JP2024046759A - 迅速で効率的な糖タンパク質の脱グリコシル化 - Google Patents
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Abstract
【課題】糖タンパク質の脱グリコシル化の迅速で費用効率性が高い方法を提供する。【解決手段】糖タンパク質の完全な脱グリコシル化のための方法であって、安定な変性糖タンパク質を得るために、糖タンパク質をアニオン性表面活性剤、還元剤および非イオン性表面活性剤と合わせる、該方法を提供する。さらに変性糖タンパク質は非イオン性表面活性剤と合わせてアニオン性表面活性剤の阻害効果を無効にする。脱グリコシル化タンパク質を得るために、エンドグリコシダーゼを変性糖タンパク質に添加してＮ－結合型グリカンを開裂する。遊離したグリカンを液体クロマトグラフィーにより分離する。【選択図】なし
Description
発明の分野
本発明は、分子の類似性を確立するために産業に必要とされる、迅速で確実な分析方法に関する。それは糖タンパク質の迅速で効率的な脱グリコシル化のための方法を示す。それはまた手段として部分的な脱グリコシル化を利用して糖タンパク質の三次構造を比較することにより分子の類似性を評価する方法に関する。
本発明は、分子の類似性を確立するために産業に必要とされる、迅速で確実な分析方法に関する。それは糖タンパク質の迅速で効率的な脱グリコシル化のための方法を示す。それはまた手段として部分的な脱グリコシル化を利用して糖タンパク質の三次構造を比較することにより分子の類似性を評価する方法に関する。
発明の背景
グリコシル化はタンパク質のフォールディング、輸送、および安定性ならびに受容体結合、細胞シグナリング、免疫認識、炎症および病原性などの細胞的事象における重要な役割を果たす。真核生物起源のタンパク質は翻訳後修飾の結果として度々グリコシル化される。特定のグリカンレベルにおける変化は、糖尿病、癌、および伝染病を含む複数の疾患におけるバイオマーカーとして度々使用される。グリコシル化は複雑で不均質なので、グライコムをマッピングすることは極めて困難な課題であり、遊離したグリカンをプロファイルする液体クロマトグラフィーＬＣにより一般になされる。２つ、つまりＮ－結合型およびＯ－結合型の中で；Ｎ－結合型グリカンはＰＮＧａｓｅＦを用いた酵素的開裂により糖タンパク質から分離される。酵素Ｏ－グリコシダーゼはコア１のＯ－グリカンを開裂するために共通して使用され、しかしながらノイラミニダーゼ酵素との前処理がＯ－グリカンから末端シアル酸を除去するために必要である。タンパク質が最初に変性しない限り、タンパク質の二次および三次構造は酵素の炭水化物への接近を阻害する。変性のための公知のプロトコールは、３７℃で一晩のインキュベーションを伴う、界面活性剤または還元剤の使用を含む。
グリコシル化はタンパク質のフォールディング、輸送、および安定性ならびに受容体結合、細胞シグナリング、免疫認識、炎症および病原性などの細胞的事象における重要な役割を果たす。真核生物起源のタンパク質は翻訳後修飾の結果として度々グリコシル化される。特定のグリカンレベルにおける変化は、糖尿病、癌、および伝染病を含む複数の疾患におけるバイオマーカーとして度々使用される。グリコシル化は複雑で不均質なので、グライコムをマッピングすることは極めて困難な課題であり、遊離したグリカンをプロファイルする液体クロマトグラフィーＬＣにより一般になされる。２つ、つまりＮ－結合型およびＯ－結合型の中で；Ｎ－結合型グリカンはＰＮＧａｓｅＦを用いた酵素的開裂により糖タンパク質から分離される。酵素Ｏ－グリコシダーゼはコア１のＯ－グリカンを開裂するために共通して使用され、しかしながらノイラミニダーゼ酵素との前処理がＯ－グリカンから末端シアル酸を除去するために必要である。タンパク質が最初に変性しない限り、タンパク質の二次および三次構造は酵素の炭水化物への接近を阻害する。変性のための公知のプロトコールは、３７℃で一晩のインキュベーションを伴う、界面活性剤または還元剤の使用を含む。
脱グリコシル化タンパク質は、グリカンによる内在する不均質性および不十分なイオン化により苦労する、大きく複雑なモノクローナル抗体の場合における完全な／還元した（reduced）質量分析のために有用になり得る。遊離したグリカンを高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、または質量分析（ＭＳ）などの方法によりＮ－グリカンプロファイリングのための蛍光染料を有する、それらのフリー還元末端（free-reducing terminus）でラベル化され得る。
ＰＮＧａｓｅＦによるタンパク質の脱グリコシル化は、グリカンの表面接近可能性および嵩高く高度に分岐したグリカンによる立体障害などの要因に依存する。これらの要因は各々間接的にタンパク質のグローバルな構造およびグリカン部位占有率に依存する。全てのこれらの要因は脱グリコシル化された種の分子量の違いを利用してＣＥ－ＳＤＳ（キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム）により観察され得る、タンパク質上の特定の部位の脱グリコシル化の割合を決定するだろう。このように、糖タンパク質上の異なる部位の脱グリコシル化の割合の情報を含む部分的な脱グリコシル化プロファイルはその三次／四次構造の指紋（fingerprint）としての役割を果たし得る。
タンパク質の脱グリコシル化後に遊離するグリカンは品質制御のため、および度々、タンパク質が所望の治療効果または他の効果を有するかどうか決定するための両方に有用である。クロマトグラフィーマッピングプロトコールに対して、タンパク質およびペプチドの両方の完全な脱グリコシル化が度々望まれている。脱グリコシル化はＳＤＳ－ＰＡＧＥによるタンパク質分離中の汚染を減らすことができるか、または質量分光分析中のより簡単なイオン化およびスペクトル解釈を許容し得る。これは特に、多数の翻訳後修飾からの不均質のためにひずみ得るタンパク質の完全な分子量を見るとき、特に有用であり得る。治療抗体の場合において、脱グリコシル化は度々、Ｃ末端リジンの存在などの修飾を特徴づけるか、またはラベル化もしくは薬物コンジュゲート化したモノクローナル抗体が免疫グロビンと結合させる低分子の数を観察するために必要である。
生物医薬産業において、承認の基準は品質、有効性および安全性を含む。したがって、候補のバイオシミラーの分子類似性を評価して革新者製品とすることは、バイオシミラー製品開発中の重要な課題である。この目的のために、迅速で確実な分析方法が、規制機関により必要とされる分子類似性を確立するために産業で必要とされる。
発明の目的：
本発明の目的は、手段として部分的な脱グリコシル化を利用する糖タンパク質の三次構造を比較することおよびグリカンの分析のためのより早く、効率的な糖タンパク質の完全な脱グリコシル化のための方法を有することである。
本発明の目的は、手段として部分的な脱グリコシル化を利用する糖タンパク質の三次構造を比較することおよびグリカンの分析のためのより早く、効率的な糖タンパク質の完全な脱グリコシル化のための方法を有することである。
発明の概要
本発明の１つの目的は、迅速な手段として部分的な脱グリコシル化方法を提供してマルチプルグリカン部位（multiple glycan site）を有する糖タンパク質の三次／四次構造を評価し比較することである。本方法は、部分的に脱グリコシル化されたタンパク質の亜母集団を得るために、限定された期間に天然の糖タンパク質にエンドグリコシダーゼを添加してＮ－結合型グリカンを部分的に開裂させることを含む。部分的に脱グリコシル化した糖タンパク質はキャピラリー電気泳動を使用して分析される。
本発明の１つの目的は、迅速な手段として部分的な脱グリコシル化方法を提供してマルチプルグリカン部位（multiple glycan site）を有する糖タンパク質の三次／四次構造を評価し比較することである。本方法は、部分的に脱グリコシル化されたタンパク質の亜母集団を得るために、限定された期間に天然の糖タンパク質にエンドグリコシダーゼを添加してＮ－結合型グリカンを部分的に開裂させることを含む。部分的に脱グリコシル化した糖タンパク質はキャピラリー電気泳動を使用して分析される。
本発明のもう１つの目的は、糖タンパク質の完全な脱グリコシル化のための方法であって、安定な変性糖タンパク質を得るために、糖タンパク質をアニオン性表面活性剤、還元剤および非イオン性表面活性剤と合わせる、該方法を提供することである。さらに変性糖タンパク質は非イオン性表面活性剤と合わせてアニオン性表面活性剤の阻害効果を無効にする。脱グリコシル化タンパク質を得るために、エンドグリコシダーゼを変性糖タンパク質に添加してＮ－結合型グリカンを開裂する。遊離したグリカンを液体クロマトグラフィーにより分離する。
図面の簡単な説明：
図面の簡単な説明：
詳細な説明
定義
用語「脱グリコシル化」は特に糖タンパク質からの糖の存在（グリカン）の除去のプロセスをいう。
用語「部分的な脱グリコシル化」は特にグリコシル化、脱グリコシル化した糖タンパク質および中間体の混合物をもたらす計画的な不完全な脱グリコシル化をいう。
定義
用語「脱グリコシル化」は特に糖タンパク質からの糖の存在（グリカン）の除去のプロセスをいう。
用語「部分的な脱グリコシル化」は特にグリコシル化、脱グリコシル化した糖タンパク質および中間体の混合物をもたらす計画的な不完全な脱グリコシル化をいう。
用語「完全な脱グリコシル化」は特に全体積が脱グリコシル化した糖タンパク質である、糖タンパク質からのグリカンの完全な除去をいう。
用語「糖タンパク質」は、マルチプルグリカン部位を有する抗体、そのフラグメントまたは融合タンパク質をいう。
「商業的に入手可能なキット」は、ＳｉｇｍａＰ７３６７キット、Ｐｒｏｚｙｍｅ ＧＫＥ－５００６キット、Ｒｏｃｈｅ １１３６５１７７００１キット、ＮＥＢ ＰＮＧａｓｅＦキットおよびＷａｔｅｒｓ Ｒａｐｉｇｅｓｔキットをいう。
用語「糖タンパク質」は、マルチプルグリカン部位を有する抗体、そのフラグメントまたは融合タンパク質をいう。
「商業的に入手可能なキット」は、ＳｉｇｍａＰ７３６７キット、Ｐｒｏｚｙｍｅ ＧＫＥ－５００６キット、Ｒｏｃｈｅ １１３６５１７７００１キット、ＮＥＢ ＰＮＧａｓｅＦキットおよびＷａｔｅｒｓ Ｒａｐｉｇｅｓｔキットをいう。
本発明は、マルチプルグリカン部位を有する糖タンパク質の三次／四次構造を評価しおよび比較する迅速な手段を有する方法を記載する。この方法は、ＰＮＧａｓｅＦによる脱グリコシル化の微分率をもたらすグリカン部位の暴露における違いを利用する。特定の時点でのマルチプルグリカン部位の部分的な脱グリコシル化後に作られる種の亜母集団はタンパク質に特有であり、ならびにグリカンの表面接近可能性および嵩高く高度に分岐したグリカンによる立体障害などの要因に導かれる。この指紋は、糖タンパク質の全構造と比較するために用いられる。母集団を分離する部分的な脱グリコシル化のために、還元したＣＥ－ＳＤＳを作られる質量の違いを利用するために使用した。
三次構造の方法を比較するための糖タンパク質の部分的な脱グリコシル化の方法は、
（ａ）糖タンパク質を提供すること；
（ｂ）糖タンパク質を、エンドグリコシダーゼと糖タンパク質１ｍｇあたり１ユニット～１０ユニットの量で合わせて、Ｎ－結合型グリカンを部分的に開裂すること；
（ｃ）約３７℃からの温度で約４５分～８時間、ステップ（ｂ）の構成成分をインキュベートして、部分的に脱グリコシル化されたタンパク質を提供すること、
のステップを含む。
（ａ）糖タンパク質を提供すること；
（ｂ）糖タンパク質を、エンドグリコシダーゼと糖タンパク質１ｍｇあたり１ユニット～１０ユニットの量で合わせて、Ｎ－結合型グリカンを部分的に開裂すること；
（ｃ）約３７℃からの温度で約４５分～８時間、ステップ（ｂ）の構成成分をインキュベートして、部分的に脱グリコシル化されたタンパク質を提供すること、
のステップを含む。
さらに本発明は、ＬＣプロファイリングのためにさらに処理されるべき、複雑なグリカン構造の遊離のために洗剤および還元剤を使用する迅速で効率的なタンパク質の脱グリコシル化方法を記載する。本方法は大きく且つ複雑な糖タンパク質に適用され、ここで付着したオリゴ糖は度々埋められおよび遊離しにくい。本方法の新規性は、使用される酵素の最少量でおよび非常に短い時間で酵素活性を促進する比例関係における構成成分の特有の組み合わせにある。
糖タンパク質の脱グリコシル化の方法は、
（ａ）糖タンパク質を提供すること;
（ｂ）糖タンパク質を、アニオン性表面活性剤および還元剤と合わせること、ここで還元剤は、糖タンパク質を変性させるのに十分な量である；
（ｃ）９０℃～１００℃の温度で２分～５分間、ステップ（ｂ）の構成成分をインキュベートして、変性した糖タンパク質を提供すること；
（ｄ）変性した糖タンパク質を冷却すること；
（ｅ）変性した糖タンパク質を非イオン性表面活性剤とアニオン表面活性剤の阻害効果を無効にする量において合わせること
（ｆ）エンドグリコシダーゼを変性した糖タンパク質１ｍｇあたり０．６６ユニット～１０ユニットの量で導入して、Ｎ－結合型グリカンを開裂すること；
（ｇ）３７℃で１～１５分間ステップ（ｆ）の構成成分をインキュベートして脱グリコシル化タンパク質を提供すること；および
（ｈ）脱グリコシル化タンパク質を遊離したグリカンから分離すること：
のステップを含む。
（ａ）糖タンパク質を提供すること;
（ｂ）糖タンパク質を、アニオン性表面活性剤および還元剤と合わせること、ここで還元剤は、糖タンパク質を変性させるのに十分な量である；
（ｃ）９０℃～１００℃の温度で２分～５分間、ステップ（ｂ）の構成成分をインキュベートして、変性した糖タンパク質を提供すること；
（ｄ）変性した糖タンパク質を冷却すること；
（ｅ）変性した糖タンパク質を非イオン性表面活性剤とアニオン表面活性剤の阻害効果を無効にする量において合わせること
（ｆ）エンドグリコシダーゼを変性した糖タンパク質１ｍｇあたり０．６６ユニット～１０ユニットの量で導入して、Ｎ－結合型グリカンを開裂すること；
（ｇ）３７℃で１～１５分間ステップ（ｆ）の構成成分をインキュベートして脱グリコシル化タンパク質を提供すること；および
（ｈ）脱グリコシル化タンパク質を遊離したグリカンから分離すること：
のステップを含む。
方法および材料
ＩｇＧ１ ｍＡｂｓを含む糖タンパク質および融合タンパク質はＣＨＯ細胞において製造され、Ｂｉｏｃｏｎ Ｌｔｄ．での標準的な抗体精製手順を使用して精製される。
ある態様において、糖タンパク質はモノクローナル抗体のバイオシミラーであり、および融合タンパク質のバイオシミラーである。
もう１つの態様において、糖タンパク質は、イトリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、アダリムバブなどのモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）である。
もう１つの態様において、糖タンパク質はエタネルセプトなどの融合タンパク質である。
ＩｇＧ１ ｍＡｂｓを含む糖タンパク質および融合タンパク質はＣＨＯ細胞において製造され、Ｂｉｏｃｏｎ Ｌｔｄ．での標準的な抗体精製手順を使用して精製される。
ある態様において、糖タンパク質はモノクローナル抗体のバイオシミラーであり、および融合タンパク質のバイオシミラーである。
もう１つの態様において、糖タンパク質は、イトリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、アダリムバブなどのモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）である。
もう１つの態様において、糖タンパク質はエタネルセプトなどの融合タンパク質である。
糖タンパク質の詳細は以下に示すとおり。
糖タンパク質Ａ：エタネルセプト
糖タンパク質Ｂ：イトリズマブ
糖タンパク質Ｃ：トラスツズマブ
糖タンパク質Ｄ：融合ｍＡｂ（セツキシマブ＋ＴＧＦＲＢＩＩ）
糖タンパク質Ｅ：ベバシズマブ
糖タンパク質Ｆ：アダリムバブ
糖タンパク質Ａ：エタネルセプト
糖タンパク質Ｂ：イトリズマブ
糖タンパク質Ｃ：トラスツズマブ
糖タンパク質Ｄ：融合ｍＡｂ（セツキシマブ＋ＴＧＦＲＢＩＩ）
糖タンパク質Ｅ：ベバシズマブ
糖タンパク質Ｆ：アダリムバブ
本発明のある部分は多数のグリカン部位を有する糖タンパク質の三次／四次構造を評価および比較する迅速な手段として部分的な脱グリコシル化方法を提供することである。本方法は、部分的に脱グリコシル化されたタンパク質の亜母集団を得るためにＮ－結合型グリカンを部分的に開裂するために４５分～８時間などの限定された期間、１ｍｇの糖タンパク質あたり１ユニット～１０ユニットでネイティブな糖タンパク質へのエンドグリコシダーゼの添加を含む。部分的に脱グリコシル化された糖タンパク質はキャピラリー電気泳動を使用して分析される。
本発明の第２の部分は糖タンパク質の完全な脱グリコシル化の方法を提供することであり、ここで、糖タンパク質はアニオン性表面活性剤および還元剤と合わせ、９０～１００℃で２分～５分間インキュベートする。安定な変性糖タンパク質を得るためにさらなる非イオン性表面活性剤を添加する。変性糖タンパク質をさらに非イオン性表面活性剤と合わせてアニオン性表面活性剤の阻害効果を無効にする。脱グリコシル化タンパク質を得るために、エンドグリコシダーゼを１ｍｇの変性糖タンパク質あたり１～１０ユニット添加して３７℃で１～１５分の時間インキュベートしてＮ結合型グリカンを開裂させる。１ｍｇあたり０．１ユニットのエキソグリコシダーゼをエンドグリコシダーゼ後の非イオン性表面活性剤または脱グリコシル化タンパク質後の変性糖タンパク質に添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、変性糖タンパク質の脱シアル酸化タンパク質を得るために、Ｎ－およびＯ－グリカンの末端シアル酸を開裂する。遊離したグリカンを液体クロマトグラフィーにより分離する。
エキソグリコシダーゼをエンドグリコシダーゼ後の非イオン性表面活性剤または脱グリコシル化タンパク質後の変性糖タンパク質に任意に添加してＮ－およびＯ－グリカンの末端シアル酸を開裂して変性糖タンパク質の脱シアル化タンパク質を得る。
ある態様において、アニオン性表面活性剤は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、カルボキシラート、スルホナート、石油スルホナート、アルキスベンゼンスルホナート、ナフタレンスルホナート、オレフィンスルホナート、アルキルサルファート、サルファート、サルファート化天然油および脂質、サルファート化エステル、サルファート化アルカノールアミドおよびアルキルフェノールからなる群から選択されるものである。
ある態様において、アニオン性表面活性剤は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、カルボキシラート、スルホナート、石油スルホナート、アルキスベンゼンスルホナート、ナフタレンスルホナート、オレフィンスルホナート、アルキルサルファート、サルファート、サルファート化天然油および脂質、サルファート化エステル、サルファート化アルカノールアミドおよびアルキルフェノールからなる群から選択されるものである。
好ましい態様において、糖タンパク質の変性のために使用されるアニオン性表面活性剤はＳＤＳである。
還元剤はジスルフィド結合を破壊する量であり、β－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、またはトリス（カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される。
好ましい態様において、還元剤は１００ｍＭ～１５０ｍＭの量におけるβ－メルカプトエタノールである。
非イオン性表面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、エトキシ化脂肪族アルコール、ポリオキシエチレン表面活性剤、カルボン酸エステル、ポリエチレングリコールエステル、無水ソルビトールエステルおよびそのエトキシ化誘導体、脂肪酸のグリコールエステル、カルボキシアミド、モノアルカノールアミン凝縮物およびポリエチレン脂肪酸アミドからなる群から選択されるものである。
還元剤はジスルフィド結合を破壊する量であり、β－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、またはトリス（カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される。
好ましい態様において、還元剤は１００ｍＭ～１５０ｍＭの量におけるβ－メルカプトエタノールである。
非イオン性表面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、エトキシ化脂肪族アルコール、ポリオキシエチレン表面活性剤、カルボン酸エステル、ポリエチレングリコールエステル、無水ソルビトールエステルおよびそのエトキシ化誘導体、脂肪酸のグリコールエステル、カルボキシアミド、モノアルカノールアミン凝縮物およびポリエチレン脂肪酸アミドからなる群から選択されるものである。
ある態様において、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００などの非イオン性表面活性剤はＳＤＳの阻害効果を無効にするために添加する。
好ましい態様において、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘは０．６０％～１．２％の濃度で添加される。
もう１つの態様において、タンパク質の変性のためのＷａｔｅｒｓ Ｒａｐｉｇｅｓｔキットなどの商業的に入手可能なＳＦ表面活性剤に続くＲｏｃｈｅ ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用する脱グリコシル化はまた本発明の性能を比較するために使用された。
好ましい態様において、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘは０．６０％～１．２％の濃度で添加される。
もう１つの態様において、タンパク質の変性のためのＷａｔｅｒｓ Ｒａｐｉｇｅｓｔキットなどの商業的に入手可能なＳＦ表面活性剤に続くＲｏｃｈｅ ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用する脱グリコシル化はまた本発明の性能を比較するために使用された。
ある部分において、ＰＮＧａｓｅＦなどのエンドグリコシダーゼは変性糖タンパク質に添加して糖タンパク質からＮ－結合型グリカンを開裂し、ここで最内部のＧｌｃＮＡｃ残基はα１－６フコース残基と結合してもよくまたはしなくてもよく、完全に脱グリコシル化された糖タンパク質を得る。必要とされる時間は１～１５分の間である。
もう１つの部分において、エンドグリコシダーゼはＰＮＧａｓｅＦであり、それは４５分～８時間、ネイティブな糖タンパク質に添加されて糖タンパク質からＮ－結合型グリカンを部分的に開裂し、ここで最内部グリカン残基がＧｌｃＮＡｃであり、部分的な脱グリコシル化糖タンパク質を得る。
シアリダーゼなどのエキソグリコシダーゼは、変性したおよびＮ－グリカン脱グリコシル化糖タンパク質に添加して糖タンパク質からのＯ－結合型グリカンから末端シアル酸を開裂する。
好ましい態様において、シアリダーゼ酵素反応を３７℃で３０分行い、脱シアル化タンパク質を得る。
もう１つの部分において、エンドグリコシダーゼはＰＮＧａｓｅＦであり、それは４５分～８時間、ネイティブな糖タンパク質に添加されて糖タンパク質からＮ－結合型グリカンを部分的に開裂し、ここで最内部グリカン残基がＧｌｃＮＡｃであり、部分的な脱グリコシル化糖タンパク質を得る。
シアリダーゼなどのエキソグリコシダーゼは、変性したおよびＮ－グリカン脱グリコシル化糖タンパク質に添加して糖タンパク質からのＯ－結合型グリカンから末端シアル酸を開裂する。
好ましい態様において、シアリダーゼ酵素反応を３７℃で３０分行い、脱シアル化タンパク質を得る。
自然な条件下の脱グリコシル化を以下の通り行った。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ ｐＨ８．０、１ｍｇの各糖タンパク質、１０ユニットのＰＮＧａｓｅＦを有する１ｍＭＣａＣｌ２を３７℃で１６時間インキュベートして完全な脱グリコシル化をすることによりＮ－グリカンを除去するために、ＰＮＧａｓｅＦ（Ｒｏｃｈｅ、ａｔ．１１３６５１９３００１）を使用した。部分的な脱グリコシル化のために、各図に示した通り、インキュベーションはより短い時間であった。
シアリダーゼ消化（ＱＡＢｉｏ、Ｅ－Ｓ００１）のために、０．１ユニットのシアリダーゼを５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．５中の各糖タンパク質１ｍｇに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。分析が行われるまでサンプルを－２０℃で凍結した。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ ｐＨ８．０、１ｍｇの各糖タンパク質、１０ユニットのＰＮＧａｓｅＦを有する１ｍＭＣａＣｌ２を３７℃で１６時間インキュベートして完全な脱グリコシル化をすることによりＮ－グリカンを除去するために、ＰＮＧａｓｅＦ（Ｒｏｃｈｅ、ａｔ．１１３６５１９３００１）を使用した。部分的な脱グリコシル化のために、各図に示した通り、インキュベーションはより短い時間であった。
シアリダーゼ消化（ＱＡＢｉｏ、Ｅ－Ｓ００１）のために、０．１ユニットのシアリダーゼを５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．５中の各糖タンパク質１ｍｇに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。分析が行われるまでサンプルを－２０℃で凍結した。
変性条件下の脱グリコシル化を以下の通り行った。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ ｐＨ８．０中の１ｍｇの各糖タンパク質、１ｍＭＣａＣｌ２を１００－１３０ｍＭ β－メルカプトエタノールおよび１０％貯蔵溶液からのＳＤＳ０．１～０．８％と混合した。混合物を９５℃で２分間インキュベートし、室温まで冷却した（２分）。０．７５－１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加してボルテックスし、続いて１～１０ユニットのＰＮＧａｓｅＦ酵素（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ．１１３６５１９３００１）および３７℃で１～１５分インキュベートした。
シアリダーゼ消化のために、０．１ユニットのシアリダーゼを５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．５における各糖タンパク質１ｍｇに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。シアリダーゼ消化のための糖タンパク質を上記の通りの０．４％ＳＤＳ、１００ｍＭ β－メルカプトエタノールおよび０．７５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の存在下、１０ユニットのＰＮＧａｓｅ Ｆで前処理した。分析が行われるまでサンプルを－２０℃で凍結した。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ ｐＨ８．０中の１ｍｇの各糖タンパク質、１ｍＭＣａＣｌ２を１００－１３０ｍＭ β－メルカプトエタノールおよび１０％貯蔵溶液からのＳＤＳ０．１～０．８％と混合した。混合物を９５℃で２分間インキュベートし、室温まで冷却した（２分）。０．７５－１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加してボルテックスし、続いて１～１０ユニットのＰＮＧａｓｅＦ酵素（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ．１１３６５１９３００１）および３７℃で１～１５分インキュベートした。
シアリダーゼ消化のために、０．１ユニットのシアリダーゼを５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．５における各糖タンパク質１ｍｇに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。シアリダーゼ消化のための糖タンパク質を上記の通りの０．４％ＳＤＳ、１００ｍＭ β－メルカプトエタノールおよび０．７５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の存在下、１０ユニットのＰＮＧａｓｅ Ｆで前処理した。分析が行われるまでサンプルを－２０℃で凍結した。
グリカンのＮＰ ＨＰＬＣ－ＦＬＤのためのサンプル調製を以下の通り行った。
遊離したグリカンを冷却したエタノールを添加することによりタンパク質から分離し、続いて８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。グリカンを含有する上澄みを集め真空乾燥した。ラベルする試薬をアントラニル酸５ｍｇおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウム６ｍｇをＤＭＳＯ：氷酢酸の７０：３０混合物１００μＬに溶解させることにより調製した。この試薬の５μＬを乾燥したグリカンサンプルに添加して、８０℃で４５分間インキュベートした。その後ラベル化したグリカンを水中で再構成し（reconstituted）、酢酸エチルで５回洗浄した。過剰量の酢酸エチルを有機および水層の相分離を使用して各回除去し、サンプルを再度真空乾燥する。乾燥したサンプルを１００μｌの５０％アセトニトリルおよび５０％水（ｖ／ｖ）において再構成し、さらに混合した。上澄みを除去し、マキシマムリカバリーバイアルに移し、蛍光検出器を有するＨＰＬＣシステム中に注入した。グリカンを移動相Ａが１００％アセトニトリルであり移動相Ｂが５０ｍＭギ酸アンモニウムｐＨ４．４であるＬｕｄｇｅｒＳｅｐ Ｎ２アミドカラム上で分離した。蛍光検出器を励起３５２ｎｍおよび放射４３５ｎｍに設定した。グリカンサンプルは分析まで２～８℃で貯蔵され得る。
遊離したグリカンを冷却したエタノールを添加することによりタンパク質から分離し、続いて８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。グリカンを含有する上澄みを集め真空乾燥した。ラベルする試薬をアントラニル酸５ｍｇおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウム６ｍｇをＤＭＳＯ：氷酢酸の７０：３０混合物１００μＬに溶解させることにより調製した。この試薬の５μＬを乾燥したグリカンサンプルに添加して、８０℃で４５分間インキュベートした。その後ラベル化したグリカンを水中で再構成し（reconstituted）、酢酸エチルで５回洗浄した。過剰量の酢酸エチルを有機および水層の相分離を使用して各回除去し、サンプルを再度真空乾燥する。乾燥したサンプルを１００μｌの５０％アセトニトリルおよび５０％水（ｖ／ｖ）において再構成し、さらに混合した。上澄みを除去し、マキシマムリカバリーバイアルに移し、蛍光検出器を有するＨＰＬＣシステム中に注入した。グリカンを移動相Ａが１００％アセトニトリルであり移動相Ｂが５０ｍＭギ酸アンモニウムｐＨ４．４であるＬｕｄｇｅｒＳｅｐ Ｎ２アミドカラム上で分離した。蛍光検出器を励起３５２ｎｍおよび放射４３５ｎｍに設定した。グリカンサンプルは分析まで２～８℃で貯蔵され得る。
以下の通りのＣＥ－ＳＤＳサンプル調製および装置操作手順
ＣＥ－ＳＤＳ分析を３２カラットＶ ９．１ソフトウェアを備えるPA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System (Beckman Coulter)で行った。３０ｃｍ長のキャピラリーを５０μ ＩＤと２００μの開口部（aperture）とともに用いる。サンプルを１０ｋＤａ ＭＷＣＯ ＮａｎｏＳｅｐにおいてＳＤＳバッファーｐＨ９．５を使用して糖タンパク質１２５μｇを脱塩することにより調製した。ｐＨ９．５のＳＤＳバッファー７６μｌを０．５μｌの内部標準（１０ｋＤａｍｏｌ．ｗｔ．マーカー、ＳＤＳＭＷ分析キット）および５μｌのβ－メルカプトエタノールとともに脱塩したサンプル１９μｌと混合した。混合物をボルテックスし、簡単に遠心分離した。内容物を８０℃で２分インキュベートし、溶液を室温まで冷却した。内容物をユニバーサルバイアル中に設置されたＰＣＲチューブに移した。
ＣＥ－ＳＤＳ分析を３２カラットＶ ９．１ソフトウェアを備えるPA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System (Beckman Coulter)で行った。３０ｃｍ長のキャピラリーを５０μ ＩＤと２００μの開口部（aperture）とともに用いる。サンプルを１０ｋＤａ ＭＷＣＯ ＮａｎｏＳｅｐにおいてＳＤＳバッファーｐＨ９．５を使用して糖タンパク質１２５μｇを脱塩することにより調製した。ｐＨ９．５のＳＤＳバッファー７６μｌを０．５μｌの内部標準（１０ｋＤａｍｏｌ．ｗｔ．マーカー、ＳＤＳＭＷ分析キット）および５μｌのβ－メルカプトエタノールとともに脱塩したサンプル１９μｌと混合した。混合物をボルテックスし、簡単に遠心分離した。内容物を８０℃で２分インキュベートし、溶液を室温まで冷却した。内容物をユニバーサルバイアル中に設置されたＰＣＲチューブに移した。
脱グリコシル化方法は本発明の方法の通りに行われ（図１～９）、その後ＲｏｃｈｅおよびＷａｔｅｒｓ Ｒａｐｉｇｅｓｔ（図１０～１３）による事前に存在する商業的に入手可能な脱グリコシル化方法と比較した。方法の使用はまたＯ－結合型グリカンを有する糖タンパク質のシアリダーゼ酵素消化まで拡張される（図１４）。
例１：
自然な条件下でのＰＮＧａｓｅＦによる多数のグリカン部位糖タンパク質の脱グリコシル化の継時変化が図１に説明されており、それは抗体の融合構成物である、部分的に脱グリコシル化された糖タンパク質Ａの還元されたＣＥ－ＳＤＳプロファイルである。還元されたＣＥ－ＳＤＳプロファイルは、異なる時間間隔で糖タンパク質の異なる亜母集団が得られ、ここで各連続したピークは、タンパク質中の違うグリカン部位の脱グリコシル化に対して直接的に関連付けられる。
例１：
自然な条件下でのＰＮＧａｓｅＦによる多数のグリカン部位糖タンパク質の脱グリコシル化の継時変化が図１に説明されており、それは抗体の融合構成物である、部分的に脱グリコシル化された糖タンパク質Ａの還元されたＣＥ－ＳＤＳプロファイルである。還元されたＣＥ－ＳＤＳプロファイルは、異なる時間間隔で糖タンパク質の異なる亜母集団が得られ、ここで各連続したピークは、タンパク質中の違うグリカン部位の脱グリコシル化に対して直接的に関連付けられる。
図１において、糖タンパク質Ａは３つの違うグリカン部位（二量化形態中に６つ）を示し、その部分的な脱グリコシル化は４つの違うピークへ導く。ピーク１は完全にグリコシル化され、各々脱グリコシル化される１および２個の部位を有するピーク２および３が続く。さらにピーク４は脱グリコシル化された全て３つのグリカン部位を有し、完全に脱グリコシル化された糖タンパク質Ａである。進行する脱グリコシル化のインキュベーション時間として、グリカン部位亜母集団は完全な脱グリコシル化に向かってシフト（左側）した。各時間間隔での各亜母集団の強度は、タンパク質の局所の構造および嵩高くおよび高度に分岐したグリカン（部位占有率）による立体障害によりマスクされ得るグリカン部位の接近可能性に影響を与える。したがって、このプロファイルはグリコシル化タンパク質の三次構造の指紋であり、およびより高次の構造品質を評価するための手段として用いられ得る。プロファイルは図２にみられるとおり単一のグリカン部位糖タンパク質（２量化形態において２つ）においてより単純であり、それは自然な条件下で３７℃で１０Ｕ ＰＮＧａｓｅ Ｆにより部分的に脱グリコシル化される糖タンパク質の還元されたＣＥ－ＳＤＳプロファイルである。抗体である糖タンパク質を軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）に還元する。Ｎｇ－ＨＣは部分的なＰＮＧａｓｅＦ消化後に生じた非グリコシル化重鎖に対応する。特定の部位でのグリカン構造における不均質性による大きさの変化（variant）は、各亜母集団のピーク幅を占めるべきと仮定される（低い分子量差のため）。特別な時点での亜母集団は、温度、インキュベーションの長さ、酵素ユニットおよびインキュベーションの時間での混合などの多くの要因に影響を受けやすい。還元する時間および還元する酵素ユニットの両方は脱グリコシル化の亜母集団の減少をもたらす酵素反応の速度を遅くするだろう。インキュベーションの長さおよび混合の影響は各々図１および図３に実証される。
ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化でのバッファーマトリックスからの干渉がまた見積もられ、アッセイはタンパク質バッファーに反応しにくい（図４）。このようにパラメータは糖タンパク質の良好に溶解したグリカン亜母集団を含有する最高のプロファイルを得るために最適化されるべきである。本発明者らの実験のために、本発明者らは３７℃で１０ＵのＰＮＧａｓｅＦ酵素、３００ｒｐｍで混合して４５分のインキュベーション時間で糖タンパク質のプロファイルを選ぶ。
分析的な方法の変動性を自然な条件下で糖タンパク質Ａの４５分の脱グリコシル化で確立し、日内（intra-day）での再現性（reproducibility）／繰り返し性（repeatability）、日間（inter-day）および分析間（inter-analyst）での実行（runs）に基づいて見積もる。表１において、図１に示される各亜母集団の相対的な存在量が示され、％ＲＳＤが計算される。最大の変動性がより低い量における種に対して観測され、よく分割された（resolved）亜母集団ではない。糖タンパク質Ａの実証方法変動性の還元したＣＥ－ＳＤＳプロファイルを図５に重ね合わせる。
表１．日内、日間および分析間のために評価された分析方法変動性。各亜母集団をピーク１、２、３および４の相対的領域百分率として見積もる。
本発明者らは本方法の構造安定性を見積もるために部分的に脱グリコシル化した抗体の亜母集団上の多くの要因による抗体の部分的な変性／アンフォールディングの効果を見積もった。変性したサンプルをＰＮＧａｓｅＦ消化の前に熱、界面活性剤および還元剤に曝露することにより得た。熱と界面活性剤の両方は水素結合および疎水性相互作用に影響を与える。還元剤はタンパク質におけるジスルフィド結合を標的にする。部分的な変性の後３００ｒｐｍで４５分間混合して３７℃で１０ＵのＰＮＧａｓｅ Ｆにより部分的に脱グリコシル化した糖タンパク質の還元したＣＥ－ＳＤＳプロファイル。完全に脱グリコシル化した糖タンパク質Ａを１６時間のＰＮＧａｓｅ Ｆ消化により得た。図６にみられるとおり、上記要因の各々は脱グリコシル化配座異性体の亜母集団に異なる程度で影響を与えた。
例えば、ピーク３および４への最大シフト（完全な脱グリコシル化に対する）は、０．０１％ ＳＤＳまたは２－メルカプトエタノールと処理したタンパク質において見られる。３７℃での抗体の一晩のインキュベーションおよび９５℃で２分のインキュベーションの両方が、コントロールとして使用される定期的な４５分の部分的に脱グリコシル化された糖タンパク質と比較して、亜母集団における重要なシフトをもたらした。３７℃で一晩のインキュベーションで得られた結果は、脱グリコシル化された糖タンパク質とグリコシル化された抗体と比較した安定性上の意味合いを有した。ほとんどの場合において、観測される違いは、後者単独よりも、延長されたインキュベーションに対する酵素的な処理による温和なタンパク質変性とグリカン除去後の構造的な歪みとの組み合わせた効果だろう。タンパク質のグリカン亜母集団におけるシフトは、部分的な変性により強いられたタンパク質の三次構造における変化が、糖タンパク質において関連する部位での脱グリコシル化の量に直接的に影響すること、およびしたがって亜母集団のレベルがタンパク質の四次／三次構造と比較して使用され得る、ということを示す。
より高次構造と比較する方法を使用するために、それはＥＵおよびＵＳの規制機関から承認される多数のロットの糖タンパク質で試験された。５つの部分的に脱グリコシル化した多くの糖タンパク質Ａの図７における還元したＣＥ－ＳＤＳプロファイルを得た。糖タンパク質を３００ｒｐｍで４５分間混合しながら３７℃で１０ＵＰＮＧａｓｅＦにより脱グリコシル化された。ロット１、２、および３はＥＵから、４および５はＵＳから認可される。図７はＥＵの３つおよびＵＳの２つのロットの糖タンパク質Ａの還元したＣＥ－ＳＤＳの出力（traces）を示す。明らかに、本方法の変動性以上である分析されるバッチ間での著しい変動性が観測された。糖タンパク質ＡはＦｃと融合ドメインの両方でグリコシル化され、ロットにおけるグリカン部位占有が類似しない場合、観測される違いが得られる。糖タンパク質Ａの多くのロットにおける嵩高く分岐したグリカンの区別を示す分布は、変化したＣＥ－ＳＤＳプロファイルの原因となるＰＮＧａｓｅＦ消化に異なるレベルの立体障害を引き起こすだろう。しかしながら、ＥＵおよびＵＳの両方のロットのＮ－グリカンプロファイルが類似している。表２において、１つの代表的なＥＵおよびＵＳのロットがそれらのＬＣグリカンプロファイルと比較され、類似していることが見出される。これらのロットは非常に異なる部分的な脱グリコシル化還元ＣＥプロファイルを示した（図７））。これは、抗体Ａで観測されるロット間の変動性はグリカンの付着部位でのタンパク質構造からきている、ということを示唆した。それにもかかわらず、グリカン付着の部位での部位占有率およびタンパク質の構造の両方が部分的に脱グリコシル化されたサンプルにおいて亜母集団に影響を与え得る。
グリカンがモノクローナル抗体の生物学的活性に影響を与えることが知られているので、抗体生産において、製品の有効性を維持するために、異なるロットのグリカンプロファイルにおける変動性は最小化され、したがって上で観測されるロット間の違いは現実である。このように、本方法は繊細であり、革新者製品の三次構造におけるロット間変動性をマッピングすることとバイオシミラーと比較することに適している。
表２．還元したＣＥ－ＳＤＳプロファイルにおける相対的な極大差を示す多くの糖タンパク質ＡのＬＣグリカンプロファイルの比較。数値はロットにおけるグリカン種の相対存在量に対応する。
タンパク質の脱グリコシル化後に遊離するグリカンは品質の制御のためおよびタンパク質が所望の治療の有効性または他の効果を有するかどうかを決定するための両方に有用である。クロマトグラフのマッピングプロトコールのために、および他の分析的なシナリオのために、タンパク質とペプチドの両方の完全な脱グリコシル化が度々望まれる。例えば、脱グリコシル化はＳＤＳ－ＰＡＧＥによるタンパク質分離中の汚染を減らすことができるか、または質量分光分析中のより簡単なイオン化およびスペクトル解釈を許容し得る。これは特に、多数のＰＴＭからの不均質のためにひずみ得るタンパク質の完全な分子量を見るとき、特に有用であり得る。治療抗体の場合において、脱グリコシル化は度々、Ｃ末端リジンの存在などの修飾を特徴づけるか、またはラベル化または薬物コンジュゲート化したモノクローナル抗体が免疫グロビンと結合する低分子の数を観察するために必要である。この理由のため、それは度々脱グリコシル化糖タンパク質に有利である。
本発明において、本発明者らは、界面活性剤および還元剤を使用する迅速で効率的なタンパク質－脱グリコシル化方法を示す。タンパク質脱グリコシル化に続くステップのフローチャートが以下のフローチャートに描かれる。各ステップの説明が表３に詳しく述べられる。
表３：本方法の説明。ステップの数はフローチャートに対応する。
例２
簡潔に、アニオン性界面活性剤ＳＤＳ（０．４％）および還元剤β－メルカプトエタノール（１００ｍＭ）を９５℃でタンパク質をアンフォールディングするために用いる。その後、ＰＮＧａｓｅＦによる脱グリコシル化の前に非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（０．７５％）で処理してＳＤＳの阻害効果を無効にする。１ｍＭの塩化カルシウムを反応バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ８．０）において使用して安定化し、ＰＮＧａｓｅＦ活性を促進した。反応最適化条件を図８に詳しく述べ、ここで変性条件下での抗体Ｃの完全な脱グリコシル化のための最適化ＳＤＳ濃度を説明する。ＳＤＳ濃度を固定するために、最初の脱グリコシル化実験を３７℃で１０Ｕ ＰＮＧａｓｅＦ、１３０ｍＭβ－Ｍｅ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で行った。１０Ｕの酵素を用いた１５分の完全な脱グリコシル化はまた本発明の方法で他のＦｃグリコシル化抗体（糖タンパク質ＥおよびＦ）に観測された（図９）。
簡潔に、アニオン性界面活性剤ＳＤＳ（０．４％）および還元剤β－メルカプトエタノール（１００ｍＭ）を９５℃でタンパク質をアンフォールディングするために用いる。その後、ＰＮＧａｓｅＦによる脱グリコシル化の前に非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（０．７５％）で処理してＳＤＳの阻害効果を無効にする。１ｍＭの塩化カルシウムを反応バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ８．０）において使用して安定化し、ＰＮＧａｓｅＦ活性を促進した。反応最適化条件を図８に詳しく述べ、ここで変性条件下での抗体Ｃの完全な脱グリコシル化のための最適化ＳＤＳ濃度を説明する。ＳＤＳ濃度を固定するために、最初の脱グリコシル化実験を３７℃で１０Ｕ ＰＮＧａｓｅＦ、１３０ｍＭβ－Ｍｅ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で行った。１０Ｕの酵素を用いた１５分の完全な脱グリコシル化はまた本発明の方法で他のＦｃグリコシル化抗体（糖タンパク質ＥおよびＦ）に観測された（図９）。
本方法の新規性は、１～１５分という非常に短時間のプロセスを完結させるために使用される酵素の最低量を用いた酵素活性を促進する比例関係における構成成分の特有の組み合わせにある。表４に示す通り、商業的に入手可能なキットにおいて、１０～２５ユニットの酵素が１ｍｇの変性タンパク質からのＮ－グリカンを遊離するために示される（特異的活性参照）。本方法において、表３のとおり社内で開発したプロトコールを用いて、１ユニットの酵素（試験されるRoche酵素）は～９５％の１ｍｇ変性タンパク質を１分で消化することができ、それは酵素活性においておよそ１０倍増加し、商業的に入手可能なキットにおける１時間～一晩のインキュベーションと比較して時間内での顕著な還元である（表４）。
例３
図１０は、Ｒｏｃｈｅキット（１０Ｕの変性剤なしのＲｏｃｈｅ酵素）およびＢｉｏｃｏｎの方法（１Ｕの変性剤有りのＲｏｃｈｅ酵素）でのＦｃグリコシル化抗体糖タンパク質Ｂの脱グリコシル化のパーセントの経時変化を比較する。観測されるとおり、ほぼ完結した脱グリコシル化（～９９％）が、１０ＵのＲｏｃｈｅ酵素変性剤なしで１６時間で観測され、一方同様のグリカン収率（～９４％）を、本発明の方法において用いられる１ＵのＲｏｃｈｅ酵素を用いて１分で達成された。
図１０は、Ｒｏｃｈｅキット（１０Ｕの変性剤なしのＲｏｃｈｅ酵素）およびＢｉｏｃｏｎの方法（１Ｕの変性剤有りのＲｏｃｈｅ酵素）でのＦｃグリコシル化抗体糖タンパク質Ｂの脱グリコシル化のパーセントの経時変化を比較する。観測されるとおり、ほぼ完結した脱グリコシル化（～９９％）が、１０ＵのＲｏｃｈｅ酵素変性剤なしで１６時間で観測され、一方同様のグリカン収率（～９４％）を、本発明の方法において用いられる１ＵのＲｏｃｈｅ酵素を用いて１分で達成された。
例４
図１１は、より少ない酵素ユニットを用いて本発明の方法を使用する減少したインキュベーション時間およびＲｏｃｈｅキットで得られた、２つのＦｃグリコシル化モノクローナル抗体（糖タンパク質ＢおよびＣ）からのグリカン種のＬＣプロファイルの比較を与える。１０Ｕの酵素で１６時間と１ユニットの酵素で１分で消化した糖タンパク質Ｂについて同一のプロファイルが得られる。１５分間０．６６Ｕの酵素でと１６時間１０Ｕの酵素と比較して類似のグリカン収率が消化される糖タンパク質Ｃに対して得られた。少ないグリカン種（＜０．５％）は１０ＵのＲｏｃｈｅ酵素単独で１６時間で観測された。類似のグリカン種が１分間の１ユニットの酵素インキュベーションでの本発明の方法で観測された（図１１）。
図１１は、より少ない酵素ユニットを用いて本発明の方法を使用する減少したインキュベーション時間およびＲｏｃｈｅキットで得られた、２つのＦｃグリコシル化モノクローナル抗体（糖タンパク質ＢおよびＣ）からのグリカン種のＬＣプロファイルの比較を与える。１０Ｕの酵素で１６時間と１ユニットの酵素で１分で消化した糖タンパク質Ｂについて同一のプロファイルが得られる。１５分間０．６６Ｕの酵素でと１６時間１０Ｕの酵素と比較して類似のグリカン収率が消化される糖タンパク質Ｃに対して得られた。少ないグリカン種（＜０．５％）は１０ＵのＲｏｃｈｅ酵素単独で１６時間で観測された。類似のグリカン種が１分間の１ユニットの酵素インキュベーションでの本発明の方法で観測された（図１１）。
本発明において試験される糖タンパク質は、モノクローナル抗体／構造的に複雑でそのＦｃ、Ｆａｂおよび融合部で多数グリコシル化されている融合抗体（＞１００ｋＤａ）である。図１２のパネルは６個の違う部位（２量体中で１２個）でグリコシル化されるＦｃ、Ｆａｂおよび融合部を有する多数グリコシル化された融合糖タンパク質ＤのＬＣ－グリカンプロファイルを示す。さらなるグリカン種はさもなければ消化のためのＰＮＧａｓｅＦに近づけない本方法を用いて遊離する。これらのグリカン種は高度に分岐し、嵩高い、タンパク質のＦａｂおよび融合部に存在するガラクトシル化し、およびシアル化した種に対応する。パネルｂにおいて、脱グリコシル化した融合タンパク質（糖タンパク質Ｄ）のＣＥプロファイルが描かれ、ここで８７％の脱グリコシル化は本発明の方法を用いて１分間インキュベートした１ユニットの酵素を用いて観測され、消化は酵素１０ユニットを用いて１分で完結した。脱グリコシル化の相対的割合は図１２のパネルｂにおいて言及される。
さらに、図１３に示す通り、本発明の方法はまた同様の時間に酵素量において完全に脱グリコシル化する多数のグリカン部位融合タンパク質(糖タンパク質 A)においてもまた効率的であった。
さらに、図１３に示す通り、本発明の方法はまた同様の時間に酵素量において完全に脱グリコシル化する多数のグリカン部位融合タンパク質(糖タンパク質 A)においてもまた効率的であった。
例５
本発明者らは、ＰＮＧａｓｅＦ以外の酵素による脱グリコシルカのための界面活性剤および還元剤の類似のレシピを拡大した。図１４において、シアリダーゼ消化の界面活性剤ありとなしとでの比較を示す。本発明者らのレシピのシアリダーゼは、シアリダーゼ単独と類似する、すなわち３０分での脱シアルＯ－グリカン（末端シアル酸の除去）を可能にする。使用されるタンパク質はシアリダーゼ処理の前にＰＮＧａｓｅ Ｆを使用するＮ－グリカン脱グリコシル化物である。本発明はさらに酵素ユニットだけでなくインキュベーション時間を減らすように最適化され得る。
本方法は他のエンドグリコシダーゼ酵素、例えばベータ－ガラクシトダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、エンド－Ｈ、エンド－Ｆ２、エンド－Ｓ、マンノシダーゼおよびフコシダーゼなど、をさらに添加して各末端糖残基を除去することにより分析される。
本発明者らは、ＰＮＧａｓｅＦ以外の酵素による脱グリコシルカのための界面活性剤および還元剤の類似のレシピを拡大した。図１４において、シアリダーゼ消化の界面活性剤ありとなしとでの比較を示す。本発明者らのレシピのシアリダーゼは、シアリダーゼ単独と類似する、すなわち３０分での脱シアルＯ－グリカン（末端シアル酸の除去）を可能にする。使用されるタンパク質はシアリダーゼ処理の前にＰＮＧａｓｅ Ｆを使用するＮ－グリカン脱グリコシル化物である。本発明はさらに酵素ユニットだけでなくインキュベーション時間を減らすように最適化され得る。
本方法は他のエンドグリコシダーゼ酵素、例えばベータ－ガラクシトダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、エンド－Ｈ、エンド－Ｆ２、エンド－Ｓ、マンノシダーゼおよびフコシダーゼなど、をさらに添加して各末端糖残基を除去することにより分析される。
例６
本発明者らは、また変性およびその後に続くＲｏｃｈｅ ＰＮＧａｓｅ Ｆによる脱グリコシル化のための商業的に入手可能なＷａｔｅｒｓ Ｒａｐｉｇｅｓｔキットの性能を比較した。図１３は本発明の方法および商業的に入手可能なＷａｔｅｒｓ Ｒａｐｉｇｅｓｔ（ＲＧ）キットを使用する糖タンパク質Ａの脱グリコシル化を実証する還元したＣＥ－ＳＤＳプロファイルを説明する。それは時間の減少、費用の減少および酵素ユニットの減少の利益を有するので、結果は、脱グリコシル化の本発明の方法が商業的に入手可能な／伝統的な方法よりもよいということを示す。本発明は糖タンパク質のより速い脱グリコシル化を許容するだけでなく、収率と遊離されるグリカン種の数の両方を改善する。
本発明者らは、また変性およびその後に続くＲｏｃｈｅ ＰＮＧａｓｅ Ｆによる脱グリコシル化のための商業的に入手可能なＷａｔｅｒｓ Ｒａｐｉｇｅｓｔキットの性能を比較した。図１３は本発明の方法および商業的に入手可能なＷａｔｅｒｓ Ｒａｐｉｇｅｓｔ（ＲＧ）キットを使用する糖タンパク質Ａの脱グリコシル化を実証する還元したＣＥ－ＳＤＳプロファイルを説明する。それは時間の減少、費用の減少および酵素ユニットの減少の利益を有するので、結果は、脱グリコシル化の本発明の方法が商業的に入手可能な／伝統的な方法よりもよいということを示す。本発明は糖タンパク質のより速い脱グリコシル化を許容するだけでなく、収率と遊離されるグリカン種の数の両方を改善する。
迅速な脱グリコシル化方法は以下の長所および適用を有する。
１）重度にグリコシル化される、構造的に複雑な糖タンパク質の脱グリコシル化
２）ＮおよびＯ－グリカンを含む完全な糖タンパク質のエキソグリコシダーゼを含む、完全なＮ－グリカンＬＣ－ＭＳプロファイリング
３）本来の不均質性および暴露されたグリカンの低いイオン化のために苦労する糖タンパク質の完全および還元された質量分析。界面活性剤を脱塩スピンカラムを使用してＭＳ分析の前に除去することができる。多くの消化後清浄化プロトコールはまた文献において利用可能であり、それは反応混合物から界面活性剤を取り除く。
４）グリコシル化部位および付着部位でのグリカンの不均質のため、さもなければ困難であるＭＳを使用する部位占有率の同定。
１）重度にグリコシル化される、構造的に複雑な糖タンパク質の脱グリコシル化
２）ＮおよびＯ－グリカンを含む完全な糖タンパク質のエキソグリコシダーゼを含む、完全なＮ－グリカンＬＣ－ＭＳプロファイリング
３）本来の不均質性および暴露されたグリカンの低いイオン化のために苦労する糖タンパク質の完全および還元された質量分析。界面活性剤を脱塩スピンカラムを使用してＭＳ分析の前に除去することができる。多くの消化後清浄化プロトコールはまた文献において利用可能であり、それは反応混合物から界面活性剤を取り除く。
４）グリコシル化部位および付着部位でのグリカンの不均質のため、さもなければ困難であるＭＳを使用する部位占有率の同定。
Claims (21)
- 糖タンパク質の脱グリコシル化の方法であって、
（ａ）糖タンパク質を提供すること；
（ｂ）糖タンパク質を、アニオン性表面活性剤および還元剤と合わせること、ここで還元剤は、糖タンパク質を変性させるのに十分な量である；
（ｃ）９０℃～１００℃の温度で２分～５分間、ステップ（ｂ）の構成成分をインキュベートして、変性した糖タンパク質を提供すること；
（ｄ）変性した糖タンパク質を冷却すること；
（ｅ）変性した糖タンパク質を非イオン性表面活性剤とアニオン表面活性剤の阻害効果を無効にする量で合わせること
（ｆ）エンドグリコシダーゼを変性した糖タンパク質１ｍｇあたり０．６６ユニット～１０ユニットの量で導入して、Ｎ－結合型グリカンを開裂すること；
（ｇ）３７℃で１～１５分間、ステップ（ｆ）の構成成分をインキュベートして、脱グリコシル化タンパク質を提供すること；および
（ｈ）脱グリコシル化タンパク質を遊離したグリカンから分離すること：
のステップを含む、前記方法。 - エンドグリコシダーゼが、ステップ（ｅ）の後またはステップ（ｇ）の後、任意に変性糖タンパク質１ｍｇあたり０．１ユニットの量において添加され、３７℃で３０分間、構成成分をインキュベートして、脱シアル酸化されたタンパク質を提供する、請求項１に記載の方法。
- アニオン性表面活性剤が、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム)、カルボキシラート、スルホナート、石油スルホナート、アルキルベンゼンスルホナート、ナフタレンスルホナート、オレフィンスルホナート、アルキルサルファート、サルファート、サルファート化天然油および脂質、サルファート化エステル、サルファート化アルカノールアミドおよびアルキルフェノールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- アニオン性表面活性剤が、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項３に記載の方法。
- ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が、好ましくは０．１％～０．８％の濃度である、請求項４に記載の方法。
- 非イオン性表面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、エトキシ化脂肪族アルコール、ポリエチレン表面活性剤、カルボキシエステル、ポリエチレングリコールエステル、無水ソルビトールエステルおよびそのエトキシ化誘導体、脂肪酸のグリコールエステル、カルボキシアミド、モノアルカノールアミン凝縮物およびポリエチレン脂肪酸アミドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- 非イオン性表面活性剤が好ましくはＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００である、請求項６に記載の方法。
- Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘが、好ましくは０．６０％～１．２％の濃度である、請求項７に記載の方法。
- 還元剤が、ジスルフィド結合を切断する量であり、およびβ-メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、またはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- 還元剤が好ましくはβ－メルカプトエタノールである、請求項９に記載の方法。
- β－メルカプトエタノールが好ましくは１００ｍＭ～１５０ｍＭの量である、請求項１０に記載の方法。
- 最内部の残基がＧｌｃＮＡｃである場合、エンドグリコシダーゼが、糖タンパク質からＮ－結合型グリカンを開裂させる能力を有するＰＮＧａｓｅＦである、請求項１に記載の方法。
- 酵素活性が１～１５分で完結する、請求項１２に記載の方法。
- エキソグリコシダーゼが、糖タンパク質のＮ－およびＯ－結合型グリカンの両方から末端シアル酸を開裂させる能力を有するシアリダーゼである、請求項２に記載の方法。
- 酵素活性が３０分で完結する、請求項１４に記載の方法。
- 遊離したグリカンを液体クロマトグラフィーにより分離する、請求項１に記載の方法。
- 糖タンパク質が、抗体、そのフラグメントまたはマルチプルグリカン部位を有する融合たんぱく質である、請求項１に記載の方法。
- 三次構造を比較するための糖タンパク質の脱グリコシル化の方法であって、
（ａ）糖タンパク質を提供すること；
（ｂ）糖タンパク質を、エンドグリコシダーゼと糖タンパク質１ｍｇあたり１ユニット～１０ユニットの量で合わせて、Ｎ－結合型グリカンを部分的に開裂すること；
（ｃ）約３７℃からの温度で約４５分～８時間、ステップ（ｂ）の構成成分をインキュベートして、部分的に脱グリコシル化したタンパク質を提供すること、
のステップを含む、前記方法。 - 最内部の残基がＧｌｃＮＡｃである場合、エンドグリコシダーゼが、糖タンパク質からＮ－結合型グリカンを開裂させる能力を有するＰＮＧａｓｅＦである、請求項１８に記載の方法。
- 部分的に脱グリコシル化された糖タンパク質がキャピラリー電気泳動を使用して分析される、請求項１８に記載の方法。
- 糖タンパク質が、マルチプルグリカン部位を有する抗体、そのフラグメントまたは融合タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
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