CN106604930B

CN106604930B - 去糖基化试剂和方法

Info

Publication number: CN106604930B
Application number: CN201580037222.3A
Authority: CN
Inventors: P·马涅利; E·格思里; C·H·塔容; M-Q·徐; J·巴斯威尔
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 2014-05-30
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2035-05-29
Also published as: KR20230091199A; EP3149034B1; US20150346194A1; KR20170012286A; EP3149034A2; CN106604930A; WO2015184325A2; EP4083066A3; WO2015184325A3; EP4083066A2; US20170138959A1; US9964548B2

Abstract

提供了用于高效地制备完全去糖基化的抗体的组合物和方法，其中以可溶或冻干形式的试剂的相对量，以及反应的时间和温度，测量效率。提供了用于从糖基化的抗体分离基本上所有N联聚糖和用于保持抗体的功能性的组合物和方法。所述方法与聚糖标记和蛋白酶消化相容，而不需要在先的纯化步骤。

Description

去糖基化试剂和方法

背景技术

据估计超过50％的人蛋白是糖基化的。许多健康和疾病生物标记是糖基化的蛋白质并且具体的糖形可以与健康或疾病状态关联。这包括与癌症、糖尿病、炎症和其它医疗状况以及发育相关的糖基化的蛋白质。另外，糖基化的蛋白质不仅仅限于人或哺乳动物，而是发现于所有真核系统以及原核生物、古细菌(Archaea)和植物中。

抗体是糖蛋白。抗体上的聚糖可以是结构上异形的并且可以在健康和疾病中显著地改变。在抗体体外生产期间，附着至抗体的聚糖不仅受用于其生产的细胞类型影响，而且受细胞培养条件影响。养分利用率、pH、细胞密度和CO₂水平的变化可以显著地改变由细胞产生的抗体糖形。对于治疗性抗体，这可以影响组织分布、血清半衰期、蛋白酶解抗性、补体激活、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、和炎症。因此，在特定监管批准的(regulatory-approved)糖形变化的限度内制造治疗性抗体是期望的。

糖蛋白比如抗体的聚糖概况呈现(profiling)需要用于测试和鉴定抗体样品中的糖形的方法。聚糖结构的分析是非标准化的、耗时的和低通量的过程，所述过程具有如下条件下的多达16小时的去糖基化培育时间：不仅导致部分去糖基化而且冒着损害蛋白质的风险。(Jenkins,等,Mol Biotechnol.39(2):113-8(2008)；Liu,等,J Pharm Sci.97(7):2426-47(2008))。缩短培育期的尝试已经导致使用洗涤剂，其影响蛋白质完整性并且因此影响功能性并且干扰质谱。抗体可能难以去糖基化，这是因为聚糖可以埋入分子的结构折叠内。标准方法使用方法比如极热和严苛的(harsh)变性剂如十二烷基硫酸钠(SDS)使抗体结构变性以暴露聚糖。然而，这些方法具有几个缺点：例如SDS可以使得用于去除聚糖的酶变性，SDS难以去除，和甚至痕量的SDS可以干扰样品分析方法如质谱。这些方法也是耗时的。替代方法试图通过使用高浓度的肽-N-糖苷酶F(PNGase F)增加去糖基化率。然而，此途径没有克服与部分去糖基化相关联的假定的和非期望的偏向性(bias)。部分去糖基化可导致某些糖形相对于其它优先地从蛋白质释放。由于其需要显著量的PNGase F，此途径也是昂贵的并且不容易放大规模。

改善去糖基化以便抗体表征的当前的途径继续导致更加复杂的方法，需要额外的时间进行处理，是效率低的，并且不完全地去除聚糖。另外，去糖基化的抗体的生产当前限于定点诱变或细菌表达系统。不幸地，这些系统在以任意有意义的数量生产正确装配和折叠的抗体中具有困难。

发明内容

一般而言，描述了包括组合物的制剂和使用方法，其用于使蛋白质比如抗体完全地去糖基化，这导致无偏向地去除为在去糖基化反应中使用的糖苷酶或糖苷酶混合物的底物的聚糖。还描述了用于从蛋白质分离聚糖的方法和试剂，用于进一步分析可以被任选地标记的聚糖。其中这涉及借助于蛋白酶的肽解离(cleavage)，惊人地，已经显示肽解离和去糖基化可以在单一步骤中完成。为了便于使用，糖苷酶和/或缓冲剂组合物可以被冻干并且添加至糖基化的蛋白质以实现去糖基化。

一般而言，在一个方面，提供了不能天然存在的人造的体外制剂或组合物，其包括(i)胆汁盐或不包括十二烷基硫酸钠(SDS)的洗涤剂；(ii)一种或多种糖苷酶；(iii)如通过电泳或通过质谱测定的完全去糖基化的抗体；和(iv)聚糖解离产物。在一个方面，洗涤剂是可透析的不可解离的羧酸盐阴离子表面活性剂。一般而言，在另一个方面，提供了不能天然存在的人造的体外制剂或组合物，其包括(a)胆汁盐或可透析的不可解离的羧酸盐阴离子表面活性剂；(b)一种或多种糖苷酶；(c)如通过电泳或通过质谱测定的完全去糖基化生物活性蛋白；和(d)聚糖解离产物。

在另一个方面，完全去糖基化的抗体具有抗原结合活性并且可以用于免疫测定。在另一个方面，使用荧光标记、放射性同位素、丙酮、抗体或其组合标记聚糖解离产物和/或抗体。这可以促进聚糖类型的分析以及测定蛋白质上的聚糖结合位点。去糖基化的蛋白质的实例包括抗体。代表性抗体的实例包括去糖基化的人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、人IgM、人IgA1、人IgA2、人IgE、鼠IgG1、鼠IgG2a和鼠IgA。

在另一个方面，蛋白酶可以包括在组合物中，其中蛋白酶可以是，例如，胰蛋白酶。蛋白酶的其它实例可以包括GluC、AspN、蛋白酶K、因子Xa、肠激酶、LysC、Arg-C、LysN、IdeS、V-8蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-裂解蛋白酶(Alpha-Lytic Protease)、焦谷氨酸氨肽酶(Aminopeptidas)、亮氨酸氨肽酶、甲硫氨酸氨肽酶、氨肽酶I、氨肽酶A、羧肽酶(A、B、G、Y)、胃蛋白酶、组织蛋白酶(B、C、D)、α-胰凝乳蛋白酶、TEV、凝血酶、IdeZ和IdeE。

在另一个方面，糖苷酶(一种或多种糖苷酶)可以是多种糖苷酶并且可以包括例如一种或多种外切糖苷酶和/或一种或多种内切糖苷酶。糖苷酶中的一种或多种可以是融合蛋白，其中例如融合蛋白可以被固定化在基质上。融合蛋白的实例包括突变型O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)，其任选地可以通过将ATG亲和结合至基质被固定化。糖苷酶或一种或多种糖苷酶可以包括一种或多种N-聚糖糖苷酶、一种或多种O-糖苷酶和/或一种或多种内切糖苷酶。

在另一个方面，组合物可以包括水性缓冲剂。

一般而言，在一个方面，提供了如下方法，其包括(a)培育组合物与糖基化的抗体小于60分钟，所述组合物包括可透析的不可解离的羧酸盐表面活性剂——其不包括十二烷基硫酸钠(SDS)——和/或胆汁盐；和一种或多种糖苷酶；和(b)从糖基化的抗体完全地解离聚糖以形成去糖基化的抗体和聚糖解离产物。

在方法的一个方面，去糖基化的抗体和/或解离的聚糖产物被分离和任选地纯化。去糖基化的抗体的抗原结合活性可以被表征。当测试时，抗体的抗原结合性质被发现是保持的(preserved)。使用选自例如放射免疫测定、ELISA、亲和结合测定、或免疫沉淀测定的抗体-抗原结合测定可以量化去糖基化的抗体与抗原的结合。去糖基化的抗体适合于治疗和/或诊断用途。

在方法的一个方面，蛋白酶比如胰蛋白酶被包含在组合物内，所述组合物包含用于将蛋白质解离为去糖基化肽片段和聚糖解离产物的一种或多种糖苷酶。

在一个方面，组合物在与糖基化的抗体培育之前被冻干，其中糖基化的抗体在水性缓冲剂中。在另一个方面，糖苷酶被固定化在基质上。在一个方面，培育在大约20℃-60℃的温度下。在另一个方面，培育5分钟或更少的时间。

一般而言，在一个方面，描述了如下试剂盒，其包含一种或多种冻干的糖苷酶、和/或一种或多种固定化的糖苷酶、或溶液和冻干的缓冲剂或非冻干的缓冲剂中的一种或多种糖苷酶、或其组合，其中冻干或非冻干的缓冲剂包括：胆汁酸；或可透析的不可解离的羧酸盐阴离子表面活性剂——不包括SDS；或其组合。

附图说明

附图意欲图解本文描述的组合物和/或方法的一种或多种形式。除非另外规定，出于解释任何权利要求的范围的目的，这些不意欲是限制性的。

图1A-1D显示了糖基化的抗体的示意图以及通过质谱测定的糖基化和去糖基化的抗体重链的质量分布。展示了部分去糖基化，其由添加PNGase F(New England Biolabs,Ipswich,MA)(还参见实施例1)之前的标准的热预处理造成。在不存在表面活性剂的情况下。

图1A显示了由两条重链(H，白色)；两条轻链(L，灰色)和附着至重链的聚糖分子(G)组成的抗体的图。优选地，在完全去糖基化的抗体分子中不存在聚糖。

图1B是对照(“无预处理”和“无PNGase F”处理)，其显示了在初始单克隆IgG抗体样品中存在的糖形的概况。该示意图图解了每个观察到的主峰的糖形。

图1C显示了通过热预处理并且使用PNGase F培育1小时的抗体的概况。四个主峰(质量50191、50353、50516和50823)代表完全糖基化的糖蛋白。在这些条件下，小于大约10％的抗体重链是去糖基化的(参见在最左侧峰处——靠近质量48747——不具有附着的聚糖的抗体重链的示意图)。

图1D显示了热结合延长的16小时PNGase F培育不导致显著去糖基化的抗体。增加PNGase F培育时间至16小时稍微地增加去糖基化的重链部分的量，但是相当大比例的抗体仍是糖基化的，如由50191、50353、50516和50823处的糖基化的糖蛋白主峰证明的。

图2A-2C显示了抗体重链在质谱中的质量分布，并且展示了PNGase F处理之前组合的热变性和还原剂的更强预处理不足以产生显著去糖基化的抗体(还参见实施例2)。

图2A是对照，其显示了在初始单克隆IgG抗体样品中存在的糖蛋白的概况(无预处理和无PNGase F处理)。

图2B是通过热变性结合还原剂二硫苏糖醇(DTT)预处理并且使用PNGase F培育1小时的抗体的概况。与单独热变性相比，组合预处理没有改善去糖基化(比较图1B和图2B)。抗体重链保持显著糖基化的，其中小于10％是去糖基化的(参见靠近质量大小48750的峰)。

图2C显示了相同的预处理以及延长的16小时PNGase F培育也没有使抗体重链显著去糖基化。只完成了部分去糖基化，如由显示的糖形的三个剩余的主峰证明的。某些糖形的去糖基化率的偏向性由不存在第四种糖形证明(由箭头指示的)。这展示了在这些反应条件下不同的糖形以不同的比率被去糖基化。

图3A-3B展示了在PNGase F消化之前使用商业上可获得的试剂RapiGest^TM(Waters,Milford,MA)预处理抗体后，抗体不是显著去糖基化的。如实施例3中描述的，使用制造商建议量的RapiGest预处理糖基化的抗体。在ESI-TOF MS分析前使用PNGase F培育预处理的抗体1小时。

图3A是对照(无PNGase F)，其显示了在原始样品中存在的抗体重链糖形(质量50192、50354和50823)。

图3B展示了基本上所有重链糖形(由箭头指示的)在使用RapiGest后仍存在。只有小部分的抗体重链是去糖基化的(质量48748)。

图4A-4C显示了宽范围的条件，其中羧基化表面活性剂十二烷基肌氨酸(LS)、DTT和PNGaseF可以在50℃下在5分钟内产生显著去糖基化的抗体(还参见实施例4)。显示了在存在变化量的LS结合变化量的DTT的情况下，在使用PNGase F去糖基化后，小鼠单克隆IgG抗体(New England Biolabs,Ipswich,MA)(实施例1中描述的)的SDS-PAGE迁移率变动。箭头指示如下泳道：其中完全去糖基化的底物通过对应于分子量减少的凝胶位置的变动被检测出。

图4A比较了使用0.2mM、1mM、4mM和20mM DTT结合0％、0.05％、0.1％、0.5％LS的反应条件。

图4B比较了使用20mM、40mM和80mM DTT结合0％、0.2％、0.4％、0.5％LS的反应条件。

图4C比较了使用4mM和20mM DTT结合0％、0.5％、2％、4％和5％LS的反应条件。

图5显示了在存在0.5％LS和PNGaseF用于50℃下5分钟的培育期的情况下，低浓度的DTT增强抗体的去糖基化(还参见实施例5)。使用0.5％LS中的PNGase F结合0.02mM、0.05mM或0.1mM DTT处理的小鼠单克隆IgG抗体(实施例1中描述的)通过SDS-PAGE迁移率变动显示。去糖基化的底物通过如下被观察到：与由失去聚糖造成的分子量减少对应的SDS-PAGE上样品迁移率的增加(参见“X”)。

图6显示了DTT可以替代三(2-羧乙基)膦(TCEP)以在与图5中描述的条件类似的条件下增强抗体的去糖基化(还参见实施例6)。

图7A和7B显示了一系列温度可以用于通过SDS-PAGE迁移率变动(参见箭头)检测出的小鼠单克隆IgG抗体的完全去糖基化，所述完全去糖基化通过使用缓冲剂——其包含胆汁盐或羧基化表面活性剂结合还原剂(0.5％LS和20mM DTT或2％脱氧胆酸盐(SDC)和4mMDTT)——的PNGaseF进行。一步和两步反应的额外细节提供在实施例7中。

图7A：在不同温度下进行的使用PNGaseF的5分钟培育的一步反应。显示了使用两种不同缓冲剂的结果。

图7B：50℃下5分钟的预处理培育和在不同温度下进行的使用PNGase F的随后的5分钟培育的两步反应。显示了使用两种不同缓冲剂的结果。

图8展示了22℃下鼠抗麦芽糖结合蛋白(抗-MBP)的去糖基化，其比较了在5分钟、10分钟和15分钟培育下的固定化的PNGase(苄基-鸟嘌呤–突变型AGT(BG-HS)PNGase F)和可溶的(游离的)PNGaseF。图8中的结果显示了使用固定化的PNGase F以及使用可溶的PNGaseF在室温下培育5分钟后，两步反应中的完全抗体去糖基化(还参见实施例8)。

图9显示了使用一步反应的抗体的完全去糖基化(还在实施例9中描述的)可以在3分钟内完成。在存在缓冲剂——其包含羧基化表面活性剂和还原剂——的情况下，使用PNGase F在50℃下处理小鼠单克隆IgG抗体1至5分钟。箭头显示了其中观察到完整迁移率变动的样品，其指示完全去糖基化。

图10A-10B图示地表现了组合物和从抗体释放的N-聚糖的表征(还参见实施例10)。

图10A显示了当在存在胆汁盐、SDC的情况下使用PNGase F和还原剂(DTT)(阴影柱)；或仅使用PNGase F和DTT(白色)培育时，从糖基化的抗体释放的聚糖(A至I)。当使用DTT加SDC与仅使用DTT相比时，在峰值部分中观察到最小十倍的聚糖产量增加。十倍增加指示所有聚糖通过此方法从抗体高效地和基本上完全地去除。

图10B提供了饼图，其显示了在使用如下去糖基化后，IgG N-聚糖的百分比组成：

(i)DTT和SDC；提供了在单克隆IgG样品中存在的N-聚糖的精确组成，其显示了基本上所有九种类型的聚糖的非偏向表现。

(ii)只有DTT：与(i)相比，不是所有聚糖均被去除，其中与存在DTT和SDC的情况下的去糖基化相比，主要的N-聚糖(D和B)未被充分表现并且次要的聚糖种类(A、H、E和I)被过多表现，并且因此显示了在仅存在还原剂的情况下通过PNGase F去除N-聚糖中的偏向性。

图11A-11B显示了从抗体释放并且在一锅法(one pot method)(图11A)或两锅法(two pot method)(图11B)中标记的荧光标记的N-聚糖的色谱概况(还参见实施例11)。在存在DTT和SDC的情况下，使用PNGase F从单克隆IgG抗体解离聚糖。从抗体解离的聚糖，或者在一锅法中在去糖基化混合物中被直接标记，或者在两锅法中在标记前首先从去糖基化混合物分离。然而，图11A和11B中的总体概况是类似的，聚糖的绝对数量在一锅法中显著地增加(比较图11A和11B的y轴上荧光计数)，其指示一锅法的效率。

图11A显示了使用一锅法的标记的聚糖的总体概况，其中聚糖在标记之前不被分离。

图11B显示了使用两锅法的标记的聚糖的总体概况，其中聚糖在标记之前首先被分离。

图12A-12C显示了在5分钟内从三种不同的抗体释放并且在一锅法中标记的荧光标记的N-聚糖的色谱概况。在存在LS和DTT的情况下，在标记前使用PNGase F从每个抗体解离N-聚糖(还参见实施例14)。

图12A是利妥昔单抗(rituximab)的N-聚糖概况。

图12B是西妥昔单抗(cetuximab)的N-聚糖概况。

图12C是依那西普(etanercept)的N-聚糖概况。

图13A-13C展示了使用DTT、胆汁盐和温热的组合通过PNGaseF去糖基化的抗体是功能性的并且保留特异性地识别和结合至其关联抗原(cognate antigen)的能力。

图13A是每个处理的样品的SDS-PAGE。IgG的去糖基化的重链比糖基化的重链移动得稍微更快(更低)(如由具有糖基化的和去糖基化的重链的示意图的箭头指示的)。(+)是在存在SDC和还原剂的情况下使用PNGase F处理的抗-MBP抗体；(-)是平行样品但没有PNGase F处理。

图13B是在存在表面活性剂和还原剂的情况下使用PNGase F处理的样品的ESI-TOF MS分析，其显示了显著去糖基化的抗体。阴性对照显示了当不使用PNGase F处理时在原始样品中存在的抗体糖形。

图13C确认了阳性样品的去糖基化的抗体是功能性的并且保留其类似于糖基化的抗体的识别和结合至其抗原的能力。在MBP-融合蛋白上进行蛋白质印迹。凝胶上面的白色三角形指示在进行印迹的凝胶上加样的4.2ng至0.5ng的减少量的关联抗原。

图14A-14B展示了使用冻干的PNGase F(冻干(lyo)PNGase)和包含胆汁盐或表面活性剂和DTT的缓冲剂的快速去糖基化是有效的。PNGase F和缓冲剂可以被一起冻干(冻干混合剂(master mix))或者被分别地冻干(冻干缓冲剂)，而对活性没有任何有害作用(还参见实施例14)。

图14A显示了使用冻干的PNGase F和缓冲剂(一起干燥或分别干燥)完全地去糖基化的单克隆IgG的SDS-PAGE。箭头指示迁移变动对应于IgG的完全去糖基化，其比得上阳性对照(“新鲜的PNGase F”)，其使用没有被冻干的PNGase F和缓冲剂(在右侧显示)。阴性对照(“C”)中不存在PNGase F。

图14B是在图14A中描述的样品的ESI-TOF MS分析((i)使用冻干的混合剂(PNGaseF-缓冲剂)的完全去糖基化；(ii)使用冻干的PNGase F、冻干的缓冲剂的完全去糖基化)；(iii)阴性对照(没有PNGase F))。分析确认了冻干的和再水化的缓冲剂和酶在50℃下在5分钟内基本上使抗体去糖基化。

图15A-15B图解了包含胆汁盐或羧基化阴离子洗涤剂和DTT的缓冲剂可以用于高效地使各种抗体同种型去糖基化(还参见实施例15)。SDS-PAGE凝胶显示了包含缓冲剂和同种型抗体但不包含PNGase F的对照(没有酶(-))。(+)指的是在存在0.5％LS和20mM DTT的情况下使用PNGase F的去糖基化反应。指示了抗体的同种型和来源(人“h”；小鼠“m”)。PNGase F条带指示在每个凝胶以及同种型的轻链(LC)的一侧上。每个实验反应显示了与阴性对照相比的重链的迁移率变动(其位置由一侧的“HC”指示)，这指示成功的去糖基化。

图15A，抗体同种型：hIgG1、hIgG2和hIgG4。

图15B，抗体同种型：hIgM、hIgA1、hIgE、mIgG1、mIgG2A。

图16A-16B显示了SDS-PAGE凝胶，其中完全去糖基化需要的PNGaseF的量在存在LS和还原剂的情况下比在其他相同的一步反应条件(实验条件参见实施例17)下仅存在还原剂的情况显著减少。PNGaseF∶IgG的量(μg/μl)的比率显示在不存在LS的情况下大于20倍、大于50倍、大于75倍、大于90倍多的PNGase F，因而显示了在存在LS的情况下使用显著更低量的PNGase F可以完成完全去糖基化，则没有LS将是这种情况。

图16A显示了使用62.5单位的PNGase F的单克隆IgG的完全去糖基化，并且其中反应缓冲剂包含0.5％LS(参见黑色箭头)。

图16B显示了当不存在LS时，甚至可获得的最浓的原液(4000单位)不足以完全去糖基化(由X指示)。

图17A-17B显示了SDS-PAGE凝胶，其中完全去糖基化需要的PNGaseF的量在存在LS的情况下比在其他相同的两步反应条件下仅存在缓冲剂的情况显著减少。(实验条件参见实施例18)。PNGaseF∶IgG的比率显示在不存在LS的情况下大于20倍、大于50倍、大于75倍、大于90倍多的PNGase F。

图17A显示了使用62.5单位的PNGase F的单克隆IgG的完全去糖基化，并且其中反应缓冲剂包含0.5％LS(参见黑色箭头)。

图17B显示了当不存在LS时，甚至可获得的最浓的原液(4000单位)不足以完全去糖基化(由X指示)。

图18A-18C显示了非还原条件下PNGase F去糖基化(羧酸型(carboxylic)洗涤剂，热)的条件保持抗体分子的功能完整性。小鼠单克隆IgG、利妥昔单抗和依那西普在不存在DTT的情况下在多种条件下预处理以测定促进有效的去糖基化需要的LS的量以及温度和培育时间。去糖基化的、完整的单克隆抗体保留其抗原结合性质(还参见实施例19)。

图18A显示了在不存在还原剂的情况下，在80℃至55℃范围内的温度下预处理2至15分钟的抗体的快速去糖基化是有效的。SDS-PAGE显示了与完全去糖基化对应的大小变动(由箭头指示的)。

图18B显示了在不存在还原剂的情况下，快速去糖基化将保持抗体的结构。为了检测多聚体蛋白(即IgG异四聚体)的存在，样品还在样品缓冲剂中不具有DTT的SDS PAGE上运行。很明显多聚体结构已经被保持，注意到在80KD标志物下没有移动的单体结构。

图18C显示了去糖基化的、完整的单克隆抗-MBP的功能活性，与预培育的抗体或新鲜的抗体(其二者仍是糖基化的)相比，通过去糖基化的、完整的单克隆抗-MBP以等价的效价识别对应的抗原(MBP-标记的蛋白质)。

图19显示了使用羧酸型表面活性剂比如LS或月桂酸钠(LAU)的快速去糖基化是有效的(参见实施例20)。SDS-PAGE迁移变动指示完全去糖基化(箭头)可以比得上对照(“C”)。羧酸在存在或不存在还原剂的情况下是有效的。图还显示了在一步或两步反应中羧酸对50℃下5分钟内的快速去糖基化是有效的。

图20A-20B显示了同时的Rapid PNGase F(New England Biolabs,Ipswich,MA)和胰蛋白酶反应的结果。快速去糖基化在存在蛋白酶比如胰蛋白酶的情况下发生(参见实施例21)。小鼠单克隆IgG同时地使用PNGase F去糖基化和由胰蛋白酶解离以产生去糖基化的胰蛋白酶消化肽段用于质谱分析。

图20A显示了由PNGase F/胰蛋白酶消化观察到的总离子。在Tris HCl缓冲剂(对于胰蛋白酶活性最佳)上进行的反应显示了在不存在LS的情况下与存在LS的情况下预测的相同的肽覆盖。

图20B显示了分离的EDYnSTIR肽的断裂模式(fragmentation pattern)，其对应于小鼠IgG的独特的糖基化位点。仅发现肽为天冬氨酸形式，其指示去糖基化完成。

具体实施方式

本发明的实施方式提供了改进的方法和组合物，其用于通过完全地和任选地快速去除聚糖来分析糖蛋白比如抗体，其允许无偏向性地单独分析去糖基化的蛋白质和释放的聚糖和/或制备功能性去糖基化的抗体。

本实施方式的优点包括下列至少之一：(i)最小化蛋白质或聚糖的氧化、脱酰胺作用、和其它不需要的化学修饰的去糖基化条件；(ii)不干扰使用质谱的下游分析的去糖基化条件；(iii)导致消除针对某些种类的聚糖的偏向性的完全去糖基化；(iv)便利的和成本有效的快速反应条件；(v)保持去糖基化的蛋白质的功能；(vi)在单一步骤中使用蛋白酶将蛋白质降解为肽和使用糖苷酶进行去糖基化；(vii)在反应中使用减少量的糖苷酶；和(viii)合适添加至糖基化的抗体的用于去糖基化的冻干的试剂的可用性。由于本发明的实施方式的某些特征获得这些优点。这些包括下列一个或多个：可透析的不可解离的羧基化阴离子表面活性剂中的糖苷酶和/或缓冲剂中的胆汁盐的冻干的或溶解的制剂。制剂可以额外地包含还原剂。制剂可以额外地包含蛋白酶比如胰蛋白酶。制剂可以是溶解的或冻干的制剂。当与糖基化的抗体结合时，制剂可以在小于70℃的温度下在小于60分钟内并且任选地根据需要在单一步骤反应内或在包含预处理的两个步骤中或在多于两个步骤中实现糖基化的抗体的完全去糖基化。

方法的实施方式的高灵敏度可以用于以简单的、有效的、全面的和快速的方式测定在样品中存在的所有或基本上所有抗体糖形。由于基本上所有聚糖均可以从糖蛋白去除，避免了在其它方法中发现的固有偏向性。灵敏度还意味着可以使用较少的样品。所述方法可以避免正常地在其它程序中发现的由多个操作步骤(例如，热变性、烷基化、SDS不能被容易地去除的SDS处理、或不耐热或不耐酸试剂的失活)引起的样品损失。因此，所述方法适合低体积或低浓度的样品。额外地，由于方法的实施方式利用相对小量的糖苷酶，大样品体积的样品和/或多个样品(同时地或顺序地)可以被容易地去糖基化。

所述方法容易地与下游分析结合，比如色谱(例如，HPLC，HP阴离子交换色谱与脉冲安培检测(pulsed amperometric detection)(HPAE-PAD))、凝胶电泳、质谱(例如，MALDI-TOF MS、ESI-TOF MS)、和毛细电泳。可以使用所述方法例如以测定去糖基化的蛋白质(例如抗体)的分子量、电荷状态、氧化、剪辑、和脱酰胺作用，确认蛋白质去糖基化(抗体去糖基化)，测定蛋白质功能(例如抗体功能)，测定聚糖组成，测定聚糖结构，和鉴定糖概况(glycoprofile)信息。这促进在产业中具有实际含义的快速工作流程。本文描述的方法和试剂可以用于诊断、质量控制、抗体生产(比如治疗性抗体)的管理和过程优化、糖组学概况、和高通量分析。

在一个实施方式中，底物糖蛋白是抗体。在一个实施方式中，聚糖是可由PNGase糖苷酶去除的N-聚糖。

除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与相关领域中的普通技术人员一般理解的相同的含义。下面提供了某些术语的范围。本文描述的实施方式可以包括一个或多个值的范围(例如，大小、浓度、时间、温度)。值的范围将理解为包括范围内的所有值，包括叙述的范围中的值的子集(一个或多个)，至下限的单位的十分之一的程度，除非上下文另外明确地规定。

如本文使用的，冠词“一个”、“一种”和“该”等价地涉及作为单数或复数的含义，除非上下文另外规定。

术语“抗体”与术语免疫球蛋白可交换地使用并且包括当起作用时能够结合抗原的完整抗体和片段。抗体可以是天然的或重组的、多克隆的、单克隆的、人源化的、哺乳动物的(包括人、灵长类、骆驼、猪、马、啮齿动物、牛)、鸟的、爬行动物的、鱼的(例如，八目鳗(hagfish)、七鳃鳗(lamprey)、硬骨鱼和软骨鱼——其包括板鳃亚纲(elasmobranchii))。抗体可以源自体内样品，比如血清、血浆或血液样品或由宿主分泌的、排泄的或另外去除的其它体液。可选地，抗体可以来自体外细胞培养。抗体(例如，治疗性抗体)可以在生物反应器中，或在多细胞宿主生物体(例如培养的作物)中产生。例如，抗体可以是单链抗体。

术语“抗体”包括所有种类和同种型的抗体，并且包括重链Ig、IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgNAR、IgW和IgY，并且可以进一步包括其嵌合蛋白、多特异性蛋白(例如双特异性的、三特异性的、四特异性的)、衍生蛋白和融合蛋白。定义中还包括重组抗体比如微抗体(minibody)、双抗体、三链抗体、四链抗体(tetrabody)、scFv、双特异性scFv、三特异性Fab₃、单域抗体(sdAb)、和双-可变域抗体。包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、Fc、Fd、单域(例如，VhH、V_L、V_H、V_NAR)、和其部分的抗体片段包括在术语“抗体”中。

抗体可以是可溶的。抗体可以处于水性状态或可以被沉淀、干燥或固定化例如在固体表面上，比如珠、柱或基质。

包括由细胞产生的片段的抗体通常是糖基化的。一般地，抗体是被N联聚糖糖基化的，但是它们也可以包含O-聚糖。糖基化可以在抗体的任意区域上发生。抗体的具体的糖形可以取决于各种条件——比如健康、疾病状态或培养条件——变化。这样的变化可以影响抗体的活性和半衰期。去糖基化的抗体可以在抗体活性或半衰期中具有减小的变化或不具有变化。

在某些实施方式中，当抗体和抗原在捕捉剂/分析物复合体中特异性地结合时，它们之间的亲和性表征为小于10^-6M、小于10^-7M、小于10^-8M、小于10^-9M、小于10^-9M、小于10^-11M、或小于大约10^-12M或更小的K_D(解离常数)。

术语“聚糖”指的是游离形式或附着至另一种分子的任何糖并且包括O-聚糖和N-聚糖。N联聚糖是共价连接至共有序列——-Asn-X-Ser/Thr，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸——中的多肽链的天冬酰胺残基的聚糖。O联聚糖是经由糖苷键连接至丝氨酸或苏氨酸的羟基的聚糖。聚糖可以是单糖、寡糖或多糖，直链的、支链的或直链和支链的混合物，并且由单一类型的糖或多种类型的糖组成。术语“糖形”指的是糖蛋白的不同的分子形式，其由可变的聚糖结构和/或聚糖附着位点占位造成。术语“糖概况”指的是一个或多个糖分子上聚糖的性质或特性。概况可以包括任何一个或多个聚糖的身份(identity)、结构、组成和/或数量、糖分子上的糖基化位点(一个或多个)或位置(一个或多个)、和/或糖分子上的聚糖占位。“糖概况”可以与“糖基化概况”可交换地使用。

术语“糖基化”指的是碳水化合物与多肽、脂质、多核苷酸或另一种碳水化合物的共价连接。术语“糖基化的肽”、“糖基化的多肽”或“糖基化的蛋白质”可以与“糖肽”、“糖多肽”或“糖蛋白”可交换地使用。

术语“去糖基化”指的是从含聚糖的分子去除聚糖。去糖基化可以酶促地或化学地完成。单个糖苷酶或糖苷酶(glysidase)的混合物可以用于使蛋白质去糖基化。解离“基本上所有”聚糖导致完全去糖基化的蛋白质，其中“完全去糖基化”指的是如通过SDS-PAGE或通过质谱测定的通过糖苷酶的>70％、>80％、>90％、>92％、>94％、>96％、>98％或>99％去糖基化。例如，通过N-聚糖或O-聚糖糖苷酶的完全去糖基化指的是>70％、>80％、>90％、>92％、>94％、>96％、>98％或>99％N-或O-聚糖去糖基化。如果通过N-聚糖和O-聚糖糖苷酶的混合物实现完全去糖基化，则这指的是>70％、>80％、>90％、>92％、>94％、>96％、>98％或>99％N-聚糖和O-聚糖去糖基化。完全去糖基化的实例是90％-100％去糖基化。

术语“糖苷酶”指的是可以解离聚糖的酶并且包括内切糖苷酶、外切糖苷酶和酰胺酶。在一个实施方式中，糖苷酶是内切糖苷酶和/或外切糖苷酶。在一个实施方式中，糖苷酶是酰胺酶。在一些实施方式中，糖苷酶解离N联聚糖。在一些实施方式中，糖苷酶解离O联聚糖。在一些实施方式中，糖苷酶选自去糖基化的肽-N-糖苷酶——其来自杏仁(PNGase A)(参见下面)或来自大米(PNGase Ar)(参见下面)、肽-N-糖苷酶F(PNGase F)、PNGase Y(Swiss Prot:Q6CAX5.1 YALI0C23562g YALI0C23562p[解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)CLIB122]Gene ID:2909617NCBI参考序列：NC_006069.1)、O-糖苷酶(NewEngland Biolabs,Ipswich MA)、内切糖苷酶D(Endo D)(New England Biolabs,IpswichMA)、内切糖苷酶F(Endo F)(QAbio,Palm Desert,CA)、内切糖苷酶F1(Endo F1)(QAbio,Palm Desert,CA)、内切糖苷酶F2(Endo F2)(QAbio,Palm Desert,CA)、内切糖苷酶F3(EndoF3)(QAbio,Palm Desert,CA)、内切糖苷酶H(Endo H)(New England Biolabs,IpswichMA)、内切糖苷酶M(Endo M)(TCI America)、内切糖苷酶S(Endo S)(New England Biolabs,Ipswich MA)、β1-3半乳糖苷酶(New England Biolabs,Ipswich MA)、β1-4半乳糖苷酶(NewEngland Biolabs,Ipswich MA)、α1-3,6半乳糖苷酶(New England Biolabs,Ipswich MA)、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(New England Biolabs,Ipswich MA)、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(New England Biolabs,Ipswich MA)、β-N-乙酰氨基己糖苷酶(New England Biolabs,Ipswich MA)、α1-2,3甘露糖苷酶(New England Biolabs,Ipswich MA)、α1-6甘露糖苷酶(New England Biolabs,Ipswich MA)、神经氨酸苷酶(New England Biolabs,IpswichMA)、α2-3神经氨酸苷酶(New England Biolabs,Ipswich MA)、α1-2岩藻糖苷酶(NewEngland Biolabs,Ipswich MA)、或其组合。在一些实施方式中，糖苷酶是融合蛋白。在一些实施方式中，糖苷酶是PNGase F。PNGase F是商业上可获得的酶(例如，New EnglandBiolabs,Ipswich MA，目录号P0704或P0710)。在一些实施方式中，PNGase F是融合蛋白。例如，PNGase F可以是使用几丁质结合结构域(CBD)标记的PNGase F或PNGase F-SNAP融合蛋白(参见实施例16)。在一些实施方式中，糖苷酶是冻干的。在一些实施方式中，糖苷酶是冻干的PNGase F。在一些实施方式中，糖苷酶基本上不含动物源试剂。

如本文描述的，糖苷酶(其包括单个糖苷酶或糖苷酶的混合物)可以被固定化在固体、半固体或多孔表面上。适合糖苷酶(比如PNGaseF)的固定化的表面包括珠、树脂、柱、孔、板、微芯片、微流体装置、过滤器等。在一个实施方式中，糖苷酶，比如PNGase F，被固定化在琼脂糖或磁珠上。固定化可以借助融合蛋白(例如PNGaseF融合蛋白)实现，其中融合蛋白具有对特异性分子比如几丁质的CBD或麦芽糖的麦芽糖结合结构域的亲和性。在一个实施方式中，融合蛋白包含突变型AGT。

在一个实施方式中，一个单位的糖苷酶是在10μl反应体积中在50℃下5分钟从5μg的小鼠单克隆IgG去除>95％聚糖需要的酶量。

在另一个实施方式中，一个单位的PNGase F是在10μl的总反应体积中在37℃下1小时中由10μg的变性的RNase B完全去糖基化需要的酶量。

术语“胆汁酸”指的是由具有四个环、以羧酸终止的(五至八个原子)碳侧链、和一个或多个羟基的类固醇结构组成的分子家族。四个环从左至右(如一般绘制的)标记A、B、C和D，其中D-环比其它三个少一个碳。羟基可以在两个位置中的任一个中：上面(或外面)，称为β(β；通常按照惯例绘制为实线)，或下面，称为α(α；作为虚线可见)。所有胆汁酸具有源自母体分子胆固醇的3-羟基。胆汁酸在Hofmann,等,J.Lipid Res.51:226–46(2010)和Russell,Annu.Rev.Biochem.72:137–74(2003)中综述并且包括胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和石胆酸，但是许多其它胆汁酸——包括天然存在的胆汁酸的合成变体——是已知的。胆汁酸可以作为盐采用，即，作为胆汁盐。

术语“阴离子表面活性剂”指的是具有带负电荷的头部(head)的表面活性剂，比如硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐或羧酸盐。

可以称为“洗涤剂”的术语“不可解离的羧基化阴离子表面活性剂”指的是具有羧基化头部的阴离子表面活性剂，其实例包括但不限于烷基羧酸盐(肥皂)，比如硬脂酸钠、和LS以及氟表面活性剂比如全氟壬酸、全氟辛酸(PFOA或PFO)。其它羧基化阴离子表面活性剂是已知的并且下面描述了进一步的实例。表面活性剂/洗涤剂可以通过在弱酸条件——其中其它化学键(即肽键、糖苷键等不受影响)——下解离致使失活。

术语“可透析的”指的是如下分子：其能够穿过透析膜(即，半透膜)，具有25KD、50KD，或优选地在75KD–100KD的范围内的截留分子量(MWCO)，从而保留>90％的具有至少10kDa的分子质量的蛋白质而非表面活性剂。

术语“非天然存在的”指的是大自然不存在的组分。在蛋白质的背景下，术语“非天然存在的”指的是如下蛋白质：其具有不同于其天然状态的蛋白质的氨基酸序列和/或翻译后修饰模式。例如，非天然存在的蛋白质可以在蛋白质的N-端处、C-端处和/或N-和C-端之间具有一个或多个氨基酸置换、缺失或插入。“非天然存在的”蛋白质可以具有如下氨基酸序列：其不同于天然存在的氨基酸序列但是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一于天然存在的氨基酸序列。在某些情况下，如果其由不同的(例如，细菌)细胞产生，则非天然存在的蛋白质可以包含N-端甲硫氨酸或可以缺少一个或多个翻译后修饰(例如，糖基化、磷酸化等)。

在制剂的背景下，术语“非天然存在的”指的是：a)不天生地结合的组分的组合，例如，因为它们在不同的位置处、在不同的细胞或不同的细胞隔室中；b)具有在大自然未发现的相对浓度的组分的组合；c)缺少在大自然通常与组分中的一种相关联的某物的组合；e)处于在大自然未发现的形式的组合，例如，干燥的、冷冻干燥的、结晶的、水性的；和/或d)包含在大自然未发现的组分的组合。例如，制剂可以包含在大自然未发现的缓冲剂(例如，Tris、HEPES、TAPS、MOPS、曲辛或MES)、洗涤剂、染料、反应增强剂或抑制剂、氧化剂、还原剂、溶剂或防腐剂。在本实施方式中，两步反应和一步反应被描述在如下条件下用于去糖基化：(a)保持抗体针对其抗原的结合性质；(b)保持蛋白质或聚糖的特性用于进一步的分析；和/或(c)如果多聚体结构存在，则保持蛋白质的多聚体结构。在一些情况下，一锅、两步反应是足够的。然而，一步反应可以促进糖蛋白的高通量分析并且可以最小化操作误差。方法的本方面对于纳克至微克量的糖基化的蛋白质是有效的。方法的方面成功应用于相对大量的底物蛋白在稀有种类的聚糖的检测中具有实用性。

“两步”程序包括第一步(预处理步骤)，不希望受限于理论，其被认为在避免糖蛋白的聚集和/或凝结的条件下使得底物糖蛋白变得松弛。为了方便和糖苷酶的最大活性，第二步(去糖基化反应步骤/反应步骤)利用与第一步中相同或类似的缓冲剂。在此，添加糖苷酶试剂用于聚糖的解离。相比之下，“一步”程序从一开始在混合剂中引入糖苷酶。一步程序优选地利用在两步程序中可选的或可以省略的还原剂比如DTT。例如，参见实施例7，其描述了使用单个步骤使蛋白质去糖基化的一锅法，其中使用还原剂、包含SDC或LS的缓冲剂、和PNGase F培育抗体。在50℃下培育混合物5分钟产生显著去糖基化的抗体(参见图7A)。在小于3分钟内观察到去糖基化(参见实施例9，和图9)。

两步和一步法的pH条件是类似的并且出于最佳的糖苷酶活性在4至10的范围中。例如，pH可以是大约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0或其任意范围。

洗涤剂SDS被发现不适合于本实施方式，因为其使糖蛋白变性，使得其丢失其否则具有的任何结构或功能。而且，SDS不能从反应混合剂容易地去除并且其与蛋白质紧密地缔合，并且其后干扰聚糖和蛋白质的质谱。在实施例中，已经发现SDS消极地影响糖苷酶比如PNGaseF的活性。因此，SDS从本实施方式排除。

在此，已经发现表面活性剂比如可透析的不可解离的羧基化阴离子表面活性剂和/或胆汁酸或其盐适合用于本方法。不希望受限于理论，可以认为不可解离的可透析的羧基化阴离子表面活性剂或胆汁酸用来松弛蛋白结构并且促进酶介导的去糖基化。此外，这些试剂可以被去除，以便不过分地妨碍质谱分析并且可以进一步允许蛋白质(比如抗体)保留如本文展示的功能。

用于本实施方式的可透析的不可解离的羧基化阴离子表面活性剂的实例包括LS、月桂酸、硬脂酸、棕榈酸、其组合、和其盐。在一些实施方式中，羧基化阴离子表面活性剂盐是LS。羧基化阴离子表面活性剂可以是冻干的和/或可以基本上不含动物源试剂。

然而，使用一系列浓度的可透析的不可解离的羧基化阴离子表面活性剂比如LS钠盐或SDC是可能的，优选的是使用至少0.5％的浓度，例如，0.5％至8％的范围内的浓度或1％至5％的范围内的浓度。

用于本实施方式的胆汁酸的实例包括胆酸、鹅去氧胆酸、石胆酸、去氧胆酸、熊去氧胆酸或其盐或前述的组合。在一些实施方式中，胆汁酸是去氧胆酸。在一个实施方式中，胆汁酸盐是SDC。胆汁酸可以是冻干的。胆汁酸可以基本上不含动物源试剂。然而，使用一系列浓度的胆汁盐比如SDC是可能的，优选的是使用至少2％比如3％或5％的浓度。在一个实施方式中，SDC在大约2％的浓度下使用。

适合如本文描述的用途的洗涤剂的进一步的实例可以从Sigma Life Sciences(参见Biofiles(2008)Vol.3No.3“Detergents and Solubilization reagents”),G-Biosciences“Detergents:A handbook and Selection Guide to Detergents andDetergents Removal”获得。

除了阴离子羧酸表面活性剂和/或胆汁盐以外，对于去糖基化预处理或反应混合物，已经发现有利的但非必要的是包括还原剂。

在一些实施方式中，还原剂是DTT、β-巯基乙醇或TCEP。本领域技术人员可以确定还原剂的终浓度。在一些实施方式中，还原剂是DTT。例如，DTT的终浓度可以在大约0.2mM至大约100mM之间。例如，终浓度可以是大约0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM、2mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM DTT，或其任意范围(参见实施例4和5)。在一些实施方式中，还原剂是TCEP。在一些实施方式中，TCEP的终浓度在大约0.2mM至大约10mM之间。例如，大约0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM、2mM、5mM、10mM TCEP，或其任意范围(参见实施例6)。

在一个实施方式中，糖蛋白在去糖基化前可以被任选地预处理，其中整个去糖基化反应可以在小于60分钟比如小于30分钟内完成。在一些实施方式中，去糖基化反应混合物(使用或不使用热预处理)在大约25℃至高达70℃的温度(例如，大约25℃、30℃、37℃、40℃、43℃、45℃、48℃、50℃、53℃、55℃、58℃、60℃、63℃、65℃、70℃或其范围)下培育大约2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、5小时、10小时、或其任意范围。参见例如，实施例7。在一个实施方式中，混合物在大约37℃、45℃或50℃下培育大约30分钟、15分钟、10分钟、5分钟或大约3分钟或更短。在一些实施方式中，反应可以在30℃至50℃的范围内的温度下在2分钟至60分钟内至少90％完成。反应条件，例如，温度，可以取决于使用的酶变化。

反应中抗体的浓度可以在10ng/μl至10μg/μl的范围内，例如，100ng/μl至5μg/μl，但是也预期在此范围外的浓度。

在某些实施方式中，包含抗体的混合物在添加糖苷酶后导致基本上完全去糖基化，所述抗体在添加糖苷酶前在大约45℃至大约95℃的温度下使用不具有糖苷酶的表面活性剂预处理1分钟至60分钟，例如，大约1分钟、2分钟、3分钟、或小于大约5分钟、10分钟、15分钟、或30分钟。这显示在例如实施例7和17中。在一个实施方式中，预处理培育是大约55℃下大约15分钟。在另一个实施方式中，预处理培育是大约80℃下大约2分钟(参见例如，图7A-7B，图8，实施例7和实施例8，其展示了从环境温度(室温)至大约63℃的多种适合去糖基化的温度范围)。在其它实例中，在使用糖苷酶培育前，可以任选地使用还原剂比如DTT和缓冲剂——其包含可透析的不可解离的羧基化阴离子洗涤剂比如LS或胆汁酸比如SDC——预处理糖基化的抗体。

实施例展示了小于60分钟、30分钟、15分钟、5分钟、4分钟和3分钟内的抗体的去糖基化。完全去糖基化可以在室温至大约55℃的范围内的温度下持续5分钟实现。举例而言，55℃的温度可以使用10分钟或37℃的温度可以使用15分钟，其与可透析的不可溶的羧基化阴离子洗涤剂或胆汁酸组合导致底物糖蛋白的充分打开(opening)，以允许接近聚糖以便进行解离。

在一些实施方式中，在环境温度(大约22℃)下使抗体去糖基化是期望的。意想不到的发现是混合物中抗体的去糖基化仍可以是快速的。在一个实施方式中，混合物在环境温度下培育大约2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、5小时、10小时、或其范围。实施例8和图8显示了在环境温度下使用固定化的PNGase F或游离的PNGase F(使用或不使用预处理)的15分钟、10分钟、5分钟或更短内的快速去糖基化。在一个实施方式中，环境温度是大约18℃至大约25℃(例如，大约18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、或其范围)。出于除了酶活性以外的原因，固定化的PNGase F可以优选地在环境温度下使用。然而，固定化的PNGaseF还可以在本文描述任何更高的温度下使用。

确定哪种糖形存在于抗体样品中有用于确定抗体是否将具有期望的活性和/或半衰期，这取决于存在的具体的糖形。本方法对于糖形的去糖基化是有效的。

环境温度下的去糖基化(如本文显示的(参见实施例16))对于在线生产或分析过程是特别期望的。环境温度去糖基化是本文描述的方法中使用固定化的PNGase F的一个具体的应用。

在一个实施方式中，去糖基化的抗体从解离的聚糖分开(分离、纯化)。例如，分离方法可以包括蛋白A亲和层析、蛋白G亲和层析、蛋白L亲和层析等。另外的分离方法包括使用通用的N-聚糖结合试剂，比如在2014年7月2日提交的美国临时序列号62/020,335中描述的，其教导通过引用以其全部并入本文。

可以使用任何标准技术测定糖形，比如色谱、电泳、光谱或质谱。在实施例14中，糖形通过质谱测定。

在一个实施方式中，去糖基化的抗体或其去糖基化的片段、和/或解离的聚糖被标记。标记物是领域标准的(art-standard)并且非排他性列举包括荧光标记、放射性同位素、丙酮、抗体、或其组合。在一个实施方式中，使用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记解离的聚糖。可选地，或结合2-AB，可以使用2-氨基苯甲酸(氨茴酸；2-AA)标记解离的聚糖。有利地，上面描述的方法与如下相容：直接标记产物而不需要在先纯化来自混合物的产物。此实施方式的说明性实例在实施例11和12中描述。另外，聚糖的标记可以在高水性条件下完成。高水性条件指的是具有至少或大约60％、65％、70％、75％、80％或85％(vol/vol)水的溶液。在一个实施方式中，聚糖在存在至少80％水的情况下被标记。

在一个实施方式中，方法进一步包括在大约55℃至大约75℃的温度下使用标记试剂培育混合物大约30分钟至大约3小时。在一个实施方式中，使用标记试剂培育混合物大约30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、或3小时。在一个实施方式中，使用标记试剂在大约55℃、65℃、65℃、70℃、或75℃下培育混合物。在一个实施方式中，使用标记试剂在大约65℃下培育混合物大约2小时。标记剂的实例包括荧光染料比如异硫氰酸荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(tetramethylrohodamine isothiocyante)、丽丝胺罗丹明B、萘-5-磺酸、

染料(488、546、555、568、594、647、350、532)、

荧光团、PacificBlue^TM、Pacific Orange^TM、和

(均商业上可获得自Life Technologies,Carlsbad,CA)。

基本上所有聚糖可以以非偏向方式从糖蛋白去除。举例而言，N联聚糖可以从抗体解离、分离并且标记用于分析。在实施例16中，样品通过LC/ESI-MS分析。在在先分离释放的聚糖或不在先分离释放的聚糖的情况下，释放的聚糖都可以被标记(例如，如实施例16中说明的)。如实施例11中进一步描述的，在两锅法中，基本上所有N联聚糖可以被解离或被分离(图11B中图解的)，然后标记，或在一锅法中在不分离的情况下被直接地标记(图11A中图解的)。标记的聚糖的总体概况是相同的，不论是否首先分离聚糖。然而，一锅法中聚糖的绝对数量显著地增加。在这些实施方式中，在存在DTT和SDC的情况下，可以使用糖苷酶(比如PNGase F)从糖基化的抗体(比如单克隆IgG抗体)解离聚糖。在一锅去糖基化和标记方法中，使用由LS示例的可透析的不可解离的羧基化阴离子表面活性剂也展示了类似的去糖基化结果(参见实施例12和图12A-12C)。这展示了包括胆汁盐或羧基化表面活性剂的糖苷酶反应与聚糖的直接标记——其最小化聚糖标记期间的抗体沉淀——的意想不到的相容性。

在一个实施方式中，与在同一反应条件下测试的对应的糖基化的抗体的表位结合亲和力和/或亲和性相比，去糖基化的抗体保留至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％表位结合亲和力和/或亲和性。可以使用领域标准技术确认表位结合亲和力和/或亲和性，比如蛋白质印迹、ELISA、Biacore等。例如，抗体被完全地去糖基化并且通过蛋白质印迹确认其活性以保留表位结合(参见实施例13和19，图13C和18C)。方法的实施方式可以被应用至任何糖基化的抗体种类或同种型。如实施例13和15中显示的，所有抗体可以被成功地去糖基化为显著去糖基化的形式(还参见图13A-13C，和图15A-15B)。

在一个实施方式中，蛋白酶比如胰蛋白酶可以被添加至包含糖苷酶比如PNGaseF的反应混合物，而不大量失去糖苷酶的活性。在单个反应中，蛋白酶可以将抗体解离为肽片段同时糖苷酶去除聚糖。合适的蛋白酶的实例包括：胰蛋白酶、GluC、AspN、蛋白酶K、因子Xa、肠激酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)、LysC、Arg-C(Promega,Madison,WI)、LysN(Life Technologies,Carlsbad,CA)、IdeS(Genovis,Cambridge,MA)、V-8蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-裂解蛋白酶、焦谷氨酸氨肽酶、亮氨酸氨肽酶、甲硫氨酸氨肽酶、氨肽酶I、氨肽酶A、羧肽酶(A、B、G、Y)、胃蛋白酶、组织蛋白酶(B、C、D)、α-胰凝乳蛋白酶(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、TEV、凝血酶、IdeZ和IdeE(New England Biolabs,Ipswich,MA)。

在一个实施方式中，反应物在使用前可以是冻干的而不负面地影响去糖基化。

还提供了试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包括一种或多种冻干的试剂。在一个实施方式中，冻干的试剂选自：冻干的糖苷酶比如冻干的PNGase F；冻干的缓冲剂，其中缓冲剂包括胆汁酸或其盐、羧基化阴离子表面活性剂或其盐、或其组合；冻干的还原剂；和其组合。上面描述了胆汁盐、可透析的不可解离的羧酸盐阴离子表面活性剂和其盐。额外地或可选地，试剂盒包括固定化的糖苷酶比如PNGase F。说明性的冻干的试剂、固定化的PNGaseF和使用它们的方法在实施例(参见实施例8和14)中描述。在一个实施方式中，试剂盒进一步包括一种或多种组分，其选自聚糖标记试剂、对照标准物、和使用说明书。在一个实施方式中，一种或多种试剂基本上不含动物源产品。在另一个实施方式中，蛋白酶可以包括在试剂盒中，例如胰蛋白酶，其中蛋白酶可以与糖苷酶和/或反应缓冲剂一起被冻干或分别被冻干。

用于通过抗体或其去糖基化的片段制备本文说明的去糖基化的蛋白质的试剂和方法的实施例不意欲是限制性的而是说明本发明的实施方式。实施方式可适合任何糖基化的蛋白质，其不限于包括抗体片段在内的抗体。用于从糖蛋白获得基本上所有联结的(linked)聚糖的试剂和方法的实例是体外分析的结果，并且不构成或不可以解释为或作为天然存在的混合物或事项，比如在体内可以存在的。去糖基化方法的实施方式与从蛋白质比如包括其片段的抗体解离的聚糖的直接标记相容，而不先从包含抗体或其片段和聚糖的混合物纯化聚糖。可选地，去糖基化的蛋白质比如包括其去糖基化的片段的抗体可以在蛋白质组分析前通过任何合适的手段被进一步加工，所述手段包括透析、点滴透析(dropdialysis)、使用分子筛过滤、或固相萃取。如果需要，聚糖还可以通过例如具有正相或反相的固相萃取(C18，石墨碳，HILIC)被进一步加工。还提供了促进环境温度下的样品加工的方法和试剂。这样的方法和试剂特别有用于工业生产应用中的在线样品分析。

下面是源自杏仁的新型改进的PNGase的描述，其解离α1,3岩藻糖，适合从在植物、昆虫、软体动物和蠕虫中重组地制造的蛋白质去除N-聚糖。这些糖-表位在人以及其它脊椎动物中不存在，并且正因如此已经涉及人中的变应原性和免疫原性反应，并且可以是快速清除植物或昆虫源重组治疗性蛋白的因子(Bardor,等,Current Opinion StructuralBio.16:576-583(2006))。杏仁源糖苷酶在大自然作为N-糖基化的异二聚体被发现。在本发明的实施方式中，其被用作单链去糖基化的多肽。其已经发现与PNGaseF的实例中描述的制剂中的其它糖苷酶类似地有效。

表1：植物源糖苷酶(PNGase)的实例

在本发明的实施方式中，如上面描述的使用PNGase，其具有与下列序列的至少85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同源性：

AAVPHRHRLPSHHLASLKLNASAPPTTYFEVDRPIRPPRGSVGPCSTLLLSNSFGATYGRPPVTAAYAPPSCLAGGGGGGGGASSIALAVLEWSADCRGRQFDRIFGVWLSGAELLRSCTAEPRATGIVWSVSRDVTRYAALLAEPGEIAVYLGNLVDSTYTGVYHANLTLHLYFHPAPPPPPPPQQADLIVPISRSLPLNDGQWFAIQNSTDVQGKRLAIPSNTYRAILEVFVSFHSNDEFWYTNPPNEYIEANNLSNVPGNGAFREVVVKVNDDIVGAIWPFTVIYTGGVNPLLWRPITGIGSFNLPTYDIDITPFLGKLLDGKEHDFGFGVTNALDVWYIDANLHWLDHKSEETTGSLISYEAQGLVLNVDSGFSGLDGQFVTSASRHISATGLVKSSYGEVTTNFYQRFSYVNSNVYSKNGSVQVVNQTIDAKSGVFAKDALAVLLSEELHQIFPLYVYTGTSDEEADEYTLISHVKLGVNEKETSGGKMGFSYNSLRNAQSAHGSMKVKKNLVVGGLGETHQAYKYVGADGCYFRDVRSKNYTVLSDHSGDSCTKRNPYNGAKFSLRNDQSARRKLMVNNL(SEQ ID NO:1)。

为了进一步增强在非天然宿主细胞中克隆的选择的PNGase的性质比如表达水平和活性，突变可以定向至蛋白质中的二元位点，例如，基础氨基酸可以转化为任何其它氨基酸，特别是在来自相同生物体的其它亚型中的相同位置处观察到的那些。选择氨基酸以置换二元位点可以以这样的方式做出：避免破坏任何二级结构比如α螺旋或β折叠。通过计算机程序比如Jpred3(Cole,等,Nucleic Acids Research,36(suppl 2):W197-W201(2008))鉴定这些潜在的结构。

选择的PNGase在非同源宿主细胞中表达为单个多肽，并且当在动物细胞或酵母、杆状病毒/昆虫细胞中表达时，重组PNGase自身变为使用N联聚糖修饰的。

为了便于纯化，选择能够分泌PNGase的宿主细胞比如酵母，但是PNGase也可以纯化自宿主细胞的裂解物。用于表达植物PNGase的合适的宿主细胞的实例可以包括酵母比如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)(K.lactis)或毕赤酵母(Pichia pastoris)(P.pastoris)。在以高甘露糖N联聚糖在非天然宿主细胞中合成PNGase的地方，使用合适的高甘露糖N联聚糖裂解酶比如Endo H的去糖基化是优选的。

可以使用任何底物——对于其，已经充分地描述了N联聚糖——测定植物PNGase对包含α1,3岩藻糖的N联聚糖的活性，而不需要首先将蛋白质解离为肽。例如，HRP和菠萝的菠萝蛋白酶具有已经被充分表征的包含α1,3岩藻糖的N联聚糖。这些蛋白质上的基本上所有聚糖具有经由α1,3糖苷键连接至岩藻糖的GlcNAc和连接至两个甘露糖(菠萝蛋白酶)或三个甘露糖(HRP)——其中第一个甘露糖还连接至木糖——的第二个GlcNAc。相比之下，蜗牛血蓝蛋白和人IgG具有经由α1,6糖苷键连接至岩藻糖的GlcNAc。HRP和菠萝的菠萝蛋白酶均是有用的糖蛋白底物，用于测定糖苷酶对包含α1,3岩藻糖的N联聚糖的解离。这些糖蛋白可以容易地缀合至产生着色信号或荧光信号的标记。荧光染料的实例：异硫氰酸荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明、丽丝胺罗丹明B、萘-5-磺酸、

染料(488、546、555、568、594、647、350、532)、

荧光团、Pacific Blue^TM、Pacific Orange^TM、和

纯化自杏仁的PNGase二肽和克隆自水稻并且在乳酸克鲁维酵母或毕赤酵母中表达的重组单肽PNGase Ar的具体活性可以多达500,000至600,000单位/mg的蛋白质。一个单位被定义为在10μl的总反应体积中在37℃下在1小时内从10μg的变性的RNase B去除>95％的碳水化合物需要的酶量。

使包含α1,3岩藻糖的N-聚糖去糖基化和表征这些N-聚糖的能力具有许多用途。这些包括满足联邦政府规章对治疗性蛋白的表征。额外地，N-聚糖的去除可以减少施用这些治疗性蛋白的不需要的副作用。下面提供了应用的实例。

当与具体的底物一起培育时，HRP产生标记分子的着色、荧光或发光衍生物，使得其被检测到和被量化。HRP通常在缀合物(已经被基因地或化学地接合的分子)中使用以测定分子靶标的存在。例如，缀合至HRP的抗体可以用于在蛋白质印迹中检测少量的特异性蛋白质。为了避免交叉反应性，可以使用本文描述的方法的实施方式针对已经使用PNGase去糖基化的HRP制备抗体。

已经研发了个性化疫苗用于使用蛋白质治疗淋巴瘤。这些蛋白质的去糖基化是优选的。用于非何杰金淋巴瘤的疫苗已经在烟草植物中生产，其中去除N-聚糖涉及α1,3岩藻糖(McCormick,等,PNAS,105:10131-10136(2008))。PNGase Ar可以用于分析完整的去糖基化的蛋白质的活性是否等价于糖基化的蛋白质，但是具有来自于去糖基化的优点。

本文引用的所有参考文献通过引用并入，其包括美国临时申请序列号：2014年5月30日提交的62/005,559、2014年6月27日提交的62/018,074、2014年7月8日提交的62/021,936、2014年8月22日提交的62/040,745、和2014年11月17日提交的62/080,480。

实施例

实施例1：在PNGase F处理之前单独地通过温热预处理抗体不产生完全去糖基化的抗体

制备IgG的浓缩的样品：抗-MBP单克隆抗体(New England Biolabs,Ipswich,MA)的整分试样是冻干的并且重悬浮在250μL的水中(产生200mM NaCl，4mM EDTA，40mM TrispH 7中4μg抗体/μL的终浓度)。使用水将浓缩的IgG(36μg)稀释至27μL的总体积。样品被加热至55℃持续10分钟，并且然后保持在4℃下。向所有样品添加3μL的不含洗涤剂的缓冲剂。对照反应不包含任何去糖基化酶，而1μL的快速PNGase F被添加至每个去糖基化实验样品。反应在37℃下培育1小时或16小时，然后保持在4℃下直到进一步分析。为了通过ESI-TOF测定IgG的完整质量(intact mass)，在室温下使用10mM DTT进一步处理去糖基化的IgG样品30分钟，并且甲酸被添加至0.1％。使用本领域中已知的方法，通过具有PLRP-S(5μm颗粒，1000A孔径)的反相液相色谱(LC)和电喷雾离子化飞行时间质谱(ESI-TOF MS)分析样品。结果显示在图1A-1C中。

实施例2：在PNGase F处理之前通过热变性结合还原剂预处理抗体不产生完全去糖基化的抗体

如实施例1中描述的制备浓缩的IgG样品。单克隆IgG(36μg)在40mM DTT中稀释至27μL的体积。样品在55℃下培育10分钟，在其后添加3μL的反应缓冲剂(500mM磷酸钠pH7.5)。阴性对照不包含任何去糖基化酶，而500U的不含甘油的PNGase F被添加至每个去糖基化实验样品。反应在37℃下培育1小时或16小时，然后保持在4℃下直到进一步分析。如实施例1中描述的，通过ESI-TOF分析不含洗涤剂的IgG样品的完整质量。结果显示在图2A-2C中。

实施例3：在PNGase F去糖基化之前使用商业试剂RapiGest^TM处理不产生完全去糖基化的抗体

如实施例1中描述的制备浓缩的IgG样品。单克隆IgG的整份试样(64μg)在20μL的总体积中的0.1％RapiGest^TM中再水化。样品在55℃下培育10分钟，在其后是10μL的反应缓冲剂。对照反应不包含任何去糖基化酶，而1μL的快速PNGase F被添加至每个去糖基化实验样品。反应在37℃下培育1小时。如实施例1中描述的，通过ESI-TOF分析不含洗涤剂的IgG样品的完整质量。结果显示在图3A-3B中。

实施例4：使用一系列浓度的羧基化表面活性剂使抗体完全去糖基化

在20μL的总体积中，抗-MBP小鼠单克隆IgG 36μg(New England Biolabs,Ipswich,MA)与变化量的DTT(0.2至80mM范围内的终浓度)和变化量的LS(0.05至5％w/v范围内的终浓度)混合。对照反应不包含任何去糖基化酶。1μl的快速PNGase F被添加至所有其它样品并且在50℃下培育5分钟。每个样品的整份试样经由SDS-PAGE分离并且使用SimplyBlue^TM SafeStain(Life Technologies,Carlsbad,CA)可视化。

使用变化浓度的SDC(例如，范围在大约0.05％至大约5％w/v之间)重复类似的实验(数据未显示)。在热预处理糖基化的样品或不热预处理糖基化的样品的情况下，在大约50℃下在5分钟或更短实现去糖基化。在大约2％至5％的范围的SDC中展示了完全去糖基化。结果显示在图4A-4C中。

实施例5：使用一系列浓度的还原剂DTT使抗体完全去糖基化

在20μL的总体积中，抗-MBP小鼠单克隆IgG(36μg，New England Biolabs)与变化量的DTT(0至0.1mM范围内的终浓度)和LS(终浓度0.5％w/v)混合。对照反应不包含任何去糖基化酶。1μl快速PNGase F被添加至所有其它样品并且在50℃下培育5分钟。每个样品的整份试样经由SDS-PAGE分离并且使用SimplyBlue SafeStain可视化。结果显示在图5中。

实施例6：使用一系列浓度的还原剂三(2-羧乙基)膦(TCEP)使抗体完全去糖基化

在20μL的总体积中，抗-MBP小鼠单克隆IgG(36μg)与变化量的TCEP(0至20mM范围内的终浓度)和LS(终浓度0.5％w/v)混合。对照反应不包含任何去糖基化酶。1μl快速PNGase F被添加至所有其它样品并且在50℃下培育5分钟。每个样品的整份试样经由SDS-PAGE分离并且使用SimplyBlue SafeStain可视化。结果显示在图6中。

实施例7：使用一系列温度使抗体完全去糖基化

在20μL的总体积中，抗-MBP小鼠单克隆IgG(36μg)的十六个样品与DTT(终浓度20mM)和LS(终浓度0.5％w/v)混合。额外地，第二组抗-MBP小鼠单克隆IgG(36μg)的16个样品与DTT(终浓度4mM)和SDC(终浓度2％w/v)在缓冲剂中混合以形成总计20μl的体积。在添加1μl快速PNGase F之前，通过在50℃下预培育5分钟在两步反应中处理八个含LS的样品和8个含SDC的样品。在没有预培育的一步反应中，1μl快速PNGase F被添加至其余的8个含LS的样品和8个含SDC的样品。对照(在对应的LS或SDC缓冲剂中的单独的IgG样品)不包含任何PNGaseF。所有样品(在50℃下预处理；或不预处理)在编程有8点(8-point)温度梯度(从38℃至63℃)的热循环仪中培育5分钟。每个样品的整份试样经由SDS-PAGE分离并且使用SimplyBlue SafeStain可视化。结果显示在图7A-7B中。

实施例8：在环境温度下使抗体完全去糖基化

使用游离的快速PNGase F或重组PNGase F的固定化形式，抗体可以在环境温度下在大约5、10和15分钟内被完全地去糖基化。固定化利用PNGase F的融合蛋白，其中PNGaseF经由

(New England Biolabs,Ipswich,MA)被融合，其又共价结合至苄基鸟嘌呤琼脂糖珠。虽然在此使用了琼脂糖珠，但是可以使用本领域已知的任何合适的基质。

抗-MBP小鼠单克隆IgG(100μg)的样品与0.5％LS和20mM DTT混合，并且在37℃下培育15分钟。样品被加样至包含PNGase F HS-BG琼脂糖珠的柱。反应在22℃下培育5、10或15分钟。使用可溶的(游离的)PNGase F的对照反应在相同的条件下进行。不使用酶处理阴性对照(“抗-MBP-”)。

固定化的PNGase F或可溶的快速PNGase F处理导致SDS-PAGE上的迁移率变动，其对应于IgG的重链的完全去糖基化。如实施例1中描述的，通过ESI-TOF分析对照和去糖基化的抗体样品的完整质量。结果显示在图8中。

实施例9：在3分钟或更短使抗体去糖基化以产生显著去糖基化的抗体

在具有缓冲剂的20μL的总体积中，抗-MBP小鼠单克隆IgG(36μg)与DTT(终浓度20mM)和LS(终浓度0.5％w/v)混合。对照反应不包含任何PNGase F。向所有其它样品添加1μl的快速PNGase F。样品在50℃下培育1至5分钟。每个样品的整份试样经由SDS-PAGE分离并且使用SimplyBlue SafeStain(Life Technologies)可视化。结果显示在图9中。在三分钟的培育时间内观察到完全去糖基化。

实施例10：从抗体解离基本上所有N联聚糖以产生非偏向的N-聚糖组合物

如实施例1中描述的制备浓缩的IgG样品。在存在或不存在2％SDC的情况下，单克隆IgG与4mM DTT在20μL的总体积中混合。样品在预处理中被加热至55℃持续10分钟，接着1μl快速PNGase(在对照中不进行)和37℃下4小时的第二次培育。释放的糖通过具有石墨柱(graphite cartridge)的固相萃取(SPE)分离，干燥，并且使用2-氨基苯甲酰胺(2AB)标记。通过LC/ESI-MS分析样品，通过荧光频道中的峰值积分(peak integration)估算聚糖丰度。基于它们的保留时间(荧光踪迹(fluorescent trace))和它们对应的m/z值人工地指定聚糖结构。结果显示在图10A-10B中。

实施例11：在存在胆汁盐的情况下，直接荧光标记从抗体释放的聚糖，而没有在先的聚糖纯化

在20μL的总体积中，抗-MBP单克隆抗体的整份试样(14μg)悬浮在2％SDC和4mMDTT中。1μl快速PNGase F被添加至每个去糖基化样品。反应在50℃下培育15分钟，在其后在相同的反应容器中使用2-氨基苯甲酰胺(2AB)直接标记释出的聚糖(一锅)，或如实施例12中描述的通过SPE纯化并且干燥(两锅)。新鲜的标记溶液(20μL，包含2AB，氰基硼氢化钠和乙酸)被添加至干燥的聚糖，或被直接添加至去糖基化反应(高水性标记条件)。高水性条件指的是具有至少或大约60％、65％、70％、75％、80％或85％(vol/vol)的水的反应。标记反应在65℃下培育2小时，在其后通过HILIC SPE加工N-聚糖以去除未结合的标记物并且通过LC-MS进行分析，结果显示在图11A-11B中。使用可透析的不可解离的羧基化阴离子表面活性剂代替胆汁盐获得类似的结果(参见实施例12)。

实施例12：在存在羧基化阴离子表面活性剂的情况下，直接荧光标记从抗体释放的聚糖，而没有在先的聚糖纯化

如实施例9中描述的，使用20mM DTT、0.5％LS和快速PNGaseF使治疗性单克隆IgG和IgG融合蛋白(利妥昔单抗、西妥昔单抗、依那西普)去糖基化大约5分钟，以便完全去糖基化。紧接其后，标记混合物(包含用于还原胺化的试剂)被添加并且在65℃下培育另外的2小时。标记反应可以在高水性条件(上面描述的)下进行。高水性条件包括>60％，优先地至少或大约80％的水。荧光标记的聚糖经历HILIC SPE纯化，并且通过HPLC-MS进行分析。结果显示在图12A-12C中。

实施例13：在还原条件下，在存在十二烷基肌氨酸的情况下，在去糖基化后保留单克隆抗体活性

使用如实施例1中描述的浓缩的IgG样品。单克隆IgG(36μg)与4mMDTT和0.5％LS在20μL的总体积中混合。对照反应不包含任何去糖基化酶。1μl快速PNGase F被添加至实验样品并且在50℃下培育5分钟。通过ESI-TOF分析IgG样品的完整质量。

为了测定完整的、去糖基化的单克隆IgG的功能活性，使用MBP-EndoH融合蛋白(EndoHf,New England Biolabs,Ipswich,MA)，在蛋白质印迹上针对其对应的抗原(麦芽糖结合蛋白，MBP)分析抗-MBP-单克隆抗体。连续稀释的Endo Hf的蛋白质印迹在PVDF膜(Immobilon-P Millipore,Billerica,MA)上准备并且使用去糖基化的抗-MBP小鼠单克隆抗体(在上面描述的非还原条件下使用PNGase F处理)或糖基化的抗-MBP小鼠单克隆抗体(未使用快速PNGase F处理)进行免疫印迹。结果显示在图13A-13B中。

实施例14：缓冲剂和PNGase F可以被分别地或组合地冻干并且用于产生去糖基化的抗体

快速PNGase F与包含0.5％LS和20mM DTT的反应缓冲剂一起(“混合剂”)或分别地冻干。在测试冻干的混合剂的活性之前，或单独地测试冻干的缓冲剂和快速PNGase F的活性之前，再水化每个组分。每个酶-缓冲剂混合物被添加至IgG样品。阴性对照反应在50μL的新鲜的0.5％LS和20mM DTT中包含36μg的抗体。阳性对照反应与阴性对照相同但是具有2μl的快速PNGase F。所有反应在50℃下培育5分钟。每个样品的整份试样经由SDS-PAGE分离并且使用SimplyBlue SafeStain可视化。如实施例4和5中描述的，通过将LS替换为胆汁盐比如SDC(例如2％SDC和8mM DTT)，可以在干燥的混合剂或干燥的包含胆汁盐的反应缓冲剂中取得类似的结果。结果显示在图14A-14B中。

实施例15：一步或两步完全去糖基化对于抗体同种型是非特异性的

使用抗体的11种不同的同种型展示了完全去糖基化的一般效果。以治疗性抗体利妥昔单抗的可变区为特征的抗-hCD20同种型集合获取自Invitrogen(San Diego,CA)。由人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、人IgM、人IgA1、人IgA2、人IgE、鼠IgG1、鼠IgG2a和鼠IgA构成的纯化的同种型被用于制备1mg/ml的终浓度。每个同种型安排两个去糖基化反应。由16μg的抗体构成的阴性对照反应与给出在总计20μL中0.5％LS和20mM DTT的终浓度的缓冲剂混合。反应相同于阴性对照，但是添加1μl快速PNGase F。所有反应在50℃下培育10分钟。每个样品的整份试样经由SDS-PAGE分离并且使用SimplyBlue SafeStain可视化(参见图15A-15B)。使用包含代替LS的2％SDC的缓冲剂已经获得了类似的结果。

发生同种型非特异性的两步完全去糖基化反应。两步反应包括酶促地解离聚糖前的短暂的热预处理步骤。热预处理的温度和时间可以变化，并且一般而言，较短的时间可以与较高的温度组合。在此，预处理时间短达一或两分钟，并且温度可以高至大约95℃。在此实施例中，在添加快速PNGase F和在50℃下培育混合物大约10分钟前，包含胆汁盐或羧基化阴离子表面活性剂的缓冲剂中的抗-hCD20同种型集合抗体在80℃下预处理大约2分钟。通过SDS-PAGE或其它领域标准技术确认完全去糖基化。

实施例16：抗体生产期间的环境温度在线分析

抗体的大规模生产，比如用于商业或治疗性抗体生产的那些，需要适合在线分析的分析过程。在生产期间，可以需要在细胞培养期间的多个时间点处分析抗体以监测糖基化的抗体的聚糖概况。在此实施例中，抗体培养物的样品在一个或多个时间点处从生物反应器无菌地取出并且加样在包含固定化的PNGase F的装置上。装置是装有具有固定化的PNGase F的珠的柱。可选地，微流体装置可以与固定化在与样品接触的表面上的PNGase F一起使用。如本文描述的，装置可以预装载或随后装载有缓冲剂。在缓冲剂中使用0.5％LS、20mM DTT或2％SDC、20mM DTT。在洗脱和分析无糖基化的抗体和/或聚糖组合物的洗脱物前，设备中的样品允许在环境温度下反应15分钟或更短(例如，10分钟、5分钟或更短)。图8展示了在相同的缓冲剂中固定化的PNGaseF与可溶的PNGaseF一样有效。

实施例17：在50℃下五分钟内用还原剂的完全去糖基化的PNGase F/IgG比率(参见图16A-16B)

为了测定在50℃下使用一步反应五分钟的PNGaseF与抗体的有效比率，在具有或不具有LS(终浓度0,5％w/v)的情况下，抗-MBP小鼠单克隆IgG的样品(36μg)与DTT(20mM)在10μl的缓冲剂中结合。对照不包含任何去糖基化酶。两倍稀释的原液重组PNGase F(8000单位/μl)被添加至样品，其在50℃下培育5分钟(一步，同时温和加热和去糖基化)。来自每个管的整份试样与样品缓冲剂混合，加热，并且加样在

10-20％Tris甘氨酸凝胶(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)上。在电泳后，使用SimplyBlue SafeStain染色凝胶以可视化条带(参见图16A-16B)。

完全去糖基化的比率限定为使10μl的反应体积中的1μg的IgG在50℃下在5分钟内完全去糖基化需要的PNGase F的最小单位量。

实施例18：在两步反应中，不用还原剂的完全去糖基化的PNGase F/IgG比率

利用两步反应测定在不存在还原剂的情况下PNGaseF与抗体的有效比率。抗-MBP小鼠单克隆IgG的样品与或不与LS(终浓度0.5％w/v)在10μl的缓冲剂中结合。样品在75℃下培育五分钟。对照不包含任何去糖基化酶。两倍稀释的原液重组PNGase F(8000单位/μl)被添加至样品，其在50℃下培育5分钟。来自每个管的整分试样与样品缓冲剂混合，加热，并且加样在Novex 10-20％Tris甘氨酸凝胶上。在电泳后，使用SimplyBlue SafeStain染色凝胶以可视化条带(参见图17A-17B)。

在非还原条件下完全去糖基化的比率限定为使10μl的反应体积中的1μg的IgG在50℃下在5分钟内完全去糖基化需要的PNGase F的最小单位量。图16A-16B和图17A-17B中的结果显示了可透析的不可解离型羧化阴离子表面活性剂的存在使两步反应中完全去糖基化需要的PNGase F的量显著地减少>20倍、>50倍、>75倍或>90倍的PNGase F。

实施例19：非还原条件下的完全去糖基化保持抗体结合功能。

如下建立在去糖基化后保留四聚体抗体的功能结构。抗-MBP小鼠单克隆IgG(36μg)、利妥昔单抗(40μg,Genentech,San Francisco,CA)和依那西普(25μg,Amgen,ThousandOaks,CA)与LS(终浓度0.5％w/v)在20μl(终体积)的缓冲剂中混合。在多种条件下预处理反应物：80℃持续2分钟、75℃持续5分钟、70℃持续10分钟、65℃持续10分钟、60℃持续10分钟、或55℃持续15分钟。对照不包含任何去糖基化酶，向所有其它样品添加1μl的快速PNGase F。反应物立刻在50℃下培育10分钟。整份试样与样品缓冲剂混合，加热，并且加样在Novex 10-20％Tris甘氨酸凝胶上。还运行非还原性凝胶以展示二聚体和四聚体的结构完整性：整份试样在不存在DTT的情况下与样品缓冲剂混合，加热，并且如上面描述的运行凝胶。在电泳后，使用SimplyBlue SafeStain染色凝胶以可视化条带。

为了测定完整的、去糖基化的单克隆IgG的功能结合活性，使用MBP-Endo H融合蛋白Endo Hf，在蛋白质印迹上针对其对应的抗原(麦芽糖结合蛋白，MBP)分析抗-MBP-单克隆抗体。连续稀释的EndoHf的蛋白质印迹在PVDF膜(Immobilon-P Millipore)上准备并且使用去糖基化的抗-MBP小鼠单克隆抗体(在上面描述的非还原条件下使用PNGase F处理)或糖基化的抗-MBP小鼠单克隆抗体(未使用PNGase F处理)进行免疫印迹。还包括使用新鲜的抗-MBP的对照。结果显示在图18A-18C中。

实施例20：在存在两种不同的可透析的不可解离型羧基化表面活性剂的情况下，在具有PNGase F处理的一步或两步反应中使抗体完全去糖基化

在20μL体积的缓冲剂中，抗-MBP单克隆抗体的整份试样(36μg)悬浮在具有或不具有20mM DTT的包含2.5％LS或月硅酸盐(LAU)的缓冲剂中。对照反应不包含PNGase F。对于一步反应，添加1μL的快速PNGase F并且样品在50℃下培育5分钟。对于两步反应，样品在72℃下预加热5分钟，在冷却后，添加1μL的快速PNGase F并且样品在50℃下培育5分钟。每个样品的整份试样(5.4μg IgG)经由SDS-PAGE分离并且使用SimplyBlue SafeStain可视化(参见图19)。

实施例21：使用PNGase F和胰蛋白酶同时消化蛋白质

进行同时的PNGase F/胰蛋白酶消化以促进单克隆抗体的肽作图(和肽覆盖)。此单步方法对结构分析比如聚糖占位测定是有利的，并且在需要数小时完成的胰蛋白酶消化之前有利地比较重组PNGase F消化。

为了测定对蛋白酶消化有利的去糖基化条件，25μg的抗-MBP小鼠单克隆IgG重悬浮在总计50μl的缓冲剂中。抗体在95℃下培育5分钟，并且然后以1∶100的酶∶底物比率添加6μl的快速PNGase F和250ng的胰蛋白酶-ultra^TM，质谱等级(New England Biolabs,Ipswich,MA)。样品在37℃下培育30分钟至3小时，或在50℃下培育5分钟至30分钟。

一微升的消化的样品(同时PNGase F/胰蛋白酶消化)被注射至C18分析柱上并且使用60分钟线性梯度分离。通过CID和ETD二者自动地选择和断裂带多个电荷的(multiple-charged)肽离子。考虑具有最大两个未酶切位点(missed cleavage)的理论肽，分析MS和MS/MS断裂数据。分析允许天冬酰胺的可变修饰以说明在通过PNGase F去除聚糖后发生的至天冬氨酸的转变。虽然图20A-20B中的数据显示了在不存在LS的情况下PNGase F/胰蛋白酶的结果，但是本实施例提供了在存在羧基化阴离子表面活性剂的情况下进行反应的方法。

实施例22：在两步反应中使包含N-和O-聚糖二者的抗体完全去糖基化，其涉及在使用糖苷酶的组合处理之前，使用热结合胆汁盐或不可解离型可透析的羧基化表面活性剂预处理。

对于包含O-聚糖的抗体，任选地去除所有O-聚糖以及N-聚糖可以是期望的。用于解离O-聚糖的包含O-糖苷酶(Endo-α-N-乙酰半乳糖苷酶)和3种外切糖苷酶(神经氨酸苷酶、β1-4半乳糖苷酶和βN-乙酰葡糖胺糖苷酶(New England Biolabs,Ipswich,MA))的酶组合和用于解离N-聚糖的N-糖苷酶(PNGase F)一起使用以使具有O-和N-聚糖的蛋白质完全地去糖基化。

治疗性单克隆融合蛋白(依那西普)与0.5％LS和20mM DTT混合。样品在80℃下预培育2分钟。5μl的包含上面描述的所有糖苷酶的蛋白质去糖基化混合物(New EnglandBiolabs,Ipswich,MA)被添加至样品。对照反应不包括酶；或用SDS代替LS，反应在37℃下培育30分钟。每个样品的整份试样经由SDS-PAGE分离并且使用SimplyBlue SafeStain可视化。

与对应于完全去除O-聚糖和N-聚糖二者的对照相比，使用蛋白质去糖基化混合物处理的样品显示了迁移率的增加。此实施例强调使用SDS的问题，其对于通过酶混合物完全去糖基化是有害的。

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Claims

1.组合物，其包括：(i)不包括十二烷基硫酸钠(SDS)的可透析的不可解离的羧基化阴离子表面活性剂，和还原剂；(ii)一种或多种糖苷酶；(iii)通过电泳或通过质谱测定的去糖基化的抗体或抗体片段，其中所述去糖基化的抗体或抗体片段指90％-100％去糖基化的；和(iv)聚糖解离产物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述还原剂是二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述去糖基化的抗体具有抗原结合活性。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述去糖基化的抗体选自去糖基化的人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、人IgM、人IgA1、人IgA2、人IgE、鼠IgG1、鼠IgG2a和鼠IgA。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述去糖基化的抗体适合用于免疫测定。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述聚糖解离产物和/或所述抗体使用荧光标记、放射性同位素、丙酮、抗体或其组合标记。

7.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括蛋白酶。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。

9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述蛋白酶选自胰蛋白酶、GluC、AspN、蛋白酶K、因子Xa、肠激酶、LysC、Arg-C、LysN、IdeS、V-8蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-裂解蛋白酶、焦谷氨酸氨肽酶、亮氨酸氨肽酶、甲硫氨酸氨肽酶、氨肽酶I、氨肽酶A、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶G、羧肽酶Y、胃蛋白酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、α-胰凝乳蛋白酶、TEV、凝血酶、IdeZ和IdeE。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述糖苷酶中的一种或多种是融合蛋白。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述糖苷酶融合蛋白被固定化在基质上。

12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述融合蛋白包括突变型O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)。

13.根据权利要求10所述的组合物，其中所述融合蛋白通过将O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶亲和结合至基质被固定化。

14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括水性缓冲剂。

15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种糖苷酶是多种糖苷酶。

16.根据权利要求1或15所述的组合物，其中所述多种糖苷酶包括外切糖苷酶和/或内切糖苷酶。

17.一种方法，其包括：

(a)培育组合物与糖基化的抗体小于60分钟，所述组合物包括不包括十二烷基硫酸钠(SDS)的可透析的不可解离的羧酸盐表面活性剂，和还原剂；和一种或多种糖苷酶；和

(b)从所述糖基化的抗体解离聚糖以形成去糖基化的抗体和聚糖解离产物，其中所述从所述糖基化的抗体解离聚糖指90％-100％去糖基化的。

18.根据权利要求17所述的方法，进一步包括分离所述去糖基化的抗体或解离的聚糖产物。

19.根据权利要求17或18所述的方法，进一步包括表征所述抗体和/或所述聚糖解离产物。

20.根据权利要求17所述的方法，进一步包括测定所述去糖基化的抗体的抗原结合活性。

21.根据权利要求20所述的方法，其包括通过选自放射免疫测定、ELISA、亲和结合测定、或免疫沉淀测定的抗体-抗原结合测定来测定所述抗体的活性。

22.根据权利要求17所述的方法，其中所述组合物进一步包括蛋白酶，用于形成肽片段和聚糖解离产物的混合物。

23.根据权利要求17所述的方法，其中在与糖基化的抗体培育之前，冻干所述组合物，其中所述糖基化的抗体在水性缓冲剂中。

24.根据权利要求17所述的方法，其中所述糖苷酶中的一种或多种被固定化在基质上。

25.根据权利要求17所述的方法，其中所述培育在20℃-60℃的温度下。

26.试剂盒，其包括一种或多种冻干的糖苷酶和冻干的缓冲剂，其中所述冻干的缓冲剂包括：排除SDS的可透析的不可解离的羧酸盐阴离子表面活性剂，和还原剂。

27.根据权利要求26所述的试剂盒，进一步包括蛋白酶。