhantes. A amostra pode ser pré-tratada pormeios convencionais (por exemplo, aquecimento, trituração,sonificação, exposição a certas enzimas digestivas) a fimde assegurar o contato entre a proteína de príon patogênicoque possa estar presente na amostra e o reagente peptóide.

Os métodos de detecção da invenção podem utilizarqualquer um dos reagentes peptóides aqui descritos. Emalgumas modalidades, o método de detecção da presenteinvenção utiliza um reagente peptóide que interage com umaproteína de doença conformacional, por exemplo, umaproteína de príon, preferivelmente com uma forma patogênicacomparada com uma forma não patogênica da proteína dedoença conformacional, que possui uma fórmula de:

Xa(Q)n-Xb

em que:

Xa é H, (Ci-C6) alquil, cicloalquil, aril, aralquil,heteroaril, heteroarilalquil, heterocicloalquil, (C1-C6Jacil, amino (Ci-6) acil, um aminoácido, um grupo protetoramino ou um polipeptídeo de 2 a cerca de 100 aminoácidos,em que Xa é opcionalmente substituído por uma porçãoconjugada que é opcionalmente anexada através de uma porçãoligante;

Xb é H, (Ci-C6) alquil, aril, aralquil, heteroaril,heteroarilalquil, heterocicloalquil, amino, alquilamino,dialquilami.no, hidroxil, (C1-C6) alcóxi, arilóxi, aralcóxi,um grupo protetor carbóxi, um aminoácido ou um polipeptídeode 2 a cerca de 100 aminoácidos, em que Xb é opcionalmentesubstituído por uma porção conjugada que é opcionalmenteanexada através de uma porção ligante; e η é 3 a cerca de30; em que pelo menos cerca de 50% da região peptóide -(Q)n- compreende glicinas N-substituídas.

Em algumas dessas modalidades, η é de cerca de 4 acerca de 30, de preferência, cerca de 5 a cerca de 30, e aregião peptóide -(Q)n- compreende pelo menos uma sub-regiãoselecionada independentemente de:

(a) -AABA-;

(b) -AABAB-

(c) -ABACC-

(d) -AAAAA-

(e) -ABCBA-

(f) -AABCA-; ou

(g) -ABABA-

em que A, B e C são, cada um, glicinas N-substituídasdiferentes.

Em algumas modalidades do método de detecção, oreagente peptóide compreende uma região terminal amino, umaregião terminal carbóxi, e pelo menos uma região peptóideentre a região terminal amino e a região terminal carbóxi,em que a região peptóide compreende cerca de 3 a cerca de30 glicinas N-substituídas e, opcionalmente, um ou maisaminoácidos. Em algumas dessas modalidades, a regiãopeptóide compreende uma sub-região peptóide selecionada de:

(a) -AABA-;

(b) -AABAB-;(C) -ABACC-

(d) -AAAAA-

(e) -ABCBA-

(f) -AABCA-

(g) -ABABA-

em que A, BeC são, cada um, glicinas N-substituídasdiferentes.

Em algumas modalidades do método de detecção dapresente invenção, o reagente peptóide compreende umanálogo de peptóide de um fragmento peptídico de 3 a 30aminoácidos da proteína de doença conformacional, em que ofragmento peptídico é selecionado do grupo de seqüências

que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 12, 13, 14, 15 , 16, 17 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 , 26 , 27, 28, 29, 30 , 31, 32 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 , 41 , 42, 43, 44, 45 , 46, 47 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 , 56 , 57, 58, 59, 60 , 61, 62 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 , 71 , 72, 73, 74, 75 , 76, 77 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 , 86 , 87, 88, 89, 90 , 91, 92 93, 94, 95, 96 , 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 130, 131, 132, 133, 134, 135, 135, 137, 138, 139, 140, 141 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 149, 150 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222 223, 224, 225, 226, 227 e 228, em que:(a) pelo menos um resíduo diferente de prolina dofragmento peptídico é substituído por uma glicina N-substituída para formar o análogo de peptóide; ou

(b) pelo menos cinco resíduos de aminoácidos dofragmento peptídico são substituídos, cada um, por umaglicina N-substituída para formar o análogo de peptóide.

Em algumas modalidades do método acima, a substituiçãode qualquer um ou mais resíduos de aminoácidos do fragmentopeptídico com uma glicina N-substituída que corresponde aoseguinte esquema de substituição:

i)Ala, Gly, lie, Leu, Pro e Val são substituídos porN-(alquil)glicina, N-(aralquil)glicina ou N-(heteroarilalquil)glicina;

ii)Asp, Asn, Cys, Gln, Glu, Met, Ser e Thr sãosubstituídos por N-(hidroxialquil)glicina, N-(alcóxi)glicina, N-(aminoalquil)glicina ou N-(guanidinoalquil)glicina;

iii)Phe, Trp e Tyr são substituídos por N-(aralquil)glicina, N-(heteroarilalquil)glicina, N-(hidroxiaralquil)glicina ou N-(alcoxiaralquil)glicina; e

iv)Arg, His e Lys são substituídos por N-(aminoalquil)glicina ou N-(guanidinoalquil)glicina.

Em algumas dessas modalidades, o reagente peptóidecompreende um análogo de peptóide de um fragmento peptídicode 5 a 30 aminoácidos da proteína de doença conformacional,como descrito acima.

Em algumas modalidades do método para detecção dapresença de um príon patogênico em uma amostra, o reagentepeptóide compreende uma seqüência como aqui descrita, porexemplo, que possui uma seqüência selecionada do que grupoconsiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 229, 230, 231, 232, 233,234, 235, 236, 237, 238, 239, 240 e 241. Em algumasmodalidades, o reagente peptóide compreende uma seqüênciaselecionada do ID. DE SEQ. N°: 229, 230, 232, 233, 234,235, 237, 238, 239 ou 240. Em algumas modalidades, oreagente peptóide compreende uma seqüência selecionada doID. DE SEQ. N°: 229, 230, 235, 237, 238, 239 OU 240. Emalgumas modalidades, o reagente peptóide compreende umaseqüência selecionada do ID. DE SEQ. N°: 230, 237, 238, 239ou 240. Em algumas modalidades o método da invenção utilizaum ou mais dos reagentes peptóides I, II, VII, IX, X, XIa,XIb, XIIa ou XIIb. Em algumas modalidades o método dainvenção utiliza um ou mais dos reagentes peptóides II, IX,X, XIa, XIb, XIIa ou XIIb. Em algumas modalidades, oreagente peptóide usado no método compreende uma seqüênciaselecionada de IDS. DE SEQ. Nos: 229, 236, 231, 232, 233,234 ou 235. Em algumas modalidades, o reagente peptóidecompreende uma seqüência selecionada de IDS. DE SEQ. Nos:230, 237, 238, 239 ou 240. Em algumas dessas modalidades, oreagente peptóide compreende o ID. DE SEQ. N°: 230, 237 ou240. Em algumas dessas modalidades, o reagente peptóidecompreende o ID. DE SEQ. N°: 240.

Em algumas modalidades, o método para detecção dapresença de um príon patogênico em uma amostra compreende ocontato da amostra com um primeiro reagente peptóide dainvenção sob condições que permitem a ligação do primeiroreagente peptóide ao prion patogênico, se presente, paraformar um complexo que compreende o primeiro reagentepeptóide e a proteína de príon patogênico, e a detecção dapresença do príon patogênico na amostra, caso presente, porsua ligação ao primeiro reagente peptóide. A ligação doprion patogênico ao primeiro reagente peptóide pode serdetectada por detecção da formação do complexo, a formaçãodo complexo sendo indicativa da presença do prionpatogênico. Em geral, em modalidades preferidas do método,o complexo que compreende o primeiro reagente peptóide e aproteína de prion patogênico é separado do resto da amostra(ou seja, a amostra não ligada), antes da detecção. Aformação do complexo pode ser detectada por detecção doprion patogênico no complexo ou por dissociação do complexo(após a separação da amostra não ligada) e detecção doprion patogênico dissociado. O prion patogênico dissociadopode ou não estar na conformação patogênica. Em algumasmodalidades, o prion patogênico dissociado está em umaconformação de prion desnaturado. 0 prion patogênicodissociado pode ser detectado por meios conhecidos natécnica, por exemplo, . por ligação de um anticorpo anti-prion que seja especifico para a isoforma apropriada doprion, e que são aqui descritos com mais detalhes. Foramdescritos na técnica anticorpos que reconhecem diferentesisoformas de príons (veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos5.846.533, 6.765.088, 6.261.790, 4.806.627, 6.165.784,6.528.269; EP891552, EP909388; Polymenidou e cols. TheLancet 2005 4: 805) .

Em uma modalidade preferida do método acima, o prionpatogênico é dissociado do complexo com o reagente peptóidecom o uso de um agente caotrópico, ou com o uso de umtratamento de pH elevado ou reduzido, como aqui descrito.

Além disso, o método para detecção de um prionpatogênico em uma amostra em que primeiro é feita aformação de um complexo com o reagente peptóide específicopara príon pode ser seguido por detecção do complexo com ummétodo analítico. 0 método analítico pode compreender ummétodo como, por exemplo, espectroscopia com UV visível,FTIR, espectroscopia por ressonância magnética nuclear,espectroscopia Raman, espectrometria de massa, HPLC,eletroforese capilar, espectroscopia por ressonância porplasmônio de superfície, sistemas micro-eletromecânicos(MEMS) ou qualquer outro método conhecido na técnica.

Em algumas modalidades, o reagente peptóide ou oreagente de ligação de príon compreende um marcadordetectável. Marcadores detectáveis adequados para uso nainvenção incluem, por exemplo, qualquer molécula capaz dedetecção, como as definidas acima. Em algumas modalidades,o marcador compreende uma enzima, um radioisótopo, umatoxina ou um fluoróforo. Adicionalmente, o marcadordetectável pode incluir um tag de oligonucleotídeo, o qualpode ser detectado por um método de detecção de ácidonucléico que inclui, por exemplo, reação em cadeia depolimerase (PCR), amplificação mediada por transcrição(TMA), DNA ramificado (b-DNA), amplificação baseada emseqüência de ácidos nucléicos (NASBA), e semelhantes.Marcadores detectáveis preferidos incluem enzimas,especialmente fosfatase alcalina (AP), peroxidase de raiz-forte (HRP), e compostos fluorescentes. Como é conhecido natécnica, as enzimas são utilizadas em combinação com umsubstrato detectável, por exemplo, um substrato cromogênicoou um substrato fluorogênico, para gerar um sinaldetectável.

Em algumas modalidades dos métodos de detecção dainvenção, um ou mais reagentes peptóides são anexados a umsuporte sólido. Um suporte sólido, para as finalidades dainvenção, pode ser qualquer material que seja uma matrizinsolúvel e que possa ter uma superfície rígida ou semi-rígida à qual uma molécula de interesse (por exemplo,reagentes peptóides da invenção, proteínas de príon,anticorpos etc.) pode ser ligada ou anexada. Suportessólidos exemplares incluem, sem limitação, aqueles aquidescritos previamente. Reagentes peptóides, como aquidescritos, podem ser anexados ao suporte covalentemente, oupor absorção, acoplamento ou uso de pares de ligação. Porexemplo, os reagentes peptóides podem ser facilmenteacoplados ao suporte sólido com o uso de tecnologias bemconhecidas na técnica. A imobilização ao suporte pode serintensificada acoplando-se primeiro o reagente peptóide auma proteína, por exemplo, quando a proteína tem melhorespropriedades de ligação à fase sólida. Proteínas deacoplamento adequadas incluem, sem limitação,

macromoléculas, por exemplo, albuminas séricas que incluemalbumina sérica bovina (BSA), hemocianina keyhole limpet,moléculas de imunoglobulina, tireoglobulina, ovalbumina eoutras proteínas bem conhecidas por aqueles habilitados natécnica. Os reagentes peptóides também podem ser anexadosao suporte sólido através da interação de um par de ligaçãode moléculas. Um membro do par de ligação é acoplado aosuporte sólido e o outro membro do par de ligação é anexadoao reagente peptóide (antes, durante ou depois da síntese).Por exemplo, o suporte pode compreender avidina ouestreptavidina, e o reagente peptóide pode compreenderbiotina. Além de biotina-avidina e biotina-estreptavidina,outros pares de ligação adequados para a anexação dopeptóide ao suporte incluem, sem limitação, antígeno-anticorpo, hapteno-anticorpo, mimetopo-anticorpo, receptor-hormônio, receptor-ligante, agonista-antagonista, lectina-carboidrato, Proteína Α-anticorpo Fc. Esses pares deligação são bem conhecidos (veja, por exemplo, PatentesU.S. Nos 6.551.843 e 6.586.193) e aqueles habilitados natécnica são capazes de selecionar pares de ligaçãoadequados e adaptá-los para uso com a presente invenção.Alternativamente, os reagentes peptóides podem ser anexadoscovalentemente ao suporte sólido com o uso de químicas deconjugação que são bem conhecidas na técnica. Reagentespeptóides que contêm tiol são anexados diretamente aossuportes sólidos, por exemplo, glóbulos magnéticoscarboxilados, com o uso de métodos padronizados conhecidosna técnica (veja, por exemplo, Chrisey, L.A., Lee, G.U. eO1Ferrall, C.E. (1996). "Covalent attachment of syntheticDNA to self-assembled monolayer films". Nucleic AcidsResearch 24(15), 3.031-3.039; Kitagawa, T., Shimozono, T.,Aikawa, T., Yoshida, T. e Nishimura, H. (1980)."Preparation and characterization of hetero-bifunctionalcross-linking reagents for protein modifications". Chem.Pharm. Buli. 29(4), 1.130-1.135). Glóbulos magnéticoscarboxilados primeiro são acoplados a um agente dereticulação heterobifuncional que contém uma funcionalidademaleimida (BMPH de Pierce Biotechnology Inc.) com o uso dequímica de carbodiimida. 0 peptídeo ou peptóide tiolado éentão acoplado covalentemente à funcionalidade maleimidados glóbulos revestidos com BMPH. Quando usados nasmodalidades dos métodos de detecção da invenção, o suportesólido auxilia na separação do complexo que compreende oreagente peptóide da invenção e a proteína de príonpatogênico da amostra não ligada. Glóbulos magnéticosparticularmente convenientes para acoplamento de tiol sãoos Dynabeads® M-270 de Ácido Carboxílico da Dynal. Oreagente peptóide também pode compreender um ligante, porexemplo, uma ou mais porções de ácido aminohexanóico.

Em algumas modalidades do método para detecção dapresença de um príon patogênico em uma amostra, o métodocompreende o contato da amostra com um primeiro reagentepeptóide da invenção sob condições que permitem a ligaçãodo primeiro reagente peptóide ao príon patogênico, sepresente, para formar um primeiro complexo, e então ocontato do primeiro complexo com um segundo reagentepeptóide da invenção marcado de forma detectável sobcondições que permitem a ligação do segundo reagentepeptóide ao príon patogênico do primeiro complexo paraformar um segundo complexo, e a seguir a detecção daligação do príon patogênico ao segundo reagente peptóide.Em algumas modalidades, a ligação da proteína de príonpatogênico ao segundo reagente peptóide pode ser detectadapor detecção da formação do segundo complexo, a formação dosegundo complexo sendo indicativa da presença de príonpatogênico. Em algumas modalidades, os reagentes peptóidessão diferentes. Em algumas modalidades, o primeiro e osegundo reagentes peptóides são iguais. Em algumasmodalidades, o primeiro reagente peptóide compreendebiotina. Em modalidades adicionais, o primeiro reagentepeptóide é anexado a um suporte sólido.

Em algumas modalidades dos métodos de detecção dainvenção, o método compreende o contato da amostra com umprimeiro reagente peptóide da invenção sob condições quepermitem a ligação do primeiro reagente peptóide ao príonpatogênico, se presente, para formar um primeiro complexo;remoção da amostra não ligada, que pode incluir, porexemplo, príon não patogênico presente na amostra; adissociação do príon patogênico do primeiro complexogerando, dessa forma, príon patogênico dissociado; ocontato do príon patogênico dissociado com um segundoreagente peptóide da invenção marcado de forma detectávelsob condições que permitem a ligação do segundo reagentepeptóide ao príon patogênico dissociado, para formar umsegundo complexo; e a detecção da formação do segundocomplexo, a formação do segundo complexo sendo indicativada presença de príon patogênico. Nessa modalidade, o príonpatogênico dissociado retém a conformação patogênica.

Em geral, "príon patogênico dissociado" ou "príondissociado" pode incluir proteína de príon que retém aconformação patogênica, além de proteína de príonpatogênico que foi desnaturada, cujo príon desnaturado podenão ter nem a conformação patogênica nem a conformaçãocelular normal, e pode não ser infeccioso.

Alternativamente, quando os reagentes peptóides dainvenção forem usados para capturar diretamente a proteínade príon patogênico para formar um primeiro complexo e oprimeiro complexo for separado dos materiais não ligados daamostra, como descrito acima, um reagente de ligação depríon, que é opcionalmente marcado de forma detectável,poderá ser usado para a detecção do príon patogênico, tantoenquanto o príon patogênico estiver ligado ao primeirocomplexo quanto após a dissociação da proteína de príon doprimeiro complexo. Como aqui mencionado previamente, umreagente de ligação de príon é um reagente que se liga auma proteína de príon em alguma conformação, por exemplo, oreagente de ligação de príon pode se ligar a uma ou mais deuma forma desnaturada da proteína de príon, a forma PrPc(isoforma não patogênica) ou ao PrPsc (isoformapatogênica). Alguns desses reagentes de ligação de príon seligarão a mais de uma dessas formas de proteína de príon.Foram descritos reagentes de ligação de príon, e essesincluem, por exemplo, anticorpos anti-príon (descritos,inter alia, em Peretz e cols. 1997 J. Mol. Biol. 273: 614;Peretz e cols. 2001 Nature 412: 739; Williamson e cols.1998 J. Virol. 72: 9.413; Polymenidou e cols. The Lancet15 2005 4: 805; Patente U.S. N0 4.806.627; Patente U.S. N06.765.088; e Patente U.S. N0 6.537.548), polipeptídeoshíbridos enxertados com motivo (veja WO 03/085086), certospolímeros catiônicos ou aniônicos (veja WO 03/073106),certos peptídeos que são "catalisadores da propagação"(veja WO 02/097444), reagentes peptídicos específicos parapríons (veja por exemplo, WO 2006/076687 e US20060035242) eplasminogênio. Caso o reagente de ligação de príon emparticular usado se ligue a uma forma desnaturada do príon,ficará evidente que a proteína de príon patogênico doprimeiro complexo deve ser desnaturada antes da detecçãocom o reagente de ligação de príon. Reagentes de ligação depríon, particularmente anticorpos anti-príon, podem serseletivos para proteínas de príon de espécies animaisespecíficas. Dessa forma, ficará evidente que serãoescolhidos reagentes de ligação de príon que tenhampropriedades de ligação adequadas em termos daespecificidade para a conformação de príon e especificidadeem termos de espécie.

Dessa forma, o reagente peptóide da invenção pode serusado tanto como um reagente de "captura" para príonspatogênicos em uma amostra quanto como um reagente de"detecção" para o príon patogênico capturado, ou comoambos, ou seja, como reagente de captura e de detecção.

Quando o reagente peptóide for usado para captura do príonpatogênico, o príon capturado poderá ser removido do restoda amostra (em virtude do complexo formado com o reagentepeptóide), e o príon poderá ser detectado por meiosconvencionais (por exemplo, ELISA, Western blot,imunoprecipitação etc.), tanto enquanto ainda estiver emcomplexo com o reagente peptóide quanto após dissociação docomplexo. O príon capturado pode alternativamente serdetectado com o uso de um segundo reagente peptóide que émarcado de forma detectável.

ELISA

Um método particularmente preferido para detecção deum príon patogênico em uma amostra combina o uso dosreagentes peptóides da invenção com uma técnicaaperfeiçoada de ELISA. O ensaio combina o poder dosreagentes peptóides para discriminar entre a formapatogênica e não patogênica das proteínas de príon com umatécnica aperfeiçoada de ELISA. Como os reagentes peptóidesinteragem preferivelmente com as proteínas de príonpatogênico, esses reagentes são usados para separar econcentrar qualquer príon patogênico presente na amostra.

Diferentemente dos métodos que utilizam digestão comproteinase K para discriminar entre as isoformaspatogênicas e não patogênicas, o que tipicamente resulta emalguma digestão no terminal N até mesmo da isoformapatogênica, o uso dos reagentes peptóides no método dainvenção resulta na separação de proteínas de príonpatogênico de comprimento total. Dessa forma, anticorposanti-príon que reconhecem epitopos na extremidade doterminal N da proteína de príon, por exemplo, epitopos naregião dos resíduos 23-90, podem ser usados para adetecção, bem como de anticorpos anti-príon que reconhecemepitopos de outras regiões da proteína de príon. A regiãodo terminal N da proteína de príon da maioria das espéciescontém uma seqüência repetida (4 cópias de octa-repetiçõesGQPHGGGS/W ou 5 cópias em PrP bovino). Os anticorpos que seligam dentro dessa região podem exibir avidez aumentada, oque resulta em uma sensibilidade aumentada para o ensaio.

Após a proteína de príon patogênico ter sido separadada isoforma não patogênica (que está presente em muitasamostras biológicas) com o uso dos reagentes peptóides,como descrito acima, a proteína de príon patogênico podeser dissociada do reagente peptóide e detectada em diversosformatos de ELISA, aqui descritos. 0 príon patogênico étipicamente desnaturado no processo de dissociação doreagente peptóide, embora isso não ocorra necessariamente.A desnaturação do PrPsc capturado antes da realização doELISA é preferível, na medida em que a maioria dosanticorpos anti-príon de alta afinidade se liga à formadesnaturada do PrP, e muitos anticorpos anti-príon que seligam ao PrP desnaturado são conhecidos e disponíveiscomercialmente. A dissociação e a desnaturação do príonpatogênico podem ser obtidas com o uso de concentraçõeselevadas de agentes caotrópicos, por exemplo, 3 M a 6 M deum sal de guanidínio como, por exemplo, tiocioanato deguanidínio ou HCl de guanidínio. O agente caotrópico deveser removido ou diluído antes da realização do ELISA, poisele irá interferir com a ligação dos anticorpos anti-príonusados no ELISA. Isso resulta em etapas de lavagemadicionais ou na geração de grandes volumes de amostra,ambos indesejáveis para ensaios rápidos e de altorendimento.

Os presentes inventores descobriram que, em algumasmodalidades, uma alternativa preferível ao uso de um agentecaotrópico para desnaturação da proteína de príonpatogênico, e dissociação do reagente peptóide, é o uso depH elevado ou reduzido. A proteína de príon patogênico éfacilmente dissociada do reagente peptóide e desnaturadapela adição de componentes que aumentam o pH acima de 12(por exemplo, NaOH) ou abaixo de 2 (por exemplo, H3PO4) .Além disso, o pH pode ser facilmente ajustado até o pHneutro por adição de pequenos volumes de um ácido ou umabase adequada permitindo, desse modo, o uso diretamente noELISA, sem lavagens adicionais e sem aumentar os volumes daamostra significativamente.

Dessa forma, a invenção fornece um método paradetecção da presença de um príon patogênico em uma amostraque compreende: o contato da amostra suspeita de conter umpríon patogênico com um reagente peptóide que interagepreferivelmente com a forma patogênica da proteína depríon, sob condições que permitem a ligação do reagentepeptóide à proteína de príon patogênico, se presente; aremoção do material não ligado da amostra; a dissociação dopríon patogênico do reagente peptóide; e a detecção dapresença do príon patogênico dissociado com a utilização deum reagente de ligação de príon. Ficará evidente que, casoo reagente de ligação de príon em particular usado se liguea uma forma desnaturada do príon, a proteína de príonpatogênico "capturada" deve ser desnaturada antes dadetecção com o reagente de ligação de príon. Depreferência, o reagente de ligação de príon é um anticorpoanti-príon.

Foram descritos anticorpos, anticorpos modificados eoutros reagentes que se ligam aos príons, particularmenteao PrPc ou ao PrP desnaturado, alguns destes sendodisponíveis comercialmente (veja, por exemplo, anticorposanti-príon descritos em Peretz e cols. 1997 J. Mol. Biol.273: 614; Peretz e cols. 2001 Nature 412:739; Williamson ecols. 1998 J. Virol. 72: 9.413; Polymenidou e cols. 2005Lancet 4: 805; Patente U.S. N0 6.765.088. Alguns desses eoutros são disponíveis comercialmente de, inter alia, InProBiotechnology, South San Francisco, CA, Cayman Chemicals,Ann Arbor MI; Prionics AG, Zurique; veja também, WO03/085086 para uma descrição de anticorpos modificados).Anticorpos adequados para uso no método incluem, semlimitação, 3F4 (U.S. 4.806.627), D18 (Peretz e cols. J.Mol. Biol. 1997 273: 614), D13 (Peretz 199.7, supra), 6H4(Liu e cols. J. Histochem. Cytochem. 2003 51: 1.065),MAB5242 (Chemicon), 7D9 (Kascsak e cols. 1987 J. Virol. 61:3.688), BDI115 (Biodesign International), SAF32, SAF53,SAF83, SAF84 (anticorpos SAF disponíveis por SPI Bio,França), 19B10 (W0 2004/4033628), 7VC (WO 2004/4033628),12F10 (SPI Bio) , PRI308 (SPI Bio), 34C9 (Prionics AG) , FabHuM-P (Peretz e cols. Nature 2001 412: 739), POM 1 até POM19 (Polymenidou e cols. 2005, supra) Fab HuM-Rl (Peretz1997, supra) e Fab HuM-R72 (Peretz 1997, supra) . Outrosanticorpos anti-príon podem ser facilmente gerados pormétodos que são bem conhecidos na técnica. Anticorpos anti-príon preferidos serão aqueles que se ligam a uma formadesnaturada do príon patogênico. Anticorpos anti-príonparticularmente preferidos serão aqueles que reconhecemepitopos na região do terminal N da proteína de príon.Alguns anticorpos anti-príon são específicos para aproteína de príon de uma espécie animal ou de um númerolimitado de espécies animais, outros são capazes de seligar às proteínas de príon de muitas espécies animais.Ficará evidente a escolha de anticorpos anti-príonadequados com base nas amostras a serem analisadas e nafinalidade do teste.

Em modalidades preferidas, o reagente peptóide éfornecido em um suporte sólido. 0 reagente peptóide podeser fornecido em um suporte sólido, antes do contato daamostra, ou o reagente peptóide pode ser adaptado paraligação ao suporte sólido após o contato da amostra, eligação de qualquer príon patogênico nele contido (porexemplo, pela utilização de um reagente peptóidebiotinilado e de um suporte sólido que compreende umaavidina ou estreptavidina).

Dessa forma, a invenção adicionalmente fornece ummétodo para detecção da presença de um príon patogênico emuma amostra, que compreende:

(a) o fornecimento de um primeiro reagente peptóide emum primeiro suporte sólido;

(b) o contato do primeiro suporte sólido com umaamostra, sob condições que permitem que as proteínas depríon patogênico, quando presentes na amostra, se liguem aoreagente peptóide para formar um primeiro complexo;

(c) remoção do material não ligado da amostra;

(d) a dissociação das proteínas de príon patogênico doprimeiro complexo; e

(e) a detecção dos príons patogênicos dissociados coma utilização de um reagente de ligação de príon.

0 reagente peptóide pode ser qualquer um daqueles aquidescritos, de preferência, o reagente peptóide é derivadode uma seqüência selecionada do que grupo consiste nos IDS.DE SEQ. NoS: 229-241. O reagente de ligação de príon é aquidescrito com mais detalhes. De preferência, o reagente deligação de príon é um anticorpo anti-príon. O primeirosuporte sólido é, de preferência, um glóbulo magnético,mais preferivelmente, um glóbulo de poliestireno/óxido deferro.

Métodos de anexação de um reagente peptóide em umsuporte sólido são convencionais na técnica, e são aquidescritos em outra seção, e incluem métodos bem conhecidosde anexação de proteínas e peptídeos a várias superfíciessólidas. A amostra é colocada em contato com o suportesólido que compreende o reagente peptóide sob condições quepermitem a que quaisquer proteínas de príon patogênico naamostra se liguem ao reagente peptóide, formando umprimeiro complexo. Essas condições de ligação sãofacilmente determinadas por aqueles habilitados na técnica,e são aqui descritas com mais detalhes. Tipicamente, ométodo é realizado nos poços de uma placa de microtitulaçãoou em tubos plásticos de pequeno volume, mas qualquerrecipiente conveniente será adequado. A amostra égeralmente uma amostra ou suspensão liquida, e pode seradicionada ao recipiente da reação, antes ou depois doreagente peptóide. Após o primeiro complexo serestabelecido, o material não ligado da amostra (ou seja,quaisquer componentes da amostra que não se ligaram aoreagente peptóide, incluindo qualquer proteína de príonpatogênico não ligada) pode ser removido por separação dosuporte sólido da solução da reação (que contém osmateriais não ligados da amostra), por exemplo, porcentrifugação, precipitação, filtração, força magnéticaetc. 0 suporte sólido com o primeiro complexo podeopcionalmente ser submetido a uma ou mais etapas de lavagempara a remoção de quaisquer materiais residuais da amostra,antes de se realizar as etapas seguintes do método.

Após a remoção de materiais não ligados da amostra ede quaisquer lavagens opcionais, as proteínas de príonpatogênico ligadas são dissociadas do primeiro complexo.

Essa dissociação pode ser obtida de várias formas. Em umamodalidade, um agente caotrópico, de preferência umcomposto de guanidínio, por exemplo, tiocioanato deguanidínio ou cloridrato de guanidínio, é adicionado atéuma concentração entre 3 M e 6 Μ. A adição do agentecaotrópico nessas concentrações faz com que a proteína depríon patogênico se dissocie do reagente peptóide, e tambémfaz com que a proteína de príon patogênico se desnature.

Em outra modalidade, a dissociação é obtida porelevação do pH até 12 ou mais ("pH elevado") ou diminuiçãodo pH até 2 menos ("pH reduzido"). A exposição do primeirocomplexo a um pH tanto elevado quanto reduzido produz adissociação da proteína de príon patogênico do reagentepeptóide, e faz com que a proteína de príon patogênico sedesnature. Nessa modalidade, prefere-se a exposição doprimeiro complexo a um pH elevado. Um pH entre 12,0 e 13,0é geralmente suficiente; de preferência, é usado um pHentre 12,5 e 13,0; mais preferivelmente, um pH de 12,7 a12,9; principalmente um pH de 12,9. Alternativamente, aexposição do primeiro complexo a um pH reduzido pode serusada para dissociar e desnaturar a proteína de príonpatogênico do reagente peptóide. Para essa alternativa, umpH entre 1,0 e 2,0 é suficiente. A exposição do primeirocomplexo tanto a um pH elevado quanto a um pH reduzido érealizada apenas por um período de tempo curto, porexemplo, 60 minutos, de preferência por, no máximo, 15minutos, mais preferivelmente, por, no máximo, 10 minutos.

Exposições mais longas do que essas podem produzir umadeterioração significativa da estrutura da proteína depríon patogênico, de tal forma que os epitopos reconhecidospor anticorpos anti-príon usados nas etapas de detecção sãodestruídos. Após exposição por tempo suficiente paradissociar a proteína de príon patogênico, o pH pode serfacilmente reajustado até o pH neutro (ou seja, pH entrecerca de 7,0 e 7,5) por adição de um reagente ácido (casosejam usadas condições de dissociação de pH elevado) ou umreagente básico (caso sejam usadas condições de dissociaçãode pH reduzido). Aqueles habilitados na técnica podemfacilmente determinar protocolos apropriados, e serão aquidescritos exemplos.Em geral, para efetuar uma condição de dissociação depH elevado, a adição de NaOH até uma concentração de cercade 0,05 N a cerca de 0,2 N é suficiente. De preferência,NaOH é adicionado até uma concentração entre 0,05 N a 0,15N; mais pref erivelmente, é usado 0,1 N de NaOH. Após aobtenção da dissociação do príon patogênico do reagentepeptóide, o pH pode ser reajustado até o pH neutro (ouseja, entre cerca de 7,0 e 7,5) por adição de quantidadesadequadas de uma solução ácida, por exemplo, ácidofosfórico, fosfato de sódio monobásico.

Em geral, para efetuar uma condição de dissociação depH reduzido, a adição de H3PO4 até uma concentração decerca de 0,2 M a cerca de 0,7 M é suficiente. Depreferência, H3PO4 é adicionado até uma concentração entre0,3 M e 0,6 M; mais pref erivelmente, é usado 0,5 M deH3PO4. Após a obtenção da dissociação do príon patogênicodo reagente peptóide, o pH pode ser reajustado até o pHneutro (ou seja, entre cerca de 7,0 e 7,5) por adição dequantidades adequadas de uma solução básica, por exemplo,NaOH ou KOH.

A proteína de príon patogênico dissociado é entãoseparada do suporte sólido que compreende o reagentepeptóide. Essa separação pode ser obtida de forma similar àremoção dos materiais não ligados da amostra descritaacima, exceto pelo fato de que a porção que contém osmateriais não ligados (agora a proteína de príon patogênicodissociado) é retida, e a porção do material de suportesólido é descartada.

A proteína de príon patogênico dissociado pode serdetectada com o uso de reagentes de ligação de príon.Vários desses agentes de ligação de príon são conhecidos eaqui descritos. Reagentes de ligação de príon preferidospara a detecção da proteína de príon patogênico dissociadosão anticorpos anti-príon. Foram descritos diversosanticorpos anti-príon, e muitos são disponíveiscomercialmente, por exemplo, Fab D18 (Peretz e cols. (2001)Nature 412: 739-743), 3F4 (disponível por Sigma Chemical StLouis MO; além disso, veja, a Patente U.S. N0 4.806.627),SAF-32 (Cayman Chemical, Aim Arbor MI) , 6H4 (Prionic AG,Suíça; além disso, veja a Patente U.S. N0 6.765.088), POMs1 até 19 (Polymenidou e cols. The Lancet 2005 4: 805) eoutros descritos acima e bem conhecidos na técnica. Asproteínas de príon patogênico dissociado podem serdetectadas em um ensaio do tipo ELISA, tanto como um ELISAdireto, quanto como um ensaio do tipo ELISA em sanduíche deanticorpo, que serão descritos com mais detalhesposteriormente. Embora o termo "ELISA" seja usado paradescrever a detecção com anticorpos anti-príon, o ensaionão se limita àqueles nos quais os anticorpos estão"ligados à enzima". Os anticorpos de detecção podem sermarcados com qualquer um dos marcadores detectáveis aquidescritos e bem conhecidos na técnica de imunoensaio.

Em uma modalidade do método, a proteína de príonpatogênico dissociado é revestida passivamente sobre asuperfície de um segundo suporte sólido. Métodos para esserevestimento passivo são bem conhecidos, e tipicamente sãorealizados em 100 mM de NaHCO3 em pH 8, por várias horas acerca de 37 0C ou de um dia para o outro a 4 °C. Outrostampões de revestimento são bem conhecidos (por exemplo, 50mM de carbonato, pH 9,6, 10 mM de Tris pH 8, ou 10 mM dePBS pH 7,2). O segundo suporte sólido pode ser qualquer umdos suportes sólidos aqui descritos ou bem conhecidos natécnica; de preferência, o segundo suporte sólido é umaplaca de microtitulação, por exemplo, uma placa depoliestireno de 96 poços. Quando a dissociação tiver sidorealizada com a utilização de uma concentração elevada deagente caotrópico, a concentração do agente caotrópico seráreduzida por diluição por pelo menos cerca de 2 vezes,antes do revestimento sobre o segundo suporte sólido.Quando a dissociação tiver sido realizada com o uso de umpH elevado ou reduzido, seguido por neutralização, aproteína de príon patogênico dissociado poderá ser usadapara revestimento, sem qualquer diluição adicional.

Após a proteína de príon patogênico dissociado serrevestida sobre o segundo suporte sólido, o suporte podeser lavado para a remoção de quaisquer componentes que nãoestejam aderidos ao suporte sólido. Anticorpos anti-príonsão adicionados sob condições que permitem a ligação dosanticorpos à proteína de príon revestida sobre o segundosuporte sólido. Caso a proteína de príon patogênicodissociado tenha sido desnaturada antes do revestimentosobre o segundo suporte sólido, os anticorpos usados serãoaqueles que se ligam à forma desnaturada da proteína depríon. Tais anticorpos incluem aqueles que são bemconhecidos (tais como aqueles descritos acima), bem comoanticorpos que são gerados por métodos bem conhecidos, porexemplo, pelo uso de rPrP, PrPc ou fragmentos destes, paradespertar uma reação imunológica em camundongos, coelhos,ratos etc. (veja as Patentes U.S. NoS 4.806.627, 6.165.784,6.528.269, 6.379.905, 6.261.790, 6.765.088, 5.846.533;ΕΡ8 91552Β1 e EP 909388Β1) . Anticorpos anti-príon quereconhecem epitopos na extremidade do terminal N daproteína de príon são particularmente preferidos, porexemplo, anticorpos que reconhecem epitopos dentro daregião dos resíduos 23-90.

Dessa forma, a invenção, em uma modalidade, fornece ummétodo para detecção da presença de um príon patogênico emuma amostra, que compreende:

(b) o contato do primeiro reagente peptóide com umaamostra, sob condições que permitem que as proteínas depríon patogênico, quando presentes na amostra, se liguem aoreagente peptóide para formar um primeiro complexo;

(c) remoção do material não ligado da amostra;

(d) a dissociação das proteínas de príon patogênico doprimeiro complexo;

(e) a separação das proteínas de príon patogênicodissociado do primeiro suporte sólido;

(f) o contato das proteínas de príon patogênicodissociado com um segundo suporte sólido sob condições quepermitem que a proteína de príon dissociado seja aderida aosegundo suporte sólido; e

(g) a detecção dos príons patogênicos aderidos nosegundo suporte sólido com a utilização de um reagente deligação de príon.

Nessa modalidade, o primeiro suporte sólido é, depreferência, um glóbulo magnético; o segundo suporte sólidoé, de preferência, a placa de microtitulação; o reagente deligação de príon é, de preferência, um anticorpo anti-príon, particularmente 3F4, 6H4, SAF32 ou um ou mais dosanticorpos POM descritos em Polymenidou, supra. 0 reagentede ligação de príon é marcado de forma detectável.

Em outra modalidade do método, as proteínas de príonpatogênico dissociado são detectadas com o uso de um ELISAdo tipo sanduíche de anticorpo. Nessa modalidade, aproteína de príon dissociado é "recapturada" em um segundosuporte sólido que compreende um primeiro anticorpo anti-príon. 0 segundo suporte sólido com a proteína de príonrecapturada é opcionalmente lavado para remover quaisquermateriais não ligados, e então colocado em contato com umsegundo anticorpo anti-príon sob condições que permitem queo segundo anticorpo anti-príon se ligue à proteína de príonrecapturada. 0 primeiro e o segundo anticorpos anti-príonserão tipicamente anticorpos diferentes e, de preferência,reconhecerão epitopos diferentes na proteína de príon. Porexemplo, o primeiro anticorpo anti-príon reconhecerá umepitopo na extremidade do terminal N da proteína de príon,e o segundo anticorpo anti-príon reconhecerá um epitopo naoutra extremidade que não o terminal N, ou vice-versa. 0primeiro anticorpo pode ser, por exemplo, SAF32, quereconhece um epitopo na região de octa-repetição (resíduos23-90), e o segundo anticorpo pode ser 3F4, que reconheceum epitopo nos resíduos 109-112; alternativamente, oprimeiro anticorpo pode ser 3F4 e o segundo anticorpo podeser SAF32. Outras combinações de primeiro e de segundoanticorpo podem ser facilmente selecionadas. Nessamodalidade, o segundo anticorpo anti-príon, mas não oprimeiro anticorpo anti-príon, será marcado de formadetectável. Quando a dissociação da proteína de príonpatogênico do reagente peptóide for realizada com o uso deum agente caotrópico, o agente caotrópico deverá serremovido ou diluído por pelo menos 15 vezes, antes darealização do ensaio de detecção. Quando a dissociação forefetuada com a utilização de um pH elevado ou reduzido, eneutralização, o príon dissociado poderá ser usado semdiluição adicional. Quando a proteína de príon patogênicodissociado for desnaturada antes da realização da detecção,tanto o primeiro quanto o segundo anticorpos irão se ligarà proteína de príon desnaturada.

Dessa forma, a invenção fornece um método paradetecção da presença de um príon patogênico em uma amostra,que compreende:

(a) o fornecimento de um primeiro reagente peptóidecomo aqui descrito em um primeiro suporte sólido;

(c) remoção do material não ligado da amostra;

(d) a dissociação das proteínas de príon patogênico doprimeiro complexo, pela qual a proteína de príon patogênicoé desnaturada;

(e) a separação das proteínas desnaturadas de príonpatogênico dissociado do primeiro suporte sólido;

(f) o contato das proteínas desnaturadas de príonpatogênico dissociado com um segundo suporte sólido, em queo segundo suporte sólido compreende um primeiro anticorpoanti-príon, sob condições que permitem que a proteína depríon dissociado se ligue ao primeiro anticorpo anti-príon;e(g) a detecção das proteínas de príon ligadas nosegundo suporte sólido com um segundo anticorpo anti-príon.

Nessa modalidade, o primeiro suporte sólido é, depreferência, um glóbulo magnético; o segundo suporte sólidoé, de preferência, uma placa de microtitulação ou umglóbulo magnético; o primeiro e o segundo anticorpos anti-príon são, de preferência, anticorpos diferentes; oprimeiro e o segundo anticorpos se ligam, de preferência, àproteína de príon desnaturada; de preferência, pelo menosum entre o primeiro ou segundo anticorpo anti-príonreconhece um epitopo na região do terminal N da proteína depríon. Em algumas modalidades, o segundo anticorpo anti-príon é marcado de forma detectável; em modalidadesadicionais, o segundo anticorpo anti-príon é marcado comenzima.

Qualquer um dos métodos de detecção para um príonpatogênico aqui descrito acima pode ser usado em um métodopara o diagnóstico de uma doença relacionada a príon.

Diagnóstico e tratamento

A invenção ainda fornece métodos de tratamento ouprevenção de uma doença relacionada a príon que compreendema administração a um animal de um ou mais reagentespeptóides, ou composições destes, como aqui descritos. Ainvenção também fornece métodos para a determinação de umnível de infecção por uma doença relacionada a príon em umanimal, que podem ser usados para se fazer o diagnóstico eavaliar a necessidade de tratamento ou prevenção. Caso sejanecessário tratamento ou prevenção, ele pode ou não serpara a doença relacionada a príon. Ou seja, caso sejadeterminado que não existe infecção por príon, o tratamentoou a prevenção pode ser necessário para uma doença,distúrbio, condição ou sintoma não relacionados a príons.Um tratamento como esse pode ser, por exemplo, ummedicamento convencional. A invenção também fornece métodosde identificação da localização da infecção relacionada apríons.

0 termo "tratamento" ou "que trata", como aqui usado,significa a cura, melhora ou reversão do progresso de umadoença ou distúrbio, ou melhora ou reversão de um ou maissintomas ou efeitos colaterais dessa doença ou distúrbio.

0 termo "administração", como aqui usado, significa aadministração direta do reagente peptóide ou da composiçãodeste, a qual irá fornecer uma quantidade eficazmenteterapêutica do reagente peptóide no animal receptor.

Como aqui usada, a frase "quantidade terapeuticamenteeficaz" refere-se à quantidade do reagente peptóide ativo,ou composição, que desperta a resposta biológica oumedicinal que se busca em um tecido, sistema, animal,indivíduo ou ser humano por um pesquisador, veterinário,médico ou outro profissional, que inclui um ou mais dosseguintes:

(1) a prevenção da doença; por exemplo, prevenção deuma doença, condição ou distúrbio em um indivíduo que podeestar predisposto à doença, condição ou distúrbio, masainda não apresenta ou exibe a patologia ou sintomatologiada doença;

(2) a inibição da doença; por exemplo, inibição de umadoença, condição ou distúrbio em um indivíduo que apresentaou que exibe a patologia ou sintomatologia da doença,condição ou distúrbio; e

(3) melhora da doença; por exemplo, melhora de umadoença, condição ou distúrbio em um indivíduo que apresentaou exibe a patologia ou sintomatologia da doença, condiçãoou distúrbio (ou seja, reversão da patologia e/ousintomatologia), por exemplo, por diminuição da gravidadeda doença.

Em algumas modalidades, o método compreende a obtençãode uma amostra do animal; detecção da presença de um príonpatogênico de acordo com qualquer um dos métodos dedetecção da invenção; e determinação do nível de doença deinfecção por príon pela presença ou ausência do príonpatogênico detectado.

Em algumas modalidades, é fornecido um método dedeterminação de uma localização de uma infecção por umadoença relacionada a príon em um animal, em que o métodocompreende a administração ao animal do reagente peptóideda invenção, ou da composição deste, em que o reagentepeptóide está ligado a um agente de formação de imagens; edetecção do agente de formação de imagens localizando,dessa forma, a infecção por uma doença relacionada a príonno animal.

Em algumas modalidades de um método de tratamento oude prevenção de uma doença relacionada a príon em umanimal, o método compreende a determinação da presença deum ou mais príons patogênicos no animal de acordo com ummétodo de detecção da invenção; a seguir, a administraçãode um ou mais reagentes peptóides da invenção, oucomposições que os contenham, ao animal, após adeterminação de que um ou mais príons patogênicos estãopresentes; ou a administração de um ou mais medicamentosconvencionais ao animal, após a determinação de que um oumais príons patogênicos não estão presentes. Em algumasmodalidades, o método compreende a administração de um oumais medicamentos convencionais ao animal, após adeterminação de que uma infecção por uma doença relacionadaa príon está presente. Em algumas modalidades, a amostrapara o teste compreende um material de um órgão, células,sangue total, uma fração sangüínea, um componentesangüíneo, plasma, plaquetas, soro, líquidocefalorraquidiano (LCR), tecido cerebral, tecido do sistemanervoso, tecido muscular, tecido muscular e gorduroso,medula óssea, urina, lágrimas, ou tecido que não seja dosistema nervoso.

Em algumas modalidades do método de tratamento ou deprevenção de doença relacionada a príon em um animal, ométodo compreende a administração ao animal de uma primeiradose que compreende um reagente peptóide da invenção, oucomposição que o contenha, e a administração ao animal deuma segunda dose que compreende um reagente peptóide dainvenção, ou composição que o contenha, em uma quantidadesuficiente para induzir uma resposta imunológica no animal.O termo "resposta imunológica", como aqui usado, é odesenvolvimento, no animal, de uma resposta imunológicahumoral e/ou uma resposta imunológica celular a um reagentepeptóide, por exemplo, quando o reagente peptóide estápresente em uma vacina. Dessa forma, a resposta imunológicageralmente resulta no desenvolvimento, no animal, de umaresposta imunológica secretora, celular e/ou mediada poranticorpos. Normalmente, essa resposta inclui, semlimitação, um ou mais dos seguintes efeitos: a produção deanticorpos de qualquer uma das classes imunológicas, porexemplo, imunoglobulinas A, D, E, G ou M, a proliferação delinfócitos B e T, a geração de sinais de ativação,crescimento e diferenciação às células imunológicas, eexpansão de células T auxiliares (helper), células Tsupressoras e/ou células T citotóxicas. A quantidade deanticorpos produzida irá variar, dependendo de váriosfatores, que incluem o animal envolvido, o número de dosesda composição administrada, a presença de um adjuvante etc.

Algumas composições de reagente peptóide da invençãoainda contêm um adjuvante. Em algumas dessas modalidades dométodo de tratamento ou de prevenção de doença relacionadaa príon em um animal, a primeira dose e/ou a segunda dosecompreende pelo menos um adjuvante. Em algumas dessasmodalidades, tanto a primeira quanto a segunda doses contêmum adjuvante. Exemplos não limitantes de adjuvantes úteisnas doses e composições da invenção incluem aqueles em WO05/016127, aqui incorporado em sua totalidade.

Em algumas modalidades do método de tratamento ou deprevenção de doença relacionada a prxon em um animal, oanimal foi diagnosticado como infectado com um príonpatogênico. Em algumas modalidades, o animal esteveintimamente próximo a um animal que foi diagnosticado comoinfectado com um príon patogênico. "Intimamente próximo"refere-se ao fato de o animal estar no mesmo rebanho oucomunidade de animais, na mesma fazenda, rancho ousemelhantes, ou ter sido transportado, processado etc., como animal diagnosticado. Em algumas modalidades, o animal éum membro da família de um segundo animal que foidiagnosticado como infectado com um príon patogênico. Emalgumas modalidades, o animal exibe sintomas associados auma doença relacionada a príon. Em algumas modalidades, oanimal está em risco para uma doença relacionada a príon.Um animal "em risco" pode ser aquele que tem umapredisposição, geneticamente ou de algum outro tipo, porexemplo, ambientalmente, em direção ao desenvolvimento,aquisição, recepção, ser exposto, ou semelhantes, a umadoença relacionada a príon. Uma predisposição ambientalinclui, por exemplo, um animal e um rebanho ou comunidadeque vive em uma área, geográfica ou fisicamente, onde houveexposição a uma doença relacionada a príon. Em algumasmodalidades, o animal em risco é um descendente de umanimal infectado, ou suspeito de estar infectado, com umpríon patogênico. Em algumas modalidades, o animal em riscoingeriu materiais biológicos derivados de um segundoanimal, em que o segundo animal está infectado ou em riscopara uma doença relacionada a príon.

Uma composição que compreende a primeira dose pode sera mesma ou diferente daquela da segunda dose. Em algumasmodalidades, a composição da segunda dose é a mesma queaquela da primeira dose. Em algumas modalidades, ascomposições da primeira e da segunda doses são diferentes.Em algumas modalidades, o método ainda compreende aadministração de um medicamento convencional. Em algumasmodalidades, o medicamento convencional compreendeanticorpos, oligonucleotídeos, compostos orgânicos oupeptideomimético. Em algumas modalidades, o medicamentoconvencional é um antígeno ou agente imunorregulador como,por exemplo, imunoglobulinas, citocinas, linfocinas equimiocinas, incluindo, sem limitação, interleucina 2 (IL-2) , IL-2 modificada (cysl25-serl25), fator estimulante demacrófagos granulócitos (GM-CSF), interleucina 12 (IL-12) ,interferon alfa ou gama, quimiocina IP-IO e quimiocinas β,por exemplo, RANTES, ΜΙΡ1-α e ΜΙΡ1-β.

O animal em qualquer um dos métodos de tratamento eprevenção da invenção compreende seres humanos ou nãohumanos. Para animais não humanos, o animal pode serselvagem, ou seja, não domestiçado, por exemplo, veado,alces, alce americano, antílope, urso, cabrito montês,lhama, bisão, cavalos, mulas e asnos, grandes felinos decaça, tais como panteras, leões da montanha, puma, tigres,leões e leopardos, e mamíferos menores, por exemplo,coelhos, marmotas norte-americanas, guaxinins, gambá, esemelhantes, ou pássaros; ou animais domesticados,incluindo, por exemplo, animais de estimação domesticados,por exemplo, gatos, cachorros, furões, coelhos, ratos oucamundongos, animais de criação e semoventes, por exemplo,vacas, gado, carneiro, porcos, cabras, cavalos, mulas easnos, ou aves, por exemplo, frangos, galinhas, patos,gansos, perus, e outros pássaros galináceos, e animais delaboratório, por exemplo, primatas não humanos, tais comomicos, macacos e lêmures e roedores, tais como camundongos,ratos, hamsters e porquinhos-da-índia. Animais adequadospara uso com a invenção podem ser de qualquer idade,incluindo tanto adultos quanto recém-nascidos. Em algumasmodalidades, o animal é um mamífero. Em algumasmodalidades, o mamífero é um ser humano. Em algumasmodalidades, o mamífero é um não humano. Em algumasmodalidades, a composição é administrada como aqui descritoacima. Em algumas modalidades, o mamífero compreende umgato, cachorro, furão, coelho, rato, camundongo, vaca,novilho, carneiro, carneiro, porco, cabra, cavalo, mula,asno, veado, alces, urso, bisão, puma, leão da montanha,mico, macaco, lêmure, hamster ou porquinho-da-índia. Emalgumas modalidades, o mamífero compreende vacas, novilhos,veados, carneiros, ovelhas, porcos ou cabras. Em algumasmodalidades, a composição é administrada por viaintramuscular, intramucosa, intranasal, subcutânea,intradérmica, transdérmica, intravaginal, intra-retal, oralou intravenosa.

Isolamento, redução e eliminação

A presente invenção também fornece métodos para oisolamento de um príon patogênico de uma amostra ou deredução da quantidade de um príon patogênico em umaamostra.

0 método de isolamento de um príon patogênico de umaamostra compreende o fornecimento de um suporte sólido quecompreende um reagente peptóide da invenção; o contato dosuporte sólido com a amostra, sob condições que permitem aligação do príon patogênico, se presente na amostra, aoreagente peptóide para formar um complexo, e depois aremoção da amostra não ligada fornecendo, dessa forma,príon patogênico isolado. Em algumas modalidades, o métodoainda compreende a dissociação do príon patogênico docomplexo.

O método para redução da quantidade do príonpatogênico em uma amostra compreende o fornecimento de umsuporte sólido que compreende um reagente peptóide dainvenção; a seguir, o contato do suporte sólido com aamostra, sob condições que permitem a ligação do príonpatogênico, se presente na amostra, ao reagente peptóide dosuporte; e a recuperação da amostra não ligada fornecendo,dessa forma, amostra com uma quantidade reduzida do príonpatogênico. Em algumas modalidades, a quantidade do príonpatogênico é reduzida abaixo de um nível detectável. Emalgumas modalidades, a quantidade do príon patogênico éreduzida em torno de 80 a 100, cerca de 85 a 100, cerca de90 a 100 ou de cerca de 95 a 100%.

A invenção ainda fornece um método de preparação de umsuprimento sangüíneo que é substancialmente livre de umpríon patogênico, em que suprimento sangüíneo compreendeamostras de sangue coletadas, tais como aquelas de um bancode sangue, ou aquelas coletadas de um paciente antes de umacirurgia, por exemplo, uma autotransfusão durante cirurgia.O suprimento sangüíneo pode incluir, por exemplo, e semlimitação, sangue total, plasma, plaquetas ou soro. Emalgumas modalidades, o método compreende a detecção dapresença ou ausência de príon patogênico em diversasamostras de acordo com um método de detecção da invenção, ea combinação das amostras nas quais o príon patogênico nãoé detectado gerando, desse modo, um suprimento sangüíneoque é substancialmente livre do príon patogênico. Emalgumas modalidades, o método de detecção da invençãocompreende permitir que um reagente peptóide se ligue aopríon patogênico, se presente, para formar um complexo, e adetecção da presença do príon patogênico na amostra por sualigação ao reagente peptóide. Em algumas modalidades, aligação do príon patogênico ao reagente peptóide pode serdetectada por detecção da formação do complexo, a formaçãodo complexo sendo indicativa da presença do prionpatogênico. Em algumas modalidades, o complexo quecompreende o reagente peptóide e a proteína de príonpatogênico é separado do resto da amostra (ou seja, daamostra não ligada), antes da detecção. Em algumasmodalidades, a formação do complexo pode ser detectada pordetecção do príon patogênico no complexo ou por dissociaçãodo complexo (após a separação da amostra não ligada) edetecção do príon patogênico dissociado.

A invenção também fornece um método de preparação deum produto alimentício, por exemplo, suprimento de carne(por exemplo, tecido muscular e gorduroso (ou seja, carne)de gado, carneiro ou porco, por exemplo, carne de boi,carneiro, carne de carneiro ou carne de porco, usado paraconsumo humano ou animal) que é substancialmente livre depríons patogênicos. Em algumas modalidades, o métodocompreende a detecção da presença ou ausência de príonpatogênico em diversas amostras de acordo com um método dedetecção da invenção, e a combinação das amostras nas quaiso príon patogênico não é detectado fornecendo, dessa forma,o produto alimentício que é substancialmente livre do príonpatogênico. Em algumas modalidades, o produto alimentício écoletado de um organismo vivo ou falecido que fará parte doproduto alimentício, ou de alimento que se deseja incluirno produto alimentício. Em algumas modalidades, o método dedetecção da invenção compreende permitir que um reagentepeptóide se ligue ao príon patogênico, se presente, paraformar um complexo, e a detecção da presença do príonpatogênico na amostra por sua ligação ao reagente peptóide.Em algumas modalidades, a ligação do príon patogênico aoreagente peptóide pode ser detectada por detecção daformação do complexo, a formação do complexo sendoindicativa da presença do príon patogênico. Em algumasmodalidades, o complexo que compreende o reagente peptóidee a proteína de príon patogênico é separado do resto daamostra (ou seja, da amostra não ligada), antes dadetecção. Em algumas modalidades, a formação do complexopode ser detectada por detecção do príon patogênico nocomplexo ou por dissociação do complexo (após a separaçãoda amostra não ligada) e detecção do príon patogênicodissociado.

Projetos

É fornecido ainda pela invenção um método de projetode um reagente peptóide da invenção. Como ponto de partida,o reagente peptóide pode ser projetado com base nasseqüências de certos fragmentos peptídicos de uma proteínade príon (por exemplo, fragmentos peptídicos que possuem osIDS. DE SEQ. Nos: 12-228) realizando-se substituições deresíduos de aminoácidos na seqüência do fragmento peptídicocom glicinas N-substituídas, síntese do peptídeo modificadocom a utilização dos métodos descritos nas Patentes U.S.Nos 5.811.387, 5.831.005, 5.877.278, 5.977.301 e 6.033.631,bem como em Simon e cols. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA89: 9.367, cujas publicações são aqui incorporadas porreferência em sua totalidade, testes do peptídeo modificadoquanto à ligação às proteínas de príon patogênico pelosmétodos aqui descritos. Podem ser feitas substituiçõesadicionais de acordo com o esquema de substituição abaixo,até que seja obtido um reagente peptóide adequado.

Além disso, o projeto do reagente peptóide podecompreender aspectos do Protocolo de Síntese de Fase Sólidapara Peptóides descrito no Exemplo 5, abaixo.

Em algumas modalidades, o método de produção de umreagente peptóide da invenção compreende:

a) o fornecimento de um fragmento peptídico de umaproteína de príon; a substituição de um primeiro aminoácidode um fragmento peptídico com uma glicina N-substituídapelo seguinte esquema de substituição:

i) Ala, Gly, Ile, Leu, Pro e Val são substituídos por N-(alquil)glicina, N-(aralquil)glicina ou N-(heteroarilalquil)glicina;

ii) Asp, Asn, Cys, Gln, Glu, Met, Ser e Thr sãosubstituídos por N-(hidroxialquil)glicina, N-(alcóxi)glicina, N-(aminoalquil)glicina ou N-(guanidinoalquil)glicina;

iii) Phe, Trp e Tyr são substituídos por N-(aralquil)glicina, N-(heteroarilalquil)glicina, N-(hidroxiaralquil)glicina ou N-(alcoxiaralquil)glicina; e

iv) Arg, His e Lys são substituídos por N-(aminoalquil)glicina ou N-(guanidinoalquil)glicina;

b) substituição de um segundo aminoácido do fragmentopeptídico com uma glicina N-substituída de acordo com aEtapa (a);

c) substituição de um terceiro aminoácido do fragmentopeptídico com uma glicina N-substituída de acordo com Etapa(a) ; e

d) opcionalmente, repetindo-se a etapa (c) 1-27 vezesgerando, dessa forma, um reagente peptóide projetado quecompreende 3 a 30 glicinas N-substituídas; e, síntese doreagente peptóide projetado.Em algumas modalidades do método acima, o fragmentopeptídico compreende um peptídeo que possui uma seqüênciaselecionada do que grupo consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 12,13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25 , 26, 2728, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, 35 , 36, 37, 38, 39, 40 , 41, 4243, 44, 45 , 46, 47, 48, 49, 50 , 51, 52, 53, 54, 55 , 56, 5758, 59, 60 , 61, 62, 63, 64, 65 , 66, 67, 68, 69, 70 , 71, 7273, 74, 75 , 76, 77, 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84, 85 , 86, 8788, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97 , 98 , 99, 100, 101102 , 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113114 , 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125126 , 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 135, 137138 , 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149150 , 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161162 , 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173174 , 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185186 , 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209,210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221,222, 223, 224, 225, 226, 227 e 228.

Em algumas modalidades do método acima, o fragmentopeptídico compreende um peptídeo que possui uma seqüênciaselecionada do que grupo consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 66,67, 68, 72 , 81, 96, 97, 98, 107, 108, 109, 14, 35 , 36, 3740, 50, 51 , 77, 89, 100, 101 , 110 , 56, 57, 65, 82, ^t1 00 111112, 113, 114, 115, 116, 117 , 118 , 119 , 120, 121, 122, 123124, 125, 126, 127, 128, 129 , 130 , 131 , 132, 133, 134, 135136, 137, 138, 139, 140, 141 , 142 , 143 , 144, 145, 146, 147148 , 149, 150, 151, 152, 153 , 154 , 155 , 156, 157, 158, 159160, 161, 162, 163, 164, 165 , 166 , 167 , 168, 169, 170, 171172, 173, 174, 175, 176, 177, 278, 279, 180, 181, 182, 183184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219220, 221, 222, 223, 224, 225 e 228

Em algumas modalidades do método acima, o fragmentopeptidico compreende um peptídeo que possui uma seqüênciaselecionada do que grupo consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 12,

14, 50, 51 , 52, 68, 72, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133,134, 135, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145,146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157,158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169,170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181,182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193,194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205,206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217,218 e 219.

Em algumas modalidades do método acima, o fragmentopeptidico compreende um peptídeo que possui uma seqüênciaselecionada do que grupo consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 14,

50, 51, 52, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169170, 171 , 172, 173 , 174 , 175 , 176, 177, 178, 179, 180, 181182, 183 , 184, 185 , 186 , 187 , 188, 189, 190, 191, 192, 193194, 195 , 196, 197 , 198 , 199 , 200, 201, 202, 203, 204, 205206, 207 , 208, 209 , 210 , 211 , 212, 213, 214, 215, 216, 217218 e 219.

Em algumas modalidades do método acima, o fragmentopeptidico compreende um peptídeo que possui uma seqüênciaselecionada do que grupo consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 12,68, 72, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124,125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136,137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, e160.

Em algumas modalidades do método de projeto doreagente peptóide, o fragmento peptídico compreende umpeptídeo que possui uma seqüência selecionada do que grupoconsiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 12, 14, 50, 51, 52, 67, 68,72 e 109. Em algumas modalidades, o fragmento peptídicocompreende um peptídeo que possui uma seqüência do ID. DESEQ. N0: 14 ou 68.

Em algumas modalidades, o método ainda compreende aadição ao reagente peptóide de uma porção conjugadaselecionada de uma molécula efetora, um substrato ou ummarcador, cada um opcionalmente anexado ao reagentepeptóide através de uma porção ligante. Em algumasmodalidades, a porção conjugada compreende biotina. Emalgumas modalidades, a porção conjugada compreende um grupomercapto.

Outros usos

A invenção também fornece um suporte sólido quecompreende pelo menos um reagente peptóide da invenção. Osuporte sólido pode ser como aqui previamente descritoacima. A invenção ainda fornece um kit para a detecção dapresença de um príon patogênico em uma amostra. Em algumasmodalidades, o kit compreende um reagente peptóide dainvenção. Em algumas modalidades, o kit compreende umsuporte sólido que compreende um reagente peptóide dainvenção. Em algumas modalidades, o kit compreende umsuporte sólido que compreende um reagente peptóide dainvenção e um reagente. O reagente pode ser, por exemplo, esem limitação, um reagente de detecção, por exemplo, umanticorpo marcado de forma detectável, cromóforo,cromógeno, um reagente de ligação de príon, por exemplo,anticorpos anti-prion, polipeptídeos híbridos enxertadoscom motivo, polímeros catiônicos ou aniônicos,catalisadores da propagação e plasminogênio ou um tampão.Em algumas modalidades, o kit compreende dois ou maisreagentes peptóides da invenção. Em algumas modalidades dokit, são opcionalmente incluídos controles positivos e/ounegativos.

A fim de que a invenção aqui revelada possa serentendida mais eficientemente, serão fornecidos a seguirexemplos. Deve-se entender que esses exemplos têmfinalidade apenas ilustrativa, e não devem ser consideradoscomo limitantes da invenção de forma alguma.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Seqüências da região peptóide

A Tabela 1 lista regiões peptóides de exemplo(direcionadas do amino para carbóxi) adequadas para apreparação dos reagentes peptóides da presente invenção. ATabela 2 fornece os significados das abreviações usadas naTabela 1. A Tabela 3 fornece as estruturas relevantes decada uma das seqüências. Os reagentes peptóides que contêmas seqüências de Tabela 1 foram testados quanto à ligaçãopreferencial ao PrPsc, de acordo com os ensaios aquidescritos. As preparações dos reagentes específicos serãoaqui descritas a seguir.Tabela 1: Regiões peptõides representativas para os

<table>table see original document page 116</column></row><table>

Tabela 2. Significados das abreviações da Tabela 1.

<table>table see original document page 116</column></row><table><table>table see original document page 117</column></row><table><table>table see original document page 118</column></row><table><table>table see original document page 119</column></row><table>

Exemplo 2

Reagentes peptõides

Os reagentes peptóides a seguir foram preparados com ouso dos métodos sintéticos para a preparação de moléculaspeptóides que contêm resíduos de glicina N-substituída,como os procedimentos revelados nas Patentes U.S. Nos5.811.387, 5.831.005, 5.877.278, 5.977.301 e 6.033.631, bemcomo em Simon e cols. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:9.367, cada uma delas aqui incorporada por referência emsua totalidade, e com o uso do protocolo descrito noExemplo 5. Cada um dos reagentes abaixo foi testado quantoà afinidade de ligação por uma proteína de príon de acordocom os ensaios aqui descritos.

Reagente peptõide I

0 reagente peptóide abaixo compreende o ID. DE SEQ.N°: 229.Massa calculada: 1.054,42; Massa observada: 1.054,2

Todas as medições da massa observada foram medidas em umSistema de Micromassa ZQ LC/MS Waters (Milford, MA).Reagente peptõide II

O reagente peptóide abaixo compreende o ID. DE SEQ.N°: 230

<formula>formula see original document page 120</formula>

Massa calculada: 1.290,70; Massa observada: 1.290,8.Reagente peptóide III

O reagente peptóide abaixo compreende o ID. DE SEQ.N°: 231.

<formula>formula see original document page 120</formula>

Massa calculada: 1.861,30; Massa observada: 1.861,6.Reagente peptóide IV

O reagente peptóide abaixo compreende o ID. DE SEQ.N°: 232.

<formula>formula see original document page 120</formula>

Reagente peptóide VO reagente peptóide abaixo compreende o ID. DE SEQ.N°: 233.

<formula>formula see original document page 121</formula>

Reagente peptóide VI

O reagente peptóide abaixo compreende o ID. DE SEQ.

<formula>formula see original document page 121</formula>

Massa calculada: 1.956,49; Massa observada: 1.956,2.

Reagente peptóide VII

O reagente peptóide abaixo compreende o ID. DE SEQ.N°: 235.

<formula>formula see original document page 121</formula>

Massa calculada: 1.8 96,39; Massa observada: 1.8 96,4.

Reagente peptóide VIII

O reagente peptóide abaixo compreende o ID. DE SEQ.N°: 236.

<formula>formula see original document page 121</formula>

Massa calculada: 1.732,18; Massa observada: 1.732,4.

Reagente peptóide IX

O reagente peptóide abaixo compreende o ID. DE SEQ.N°: 237.<formula>formula see original document page 122</formula>

Massa calculada: 1.248,65; Massa observada: 1.248,4.

Reagente peptõide X

O reagente peptóide abaixo compreende o ID. DE SEQ.N0: 238

<formula>formula see original document page 122</formula>

Massa calculada: 1.248,65; Massa observada: 1.248,4.

Reagentes peptóides XIa e XIb

Os reagentes peptóides abaixo, XIa e XIb, compreendemo ID. DE SEQ. N0: 239.

<formula>formula see original document page 122</formula>

XIa: Massa calculada: 1.3 04,76; Massa observada: 1.3 04,6.

XIb: Massa calculada: 1.166,59; Massa observada: 1.166,2.

Reagentes peptóides XIIa e XIIb

Os reagentes peptóides abaixo de fórmulas XIIa e XIIbcompreendem o ID. DE SEQ. N°: 240.<formula>formula see original document page 123</formula>

XIIa: Massa calculada: 1.276,71; Massa observada: 1.276,6.Reagente peptõide XIII

O reagente peptóide abaixo compreende o ID. DE SEQ.N°: 241.

<formula>formula see original document page 123</formula>

Massa calculada: 1.256,58; Massa observada: 1.256,6.

Exemplo 3

Ensaios de ligaçãoEnsaio pull-down

Os reagentes peptóides do Exemplo 2 foram testadosquanto à sua habilidade para se ligar especificamente àsproteínas de príon patogênico com o uso de um ensaio pull-down (atração) de glóbulo magnético. Para esse ensaio, osreagentes peptóides foram anexados a glóbulos magnéticos emuma de duas formas: 1) os reagentes peptóides forammarcados com biotina, o que permitiu a adesão aos glóbulosmagnéticos revestidos com estreptavidina, ou 2) ospeptóides foram ligados covalentemente aos glóbulosmagnéticos através de um ácido propiônico de tiol. O modode adesão do reagente peptóide aos glóbulos teve poucoefeito na atividade de ligação do reagente peptóide; noentanto, quando os reagentes peptóides eram anexadoscovalentemente aos glóbulos, foi observada menosinterferência de fundo das amostras de plasma usadas comodiluente. Os glóbulos magnéticos foram obtidos de Dynal(Brown Deer, WI). Tipicamente, dez microlitros (10 μL) deDynabeadse de Estreptavidina M-280 (cat # 112.05) foramusados para a reação pull-down única com o uso de reagentepeptóide biotinilado.

Homogeneizados de cérebro humano (10% p/v em 0,25 M deSacarose) de pacientes com CJD falecidos e de indivíduosfalecidos saudáveis (ou seja, sem CJD) foram obtidos do"National Institute for Biological Standards and Controls"(NIBSC), Blanche Lane South Mimms, Pottersbar, Reino Unido.Para a maioria dos experimentos aqui descritos, amostras de3 pacientes com CJD (um paciente sem CJD e dois pacientescom CJD) foram combinadas, e foram feitos ensaios nasamostras combinadas de homogeneizado cerebral. Alíquotas de200 μL foram diluídas 1:1, vol:vol, em tampão de TBS (50 mMde Tris-HCl pH 7,5 e 37,5 mM de NaCl) contendo Triton XlOO1% e Tween-20 1%, e as amostras sonifiçadas por váriasrepetições de vários segundos cada. As alíquotas dehomogeneizado cerebral foram mantidas a -70°C.

Para avaliar a ligação do reagente peptóide ao PrPsc,homogeneizados cerebrais com CJD foram salpicados em plasmahumano de um indivíduo saudável. Em geral, foram usadasduas amostras de controle negativo: 1) plasma humanonormal, e 2) plasma humano normal salpicado com normalhomogeneizado de cérebro humano (sem CJD). A concentração-padrão do ensaio de plasma humano variou de 0 até 80% dovolume total da amostra.

Em um protocolo típico, para um teste pull-down (100μl finais em um poço de placa de microtitulação de 96poços), são usados 10 μΐ de Dynabeads® de Estreptavidina M-280 (cat # 112.05). A quantidade adequada de glóbulos élavada uma vez, antes do uso com TBS contendo Tween-20 1% eTriton X-100 1% (TBSTT). Os péletes de glóbulos sãoressuspensos em 10 vezes o volume original, ou seja, 100μΐ, com TBSTT. A seguir, 0,1 μΐ de estoque de reagentepeptóide biotinilado (10 mM em H2O) é adicionado à soluçãode glóbulos, misturado em temperatura ambiente, a 750 rpm(Eppendorf, Thermomixer R) por 1 hora ou 30 minutos a 750rpm a 37°C. Os sobrenadantes contendo peptóides não ligadossão descartados, e os glóbulos são lavados três vezes com ouso de TBS e Tween-20 0,05% (TBST), usando aparelho de ímãque mantém os glóbulos no fundo do tubo. Nesse estágio, sãoobtidos os glóbulos magnéticos de estreptavidina revestidoscom peptóide reagente. A seguir, os glóbulos magnéticosrevestidos com peptóide (representando o volume de partidaoriginal em μΐ) são misturados com várias concentrações dehomogeneizado cerebral com CJD 10% na presença de plasma(concentração final de 0-80%), Ix TBS, Triton XlOO 1% eTween-20 1%, em um volume final de 100 μΐ. Um volume dereação típico é de 100 μΐ em poço de uma placa de 96 poços.A placa é agitada a 750 rpm (Eppendorf, Thermomixer R) por1 hora a 37°C. Os glóbulos são lavados para a remoção deproteína não ligada, quatro vezes com solução de TBScontendo Tween-20 0,05%, usando uma lavadora de placasELx405 Magna (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT).Essa lavadora de placas de microtitulação é projetadaespecificamente para aplicações que utilizam a tecnologiade glóbulos magnéticos. Um segundo veículo posiciona aplaca do ímã próximo ao fundo da microplaca, fixando osglóbulos magnéticos durante os ciclos de aspiraçãocríticos.

ELISA

Após a lavagem final do ensaio pull-pown, o PrPsc éeluído dos glóbulos, desnaturado e detectado com anticorposmonoclonais (mAb) anti-príon em formato ELISA (ensaioimunoabsorvente ligado à enzima). Em um formato de ensaio(um ELISA indireto), a detecção de mAb anti-príon, que éproporcional à quantidade ligada ao PrPsc, é obtida comanticorpo policlonal secundário que reconhece o anticorpomonoclonal primário. O anticorpo secundário é conjugado àenzima fosfatase alcalina. Quando incubada com substratoquimioluminescente, a enzima quebra um composto químico,produzindo uma emissão de luz que é medida por uma leitorapadronizada de quimioluminescência de microplacas. Asunidades medidas são definidas como unidades relativas deluz (RLU). No segundo formato (um ELISA direto), a detecçãoé feita com o uso de anticorpos monoclonais (mAb) anti-príon que são conjugados à fosfatase alcalina e, dessaforma, não é necessário anticorpo secundário. 0 mesmosubstrato quimioluminescente (Lumi-Phos Plus de LumingenfInc.) é usado para ambos os formatos. Formatos de ELISA emsanduíche também podem ser utilizados, como aqui descrito.0 ELISA pode ser realizado em qualquer um dentre diversosformatos, por exemplo, em placas, em glóbulos, empartículas magnéticas. 0 príon desnaturado eluído pode serrevestido passivamente sobre um suporte sólido, ou pode serligado em um arranjo do tipo em sanduíche anticorpo-antígeno, o anticorpo anti-príon sendo revestido sobre osuporte sólido.

Resultados

Os resultados dos ensaios de ligação ELISA serãoresumidos abaixo.

A maioria dos reagentes peptóides representativos dainvenção testados possui eficiência de ligação similaràquela do peptídeo do ID. DE SEQ. N°: 68. Em estudosprévios, o peptídeo do ID. DE SEQ. N°: 68 teve boaeficiência de ligação para as proteínas de príon (veja, porexemplo, Pedido de Patente U.S. N0 de Série 11/056.950,depositado em 11 de fevereiro de 2005) e, desse modo, foiusado como um referencial para medir as eficiências deligação dos reagentes peptóides da invenção. Os dados naTabela 4 mostram os sinais obtidos em ensaios pull-down/ELISA usando vários reagentes peptóides, comparado comum reagente peptídico (ID. DE SEQ. N°: 68, descrito nospedidos U.S. de co-propriedade N0 de Série 10/917.646,depositado em 13 de agosto de 2004, U.S. N0 de Série11/056.950, depositado em 11 de fevereiro de 2005 e PedidoInternacional PCT/US2004/026363, depositado em 13 de agostode 2004). São mostrados os sinais de uma amostra de 1 μΐ deum homogeneizado cerebral de CJD 10%, ou de uma amostra de1 μΐ de um homogeneizado cerebral normal 10%, ambos emplasma 70%. A coluna mais à direita registra a médiaexperimental dos ensaios de reagente peptóide como a% damédia experimental do ensaio do peptídeo do ID. DE SEQ. N°:68 .

Tabela 4: Percentual de ligação de reagentes peptóidesrepresentativos em plasma humano 7 0%, comparado com opeptídeo do ID. DE SEQ. N°: 68.<table>table see original document page 128</column></row><table>

*DP = desvio padrão.

Tabela 5: Percentual de ligação de reagentes peptóidesrepresentativos em plasma humano 7 0%, comparado com opeptídeo do ID. DE SEQ. N°: 68.

<table>table see original document page 128</column></row><table>*DP = desvio padrão.

Tabela 6: Percentual de ligação de reagentes peptóidesrepresentativos em plasma humano 20%, comparado com opeptídeo do ID. DE SEQ. N°: 68.

<table>table see original document page 129</column></row><table>

*DP = desvio padrão.

Como mostrado nas Tabelas 4 e 5, em plasma 70%, muitosdos reagentes peptóides representativos testadosapresentaram uma afinidade de ligação maior do que aquelado peptídeo de referência, ID. DE SEQ. N0 68, efreqüentemente aproximadamente 10 a 25% maios. As Tabelas 4e 5 também mostram a especificidade dos reagentes peptóidespara a forma patogênica da proteína de príon (espera-se queapenas a forma não patogênica da proteína de príon estejapresente nos homogeneizados cerebrais normais). A Tabela 6mostra os resultados de ensaios pull-down/ELISA comreagentes peptóides em homogeneizados cerebrais com CJDdiluídos em plasma humano 20%.Tabela 7: Percentual de ligação de um reagentepeptóide representativo ligado diretamente aos glóbulosmagnéticos em plasma humano 70%, comparado com o peptídeodo ID. DE SEQ. N°: 68.

<table>table see original document page 130</column></row><table>

*DP = desvio padrão.

O reagente peptóide que compreende o ID. DE SEQ. N°:240 (XIIb) foi ligado covalentemente aos glóbulosmagnéticos; o peptídeo que compreende o ID. DE SEQ. N°: 68também foi ligado covalentemente aos glóbulos magnéticos.Os reagentes ligados covalentemente foram usados em umareação pull-down/ELISA, como descrito acima, para osreagentes peptóides e peptídeos biotinilados ligados aosglóbulos de estreptavidina. A ligação covalente dosreagentes aos glóbulos não afetou significativamente ahabilidade dos glóbulos para interagir preferivelmente comos príons patogênicos.

Especificidade de reagentes para a forma patogênicaComo mostrado nas Tabelas 4 e 5 acima, os reagentespeptóides podem atrair o PrPsc que está presente emhomogeneizados cerebrais humanos de pacientes com CJD, masnão puxam nenhum do PrPc presente em plasma humano ou nohomogeneizado de cérebro humano normal de controle.Experimentos adicionais que comparam a ligação dosreagentes peptóides aos homogeneizados cerebrais com CJD ehomogeneizados cerebrais normais (ou seja, sem CJD) sãomostrados abaixo.

Tabela 8. Ligação de reagentes peptóides a 2microlitros de homogeneizado cerebral 10% normal ouhomogeneizado cerebral com CJD em plasma humano 70%.

<table>table see original document page 131</column></row><table>

Tabela 9. Ligação de reagentes peptóides a 0,1microlitro de homogeneizado cerebral de CJD 10% ou 1microlitro de 10% homogeneizado de cérebro humano normal emplasma humano 7 0%. _

<table>table see original document page 131</column></row><table>

Os experimentos na Tabela 10 foram realizados em umaamostra de homogeneizado cerebral humano de vCJD, em vez deuma mistura de HC de vCJD e sCJD.

Tabela 10. Ligação de reagente peptõide 240(XIIb)ligado covalentemente aos glóbulos magnéticos aohomogeneizado cerebral normal ou com vCJD em plasma humano70%.

<table>table see original document page 132</column></row><table>

Tabela 11. Ligação de reagente peptóide 240(XIIb)anexado covalentemente aos glóbulos magnéticos.

<table>table see original document page 132</column></row><table>

No decorrer desses experimentos, foi observado quecertas amostras de plasma humano aparentemente continhamalgum material que interferia com a reação de ligação, eresultaram em sinais menores quando aqueles plasmas eramusados como os diluentes. Foram feitos experimentos decomparação com reagentes peptóides que estavam ligadoscovalentemente aos glóbulos magnéticos e com os mesmosreagentes peptóides anexados aos glóbulos magnéticosatravés da ligação de biotina-estreptavidina (Tabela 12 vs.Tabela 13). Os reagentes peptóides acoplados covalentementeforam bem menos sensíveis às variações nas amostras deplasma usadas como diluente.

Tabela 12: Ensaios pull-down cm o uso de reagentepeptóide biotinilado representativo ligado aos glóbulosmagnéticos de estreptavidina em vários plasmas humanos.

<table>table see original document page 133</column></row><table>

Tabela 13: Ensaios pull-down com o uso de reagentepeptóide representativo ligado diretamente aos glóbulosmagnéticos em vários plasmas humanos.

<table>table see original document page 133</column></row><table><table>table see original document page 134</column></row><table>

*DP = desvio padrão.

Os ensaios na Tabela 12 usaram 2,5 X maishomogeneizado cerebral de CJD do que os ensaios na Tabela13. 0 plasma humano de controle foi o mesmo para cadaconjunto de experimentos e foi demonstrado previamente quenão contém o material interferente. Os resultados mostramque o reagente peptóide acoplado covalentemente nãoapresenta nenhuma interferência na ligação quando sãousados plasmas diferentes, comparado com o controle deplasma (e, na verdade, apresenta sinais maiores do que oplasma de controle), comparado como o peptóide biotiniladoanexado aos glóbulos de estreptavidina, que exibem sinaisbem menores em diversos de plasmas diferentes.

Foram realizados ensaios pull-down/ELISA similaresàqueles descritos acima para amostra humana em diversasamostras de diferentes espécies animais, incluindocamundongo, hamster da Síria e carneiro (foram testadostanto homogeneizados cerebrais quanto amostras de sangue decarneiro com scrapie e de carneiro normal) . Para cada umadessas espécies, a forma patogênica da proteína de príondaquela espécie foi detectada em amostras de animaisdoentes, mas não de animais não doentes, com o uso doreagente peptóide da invenção.

Exemplo 4

ELISA em sanduíche

Foi desenvolvido um ELISA em sanduíche para medir oPrPc presente em amostras de plasma humano. Para determinaros níveis de PrPc presentes em plasma humano, realizamosELISA em sanduíche com o uso de quantidades conhecidas deproteína recombinante de PrP humano (rPrP) para desenvolveruma curva-padrão (Fig. 1B). A quantidade de PrPc emquantidades crescentes de plasma humano foi determinada como uso da curva-padrão com rPrP (Fig IA) . Para o ELISA emsanduíche, placas de microtitulação de 96 poços foramrevestidas com o mAb SAF32 (denominado anticorpo de"captura"). Esse anticorpo se liga à região de octa-repetição de PrP humano, resíduos 23-90, e irá se ligar aoPrPc de comprimentos totais e PrPsc desnaturado resíduos 23-231. A placa foi bloqueada com caseína por 1 hora a 37°C.Para determinar os níveis de PrPc no plasma humano, foramadicionadas quantidades diferentes de plasma às placasrevestidas com SFA32, e elas foram incubadas por 2 horas37°C sem agitação. As placas foram lavadas e o anticorpo3F4 (anticorpo que se liga aos resíduos de PrP humano 109-112) conjugado ã enzima fosfatase alcalina (anticorpo de"detecção", 3F4-AP) foi adicionado por 1 hora a 37°C. Asplacas foram lavadas e o substrato quimioluminescente foiadicionado, e as unidades de luz foram contadas apósincubação de 30 minutos a 37°C. Para quantificar aquantidade de PrPc, incubamos as placas revestidas com SAF-32 com concentrações crescentes de PrP humano recombinantecom o uso do mesmo formato de ELISA em sanduíche. Com o usoda curva-padrão de rPrP, medimos a concentração de PrPcnesse lote de plasma humano como sendo de cerca de 488pg/70 μl.

Usando esse mesmo ELISA em sanduíche, avaliamos aespecificidade de nossos reagentes peptóides para atrairPrPsc ou PrPc de uma amostra de plasma humano. O reagentepeptóide XIIb foi conjugado covalentemente aos glóbulosmagnéticos (Dynabeads de ácido carboxílico M-270) comodescrito. Os glóbulos acoplados ao reagente peptóide forammisturados por 1 hora em ensaio de 100 μL que contém 70 μLde plasma humano, Tween-20 1%, Triton X-100 l%e TBS. Parainvestigar a atração específica de PrPsc, repetimos oexperimento com plasma salpicado com 0,05 μL dehomogeneizado cerebral 10% (HC) preparado a partir de umpaciente diagnosticado com vCJD e como controle de umindivíduo normal. Após lavagem, os glóbulos foram tratadoscom 15 μL de 3 M de GdnSCN para eluir e desnaturar o PrPsc.Para evitar a desnaturação do anticorpo de captura, oGdnSCN foi diluído com 210 μL de H2O, e a solução foiadicionada à placa de microtitulação revestida com SAF32,elevando o volume total de antígeno até 250 μL. Realizamoso experimento com 0,05 μL de homogeneizado cerebral normal10% ou homogeneizado cerebral com vCJD 10%. As placas foramlavadas e o PrP detectado com 3F4-AP com o uso de um asubstrato quimioluminescente AP (LumiphosPlus). Verificamosque, embora a quantidade de PrPc no plasma, quandodetectada diretamente (ou seja, sem qualquer atração), meçacerca de 887 LU, a quantidade ou PrPc atraída com osglóbulos de reagente peptóide contribui apenas com níveisde fundo de 23 LU. O mesmo é verdadeiro quando 0,05 μL deHC normal é salpicado em 70 μL de plasma. Quando 0,05 μL deHC com vCJD foi salpicado em 70 μL de plasma, pode serdetectado um aumento de quatro vezes no sinal. Com o uso derPrP como curva-padrão, verificamos que os glóbulos dereagente peptóide atraíram 47 pg de PrPsc quando salpicadosno plasma contendo cerca de 48 8 pg de PrPc, enquanto opeptóide ligou somente 7 pg de PrPc, sugerindo umenriquecimento de, no mínimo, 70 vezes (Tabela 14).

Tabela 14. Atração específica de PrPsc com glóbulos dereagente peptóide

<table>table see original document page 137</column></row><table>

Exemplo 5

Desnaturação por pH com ELISA em sanduíche

Como alternativa à dissociação com o uso de agentescaotrópicos para dissociação e desnaturação do príonpatogênico após a etapa de atração, desenvolvemos umprocedimento que usa um pH elevado ou um pH reduzido paraefetuar a dissociação/desnaturação. A vantagem desseprocedimento é que, diferentemente da situação comdesnaturação com GdnSCN, as condições de desnaturação porpH podem ser facilmente revertidas, sem aumentarsignificativamente o volume na reação ou sem introdução deetapas de lavagem adicionais.

As atrações (pull-downs) foram realizadas como noExemplo 4, com os glóbulos magnéticos acoplados ao reagentepeptóide XIIb com amostras de 0,10 μΐ de homogeneizadocerebral com vCJD 10% salpicado em 100 μΐ de soluçãocontendo plasma humano 70%. Após mistura por 1 hora a 37°C,os glóbulos foram lavados e tratados sob várias condiçõesde pH, como indicado na Tabela 15. Como controle,utilizamos 3 M de GdnSCN ou Soro fisiológico com TampãoTris (TBS) com pH de 7,5 para tratamento dos glóbulos. Apósuma incubação de 10 minutos em temperatura ambiente, assoluções foram levadas até um pH neutro de cerca de 7, comoindicado na tabela. Os sobrenadantes foram coletados emplaca de microtitulação de 96 poços revestidos com SAF32(anticorpo de captura), que foram incubadas por 12 horas a4°C. Anticorpo 3F4 marcado com fosfatase alcalina foi usadopara a detecção, como descrito no Exemplo 4. As amostraspull-down que foram tratadas com 3 M de GdnSCN paradissociação e desnaturação dos glóbulos mostraram um sinaldo plasma salpicado com vCJD, mas não o plasma de controle,como esperado. 0 tratamento das amostras pull-down comtampão em pH 7,5 não exibiu sinal significativo do plasmasalpicado com vCJD ou plasma de controle, como esperado. Aamostras pull-down foram tratadas com soluções de váriospH, como mostrado. Vários dos tratamentos de pH elevado epH reduzido foram capazes de dissociar e desnaturar aproteína de príon dos glóbulos, e o tratamento com pH 13foi tão eficiente quanto 3 M de GdnSCN. Significativamente,embora o volume da amostra de GdnSCN (após diluição) fossede 225 μΐ, o volume da amostra tratada com pH 13 era deapenas 75 μΐ após neutralização.

TABELA 15<table>table see original document page 138</column></row><table><table>table see original document page 139</column></row><table>

Exemplo 6

Desnaturação por pH com ELISA direto

A dissociação e a desnaturação com pH elevado ereduzido também foram testadas em combinação com um formatode ELISA direto com o uso de anticorpo 3F4 marcado com APpara detecção. 0 processo foi realizado como no Exemplo 5até, e incluindo, a etapa de neutralização. 0 PrP nossobrenadantes foi revestido diretamente sobre os poços dasplacas de microtitulação em um tampão de NaHCO3 em pH 8,9.

As placas foram lacradas e incubadas de um dia para o outroa 4°C. No dia seguinte, a placa foi lavada, bloqueada comcaseína, e o PrP nas placas foi detectado com 3F4 marcadocom AP com o uso de um substrato quimioluminescente. Osresultados são mostrados na Tabela 16.

TABELA 16<table>table see original document page 140</column></row><table><table>table see original document page 141</column></row><table>

Exemplo 7

ELISA em sanduíche em glóbulos magnéticos

Tipicamente, ELISA em sanduíche é realizado com o usode placas de microtitulação de poliestireno com 96 poços,onde o anticorpo de captura é revestido sobre as placas, eas subseqüentes ligação, lavagem e detecção de antígeno sãofeitas no mesmo poço. No entanto, outro formato que utilizaglóbulos magnéticos como matriz de fase sólida pode serusado. Nesse formato, os glóbulos magnéticos, que sãorevestidos com o anticorpo de captura, são primeiramentemisturados com o antígeno e, a seguir, é adicionado oanticorpo de detecção.

Para testar se o procedimento de dissociação edesnaturação por pH que desenvolvemos para uso com o ELISAem placas poderia ser igualmente bem usado com os glóbulosmagnéticos como suporte sólido, realizamos os seguintesexperimentos. A atração de PrPsc de amostras salpicadas deplasma humano com o uso de glóbulos magnéticos acoplados aoreagente peptóide XIIb foi realizada como descritopreviamente. Os glóbulos pull-down foram desnaturados com50 μl de 0,1 N de NaOH, e neutralizados com NaH2PO4 (20μL). O sobrenadante foi transferido para um poço depolipropileno limpo.

A essa solução, adicionamos novos glóbulos magnéticosque haviam sido revestidos com anticorpos anti-príon comoanticorpos de "captura". Um conjunto de glóbulos foirevestido com anticorpo 3F4, outro conjunto de glóbulos foirevestido com um anticorpo (C17) que reconhece um epitopono terminal C da proteína de príon entre os resíduos 121 e231. Os glóbulos revestidos com anticorpo e o eluente dopull-down foram incubados por 2 horas. Os glóbulos foramlavados uma vez, e foi adicionado um anticorpo de detecçãomarcado com AP. O anticorpo usado para o anticorpo dedetecção (C2) é aquele que se liga à região de octa-repetição de PrP, resíduos 23-90. Os glóbulos e o anticorpode detecção foram incubados por mais 2 horas. Os glóbulosforam então lavados, e foi adicionado substrato APquimioluminescente, misturados por 30 minutos, e aquimioluminescência foi medida com Luminoskan Ascent(Thermo Labsytems).

Foi realizado ELISA com o uso dos mesmos anticorpos decaptura e de detecção em formato de placa para comparação.Os resultados são mostrados na Tabela 17. Em ambos osformatos, a presença de PrPsc em 1 nl de HC vCJD 10% foidetectada após salpicar e pull-down da solução de 70 μL deplasma.

TABELA 7

<table>table see original document page 142</column></row><table><table>table see original document page 143</column></row><table>

Exemplo 8

Peptídeos úteis para o projeto de reagentes peptóides

Exemplos não limitantes de peptídeos úteis na produçãodos reagentes peptóides da invenção são derivados deseqüências mostradas na Tabela 18. Os peptídeos na tabelasão representados pelos códigos de aminoácidosconvencionais de uma letra, e são revelados com seuterminal amino à esquerda e o carbóxi terminal à direita.Qualquer uma das seqüências na tabela pode incluiropcionalmente ligantees Gly (Gr, em que η = 1, 2, 3 ou 4)no terminal amino e/ou carbóxi. Aminoácidos entre colchetesindicam resíduos alternativos que podem ser usados naquelaposição em peptídeos diferentes. Parênteses indicam o(s)resíduo(s) que pode estar presente ou ausente do reagentepeptídico. Parênteses duplos (por exemplo, ID. DE SEQ. N°:111) seguidos por um "2" indicam que a seqüência incluiduas cópias do peptídeo entre os parênteses duplos. 0resíduo que vem a seguir da designação do número de cópias(por exemplo, "K" no ID. DE SEQ. N°: 111) indica o resíduodo qual cada cópia do peptídeo entre os parênteses duplosse estende. Dessa forma, o ID. DE SEQ. N°: 111 é um dímerodas seqüências peptídicas QWNKPSKPKTN (ou seja, o ID. DESEQ. N° : 14), cada um ligado por seu terminal carbóxi a umresíduo lisina (K) por meio dos grupos funcionais a- e e-amino de lisina. Seqüências que incluem "MAPS" indicampeptídeos com múltiplos sítios antigênicos. O número queprecede o termo "ramificações" indica o número de cópias.Dessa forma, o ID. DE SEQ. N°: 112 contém 4 cópias deGGGKKRPKPGGWNTGGG, o que corresponde ao ID. DE SEQ. N°: 67com ligantees em cada terminal, enquanto o ID. DE SEQ. N°:113 contém 8 cópias de GGGKKRPKPGGWNTGGG, o que correspondenovamente ao ID. DE SEQ. N° : 67 com ligantees Gly em cadaterminal.

Tabela 18: Exemplos de seqüências peptídicas para aprodução dos reagentes peptóides da invenção.

<table>table see original document page 144</column></row><table><table>table see original document page 145</column></row><table><table>table see original document page 146</column></row><table><table>table see original document page 147</column></row><table><table>table see original document page 148</column></row><table><table>table see original document page 149</column></row><table><table>table see original document page 150</column></row><table><table>table see original document page 151</column></row><table><table>table see original document page 152</column></row><table>

Exemplo 9

Protocolo para síntese de fase sólida de submonômeropara peptõides

Procedimentos experimentais gerais. Os solventes sãode grau reagente e são usados sem purificação adicional.Ácido bromoacético foi obtido de Aldrich (grau de 99%) eDIC foi obtido de Cheminplex International. Todas asreações e lavagens são realizadas a 35°C, a menos queobservado de forma diferente. A lavagem da resina refere-seà adição de um solvente de lavagem (normalmente DMF ouDMSO) à resina, agitando-se a resina de forma a se obter umcaldo uniforme (tipicamente por cerca de 20 segundos),seguido por drenagem cuidadosa do solvente da resina. Ossolventes são mais bem removidos por filtração a vácuoatravés de depósito do fundo do vaso de reação até que aresina pareça seca (tipicamente por cerca de 10 segundos).Os caldos de resina foram agitados através do borbulhamentode argônio através do fundo do vaso com depósito. Ossolventes usados para a dissolução dos reagentes devem serdesgaseifiçados antes do uso por sonificação sob uma câmarade vácuo por 5 minutos. Para os solventes de lavagem, émuito conveniente ter recipientes contendo DMF, DMSO ediclorometano disponíveis com volumes ajustáveis (1-5 ml) .

Prefere-se não interromper a síntese no estágio dedímero, pois dímeros podem ciclizar com a estocagem por umperíodo de tempo longo para formar dicetopiperazinas. 0ponto preferido para interromper a síntese é após aslavagens de deslocamento.

Inchação inicial da Resina e desproteção Fmoc. Um vasode reação com depósito é carregado com 100 de Fmoc-resinade amida Rink (0,50 mmol/g de resina). À resina, sãoadicionados 2 ml de DMF, e essa solução é agitada por 5minutos para inchar a resina. Pode ser usado um bastão devidro para quebrar os grumos de resina, se necessário. 0DMF é então drenado. O grupo Fmoc é então removido poradição de 2 ml de piperidina 20% em DMF à resina. Isso éagitado por 1 minuto, e depois drenado. Mais 2 ml depiperidina 2 0% em DMF são acrescentados à resina e agitadospor 20 minutos, e a seguir drenados. A resina é entãolavada com DMF (5 χ 2 ml).

Ciclo de síntese de submonômero. A amina desbloqueadaé então acilada por adição à resina de 1,13 ml de 1,2 M deácido bromoacético em DMF, seguido por 200 μΐ (0,93 equiv.)de N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) pura. Essa solução éagitada por 20 minutos a 35°C, e depois drenada. A resina éentão lavada com DMF (3 χ 2 ml).<formula>formula see original document page 154</formula>

A etapa de acilação é então seguida por deslocamentonucleofílico com uma amina primária. À resina lavada, éadicionado 0,85 ml de uma solução de 1 M da amina em NMP.Essa solução é agitada por 3 0 minutos a 35°C, e depoisdrenada. A resina é antão lavada com DMF (3 χ 2 ml). Issocompleta um ciclo de reação.

0 ciclo de acilação/deslocamento é repetido até queseja obtido o oligômero desejado, por exemplo, de 3 a cercade 30 vezes.

Conjugação do grupo tiol e biotina. Opcionalmente,biotina era acoplada ao terminal N pela adição de 2,0 ml deuma solução de biotina (0,4 M) e HOBt (0,4 M) em DMSO,seguida pela adição de 1,05 equivalente de DIC puro. Amistura de reação foi agitada por 1 hora a 35°C, quandoentão a mistura de reação foi drenada e a resina lavada comDMSO (2 χ 3 ml), seguido por DMF (3 χ 2 ml). Opcionalmente,um grupo tiol era incorporado pela incorporação decisteína, que era adicionada por meio de uma etapa deacoplamento de aminoácido: Fmoc-Cys(Trt) (NovaBiochem) eraacoplado ao terminal N pela adição de 2,0 ml de uma soluçãode Fmoc-Cys(Trt) (0,4 M) e HOBt (0,4 M) em DMF, seguidapela adição de 1,05 equivalente de DIC pura. A mistura dereação era agitada a 350C por 1 hora, quando então amistura de reação era drenada e a resina lavada com DMF (3χ 3 ml). O grupo Fmoc é então removido por adição de 2 mlde piperidina 20% em DMF à resina. Essa é agitada por 1minuto, e depois drenada. Mais 2 ml de piperidina 20% emDMF são adicionados à resina e agitados por 20 minutos, e aseguir drenados. A resina é então lavada com DMF (5x2ml) .

Clivagem (para 50 pmol de resina) . Após a reação desíntese e lavagem da resina, a resina é lavada comdiclorometano (2 χ 2 ml) e seca ao ar por um minuto. Aresina seca é colocada em um frasco de cintilação de vidrocontendo uma barra de microagitação de teflon, eaproximadamente 5 ml de TFA/triisopropilsilano/água95/2,5/2,5 (v/v/v) são adicionados. Essa solução é agitadapor 15 minutos. Filtrar a mistura de clivagem para cadaamostra através de uma coluna de extração de fase sólida(SPE) de 8 ml, adaptada com uma frita de polietileno de 2 0μπι em um tubo de centrífuga cônico de polipropileno de 50ml. A resina é então lavada com 1 ml do TFA 95%, e osfiltrados são combinados. 0 filtrado é então diluído com umvolume igual de água no tubo de centrífuga. Essa solução éentão congelada e liofilizada até seca. 0 produto seco éentão recolhido em 10 ml de 1:1 ácido acetonitrila/água, enovamente liofilizado até seco.

Caracterização do oligômero. Oligômeros peptóideindividuais são analisados por HPLC de fase reversa emcolunas C-18 (Vydac, 5 pm, 300 A, 4,5 χ 250 mm). É usado umgradiente linear de B 0-80% em 40 minutos, em uma taxa defluxo de 1 ml/min (solvente A = TFA 0,1% em água, solventeB = TFA 0,1% em acetonitrila) . Os picos principais sãocoletados e submetidos à análise MS por eletrospray paradeterminar os pesos moleculares.

Purificação do peptóide. Os peptóides são purificadospor HPLC de fase reversa, antes de serem usados pelosbiólogos. Tipicamente esses compostos são analisados epurificados em colunas C18. Dessa forma, os compostos sãodissolvidos em uma pequena quantidade de acetonitrila10%/água, e purificados em um coluna C18 ID DuraGel HS de50 χ 20 mm (Peeke Scientific). É usado um gradiente linearde B 5-65% em 40 minutos, em uma taxa de fluxo de 3 0 ml/min(solvente A= TFA 0,1% em água, solvente B = TFA 0,1% emacetonitrila). As frações combinadas do produto sãocombinadas e liofilizadas até um pó branco.

Exemplo 10

Eficiência de atração do reagente peptóide XIIb

A capacidade do reagente peptóide XIIb de se ligarcovalentemente aos glóbulos foi testada pelo ensaio pull-down, como descrito abaixo.

Homogeneizado cerebral (HC) com vCJD ou normal foisalpicado em plasma humano normal 50% reunido em pool emTBS com Tween-20 1% e Triton-X 1001%. As amostras decontrole não receberam nenhum dos dois. Os 100 μΐ de cadaamostra (contendo 10 nl de HC 10% ou nada) foram misturadoscom 3 μL de glóbulos de XIIb (30 mg/ml), e a misturaresultante foi incubada a 37°C por 1 hora com agitaçãoconstante a 750 rpm. A seguir, os glóbulos foram lavadosquatro vezes com TBST contendo Tween-200,05%, e o PrPscligado aos glóbulos foi dissociado por adição de 0,1 N deNaOH. A proteína de príon desnaturada foi posteriormenteneutralizada por 0,3 M de NaH2PO4, e transferida para imaplaca da ELISA.

A eficiência da atração (pull-down) foi calculada porcomparação dos sinais das amostras atraídas com as deamostras idênticas que foram desnaturadas por tiocioanatode guanidínio (GdnSCN) sem nenhuma atração. A proteína depríon cérebro com vCJD ou normal foi desnaturadamisturando-se um volume igual de HC 5% e 6 M de GdnSCN, eincubada em temperatura ambiente por 10 minutos. A amostrafoi então diluída em TBST até a mesma concentração dasamostras atraídas, com somente TBST como controle. Cem μΐde cada amostra desnaturada diretamente foramposteriormente transferidos para a mesma placa de ELISApara amostras atraídas.

A placa de ELISA foi revestida por anticorpo decaptura 3F4 a 2,5 pg/ml em 0,1 M de NaHCO3. 0 procedimentode revestimento foi realizado a 40C de um dia para o outro,e a seguir lavado três vezes por TBST. A seguir, a placafoi bloqueada por caseína 1% em TBS a 37°C por 1 hora. Aproteína de príon de ambas as amostras, atraídas edesnaturadas diretamente, foi incubada em uma placa deELISA com 3F4 por 1 hora a 37°C, com agitação constante a300 rpm, e a placa foi lavada seis vezes com TBST. 0anticorpo de detecção conjugado à fosfatase alcalina (AP)foi diluído até 0,1 pg/ml em caseína 0,1% em TBST, e depoisadicionado à placa de ELISA. A seguir, a placa foi incubadaa 37°C por 1 hora, e lavada seis vezes por TBST. O sinalfoi desenvolvido com o uso de substrato quimioluminescenteLumi-Phos Plus intensificado, e lido por um luminômetro emunidades relativas de luz (RLU).

Os resultados são mostrados na Tabela 19. A proteínade príon de tecido cerebral pode ser completamentedesnaturada por 3 M de GdnSCN e detectada por seuanticorpo. Nesse experimento, comparamos o sinal geradopela atração de proteína de príon com o uso de glóbulos comXIIb com o sinal obtido da proteína desnaturada diretamentepor GdnSCN. Os dados demonstraram que o nível de fundo (semHC) para as amostras pull-down e desnaturadas diretamentefoi de 9,0 e 7,7 RLU, respectivamente. Dez nl de HC normal10% desnaturado diretamente teviveram um sinal de 14,6 RLU,refletindo o nível de PrPc no cérebro normal. No entanto,10 nl de HC normal 10% detectado pelo método pull-downmostraram uma leitura de 9,9 RLU, o que é similar ao seunível de fundo. Isso demonstrou a especificidade dopeptóide XIIb. Quando 10 nl da amostra de vCJD 10% foramtestados por métodos de desnaturação pull-down e direta, osdados demonstraram 53,0 e 56,3 RLU, o que significa que aeficiência de pull-down de glóbulos com XIIb alcançou quase100%.

Tabela 19

<table>table see original document page 158</column></row><table>

Exemplo 11

Distinção das cepas de príons

As diferenças estruturais entre cepas de príons podemser detectadas medindo-se suas diferentes propriedadestermodinâmicas de desdobramento. A incubação de PrPsc comconcentrações crescentes de desnaturante químico pode gerarum perfil de desnaturação do conformador do príon que écaracterístico de cada cepa. Estudos prévios usaram aresistência à proteinase K (PK) para medir a proporção dePrPsc que permanecia dobrada após tratamento comdesnaturante. Aqui, testamos se o reagente peptóide XIIbtambém poderia ser usado para distinguir PrPsc dobrado edesdobrado e, dessa forma, permitir a medida dos estadosconformacionais em cepas sensíveis à PK nas quais os perfisde desnaturação não pode ser medido por métodosconvencionais.

Para a geração de um perfil de desnaturação para umacepa de vCJD, um homogeneizado cerebral de vCJD ("NIBSC CJDResource Centre") foi incubado com várias concentrações decloridrato de guanidina, antes de as amostras seremdiluídas e submetidas ao pull-down com o uso do reagentepeptóide XIIb (veja o Exemplo 3 e a descrição do "Pull-downde XIIb" abaixo). 0 material ligado ao XIIb foi entãoeluído e detectado por ensaio de ELISA em sanduíche. Umarepresentação gráfica do PrPsc atraído em cada concentraçãode desnaturante demonstrou que a concentração de cloridratode guanidina era inversamente proporcional à fração dePrPsc desdobrado atraído (pulled down) por XIIb. Os pontosde dados formaram uma curva sigmóide única, sugerindo aexistência de um conformador do PrPsc no homogeneizadocerebral que desdobra em uma transição importante (veja aFigura 4, pontos abertos). Portanto, acredita-se que XIIbreconheça um epitopo estrutural em PrPsc que é rompido como tratamento com desnaturante químico. A análise de umacepa de CJD esporádica (sCJD, "NIBSC CJD Resource Centre")resultou em uma curva sigmóide similar que se desviava paraa direita do perfil de desnaturação para vCJD (veja aFigura 4, pontos cinzas), ilustrando que parece que oepitopo estrutural reconhecido por XIIb é mais estável nacepa sCJD, quando comparada à cepa vCJD. A análise de cadacepa gerou consistentemente o padrão equivalente,permitindo a definição da curva com um valor característicocomo uma medida da estabilidade conformacional relativa dePrPsc: a concentração de GdnHCl encontrada na metade dadesnaturação máxima (GdnHCli/2) . O perfil de desnaturação devCJD teve um GdnHCli/2 de 1,6 M de GdnHCl. Em contraste, umhomogeneizado cerebral de sCJD foi mais estável àdesnaturação por guanidina, com um GdnHCli/2 de 2,0 M deGdnHCl. Portanto, XIIb pode ser usado como uma ferramentapara dissecar a variabilidade conformacional entre cepas depríons.

Pull-down de XIIb

Homogeneizado cerebral infeccioso (75-200 nl, 10%) foidesnaturado em soluções de guanidina com concentrações quevariam de 0-4 M por 1 hora em temperatura ambiente. Apósdesnaturação, todas as amostras foram ajustadas até umaconcentração final de 0,1 M de cloridrato de guanidina emTBSTT, e PrPsc dobrado foi atraído com glóbulos com XIIbcom o uso de procedimentos padronizados de pull-down. Omaterial atraído foi eluído e medido por ensaio de ELISA emsanduíche em triplicata com anticorpos de captura C17 eanticorpos de detecção 3F4-AP.

Como será percebido por aqueles habilitados natécnica, podem ser feitas várias alterações e modificaçõesnas modalidades preferidas da invenção, sem se afastar doespírito da invenção. Pretende-se que todas essas variaçõesestejam incluídas no escopo da invenção. Pretende-se tambémque cada uma das patentes, pedidos e publicações impressas,incluindo livros, mencionados neste documento de patente,sejam aqui incorporadas por referência em sua totalidade.Listagem de Seqüência

<110> Chiron Corporation

<120> REAGENTES PEPTÓIDES ESPECÍFICOS PARA PRÍON

<130> 20366- 047W01

<150> US 60/715,761<151> 09/09/2005

<150> US 60/726,686<151> 14/10/2005

<150> US 60/758,934<151> 13/01/2006

<160> 241

<170> FastSEQ para Versão Windows 4.0

<210> 1<211> 253<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 1

Met Ala Asn Leu Gly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp

1 5 10 15

Ser Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn

20 25 30

Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg

35 40 45

Tvr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly

50 55 60

Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly65 70 75 80

Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His

85 90 95

Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met

100 105 HO

Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr

115 120 125

Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp

130 135 140 , „.

Tvr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln!45 150 155 160

Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val

165 170 175

His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr

180 185 190

Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg

195 200 205

Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala

210 215 220

Tvr Tvr Gln Arg Gly Ser Ser Met Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val225 230 235 240

Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly245 250<210> 2

<211> 254

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp

1 5 10 15

Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn

20 25 30

Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg

35 40 45

Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp

50 55 60

Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp65 70 75 80

Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn

85 90 95

Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Ala

100 105 110

Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met

115 120 125

Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp

130 135 140

Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn Gln Val145 150 155 160

Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His

165 170 175

Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr

180 185 190

Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg Val

195 200 205

Val Glu Gln Met Cys Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr

210 215 220

Tvr Asp Glv Arg Arg Ser Ser Ser Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro225 230 235 240

Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly245 250

<210> 3<211> 253<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 3

Met Ala Asn Leu Gly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp

! 5 10 15

Ser Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn

20 25 30

Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg

35 40 45

Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly

50 55 60

Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly65 70 75 80

Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His

85 90 95

Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met100 105 110 Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr 115 120 125 Met Leu 130 Gly Ser Ala Met Ser 135 Arg Pro Ile Ile His 140 Phe Gly Ser AspTyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln145 150 155 160Val Tyr Tyr Arg Pro 165 Met Asp Glu Tyr Ser 170 Asn Gln Asn Asn Phe 175 ValHis Asp Cys Val 180 Asn Ile Thr Ile Lys 185 Gln His Thr Val Thr 190 Thr ThrThr Lys Gly 195 Glu Asn Phe Thr Glu 200 Thr Asp Val Lys Met 205 Met Glu ArgVal Val 210 Glu Gln Met Cys Ile 215 Thr Gln Tyr Glu Arg 220 GlU Ser Gln AlaTyr Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Met Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val225 230 235 240Ile Leu Leu Ile Ser 245 Phe Leu Ile Phe Leu 250 Ile Val Gly

<210> 4<211> 254<212> PRT

<213> Mesocricetus auratus

<400> 4

Met Ala Asn Leu Ser Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Ala Met Trp1 5 10 15 Thr Asp Val Gly 20 Leu Cys Lys Lys Arg 25 Pro Lys Pro Gly Gly 30 Trp AsnThr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg 35 40 45 Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 50 55 60 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 65 70 75 80Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His 85 90 95 Asn Gln Trp Asn 100 Lys Pro Ser Lys Pro 105 Lys Thr Asn Met Lys 110 His MetAla Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr 115 120 125 Met Leu 130 Gly Ser Ala Met Ser 135 Arg Pro Met Met His 140 Phe Gly Asn AspTrp Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Asn Arg Tyr Pro Asn Gln145 150 155 160Val Tyr Tyr Arg Pro 165 Val Asp Gln Tyr Asn 170 Asn Gln Asn Asn Phe 175 ValHis Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr 180 185 190 Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Ile Met Glu Arg 195 200 205 Val Val 210 Glu Gln Met Cys Thr 215 Thr Gln Tyr Gln Lys 220 Glu Ser Gln AlaTyr Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ala Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro225 230 235 240Val Ile Leu Leu Ile 245 Ser Phe Leu Ile Phe 250 Leu Met Val Gly<210> 5

<211> 265

<212> PRT<213> Bos taurus

<220>

<221> VARIANTEE<222> 46, 155

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 5

Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala

15 10 15

Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly

20 25 30

Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Xaa Pro Gly

35 40 45

Gly Asn Thr Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro

50 55 60

His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro65 70 75 80

His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro

85 90 95

His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Thr His Gly Gln Trp Asn

100 105 110

Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val Ala Gly Ala Ala

115 120 125

Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser

130 135 140

Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Xaa Asp Tyr Glu Asp Arg145 150 155 160

Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg

165 170 175

Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val

180 185 190

Asn Ile Thr Val Lys Glu His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu

195 200 205

Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln

210 215 220

Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg225 230 235 240

Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile

245 250 255

Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly260 265

<210> 6

<211> 256

<212> PRT

<213> Ovis aries

<400> 6

Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala

χ 5 10 15

Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly

20 25 30

Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly

35 40 45

Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His50 55 60 Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His65 70 75 80Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly 85 90 95 Gly Ser His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met 100 105 110 Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu 115 120 125 Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe 130 135 140 Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr145 150 155 160Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Arg Tyr Ser Asn Gln Asn 165 170 175 Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Gln His Thr Val 180 185 190 Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Ile 195 200 205 Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu 210 215 220 Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser225 230 235 240Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly

245 250 255

<210> 7<211> 254<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7 Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp1 5 10 15 Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn 20 25 30 Thr Gly Gly 35 Ser Arg Tyr Pro Gly 40 Gln Gly Ser Pro Gly 45 Gly Asn ArgTyr Pro Pro Gln Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp 50 55 60 Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp65 70 75 80Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn 85 90 95 Gln Trp Asn Lys 100 Pro Ser Lys Pro Lys 105 Thr Asn Leu Lys His 110 Val AlaGly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met 115 120 125 Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp 130 135 140 Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn Gln Val145 150 155 160Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His 165 170 175 Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr 180 185 190 Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg Val 195 200 205 Val Glu 210 Gln Met Cys Val Thr 215 Gln Tyr Gln Lys Glu 220 Ser Gln Ala TyrTyr Asp Gly Arg Arg225

Val Ile Leu Leu Ile245

Ser Ser Ser Thr Val Leu230 235

Ser Phe Leu Ile Phe Leu250

Phe Ser Ser Pro Pro240

Ile Val Gly

<210> 8<211> 256<212> PRT

<213> Cervus elaphus<400> 8

Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala

1 5 10 15

Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly

20 25 30

Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly

35 40 45

Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His

50 55 60

Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His65 70 75 80

Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly

85 90 95

Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met

100 105 110

Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu

115 120 125

Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe

130 135 140

Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr145 150 155 160

Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Asn Asn Gln Asn

165 170 175

Thr Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Gln His Thr Val

180 185 190

Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met

195 200 205

Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu

210 215 220

Ser Glu Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser225 230 235 240

Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly245 250 255

<210 > 9<211> 256<212> PRT<213> Dama dama

<400> 9

Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser

1 5

Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys20

Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg

35 40

Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly

50 55

Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His

Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala

10 15

Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly25 30

Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly45

Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His60

Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His65 70 75 80Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly 85 90 95 Gly Thr His Ser 100 Gln Trp Asn Lys Pro 105 Ser Lys Pro Lys Thr 110 Asn MetLys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu 115 120 125 Gly Gly 130 Tyr Met Leu Gly Ser 135 Ala Met Asn Arg Pro 140 Leu Ile His PheGly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr145 150 155 160Pro Asn Gln Val Tyr 165 Tyr Arg Pro Val Asp 170 Gln Tyr Asn Asn Gln 175 AsnThr Phe Val His 180 Asp Cys Val Asn Ile 185 Thr Val Lys Gln His 190 Thr ValThr Thr Thr 195 Thr Lys Gly Glu Asn 200 Phe Thr Glu Thr Asp 205 Ile Lys MetMet Glu 210 Arg Val Val Glu Gln 215 Met Cys Ile Thr Gln 220 Tyr Gln Arg GluSer Glu Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser225 230 235 240Pro Pro Val Ile Leu 245 Leu Ile Ser Phe Leu 250 Ile Phe Leu Ile Val 255 Gly

<210> 10<211> 256<212> PRT

<213> Odocoileus hemionus<4 0 0 > 10

Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala

!5 ίο 15

Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly

20 25 30

Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly

35 40 45

Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His

50 55 60

Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His65 70 75 80

Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly

85 90 95

Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met

100 105 HO

Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu

115 120 125

Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe

130 135 140

Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr145 150 155 160

Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Asn Asn Gln Asn

165 170 175

Thr Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Gln His Thr Val

180 185 190

Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met

195 200 205

Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu

210 215 220

Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser225 230 235 240Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 245 250 255 <210> 11 <211> 256 <212> PRT <213> Odocoileus virginianus <400> 11 Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala1 5 10 15 Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly 20 25 30 Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly 35 40 45 Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His 50 55 60 Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His65 70 75 80Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly 85 90 95 Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met 100 105 110 Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu 115 120 125 Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe 130 135 140 Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr145 150 155 160Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Asn Asn Gln Asn 165 170 175 Thr Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Gln His Thr Val 180 185 190 Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met 195 200 205 Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu 210 215 220 Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser225 230 235 240Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 245 250 255

<210> 12<211> 5<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 O >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 12

Lys Lys Arg Pro Lys1 5

<210 > 13<211> 22<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 13

Met Ala Asn Leu Gly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp

1 5 10 15

Ser Asp Leu Gly Leu Cys20

<210> 14<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 14

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn15 10

<210> 15<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<4 0 0 > 15

Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val15 10 15

<210> 16<211> 28<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTEE<222> 5

<223> Xaa = Asn ou Thr<220>

<221> VARIANTE<222> 15

<223> Xaa = Ile ou Val<22 0 >

<221> VARIANTE<222> 17

<223> Xaa = Gln ou Glu<400> 16Asn Gln Asn Asn Xaa Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Xaa Lys

1 5 10 15

Xaa His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn20 25

<210> 17<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 17

Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp1 5 10

<210> 18<211> 8<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<4 00 > 18

Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp1 5

<210> 19<211> 38<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 9

<223> Xaa = Val ou Ile<22 0 >

<221> VARIANTE<222> 11

<223> Xaa = Met ou Ile<220>

<221> VARIANTE<222> 21

<223> Xaa = Ile ou Val<220>

<221> VARIANTE<222> 25

<223> Xaa = Glu ou Gln

<220><221> VARIANTE<222> 32

<223> Xaa = Gln ou Asp<220>

<221> VARIANTE<222> 36

<223> Xaa = Gly ou Ser<220>

<221> VARIANTE<222> 37

<223> Xaa = Ser ou Ala<400> 19

Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp

1 5

Glu Gln Met Cys Xaa Thr Gln Tyr20

Gly Arg Arg Xaa Xaa Ser35

Xaa Lys Xaa Met Glu Arg Val Val

10 15

Xaa Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Xaa25 30

<210> 20<211> 63<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 5

<223> Xaa = Asn ou Thr<220>

<221> VARIANTE

<222> 15, 46

<223> Xaa = Ile ou Val

<220>

<221> VARIANTE<222> 17

<223> Xaa = Gln ou Glu<220>

<221> VARIANTE<222> 34

<223> Xaa = Val ou Ile<220>

<221> VARIANTE<222> 36

<223> Xaa = Met ou Ile<220>

<221> VARIANTE<222> 50

<223> Xaa = Glu ou Gln<220>

<221> VARIANTE<222> 57

<223> Xaa = Gln ou Asp<220>

<221> VARIANTE<222> 61

<223> Xaa = Gly ou Ser<220>

<221> VARIANTE<222> 62

<223> Xaa = Ser ou Ala

<400> 20

Asn Gln Asn Asn Xaa Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Xaa Lys

15 10 15

Xaa His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr

20 25 30

Asp Xaa Lys Xaa Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Xaa Thr Gln Tyr

35 40 45

Xaa Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Xaa Gly Arg Arg Xaa Xaa Ser50 55 60

<210> 21<211> 22<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 1

<223> Xaa = Ala, Vai, Thr ou Met<220>

<221> VARIANTE<222> 2

<223> Xaa = Val ou Ile

<220>

<221> VARIANTE<222> 20

<223> Xaa = Ile ou Met<400> 21

Xaa Xaa Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu

15 10 15

Ile Phe Leu Xaa Val Gly20

<210> 22<211> 36<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22O>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 2

<223> Xaa = Asn ou Ser<220>

<221> VARIANTE<222> 4

<223> Xaa = Trp Or Tyr<220>

<221> VARIANTE<222> 14

<223> Xaa = His ou Tyr<220>

<221> VARIANTE<222> 25

<223> Xaa = Met ou Val<220>

<221> VARIANTE<222> 27

<223> Xaa = Gln, Glu ou Arg<22 0 >

<221> VARIANTE<222> 29

<223> Xaa = Ser ou Asn<220>

<221> VARIANTE<222> 33

<223> Xaa = Asn ou Thr

Xaa Arg Tyr15

Asn Gln Asn30

<400> 22

Gly Xaa Asp Xaa Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met

15 10

Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Xaa Asp Xaa Tyr Xaa

20 25

Xaa Phe Val His35

<210> 23<211> 22<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 2

<223> Xaa = Asn ou Thr<220>

<221> VARIANTE<222> 12

<223> Xaa = Ile ou Val<220>

<221> VARIANTE<222> 14

<223> Xaa = Gln ou Glu<400> 23

Asn Xaa Phe Val His Asp Cys Val

1 5

Val Thr Thr Thr Thr Lys20

Asn Ile Thr Xaa Lys Xaa His Thr10 15

<210> 24<211> 4<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente

<400> 24Val Tyr Tyr Arg1

<210> 25<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 11

<223> Xaa = Met ou Val<220>

<221> VARIANTE<222> 13

<223> Xaa = Gln, Glu ou Arg<400> 25

Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Xaa Asp Xaa15 10

<210> 26<211> 33<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 26

Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly

1 5

Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly20

Gly

Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg

10 15

Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly25 30

<210> 27<211> 25<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<4 O O > 27

Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly

15 10 15

Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly20 25

<210> 28<211> 33<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 26

<223> Xaa = Gly ou Thr

<400> 28

Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr

1 5

Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly20

Gly

Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly

10 15

Gly Xaa Trp Gly Gln Pro His Gly25 30

<210> 29<211> 22<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 29

Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro

15 10 15

Ser Lys Pro Lys Thr Asn20<210> 30<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 30

Gly Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn15 10 15

<210> 31<211> 49<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 26

<223> Xaa = Gly ou Thr<400> 31

Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr

1 5

Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly20

Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His35

Gly Gly

Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly

10 15

Gly Xaa Trp Gly Gln Pro His25 30

Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His40 45

<210> 32<211> 8<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 32

Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp1 5

<210> 33<211> 21<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 33

Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg

, 5 10 15Glu Asn Met His Arg20

<210> 34<211> 21<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 34

Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg

1 5 10 15

Glu Asn Met Tyr Arg20

<210> 35<211> 38<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 35

Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr

!5 10 15

His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His

20 25 30

Val Gly Gly Gly Gly Cys35

<210> 36<211> 30<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 36

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn Gln

15 10 15

Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val20 25 30

<210> 37<211> 30<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente

<400> 37

Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro15 10 15

Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Gly Gly Gly Gly20 25 30

<210> 38<211> 4<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 1

<223> Xaa = Met ou Leu<220>

<221> VARIANTE<222> 4

<223> Xaa = Met ou Val

<400> 38Xaa Lys His Xaa1

<210> 39<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 6

<223> Xaa = Met ou Leu<220>

<221> VARIANTE<222> 9

<223> Xaa = Met ou Val<400> 39

Lys Pro Lys Thr Asn Xaa Lys His Xaa1 5

<210> 40<211> 34<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 40

Cys Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn Gln Trp1 5 10 15

Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Gly Gly Gly20 25 30

Gly Cys

<210> 41<211> 25<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 41

Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr

1 5 10 15

Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn20 25

<210> 42<211> 23<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 42

Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu

1 5 10 15

Asn Met Tyr Arg Pro Val Asp20

<210> 43<211> 22<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 43

Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr

1 5 10 15

Met Leu Gly Ser Ala Met20

<210> 44<211> 24<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 44Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg

1 5 10 15

Glu Asn Met Tyr Arg Gly Gly Gly

<210> 45<211> 26<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 45

Gly Gly Gly Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp Glu Asp Arg

15 10 15

Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Gly Gly20 25

<210> 46<211> 31<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 46

Gly Gly Cys Gly Gly Gly Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp

15 10 15

Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Gly Gly Gly Cys20 25 30

<210> 47<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 47

Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly15 10 15

<210> 48<211> 5<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 48

Gly Gly Leu Gly Gly1 5

ι<210> 49<211> 3<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente

<400> 49Leu Gly Ser1

<210> 50<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 50

Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Gly Gly Gly1 5 10

<210> 51<211> 25<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente

Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Gly Gly Gly Gln Trp

5 10 15

Lys Pro Lys Thr Asn25

<4 0 0 > 51Gln Trp Asn Lys1

Asn Lys Pro Ser20

<210> 52<211> 18<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 52

Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Gly1 5 10 15

Gly Gly

<210> 53<211> 22<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 53

Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro

1 5 10 15

Ser Lys Pro Lys Thr Asn20

<210> 54<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 54

Gly Gly Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn15 10 15

<210> 55<211> 25<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 55

Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu

!5 10 15

Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met20 25

<210> 56<211> 18<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 56

Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly LeuX5 10 15

Gly Gly

<210> 57<211> 25<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 57

Lys Lys Lys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu

15 10 15

Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met20 25

<210> 58<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<22 0 >

<221> VARIANTE<222> 8

<223> Xaa = Ser ou Asn<400> 58

Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Xaa Arg1 5

<210> 59<211> 6<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 1

<223> Xaa = Ser ou Asn<220>

<221> VARIANTE<222> 4

<223> Xaa = Met Ile ou Leu<220>

<221> VARIANTE<222> 5

<223> Xaa = Ile ou Leu<400> 59

Xaa Arg Pro Xaa Xaa His1 5

<210> 60<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 8

<223> Xaa = Ser ou Asn<220>

<221> VARIANTE<222> 11

<223> Xaa = Met, Ile ou Leu<220>

<221> VARIANTE<222 > 12

<223> Xaa = Ile ou Leu<400> 60

Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Xaa Arg Pro Xaa Xaa His15 10

<210> 61<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 8

<223> Xaa = Ser ou Asn<220>

<221> VARIANTE<222 > 11

<223> Xaa = Met, Ile ou Leu<220>

<221> VARIANTE<222> 12

<223> Xaa = Ile ou Leu<220>

<221> VARIANTE<222> 16

<223> Xaa = Asn ou Ser<400> 61

Tvr Met Leu Gly Ser Ala Met Xaa Arg Pro Xaa Xaa His Phe Gly Xaa15 10 15

Asp

<210> 62<211> 25<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 1

<223> Xaa = Trp ou Tyr<220>

<221> VARIANTE<222> 11

<223> Xaa = His ou Tyr<220>

<221> VARIANTE<222> 22

<223> Xaa = Met ou Val<220>

<221> VARIANTE<222> 24

<223> Xaa = Gln, Glu ou Arg<400> 62

Xaa Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Xaa Arg Tyr Pro Asn Gln

15 10 15

Val Tyr Tyr Arg Pro Xaa Asp Xaa Tyr20 25

<210> 63<211> 30<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 1

<223> Xaa = Trp ou Tyr<220>

<221> VARIANTE<222> 11

<223> Xaa = His OU Tyr<220>

<221> VARIANTE<222> 22

<223> Xaa = Met ou Val<220>

<221> VARIANTE<222> 24

<223> Xaa = Gln, Glu ou Arg<220>

<221> VARIANTE<222> 26<223> Xaa Ser Asn<220>

<221> VARIANTE<222> 30

<223> Xaa = Asn ou Thr<400> 63

Xaa Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu

1 5

Val Tyr Tyr Arg Pro Xaa Asp Xaa20

Asn Met Xaa Arg Tyr Pro Asn Gln

10 15

Tyr Xaa Asn Gln Asn Xaa25 30

<210> 64<211> 8<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 2

<223> Xaa = Gln, Glu ou Arg<220>

<221> VARIANTE<222> 4

<223> Xaa = Ser ou Asn<220>

<221> VARIANTE<222 > 8

<223> Xaa = Asn ou Thr<400> 64

Asp Xaa Tyr Xaa Asn Gln Asn Xaa1 5

<210> 65<211> 18<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 65

Lys Lys Lys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu

15 10 15

Gly Gly

<210> 66<211> 24<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 66

Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser20

<210> 67<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 67

Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly15 10 15

<210> 68<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 68

Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly15 10

<210> 69<211> 23<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 69

Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln His Gly Gly Ser Trp Gly Gln Pro

15 10 15

His Gly Gly Ser Trp Gly Gln20

<210> 70<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 70Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp Gly Gln1 5 10 15

<210> 71<211> 8<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 71

Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln1 5

<210> 72<211> 20<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<400> 72

Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro

15 10 15

Lys Pro Gly Gly20

<210> 73<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 73

Gly Gly Gly Gly Pro Lys Arg Lys Gly Pro Lys15 10

<210> 74<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 74

Gly Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser15 10 15

<210> 75<211> 12<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 75

Gly Gly Gly Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr1 5 10

<210> 76<211> 27<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 76

Gly Gly Gly Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp Glu Asp Arg

1 5 10 15

Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Gly Gly Cys20 25

<210> 77<211> 18<212 > PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 77

Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Gly

1 5 10 15

Gly Gly

<210> 78

<211> 25<212 > PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente

Gly Ala Val Val Gly Gly Leu10 15

<400> 78Gly Gly Gly1

Gly Gly Tyr

Ala Gly Ala5

Met Leu Gly20

Ala Ala Ala

Ser Ala Met25

<210> 79

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220><223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 79

Gly Gly Gly Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys1 5 10

<210> 80<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 80

Gly Gly Gly Lys Pro Ser Lys Pro Lys1 5

<210> 81<211> 23<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 81

Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys

15 10 15

Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn20

<210> 82<211> 28<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente

<400> 82 „,„-,,·

Lys Lys Lys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu

15 10 15

Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Asp Asp Asp20 25

<210> 83<211> 25<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 83

ASP Asp Asp Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu15 10 15

LGly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met20 25

<210> 84<211> 28<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<400> 84

Lys Lys Lys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu1 5 10 15

Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Lys Lys Lys20 25

<210> 85<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<400> 85

Gly Gly Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys15 10

<210> 86<211> 28<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 86

Asp Asp Asp Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu

1 5 10 15

Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Asp Asp Asp20 25

<210> 87<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<4 00 > 87

Gly Gly Gly Asn Asn Lys Gln Ser Pro Trp Pro Thr Lys Lys15 10

<210> 88

l<211> 21<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<400> 88

Asp Lys Asp Lys Gly Gly Val Gly Ala Gly Ala Ala Val Ala Ala Gly

1 5 10 15 20

Gly Asp Lys Asp Lys

<210> 89<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 89

Gly Gly Gly Gln Ala Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn10

<210> 90<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<400> 90

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Ala Ser Lys Pro Lys Thr Asn1 5 10

<210> 91<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 91

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Ala Lys Thr Asn15 10

<210> 92<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 92

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Ala Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn15 10

<210> 93<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 93

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Ala Pro Lys Thr Asn15 10

<210> 94<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<4 0 0 > 94

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Ala Thr Asn15 10

<210> 95<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 95

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Ala Ser Lys Ala Lys Thr Asn15 10

<210> 96<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 96

Gly Gly Gly Lys Lys Arg Ala Lys Pro Gly Gly15 10

<210> 97<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<211> 21<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 88

Asp Lys Asp Lys Gly Gly Val Gly Ala Gly Ala Ala Val Ala Ala Gly

15 10 15

Gly Asp Lys Asp Lys20

<210> 89<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 89

Gly Gly Gly Gln Ala Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn15 10

<210> 90<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 90

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Ala Ser Lys Pro Lys Thr Asn1 5 10

<210> 91<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 91

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Ala Lys Thr Asn15 10

<210> 92<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220><223 >

Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 92

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Ala Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn15 10

<210> 93<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 93

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Ala Pro Lys Thr Asn15 10

<210> 94<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<4 0 0 > 94

,Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Ala Thr Asn15 10

<210> 95<211> 14< 212 > PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 95

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Ala Ser Lys Ala Lys Thr Asn15 10

<210> 96<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 96

Gly Gly Gly Lys Lys Arg Ala Lys Pro Gly Gly15 10

<210> 97

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> PeptIdeo Gerado Sinteticamente<4OO> 97

Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Ala Gly Gly15 10

<210> 98<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 98

Gly Gly Gly Lys Lys Arg Ala Lys Ala Gly Gly15 10

<210> 99<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 99

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Ala Ser Lys Pro Lys Thr Asn1 5 10

<210> 100<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<22 3> Peptídeo Gerado Sinteticamente<4 00 > 100

Gly Gly Gly Gln Trp Ala Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn15 10

<210> 101<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente

<400> 101

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ala Lys Pro Lys Thr Asn15 10<210 > 102<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<400> 102

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Ala Asn15 10

<210> 103<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<400> 103

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Ala15 10

<210> 104<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<400> 104

Gly Gly Gly Ala Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly15 10

<210> 105<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<400> 105

Gly Gly Gly Lys Ala Arg Pro Lys Pro Gly Gly15 10

<210> 106<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 106Gly Gly Gly Lys Lys Ala Pro Lys Pro Gly Gly15 10

<210> 107<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 107

Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Ala Pro Gly Gly15 10

<210> 108<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 108

Gly Gly Gly Lys Lys Ala Pro Lys Ala Gly Gly15 10

<210> 109<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 109

Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Gly Trp Asn Thr Gly

15 10 15

Gly

<210> 110<211> 39<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 110

Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Gly Gly Gly Gln Trp

15 10 15

Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys

20 25 30

Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn35<210> 111<211> 23<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 O >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<4 00 > 111

Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Gln Trp Asn Lys Pro

15 10 15

Ser Lys Pro Lys Thr Asn Lys20

<210> 112<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 112

Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly

15 10 15

Gly

<210> 113<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial-------------------

<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 113

Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly

15 10 15

Gly

<210> 114<211> 18<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 114

Lys Lys Lys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu

15 10 15

Gly Gly<210> 115<211> 19<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 14

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 115

Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn

15 10 15

Thr Gly Gly

<210> 116<211> 18<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 14

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 116

_Asp _Leu Gl_y_Leu_Cys-Lys_Lys-Arg—P-ro Lys- Pro-G-ly-G-l-y Xaa-Trp-Asn

15 10 15

Thr Gly

<210> 117<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 14

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 117

Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn

15 10 15

Thr

<210> 118<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 14

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<4 0 0 > 118

Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn15 10 15

<210 > 119<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 14)

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 119

Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp15 10 15

<210> 120<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 14

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 120

Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa15 10

<210> 121<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 13

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 121

Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr

15 10 15

Gly

<210> 122<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 13

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 122

Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr15 10 15

<210> 123<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 13

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 123

Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn15 10 15

<210 > 124<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 13

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 124

Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp15 10

<210> 125<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 13

<223> Xaa = Qualquer Aminoãcido<400> 125

Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa15 10

<210> 126<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 12

_<22.3 >_Xaa =_Q.ualquer Aminoácido------------

<400> 126

Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly

15 10 15

Gly

<210> 127<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 12

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 127

Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly15 10 15<210> 128<211> 15<212 > PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 12

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 128

Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr15 10 15

<210> 129<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 12

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<4 0 0 > 129

Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn15 10

<210> 130<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 12

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 130

Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp15 10

<210> 131<211> 12<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 12

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 131

Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa15 10

<210 > 132<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 11

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 132

Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly Gly15 10 15

<210> 133<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 11

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 133

Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly15 10 15

<210> 134<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 11)

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 134Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr15 10

<210> 135<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 11

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 135

Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn15 10

<210> 136<211> 12<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 11

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<4 0 0 > 136

Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp15 10

<210> 137<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 11

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 137

Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa15 10

<210> 138<211> 15<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 10

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 138

Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly Gly15 10 15

<210> 139<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 10

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 139

Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly15 10

<210> 140<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 10

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 140

Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr15 10

<210> 141<211> 12<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 10

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 141

Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn15 10

<210> 142<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 10

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 142

Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp15 10

<210> 143<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<22 0>

<221> VARIANTE

<222> 10<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 143

Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa15 10

<210> 144<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 9

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 144

Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly Gly15 10<210> 145<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 9

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 145

Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr Gly15 10

<210> 146<211> 12<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 9

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 146

Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr15 10

<210> 147<211> 11<212 > PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 9

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 147

Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn15 10

<210> 148<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 9

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 148

Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp15 10

<210> 149<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 9

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 149

Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa1 5

<210> 150<211> 19<212> PRT

<213> Seqüência Artificial< 2 2 O >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 14

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 150

Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn

15 10 15

Thr Gly Gly

<210> 151

<211> 18

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE

<222> 14

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400 > 151

Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn

15 10 15

Thr Gly

<210> 152<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 14

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 152

Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn

15 10 15

Thr

<210 > 153<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> .Peptídeo Gerado Sinteticamente<22 0 >

<221> VARIANTE<222 > 14

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 153

Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn15 10 15

<210> 154<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 14

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 154

Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp10 15

<210> 155<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 14

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 155

Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa15 10

<210> 156<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<22 3> Peptldeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 13

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<4 0 0 > 156

Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr

15 10 15

Gly

<210> 157<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 13

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 157

Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn Thr15 10 15

<210> 158<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 13

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 158

Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp Asn15 10 15

<210> 159<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 13

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 159

Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa Trp15 10

<210> 160<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 13

<223> Xaa = Qualquer Aminoácido<400> 160

Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Xaa15 10

<210> 161<211> 18<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente

<400> 161Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys

15 10 15

His Met

<210> 162<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<4 0 0 > 162

Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys

15 10 15

His

<210> 163<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 163

Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys15 10 15

<210> 164 - ... _

<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 164

Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met15 10 15

<210> 165<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 165

Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn15 10

<210> 166<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 166

His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His

15 10 15

Met

<210> 167<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 167

His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His15 10 15

<210> 168<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente

<400> 168

His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys15 10 15

<210> 169<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 169

His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met15 10

<210> 170<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 170

His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn1 5 10

<210> 171<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 171

Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met15 10 15

<210> 172<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 172

Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His15 10 15

<210> 173<211> 14<212> PRT

<213 > Seqüência_Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 173

Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys15 10

<210> 174<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 174

Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met15 10

<210> 175<211> 12<212> PRT<213> Seqüência

Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 175

Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn1 5 10

<210> 176<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 176

Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met15 10 15

<210> 177<211> 14<212> PRT

<213 > Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<4 0 0 > 177

Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His15 10

<210> 178<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 178

Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys15 10

<210 > 179<211> 12<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente

<400> 179

Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met15 10<210> 180<211> 18<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220><223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 180

Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys

1 5 10 15

His Val

<210> 181<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 181

His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His

1 5 10 15

Val

<210> 182<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 182

Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val1 5 10 15 <210> 183<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 183

Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val1 5 10 15

<210> 184

<211> 18

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 184

Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys

15 10 15

His Met

<210> 185<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 185

Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys

15 10 15

His

<210> 186<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 186

Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys15 10 15

<210> 187<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 187

Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met15 10 15

<210> 188<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 188

Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn<210> 189<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<4 0 0 > 189

His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His

15 10 15

Met

<210> 190<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<4 00 > 190

His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His15 10 15

<210> 191<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<4 00 > 191

His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys15 10 15

<210> 192<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 192

His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met15 10

<210> 193<211> 13<212> PRT<213> Seqüência

Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 193

His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn15 10

<210> 194<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 194

Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met15 10 15

<210> 195<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 195

Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His15 10 15

<210 > 196<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 196

Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys15 10

<210> 197<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente

<400> 197

Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met15 10<210 > 198<211> 12<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 198

Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn15 10

<210> 199<211> 18<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 199

Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys

15 10 15

His Val

<210> 200<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 200

His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His

15 10 15

Val

<210> 201<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 201

Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val1 5 10 15

<210> 202<211> 18<212> PRT<213> Seqüência

Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 202

Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys

1 5 10 15

His Met

<210> 203<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 203

Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys

15 10 15

His

<210> 204<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<4 00> 204

Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys15 10 15

<210> 205<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sintetieamente<400> 205

Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met15 10 15

<210> 206<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente

<400> 206

Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn10

<210> 207<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 207

His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His

1 5 10 15

Met

<210> 208<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 208

His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His1 5 10 15

<210> 209<211> 15<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 209

His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys1 5 10 15

<210> 210<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 210

His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met1 5 10

<210> 211<211> 13<212> PRT<213> Seqüência

Artificial<22O>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 211

His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn1 5 10

<210> 212<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 212

Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met1 5 10 15

<210> 213<211> 15<212> PRT

<213 > Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 213

Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His1 5 10 15

<210> 214<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 214

Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys1 5 10

<210> 215<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 215

Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met1 5 1021612PRT

Seqüência Artificial<22 O >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 216

Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn15 10

<210><211><212><213 >

<210> 217<211> 18<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 217

Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys

15 10 15

His Val

<210> 218<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 218

His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His

15 10 15

Val

<210> 219<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 219

Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val15 10 15

<210> 220<211> 24<212> PRT<213> Seqüência

Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 220

Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln

1 5 10 15

Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln20

<210> 221<211> 26<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 221

Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Ser Gln Trp Asn Lys Pro

15 10 15

Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met20 25

<210> 222<211> 33<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 222

Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met Gly

15 10 15

Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His20 25 30

Met

<210> 223<211> 30<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 11

<223> Xaa = Asn ou Ser<220>

<221> VARIANTE<222> 23

<223> Xaa = Leu ou Met<220><221> VARIANTE<222> 26

<223> Xaa = Val ou Met<400> 223

Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Xaa Gln Trp Asn Lys Pro

1 5 10 15

Ser Lys Pro Lys Thr Asn Xaa Lys His Xaa Gly Gly Gly Gly20 25 30

<210> 224<211> 23<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 O >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE

<222> 11, 20

<223> Xaa = Gly ou Ser

<400> 224

Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln His Gly Xaa Ser Trp Gly Gln Pro

1 5 10 15

His Gly Gly Xaa Trp Gly Gln20

<210> 225<211> 18<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 12

<223> Xaa = Leu ou Met<220>

<221> VARIANTE<222> 15

<223> Xaa = Val ou Met<400> 225

Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Xaa Lys His Xaa Gly

1 5 10 15

Gly Gly

<210> 226<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptxdeo Gerado Sinteticamente<400> 226

Gly Gly Gly Ala Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn1 5 10

<210> 227<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 227

Gly Gly Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Gly Gly

15 10 15

Gly

<210> 228<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<400> 228

Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly

15 10 15

Gly

<210> 229<211> 5<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 1, 2, 3, 4, 5

<223> Xaa = N-(4-aminobutil)glicina

<400> 229

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5

<210> 230<211> 6<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 O >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 1, 2, 5

<223> Xaa = N-(4-aminobutil)glicina<220>

<221> VARIANTE<222> 3

<223> Xaa = N-(4-guanidinobutil)glicina<220>

<221> VARIANTE<222> 4, 6

<223> Xaa = (S)-N-(1-feniletil)glicina<400> 230

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5

<210> 231<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<22 0 >

<221> VARIANTE<222> 1, 4, 7

<223> Xaa = N-(4-aminoetil)glicina

<220>

<221> VARIANTE

<222> 2, 3, 5, 6, 8, 9

<223> Xaa = N-(2-(4-metoxifenil)etil)glicina

<400> 231

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5

<210> 232<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 1, 3, 10

<223> Xaa = N-(2-metoxietil)glicina<220><221> VARIANTE<222> 2

<223> Xaa = N-(2-3'-indoliletil)glicina<220>

<221> VARIANTE<222> 4, 7

<223> Xaa = N-(4-aminobutil)glicina<22 0 >

<221> VARIANTE<222> 5, 8

<223> Xaa = (S)-N-(1-feniletil)glicina<220>

<221> VARIANTE<222> 6, 9

<223> Xaa = N-(2-hidroxietil)glicina<400> 232

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10

<210> 233<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE

<222 > 1, 3, 5, 6, 8, 10, 11

<223> Xaa = (S)-N-(1-feniletil)glicina

<220>

<221> VARIANTE<222> 2, 4, 7, 9

<223> Xaa = N-(4-aminobutil)glicina<400> 233

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10

<210> 234<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<22 0 >

<221> VARIANTE

<222> 1, 3, 5, 6, 8, 10, 11

<223> Xaa = N-benzilglicina

<220><221> VARIANTE<222> 2, 4, 7, 9

<223> Xaa = N-(4-aminobutil)glicina<400> 234

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10

<210> 235<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE

<222 > 1, 3, 6, 10, 11

<223> Xaa = N-(2-metoxietil)glicina

<22 0 >

<221> VARIANTE<222> 2, 4, 7, 9

<223> Xaa = N-(4-aminobutil)glicina<220>

<221> VARIANTE<222> 5, 8

<223> Xaa = N-((8'-naftil)metil)glicina<400> 235

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10

<210> 236<211> 11<212 > PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE

<222> 1, 3, 5, 6, 8, 10, 11

<223> Xaa = N-(2-metoxietil)glicina

<220>

<221> VARIANTE<222> 2, 4, 7, 9

<223> Xaa = N-(4-aminobutil)glicina<400> 236

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10

<210> 237<211> 6<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 1, 2, 3, 5

<223> Xaa = N-(4-aminobutil)glicina<220>

<221> VARIANTE<222> 4, 6

<223> Xaa = (S)-N-(1-feniletil)glicina

<400> 237

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5

<210> 238<211> 6<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<22 0 >

<221> VARIANTE<222> 1, 3, 4, 6

<223> Xaa = N-(4-aminobutil)glicina<220>

<221> VARIANTE<222> 2, 5

<223> Xaa = (S)-N-(1-feniletil)glicina<400> 238

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5

<210> 239<211> 6<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Peptídeo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 1, 2, 3, 5

<223> Xaa = N-(4-aminobutil)glicina<220><221> VARIANTE<222> 4, 6

<223> Xaa = (S)-N-(1-feniletil)glicina<400> 239

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5

<210> 240<211> 6<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222> 1, 2, 3, 5

<223> Xaa = N-(4-aminobutil)glicina<220>

<221> VARIANTE<222> 4, 6

<223> Xaa = N-benzilglicina<400> 240

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5

<210> 241<211> 6<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo Gerado Sinteticamente<220>

<221> VARIANTE<222 > 1, 3, 5

<223> Xaa = N-(2-metoxietil)glicina<220>

<221> VARIANTE<222> 2, 4, 6

<223> Xaa = N-benzilglicina

<400> 241

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5

Claims

1. Reagente peptóide que interage preferivelmente comuma forma patogênica de uma proteína de doençaconformacional comparada com uma forma não patogênica daproteína de doença conformacional, o reagente peptóidecaracterizado por possuir uma fórmula de:Xa- (Q)n-Xbem que:cada Q é independentemente um aminoácido ou umaglicina N-substituída, e -(Q)- define uma região peptóide;Xa é H, (Ci-C6) alquil, cicloalquil, aril, aralquil,heteroaril, heteroarilalquil, heterocicloalquil, (Ci-C6)acil, amino (Ci-6) acil, um aminoácido, um grupo protetoramino ou um polipeptídeo de 2 a cerca de 100 aminoácidos,em que Xa é opcionalmente substituído por uma porçãoconjugada que é opcionalmente anexada através de uma porçãovinculadora;Xb é H, (Ci-C6) alquil, aril, aralquil, heteroaril,heteroarilalquil, heterocicloalquil, amino, alquilamino,dialquilamino, hidroxil, (C1-CeJalcoxi, arilóxi, aralcóxi,um grupo protetor carbóxi, um aminoácido ou um polipeptídeode 2 a cerca de 100 aminoácidos, em que Xb é opcionalmentesubstituído por uma porção conjugada que é opcionalmenteanexada através de uma porção vinculadora; eη é 3 a cerca de 30;em que pelo menos cerca de 50% da região peptóide -(Q)n compreende glicinas N-substituídas.

2. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a glicina N-substituída tema fórmula:- (NR-CH2-CO) -em que cada R é selecionado independentemente de (C2-C6) alquil, halo (C1- C6) alquil, (C2-C6) alquenil, (C2-C6)alquinil, (C6-Ci0) cicloalquil-aril, amino (C1-C6) alquil,amônio (Ci-C6) alquil, hidróxi (C1-C6) alquil, (C1-C6) alcóxi (C1-C6) alquil, carbóxi, carbóxi (C2-C6) alquil, carbamil,carbamil (C2-C6) alquil, guanidino, guanidino (C1-C6) alquil,amidino, amidino (C1-C6) alquil, tiol, (C1-C6Jalquiltiol,alquiltioalquil de 210 átomos de carbono, heterociclilcontendo N, heterociclil(C1-C6)alquil contendo N,imidazolil, imidazolilalquil de 4-10 átomos de carbono,piperidil, piperidilalquil de 5-10 átomos de carbono,indolil, indolilalquil de 9-15 átomos de carbono, naftil,naftilalquil de 11-16 átomos de carbono e arilíC.C6)alquil; em que cada porção R é opcionalmente substituídapor 1-3 substituintes selecionados independentemente dehalogênio, hidróxi e (C1-C6)alcoxi.

3. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que Xb é um aminoácidosubstituído opcionalmente por uma porção conjugada que éopcionalmente anexada através de uma porção vinculadora.

4. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que η é de cerca de 5 a cerca de 15.

5. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que cada Q é uma glicina N-substituída.

6. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a região peptóide -(Q)n- époliônico em pH fisiologicamente relevante.

7. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a região peptóide -(Q)n- temuma carga final de pelo menos 3+ em pH fisiologicamenterelevante.

8. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a glicina N-substituída tema fórmula -(NR-CH2-CO)-, em que R é selecionadoindependentemente de (C2-C6) alquil, halo (C1-C6) alquil, (C2-C6) alquenil, (C2-C6) alquinil, (C6-C10) cicloalquil-aril,amino (Ci-C6) alquil, amônio (C1-C6) alquil, hidróxiíCi-C6) alquil, (C1-C6) alcóxi (C1-C6) alquil, carbóxi, carbóxi(C2-C6) alquil, carbamil, carbamil (C2-C6) alquil, guanidino,guanidino (C1-C6) alquil, amidino, amidino (C1-C6) alquil, tiol,(C1-C6) alquiltiol, alquiltioalquil de 210 átomos decarbono, heterociclil contendo N, heterociclil(C1-C6)alquilcontendo N, imidazolil, imidazolilalquil de 4-10 átomos decarbono, piperidil, piperidilalquil de 5-10 átomos decarbono, indolil, indolilalquil de 9-15 átomos de carbono,naftil, naftilalquil de 11-16 átomos de carbono e arilíCi.-C6)alquil; em que cada porção R é opcionalmente substituídapor 1-3 substituintes selecionados independentemente dehalogênio, hidróxi e (C1-C6)alcóxi, e a região peptóide -(Q)η compreende pelo menos 3 glicinas N-substituídas, emque R é uma porção que possui carga em pH fisiologicamenterelevante.

9. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que as glicinas N-substituídascom carga compreendem uma porção R com carga que éselecionada independentemente de amino (C1-C6) alquil,amônio (C1-C6) alquil, guanidino, guanidino (C1-C6) alquil,amidino, amidino (C1-C6) alquil, heterociclil contendo N, eheterociclil(C1-C6)alquil contendo N, em que cada porção Ré opcionalmente substituída por 1-3 substituintesselecionados independentemente de halogênio, Ci-C metóxi eCi-C3 alquil.

10. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que a região peptóide -(Q)n-compreende o ID. DE SEQ. N°: 229, 230, 231, 232, 233, 234,-235, 236, 237, 238, 239, 240 OU 241.

11. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que a região peptóide -(Q)n-compreende o ID. DE SEQ. N°: 229, 230, 232, 233, 237, 238,-239 ou 240.

12. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que a região peptóide -(Q)n-compreende o ID. DE SEQ. N°: 230, 237, 238, 239 ou 240.

13. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que a região peptóide -(Q)n-compreende o ID. DE SEQ. N°: 240.

14. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado por compreender pelo menos uma porçãoconjugada.

15. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação-14, caracterizado pelo fato de que a porção conjugada éanexada através de uma porção vinculadora.

16. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação-14, caracterizado pelo fato de que a porção conjugada é umagente de entrecruzamento ou um agente de ligação.

17. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação-14, caracterizado pelo fato de que a porção conjugadacompreende biotina ou um grupo mercapto.

18. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que a proteína de doençaconformacional é aquela de uma doença relacionada a príon;a forma patogênica da proteína de doença conformacional éPrPsc; e a forma não patogênica da proteína de doençaconformacional é PrPc.

19. Reagente peptóide, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que o reagente peptóideinterage com a forma patogênica da proteína de doençaconformacional com uma afinidade pelo menos cerca de 10vezes maior do que para a forma não patogênica da proteínade doença conformacional.

20. Reagente peptóide que interage preferivelmente comPrPsc comparado com PrPc, caracterizado pelo fato de que oreagente peptóide tem a fórmula:<formula>formula see original document page 240</formula>em que:cada Q é independentemente uma glicina N-substituídaque possui a fórmula:<formula>formula see original document page 240</formula>em que cada R é selecionado independentemente de (C2-C6Jalquil, halo (C1-C6) alquil, (C2-C6) alquenil, (C2-C6) alquinil, (C6-C1O) cicloalquil-aril, amino (C1-C6) alquil,amônio (C1-C6) alquil, hidróxi (C1-C6) alquil, (C1-C6) alcóxi (C1-C6) alquil, carbóxi, carbóxi (C2-C6) alquil, carbamil,carbamil (C2-C6) alquil, guanidino, guanidino (C1-C6) alquil,amidino, amidino (C1-C6) alquil, tiol, (C1-C6Jalquiltiolialquiltioalquil de 210 átomos de carbono, heterociclilcontendo N, heterociclil(C1-C6)alquil contendo N,imidazolil, imidazolilalquil de 4-10 átomos de carbono,piperidil, piperidilalquil de 5-10 átomos de carbono,indolil, indolilalquil de 9-15 átomos de carbono, naftil,naftilalquil de 11-16 átomos de carbono e aril(C1-C6)alquil; em que cada porção R é opcionalmente substituídapor 1-3 substituintes selecionados independentemente dehalogênio, hidróxi e (C1-C6) alcóxi; e -(Q)p- define umaregião peptóide;Xa é H, (Ci-C6) alquil, cicloalquil, aril, aralquil,heteroaril, heteroarilalquil, heterocicloalquil, (C1-C6)acil, amino (Ci.-6) acil, um aminoácido, um grupo protetoramino, ou um polipeptídeo de 2 a cerca de 100 aminoácidos,em que Xa é opcionalmente substituído por uma porçãoconj ugada que e opcionalmente anexada através de uma porçãovinculadora;Xb é H, (C1-C6)alquil, aril, aralquil, heteroaril,heteroarilalquil, heterocicloalquil, amino, alquilamino,dialquilamino, hidroxil, (C1-C6)alcóxi, arilóxi, aralcóxi,um grupo protetor carbóxi, um aminoácido ou um polipeptídeode 2 a cerca de 100 aminoácidos, em que Xb é opcionalmentesubstituído por uma porção conjugada que é opcionalmenteanexada através de uma porção vinculadora; eη é 4, 5, 6, 7 ou 8 ;em que a referida região peptóide -(Q)11- tem uma cargafinal de pelo menos 3+ em pH fisiologicamente relevante.

21. Reagente peptóide caracterizado por serselecionado de:<formula>formula see original document page 241</formula><formula>formula see original document page 242</formula><formula>formula see original document page 243</formula><formula>formula see original document page 244</formula>

22. Reagente peptóide caracterizado por serselecionado de: <formula>formula see original document page 244</formula><formula>formula see original document page 245</formula><formula>formula see original document page 246</formula> ou sais destes.

23. Complexo, caracterizado por compreender o reagentepeptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10, 20 ou 21e um príon patogênico.

24. Composição, caracterizada por compreender oreagente peptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10,-20 ou 21 anexado a um suporte sólido.

25. Composição, caracterizada por compreender oreagente peptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10,-20 ou 21 e uma amostra.

26. Composição, de acordo com a reivindicação 25,caracterizada pelo fato de que a amostra é uma amostrabiológica.

27. Método para a detecção da presença de um príonpatogênico em uma amostra, caracterizado por compreender ocontato da referida amostra com um primeiro reagentepeptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10, 20 ou-21, sob condições que permitem a ligação do referidoreagente peptóide ao referido príon patogênico, sepresente, para formar um complexo, e detecção da formaçãodo referido complexo, em que a formação do complexo éindicativa da presença do referido príon patogênico.

28. Método para detecção da presença de um príonpatogênico em uma amostra, caracterizado por compreender ocontato da referida amostra com um primeiro reagentepeptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10, 20 ou 21sob condições que permitem a ligação do referido primeiroreagente peptóide ao referido príon patogênico, sepresente, para formar um primeiro complexo, o contato doreferido primeiro complexo com um segundo reagente peptóideda invenção, opcionalmente marcado de forma detectável, sobcondições que permitem a ligação do referido segundoreagente peptóide ao referido prion patogênico do referidoprimeiro complexo, para formar um segundo complexo, edetecção da formação do referido segundo complexo, em que aformação do referido segundo complexo é indicativa dapresença do príon patogênico.

29. Método para detecção da presença de um príonpatogênico em uma amostra, caracterizado por compreender ocontato da referida amostra com um primeiro reagentepeptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10, 20 ou 21sob condições que permitem a ligação do referido primeiroreagente peptóide ao referido príon patogênico, sepresente, para formar um primeiro complexo, remoção daamostra não ligada do referido primeiro complexo, o contatodo referido primeiro complexo com um segundo reagentepeptóide da invenção, opcionalmente marcado de formadetectável, sob condições que permitem a ligação doreferido segundo reagente peptóide ao referido príonpatogênico do referido primeiro complexo, para formar umsegundo complexo, e detecção da formação do referidosegundo complexo, em que a formação do referido segundocomplexo é indicativa da presença do príon patogênico.

30. Método para detecção da presença de um príonpatogênico em uma amostra, caracterizado por compreender ocontato da amostra com um primeiro reagente peptóide dequalquer uma das reivindicações 1, 10, 20 ou 21 sobcondições que permitem a ligação do referido primeiroreagente peptóide ao referido prion patogênico, sepresente, para formar um primeiro complexo, remoção daamostra não ligada do referido primeiro complexo,dissociação do referido príon patogênico do referidoprimeiro complexo gerando, dessa forma, prion patogênicodissociado, o contato do referido príon patogênicodissociado com um segundo reagente peptóide de acordo com areivindicação 1, opcionalmente marcado de forma detectável,sob condições que permitem a ligação do referido segundoreagente peptóide ao referido príon patogênico dissociado,para formar um segundo complexo, e detecção da formação doreferido segundo complexo, em que a formação do referidosegundo complexo é indicativa da presença do príonpatogênico.

31. Método para detecção da presença de um príonpatogênico em uma amostra, caracterizado por compreender ocontato da referida amostra com um primeiro reagentepeptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10, 20 ou 21sob condições que permitem a ligação do referido primeiroreagente peptóide ao referido príon patogênico, sepresente, para formar um primeiro complexo, o contato doreferido primeiro complexo com um reagente de ligação depríon, opcionalmente marcado de forma detectável, sobcondições que permitem a ligação do referido reagente deligação de príon ao referido príon patogênico do referidoprimeiro complexo, para formar um segundo complexo, edetecção da formação do referido segundo complexo, em que aformação do referido segundo complexo é indicativa dapresença do príon patogênico.

32. Método para detecção da presença de um príonpatogênico em uma amostra, caracterizado por compreender ocontato da referida amostra com um primeiro reagentepeptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10, 20 ou 21sob condições que permitem a ligação do referido primeiroreagente peptóide ao referido príon patogênico, sepresente, para formar um primeiro complexo, remoção daamostra não ligada do referido primeiro complexo, o contatodo referido primeiro complexo com um reagente de ligação depríon, opcionalmente marcado de forma detectável, sobcondições que permitem a ligação do referido reagente deligação de príon ao referido príon patogênico do referidoprimeiro complexo, para formar um segundo complexo, edetecção da formação do referido segundo complexo, em que aformação do segundo complexo é indicativa da presença dopríon patogênico.

33. Método para detecção da presença de um príonpatogênico em uma amostra, caracterizado por compreender ocontato da referida amostra com um primeiro reagentepeptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10, 20 ou 21sob condições que permitem a ligação do referido primeiroreagente peptóide ao referido príon patogênico, sepresente, para formar um primeiro complexo, remoção daamostra não ligada do referido primeiro complexo,dissociação do referido príon patogênico do referidoprimeiro complexo gerando, dessa forma, príon patogênicodissociado, o contato do referido príon patogênicodissociado com um reagente de ligação de príon,opcionalmente marcado de forma detectável, sob condiçõesque permitem a ligação do referido reagente de ligação depríon ao referido príon patogênico dissociado, para formarum segundo complexo, e detecção da formação do referidosegundo complexo, em que a formação do referido segundocomplexo é indicativa da presença do referido príonpatogênico.

34. Método para detecção da presença de um príonpatogênico em uma amostra, caracterizado por compreender ocontato da referida amostra com um primeiro reagentepeptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10, 20 ou 21sob condições que permitem a ligação do referido primeiroreagente peptóide ao referido príon patogênico, sepresente, para formar um primeiro complexo, remoção daamostra não ligada do referido primeiro complexo,dissociação do referido príon patogênico do referidoprimeiro complexo gerando, dessa forma, príon patogênicodissociado, o contato do referido príon patogênicodissociado com um reagente de ligação de príon sobcondições que permitem a ligação do referido reagente deligação de príon ao referido príon patogênico dissociado,para formar um segundo complexo, e detecção da formação doreferido segundo complexo com a utilização de um segundoreagente de ligação de príon, opcionalmente marcado deforma detectável, em que a formação do referido segundocomplexo é indicativa da presença do príon patogênico.

35. Método para detecção da presença de um príonpatogênico em uma amostra, caracterizado por compreender ocontato da referida amostra com um reagente de ligação deprlon sob condições que permitem a ligação do referidoreagente de ligação de príon ao príon patogênico, sepresente, para formar um primeiro complexo, remoção daamostra não ligada do referido primeiro complexo, o contatodo referido primeiro complexo com um reagente peptóide dequalquer uma das reivindicações 1, 10, 20 ou 21,opcionalmente marcado de forma detectável, sob condiçõesque permitem a ligação do referido reagente peptóide aoreferido príon patogênico do referido primeiro complexo,para formar um segundo complexo, e detecção da formação doreferido segundo complexo, em que a formação do referidosegundo complexo é indicativa da presença do referido príonpatogênico.

36. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 31, 32, 33, 34 ou 35, caracterizado pelofato de que o referido reagente de ligação de príoncompreende um anticorpo anti-príon.

37. Método para detecção da presença de um príonpatogênico em uma amostra, caracterizado por compreender: ocontato da referida amostra com um primeiro reagentepeptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10, 20 ou 21sob condições que permitem a ligação do referido primeiroreagente peptóide ao referido príon patogênico, sepresente, para formar um complexo, remoção da amostra nãoligada do referido complexo, dissociação do referido príonpatogênico do referido complexo gerando, dessa forma, príonpatogênico dissociado, o contato do referido príonpatogênico dissociado com um segundo suporte sólido sobcondições que permitem que o referido príon patogênicodissociado seja aderido ao referido segundo suporte sólido;e detecção do príon patogênico dissociado aderido com autilização de um reagente de ligação de príon,opcionalmente marcado de forma detectável, em que a ligaçãodo referido reagente de ligação de príon indica a presençado referido príon patogênico.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37,caracterizado pelo fato de que a referida dissociação érealizada por exposição do referido complexo a um pHelevado ou a um pH reduzido.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38,caracterizado ainda por compreender a etapa deneutralização do referido pH elevado ou do referido pHreduzido após a referida dissociação.

40. Método, de acordo com a reivindicação 37,caracterizado pelo fato de que o referido príon patogênicodissociado é desnaturado.

41. Método, de acordo com a reivindicação 37,caracterizado pelo fato de que o referido reagente deligação de príon compreende um anticorpo anti-príon.

42. Método para detecção da presença de um príonpatogênico em uma amostra, caracterizado por compreender: ocontato da referida amostra com um primeiro reagentepeptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10, 20 ou 21sob condições que permitem a ligação do referido primeiroreagente peptóide ao referido príon patogênico, sepresente, para formar um primeiro complexo, remoção daamostra não ligada do referido primeiro complexo,dissociação do referido príon patogênico do referidoprimeiro complexo gerando, dessa forma, príon patogênicodissociado, o contato do referido príon patogênicodissociado com utn segundo suporte sólido, em que o referidosegundo suporte sólido compreende um primeiro anticorpoanti-prlon, sob condições que permitem que o referido príonpatogênico dissociado se ligue ao referido primeiroanticorpo anti-príon, para formar um segundo complexo; edetecção do referido príon patogênico dissociado doreferido segundo complexo com um segundo anticorpo anti-príon, opcionalmente marcado de forma detectável, em que aligação do referido segundo anticorpo anti-príon indica apresença do referido príon patogênico.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42,caracterizado pelo fato de que a referida dissociação érealizada por exposição do referido primeiro complexo a umpH elevado ou a um pH reduzido.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado ainda por compreender a etapa deneutralização do referido pH elevado ou do referido pHreduzido após a referida dissociação.

45. Método, de acordo com a reivindicação 42,caracterizado pelo fato de que o referido príon patogênicodissociado é desnaturado.

46. Método, de acordo com a reivindicação 42,caracterizado pelo fato de que o referido primeiro reagentede ligação de príon compreende um anticorpo anti-príon.

47. Método, de acordo com a reivindicação 42,caracterizado pelo fato de que o segundo reagente deligação de príon compreende um anticorpo anti-príon.

48. Método de determinação de uma localização de umainfecção por uma doença relacionada a príon em um animal,caracterizado por compreender:(a) administração ao referido animal de um reagentepeptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10, 20 ou-21, em que o referido reagente peptóide está ligado a umagente de formação de imagens; e(b) detecção do referido agente de formação deimagens, em que a detecção do referido agente de formaçãode imagens determina a localização da referida infecção.

49. Método para o isolamento de um príon patogênico deuma amostra, caracterizado por compreender:(a) o contato de um suporte sólido que compreende umreagente peptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10,-20 ou 21 com a referida amostra sob condições que permitema ligação do referido príon patogênico, se presente naamostra, ao referido reagente peptóide para formar umcomplexo; e(b) remoção da amostra não ligada do referido complexogerando, dessa forma, príon patogênico isolado.

50. Método para redução da quantidade do príonpatogênico em uma amostra, caracterizado por compreender:(a) o contato do suporte sólido que compreende umreagente peptóide de qualquer uma das reivindicações 1, 10,-20 ou 21 com a referida amostra sob condições que permitema ligação do referido príon patogênico, se presente nareferida amostra, ao referido reagente peptóide do referidosuporte sólido para formar um complexo; e(b) separação da amostra não ligada do referidocomplexo gerando, dessa forma, a referida amostra com umaquantidade reduzida do príon patogênico.

51. Método de preparação de um suprimento sangüíneoque é substancialmente livre de um príon patogênico,caracterizado por compreender:(a) detecção da presença ou ausência de príonpatogênico em diversas amostras de sangue, em que areferida detecção envolve a ligação do referido prionpatogênico, se presente, a um reagente peptóide de qualqueruma das reivindicações 1, 10, 20 ou 21; e(b) combinação das referidas amostras nas quais opríon patogênico não é detectado fornecendo, dessa forma, osuprimento sangüíneo que é substancialmente livre do príonpatogênico.

52. Método de preparação de um produto alimentício queé substancialmente livre de um príon patogênico,caracterizado por compreender:(a) detecção da presença ou ausência de príonpatogênico em diversas amostras de alimentos, em que areferida detecção envolve a ligação do referido príonpatogênico, se presente, a um reagente peptóide de qualqueruma das reivindicações 1, 10, 20 ou 21; e(b) combinação das referidas amostras nas quais opríon patogênico não é detectado fornecendo, dessa forma, oreferido produto alimentício que é substancialmente livredo príon patogênico.