CN110225925B - 快速高效的糖蛋白去糖基化 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速且经济有效的糖蛋白去糖基化方法，其中糖蛋白与阴离子表面活性剂及还原剂还有非离子表面活性剂组合，以获得稳定的变性的糖蛋白。进一步地，将内切糖苷酶加入到变性的糖蛋白中以切割N‑连接聚糖，以获得去糖基化的蛋白质。还提供了通过部分去糖基化评估蛋白质构象的快速工具，其中使用毛细管电泳(CE‑SDS)分析部分去糖基化的蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及工业上确定分子相似性所需的快速可靠的分析方法。本发明提供了快速高效的糖蛋白去糖基化方法。本发明还涉及通过利用部分去糖基化作为工具以比较糖蛋白的三级结构来评估分子相似性的方法。
背景技术
糖基化在蛋白质折叠、运输和稳定性以及细胞活动(如受体结合、细胞信号传导、免疫识别、炎症和致病)中起关键作用。真核生物来源的蛋白质通常因翻译后修饰而糖基化。具体的聚糖水平的变化通常用作多种疾病(包括糖尿病、癌症和传染病)的生物标志物。由于糖基化是复杂且异质的，因此绘制糖组可能是极具挑战性的任务，并且通常通过释放的聚糖的液相色谱LC绘谱来完成。在N-连接和O-连接两者中，通过用PNGaseF酶切将N-连接聚糖与糖蛋白分离。O-糖苷酶通常用于切割核心1型O-聚糖，但是需要用神经氨酸酶预处理以从O-聚糖中除去末端唾液酸。除非首先使蛋白质变性，否则蛋白质的二级和三级结构将阻止酶进入碳水化合物。已知的变性方案涉及使用洗涤剂或还原剂，并且在37℃下过夜孵育。
在大而复杂的单克隆抗体由于固有的异质性和由于聚糖引起的电离不足而受到损害的情况下，去糖基化的蛋白质可用于质量完整分析/质量降低分析。可以用荧光染料标记释放的聚糖的自由还原末端，以通过诸如高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)或质谱(MS)的方法进行N-聚糖绘谱。
PNGaseF对蛋白质的去糖基化取决于以下因素，例如：聚糖的表面可接近性和大体积且高度支化的聚糖的空间位阻。这些因素分别间接地依赖于蛋白质整体构象和聚糖位点占据。所有这些因素将决定蛋白质上特定位点的去糖基化速率，这可以利用去糖基化物质的分子量的差异通过CE-SDS(十二烷基硫酸钠毛细管电泳)来监测。因此，含有糖蛋白上不同位点的去糖基化速率信息的部分去糖基化图谱可以作为其三级/四级构象的指纹。
蛋白质去糖基化后释放的聚糖可用于质量控制，还常用于确定蛋白质是否具有所需的治疗功效或其他效果。对于色谱绘图方案，通常需要将蛋白质和肽完全去糖基化。去糖基化可以减少通过SDS-PAGE使蛋白质分离期间的拖尾效应，或者可以在质谱分析期间更容易地进行电离和光谱解译。当观察可能因翻译后修饰丰富导致的异质性而歪斜的蛋白质的完整分子量时，这可能特别有用。在治疗性抗体的情况下，通常需要去糖基化来表征修饰，例如C-末端赖氨酸的存在，或者监测标记的单克隆抗体或与药物偶联的单克隆抗体中与免疫球蛋白偶联的小分子的数量。
在生物制药行业，批准的标准包括质量、功效和安全性。因此，评估候选生物仿制物与创新产品的分子相似性是生物仿制物产品开发过程中的关键任务。为此目的，业界需要快速可靠的分析方法来确定监管机构所要求的分子相似性。
发明的目的
本发明的目的是利用部分去糖基化作为工具来比较糖蛋白的三级结构，并且提供较快且高效的糖蛋白完全去糖基化方法以用于分析聚糖。
发明内容
本发明的一个目的是提供部分去糖基化方法作为评估和比较具有多个聚糖位点的糖蛋白的三级/四级构象的快速工具。该方法包括在有限的时间段内向天然糖蛋白添加内切糖苷酶来部分切割N-连接聚糖，以获得部分去糖基化的蛋白质的亚群。使用毛细管电泳来分析所述部分去糖基化的糖蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种糖蛋白完全去糖基化的方法，其中糖蛋白与阴离子表面活性剂、还原剂和非离子表面活性剂结合，以获得稳定的变性糖蛋白。变性糖蛋白进一步与非离子表面活性剂结合以抵消阴离子表面活性剂的抑制作用。将内切糖苷酶添加到变性糖蛋白中来切割N-连接聚糖，以获得去糖基化的蛋白质。通过液相色谱法来分离释放的聚糖。
附图说明
图1是部分去糖基化的糖蛋白A的还原CE-SDS图谱。作为融合构建体的糖蛋白在37℃下通过10U的PNGaseF并且在300rpm下混合，从而去糖基化，并在多个时段抽出等分试样，从而通过还原E-SDS分析法来进一步分析。去糖基化的糖蛋白亚群标记为峰1、峰2、峰3和峰4。通过16小时的PNGaseF消化获得完全去糖基化的糖蛋白A.
图2是在天然条件下通过10U的PNGaseF于37℃部分去糖基化2小时的糖蛋白C的还原CE-SDS图谱。作为抗体的糖蛋白已经还原为轻链(LC)和重链(HC)。Ng-HC与部分PNGaseF消化后产生的非糖基化重链对应。在0.4％SDS、100mMβ-Me和0.75％Triton X-100存在的情况下，于37℃用10U的PNGaseF消化15分钟来获得完全去糖基化的糖蛋白。
图3是在混合或不混合的情况下，天然条件下于37℃通过10U的PNGaseF而部分去糖基化的糖蛋白A的还原CE-SDS图谱。A)在PNGaseF孵育期间以300rpm混合；B)在PNGaseF孵育期间不混合。于多个时段抽出等分试样，通过还原CE-SDS分析法来进一步分析。去糖基化的糖蛋白亚群标记为峰1、峰2、峰3和峰4。
图4是在天然条件下，于37℃在不同缓冲剂背景下通过10U的PNGaseF而部分去糖基化1小时的糖蛋白的还原CE-SDS图谱。缓冲剂1是组氨酸制剂，缓冲剂2是PBS海藻糖制剂，而缓冲剂3是PBS制剂(PBS：磷酸盐缓冲盐水)。
图5是在天然条件下，于37℃通过10U的PNGaseF部分去糖基化1小时的糖蛋白A的还原CE-SDS图谱，该还原CE-SDS图谱证明该方法的可重复性、日间变异性及分析者间变异性。
图6是部分变性后的部分去糖基化的糖蛋白A的还原CE-SDS图谱。通过图中提到的因素使样品部分变性。糖蛋白在37℃下通过10U的PNGaseF并在300rpm下混合45分钟来去糖基化。通过16小时的PNGaseF消化获得完全去糖基化的糖蛋白A.
图7是五批部分去糖基化的糖蛋白A的还原CE-SDS图谱。糖蛋白于37℃，通过10U的PNGaseF并在300rpm下混合45分钟来去糖基化。第1批、第2批和第3批由欧盟许可，第4批和第5批由美国许可。在下图中，亚群的分布％列成表格。
图8是作为变性条件下的抗体的糖蛋白的完全去糖基化的SDS优化浓度。为了确定SDS浓度，于37℃通过10U的PNGaseF、130mMβ-Me、1％Triton X-100进行2小时的初始去糖基化实验。
图9是使用本发明方法证明作为Fc糖基化抗体的糖蛋白E和F完全去糖基化的还原CE-SDS图谱。
图10是本发明的新方法与Roche去糖基化试剂盒的去糖基化时间进程的比较。使用的糖蛋白是在Fc区糖基化的抗体(糖蛋白B)。
图11是本发明方法和Roche去糖基化试剂盒之间的LC-聚糖图谱的比较。a)通过16小时Roche去糖基化方法和本发明方法用1U的PNGase F和1分钟孵育时间获得的抗体(糖蛋白B)的Fc聚糖图谱。b)来自糖蛋白C的另一种Fc-聚糖图谱与使用本发明方法在15分钟内使用单位递减(10个单位减少至0.66个单位)的PNGaseF去糖基化后获得的聚糖图谱的比较。将使用可商购的16小时Roche去糖基化方法的去糖基化作为对照。比较常规的16小时消化与本发明的方法，将从糖蛋白B和C释放的聚糖的相对丰度列表。峰以其洗脱顺序编号，其中同分异构物是棒状的。
图12是在Fc，Fab和融合部分糖基化的糖蛋白D的LC-聚糖图谱。比较使用本发明的方法和Roche去糖基化方法所获得的释放的聚糖。
图13是还原CE-SDS图谱，其证明与本发明的完全去糖基化相比，使用Waters'Rapigest(RG)洗涤剂(0.1％-0.6％)，糖蛋白A的去糖基化不完全。
图14是PNGaseF消化后通过唾液酸酶使糖蛋白A去唾液酸化的还原CE-SDS图谱。糖蛋白含有N-聚糖和O-聚糖。在唾液酸酶处理之前，通过PNGase F除去N-聚糖。本发明的方法用于去糖基化，并与单独使用的唾液酸酶进行比较。
具体实施方式
定义
术语“去糖基化”特别是指从糖蛋白去除糖实体(聚糖)的过程。
术语“部分去糖基化”特别是指有意的不完全去糖基化，从而产生糖基化、去糖基化的糖蛋白和中间产物的混合物。
术语“完全去糖基化”特别是指从糖蛋白完全去除聚糖，其中整个体积均为去糖基的糖蛋白。
术语“糖蛋白”是指具有多个聚糖位点的抗体、其片段或融合蛋白。
“可商购的试剂盒”是指SigmaP7367试剂盒、消化酵素GKE-5006试剂盒、Roche11365177001试剂盒、NEB PNGaseF试剂盒及Waters Rapigest试剂盒。
本发明描述了一种以快速工具来评估和比较具有多个聚糖位点的糖蛋白的三级/四级构象的方法。该方法利用聚糖位点暴露的差异，通过PNGaseF产生去糖基化的速率差异。在特定时间点对多个聚糖位点进行部分去糖基化后产生的物种亚群对于蛋白质是独特的，并且受诸如聚糖的表面可接近性，大体积和高度支化的聚糖的空间位阻的因素的指导。该指纹用于比较糖蛋白的整体构象。还原CE-SDS用于开发因部分去糖基化而产生的质量差异从而分离群体。
用于比较三级结构方法的糖蛋白的部分去糖基化方法包括以下步骤：
(a)提供糖蛋白；
(b)以每1mg糖蛋白1个单位至10个单位的量将糖蛋白与内切糖苷酶组合以部分切割N-连接聚糖；
(c)将步骤(b)的组分在约37℃的温度下孵育约45分钟至8小时，以提供部分去糖基化蛋白质。
本发明进一步描述了一种快速高效的蛋白质去糖基化方法，该方法使用洗涤剂和还原剂来释放复杂的聚糖结构，以进一步加工用于LC绘谱。该方法适用于大而复杂的糖蛋白，其中附着的寡糖通常被掩盖并且难以释放。本方法的新颖之处在于正确比例下的组分的独特组合，其使用最少量的酶并且在非常短的时间内促进酶的活性。
糖基化方法包括以下步骤：
(a)提供糖蛋白；
(b)将糖蛋白与阴离子表面活性剂和还原剂组合，其中还原剂的量足以使糖蛋白变性；
(c)将步骤(b)的组分在90℃至100℃的温度下孵育2分钟至5分钟，以提供变性的糖蛋白；
(d)使变性的糖蛋白冷却；
(e)将变性的糖蛋白与非离子表面活性剂以抵消阴离子表面活性剂的抑制作用的量组合使用
(f)以每1mg变性糖蛋白0.66个单位至10个单位的量引入内切糖苷酶来切割N-连接聚糖；
(g)将步骤(f)的组分在37℃孵育1至15分钟，以提供去糖基化的蛋白质；及
(h)将去糖基化蛋白质与释放的聚糖分离。
方法和材料
在CHO细胞中产生包括IgG1单克隆抗体(IgG1mAb)和融合蛋白的糖蛋白，并使用Biocon Ltd.的标准抗体纯化程序纯化该糖蛋白。
在一个实施例中，糖蛋白为单克隆抗体的生物仿制物和融合蛋白的生物仿制物。
在另一个实施例中，糖蛋白为单克隆抗体(mAbs)，例如伊曲珠单抗(Itolizumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、阿达木单抗(adalimumab)等。
在另一个实施方案中，糖蛋白是融合蛋白，例如依那西普(Etanercept)等。
糖蛋白的细节如下所述。
糖蛋白A：依那西普
糖蛋白B：伊曲珠单抗
糖蛋白C：曲妥珠单抗
糖蛋白D：融合mAb(西妥昔单抗(Cetuximab)+TGFRBII)
糖蛋白E：贝伐单抗
糖蛋白F：阿达木单抗
本发明的一部分是提供部分去糖基化方法以作为评估和比较具有多个聚糖位点的糖蛋白的三级/四级构象的快速工具。该方法包括以每1mg糖蛋白1个单位至10个单位将内切糖苷酶添加至天然糖蛋白中，持续有限时间，例如45分钟至8小时，以部分切割N-连接聚糖，从而获得部分去糖基化蛋白质的亚群。采用毛细管电泳来分析部分去糖基化的糖蛋白。
本发明的第二部分是提供一种糖蛋白完全去糖基化的方法，其中糖蛋白与阴离子表面活性剂和还原剂组合，并在90-100℃孵育2分钟至5分钟。加入另外的非离子表面活性剂以获得稳定的变性糖蛋白。变性糖蛋白进一步与非离子表面活性剂组合以抵消阴离子表面活性剂的抑制作用。每1mg变性糖蛋白加入1-10个单位的内切糖苷酶，并于37℃下孵育1-15分钟以切割N-连接聚糖，从而获得去糖基化的蛋白质。在加入非离子表面活性剂之后，每1mg变性蛋白质中加入0.1个单位的外切糖苷酶，或者在加入内切糖苷酶之后，每1mg去糖基化蛋白质中加入0.1个单位的外切糖苷酶，并于37℃下孵育30分钟，以切割N-聚糖和O-聚糖的末端唾液酸，从而得到变性糖蛋白的去唾液酸化的蛋白质。释放的聚糖通过液相色谱分离。
在加入非离子表面活性剂之后可选地向变性糖蛋白中加入外切糖苷酶，或者在加入内切糖苷酶之后可选地向去糖基化蛋白质中加入外切糖苷酶，以切割N-聚糖和O-聚糖的末端唾液酸，从而获得变性糖蛋白的去唾液酸化蛋白质。
在一个实施例中，阴离子表面活性剂为选自SDS(十二烷基硫酸钠)、羧酸盐、磺酸盐、石油磺酸盐、烷基苯磺酸盐、萘磺酸盐、烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐、硫酸盐、硫化的天然油脂、硫化酯、硫化酰胺和烷基酚。
在优选实施例中，用于糖蛋白变性的阴离子表面活性剂为SDS。
还原剂的量能打破二硫键，而且还原剂选自β-巯基乙醇、二硫苏糖醇或者三(2-羧乙基)膦。
在优选实施例中，还原剂为β-巯基乙醇，其剂量为100mM至150mM。
非离子表面活性剂为选自Triton-X、乙氧基化脂肪醇、聚氧乙烯表面活性剂、羧酸酯、聚乙二醇酯、脱水山梨醇酯及其乙氧基化衍生物、脂肪酸的二醇酯、羧酰胺、单链烷醇胺缩合物和聚氧乙烯脂肪酸酰胺。
在一个实施例中，加入诸如Triton-X 100的非离子表面活性剂以抵消SDS的抑制作用。
在优选实施例中，Triton-X以0.60％至1.2％的浓度加入。
在另一个实施例中，可商购的SF表面活性剂如Waters Rapigest试剂盒用于蛋白质的变性，然后使用RochePNGase F去糖基化，这也用于比较本发明的性能。
在一部分中，将内切糖苷酶如PNGaseF加入到变性糖蛋白中以从糖蛋白切割N-连接聚糖，其中最内部的GlcNAc残基可以与或不与α1-6岩藻糖残基连接以获得完全去糖基化的糖蛋白。所需时间为1至15分钟。
在另一部分中，内切糖苷酶是PNGaseF，其被添加到天然糖蛋白中达45分钟至8小时以从其中最内侧的聚糖残基是GlcNAc的糖蛋白中部分切割N-连接聚糖，从而获得部分去糖基化的糖蛋白。
将外切糖苷酶如唾液酸酶加入到变性和N-聚糖去糖基化的糖蛋白中，以从糖蛋白的O-连接聚糖中切割末端唾液酸。
在优选实施例中，唾液酸酶酶促反应于37℃下进行30分钟，以获得去唾液酸化的蛋白质。
天然条件下的去糖基化按如下进行。
使用PNGaseF(Roche，目录号11365193001)，通过将1mg每种糖蛋白的50mM TrisCl(pH8.0)、1mM CaCl 2溶液的与10个单位的PNGaseF在37℃下孵育16小时来除去N-聚糖，从而完全去糖基化。对于部分去糖基化，孵育时间较短，如各图所示。
对于唾液酸酶消化(QABio，E-S001)，将0.1个单位的唾液酸酶加入到1mg每种糖蛋白的50mM乙酸钠溶液(pH4.5)中，并于37℃下孵育30分钟。将样品冷冻于-20℃直至进行分析。
变性条件下的去糖基化按如下进行。
将1mg每种糖蛋白的50mM Tris Cl(pH 8.0)、1mM CaCl2溶液与100-130mM的β-巯基乙醇和来自10％储备溶液的0.1％-0.8％的SDS混合。将混合物于95℃下孵育2分钟并冷却至室温(2分钟)。加入0.75-1％的TritonX-100并涡旋，然后加入1-10个单位的PNGaseF酶(Roche，目录号11365193001)并于37℃下孵育1-15分钟。
对于唾液酸酶消化，将0.1个单位的唾液酸酶加入1mg每种糖蛋白的50mM乙酸钠(pH4.5)溶液中，并在37℃下孵育30分钟。如上所述，在0.4％的SDS、100mM的β-巯基乙醇和0.75％的Triton X-100的存在下，用10个单位的PNGase F对唾液酸酶消化的糖蛋白进行预处理。将样品冷冻于-20℃直到进行分析。
用于进行聚糖NP HPLC-FLD的样品按如下进行制备。
通过加入冷冻乙醇，然后以8000rpm离心15分钟，从而将释放的聚糖与蛋白质分离。收集含有聚糖的上清液并真空干燥。通过将5mg的邻氨基苯甲酸(Anthranillic acid)和6mg的氰基硼氢化钠溶解在100μL的70:30的DMSO：冰醋酸混合物中来制备标记试剂。将5μL的该试剂加入到干燥的聚糖样品中并在80℃下孵育45分钟。然后使标记的聚糖在水中重构并用乙酸乙酯洗涤5次。每次使用有机层和水层的相分离除去过量的乙酸乙酯，并样品再次真空干燥。将干燥的样品在100μl的50％乙腈和50％水(v/v)中重构并充分混合。除去上清液并转移至最大的回收瓶中，注入到带有荧光检测器的HPLC系统中。在LudgerSep N2酰胺柱上分离聚糖，流动相A为100％乙腈，且流动相B为50mM的甲酸铵(pH4.4)。荧光检测器设定为在352nm下激发且在435nm下发射。聚糖样品可以储存于2-8℃直至分析。
CE-SDS样品制备和仪器操作步骤如下。
在带有32karat V 9.1软件的PA 800Plus药物分析系统(Beckman Coulter)上进行CE-SDS分析。使用30cm长、ID为50μ、且孔径为200μ的毛细管。在10kDa的MWCO NanoSep中通过用SDS缓冲剂(pH 9.5)使125μg糖蛋白脱盐来制备样品。将76μl的SDS缓冲剂(pH9.5)与19μl的脱盐样品以及0.5μl的内标(10kDa分子量标记，SDSMW分析试剂盒)和5μl的β-巯基乙醇混合。将混合物涡旋并短暂离心。将内容物于80℃下孵育2分钟并将溶液冷却至室温。将内容物转移到置于通用小瓶的PCR管中。
根据本发明的方法实施去糖基化方法(图1-9)，然后与预先存在的可商购的Roche和Waters Rapigest的去糖基化方法进行比较(图10-13)。方法的使用也扩展到具有O-连接聚糖的糖蛋白的唾液酸酶酶促消化(图14)。
实施例1：
图1是作为抗体的融合构建体的、部分去糖基化的糖蛋白A的还原CE-SDS图谱，该图示出了在天然条件下通过PNGaseF对多个聚糖位点糖蛋白A进行去糖基化的时间进程。还原CE-SDS图谱显示在不同的时间间隔获得不同的糖蛋白亚群，其中每个连续的峰与蛋白质中不同聚糖位点的去糖基化直接相关。
在图1中，糖蛋白A显示3个不同的聚糖位点(6个二聚体形式)，其部分去糖基化形成4个不同的峰。峰1完全糖基化，接着是峰2和3，其分别有一个和两个位点去糖基化。进一步的峰4中所有三个聚糖位点去糖基化并且是完全去糖基化的糖蛋白A。随着去糖基化的孵育时间的推移，聚糖位点亚群转向完全去糖基化(左侧)。每个时段的每个亚群的强度反映了可被蛋白质局部构象和通过大体积而高度支化的聚糖(位点占据)的空间位阻所掩盖的聚糖位点的可接近性。因此，该图谱是糖基化的蛋白质三级结构的指纹，并且可以用作评估更高级结构的质量的工具。如图2所示，单个聚糖位点糖蛋白(2个二聚体形式)的图谱简单得多，图2是由天然条件下于37℃通过10U的PNGase F而部分去糖基化的糖蛋白C的还原CE-SDS图谱。作为抗体的糖蛋白C已经还原为轻链(LC)和重链(HC)。Ng-HC与PNGaseF部分消化后产生的非糖基化重链对应。由于聚糖结构在特定位点的异质性导致的尺寸变异被假定为覆盖每个亚群的峰宽(因为低分子量的差异)。特定时间点的亚群对多种因素例如，温度、孵育时间、酶单位和孵育时的混合敏感。温度的降低和酶单位的降低都会降低酶促反应速率，导致较少的去糖基化亚群。图1和图3分别示出了孵育时长和混合的影响。
还评估了缓冲剂基质对PNGase F消化的干扰，并且该测定对蛋白质缓冲剂不敏感(图4)。因此，应优化参数以获得包含良好分辨的糖蛋白聚糖亚群的最佳图谱。对于我们的实验，我们选择在37℃下孵育时间为45分钟、且在300rpm下混合、10U的PNGaseF酶的糖蛋白图谱。
在天然条件下使糖蛋白A去糖基化45分钟来确定分析方法的可变性，且基于日内重现性/重复性、日间和分析间运行来评估分析方法的可变性。在表1中，将图1中所示的每个亚群的相对丰度列表并计算RSD％。观察到物种丰度较低且不好分辨的亚群的最大可变性。图5中糖蛋白A的还原CE-SDS图谱是重合的，证明了方法的可变性。
表1针对日内，日间和分析间评估的分析方法可变性。按照峰1、2、3和4的相对面积百分比来估算每个亚群。
我们估算了多种因素对部分去糖基化抗体亚群的抗体部分变性/解折叠的影响，以评估该方法的稳健性。在PNGaseF消化之前，通过暴露于热、洗涤剂和还原剂获得变性样品。热和洗涤剂都影响氢键和疏水相互作用。还原剂靶向蛋白质中的二硫键。部分变性后，通过10U的PNGase F于37℃下，300rpm下混合45分钟的部分去糖基化的糖蛋白A的还原CE-SDS图谱。通过16小时的PNGase F消化，获得完全去糖基化的糖蛋白A。如图6所示，上述各因素在不同程度上影响去糖基化构象异构体的亚群。例如，在用0.01％SDS或2-巯基丙醇处理的蛋白质中观察到最大转变为峰3和4(向完全去糖基化转变)。与用作对照的常规的45分钟部分去糖基化的糖蛋白相比，在37℃下过夜孵育抗体和在95℃孵育2分钟导致亚群的显著转变。在37℃过夜孵育后获得的结果影响去糖基化的糖蛋白与糖基化抗体的稳定性比较。在大部分情况下，观察到的差异可能是因延长孵育的酶处理导致的温和蛋白质变性和聚糖去除后的结构扭曲的组合效应，而不是后者单独的作用。蛋白质聚糖亚群的转变表明，部分变性所赋予的蛋白质三级结构的变化直接影响糖蛋白在相关位点去糖基化的量，因此亚群的水平可用于比较蛋白质四级/三级结构。
为了使用该方法比较高级结构，在欧盟和美国监管机构批准的多批糖蛋白A上进行了测试。在图7中，获得了五批部分去糖基化的糖蛋白A的还原CE-SDS图谱。糖蛋白于37℃下通过10U的PNGaseF并在300rpm下混合45分钟以去糖基化。第1批、第2批和第3批由欧盟许可，第4批和第5批由美国许可。图7显示了3个EU批次和2个US批次的糖蛋白A的还原CE-SDS痕迹。显而易见，在所分析的批次之间观察到比方法的可变性更大的显著变化。糖蛋白A在Fc和融合结构域处均进行了复杂的糖基化，如果批次中的聚糖位点占有率不相似，则能观察到差异。多批糖蛋白A中大体积和支链聚糖的差异分布将导致PNGaseF消化的不同水平的空间位阻，从而导致CE-SDS图谱的改变。然而，欧盟和美国批次的N-聚糖图谱相似。在表2中，比较了一个代表性的欧盟和美国批次的LC聚糖图谱，并且发现它们是相似的。这些批次显示出非常不同的部分去糖基化的还原CE图谱(图7)。这表明观察到的抗体A的批次间的变异性来自聚糖附着位点处的蛋白质构象。然而，聚糖附着位点的位点占有率和蛋白质构象均可影响部分去糖基化样品中的亚群。由于已知聚糖影响单克隆抗体的生物活性，因此在抗体生产中，为了保持产品的功效，要使不同批次的聚糖图谱的可变性最小化，因此上面观察到的批次差异是真实的。因此，该方法是灵敏的，且适用于绘制创新产品三级结构中的批次间可变性，并与生物仿制物进行比较。
| 糖蛋白A | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 |
| 批次#4 | 0.2 | 0.3 | 0.9 | 16.1 | 3.4 | 1.1 | 13.1 | 1.5 | 5 | 5 | 14 | 24.7 | 10.7 | 1.3 | 0.4 | 2.4 |
| 批次#1 | 0.2 | 0.4 | 0.9 | 16.3 | 2.7 | 1.4 | 13.2 | 1.4 | 5.6 | 6.5 | 14 | 24.4 | 9.6 | 0.9 | 0.3 | 2.2 |
表2、糖蛋白A批次的LC聚糖图谱比较显示还原CE-SDS图谱的最大差异。数字与批次中聚糖种类的相对丰度对应。
蛋白质去糖基化后释放的聚糖可用于质量控制和确定蛋白质是否具有所需的治疗功效或其他效果。对于色谱绘图方案和其他分析情况，通常需要将蛋白质和肽完全去糖基化。例如，去糖基化可以减少通过SDS-PAGE使蛋白质分离期间的拖尾效应，或者可以在质谱分析期间更容易进行电离和光谱解译。当观察可能因PTM丰富导致的异质性而歪斜的蛋白质的完整分子量时，这可能非常有用。在治疗性抗体的情况下，通常需要去糖基化来表征修饰，例如C-末端赖氨酸的存在，或者监测于标记的单克隆抗体种或与药物偶联的单克隆抗体种中与免疫球蛋白偶联的小分子的数量。由于这个原因，糖蛋白去糖基化通常是有利的。
在本发明中，我们显示了使用洗涤剂和还原剂的快速且高效的蛋白质去糖基化方法。以下流程图中描述了蛋白质去糖基化所遵循的步骤的流程图。表3详细说明了每个步骤。
表3：方法的描述。步骤编号与流程图对应。
实施例2
简而言之，阴离子洗涤剂SDS(0.4％)和还原剂β-巯基乙醇(100mM)用于在95℃下展开蛋白质。在用PNGaseF去糖基化之前，用非离子洗涤剂Triton X-100(0.75％)处理蛋白质以抵消SDS的抑制作用。在反应缓冲剂(10mM的Tris-Cl，pH 8.0)中使用1mM氯化钙以稳定和促进PNGaseF活性。图8中详述了反应优化条件，其中示出了在变性条件下抗体C完全去糖基化的SDS优化浓度。为了确定SDS的浓度，最初的去糖基化实验在10U的PNGaseF、130m的Mβ-Me、1％Triton X-100，37℃下进行。使用本发明方法还观察到其他Fc糖基化抗体(糖蛋白E和F)在15分钟内用10U的酶完全去糖基化(图9)。
本发明方法的新颖之处在于正确比例下的组分的独特组合，其以最少量的酶促进酶促活动以在1至15分钟的非常短的时间内完成该过程。如表4中所示，在可商购的试剂盒中，10-25个单位的酶已显示从1mg的变性蛋白质中释放N-聚糖(参见比活度)。在本方法中，根据表3，使用内部开发的方案，1个单位的酶(测试Roche酶)能够在1分钟内消化～95％的1mg变性蛋白质，酶活性几乎增加10倍，且与可商购的试剂盒的1小时至过夜的孵育相比，时间显著地缩短(表4)。
表4：市场上可获得的去糖基化试剂盒。去糖基化混合物中使用的所有成分都很容易获得并且通常用于蛋白质变性。
实施例3
图10比较了使用Roche试剂盒(10U的Roche酶-无变性剂)和使用Biocon方法(1U的Roche酶与变性剂)的Fc糖基化抗体糖蛋白B的去糖基化百分比的时间进程。如所观察到的，在未变性的情况下，使用10U的Roche酶，在16小时观察到几乎完全的去糖基化(～99％)，而在本发明的方法中使用1U的Roche酶1分钟实现了相似的聚糖产率(～94％)。
实施例4
图11给出了使用本发明方法和Roche试剂盒以较少的酶单位和减少的孵育时间获得的两种Fc糖基化单克隆抗体(糖蛋白B和C)的聚糖种类的LC图谱的比较。用10U的酶消化糖蛋白B 16小时和用1单位的酶消化糖蛋白B 1分钟获得相同的图谱。糖蛋白C用0.66U酶消化15分钟获得的聚糖产率与糖蛋白C用10U的酶消化16小时获得的聚糖产率相当。单独用10U的Roche酶消化16小时，观察到少量的聚糖种类(<0.5％)。在1单位的酶孵育1分钟后，在本发明方法中观察到类似的聚糖种类(图11)。
在本发明中测试的糖蛋白是在Fc，Fab和融合部分结构复杂且高度糖基化的单克隆抗体/融合抗体(>100kDa)。图12的图片显示了高度糖基化的融合糖蛋白D的LC-聚糖图谱，该融合糖蛋白D在6个不同位点(二聚体中12个)具有糖基化的Fc、Fab和融合部分。通过本方法释放额外的聚糖种类，否则PNGaseF无法进入从而进行消化。这些聚糖种类与蛋白质的Fab以及融合部分中存在的高度支化和大体积的半乳糖基化和唾液酸化种类对应。在图片b中描绘了去糖基化融合蛋白(糖蛋白D)的CE图谱，其中使用1个单位的酶通过本发明方法孵育1分钟观察到87％的去糖基化，并且在1分钟内用10个单位的酶完成消化。图12的图片b中提及了去糖基化的相对百分比。
此外，如图13所示，本发明方法在相似的时间和酶量下使多个聚糖位点融合蛋白(糖蛋白A)完全去糖基化也是高效的
实施例5
我们扩展了类似的洗涤剂和还原剂的配方，以通过除PNGaseF之外的酶来去糖基化。在图14中，显示了使用和不使用洗涤剂的唾液酸酶消化的比较。我们的配方中的唾液酸酶能够使O-聚糖去唾液酸化(去除末端唾液酸)与单独使用唾液酸酶(即30分钟)相似。在唾液酸酶处理之前，使用PNGase F使所用蛋白质进行N-聚糖去糖基化。可以进一步优化该方法以减少孵育时间以及酶单位。
可以通过添加其他内切糖苷酶如β-半乳糖苷酶，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，内切-H，内切-F2，内切-S，甘露糖苷酶和岩藻糖苷酶来除去各自的末端糖残基，以进一步分析该方法。
实施例6
我们还比较了可商购的用于变性的Waters Rapigest试剂盒的性能，然后通过Roche PNGase F进行后续去糖基化。图13示出了使用本发明方法和可商购的WatersRapigest(RG)试剂盒证明糖蛋白A去糖基化的还原CE-SDS图谱。结果表明，本发明的去糖基化方法优于可商购的/传统的方法，因为它具有缩短时间、降低成本和减少酶单位的优点。本发明不仅允许糖蛋白更快地去糖基化，而且还提高了释放的聚糖种类的产率和数量。
快速去糖基化方法具有以下优点和应用。
1)结构复杂且高度糖基化的糖蛋白的去糖基化。
2)完整的N-聚糖LC-MS绘谱，包括含有N-聚糖和O-聚糖的完整糖蛋白的外切糖苷酶阵列。
3)因固有的不异质性和暴露的聚糖的低电离而受到损害的糖蛋白的质量完整分析和质量减少分析。在MS分析之前，可以使用脱盐旋转柱除去洗涤剂。也可在文献中获得从反应混合物中除去洗涤剂的多种消化后清除方案。
4)使用MS鉴定糖基化位点和位点占有率，否则该糖基化位点和位点占有率会因附着位点处的聚糖异质性而难以鉴定。
Claims (10)
1.一种通过糖蛋白去糖基化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（a）提供糖蛋白；
（b）将糖蛋白与终浓度为0.4％至0.8％的十二烷基硫酸钠及还原剂组合，其中还原剂的量足以使所述糖蛋白变性；
（c）将步骤（b）中的组分在90℃至100℃的温度下孵育2分钟至5分钟，以提供变性的糖蛋白；
（d）使变性的糖蛋白冷却；
（e）将变性的糖蛋白与终浓度为0.6%至0.75％的Triton-X组合；
（f）以每1mg变性的糖蛋白1个单位至10个单位的量引入PNGaseF以切割N-连接聚糖；
（g）将步骤（f）中的组分于37℃下孵育1分钟，以提供去糖基化的蛋白质；及
（h）分离去糖基化的蛋白质与释放的聚糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（e）之后或在步骤（g）之后以每1mg变性的糖蛋白0.1个单位的量可选地加入外切糖苷酶，并于37℃下孵育组分30分钟以提供去唾液酸化的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原剂的量能破坏二硫键并且选自β-巯基乙醇、二硫苏糖醇或三（2-羧乙基）膦。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述还原剂为β-巯基乙醇。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，β-巯基乙醇的量为100mM至130mM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（a）中，将糖蛋白稀释于pH8的Tris缓冲剂中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述Tris缓冲剂包含10mM的Tris-Cl和1mM氯化钙。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述外切糖苷酶是唾液酸酶，所述唾液酸酶具有从糖蛋白的N-连接和O-连接聚糖切割末端唾液酸的能力。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过液相色谱分离所释放的聚糖。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖蛋白是具有多个聚糖位点的抗体、抗体片段或融合蛋白。
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