BG106686A

BG106686A - Метод за диагностика на преносима гъбична форма на неизострена енцефалопатия, предизвикана от разновидност на неконвенционален преносим агент в биологична проба

Info

Publication number: BG106686A
Application number: BG106686A
Authority: BG
Inventors: Jean-Philippe Deslys; Emmanuel Comoy; Jacques Grassi
Original assignee: Commissariat A L'energie Atomique
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 2002-05-10
Publication date: 2003-11-28
Also published as: DZ3229A1; WO2001035104A1; JP2003530541A; EP1232395A1; CN1391652A; FR2801106A1; HU230068B1; JP4842478B2; DE60032932D1; CA2390891A1; US20060084130A1; CA2390891C; EP1232395B1; FR2801106B1; HUP0203691A2; US7097997B1; PT1232395E; RO121829B1; US7429463B2; DE60032932T2

Abstract

По метода пробата се обработва с поне една протеаза К, така че напълно да се разградят PrPsens, приусловия, при които всички или част от повторението на октапептидни мотиви от PrPres се запази, независимо от разновидността. Обработената проба се въвежда в контакт с един лиганд, който е в състояниеспецифично да различи повторението на октапeптидни мотиви. Открива се възможното присъствие на комплекс от лиганд-повторение на октапептидните мотиви. Изобретението се отнася и до диференциално-диагностичен метод.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящото изобретение е свързано с метод за диагностика на преносима гъбична форма на неизострена енцефалопатия (TSSE), предизвикана от разновидност на неконвенционален преносим агент (UTA) в биологична проба, посредством откриване на анормални прион протеини РгРres, а също и до употребата в контекста на диференциалната диагноза на различни разновидности на UTA в биологична проба.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Преносимите гъбични форми на неизострените енцефалопатии (TSSEs) се предизвикват от неконвенционални преносими агенти (UTAs), също така наречени приони, като точното им естество до момента остава дискусионно. TSSEs съществено включват болестта на Кройцфелд - Якобс (BSE) при хората, краста по овцете и козите и гъбична форма на енцефалопатия по «ΜΜ* говедата (BSE). Други енцефалопатии са демонстрирани при семейството на котките, при норката или някои диви животни като елен или лос.

Тези болести винаги са с фатален край и в момента нямат ефективно лечение.

При TSSEs се получава натрупване на протеин на приемника или прион протеин (РгР), в анормална форма (PrP-res), главно в централната нервна система; PrP-res съвместно със способността да причинява инфекции и да се натрупва, предхожда появата на хистолочни увреждания. In vitro, той е токсичен за невронни култури.

Двете изоформи на РгР имат еднаква аминокоселинна последователност (виж фигура 1), но се различават по тяхната вторична структура: PrP-res има значително по-високо съдържание на β- надиплени листи, докато нормалния PrP-sen има по-голям брой α - спирали.

В общия случай, две биохимични свойства дават възможност да се различат тези две изоформи.

PrP-res е частично устойчив към протеаза, по-специално към протеиназа К (РК), която предизвиква разцепване (кливаж) в неговия N - край. След действието на РК, PrP-res често се нарича РгР27-30, поради очевидното молекулно тегло на дигликозилатната форма; обикновено се приема, че мястото на разцепване на PrP-res е разположено между аминокиселините 89 и 90 (Prusiner et al, Cell, 1984) за конвенционалните разновидности.

PrP-res е неразтворим в нейонни разтворители, като TRITON XI00 или TRITON 114.

Обикновената форма на прион протеина PrP-sen, по принцин напълно се разлага от протеаза и е напълно разтворима при наличие на нейонни разтворители.

Пептидните последователности на РгР при хамстер, човек, говедо и овца са дадени на фигура 1; по-специално те включват един октапептиден мотив (P(H/Q GGG(- /T)WGQ), който се повтаря 4 или 5 пъти, в зависимост от вида. Това повторение на октапептидния мотив съответства на аминокиселини 5191 от РгР (номерирана е последователността на хуманен РгР) (В. Oesch et al, 1991).

За проследяване наличието на инфекциозен агент, последните методи са основани на селективно проследяване на абнормални PrP-pres свързани към инфекциозния агент, като се използва преимуществото неговата частична устойчивост към протеаза.

Възможно е да се различат:

- Западни методи за оцветяване, които се основават на имунологично проследяване на PrP-res в тъканен екстракт, след обработка на екстракта с протеаза, така че да се разруши нормалната изоформа на PrP-sen, отделяне на протеините от екстракта посредством електрофореза, прехвърляне върху полимерна мембрана и проследяване със специфично антитяло, което разпознава РгР (Schaller О. et al., 1999).

- изпитвания от тип ELISA, които също включват обработка на тъканен екстракт с протеаза.

Измежду тези различни изпитвания, които включват обработката на тъканни екстракти с протеаза, можем да се позовем на:

- това описано от Serban et al. (Neurology, 1990, 40, 110), който е разработил изпитване за проследяване на PrP-res, което включва обездвижване на протеините върху нитроцелулозна мембрана, последвано от смилане с протеаза, денатуриране и имунодетекция с моноклонални антитела.

- това описано от Oesch et al. (Biochemistry, 1994, 33, 5926-5931), който предлага за определяне количествено на PrP-res, имунофилтрационен анализ за пречистване на PrP-res (ELIFA или ензимно-свързан имунофилтрационен анализ).

- това описано от Gratwohl et al. , 1997, който предлага анализ от тип ELISA. След обработка на пробите с протеиназа К и пречистване на PrP-res с центрофугиране, те се адсорбират върху микрофилтрационни плочки и се проследяват с използване на поликлонални антитела от заек.

- това описано от Safar et al., 1998, който не използва протеиназа К, но сравнява имунорективността на PrP-res обездвижени върху твърда опора, в зависимост от това, дали пробата е подложена на денатурираща обработка.

Обикновено, тези различни изпитвания имат за недостатък липсата на чувствителност и по този начин се причиняват погрешни негативи.

Други методи предлагат обработка на пробата с денатуриращи продукти (Oesch et al. , 1994 и 1999 WO 00/22438, The Regents of the University of California), ограничена обработка c протеиназа K (WO 00/29850, Wallac Oy et al.) или обработка c металопептидаза (WO 00/22438), която осигурява достъп до скрити антигенни места, които могат да се проследят с моноклонално антитяло 3F4, което разпознава областта 109-112 на АПрП (WO 00/29850 или WO 00/22438).

Методът описан в WO 00/29850, Wallac Oy et al., има за основен недостатък отсъствието на специфичност, дължащо се по-специално, на непълното отстраняване на РгР при препоръчваните условия за обработка, докато на методът описан в WO 00/22438, The Regents of the University of

California, липсва чувствителност поради употребата на проследяващо антитяло 3F4 (WO 00/22438), което се свързва само към един мотив на протеина.

Заявителят наскоро е осигурил изпитване за количествено откриване на PrP-res, което обхваща етап за пречистване, водещ до значително почувствително проследяване и който представлява огромен напредък за медицински мониторинг и анализ на PrP-res в кланици. Този метод, поспециално, е описан в РСТ международна заявка WO 99/41280 и в предварителния доклад на Генералната дирекция XXIV на Европейската комисия (политика за потребителя и защита здравето на потребителя; htpp://europa.eu.int/comm./dg24/health/).

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

При това, поради необходимостта от особено надеждно изпитване за диагностика на TSSEs, заявителят е продължил своите изследвания.

За да се постигне изпитване за откриване, по-специално е установено следното:

(i) изпитването да е чувствително, т.е. да има способността правилно да идентифицира незаразени животни, (п) да бъде специфично, т.е. да има способността правилно да идентифицира заразени животни, които показват клинични симптоми, (iii) да има колкото е възможно по-ниска граница за проследяване, т.е. даваща възможност за откриване на малки количества от PrP-res (откриване на PrP-res преди появата на клинични симптоми) и (iv) да има възможност да се възпроизвежда, биологичната проба, която ще се анализира трябва да се обработва в условия даващи възможност за консервиране на всички или някои от октапептидните мотиви, изключително в

PrP-res.

По-специално е открито, че за да бъдат задоволени ефективно горните четири условия (i) - (iv), е необходимо да се определят прецизно условията за обработка на пробата, която ще се анализира. При тези прецизни условия трябва напълно да се елиминират РгР от пробата, като в същото време се даде възможност за улавяне само на PrP-res.

ф

Обект на настоящото изобретение е метод за диагностика (метод А) на TSSE или прионна болест, предизвикана от разновидност на UTA, посредством проследяване на PrP-res в биологична проба. Методът се характеризира с това, че той включва:

(1) обработка на споменатата проба с поне една протеиназа К (РК), по такъв начин, че напълно да се разпадне РгР, като в същото време се запазят всички или някои от повторяемите октапептидни мотиви от PrP-res, независимо каква е разновидността на UTA; за предпочитане, посочената РК обработка се извършва при концентрация от 30 рг/мл до 200 рг/мл за 10 мин при 37°С за хомогенат при 10% (биологична проба под формата на хомогенат в подходящ буферен разтвор), или за определен период и при концентрация, които съответстват на концентрация от 30 рг/мл до 200 рг/мл за 10 мин при 37°С за хомогенат при 10%.

(2) довеждане на обработваната проба в контакт с един лиганд за споменатите октапептидни мотиви, по-специално антитела насочени срещу повторенията на октапептиден мотив и (3) проследяване възможното наличие на комплекс от повторения на октапептиден мотив/ лиганд.

Според едно преимуществено изпълнение на метода, обработката със споменатата протеиназа К е за период от 30 сек до 2 часа, при температура под 80°С, за предпочитане за период от 10 до 30 мин при 37°С, при гореспоменатите концентрации от 30 рг/мл до 200 рг/мл за хомогенат при 10% (окончателна концентрация) или за 30 мин при концентрация от 10 рг/мл до 70 рг/мл за хомогенат при 10% (окончателна концентрация) или за концентрация от 25 рг/мл до 175 рг/мл за хомогенат при 25% (окончателна концентрация).

Трябва да се отбележи, че известен брой параметри са тясно свързани помежду си: концентрацията на протеиназа К пряко зависи от продължителността на обработката (време за инкубация) на пробата; може да се счита, че при 37°С например, 10 мин инкубация с РК при концентрация от 30 до 200 рг/мл, от хомогенат при 10% се равнява на 30 мин инкубация с РК при концентрация от 10 до 70 рг/мл от хомогенат при 10%. Например, една инкубация за 30 мин с РК при 25 рг/мл се равнява на 10 мин инкубация с РК при концентрация от 75 рг/мл.

Каквито и да са концентрацията на РК и продължителността на инкубацията, обработваната проба не трябва повече да съдържа неразпаднали се РгР, докато PrP-res, който е възможно да присъства, е запазил всички или някои октапептидни мотиви.

При определяне на активната концентрация от РК могат, в по-малка степен (по несъществен начин), да участват и други параметри; това поспециално включва, буферния разтвор в който се разтваря РК; когато РК се разтваря в буферния разтвор за хомогенизиране на пробата, в зависимост от използвания хомогенизационен буферен разтвор, минималната концентрация на РК може да се изменя в диапазона на посочените по-горе концентрации:

в глюкозен буфер или в гуанидин (или негова сол), минималната концентрация на РК е за предпочитане да бъде 25 рг/мл (инкубация за 30 мин) или 75 рг/мл (инкубация за 10 мин);

в PBS буфер, минималната концентрация на РК е за предпочитане 50 рг/мл (инкубация за 30 мин) или 150 рг/мл (инкубация за 10 мин).

Преимуществено, РК може да се използва в буферен разтвор който се различава от хомогеназиционния буфер; такъв буферен разтвор преимуществено включва поне един повърхностно активен агент и/или поне един хаотропен агент и/или поне една сол.

Също е преимуществено, след обработка (или инкубация) на пробата с протеиназа К, получената суспензия, преимуществено да се обработи в условията определени в международна заявка 99/41280, а именно:

- добавяне към тази суспензия на буферен разтвор В, както е определен в същата международна заявка 99/41280 и по-специално С₃-Сб алкохоли и смеси на алкохол, чиято средна диелектрична константа е между 10 и 25,

- центрофугиране на получената суспензия и

- разтваряне на таблетката в буферен разтвор включващ поне един повърхностно активен агент и/или поне един хаотропен агент, при условията определени в споменатата международна заявка 99/41280.

1ШМШМ1Ш

Това изпитване има преимуществото да бъде особено подходящо за диференциална диагноза на TSSEs в същия приемник, предизвикана от различни разновидности на UTA, и по-специално за диференциална диагноза на BSE (гъбична форма на енцефалопатия при говеда) разновидности сравнени с конвенционални разновидности на краста при овцете.

Например, показано е, че в BSE разновидността, инфектирала хора във Великобритания, посредством анализ на електрофоретните профили на РгРres, който показва разлики в миграцията, в зависимост от UTA разновидностите; в пациенти, които развиват един нов вариант на vCJD (болест на Кройцфелд-Якобс) е открит характерен профил (тип 4), който се явява свързан с преминаващия от заразени говеда, BSE агент в храната за хора (Collinge et al., Nature, 1996). Подобен профил се наблюдава при макак заразен с BSE агент (Lasmezas et al., 1996) и котка, вероятно заразена с този агент (Priola et al., Nature Med., 1996).

Това представлява метод с голяма продължителност, който е труден за изпълнение, ако се искат възпроизведими резултати, вероятно включващ елемент на противоречие, което съществува по отношение класификацията на различните типове PrP-res и прилагането на този метод (Parchi et al., Nature, 1997).

Също така съществува силно подозрение за замърсяване на овцете с BSE агента (Butler, Nature, 1998). Тези животни, в действителност, са чувствителни към този агент, въпреки че при говедата съществува ендемична болест, крастата, друга TSSE, която има близки и неразличими клинични и хистологични характеристики. Единственият метод за сравнение при диференциална диагноза, между BSE агента и агента на крастата е инжектиране на мишки и изучаване профила на увреждането, което изисква изчакване за период от две години, като изучаването е проведено във Великобритания само върху 9 овце, при популация от няколко десетки милиона глави овце.

Направени са и първи опити за различаване на различните разновидности на UTA в проба; Kuczius Т. et al., 1999, е съобразил, че вариациите наблюдавани между различните TSSE разновидности (краста, BSE и CJD), при използване технология на гликопечат, не дават възможност да се различи всяка разновидност; екипът е избрал други биохимични и биологични маркери за PrP-res, които дават възможност да се различат по-ясно една от друга различните прионни разновидности. Аналитичните параметри, които екипът използва са следните: дълготрайна устойчивост към протеиназа К, молекулна маса на PrP-res, топология и количество на отлаганията от PrP-res. Получените резултати показват, че PrP-res на различните BSE разновидности и на крастата демонстрират значителни разлики в тяхната дълготрайна устойчивост към протеиназа К. Съпротивлението към протеиназа се изменя в зависимост от разновидността на краста: ниска устойчивост: разновидност на Chandler; междинна устойчивост: разновидност 22А; относителна стабилност: разновидност 87V. При едни и същи условия разновидностите на BSE демонстрират междинна устойчивост. Въпреки че, гликопечата не дава възможност да се разграничат разновидност на краста 87V и разновидностите на BSE, тези два типа разновидности са ясно различими след продължителна обработка с РК. Трябва да се има в предвид, че това не са протоколи, които са достатъчно надеждни и които могат да се използват в голям мащаб за полеви изследвания.

В този контекст, е важно да има надежден, чувствителен метод за откриване на PrP-res, който позволява диференциална диагноза, методът да бъде относително евтин и лесен за провеждане, като се използва биологична проба като тъканна проба.

Следователно, предмет на настоящото изобретение е също метод за диференциална диагноза (метод В) на TSSEs, причинени от разновидности на UTA в биологична проба, посредством откриване на PrP-res, свързани с различните UTA разновидности. Методът се характеризира с това, че включва:

(а) откриване на PrP-res в първа фракция на пробата, в съответствие с етапи от (1) до (3) от метода за диагностика на UTA разновидност, както е определен по-горе (метод А), след което:

(б) за всяка проба, за която в етап (а) е открито наличие на комплекс от повторения на октапептиден мотив/ лиганд се извършва:

обработка на втора фракция от пробата с поне една протеиназа К (РК), по такъв начин, че множеството от повторения на октапептидния мотив да се елиминират за PrP-res, които са свързани с поне една разновидност, която ни интересува, по-специално BSE разновидността и така че всички PrPres, които са свързани е другите UTA разновидности, да съхранят всички или някои от споменатите повторения на октапептидния мотив, при обявените условия; за предпочитане обработката да се извърши при същите условия, както са определени в етап (1) или (а), но при концентрация на РК, по-висока от тази използвана в етап (1) или (а),

- довеждане на втората фракция от пробата в контакт е лиганд, който е в състояние специфично да разпознае споменатите повторения на октапептидния мотив и откриване на възможното присъствие на комплекс от повторения на октапептидния мотив/ лиганд.

Предмет на настоящото изобретение е също метод за диференциална диагноза (вариант на метод В) на TSSEs причинени от разновидности на UTA в биологична проба, за която се счита, че съдържа PrP-res (изпитванията за откриването им са извършени по който и да е метод), методът се характеризира с това, че за всяка проба, за която е открито присъствие на PrPres, той включва:

обработка на друга фракция от биологичната проба в съответствие с етап (в), както е определено по-горе, довеждане на тази втора фракция от пробата в контакт с лиганд, който е в състояние специфично да разпознае повторенията на октапептидния мотив, и

- да открие възможното присъствие на комплекса от повторенията на октапептидния мотив/ лиганд.

В контекста на диференциалната диагноза (метод В), освен концентрацията на РК, възможно е и други условия да имат ефект върху разпадането на октапептидните мотиви, в зависимост от разновидността: поспецифично, когато РК се използва в буферен разтвор който се различава от хомогенизационния буфер, като такъв буфер който преимуществено включва поне един повърхностно активен агент и/или поне една сол, броят на разпадналите се октапептидни мотиви може силно да се изменя в зависимост от състава на буфера и от концентрацията на различните агенти.

Терминът “интересуваща ни разновидност” има предвид UTA разновидностите, по специално BSE разновидността, за която например, намерението е да се елиминира октапептидния мотив.

Една от главните характеристики на методи А и В е да се използват условията, при които се провежда обработката с протеаза, така че да се управлява разпадането на повторенията на октапептидния мотив. В зависимост от предвидената употреба, методът ще се проведе по такъв начин, че тези мотиви да се запазят (метод А) или да се разрушат (метод В):

в контекста на метод А, целта на това управление ще бъде да се запазят всички или някои от разновидностите на октапептидния мотив с цел постигане на едно много прецизно откриване на PrP-res;

в контекста на метод В, целта на управлението на разпадането от протеазата ще бъде, да се разпаднат множеството и по възможност изцяло повторенията на октапептидния мотив за PrP-res, съответсващ на разновидността(-тите) които ни интересуват, каквито и да са видовете в които те се изразяват, при условия, в които всички или някои от повторенията на октапептидния мотив се запазват за PrP-res, съответстващ на всички други TSSE разновидности. В този случай, предимството на изобретението е, че то позволява диференциална диагноза на интересуващите ни разновидности, свързани с други UTA разновидности.

По-характерно:

Изненадващо, при условията съгласно етап (1) или етап (а), РК не води до разцепване на всички или някои от повторенията на октапептидния мотив на PrP-res , свързани с всички UTA разновидности или приони, докато условията от етап (б) водят до разцепване на повторенията на октапептидния мотив на PrP-res, свързани с интересуващите ни разновидности, в същото време всички PrP-res свързани с други UTA разновидности запазват всички или някои от споменатите повторения на октапептидния мотив.

Също така е изненадващо, че едно такова изпитване, по-специално, когато лиганда е антитяло, има следните преимущества:

много голяма чувствителност на откриване, тъй като антителата насочени срещу повторенията на октапептидния мотив имат много по-голям афинитет от антителата, насочени срещу други области на PrP-res 27-30 и са по-устойчиви на използваните буферни разтвори; по-специално, разпознаването на повтарящ се мотив предизвиква взаимодействие с голям афинитет и осигурява възможност за закрепване на няколко молекули от антитялото към една РгР молекула;

възможността за диференциална диагноза на разновидностите на UTA или приони, защото е възможно, в зависимост от използваните условия, да се получи или да не се получи смилане на тези мотиви; по-специално е възможно, те да се елиминират за всички болести, свързани с интересуващата ни разновидност, например агента за BSE, при който е възможно той да се запази за други “прионни” заболявания. В резултат от това, методите съгласно изобретението осигуряват едно опростено изпитване за диференциална диагноза на BSE и/или друга интересуваща ни разновидност, свързана към други разновидности, като се използват два различни комплекса от условия (етап (1) или (а) и етап (б), условията на етап (1) или (а) (запазване на повторенията на октапептидния мотив от PrP-res свързани с всички разновидности на UTA), което позволява откриване на всички разновидности, и условията от етап (б) (елиминиране на тези мотиви само в PrP-res, свързани с разновидността, която ни интересува) като се разкриват само другите разновидности.

Затова, тези изпитвания намират по-специално приложение при разследване замърсяването на овце с разновидност на BSE, което обикновено не е възможно да се различи от конвенционалните разновидности на краста.

Според едно преимуществено изпълнение на споменатите методи, РК се разтваря в буферен разтвор, който за предпочитане включва:

а. поне един повърхностно активен агент, подбран от групата състояща се от:

анионни, повърхностно активни агенти, като SDS (натриев додекил сулфат), саркозил (лороилсаркозин), натриев холат, натриев деоксихолат или натриев торохолат;

- цветрионни, повърхностно активни агенти, като SB 3-10 (десилсулфобетаин), SB 3-12 (додецилсулфобетаин), SB 3-14, SB 3-16 (хексадецилсулфобетаин), CHAPS и деокси-CHAPS;

нейонни, повърхностно активни агенти, като С12Е8 (додецилоктаетилен гликол), TRITON Х100, TRITON XI14, Tween 20, Tween 80, MEGA 9 (нонаноилметилглукамин), октилглюкозид, LDAO (додецилдиметиламинов окис) или NP40, или

- смеси от повърхностно активни агенти, като смес на йонен повърхностно активен агент и нейонен повърхностно активен агент, смес от два йонни повърхностно активни агента или смес от един йонен повърхностно

активен агент и цветрионен повърхностно активен агент, и/или

б. поне един хаотропен агент, избран от групата състояща се от урея и гуанидин, или смес от тях, и/или

в. поне една сол, избрана от солите на метали, които могат да бъдат или да не бъдат алкални метали.

Според едно преимуществено формулиране на това изпълнение, споменатият буферен разтвор обхваща поне 5% анионен повърхностно активен агент, за предпочитане саркозил, като вариант комбиниран с SDS.

Според друго преимуществено изпълнение на методите, лиганда е избран от групата, състояща се от аптамери и антитела, способни да се свързват специфично в областта на повторенията на октапептидния мотив.

Предмет на настоящото изобретение също е комплект за диагностика за провеждане на методите, съгласно изобретението, характеризиращ се с това, че комплектът включва, в комбинация, поне един повърхностно активен агент и/или поне една сол и една протеаза, както са определени по-горе.

Комплексът от повторенията на октапептидния мотив и антитяло (когато лиганда е антитяло) се открива със стандартни имунологични методи.

ПОЯСНЕНИЕ НА ПРИЛОЖЕНИТЕ ФИГУРИ

Освен горните формулировки, изобретението също включва други такива, които възникват от следващото описание, което се отнася до примери за приложение на метода, който е предмет на настоящото изобретение и също от приложените чертежи, в които:

на фигура 1 са показани различни РгР последователности: на хуманен обект, на овца, на говедо, на мишка и на Cricetidae;

на фигура 2 е показано разкриване на PrP-res посредством Западно оцветяване;

фигури от 3 до 6 съответстват на различни условия съгласно, първо, на етап (1) или (а) и второ, на етап (б) при хуманни обекти (фигури 3 и 4) и при преживни животни (фигури 5 и 6), когато наличието на повторения на октапептиден мотив е открито посредством дву-обектово имунометрично изследване.

на фигури 7 - 12 е показано влиянието на буферните разтвори при диференциалното откриване на BSE и на краста.

на фигури 13 и 14 е показано влиянието на състава на буферните разтвори и на концентрацията на протеиназа К (ПК) за откриване на различни типове CJB.

на фигура 15 са показани резултатите получени при непосредствено смилане на мозъчни хомогенати с използване на протеиназа К.

на фигура 16 са показани различията в устойчивостта на PrP-res към протеиназа К, във функция от типа на CJB.

на фигура 17 е показано разкриване посредством Западно оцветяване на PrP-res, смлени с РК и пречистени в SAF форма.

При това, трябва ясно да се разбере, че тези примери са дадени само за илюстрация на предмета на изобретението, и те по никакъв начин не го ограничават.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Пример 1:Получаване и характеризиране на моноклонални антитела специфични за повторение на октапептиден мотив

Синтез и надписване на пептида

Един пептид, представителен за повторение на РгР октапептиден мотив, например за мотива G-G-W-G-Q-P-H-G-G-GW-G-Q-G-(nh2), съответстващ на последователност 79-92 на РгР на хуманен обект, се синтезира с използване на автоматичен синтезатор (Milligen 9050, Waters, Milford, MI). Пептидът ковалентно се свързва към ацетилхлорилнестераза (AchE) през един хетеробифункционален реагент, сукцинимидил 4-(Ь1-малеимидометил)циклохексан-1-карбоксилат (SMMCC, Calbiochem, France), както вече е описан за други пептиди или протеини ((McLaughlin et al., 1987, Grassi et al., 1989). Този метод включва реагиране на тиолна група въведена в пептида с малеимидна функция, която се присъединява към AchE посредством реакция с SMCC. Тиолната група се въвежда в пептида посредством реакция с Nсукцинимидил S-ацетилтиоацетат (SATA), както вече е описано (McLuaghlin et al., 1987). Свързването се постига посредством реагиране на AchE-SMCC при излишък на тиолатиран пептид.

Имунизация и приготвяне на моноклонални антитела

Приготвянето на фибрили свързани с краста (приготвяне на SAF, PrPres) се постигна от заразени мозъци на хамстер (разновидност на краста 263К), както е описано вече (Lasmezas et al., 1997). Приготвянето се активира с обработка с мравчена киселина, преди имунизация на мишките. Мишките, в които РгР е елиминиран (в които гена РгР е елиминиран) (мишки РгР^0/0) са имунизирани с приготвените SAF и клетки на хибридома, които са приготвени, както е вече описано ( Grassi et al., 1988,1989). Плаващите по повърхността елементи от културата се сканират, както е описано по горе. Оказва се, че е възможно да се идентифицират и стабилизират 57 хибродома; те са означени от SAF-1 до SAF-90. Всички тези антитела потвърждават възможността се да разпознават SAF обездвижени върху плочки за микротитриране, докато минимално количество от тях демонстрират възможност да разпознават пептид-AchE конюгати. Измежду тях, седем ясно разпознават повторението на октапептидния мотив (пептид 79-92); това са антителата SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35 и SAF-37. Списъкът на получените антитела, както и техните основни характеристики, са дадени в долната таблица. След клониране и разширение под формата на асцитна течност, моноклоналните антила се пречистват с афинитетна хроматография върху колона от протеин А-сефароза и се съхраняват при 19

20°С до тяхната употреба. Изотопът на антитялото се определя посредством имунодифузия, съгласно методът Ouchterlony.

- Сканиране на повърхностни елементи от култура на хибридома

Наличието на РгР- специфично антитяло в повърхностни елементи на култура от хибридома се демонстрира по два начина, посредством изпитване на тяхната способност да се свързват или с пептид-AchE конюгати или е SAF на хамстери. В първия случай, сканирането се извършва на плочки, съдържащи анти-мише IgG антитяло, обездвижено както е описано по-рано (Creminon et al., 1993, Frobert et al., 1991). Като обобщение, 100 рл от повърхностни елементи на културата и 100 цл от пептид-AchE конюгат реагират за една нощ при +4°С в плочки, съдържащи обездвижени анти-миши IgG антитела от коза. След измиване на плочките в кладенчетата се добавя 200 рл реагент на Ellman (Ellman et al., 1961), за да се открие наличието на AchE, свързан към твърдата фаза. Във втория случай плочки, съдържащи обездвижен подготвен SAF, се приготвят посредством реагиране е 50 рл от 2 рг/мл разтвор в 0.05 М фосфатен буфер, pH 7.4, за една нощ при стайна температура. След измиване плочките се потапят в буфер EIA (ЮОтМ фосфатен буфер, pH 7.4, съдържащ 150 mM NaCI, 0.1% албумин от говежди серум (BSA) и 0.01% натриев азид) за една нощ при +4°С и се съхраняват при тази температура до тяхната употреба. Свързването на моноклоналните антитела към обездвижените SAF се показва посредством употребата на анти-миши IgG антитела от коза, означени с AchE, както вече е описано (Negroni et al., 1998).

Моноклонални антитела	Изотип	Разпознат пептид	Монокло нални антитела	Изотип	Разпознат пептид
SAF 1	IgM	X	SAF 54*	IgG2b	142-160
SAF 2	9	A	SAF 56	IgM	A
SAF 3	IgG2a	X	SAF 58	IgM	A
SAF 4	IgG2a	A	SAF 59	IgM	A
SAF 5	IgGl	X	SAF 60*	IgG2b	142-160
SAF 7	IgG2a	X	SAF 61	IgG2a	142-160
SAF 8	IgGl	A	SAF 63	IgM	A
SAF 9	IgGl	A	SAF 65	igGl(?)	A
SAF 10	IgGl	A	SAF 66	IgG2a	142-160
SAF 11	IgG2a	X	SAF 67	IgGl	X
SAF 12	IgM	A	SAF 68	IgG2a	X
SAF 13	IgM	A	SAF 69*	IgG2b	142-160
SAF 14	IgGl	A	SAF 70*	IgG2b	142-160
SAF 15*	IgG3	79-92	SAF 72	IgG2b	A
SAF 21	IgGl	X	SAF 73	IgGl	X
SAF 22	9	A	SAF 75	IgG2a	142-160
SAF 23	IgGl	X	SAF 76	IgG2a	142-160
SAF 24	IgGl	A	SAF 77	IgGl	X
SAF 31*	IgG2b	79-92	SAF 80	IgGl	X
SAF 32*	IgG2b	79-92	SAF 81*	IgM	A
SAF 33*	IgG2b	79-92	SAF 82	IgGl	A
SAF 34*	IgG2a	79-92	SAF 83*	IgGl	A
SAF 35*	IgG2b	79-92	SAF 84*	IgG2b	A
SAF 37*	IgG2b	79-92	SAF 85	IgM	A
SAF 42	IgGl	A	SAF 91	IgM	A
SAF 44	IgM	A	SAF 94	IgM	A
SAF 50	IgM	A	SAF 95	IgGl	A
SAF 51	IgM	A	SAF 96	IgM	A
SAF 53*	IgG2a	X

Таблица: Получени моноклонални антитела в зависимост от изготвяне на

SAF от хамстер

79-92: антитела, които разпознават пептид 79-92

142-160: антитела, които разпознават пептид 142-160

Епитоп X: антитела, които не разпознават обездвижените SAF.

Епитоп А: антитела, които разпознават пептида 126-164, но не се свързват е пептида 142-160.

• моноклонални антитела, които демонстрират своята способност да разпознават PrP-sen на поне един от видовете, изпитвани по време на това изследване (хуманен вид, говедо, овца, мишка или хамстер) в контекста на един имунометричен анализ.

ПРИМЕР 2: Откриване на PrP-res, посредством Западно оцветяване

I: Обработка на пробата (i) Приготвяне на тъканен хомогенат от различни биологични проби

BSE при крави, краста при овце, vCJD (тип 4) при хора, спорадична CJD (тип 1) при хора и съответните отрицателни контроли

Вземат се 350 мг говежди мозък: той се смила и се хомогенизира при 20% (w/v) в 5% глюкозен разтвор.

За да се извърши хомогенизацията, мозъчната проба (350 мг) и 1.4 мл от глюкозния разтвор се въвеждат в тръби_; съдържащи керамични топчета и интензивно се разбъркват (Hybaid Robolyser).

Положителните проби се разреждат в хомогенат, получен от здрави мозъци от съответните видове, както следва:

• за овце: до 1/100 • за крави до 1/50 • за хора: тип 1 или 4 : до 1/40; тип 3: до 1/80; тип 2: до 1/20 (ii) Условия за етап (I)

Първа фракция (500 μπ) хомогенат при 20% получена от (i) се инкубира с 500 μπ буферен разтвор включващ 10% саркозил (SK10). 10% Triton XI00 (ТЮ), 2М урея (U2) и протеиназа К (РК) при 60 μτ/мл буферен разтвор (РК1), за 10 мин при 37°С (съответстващ на крайна концентрация от 30 μτ/мл за хомогенат при 10%).

На фигури от 3-6, РКЗ съответства на концентрация на РК от 180 μτ/мл буферен разтвор, a РК6 съответства на концентрация от РК от 360 рг/мл буферен разтвор.

(iii) добавя се 500 μπ буферен разтвор състоящ се от 1-бутанол (съответстващ на буферни разтвори В, както са описани в международната заявка WO 99/41280); сместа се центрофугира при 15000 об/мин за 5 мин (приблизително 17000 гр.) (iv) Получената от центрофугирането таблетка, която съдържа PrP-res, се пуска в 80-100 рл буферен разтвор С, както е описано в международна заявка WO 99/41280, за предпочитане буферен разтвор на Laemli, съдържащ 4% SDS и се нагрява при 100° С за 5 мин, за да се проведе Западно оцветяване, или в последствие да се потопи в буферен разтвор С1 съдържащ 6М урея и 0.5% саркозил, с последващо загряване за 5 мин при 100°С, след което в буферен разтвор С2, съдържащ 2М гуанидин, с последващо загряване за 5 мин при 100°С, като по този начин се извършва имунометричното изследване.

(ν) Условия за етап (б)

Втора фракция (500 μπ) хомогенат при 20% получена при (i) се инкубира с 500 μπ буферен разтвор съдържащ 5% саркозил (SK5), 5% SDS (SDS5), 1М урея (Ul) и протеиназа К (РК) при 360 рг/мл (РК6) за 10 мин при 37°С, след което се изпълняват гореописаните етапи (iii) и (iv).

II. Западно оцветяване

Получените проби се използват за провеждане на SDS-PAGE електрофореза и се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана при условия, регламентирани в пример 1 и пример 3 от гореспоменатата международна заявка WO 99/41280.

Имунопроследяването на PrP-res се извършва с моноклонални антитела SAF70 и SAF37, както е описано в пример 1 по-горе и с конюгирани с пероксидаза анти-заек Igs (1/2 500) от коза. Имунореактивността се разкрива посредством химилуминисценция (ECL, Amersham), количествено определена и нагледно представена на ауторадиографични филми, както е показано на фигура 2.

На тази фигура:

* полосите 1-5 съответстват на условията съгласно етап (1) или (а) (SK10+T10+U2+PK1).

Полоса 1: отрицателен контрол

Полоса 2: BSE при крава

Полоса 3: краста при овца

Полоса 4: vCJD (Тип 4)на хуманен обект

Полоса 5: CJD (Тип 1) на хуманен обект и * полоси 6-10 съответстват на условията съгласно етап (б) (SK10+SDS5+U1+PK6) полоса 1: отрицателен контрол полоса: 2: BSE при крава

Получените резултати показват, че

- в етап (1) или (а) (полоси 1 до 5) PrP-sen систематично се разграждат, докато сигналът, получен от PrP-res систематично нараства, когато антитялото е насочено срещу повторенията на октапептидния мотив, спрямо сигналът, получен за същите проби, когато едно антитяло е насочено срещу област 94230 от РгР;

в етап (б) (полоси 6 до 10), PrP-sen систематично се разграждат, докато сигналът, получен в полоси 8 и 10 (при наличието на антитяло, насочено срещу повторенията на октапептидния мотив) е подобен или поголям от сигналът, получен при същите проби, когато едно антитяло е насочено срещу област 94-230 от РгР, в същото време сигналът е по-слаб или неразличим за полоси 7 и 9 (PrP-res на BSE).

ПРИМЕР 3: Откриване на PrP-res посредством имунометрично изследване на два обекта, използвайки, като улавящо антитяло, моноклонално антитяло, което разпознава повторенията на октапептидния мотив

За да се извърши имунометрично изследване на два обекта, таблетката получена от (iv) в пример 2, например се разтваря в буфер съдържащ саркозил (0.25-1%) и урея (0.25-8 М), или SDS (0.25-1%) и урея (0.25-1 М); получената проба, за предпочитане да се разреди (до j или 1/20, след нагряване, с буферен разтвор съдържащ албумин, като се получава крайна концентрация с албумин между 0.1 и 1% (w/v), или с буферен разтвор съдържащ 1% деоксихолат.

Имунометрично изследване на два обекта се провежда в плочки за микротитриране, съдържащи антитяло, което е обездвижено в условията, вече описани за други протеини (Grassi et al., 1989). Принципът е както следва: анализираните РгР се разпознават от антитяло свързано към твърда опора (улавящо антитяло) и от второ антитяло, което разпознава друга част от молекулата, и което е означено с ензим (в този случай, ацетилхолинестераза, следящо антитяло) при 5 Ellman единици/мл.

В контекста на изобретението, улавящото антитяло е насочено срещу повторенията на октапептидния мотив, а следящото антитяло разпознава последователност, включена в областта 94-230 на РгР, например област 142160 от РгР. След отмиване на твърдата фаза, ензиматичната активност на плочката е пропорционална на количеството PrP-res, които са имали повторения на октапептидния мотив първоначално в анализираната проба.

На практика, изследването се извършва по следния начин:

100 рл разтвор на РгР, който се анализира, се поставят в кладенчетата на плочка за микротитриране, съдържаща антитялото, което разпознава повторенията на октапептидния мотив. След реакция за 3 часа, при стайна температура, плочката се измива, преди да се добави 100 рл разтвор от проследяващо антитяло (5 Ellman единици/мл). След реакция за една нощ, при +4°С, плочките се измиват отново, преди да се добави 200 рл разтвор на субстрат (реагент на Ellman, Grassi et al., 1989), който дава възможност да се измери активността на ацетилхолинестеразата свързана към твърдата фаза. След 30 мин ензиматична реакция, се измерва абсорбирането във всяко кладенче (КО.плътност при 414 nm).

ПРИМЕР 4: Сравнително изследване на различни условия: етап (1) или (а) и етап (б)

Пробите се приготвят както е описано в пример 2.

Хомогенатите се приготвят както в пример 2.

за хуманни обекти

На фигури 3 и 4 са показани резултатите получени с различни буферни разтвори:

* условия съгласно етап (1) или (а) от метода, съгласно изобретението:

I: хомогенат при 20%+SK10+T10+U2+PRl

ПГ : хомогенат при 10%+PK4+T5+Ul+PK0.5 (фигура 4) * условия съгласно етап (б) от метода, съгласно изобретението:

II: хомогенат при 20%+SK10+T10+U2+PK3

III: хомогенат при 20%+SK10+T10+U2+PK6

III”: хомогенат при 10%+SK5+T5+Ul+K6 (фигура 4)

IV: хомогенат при 20%+ SK20+K3

V: хомогенат при 20%+SK20+Ul+PK3

VI: хомогенат при 20%+SK20+SK2+U2+PK3

VII: хомогенат при 10%+SK20+PK3

VIII: хомогенат при 10%+SK20+Ul+PK3

IX: хомогенат при 10%+SK20+U2+PK3

X: хомогенат при 10%+SK5+SDS5+Ul+PK6

X’: хомогенат при 10%+SK2.5+SDS2.5+U2+PK6 (фигура 4)

XI: хомогенат при 20%+SK20+PK6

ХП:хомогенат при 20%+SK20+Ul+PK6

XIII .-хомогенат при 20%+SK20+U2+PK6

XIV :хомогенат при 10%+SK20+PK6

XV: хомогенат при 10%+SK20+Ul+PK6

XVI: хомогенат при 10%+SK20+U2+PK6

Количеството PrP-res, които са съхранили повторението на октапептидния мотив, се измерва с помощта на имунометрично изследване с два обекта (измерват се абсорбирането или оптическа плътност при 414 nm, виж пример 3; появата на жълто оцветяване, реагент на Ellman),: отрицателен контрол (□), спорадична CJD тип 1(п) и vCJD тип 4(·).

при преживни животни

Фигури 5 и 6 илюстрират резултатите получени с различни буферни разтвори:

* условия съгласно етап (1) от метода, съгласно изобретението:

I: хомогенат при 20%+SK10+T10+U2+PK3

ПГ: хомогенат при 10%+SK5+T5+Ul+PK0.5 (фигура 6) * условия съгласно етап (1) от метода, според изобретението:

II: хомогенат при 20%+SK10+T10+U2+PK3

III: хомогенат при 20%+SK10+T10+U2+PK6

ПГ: хомогенатпри 10%+SK5+T5+Ul+PK3 (фигура 6)

IV: хомогенат при 20%+SK20+PK3

V: хомогенат при 20%SK20+Ul+PK3

VI: хомогенат при 20%+SK20+U2+PK3

VII: хомогенат при 10%+ SK20+PK3 VIII: хомогенат при 10%+SK20+Ul+PK3 IX: хомогенат при 10%+SK20+U2+PK3 X: хомогенат при 10%+SK5+SDS5+Ul+PK6 Х’:хомогенат при 10%+SK5+SDS5+Ul+PK3 (фигура 5) XI: хомогенат при 20%+SK20+PK6

XII: хомогенат при 20%+SK20+Ul+PK6

XIII: хомогенат при 20%+SK20+U2+PK6

XIV: хомогенат при 10%+ SK20+PK6

XV: хомогенат при 10%+SK20+Ul+PK6

XVI: хомогенат при 10%+SK20+U2+PK6

Количеството PrP-res, които са съхранили повторението на октапептидния мотив се измерва с използване на имунометрично изследване с два обекта (абсорбиране или оптическа плътност при 414 нм, виж пример 3; отрицателна контрола(п), UTA при говеда(п) и UTA при овце(·).

- Фигури 7 (западно оцветяване) и 8 (имунометрично изследване с два обекта:

. Сравнението се прави с използване на хомогенати при 20% от мозъци на здрави овце, от овца, страдаща от краста и от говедо, страдащо от BSE, които са получени при условията изложени в пример 2.

. Обработка на пробите:

А: 10% саркозил А + 10% Triton + 2М урея + 60 рг/мл протеиназа К, 10 мин

В: 10% саркозил + 2М урея + 240 рг/мл протеиназа К, 10 мин

С: 10% саркозил + 240 рг/мл протеиназа К, 10 мин . Посока с западно оцветяване (фигура 7): антитела SaB7 и Saf84 (виж пример 1); посредством имунометричен анализ (фигура 8): улавяне със SaB7 и разкриване с антитяло насочено срещу зона 94-230 на РгР.

Фигури 9 (Западно оцветяване) и 10 (имунометрично изследване с два обекта):

. Сравнението се прави с използване на хомогенати при 20% от мозъци на здрави овце, от овца страдаща от краста и от говедо страдащо от BSE, получени при условията изложени в пример 2.

. Обработка на пробите:

А: 10% саркозил + 10% Triton + 2М урея + 60 рг/мл протеиназа К, 10 мин

В: 10% SDS + 5%Triton + 2М урея + 180 рг/мл протеиназа К, 10 мин.

. Откриване при същите условия както по-горе.

Като се увеличи само дозата на РК, става възможно да се разкрие диференциалната чувствителност в областта на повторенията на октапептидния мотив между BSE и краста при овце, но не и при хуманни обекти (между тип 1 и тип 4).

От друга страна, посредством модифициране на състава на повърхностно активния агент и на хаотропния агент, се дава възможност да се разкрие диференциалната чувствителност в областта от повторения на октапептиден мотив при всички случаи.

ПРИМЕР 5; Влияние на състава на буферните разтвори върху диференциалното откриване на BSE и краста

Фигури 11 (Западно оцветяване) и 12 (имунометрично изследване с два обекта):

. Направено е сравнение с използване на хомогенати при 10% от мозъци на здрави мишки или от мишки експериментално заразени с разновидност на С506МЗ (краста) или с разновидност на 6PBI (BSE), получени при условия установени в пример 2.

. Обработка на пробите:

А: 10% саркозил + 10% Triton + 2М урея + 30 μτ/мл протеиназа К, 10 мин;

В: 10% саркозил + 10% Triton + 2М урея + 60 рг/мл протеиназа К, 10 мин;

С: 10% саркозил + 10% Triton + 2М урея +180 рг/мл протеиназа К, 10 мин;

Д: 10% саркозил + 10% Triton + 2М урея + 360 рг/мл протеиназа К, 10 мин;

Е: 10% саркозил + 2М урея +180 рг/мл протеиназа К, 10 мин.

. Откриване посредством Западно оцветяване (фигура 11): антитела Saf37 и Saf70 (виж пример 1);

посредством имунометричен анализ (фигура 12) : улавяне със Saf37 и разкритие с антитяло насочено срещу област 94-230 от РгР.

Получените резултати показват, че само с нарастване на дозата от РК, се дава възможност да се разкрие диференциалната чувствителност на областта на повторения на октапептидния мотив, между BSE и краста при мишки.

ПРИМЕР 6: Влияние на буферните разтвори и на концентрацията на протеиназа К при откриване на различни CJD

Фигури 13 (Западно оцветяване) и 14 (имунометрично изследване с два обекта):

. Направено е сравнение с използване на хомогенати при 10% от мозъци от здрави хуманни обекти и от хуманни обекти страдащи от CJD (типове 1, 2, 3 и 4), получени при условията постановени в пример 2.

. Обработка на пробите:

А: 10% саркозил + 10% Triton + 2М урея + 30 рг/мл протеиназа К, 10 мин;

В: 10% саркозил +105 Triton + 2 М урея + 180 рг/мл протеиназа К, 10 мин;

С: 10% саркозил + 30 рг/мл протеиназа К, 10 мин;

Д: 10% саркозил + 60 рг/мл протеиназа К, 10 мин;

Е: 10% саркозил +180 рг/мл протеиназа К + 10 мин;

F: 10% саркозил + 360 рг/мл протеиназа К, 10 мин.

. Откриване посредством западно оцветяване (фигура 13): антитела Saf37 и Saf70 (виж пример 1);

посредством имунометричен анализ (фигура 14) и разкриване с антитяло насочено срещу област 94-230 на РгР.

Фигури 15 (Западно оцветяване) и 16 (имунометричен анализ) . Сравнението е направено с използване на хомогенати при 10% от мозъци от здрави хуманни обекти и хуманни обекти, страдащи от CJD (типове

1,2,3 и 4), получени при условията установени в пример 2.

. Обработка на пробата:

Фигура 15: смилане с протеиназа К (150 рг/мл), 10 мин.

Фигура 16: 10% саркозил + 2М урея + протеиназа К (от 30 до 360 μτ/мл), за 10 мин.

. Откриване посредством Западно оцветяване (фигура 15): антитяло Saf37 и антитяло, насочено срещу област 94-230 от РгР (виж пример 1);

посредством имунометричен анализ (фигура 16): улавяне със Safi7 и разкриване с антитяло, насочено срещу област 94-230 от РгР.

Получените резултати показват , че нарастване на дозата от РК дава възможност да се разкрие диференциалната чувствителност в област на повторения от октапептиден мотив при различни типове CJD. При тези условия, не съществува значителна разлика между тип 1 и тип 4; промяна в състава на повърхностно активния агент и на хаотропния агент при една и съща доза от РК (Е, фигури 13 и 14), дава възможност да се разрушат октапептидите при тип 4, като в същото време, се запазват тези в тип 1.

Освен това, на фигура 16 е възможно да се покаже разликата в чувствителността на PrP-res, извлечени от различни разновидности, при един и същ буферен разтвор, като функция от дозата РК.

Още повече, на фигура 15 е показано, че непосредствената обработка на хомогената с РК разкрива друг тип чувствителност на PrP-res към разграждане.

ПРИМЕР 7: Откриване посредством западно оцветяване на смлени PrP-res, пречистени в SAF форма

Хомогенати, получени при условията, съгласно пример 2, са обработени както следва:

20% хомогенат (500 μτ/мл) + 20% NaCI (500 μπ) + [20% саркозил + 2% SB314] (500 μπ) + РК (20 μτ/мл крайна концентрация) за 1 час.

На фигура 17 са показани резултатите:

b и d:

полоси 1 - 7: резултати, получени с различни разтвори на разновидност на краста С506МЗ при мишки (разтвори 1/30, 1/50, 1/250, 1/500,

1/1000 и 1/2000) полоса 8: молекулни тегла полоси 9-15: резултати, получени с различни разтвори на разновидност на BSE при мишки (разтвори от 1/1000 до 1/10).

Възможно е изцяло да се елиминира сигнала от BSE.

а и с : получените резултати потвърждават, че е налице значително увеличение на сигнала при наличие на антитела, насочени срещу повторенията на октапептидния мотив.

е: на тази фигура е показано, че е възможно да се получи намаление на сигнала от BSE , както при маймуни така и при хуманни обекти (полоси 4 и 7)

Позовавания:

. Butler D., Nature, 1998, 395, 6-7.

. Collinge J. et al., Nature, 1996, 393, 685-690.

. Creminon, С.	et	al.,	J. Immunol. Methods,	1993,	162,
179-192.
. Ellman, G.	et	al.,	Biochem.	Pharmacol.,	1961,	7,
88-95.
. Frobert, Y	et	al.,	Methods	Mol. Biol.,	1991,	80,

57-68.

. Grassi, J. et al., 436-450. . Grassi J. et al., J.	Anal. Biochem., 1988, 168, Immunol. Methods, 1989, 123,
©	193-210.
. Grathwohl K.U. et al.,	J. Virol. Methods, 1997, 64,
	205-216.
	.Kuczius T. et al., Mol.	Med., 1999, 5, 406-418.

. Lasmezas C. et al., Nature, 1996, 381, 743-744.

. Lasmezas C. et al., Science, 1997, 275, 402-405.

. McLaughlin L.L. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1987, 144, 469-476.

. Oesch B. et al., Curr. Topics Microbiol. and Immunol., 1991, 172, 109-124 . Oesch B. et al., Biochemistry, 1994, 33, 5926-5931.

. Parchi P. et al., Nature, 1997, 386, 232-234.

. Priola S.A., Nature Med., 1996, 2, 12, 1303-1304.

. Prusiner S.B. et al., Cell, 1984, 38, 127-134.

. Safar J. et al., Nature Med., 1988, 10, 1157-1165.

. Schaller O. et al. Acta Neuropathol. 1999, 98,

437-443.

. Serban D. et al., Neurology, 1990, 40, 110.

Както става ясно, гореизложеното изобретение по никакъв начин не се ограничава до неговите методи за приложение, които бяха току що описани в по-разширен вид; напротив, то обхваща всички варианти, които могат да хрумнат на един специалист в тази област, без да се отделят от контекста или обхвата на настоящото изобретение.

Claims

1. Метод за диагноза на TSSE или прионна болест причинена от разновидност на UTA, посредством откриване на PrP-res в биологична проба, характеризиращ се с това, че методът обхваща:

(1) обработка на пробата с поне една протеиназа К, по такъв начин, че напълно да се разгради PrP-sen, докато, в същото време, се запазят изцяло или в известна част повторенията на октапептидния мотив на PrP-res независимо от разновидността на UTA, (2) въвеждане на обработваната проба в контакт с лиганд за споменатите октапептидни мотиви, и (3) откриване на възможно наличие на комплекс от повторения на октапептиден мотив/лиганд.

2. Метод за диференциална диагноза на TSSEs, причинена от разновидност на UTA, в биологична проба, посредством откриване на PrPsres, свързани с различни разновидности на UTA, характеризиращ се с това, че методът обхваща:

(а) откриване на PrP-res в първа фракция на пробата, в съответствие с етапи (1) до (3) от метода за диагноза на разновидност на UTA, както е заявен в претенция 1, след което:

(б) за всяка проба, за която в етап (а) е открито наличие на комплекс от повторения на октапептиден мотив/лиганд:

обработка на втора фракция от пробата с поне една протеиназа К, по такъв начин, че множеството повторения на октапептидния мотив се елиминират за PrP-res свързани с поне една от разновидностите, които ни ηΓι ιΓίГШйШММИШ интересуват, по-специално разновидността на BSE, по такъв начин, че всички PrP-res, свързани с другите разновидности на UTA, съхраняват всички или известна част от споменатите повторения на октапептидния мотив, въвеждане на втората фракция от обработената проба в контакт с лиганд, който е в състояние специфично да разпознае споменатите повторения от октапепдния мотив и

- откриване на възможно наличие на комплекс от повторения на октапептиден мотив/лиганд.

3. Метод за диференциална диагноза на TSSEs причинени от разновидности на UTA, в биологична проба, за която се счита, че съдържа PrPres, характеризиращ се това, че методът обхваща, за всяка проба, за която е открито наличие на PrP-res, провеждане на етап (б), както е заявен в претенция 2, въвеждане на втора фракция от обработената проба в контакт с лиганд, който е в състояние специфично да разпознае споменатите повторения от октапептиден мотив, и

- откриване възможното присъствие на комплекс от повторения на октапептидния мотив/лиганд.

4. Метод, според заявеното във всяка една от претенции от 1 до 3, характеризиращ се с това, че обработката с протеиназа К, съгласно етап (1), (а) или (б) се извършва от 30 сек до 2 часа, при температура не по-ниска от 80°С, за предпочитане между 10 мин и 30 мин.

5. Метод, заявен в претенция 4, характеризиращ се с това, че обработката с протеиназа К се провежда при концентрация между 30 рг/мл и

200 рг/мл за 10 мин. при 37°С за хомогенат при 10%, или за период и при концентрация, която е еквивалентна на концентрацията между 30 рг/мл и 200 рг/мл, при гореспоменатите условия, и още по за предпочитане за 10 мин , при концентрация от 30 рг/мл до 200 рг/мл за хомогенат при 10% или за 30 мин, при концентрация от 10 рг/мл до 70 рг/мл за хомогенат при 10%.

6. Метод, както е заявен във всяка една от претенции от 1 до 5, характеризиращ се с това, че протеиназата К се разтваря в буферен разтвор, подбран от групата състояща се от буфери за хомогенизиране на биологични проби и буфери обхващащи поне един от следните агенти: поне един повърхностно активен агент и/или поне един хаотропен агент и/или поне една сол.

7. Метод, заявен в претенция 6, характеризиращ се с това, че буферният разтвор за предпочитане обхваща:

а. поне един повърхностно активен агент, избран от групата състояща се от:

анионни повърхностно активни агенти, като SDS (натриев додецил сулфат), саркозил (лауроилсаркозин), натриев холат, натриев деоксихолат или натриев таурохолат;

цвитерионни повърхностно активни агенти, като SB 3-10 (децилсулфобетаин), SB 3-12 (додецилсулфобетаин), SB 3-14, SB 3-16 (хексадецилсулфобетаин), CHAPS и деокси-CHAPS;

нейонни повърхностно активни агенти, като С12Е8 (додецилоктаетилен гликол), Trito xlOO, Triton XI14, Tween 20, Tween 80, MEGA 9 (нонаниолметилглукамин), октиглюкозид, LDAO (додецилдиметиламинов окис) или NP40, или смеси от повърхностно активни агенти, като смес от един йонен повърхностно активен агент и нейонен повърхностно активен агент, смес от два йонни повърхностни активни агента или смес от един йонен повърхностно активен агент и един цвитерионен повърхностно активен агент, и/или

8. Метод, както е заявен в претенция 7, характеризиращ се с това, че буферният разтвор обхваща поне 5% анионен повърхностно активен агент, за предпочитане саркозил, като вариант свързан със SDS.

9. Методът, както е заявен във всяка от претенции от 1 до 8, характеризиращ се с това, че лигандът е избран от групата, състояща се от аптамери и антитела, с възможност специфично да се свързват към областта на повторенията на октапептидния мотив.

10. Метод, както е заявен в претенция 2, претенция 4 или претенция 5, характеризиращ се с това, че обработката на етап (б) се извършва при същите условия, както тези определени в етап (1) или (а), но при концентрация на РК, по-висока от тази използвана на етап (1) или (а).

11. Диагностичен комплект за извършване на методите, както са заявени във всяка една от претенциите от 1 до 10, характеризиращ се с това, че той включва в комбинация, поне един повърхностно активен агент и/или поне един хаотропен агент и/или поне една сол и една протеаза, както е описано погоре.