CN115541872A - 一种pd-l1检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种pd-l1检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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CN115541872A CN202211157460.6A CN202211157460A CN115541872A CN 115541872 A CN115541872 A CN 115541872A CN 202211157460 A CN202211157460 A CN 202211157460A CN 115541872 A CN115541872 A CN 115541872A
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Abstract

本申请属于医学检验领域，尤其涉及一种PD‑L1检测试剂盒及其检测方法。本申请第一方面提供了一种PD‑L1检测试剂盒，所述试剂盒包括：抗原修复液、蛋白质变性缓冲液、糖苷内切酶工作液、内源性过氧化物酶阻断剂、PD‑L1一抗、酶标山羊抗鼠/兔二抗聚合物、显色液和复染液。本申请第二方面公开了所述PD‑L1检测试剂盒在病理石蜡组织切片染色检测PD‑L1中的应用。本申请提供了一种PD‑L1检测试剂盒及其检测方法，所述检测试剂盒可有效提高PD‑L1与PD‑L1抗体结合亲和力，提高PD‑L1检测敏感性，对筛选有效病人具有重大的意义。

Description

一种PD-L1检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本申请属于医学检验领域，尤其涉及一种PD-L1检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
通过阻断PD-1/PD-L1免疫检查位点重新激活T细胞免疫被证明是一项具有革命性前景的肿瘤治疗新方法。以食管癌为例，食管癌在我国较为常见，其病理类型以食管鳞状细胞癌(ESCC)为主，且患者确诊时多为晚期，治疗以放化疗为主，预后差；免疫治疗给晚期食管癌患者带来一个新的希望。然而，免疫治疗效果个体化差异明显，接受PD-L1抗体治疗的食管癌患者中，ORR(客观缓解率)不超过20％，而且在临床实践中发现接受PD-1/PD-L1治疗的食管癌患者中，PD-L1免疫组织化学结果与免疫治疗应答一致性较低，准确筛选对PD-L1免疫治疗有效的恶性肿瘤患者是临床治疗的难点。
目前PD-L1常规检测无论是临床的伴随诊断还是肿瘤研究均采用的是石蜡切片脱蜡至水后进行抗原热修复，进行PD-L1一抗孵育，接着采用伴随诊断试剂盒中配套的二抗系统或者通用二抗孵育，DAB显色后判读其表达情况。然而，由于癌症患者大多数表达PD-L1的细胞中会经过翻译后修饰得到调控，尤其是PD-L1糖基化修饰，这种N-糖基化修饰位于抗原结合区，产生空间位阻效应，导致抗原抗体结合效率低，常规检测方法敏感性不够；因而部分病例经常规方法检测呈现出假阴性的情况，使得部分潜在的免疫治疗获益患者，错失治疗机会，这对临床精准治疗提出了新的挑战。
发明内容
鉴于此，本申请提供了一种PD-L1检测试剂盒及其检测方法，所述检测试剂盒可有效提高石蜡组织切片中PD-L1抗原与PD-L1抗体结合亲和力，提高PD-L1检测敏感性，对筛选有效病人具有重大的临床意义。
本申请第一方面提供了一种PD-L1检测试剂盒，所述试剂盒包括：抗原修复液、蛋白质变性缓冲液、糖苷内切酶工作液、内源性过氧化物酶阻断剂、PD-L1一抗、酶标山羊抗鼠/兔二抗聚合物、显色液和复染液。
具体的，所述PD-L1一抗可根据病种适应症选用不同厂家的品牌，本申请不做具体限定。
在大多数表达PD-L1的细胞中，PD-L1在Western blot上表现出高度糖基化的模式，PD-L1的糖基修饰类型为复杂型N-糖基化，糖基化位点位于胞外区的N35、N192、N200、N219。细胞表面PD-L1的N-连接糖基化约占PD-L1蛋白分子量的52％(17kDa)，其估计分子量为33kDa。PD-L1如此巨大的糖基化修饰分子量占比，相应影响了其空间结构。PD-L1仅包含两个小的亲水区域，即PD-L1检测抗体的结合位点可能有限，也使通常用于福尔马林固定，石蜡包埋标本(FFPE)的免疫组化检测敏感性降低；更重要的是，轻链可变区存在潜在的蛋白N-糖基化位点，这种位于抗原结合区的寡甘露聚糖可阻止抗体与抗原决定簇的结合，导致PD-L1抗体结合亲和力和信号强度受到很大的影响。因此，本申请提供了消除PD-L1糖基化的影响，可有效提高PD-L1检测敏感性的PD-L1检测试剂盒和检测方案。
另一实施例中，所述蛋白质变性缓冲液包括蛋白变性剂和还原剂。
另一实施例中，所述蛋白变性剂选自十二烷基硫酸钠SDS、十四烷基三甲基溴化铵TTAB、十六烷基三甲基溴化铵CTAB、胆汁酸盐中的一种或多种；所述还原剂选自二硫苏糖醇DTT、三(2-羰基乙基)盐酸盐TCEP和β-巯基乙醇中的一种或多种。
另一实施例中，在所述蛋白质变性缓冲液中，所述十二烷基硫酸钠SDS的体积百分比为0.5％～5％；所述三(2-羰基乙基)盐酸盐TCEP的浓度为40mmol/L～80mmol/L。
另一实施例中，所述糖苷内切酶工作液包括糖苷内切酶、糖苷内切酶缓冲液、细胞膜表面活化剂和水。
另一实施例中，所述糖苷内切酶选自PNGase-A糖苷内切酶、PNGase-F糖苷内切酶、Endo-F糖苷内切酶、Endo-H和O-糖苷酶中的一种或多种；所述细胞膜表面活化剂选自NP-40、Triton X-100、Tween 20和Tween 80中的一种或多种。
另一实施例中，所述抗原修复液为用于免疫组化的柠檬酸盐PH6.0缓冲液或EDTA抗原修复液；
所述内源性过氧化物酶阻断剂为体积分数为3％的过氧化氢溶液；
所述酶标山羊抗鼠/兔二抗聚合物选自辣根过氧化物酶HRP标记的山羊抗鼠/兔二抗聚合物，或碱性磷酸酶AP标记的山羊抗鼠/兔二抗聚合物；
所述显色液选自DAB染色液或Fast Red染色液；
所述复染液选自苏木素复染液或Harris苏木素。
本申请第二方面公开了所述PD-L1检测试剂盒在病理石蜡组织切片染色检测PD-L1中的应用。
本申请第三方面提供了一种PD-L1的检测方法，所述检测方法包括：
步骤1、将待测的石蜡组织玻片依次进行烤片、脱蜡和水化，接着将所述石蜡组织玻片运用所述PD-L1检测试剂盒的抗原修复液进行恰当的热修复，得到抗原修复玻片；
步骤2、在所述抗原修复玻片上滴加所述PD-L1检测试剂盒的蛋白质变性缓冲液进行加热孵育反应，清洗液清洗后得到蛋白质变性玻片；
步骤3、在所述蛋白质变性玻片上滴加所述PD-L1检测试剂盒的糖苷内切酶工作液进行孵育反应，清洗液清洗后得到去糖苷化玻片；
步骤4、在所述去糖苷化玻片滴加所述PD-L1检测试剂盒的内源性过氧化物酶阻断剂以终止去糖基化反应，得到待测免疫组化玻片；
步骤5、采用所述PD-L1检测试剂盒的PD-L1一抗、酶标山羊抗鼠/兔二抗聚合物、显色液和复染液对所述待测免疫组化玻片进行免疫组化染色，然后依次进行脱水、透明和封片，得到检测玻片；
步骤6、评阅所述检测玻片的PD-L1表达情况。
另一实施例中，步骤5为现有常规免疫组化染色的流程方法，具体包括：
步骤一、对所述免疫组化玻片进行PD-L1一抗进行孵育，清洗液清洗，得到第一玻片；
步骤二、对所述第一玻片进行酶标山羊抗鼠/兔二抗聚合物孵育，清洗液清洗，得到第二玻片；
步骤三、对所述第二玻片进行显色液染色，水清洗，得到第三玻片；
步骤四、对所述第三玻片进行复染液复染，水冲洗，得到第四玻片。；
本申请建立消除PD-L1的N-糖基化空间位阻效应的检测方法以提高食管癌等组织中PD-L1检测的敏感性。本申请的PD-L1检测方法运用了高温抗原修复技术联合蛋白质变性剂，结合糖苷内切酶的反应，有效去除PD-L1抗原的蛋白交联和糖苷链位阻效应，显著提升了PD-L1抗原表位的暴露效率，提高其IHC检测的敏感性。
具体的，上述步骤一中抗原修复液进行恰当的热修复为高温高压抗原修复或者微波抗原修复方法。
具体的，本申请检测中使用的水可以为蒸馏水、去离子水、超纯水等常规用水。
与现有常规IHC检测技术比较，本申请具有以下优势：
1、抗原热修复技术联合蛋白质变性和去糖苷化去除N-糖基化位阻效应提高PD-L1检测敏感性；
2、PD-L1的检测方法适用于食管癌，还包括其他肿瘤运用相关免疫抑制剂治疗的适应症，包括不限于胃癌，肝癌，胆管细胞癌，肠癌，和宫颈癌及鼻咽癌，乳腺癌，非小细胞肺癌等其他肿瘤。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例提供的PD-L1检测方法的流程原理示意图，包括在待测的石蜡组织玻片(病理组织上设有PD-L1、PD-L1上设有抗体结合位点和糖链)，玻片依次进行抗原修复,蛋白质变性和去糖苷化处理，使得PD-L1的抗体结合位点暴露，抗体直接与抗体结合位点结合，有效提高检测效果。
图2为检测方法具体步骤示意图，包括：待测的石蜡组织玻片依次进行烤片、脱蜡和水化，接着将石蜡组织玻片进行抗原热修复，得到抗原修复玻片；然后在抗原修复玻片上依次进行蛋白质变性以及糖苷内切酶的去糖苷化消化处理，得到去糖苷化玻片；然后在去糖苷化玻片上进行H2O2(内源性过氧化物酶阻断剂)阻断处理以终止去糖基化反应，得到待测免疫组化玻片；然后在待测免疫组化玻片上依次孵育PD-L1一抗、酶标山羊抗鼠/兔二抗聚合物、DAB显色液和苏木素复染液进行免疫组化染色处理，最后依次进行脱水、透明和封片，得到检测玻片；
图3为本申请实施例提供的PD-L1检测方法的原理示意图，病理组织细胞上表达的PD-L1蛋白上含有N-聚糖，产生空间位阻效应，使得PD-L1抗体难以与PD-L1抗原结合；为对待测的石蜡组织细胞进行去糖苷化处理后，糖链消失，PD-L1的抗原抗体结合位点被充分暴露，再进行PD-L1的免疫组化检测；PD-L与其抗体结合亲和力得到加强，PD-L检测信号和免疫药物治疗相关性均显著提高；
图4为本申请实施例提供的对石蜡组织玻片进行去糖苷化处理/不去糖苷化处理的免疫组化染色后玻片效果对比图；
图5为本申请实施例提供的对病例石蜡组织玻片进行去糖苷化处理/不去糖苷化处理的免疫组化染色后评估TC-P、IC-P、TC-I和IC-I的统计结果柱状图展示，去糖苷化处理后的组织PD-L1蛋白检测阳性的比例明显提升；
图6为本申请实施例提供的对病例石蜡组织玻片进行去糖苷化处理/不去糖苷化处理的PD-L1免疫组化染色后玻片的TC-I的统计结果的病例分布密度展示图；
图7为本申请实施例提供的对病例石蜡组织玻片进行去糖苷化处理/不去糖苷化处理的PD-L1免疫组化染色后玻片的TC-P的统计结果的病例分布密度展示图，部分病例石蜡组织经去糖苷化处理后PD-L1检测效果明显提升；
图8为本申请实施例提供的对病例石蜡组织玻片进行去糖苷化处理/不去糖苷化处理的PD-L1免疫组化染色后玻片的IC-I的统计结果的病例分布密度展示图；
图9为本申请实施例提供的对病例石蜡组织玻片进行去糖苷化处理/不去糖苷化处理的PD-L1免疫组化染色后玻片的IC-P的统计结果的病例分布密度展示图，部分病例石蜡组织经去糖苷化处理后PD-L1检测效果明显提升。
具体实施方式
本申请提供了涉及一种PD-L1检测试剂盒及其检测方法，用于解决现有技术中PD-L1抗原与PD-L1抗体结合亲和力低，检测PD-L1的敏感性低的技术缺陷。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制。
本申请提供的PD-L1的检测方法，具体步骤包括：
步骤1、将待测的石蜡组织玻片依次进行烤片、脱蜡和水化，接着将石蜡组织玻片运用PD-L1检测试剂盒的抗原修复液进行热修复，得到抗原修复玻片；
步骤2、在抗原修复玻片上滴PD-L1检测试剂盒的蛋白质变性缓冲液进行加热孵育反应，清洗液清洗后得到蛋白质变性玻片；
步骤3、在蛋白质变性玻片上滴加PD-L1检测试剂盒的糖苷内切酶工作液进行孵育反应，清洗液清洗后得到去糖苷化玻片；
步骤4、在去糖苷化玻片滴加PD-L1检测试剂盒的内源性过氧化物酶阻断剂以终止去糖基化反应，得到待测免疫组化玻片；
步骤5、采用PD-L1检测试剂盒的PD-L1一抗、酶标山羊抗鼠/兔二抗聚合物、显色液和复染液对免疫组化玻片进行免疫组化染色，然后依次进行脱水、透明和封片，得到检测玻片；
步骤6、评阅所述检测玻片的PD-L1表达情况。
具体的，采用PD-L1检测试剂盒的PD-L1一抗、酶标山羊抗鼠/兔二抗聚合物、显色液和复染液对免疫组化玻片进行免疫组化染色的方法为现有常规免疫组化染色的方法步骤。
本申请实施例待测的石蜡组织玻片的组织为食管癌组织。图4中案例1石蜡组织玻片为64岁男性食管癌pT3N1M0的石蜡组织玻片；图4中案例2石蜡组织玻片为70岁男性食管癌pT4N2M0的石蜡组织玻片。
以下实施例所用的酶标山羊抗鼠/兔二抗聚合物、DAB显色液和苏木素复染液为常规免疫组化染色试剂盒常见成分；酶标山羊抗鼠/兔二抗聚合物具体为HRP辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗小鼠/兔二抗聚合物)。
以下实施例所用PD-L1一抗为DAKO公司的克隆号为22C3的PD-L1单克隆抗体。
实施例1
本申请实施例提供了PD-L1检测试剂盒及其PD-L1的检测方法，具体包括：
1)组织抗原修复，包括：
石蜡组织玻片(87例食管癌的石蜡组织玻片，即连续切片得到一样的两套玻片，一套标记为实验组，另一套标记为对照组)65℃烤片2小时，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，接着将该石蜡组织玻片置于pH 9.0的EDTA抗原修复液中100℃修复2min 30s，冷却至室温，得到抗原修复玻片。
为了说明检测试剂盒及其检测方法的效果，将上述抗原修复玻片分别设置实验组玻片和对照组玻片。
2)实验组玻片依次进行蛋白质变性、去糖基化反应及免疫组织化学染色，包括：
配制蛋白质变性缓冲液(含有体积分数为0.5％的SDS和浓度为50mmol/L的TCEP盐酸盐)；配制糖苷内切酶工作液【3mL糖苷内切酶工作液：300uL PNGase-F(50U/μl)中加入300uL 1％Tween20和300uL酶工作缓冲液(Tris-HCl缓冲盐溶液，pH7.5)，最后加入2100uL的纯水，即纯水补齐至3mL，PNGase-F糖苷内切酶是采用商品化的novoprotein厂家生产的酶】。
具体地实验组玻片(With Deglycosylation)依次进行蛋白质变性和PD-L1的去糖基化反应：抗原修复玻片上进行免疫组化笔画圈，在该抗原修复玻片上滴加蛋白质变性缓冲液，37℃湿盒中孵育3h，使PD-L1的糖苷酶结合位点充分暴露，然后将该玻片浸泡在新鲜PBST洗涤液中，浸泡时间为1min，浸泡次数为4次，得到蛋白质变性玻片；在该蛋白质变性玻片上滴加糖苷内切酶工作液，37℃孵育3h，切割糖链。然后洗涤液中水洗，得到去糖苷化玻片；将该去糖苷化玻片在体积分数为3％H2O2中室温浸泡10min以去除内源性过氧化物酶，将玻片在PBST洗涤液中洗涤，此过程中去糖基化反应随之终止，得到待测免疫组化玻片。该待测免疫组化玻片接着进行常规免疫组化染色：在湿盒中将免疫组化玻片进行PD-L1一抗孵育，37℃孵育50min；将孵育后的玻片浸泡在新鲜PBST洗涤液中，浸泡时间为1min，浸泡次数为4次。随后在湿盒中将该玻片进行HRP辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗小鼠/兔二抗聚合物)孵育，37℃孵育25min。将孵育后的玻片浸泡在新鲜PBST洗涤液中，浸泡时间为1min，浸泡次数为4次。随后进行DAB染色，配置1：100的DAB工作液(现有常规免疫组化染色试剂盒的DAB工作液)，在洗涤后的玻片上滴加DAB工作液反应5min。然后苏木素复染细胞核1min。最后进行脱水、透明和封片，得到检测玻片。
3)对照组玻片(Without Deglycosylation)在组织抗原修复结束后，将抗原修复玻片进行常规的免疫组化流程：将抗原修复玻片在体积分数为3％H2O2室温浸泡10min去除内源性过氧化物酶，免疫组化笔画圈，然后将该玻片浸泡在新鲜PBST洗涤液中，浸泡时间为1min，浸泡次数为4次，得到免疫组化玻片。在湿盒中将免疫组化玻片进行PD-L1一抗孵育，37℃孵育50min。将孵育后的玻片浸泡在新鲜PBST洗涤液中，浸泡时间为1min，浸泡次数为4次。随后在湿盒中将该玻片进行HRP辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗小鼠/兔二抗聚合物)孵育，37℃孵育25min。将孵育后的玻片浸泡在新鲜PBST洗涤液中，浸泡时间为1min，浸泡次数为4次。随后进行DAB染色，配置1：100的DAB工作液(现有常规免疫组化染色试剂盒的DAB工作液)，在洗涤后的玻片上滴加DAB工作液反应5min。然后苏木素复染细胞核1min，最后进行脱水、透明和封片，得到检测玻片。
4)评价分析
将实验组(With Deglycosylation)和对照组(Without Deglycosylation)的玻片采用莱卡Aperio ImageScope扫描染色片，评价分析从四个维度TC-P(肿瘤细胞阳性比例)、IC-P(免疫细胞阳性比例)、TC-I(肿瘤细胞染色强度)、IC-I(免疫细胞染色强度)对照组和实验组的PD-L1免疫组化染色结果进行判读。结果表1、表2、如图4、图5、图6、图7、图8和图9所示。
统计学分析发现食管癌组织中的肿瘤细胞和免疫细胞的表达强度和表达比例都有所增强和提升。食管癌组织中肿瘤细胞及免疫细胞表达强度新方法处理后较常规方法都有不同程度的增强(表1，图5，图6和图8)；肿瘤细胞及免疫细胞的表达率得到显著性的提升(表2，图5，图7和图9)。
表1
Figure BDA0003859396220000091
注：#1:Tumor Cell Intensity；#2:Immune Cell Intensity
表2
Figure BDA0003859396220000092
注：#3:Tumor Cell Percentage；#4:Immune Cell Percentage
与现有常规IHC检测技术比较，本申请检测PD-L1抗原表位的方法中增加了新颖的蛋白质变性及去糖基化步骤，以去除PD-L1的N-糖苷链空间位阻效应的，提升了PD-L1抗原表位的暴露效率，增加了IHC检测的敏感性。
综上所述，本申请提供的检测PD-L1抗原表位的方法可广泛适用于有相关免疫抑制剂治疗的适应症的食管癌、胃癌、肝癌、胆管细胞癌、肠癌、宫颈癌、乳腺癌、非小细胞肺癌及鼻咽癌等其他肿瘤的石蜡组织的PD-L1原位检测。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种PD-L1检测试剂盒，其特征在于，包括：
抗原修复液、蛋白质变性缓冲液、糖苷内切酶工作液、内源性过氧化物酶阻断剂、PD-L1一抗、酶标山羊抗鼠/兔二抗聚合物、显色液和复染液。
2.根据权利要求1所述的PD-L1检测试剂盒，其特征在于，所述蛋白质变性缓冲液包括蛋白变性剂和还原剂。
3.根据权利要求2所述的PD-L1检测试剂盒，其特征在于，所述蛋白变性剂选自十二烷基硫酸钠SDS、十四烷基三甲基溴化铵TTAB、十六烷基三甲基溴化铵CTAB、胆汁酸盐中的一种或多种；所述还原剂选自二硫苏糖醇DTT、三(2-羰基乙基)盐酸盐TCEP和β-巯基乙醇中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的PD-L1检测试剂盒，其特征在于，在所述蛋白质变性缓冲液中，所述十二烷基硫酸钠SDS的体积百分比为0.5％～5％；所述三(2-羰基乙基)盐酸盐TCEP的浓度为40mmol/L～80mmol/L。
5.根据权利要求1所述的PD-L1检测试剂盒，其特征在于，所述糖苷内切酶工作液包括糖苷内切酶、糖苷内切酶缓冲液、细胞膜表面活化剂和水。
6.根据权利要求5所述的PD-L1检测试剂盒，其特征在于，所述糖苷内切酶选自PNGase-A糖苷内切酶、PNGase-F糖苷内切酶、Endo-F糖苷内切酶、Endo-H、O-糖苷酶中的一种或多种；所述细胞膜表面活化剂选自NP-40、Triton X-100、Tween 20和Tween 80中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的PD-L1检测试剂盒，其特征在于，
所述抗原修复液为用于免疫组化的柠檬酸盐pH6.0缓冲液或EDTA抗原修复液；
所述内源性过氧化物酶阻断剂为体积分数为3％的过氧化氢溶液；
所述的酶标山羊抗鼠/兔二抗聚合物选自辣根过氧化物酶HRP标记的山羊抗鼠/兔二抗聚合物，或碱性磷酸酶AP标记的山羊抗鼠/兔二抗聚合物；
所述显色液选自DAB染色液或Fast Red染色液；
所述复染液选自Mayer苏木素或Harris苏木素。
8.权利要求1～7任意一项所述的PD-L1检测试剂盒在病理石蜡组织染色检测PD-L1中的应用。
9.一种PD-L1的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
步骤1、将待测的石蜡组织玻片依次进行烤片、脱蜡和水化，接着将所述石蜡组织玻片运用权利要求1～7任意一项所述的PD-L1检测试剂盒的抗原修复液进行热修复，得到抗原修复玻片；
步骤2、在所述抗原修复玻片上滴加权利要求1～7任意一项所述的PD-L1检测试剂盒的蛋白质变性缓冲液进行加热孵育反应，清洗液清洗后得到蛋白质变性玻片；
步骤3、在所述蛋白质变性玻片上滴加权利要求1～7任意一项所述的PD-L1检测试剂盒的糖苷内切酶工作液进行孵育反应，清洗液清洗后得到去糖苷化玻片；
步骤4、在所述去糖苷化玻片滴加权利要求1～7任意一项所述的PD-L1检测试剂盒的内源性过氧化物酶阻断剂以终止去糖基化反应，得到待测免疫组化玻片；
步骤5、采用权利要求1～7任意一项所述的PD-L1检测试剂盒的PD-L1一抗、酶标山羊抗鼠/兔二抗聚合物、显色液和复染液对所述待测免疫组化玻片进行免疫组化染色，然后依次进行脱水、透明和封片，得到检测玻片；
步骤6、评阅所述检测玻片的PD-L1表达情况。
10.根据权利要求9所述的PD-L1的检测方法，其特征在于，步骤5具体包括：
步骤一、对所述免疫组化玻片进行PD-L1一抗进行孵育，清洗液清洗，得到第一玻片；
步骤二、对所述第一玻片进行酶标山羊抗鼠/兔二抗聚合物孵育，清洗液清洗，得到第二玻片；
步骤三、对所述第二玻片进行显色液染色，水清洗，得到第三玻片；
步骤四、对所述第三玻片进行复染液复染，水冲洗，得到第四玻片。
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