TW202001245A

TW202001245A - 藉由去糖基化偵測免疫檢查點分子

Info

Publication number: TW202001245A
Application number: TW108120002A
Authority: TW
Inventors: 李恆煥; 王盈乃; 明奇洪
Original assignee: 美國德州系統大學評議委員會
Priority date: 2018-06-07
Filing date: 2019-06-10
Publication date: 2020-01-01
Also published as: US20210156866A1; WO2019237012A1

Abstract

本文提供偵測糖基化蛋白質(諸如免疫檢查點蛋白質)之方法。亦提供(諸如)藉由投與免疫檢查點抑制劑治療癌症之方法。

Description

藉由去糖基化偵測免疫檢查點分子

本發明大體上係關於分子生物學領域。更特定言之，其係關於經糖基化之蛋白質(諸如免疫檢查點分子)之偵測。

食品及藥物管理局(FDA)對免疫檢查點抑制劑的批准極大地改變罹患晚期或轉移性非小細胞肺癌(NSCLC)的患者之治療範例。儘管存活率有顯著改善，但大多數NSCLC患者對檢查點抑制劑(特別係針對程式化死亡-1(PD-1)及程式化死亡配體-1(PD-L1)之抗體)無效，及關於在臨床實踐中如何最佳使用此等療法仍存在不確定性。鑑於與治療相關的免疫相關及其他不良作用之風險，需要鑑定蛋白質以預測哪些患者將受益及將不受益(Matthew等人，2017)。

檢查點抑制劑阻斷抑制性T細胞信號傳導，從而導致內源性抗腫瘤免疫應答。PD-1係跨膜免疫調節分子，其負責T細胞活化及外周耐受之負調節。其表現在T細胞、B細胞及自然殺手(NK)細胞上並結合至其配體PD-L1及PD-L2。PD-L1之表現很少發生在正常組織上，但在許多實體惡性病(包括NSCLC)中的抗原呈現細胞(APC)及腫瘤細胞中普遍存在。在腫瘤細胞上存在PD-L1之組成型表現，其在慢性抗原呈現狀態下的致癌過程中發生，及在促發炎性細胞激素(諸如干擾素-γ)存在下在腫瘤部位誘導PD-L1之表現。

在過去的幾年中，研究證實，與晚期NSCLC中的習知化療法相比，檢查點抑制劑的結果有所改善。藉由免疫組織化學(IHC)在腫瘤細胞膜上表現PD-L1已被廣泛研究用於在該環境中與抗PD-1/PD-L1療法一起使用。儘管已廣泛研究了其在難治性環境中作為伴隨或補充診斷分析的作用，但已經出現了用於選擇患者進行前期治療的PD-L1之甚至更重要的作用。藉由針對第一線免疫療法的大量試驗，患者選擇比以往任何時候都更重要。然而，由於缺乏可量測PD-L1表現之準確診斷分析，使用PD-L1作為NSCLC中的預測生物標誌物存在限制。

膜蛋白(包括免疫檢查點分子)之免疫組織化學(IHC)染色係一種為臨床診斷及治療反應提供關鍵資訊之主要方法。靶蛋白之準確IHC染色對於精準醫學及免疫療法至關重要。越來越多的證據顯示，藉由免疫檢查點阻斷(諸如抗PD-L 1療法)進行免疫療法顯著地改善不同癌症類型之患者之生存率及臨床結果。然而，由於PD-L 1 IHC染色讀數與抗PD-L1療法後的患者反應無關，因此沒有可用於抗PD-L 1療法的直接生物標誌物，其中仍不清楚此種差異是否來自某些未知的生物機制或偵測技術問題(Garon等人，2015；Ma等人，2016)。因此，存在對用於量測PD-L1之表現程度以更佳預測對免疫檢查點抑制劑之臨床反應之改進的偵測方法之未滿足需求。

在一個第一實施例中，本發明提供一種用於偵測免疫檢查點蛋白質濃度之體外方法，該方法包括獲得固定的樣本；將該樣本中的蛋白質去糖基化；使該樣本與抗免疫檢查點蛋白質抗體接觸；及量測抗體與該免疫檢查點蛋白質之結合，從而偵測該免疫檢查點蛋白質之濃度。在特定態樣中，個體係人類。

在一些態樣中，固定的樣本係福馬林固定的樣本或多聚甲醛固定的樣本。在某些態樣中，福馬林固定的樣本進一步定義為福馬林固定的石蠟包埋(FFPE)樣本。在一些態樣中，固定的樣本係從唾液、血液、尿液、正常組織或腫瘤組織分離的。在特定態樣中，固定的樣本不包含活細胞。

在某些態樣中，免疫檢查點蛋白質為PD-L1、PD-L2、TIM-3、B7-H3、B7-H4、VISTA、CD40、PD-1、CTLA-4或OX-40L。在一些態樣中，抗免疫檢查點蛋白質抗體為抗PD-L1抗體。

在一些態樣中，去糖基化包括使固定的樣本與去糖基化酵素接觸。在某些態樣中，去糖基化酵素移除N-連接的糖基化。在特定態樣中，去糖基化酵素係肽-N-糖苷酶(PNGase F)。在一些態樣中，將樣本與PNGase F一起培養12-16小時，諸如12、13、14、15或16小時。在特定態樣中，將樣本與PNGase F(濃度為1-10%，諸如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、或10%)一起培養。

在某些態樣中，量測包括進行免疫墨點法、免疫組織化學、ELISA或免疫螢光。在特定態樣中，量測包括進行免疫組織化學。

在額外的態樣中，該方法進一步包括對經鑑定具有比對照樣本增加免疫檢查點蛋白質濃度之個體投與抗癌療法。在一些態樣中，先前已確定個體使用非去糖基化樣本不表現或低表現免疫檢查點蛋白質。在某些態樣中，抗癌療法為化療法、放射療法、基因療法、手術、激素療法、抗血管生成療法或免疫療法。在一些態樣中，抗癌療法為免疫療法。在特定態樣中，免疫療法為免疫檢查點抑制劑。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為PD-L1抑制劑。在一些態樣中，PD-L1抑制劑為阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維單抗(avelumab)、度伐魯單抗(durvalumab)、BMS-936559或CK-301。在某些態樣中，免疫檢查點抑制劑為PD-1抑制劑。在一些態樣中，PD-1抑制劑為帕姆單抗(pembrolizumab)或納武單抗(nivolumab)。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為CTLA-4抑制劑。在特定態樣中，CTLA-4抑制劑為易普利單抗(ipilimumab)或曲美目單抗(tremelimumab)。

在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑係經靜脈內、經腹膜內、經氣管內、經腫瘤內、經肌肉內、經內視鏡、經病灶內、經皮、經皮下、經區域或藉由直接注射或灌注投與。在特定態樣中，免疫檢查點抑制劑係經靜脈內投與的。

在一些態樣中，個體罹患免疫檢查點相關疾病，諸如癌症、糖尿病、神經退化性疾病或風濕性疾病。在特定態樣中，癌症為乳癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、胰臟癌、黑色素瘤、肝細胞癌、腎細胞癌、泌尿上皮細胞癌或霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤。

另一個實施例提供包含免疫檢查點抑制劑之藥物組合物，其係用於根據實施例及其態樣之方法確定具有增加濃度之該免疫檢查點蛋白質之個體中。在一些態樣中，免疫檢查點蛋白質為PD-L1、PD-L2、TIM-3、B7-H3、B7-H4、VISTA、CD40、PD-1、CTLA-4或OX-40L。在某些態樣中，免疫檢查點蛋白質為PD-L1。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為PD-L1抑制劑。在特定態樣中，PD-L1抑制劑為阿特珠單抗、阿維單抗、度伐魯單抗、BMS-936559或CK-301。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為PD-1抑制劑。在某些態樣中，PD-1抑制劑為帕姆單抗或納武單抗。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為CTLA-4抑制劑。在某些態樣中，CTLA-4抑制劑為易普利單抗或曲美目單抗。

另一實施例提供包含有效量之免疫檢查點抑制劑之組合物，其係用於治療個體之癌症，其中根據本發明實施例及其態樣之方法確定該個體具有增加濃度之該免疫檢查點蛋白質。在一些態樣中，免疫檢查點蛋白質為PD-L1、PD-L2、TIM-3、B7-H3、B7-H4、VISTA、CD40、PD-1、CTLA-4或OX-40L。在某些態樣中，免疫檢查點蛋白質為PD-L1。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為PD-L1抑制劑。在特定態樣中，PD-L1抑制劑為阿特珠單抗、阿維單抗、度伐魯單抗、BMS-936559或CK-301。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為PD-1抑制劑。在某些態樣中，PD-1抑制劑為帕姆單抗或納武單抗。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為CTLA-4抑制劑。在某些態樣中，CTLA-4抑制劑為易普利單抗或曲美目單抗。

另一個實施例提供一種預測罹患癌症的個體中對免疫檢查點抑制劑之反應之方法，該方法包括根據本發明實施例及其態樣之方法在從該個體獲得的樣本中量測免疫檢查點蛋白質之濃度，其中若樣本中免疫檢查點蛋白質之表現增加，則預測患者對免疫檢查點抑制劑有有利的反應。

在一些態樣中，免疫檢查點蛋白質為PD-L1、PD-L2、TIM-3、B7-H3、B7-H4、VISTA、CD40、PD-1、CTLA-4或OX-40L。在某些態樣中，免疫檢查點蛋白質為PD-L1。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為PD-L1抑制劑。在一些態樣中，PD-L1抑制劑為阿特珠單抗、阿維單抗、度伐魯單抗、BMS-936559或CK-301。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為PD-1抑制劑。在某些態樣中，PD-1抑制劑為帕姆單抗或納武單抗。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為CTLA-4抑制劑。在某些態樣中，CTLA-4抑制劑為易普利單抗或曲美目單抗。

在某些態樣中，量測包括進行免疫墨點法、免疫組織化學、ELISA或免疫螢光。在一些態樣中，進一步包括對預測具有有利反應的個體投與免疫檢查點抑制劑。在某些態樣中，免疫檢查點抑制劑係經靜脈內、經腹膜內、經氣管內、經腫瘤內、經肌肉內、經內視鏡、經病灶內、經皮、經皮下、經區域或藉由直接注射或灌注投與。

在又另一個實施例中，提供一種治療個體中免疫檢查點相關疾病(諸如癌症、糖尿病、神經退化性疾病或風濕性疾病)之方法，該方法包括對個體投與有效量之免疫檢查點抑制劑，其中根據本發明實施例及其態樣之方法，已確定該個體具有增加濃度之免疫檢查點蛋白質。在一些態樣中，個體係人類。

在一些態樣中，免疫檢查點蛋白質為PD-L1、PD-L2、TIM-3、B7-H3、B7-H4、VISTA、CD40、PD-1、CTLA-4或OX-40L。在某些態樣中，免疫檢查點蛋白質為PD-L1。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為PD-L1抑制劑。在特定態樣中，PD-L1抑制劑為阿特珠單抗、阿維單抗、度伐魯單抗、BMS-936559或CK-301。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為PD-1抑制劑。在特定態樣中，PD-1抑制劑為帕姆單抗或納武單抗。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑為CTLA-4抑制劑。在特定態樣中，CTLA-4抑制劑為易普利單抗或曲美目單抗。

在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑係經靜脈內、經腹膜內、經氣管內、經腫瘤內、經肌肉內、經內視鏡、經病灶內、經皮、經皮下、經區域或藉由直接注射或灌注投與。

在某些態樣中，癌症為乳癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、胰臟癌、黑色素瘤、肝細胞癌、腎細胞癌、泌尿上皮細胞癌或霍奇金淋巴瘤。

在額外的態樣中，該方法進一步包括投與另一抗癌療法。在一些態樣中，該額外的抗癌療法為化療法、放射療法、基因療法、手術、激素療法、抗血管生成療法或免疫療法。在某些態樣中，該額外的抗癌療法係與免疫檢查點抑制劑同時投與。

從以下詳細描述當可明瞭本發明之其他目的、特徵及優點。然而，應明瞭，詳細描述及特定實例雖然指明本發明之較佳實施例，但僅以說明的方式給出，因為熟習此項技術者從本詳細描述當可明瞭在本發明之精神及範圍內的各種變化及修改。

本申請案主張2018年6月7日申請之美國臨時專利申請案第62/681,929號之權益，其全文係以引用的方式併入本文中。

熟知糖基化對膜蛋白之生物發生及功能係重要的。作為表面抗原，已知免疫檢查點蛋白質(例如PD-L1)係糖基化的及聚糖部分對其生物功能係重要的。然而，沒有研究顯示糖基化可中斷抗PD-L1抗體結合至PD-L1，從而導致偵測不一致。因此，沒有報導使用蛋白質去糖基化來改善抗PD-L1抗體結合能力之方法。目前沒有開發用於表面抗原(諸如免疫檢查點分子)之基於抗體之偵測之一般應用之蛋白質去糖基化方法。

在本發明研究中，假設聚糖可對抗PD-L1抗體及PD-L1抗原之間的相互作用起負面作用。本發明研究發現N連接的糖基化移除可改善抗PD-L1偵測及與治療結果間的病理相關性。在三種不同的組織微陣列(TMA)中，與習知方法相比，去糖基化方法顯著增強PD-L1信號。

因此，在某些實施例中，本發明提供藉由移除糖基化以在評估基礎及臨床應用之抗原量期間促進抗體識別來偵測蛋白質(諸如免疫檢查點蛋白質)之方法。然後可藉由基於抗體之偵測方法(諸如免疫墨點法、定量ELISA、免疫螢光(IP)成像及IHC染色)偵測經去糖基化之蛋白質。該方法可應用於研究、醫藥及臨床(例如，診斷)目的。具體而言，本發明方法提供對免疫腫瘤學中精確醫學之患者反應之改進預測。

PD-L1之重糖基化阻礙其藉由PD-L1抗體之偵測並可導致各種生物分析之不准確讀數。在某些態樣中，在本發明方法中藉由酵素消化組織樣本移除PD-L1 N連接的糖基化可用於增加靶蛋白之同質性並定量地促進基於抗體之偵測以更精確地估計PD-L1濃度來防止臨床環境中之假陰性讀數。由於細胞表面蛋白通常在不同層面上進行N連接的糖基化，因此該去糖基化方法可用作在抗體偵測之前降低抗原異質性及消除結構障礙之一般方法，具有改善生物醫學研究及個性化醫療之巨大潛力。I . 定義

如本文所用，就特定組分而言，「基本上不含」在本文中用於意指沒有特定組分被有目的地調配成組合物及/或僅作為污染物或以痕量存在。因此，組合物之任何非所欲污染導致的特定組分的總量遠低於0.05%，較佳低於0.01%。最佳係一種其中用標準分析方法不能偵測到任何量特定組分之組合物。

如本說明書中所用，「一」或「一個」可意指一個或多個。如本文在申請專利範圍中所用，當與詞語「包括」結合使用時，詞語「一」或「一個」可意指一個或多於一個。

術語「或」在申請專利範圍中的使用用於意指「及/或」，除非明確指出僅指替代方案或替代方案係相互排斥的，儘管本發明支持僅指替代方案及「及/或」之定義。如本文所用，「另一種」可意指至少第二種或更多種。

在本申請案全文中，術語「約」用於指示值包括裝置之誤差之固有變化、用於確定值之方法、或研究對象之間存在的變化。

「治療(Treatment/treating)」包括(1)抑制經歷或呈現疾病之病理學或症狀學之個體或患者之疾病(例如，阻止病理學及/或症狀學之進一步發展)，(2)改善正在經歷或呈現疾病之病理學或症狀學之個體或患者之疾病(例如，逆轉病理學及/或症狀學)，及/或(3)影響正在經歷或呈現疾病之病理學或症狀學之個體或患者之疾病之任何可量測的減少。

如本文所用，術語「個體」係指人類或非人類哺乳動物或動物。非人哺乳動物包括家畜動物、伴生動物、實驗室動物及非人類靈長類動物。非人類個體亦特定地包括(但不限於)雞、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、天竺鼠、倉鼠、水貂及兔。在本發明之一些實施例中，個體係患者。如本文所用，「患者」係指在醫生或其他醫療保健工作者照顧下的個體，包括已諮詢過醫生或其他醫療保健工作者、接受醫生或其他醫療保健工作者的建議或接受醫生或其他醫療保健工作者的處方或其他推薦的人。

如術語「有效」在本說明書及/或申請專利範圍中所用的，該術語「有效」意指足以實現所需、所期或所欲的結果。當在用化合物治療患者或個體之上下文中使用時，「有效量」、「治療有效量」或「醫藥有效量」意指當投與個體或患者以治療或預防疾病時的化合物的量係足以實現疾病之此種治療或預防的量。

本文中的術語「抗體」係以最廣泛的含義使用且特定地涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其等展示所需生物活性即可。

如本文所用術語「測定表現程度」意指將基因特異性試劑(諸如探針、引物或抗體)及/或方法應用於樣本(例如個體樣本及/或對照樣本)，以定量地、半定量地或定性地確定或量測一或多種基因的量(例如mRNA的量)。例如，基因程度可藉由許多方法測定，包括(例如)免疫分析，包括(例如)免疫組織化學、ELISA、西方墨點法、免疫沉澱及類似方法，其中生物標誌物偵測劑(諸如抗體，例如，標記的抗體)特異性結合生物標誌物並允許(例如)相對或絕對確定多肽生物標誌物的量、雜交及PCR方案，其中探針或引物或引物組係用於確定核酸生物標誌物的量，包括(例如)基於探針及基於擴增之方法，包括(例如)微陣列分析、RT-PCR(諸如定量RT-PCR)、基因表現之系列分析(SAGE)、北方墨點法、數位分子條形碼技術，例如Nanostring:nCounter™分析及TaqMan定量PCR分析。可應用mRNA偵測及定量之其他方法，諸如在福馬林固定、石蠟包埋(FFPE)之組織樣本或細胞中之mRNA原位雜交。該技術目前由QuantiGene®ViewRNA (Affymetrix)提供，其針對每個mRNA使用探針組，其特異性結合至擴增系統以擴增雜交信號；此等擴增的信號可使用標準螢光顯微鏡或成像系統可視化。該系統例如可偵測及量測異質樣本中之轉錄物濃度；例如，若樣本具有存在於相同的組織切片中之正常細胞及腫瘤細胞。如所述，基於TaqMan探針之基因表現分析(基於PCR)亦可用於量測組織樣本中之基因表現程度，及(例如)用於量測FFPE樣本中之mRNA濃度。簡言之，基於TaqMan探針之分析利用與mRNA標靶特異性雜交之探針。該探針包含猝滅劑染料及連接至各末端之報導子染料(螢光分子)，及僅在與mRNA標靶特異性雜交發生時才發出螢光。在擴增步驟期間，聚合酶酵素之核酸外切酶活性導致猝滅劑及報導子染料從探針分離，並可發生螢光發射。記錄該螢光發射並藉由偵測系統量測信號；此等信號強度用於計算樣本中給定轉錄物之豐度(基因表現)。

如本文所用術語「樣本」包括從患者獲得的任何生物樣本。樣本包括(但不限於)全血、血漿、血清、紅血球、白血球(例如，周邊血液單核細胞)、導管灌洗液、乳頭抽吸物、淋巴(例如，淋巴結之彌散性腫瘤細胞)、骨髓抽吸物、唾液、尿液、糞便(stool)(亦即，糞便(feces))、痰液、支氣管灌洗液、淚液、細針抽吸物(例如，藉由針對標靶(諸如腫瘤)之細針抽吸採集，或係正常細胞(諸如，乳暈的)之隨機取樣)、任何其他體液、組織(例如，腫瘤組織)(諸如腫瘤之生檢(例如，穿刺生檢)或淋巴結(例如，前哨淋巴結生檢))及其細胞提取物。在一些實施例中，樣本係全血或其部分組分(諸如血漿、血清或細胞沉澱)。

如本文所用，「固定」樣本係指已經過保存的樣本。固定可終止任何生化反應並增加組織穩定性。化學固定方法可包括使樣本經受醛(諸如甲醛或戊二醛)或醇(諸如甲醇或乙醇)。

術語「增加」、「升高」、「過度表現(overexpress)」、「過度表現(overexpression)」、「過度表現的」、「上調」或「上調的」可互換地指與來自沒有癌症的患者之生物樣本相比較，在來自罹患癌症的患者的生物樣本(例如，血漿)中以可偵測的更高濃度存在的生物標誌物。該術語包括與來自沒有癌症的患者之樣本相比，來自罹患癌症的患者之樣本中之過度表現，其係歸因於轉錄、轉錄後加工、轉譯、轉譯後加工、細胞定位(例如，細胞器、細胞質、細胞核、細胞表面)及RNA及蛋白質穩定性。過度表現可使用用於偵測mRNA(亦即，RT-PCR、PCR、雜交)或蛋白質(亦即，ELISA、免疫組織化學技術、質譜、Luminex® xMAP技術)之習知技術偵測。與來自沒有癌症的患者之樣本相比，過度表現可係10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在某些情況下，與來自沒有癌症的患者之樣本相比，過度表現係轉錄或翻譯水平的1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或15倍或15倍以上。

如本文所用，術語「偵測」係指觀測來自標記部分的信號以指示樣本中生物標誌物之存在。可使用此項技術中已知的用於偵測特定可偵測部分之任何方法進行偵測。示例性偵測方法包括(但不限於)光譜、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學方法。II . 基於抗體之偵測方法

本發明之某些實施例係關於結合、純化、移除、定量或其他常用於偵測糖基化蛋白質(諸如具有N-連接糖基化之蛋白質)之免疫偵測方法。該分子可係免疫檢查點分子(諸如PD-L1)或經糖基化之任何其他蛋白質(諸如膜蛋白質)。

在一些態樣中，本發明方法包括使包含蛋白質之樣本去糖基化，以改善經糖基化之蛋白質之偵測。可透過酵素處理樣本進行去糖基化，諸如利用酵素肽-N-糖苷酶(PNGase F；NEB P0704)。

預期任何基於抗體之偵測方法均可與本發明方法一起使用。例如，本發明方法可用於偵測免疫檢查點分子，諸如藉由免疫墨點法、定量ELISA、免疫螢光(IF)成像、及IHC染色。各種適用的免疫偵測方法之步驟已在科學文獻中描述，諸如(例如)Nakamura等人(1987)，其已以引用的方式併入本文中。

如本文所用，樣本可指整個生物體或其組織、細胞或組成部分之子組。樣本亦可指從整個生物體或其組織、細胞或組成部分之子組或其部份或小部分製備的均質物、溶胞物或提取物。樣本之非限制性實例包括尿液、血液、腦脊髓液(CSF)、胸膜液、痰液及腹膜液、膀胱沖洗液、分泌物、口腔清洗液、組織樣本、觸印抹片或細針抽吸物。在一些實施例中，樣本可係細胞系、細胞培養物或細胞懸浮液。較佳地，樣本對應於衍生該樣本的親本細胞中存在的表現產物的量及類型。樣本可係來自人類或非人類個體。在一些實施例中，用於進行基於抗體之偵測的樣本係福馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣本。

樣本可包括體液及組織樣本，其包括(但不限於)血液、組織生檢、脊髓液、腦膜液、尿液、肺泡液。對於彼等沒有天然存在單層細胞之組織樣本，可藉由熟習此項技術者已知的標準技術解離細胞。此等技術包括(但不限於)組織之胰蛋白酶、膠原酶或解離蛋白酶(dispase)處理。

通常，使用標準技術，從樣本採集細胞。例如，細胞之採集係由生物樣本(諸如尿液)離心，取集結之細胞再懸浮。通常，將細胞再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。離心細胞懸浮液以獲得細胞集結塊後，可將細胞固定於(例如)酸性醇溶液、酸性丙酮溶液或醛類(諸如甲醛、多聚甲醛及戊二醛)中。例如，分別包含3:1比的甲醇及冰乙酸之固定劑可用作固定劑。亦可使用中性緩衝福馬林溶液，並在磷酸鈉水溶液中包含約1%至10%之37-40%甲醛。包含細胞之載玻片可藉由移除大部分固定劑，使濃縮的細胞僅懸浮在一部分溶液中來製備。

經去糖基化之蛋白質之表現程度可藉由ELISA、西方墨點法、質譜、毛細管免疫偵測方法、等電聚焦、免疫沉澱方法或免疫組織化學來量測。包括偵測之其他方法包括基於抗體之光學成像、超音波成像、MRI成像、PET成像及光療法。

一般而言，免疫結合方法包括獲得懷疑包含經糖基化之蛋白質、多肽或肽之樣本，使蛋白質去糖基化，及在有效地允許形成免疫錯合物的條件下使樣本與第一抗體接觸。抗體可連接至諸如呈柱基質形式之固體支持物，及懷疑包含經去糖基化之蛋白質之樣本可應用於經固定化之抗體。將不想要的組分從柱洗掉，使抗原免疫複合至經固定之抗體，然後藉由從柱移除蛋白質來收集。

在有效且維持一段足以允許形成免疫錯合物(初級免疫錯合物)之時間之條件下使所選樣本與抗體接觸一般係將抗體組合物簡單地加入至樣本並將混合物培養一段足夠長使得抗體與存在的經去糖基化之抗原形成免疫錯合物(亦即，結合至存在的經去糖基化之抗原)之時間的問題。在此之後，一般會洗滌樣本-抗體組合物，諸如組織切片、ELISA板、墨點法或西方墨點法以移除任何非特異性結合的抗體種類，僅允許彼等特異性結合在初級免疫錯合物內之抗體被偵測到。

一般而言，此項技術中熟知免疫錯合物形成之偵測及可藉由應用多種方法來實現。此等方法一般基於標記或標誌物(諸如彼等放射性、螢光、生物或酵素標籤中之任何者)之偵測。關於使用此種標籤之美國專利包括3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149及4,366,241，該等案各以引用的方式併入本文中。當然，如此項技術中已知的，技術人員透過使用二級結合配體(諸如第二抗體)或生物素/抗生物素蛋白配體結合排列而發現額外的優點。

用於偵測中之抗體本身可連接至可偵測之標記，其中技術人員可然後簡單地偵測該標記，從而允許確定組合物中初級免疫錯合物的量。或者，初級免疫錯合物內結合的第一抗體可藉由對抗體具有結合親和力之第二結合配體偵測。在此等情況下，第二結合配體可連接至可偵測之標記。第二結合配體本身通常係抗體，因此其可稱為「二級抗體」。在有效且在一段足以允許形成二級免疫錯合物的時間內之條件下，使初級免疫錯合物與經標記之二級結合配體或抗體接觸。然後一般洗滌二級免疫錯合物以移除任何非特異性結合之經標記之二級抗體或配體，及然後偵測二級免疫錯合物中的剩餘標記。

其他方法包括藉由兩步法偵測初級免疫錯合物。如上所述，使用對抗體具有結合親和力的第二結合配體(諸如抗體)形成二級免疫錯合物。洗滌後，再次在有效且在一段足以允許形成免疫錯合物(三級免疫錯合物)的時間內之條件下，使二級免疫錯合物與對第二抗體具有結合親和力的第三結合配體或抗體接觸。第三配體或抗體係連接至可偵測之標記，允許偵測由此形成的三級免疫錯合物。若需要此，則該系統可提供信號放大。A. 免疫組織化學分析 (IHC)

本發明方法可與製備用於藉由免疫組織化學分析(IHC)研究的新鮮冷凍且福馬林固定之石蠟包埋之組織塊結合使用。從此等顆粒樣品製備組織塊之方法已成功地用於各種預後因素的先前IHC研究中，且係熟習此項技術者熟知的(Brown等人，1990；Abbondanzo等人，1990；Allred等人，1990)。

簡言之，冷凍切片可藉由在室溫下在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中以小塑料膠囊再水化50 ng冷凍「粉化」組織；藉由離心造粒顆粒；將其等再懸浮於黏性包埋培養基(OCT)中；倒置膠囊並藉由離心再次造粒；在-70℃異戊烷中快速冷凍；切割塑料膠囊並取出冷凍的組織圓筒；將組織圓筒固定於低溫恆溫切片機夾頭上；並切割25-50個連續切片來製備。

永久性切片可藉由類似方法製備，該類似方法涉及在塑料微量離心管中再水化50 mg樣本；造粒；再懸浮於10%福馬林中以進行4小時的固定；洗滌/造粒；再懸浮於溫熱的2.5%瓊脂中；造粒；在冰水中冷卻以硬化瓊脂；從管取出組織/瓊脂塊；滲透並將塊嵌入石蠟中；並切割多達50個連續永久性切片。

在一種示例性IHC方法中，載玻片可在40-45℃下於烘箱中乾燥過夜及然後在58-65℃下培養1-3小時。然後可將載玻片用二甲苯及乙醇脫蠟並在蒸餾的H₂ O中水合。可在10 mM檸檬酸(pH 6.0)中於微波中進行抗原修復10 min (2 min 1000W，8 min 200W)，在室溫下冷卻降溫60 min，並用PBS洗滌兩次。然後可將載玻片在室溫下於3% H₂ O₂ /甲醇中封閉10 min並用PBS洗滌三次。將正常馬血清或山羊血清(含在PBS中之10%正常血清)在室溫下於潮濕室中施用30 min並擦除正常血清。將初級抗體在4℃下於潮濕室中施用過夜及然後用PBS洗滌三次。將二級抗體在室溫下於潮濕室中施用1小時及然後用PBS洗滌三次。將過氧化物酶共軛抗生物素蛋白生物素錯合物在室溫下於潮濕室中施用1小時及然後用PBS洗滌三次。施用AEC色原受質5-10分鐘並用蒸餾的H₂ O洗滌三次。然後將樣本用Mayer蘇木精複染30秒並用蒸餾的H₂ O洗滌三次。最後，載玻片安裝有水容器(aqua-mount) (Lerner Laboratories Inc)。B. 酶聯免疫吸附分析 (ELISA)

酶聯免疫吸附分析或ELISA可用於量測複數種生物標誌物之差異表現。ELISA分析有許多變化。ELISA測試可經格式化以用於分析物之直接、間接、競爭或夾心偵測。全部均基於將抗原或抗體固定在固體表面(一般係微量滴定板)上。最初的ELISA方法包括製備包含所關注生物標誌物蛋白之樣本，用樣本塗佈微量滴定板的孔，用識別特定抗原之初級抗體培養每個孔，洗去未結合的抗體，及然後偵測抗體-抗原錯合物。可直接偵測抗體-抗體錯合物。將初級抗體共軛至偵測系統，諸如產生可偵測之產物之酵素。可間接地偵測抗體-抗體錯合物。例如，如上所述，初級抗體係藉由共軛至偵測系統之二級抗體偵測。然後掃描微量滴定板並可使用此項技術中已知的方法將原始強度數據轉換成表現值。單探針及多探針套組可從商業供應商(例如，Meso Scale Discovery (MSD))獲得。

在一種ELISA方法中，將第一或捕獲結合劑(諸如特異性結合所關注生物標誌物之抗體)固定於適宜固相受質或載劑上。然後使測試生物樣本與捕獲抗體接觸並培養一段所需的時間。在洗滌以移除未結合的物質後，然後使用結合至生物標誌物上的不同的非重疊抗原決定基之第二偵測抗體來偵測多肽生物標誌物與捕獲抗體之結合。偵測抗體較佳直接或間接共軛至可偵測之部分。可用於此類方法之可偵測之部分之實例包括(但不限於)化學發光劑及發光劑；螢光團，諸如螢光素、羅丹明(rhodamine)及曙紅；放射性同位素；比色劑；及酵素-受質標記，諸如生物素。

在另一個實施例中，ELISA係競爭性結合分析，其中使用經標記之生物標誌物代替經標記之偵測抗體，及經標記之生物標誌物及存在於測試樣本中之任何未標記之生物標誌物競爭結合至捕獲抗體。結合至捕獲抗體之生物標誌物的量可基於偵測到的經標記之生物標誌物之比例來確定。

在某些實施例中，生物標誌物或結合至生物標誌物之抗體係經可偵測之部分直接或間接標記。可偵測試劑之作用係藉由允許可視化藉由結合劑與蛋白質標誌物(或其片段)結合形成的錯合物來促進診斷方法之偵測步驟。可選擇可偵測試劑，使得其產生可量測的信號及其強度與存在於所分析樣本中的蛋白質標誌物的量相關(較佳成比例)。用於標記生物分子(諸如多肽及抗體)之方法係此項技術中熟知的。可在本發明之實踐中使用多種可偵測試劑中之任何一者。適宜可偵測試劑包括(但不限於)：各種配體、放射性核素、螢光染料、化學發光劑、微粒(諸如(例如)量子點、奈米晶體、磷光體及類似物)、光敏劑、酵素(諸如，彼等用於ELISA中之酵素，亦即，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、比色標記、磁性標記及生物素、洋地黃毒苷或可獲得抗血清或單株抗體之其他半抗原及蛋白質。

抗體可附著於用於成像及診斷各種患病器官、組織或細胞類型之成像劑。抗體可經螢光團或放射性示蹤劑標記或共軛，用作成像劑。許多適宜成像劑係此項技術中已知的，使用可使用比色標誌物(諸如(但不限於)脲酶、鹼性磷酸酶、(辣根)氫過氧化物酶及葡萄糖氧化酶)偵測存在的金屬螯合錯合物、放射性同位素、螢光標誌物或酵素使成像劑附著於蛋白質或肽之方法係此項技術中已知的。在一些實施例中，成像共軛物亦將經放射性同位素雙重標記以透過核方法組合成像且製成獨特的環狀結構並針對結合親和力及藥物動力學進行最佳化。此類藥劑可藉由熟習此項技術者已知的許多方法投與，包括(但不限於)口服、吸入、皮下(sub-q)、靜脈內(I.V.)、腹膜內(I.P.)、肌肉內(I.M.)、或鞘內注射、或如下文更詳細描述的。

在一些態樣中，成像劑為發色團，諸如螢光團。適用於本發明之示例性螢光團包括羅丹明、對甲胺基酚(rhodol)、螢光素、硫基螢光素、胺基螢光素、羧基螢光素、氯螢光素、甲基螢光素、磺基螢光素、胺基對甲胺基酚、羧基對甲胺基酚、氯對甲胺基酚、甲基對甲胺基酚、磺基對甲胺基酚；胺基羅丹明、羧基羅丹明、氯羅丹明、甲基羅丹明、磺基羅丹明及硫基羅丹明；花青素(cyanine)、吲哚羰花青、氧雜羰花青、硫雜羰花青、部花青、花青2、花青3、花青3.5、花青5、花青5.5、花青7、噁二唑衍生物、吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑、苯并噁二唑、吡崙(pyren)衍生物、級聯藍(cascade blue)、噁嗪衍生物、尼羅紅(Nile red)、尼羅藍、甲酚紫、噁嗪170、吖啶衍生物、原黃素(pro flavin)、吖啶橙、吖啶黃、芳基甲鹼(arylmethine)衍生物、金胺、結晶紫、孔雀石綠、四吡咯衍生物、卟吩、酞菁(phtalocyanine)及膽紅素；1-二甲基胺基萘基-5-磺酸鹽、1-苯胺基-8-萘磺酸鹽、2-對-甲苯胺基-6-萘磺酸鹽、3-苯基-7-異氰酸基香豆素、N-(對-(2-苯并噁唑基)苯基)馬來醯亞胺、二苯乙烯、芘、6-FAM (螢光素)、6-FAM (NHS酯)、螢光素dT、HEX、JOE (NHS酯)、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMA™ (NHS酯)、TEX 615、ATTO™ 488、ATTO™ 532、ATTO™ 550、ATTO™ 565、ATTO™ RholOl、ATTO™ 590、ATTO™ 633、ATTO™ 647N、TYE™ 563、TYE™ 665及TYE™ 705。在特定態樣中，發色團為TAMRA。

可偵測之部分可包括(但不限於)氟脫氧葡萄糖(FDG)；2'-氟-2'-脫氧-1β-D-阿拉伯呋喃糖基-5-乙基尿嘧啶(FEAU)；5-[¹²³ I]-2'-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶；5-[¹²⁴ I]-2'-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶；5-[¹³¹ I]-2'-氟-5-碘-1β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶、5-[¹⁸ F]-2'-氟-5-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶；2-[¹¹ I]-及5-([¹¹ C]-甲基)-2'-氟-5-甲基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶；2-[¹¹ C]-2'-氟-5-乙基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶；5-([¹¹ C]-乙基)-2'-氟-5-乙基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶；5-(2-[¹⁸ F]-乙基)-2'-氟-5-(2-氟乙基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶、5-[¹²³ I]-2'-氟-5-碘乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶；5-[¹²⁴ I]-2'-氟-5-碘乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶；5-[¹³¹ I]-2'-氟-5-碘乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶；5-[¹²³ I]-2'-氟-5-碘-1-β-D-核糖呋喃糖基尿嘧啶；5-[¹²⁴ I]-2'-氟-5-碘-1-β-D-核糖呋喃糖基尿嘧啶；5-[¹³¹ I]-2'-氟-5-碘-1-β-D-核糖呋喃糖基尿嘧啶；5-[¹²³ I]-2'-氟-5-碘乙烯基-1-β-D-核糖呋喃糖基尿嘧啶；5-[¹²⁴ I]-2'-氟-5-碘乙烯基-1-β-D-核糖呋喃糖基尿嘧啶；5-[¹³¹ I]-2'-氟-5-碘乙烯基-1-β-D-核糖呋喃糖基尿嘧啶；或9-4-[¹⁸ F]氟-3-(羥基甲基)丁基]鳥嘌呤。

在一些態樣中，成像劑為放射性核素。適宜放射性核素標記為Tc、In、Ga、Cu、F、Lu、Y、Bi、Ac及其他放射性核素同位素。特定言之，放射性核素係選自包括¹¹¹ In、^99m Tc、^94m Tc、⁶⁷ Ga、⁶⁶ Ga、⁶⁸ Ga、⁵² Fe、⁶⁹ Er、⁷² As、⁹⁷ Ru、²⁰³ Pb、⁶² Cu、⁶⁴ Cu、⁶⁷ Cu、¹⁸⁶ Re、¹⁸⁸ Re、⁸⁶ Y、⁹⁰ Y、⁵¹ Cr、^52m Mn、¹⁵⁷ Gd、¹⁷⁷ Lu、¹⁶¹ Tb、¹⁶⁹ Yb、¹⁷⁵ Yb、¹⁰⁵ Rh、¹⁶⁶ Dy、¹⁶⁶ Ho、¹⁵³ Sm、¹⁴⁹ Pm、¹⁵¹ Pm、¹⁷² Tm、¹²¹ Sn、^177m Sn、²¹³ Bi、¹⁴² Pr、¹⁴³ Pr、¹⁹⁸ Au、¹⁹⁹ Au、¹⁸ F、¹²³ I、¹²⁴ I、¹³¹ I、⁷⁵ Br、⁷⁶ Br、⁷⁷ Br及⁸² Br等之群。此等放射性核素係陽離子的並可透過共軛物之螯合基團與螯合劑錯合形成經標記之組合物。

偵測及/或定量可偵測之標記或信號產生材料之方法取決於標記之性質。藉由適宜酵素催化之反應之產物可係(但不限於)螢光、發光或放射性的或其等可吸收可見光或紫外光。適於偵測此等可偵測之標記之偵測器之實例包括(但不限於) x射線膠片、放射性計數器、閃爍計數器、分光光度計、比色計、螢光計、發光計及密度計。任何偵測方法可以允許任何適宜製備、處理及反應之分析之任何形式進行。此可係(例如)在多孔分析板(例如，96孔或386孔)中或使用任何適宜陣列或微陣列。各種藥劑之儲備溶液可以手動或機器人進行，及所有後續的移液、稀釋、混合、分佈、洗滌、培養、樣本讀數、數據收集及分析均可使用市售的分析軟體、機器人及能夠偵測可偵測之標記之偵測儀器自動完成。成像可藉由光學成像、超音波、PET、SPECT、MRI或光療法進行。

在某些實施例中，抗原特異性抗體可固定在載劑或支持物(例如，珠子、磁性顆粒、膠乳顆粒、微量滴定板孔、比色管或其他反應容器)上。適宜載劑或支持物材料之實例包括瓊脂糖、纖維素、硝基纖維素、葡聚糖、Sephadex®、Sepharose®、脂質體、羧甲基纖維素、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、輝長岩、濾紙、磁鐵礦、離子交換樹脂、塑料薄膜、塑料管、玻璃、聚胺-甲基乙烯基醚-馬來酸共聚物、胺基酸共聚物、乙烯-馬來酸共聚物、尼龍、絲及類似物。結合劑可使用對第一結合劑具有特異性之第二結合劑間接固定(例如，可使用塗佈在載劑或支持物上之羊抗小鼠IgG Fc片段特異性抗體固定對蛋白質標誌物具有特異性之小鼠抗體)。

在其他態樣中，經去糖基化之蛋白質可藉由多重ELISA以同時偵測經去糖基化之蛋白質中之兩者或三者來偵測。例如，多重ELISA可包含具有捕獲抗體點樣於子陣列中之抗體陣列，其上培養樣本，洗掉非特異性蛋白質，並將陣列與生物素化偵測抗體之混合物培養，然後與鏈黴親和素共軛螢光團培養，該鏈黴親和素共軛螢光團係藉由螢光雷射掃描儀(例如，Quantibody Multiplex ELISA Array，RayBiotech)可視化。

樣本中幾種不同的經去糖基化之蛋白質之存在可使用多重分析法(諸如多重ELISA)同時偵測測試。多重分析提供高通量，需要少量樣本及在寬動態濃度範圍內偵測不同蛋白質之能力之優點。在某些實施例中，此類方法使用陣列，其中對多種經去糖基化之蛋白質具有特異性之多種結合劑(例如，捕獲抗體)固定在基板(諸如膜)上，其中每種捕獲抗體係定位於基板上的特定、預定位置。使用此種陣列進行分析之方法包括彼等描述於(例如)美國專利公開案第US2010/0093557A1號及第US2010/0190656A1號中之方法，其揭示內容以引用的方式明確併入本文中。

基於利用(例如)流式細胞術、化學發光或電子化學發光技術之幾種不同形式之多重陣列係此項技術中熟知的。流式細胞術多重陣列(亦稱為基於珠子之多重陣列)包括來自BD Biosciences (Bedford，Mass.)之Cytometric Bead Array (CBA)系統及來自Luminex Corp. (Austin，Tex.)之多分析物圖譜分析(xMAP®)技術，其兩者均採用可藉由流式細胞術區分的珠子組。每個珠子組塗佈有特異性捕獲抗體。螢光或鏈黴親和素標記偵測抗體結合至珠子組上形成的特異性捕獲抗體-蛋白質錯合物。多種經去糖基化之蛋白質可藉由珠子組之差異識別及量測，其中發色或螢光發射係使用流式細胞術分析偵測。

在另一種形式中，來自Quansys Biosciences (Logan，UT)之多重ELISA在96孔微量滴定板上的同一孔中的多個點處塗佈多種特異性捕獲抗體(一個點處一種抗體)。然後使用化學發光技術偵測板上對應點處的多個經去糖基化之蛋白質。

抗體微陣列亦可用於量測複數種經去糖基化之蛋白質之差異表現。為此，排列複數種抗體並共價附著於微陣列或生物晶片之表面。包含所關注蛋白質之蛋白質提取物一般用螢光染料或生物素標記。將經標記之蛋白質與抗體微陣列一起培養。在洗滌以移除未結合的蛋白質後，掃描微陣列。可使用此項技術中已知的方法將原始螢光強度數據轉換成表現值。III . 治療方法

本文進一步提供用於治療或延遲個體癌症進展之方法，包括對個體投與有效量之抗癌療法諸如免疫檢查點抑制劑(例如，下文所述)，諸如對藉由本文所提供的方法確定為蛋白質(諸如免疫檢查點蛋白質(例如，PD-L1))之表現增加的個體投與。

癌症可係乳癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、腦癌細胞、肝癌、宮頸癌、結腸癌、腎癌、皮膚癌、頭頸癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、淋巴癌、胃癌、胰臟癌、睾丸癌、腸癌、淋巴瘤或白血病。在一些實施例中，個體係哺乳動物，例如，靈長類動物，較佳高等靈長類動物，例如，人類(例如，罹患或處在罹患本文所述疾病風險中之患者)。此外，可用本發明方法治療其他免疫檢查點相關疾病，諸如糖尿病、神經退化性疾病或風濕性疾病。

在一個實施例中，個體需要增強免疫反應。在某些實施例中，個體係免疫受損的或處在免疫受損之風險中。例如，個體正在經歷或已經歷化療治療及/或放射療法。或者，或組合地，個體係由於感染而免疫受損的或處在由於感染而免疫受損之風險中。A. 醫藥組合物

本文亦提供醫藥組合物及調配物，其包括抗癌療法(諸如免疫檢查點抑制劑)及醫藥上可接受之載劑以用於確定具有增加的蛋白質(諸如免疫檢查點蛋白質)之表現的個體。

本文所述的醫藥組合物及調配物可藉由將具有所需純度的活性成分(諸如抗體或多肽)與一或多種可選的醫藥上可接受之載劑混合來製備(Remington's Pharmaceutical Sciences 第22版，2012)，呈凍乾調配物或水溶液之形式。醫藥上可接受之載劑在所用的劑量及濃度下一般對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙銨；氯化苄二甲烴銨；氯化本索寧(benzethonium chloride)；苯酚、丁基或芐基醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子表面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX^® ，Baxter International, Inc.)。B. 抗癌療法

在某些實施例中，本發明實施例之組合物及方法涉及抗癌療法，其可與至少一種額外療法組合投與。抗癌療法及/或額外療法可係放射療法、手術(例如，乳房腫瘤切除術及乳房切除術)、化療法、基因療法、DNA療法、病毒療法、RNA療法、免疫療法、骨髓移植、奈米療法、單株抗體療法、或前述之組合。療法可呈輔助或新輔助療法之形式。

在一些實施例中，抗癌療法及/或額外療法係投與小分子酶促抑制劑或抗轉移劑。在一些實施例中，抗癌療法及/或額外療法係投與副作用限制劑(例如，旨在減輕治療之副作用之發生及/或嚴重性之藥劑，諸如抗噁心劑等)。在一些實施例中，抗癌療法及/或額外療法係放射療法。在一些實施例中，抗癌療法及/或額外療法係手術。在一些實施例中，抗癌療法及/或額外療法係放射療法及手術之組合。在一些實施例中，抗癌療法及/或額外療法係γ輻射。在一些實施例中，抗癌療法及/或額外療法係靶向PBK/AKT/mTOR途徑、HSP90抑制劑、微管蛋白抑制劑、凋亡抑制劑及/或化學預防劑之療法。抗癌療法及/或額外療法可係此項技術中已知的化療劑中之一者或多者。

抗癌療法可在相對於另一癌症療法(諸如免疫檢查點療法)之前、期間、之後或以各種組合投與。投藥之時間間隔可從同時至幾分鐘至幾天至幾週。在將第一療法與另一治療劑分開地提供給患者之實施例中，技術人員一般確保在每次遞送的時間之間相當長的一段時間沒有到期，使得此兩種化合物對患者仍然能夠發揮有利的組合效果。在此種情況下，預期技術人員可在彼此約12至24或72 h內，及更特定言之，彼此在約6至12 h內為患者提供抗癌療法及額外療法。在一些情況下，可能需要將治療時間顯著延長，在該情況下每次投藥間隔幾天(2、3、4、5、6或7)至幾週(1、2、3、4、5、6、7或8)失效。

可採用各種組合。對於以下實例，第一抗癌療法(諸如免疫檢查點抑制劑)係「A」及另一抗癌療法係「B」：

投與患者本發明實施例之任何化合物或療法將遵循此等化合物之投與之一般方案，考慮到藥劑之毒性(若有的話)。因此，在一些實施例中，存在監測可歸因於組合療法之毒性之步驟。1. 化療法

根據本發明實施例可使用多種化療劑。術語「化療法」係指使用藥物治療癌症。「化療劑」用於表示在癌症之治療中投與的化合物或組合物。此類藥劑或藥物根據其在細胞內的活性模式分類，例如，其等是否及在何種階段影響細胞週期。或者，藥劑可基於其直接交聯DNA，嵌入DNA中，或藉由影響核酸合成誘導染色體及有絲分裂異常之能力來表徵。

化療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替哌(thiotepa)及環磷醯胺；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑達帕(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美托達帕(meturedopa)及尤裏達帕(uredopa)；伸乙亞胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亞乙基磷醯胺、三亞乙基硫基磷醯胺及三羥甲蜜胺；乙醯素(特別係布拉它辛(bullatacin)及布拉它辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(包括合成類似物拓樸替康(topotecan))；苔蘚抑素(bryostatin)；卡裏斯他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；克利特非辛(cryptophycin)(特別係克利特非辛1及克利特非辛8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包括合成類似物、KW-2189及CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；肉質網囊素(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷醯胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、甲氮芥氧化物鹽酸鹽、美法崙(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)及尿嘧啶芥末；亞硝基脲類，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯莫斯汀(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷尼莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如，卡奇黴素(calicheamicin)，特別係卡奇黴素γlI及卡奇黴素ωI1)；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸鹽，諸如氯膦酸鹽(氯膦酸鹽)；埃斯培拉黴素(esperamicin)；新抑癌素(neocarzinostatin)發色團及相關的色素蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素、安曲黴素(authrarnycin)、氮雜絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正亮胺酸、多柔比星(包括嗎啉基多柔比星、氰基嗎啉基多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星及脫氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西罗黴素(marcellomycin)、絲裂黴素，諸如絲裂黴素C、黴酚酸、諾加黴素(nogalarnycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、波福黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)及佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺蝶呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、蝶羅呤(pteropterin)及曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)及硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如阿西他濱(ancitabine)、阿札胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)及氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈膜斯酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)及睾內酯(testolactone)；抗腎上腺素，諸如米托坦(mitotane)及曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝斯他布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；類美登素(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidanmol)；萘托厄蒽(nitraerine)；噴托他丁(pentostatin)；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多醣錯合物；雷佐生(razoxane)；根黴素；西佐喃(sizofiran)；螺鍺胺(spirogermanium)；細交鍵孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙基胺；單端孢黴烯族毒素(trichothecenes)(特別係T-2毒素、韋拉卡瑞A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；尿烷；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加塞特辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(「Ara-C」)；環磷醯胺；類紫杉醇(taxoid)，例如，太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多西紫杉醇吉西他濱(docetaxel gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑配位配合物，諸如順鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin)及卡鉑；長春花鹼(vinblastine)；鉑；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；減瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鈉(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如，CPT-11)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；卡鉑、丙卡巴肼、普里克黴素(plicomycin)、吉西他濱(gemcitabien)、長春瑞濱(navelbine)、法呢基(farnesyl)蛋白質轉移酶抑制劑、反鉑(transplatinum)及任何上述之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。 2. 放射療法

導致DNA損傷並已廣泛使用的其他因素包括通常稱為γ射線、X射線及/或定向遞送放射性同位素至腫瘤細胞的。亦考慮DNA損傷因子之其他形式，諸如微波、質子束輻射及UV輻射。所有此等因素最有可能影響DNA、DNA之前驅物、DNA之複製及修復、及染色體之組裝及維持之廣泛損傷。X射線之劑量範圍從50至200倫琴之日劑量(延長的時間段(3至4週))至2000至6000倫琴之單劑量。放射性同位素之劑量範圍變化很大，並取決於同位素之半衰期、所發射輻射之強度及類型、及腫瘤細胞之攝取。3. 免疫療法

在癌症治療之背景下，免疫治療劑一般依賴於使用免疫效應細胞及分子來靶向並破壞癌細胞。利妥昔單抗(Rituximab)(RITUXAN®)係此一實例。免疫效應物可係(例如)對腫瘤細胞表面上的某些標誌物具有特異性之抗體。單獨的抗體可作為療法之效應物或其可募集其他細胞以實際影響細胞殺死。抗體亦可共軛至藥物或毒素(化療劑、放射性核素、蓖麻毒素A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)並用作靶向劑。或者，效應物可係攜帶表面分子之淋巴細胞，該表面分子直接或間接地與腫瘤細胞標靶相互作用。各種效應細胞包括細胞毒性T細胞及NK細胞。

抗體-藥物共軛物(ADC)包含共價連接至細胞殺死藥物之單株抗體(MAb)。該方法將MAb抗其抗原標靶之高特異性與高效細胞毒性藥物結合，產生「武裝」MAb，其將有效負載(藥物)遞送至具有富含抗原濃度之腫瘤細胞。靶向遞送藥物亦使其在正常組織中之暴露最小化，導致毒性降低及治療指數改善。FDA批准兩種ADC藥物2011年的ADCETRIS®(布妥昔單抗維多汀(brentuximab vedotin))及2013年的KADCYLA®(曲妥珠單抗依坦辛(trastuzumab emtansine)或T-DM1)驗證該方法。目前有超過30種ADC候選藥物處於癌症治療臨床試驗之不同階段。隨著抗體工程化及連接子-有效負載最佳化變得越來越成熟，新ADC之發現及開發越來越依賴於適於該方法之新標靶之鑑定及驗證及靶向MAb之產生。ADC標靶之兩個標準係腫瘤細胞中之上調/高程度表現及穩健之內化。

在免疫療法之一個態樣中，腫瘤細胞必須帶有易於靶向(亦即，不存在於大多數其他細胞上)的一些標誌物。存在許多腫瘤標誌物並此等中之任一者均適於在本發明實施例之背景下靶向。常見的腫瘤標誌物包括CD20、癌胚抗原、酪胺酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液醯基路易士(Lewis)抗原、MucA、MucB、PLAP、層黏連蛋白受體、erb B及p155。免疫療法之另一個態樣係將抗癌作用與免疫刺激作用組合。亦存在免疫刺激分子，包括：細胞激素(諸如IL-2、IL-4、IL-12)、GM-CSF、γ-IFN、趨化激素(諸如MIP-1、MCP-1、IL-8)及生長因子(諸如FLT3配體)。

免疫療法之實例包括免疫佐劑，例如，牛分枝桿菌、惡性瘧原蟲、二硝基氯苯及芳族化合物；細胞激素療法，例如，干擾素α、β及γ、IL-1、GM-CSF及TNF；基因療法，例如，TNF、IL-1、IL-2及p53；及單株抗體，例如，抗CD20、抗神經節苷脂GM2及抗p185。預期一或多種抗癌療法可與本文所述的抗體療法一起使用。

在一些實施例中，免疫療法可係免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點調高信號(例如，共刺激分子)或調低信號。可藉由免疫檢查點阻斷靶向之抑制性免疫檢查點包括腺苷A2A受體(A2AR)、B7-H3(亦稱為CD276)、B及T淋巴細胞衰減劑(BTLA)、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4，亦稱為CD152)、吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)、殺死細胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴細胞活化基因-3(LAG3)、程式化死亡1(PD-1)、T細胞免疫球蛋白域及黏蛋白域3(TIM-3)及T細胞活化之V域Ig抑制劑(VISTA)。特定言之，免疫檢查點抑制劑靶向PD-1軸及/或CTLA-4。

免疫檢查點抑制劑可係藥物，諸如小分子、配體或受體之重組形式，或特別係抗體，諸如人類抗體(例如，Pardoll，2012；已以引用之方式併入本文)。可使用免疫檢查點蛋白質或其類似物之已知的抑制劑，特定言之，可使用抗體之嵌合、人類化或人類形式。如熟練技術者所知，替代及/或等效名稱可用於本發明中提及的某些抗體。此類替代及/或等效名稱在本發明之上下文中係可互換的。例如，已知蘭勃利單抗(lambrolizumab)依替代及等效名稱亦稱作MK-3475及帕姆單抗。

在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係抑制PD-1結合至其配體結合搭配物之分子。在一個特定態樣中，PD-1配體結合搭配物係PD-L1及/或PD-L2。在另一個實施例中，PD-L1結合拮抗劑係抑制PD-L1結合至其結合搭配物之分子。在一個特定態樣中，PD-L1結合搭配物係PD-1及/或B7-1。在另一個實施例中，PD-L2結合拮抗劑係抑制PD-L2結合至其結合搭配物之分子。在一個特定態樣中，PD-L2結合搭配物係PD-1。拮抗劑可係抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗體描述於美國專利第8,735,553號、第8,354,509號及第8,008,449號中，所有該等專利均以引用的方式併入本文中。用於本文所提供的方法中之其他PD-1軸拮抗劑係此項技術中已知的，諸如，描述於美國專利公開案第US20140294898號及第US20110008369號中，所有該等公開案均以引用的方式併入本文中。

在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係抗PD-1抗體(例如，人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)。在一些實施例中，抗PD-1抗體係選自由納武單抗、帕姆單抗及CT-011組成之群。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係免疫黏附素(例如，包含融合至恆定區(例如，免疫球蛋白序列之Fc區)之PD-L1或PD-L2之細胞外或PD-1結合部分之免疫黏附素)。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係AMP-224。納武單抗(亦稱為MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558及OPDIVO^® )係描述於WO2006/121168中之抗PD-1抗體。帕姆單抗(也稱為MK-3475、Merck 3475、蘭勃利單抗、KEYTRUDA^® 及SCH-900475)係描述於WO2009/114335中之抗PD-1抗體。CT-011(亦稱為hBAT或hBAT-1)係描述於WO2009/101611中之抗PD-1抗體。AMP-224(亦稱為B7-DCIg)係描述於WO2010/027827及WO2011/066342中之PD-L2-Fc融合可溶性受體。

可在本文所提供的方法中靶向的另一免疫檢查點係細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)，亦稱為CD152。人類CTLA-4之完整cDNA序列具有Genbank登錄號L15006。CTLA-4存在於T細胞之表面上，並當結合至抗原呈現細胞之表面上的CD80或CD86時，具有「關閉」開關之作用。CTLA4係免疫球蛋白超級家族的成員，其表現在輔助T細胞之表面上，並將抑制信號傳遞至T細胞。CTLA4類似於T細胞共同刺激蛋白質CD28，且兩種分子結合至抗原呈現細胞上之CD80及CD86(亦分別稱為B7-1及B7-2)。CTLA4傳遞抑制信號至T細胞，而CD28傳遞刺激信號。細胞內CTLA4亦存在於調節性T細胞中並可能對其功能具有重要作用。透過T細胞受體及CD28之T細胞活化導致提高CTLA-4(B7分子之抑制性受體)之表現。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗-CTLA-4抗體(例如，人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。

適用於本發明方法之抗人類CTLA-4抗體(或自其衍生之VH及/或VL域)可使用此項技術中熟知的方法產生。或者，可使用相關技術公認的抗CTLA-4抗體。例如，揭示於美國專利第8,119,129號中之抗CTLA-4抗體可用於本文所揭示的方法中。上述各公開案之教示已以引用的方式併入本文中。亦可使用與任何此等此項技術公認的抗體競爭結合至CTLA-4之抗體。例如，人類化CTLA-4抗體描述於國際專利申請案第WO2001014424號及第WO2000037504號及美國專利第8,017,114號中，其等均以引用的方式併入本文中。

示例性抗CTLA-4抗體係易普利單抗(亦稱為10D1、MDX- 010、MDX- 101及Yervoy®)或其抗原結合片段及變體(參見，例如，WO 01/14424)。在其他實施例中，抗體包含易普利單抗之重鏈及輕鏈CDR或VR。因此，在一個實施例中，抗體包含易普利單抗之VH區之CDR1、CDR2及CDR3域、及易普利單抗之VL區之CDR1、CDR2及CDR3域。在另一個實施例中，抗體與上述抗體競爭結合及/或結合至CTLA-4上的相同抗原決定基。在另一個實施例中，抗體與上述抗體具有至少約90%的可變區胺基酸序列一致性(例如，與易普利單抗具有至少約90%、95%或99%的可變區一致性)。

用於調節CTLA-4之其他分子包括(諸如)描述於美國專利第5,844,905號、第5,885,796號及國際專利申請案第WO1995001994號及第WO1998042752號中之CTLA-4配體及受體，所有該等案均以引用的方式併入本文中，及(諸如)描述於美國專利第8,329,867號中之免疫黏附素，該專利係以引用的方式併入本文中。4. 手術

約60%的癌症患者將接受某種類型的手術，其包括預防性、診斷性或分期、治癒性及緩解性手術。治癒性手術包括切除，其中全部或部分癌組織被物理移除，切除及/或破壞並可與其他療法(諸如本發明實施例之治療、化療法、放射療法、激素療法、基因療法、免疫療法及/或替代療法)結合使用。腫瘤切除係指至少部分腫瘤之物理移除。除腫瘤切除外，手術治療包括雷射手術、冷凍手術、電手術及顯微鏡控制手術(Mohs手術)。

在切除部分或全部癌細胞、組織或腫瘤後，可在體內形成腔。治療可藉由灌注、直接注射或局部施用該區域額外抗癌療法來完成。此種治療可(例如)每1、2、3、4、5、6或7天、或每1、2、3、4及5週或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月重複。此等治療亦可係不同的劑量。5. 其他藥劑

預期其他藥劑可與本發明實施例之某些態樣組合使用以改善治療之治療效力。此等額外藥劑包括影響細胞表面受體及GAP接合之上調之藥劑、細胞生長抑制劑及分化劑、細胞黏附之抑制劑、增加過度增殖細胞對凋亡誘導劑之敏感性之藥劑、或其他生物藥劑。藉由提高GAP接合之數量來增加細胞間信號傳導將增加對鄰近的過度增生性細胞群之抗過度增生作用。在其他實施例中，細胞生長抑制劑或分化劑可與本發明實施例之某些態樣組合使用，以改善治療之抗過度增生效力。預期細胞黏附之抑制劑可改善本發明實施例之效力。細胞黏附抑制劑之實例係黏著斑激酶(FAK)抑制劑及洛伐他汀(Lovastatin)。進一步預期增加過度增生性細胞對凋亡之敏感性之其他藥劑(諸如抗體c225)可與本發明實施例之某些態樣組合使用以改善治療效力。IV . 套組

用於偵測糖基化之套組(諸如本文所揭示之其等套組)亦在本發明之範圍內。此種套組之一個實例可包括去糖基化酵素及一或多種抗體。該套組可進一步包括使用抗體以偵測特定糖基化蛋白質(諸如本文所述的免疫檢查點蛋白質)之存在或不存在之說明書。該套組可進一步包括用於診斷目的之說明書，指示本文所述的免疫檢查點蛋白質在來自癌症患者之樣本中之陽性鑑定指示對免疫檢查點抑制劑之敏感性。該套組可進一步包括說明書，其指示本文所述的免疫檢查點蛋白質在來自癌症患者之樣本中之陽性鑑定指示患者應用免疫檢查點抑制劑治療。V . 實例

包括以下實例以證實本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應明瞭，揭示於以下實例中之技術代表發明者發現在本發明之實踐中很好地起作用之技術，及因此可認為係構成其實踐之較佳模式。然而，根據本發明，熟習此項技術者應明瞭，在不脫離本發明之精神及範圍下，可對揭示的特定實施例進行許多改變並仍然獲得相同或相似的結果。實例 1-PD-L1 偵測方法

N 連接的糖基化之移除增強人類癌細胞中之抗 PD-L1 信號： PD-L1在凝膠電泳上之遷移模式係異質的，如在~50 kDa下的條帶範圍所示，在一組人肺及基底樣乳癌(BLBC)中具有重糖基化但在非BLBC細胞系中不具有重糖基化(圖6A及6B)。用重組糖苷酶(肽-N-糖苷酶F；PNGase F)處理以移除完整的N連接的糖基化(後文中，去糖基化)導致在~33 kDa下之PD-L1之均一模式(圖6A及6C)。為確定PD-L1之N連接的聚糖結構是否阻礙靶向PD-L1抗原之基於抗體之偵測，首先用或不用PNGase F預處理細胞，然後進行免疫螢光共聚焦顯微術。與未處理相比，在肺癌及BT-549 BLBC細胞中PNGase F處理後PD-L1之螢光強度顯著增強(圖1A、1B及6D)。基於酶聯免疫吸附分析(ELISA)之方法進一步支持該等結果。首先，使用伴刀豆球蛋白A(Con A)(代表糖蛋白前驅物之凝集素)作為陽性對照，以定量量測PNGase F之去糖基化效率，並觀測到Con A之化學發光強度顯著降低(圖1C)。在PNGase F處理後，BT-549 BLBC細胞中的抗PD-L1信號顯著增加(圖1D)，如藉由由FDA批准的針對人PD-L1之細胞外域之診斷兔單株抗體(純系28-8 mAb)確定(Phillips等人，2015)。在其他肺癌細胞中觀測到類似的結果(圖1E)。接下來，測定純系28-8 mAb結合至PD-L1之解離常數(Kd)，其顯示分別在A549及H1299細胞中去糖基化後結合親和力增加~25-及55倍(圖1F及6E)。值得注意的是，除了改善的PD-L1偵測之外，另一FDA批准的治療性PD-L1抗體(阿特珠單抗(atezolizumab))偵測到的抗PD-L1信號在肺癌細胞中去糖基化後亦顯著增強(圖6F)。由不同的PD-L1抗體證實的類似結果進一步支持PD-L1抗原區域上的聚糖阻礙其與PD-L1抗體之相互作用及隨後的偵測之觀點。

去糖基化增強藉由 IHC 染色之腫瘤組織塊中之 PD-L1 偵測： PD-L1 IHC分析係臨床中用於分組分層患者以進行免疫檢查點療法之標準方法。為解決樣本去糖基化是否適於藉由IHC評估PD-L1表現，首先將福馬林固定的石蠟包埋(FFPE)的癌細胞系組織塊用作測試模型並檢查去糖基化對抗PD-L1信號之影響。一致地，在肺癌及BLBC細胞中移除聚糖後，藉由組織分數(H分數)測定的PD-L1表現程度增強，但在不表現PD-L1之MCF-7細胞中沒有增強(圖1G及1H)。總之，此等結果指示PD-L1之N連接的糖基化阻礙PD-L1抗體之偵測，且PD-L1聚糖結構之移除可消除抗體識別之立體位阻，此可顯著改善基於抗體之偵測靈敏度。

去糖基化顯著增強人腫瘤組織微陣列中之抗 PD-L1 信號： 在來自多器官癌組織微陣列(TMA)之患者樣本之病理學染色中進一步評估抗PD-L1信號，該多器官癌組織微陣列包括五種癌症類型：乳癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌及胰臟癌(n = 200；圖2A-2C)。代表在有及沒有去糖基化下處理的樣本之間的PD-L1蛋白質表現之H分數顯著變化(p ＜ 0.0001；圖2A)。在所分析的200例病例中，有及沒有糖基化移除之H分數差異分為兩大類：H分數沒有變化之患者(44.5%；n = 89)及增加超過兩倍之患者(47.5%；n = 95) (圖2B；代表性影像顯示於圖2C中)。在多器官癌TMA之五個癌症群組(圖7A)及在肺癌(n = 149；圖2D-2F)及直腸癌(n = 92；圖7B-7D)之兩個獨立患者群組之個體分析中觀測到類似的模式。此等結果顯示PD-L1陽性IHC染色之患者數(37.5-57.5%)在去糖基化後顯著增加超過兩倍，指示在各種癌症類型之臨床診斷中PD-L1之N連接的糖基化嚴重影響PD-L1抗體對其識別。從三個獨立肺癌患者群組進一步分析腫瘤組織，其中藉由沒有事先去糖基化之習知IHC偵測到藉由腫瘤細胞中PD-L1陽性細胞百分比界定的PD-L1腫瘤比例分數(TPS)為＜1%或0-49%。在其等當中，樣本去糖基化顯著增加PD-L1 TPS至≥5%及＞49%，臨床上同意的截止值被認為分別有資格進行納武單抗及帕姆單抗療法。在不考慮反應率下，在基於其等發現之基礎上(圖2G及7E)，N連接的糖基化之移除鑑定約16.4至24.5%的患者群體，其可從抗PD-1/PD-L1療法受益但基於當前的染色方法被排除。有趣地，樣本去糖基化僅在藉由習知IHC在沒有去糖基化下PD-L1陽性細胞為＞49%的患者之相對小群體(4.2%)中增加PD-L1表現(圖2G)。總之，所提出的樣本去糖基化可係消除或減少假陰性PD-L1表現之可行方法並有可能使大量假陰性PD-L1偵測患者受益(藉由習知IHC染色，在0-49%之內)，使其等在聚糖移除後有資格進行免疫檢查點療法。

去糖基化後改善的 PD-L1 偵測與抗 -PD-1/PD-L1 療法之反應相關： 為解決PD-L1 IHC讀數與患者反應之間不一致的觀測結果，此在臨床上一直係一個長期的難題，收集95個免疫治療前保存之的FFPE塊，其包含來自已接受或正接受免疫療法之罹患不同類型癌症之患者之腫瘤組織。用或不用PNGase F糖苷酶處理相同的塊並進行IHC染色，然後進行病理性PD-L1表現與臨床反應率之間的相關性分析。一致地，與沒有去糖基化之樣本相比，經去糖基化處理之樣本之H分數顯著增加(p ＜ 0.0001；圖3A)。在去糖基化後，H-分數之倍數變化進一步分為四類：1)沒有變化(44.2%)，2)增加超過兩倍(34.7%)，3)增加少於兩倍(20%)，及4)抑制在兩倍以內(1.1%)(圖3B；圖3C中之代表性影像)。此外，在有及沒有去糖基化下處理之樣本之間PD-L1陽性信號之百分比亦顯著變化(p ＜ 0.0001；圖8A)。確定兩個可比較的組：a) PD-L1 TPS未改變之患者(67.4%)及b)增加(32.6%)之患者，其中10.5% (n = 10)增加超過兩倍(圖8B)。值得注意的是，僅在用PNGase F進行樣本預處理後，PD-L1之H分數讀數與患者無疾病進展存活期(PFS)顯著相關，但沒有PNGase F進行樣本預處理則不然(圖3D；p = 0.018對p = 0.663)。在PNGase F之存在下，在PD-L1 TPS與患者PFS之間的相關性中亦觀測到改善的p值(圖3E；p = 0.013對p = 0.480)。接受抗PD-1療法納武單抗之群組中大多數患者之病理性PD-L1濃度及PFS之統計分析(圖8C及8D；n = 39)，在PNGase F之存在下，在納武單抗療法後的PFS與PD-L1 H分數讀數之間顯示改善的p值(圖8C；p = 0.016對p = 0.287)或PD-L1 TPS(圖8D；p = 0.049對p = 0.423)。此外，在接受抗PD-1療法(例如，納武單抗、帕姆單抗及卡瑞利珠單抗)(圖8E及8F；n = 75)、或抗PD-L1療法(例如，阿特珠單抗及度伐魯單抗)(圖8G及8H；n = 12)之其他患者組中亦觀測到類似的結果(在同一群組中)。總之，樣本去糖基化可更準確地評估PD-L1濃度，以預測患者之臨床結果。除了PFS外，亦確定該群組中的49例具有可用總體存活期(OS)，以研究患者OS與病理性PD-L1濃度之間的相關性。結果指示在PNGase F處理後OS與PD-L1 H分數讀數之間的相關性的p值類似地得到改善(圖3F；p = 0.033對p = 0.798)或PD-L1 TPS(圖3G；p = 0.005對p = 0.293)。總體而言，使用PFS及OS，證實樣本去糖基化確實導致PD-L1表現之更準確評估，允許更佳地預測對抗PD-1/PD-L1療法之臨床反應。

去糖基化後增加的 PD-L1 信號有利於治療選擇： 傳統上在肺癌中，PD-L1表現＜1%之患者被排除在抗PD-1/PD-L1療法之外，而≥1%的患者優先單獨投與免疫療法(＞49%)或同時投與化療法(1-49%)。在此等95例中，發現來自一大組肺癌患者(n = 44)之組織樣本之去糖基化亦顯著改善患者PFS與藉由PD-L1 H分數(圖4A；p = 0.016對p = 0.362)或PD-L1 TPS(圖4B；p = 0.017對p = 0.460)中任一者確定的病理性PD-L1濃度之間的相關性。接下來，詢問藉由習知IHC在0-49% PD-L1 TPS內的患者是否將受益於治療選擇中之樣本去糖基化以將PD-L1陽性細胞增加至＞49%。與組1相比，在組2中觀測到PFS顯著增加(圖4C；p = 0.003；平均值，256.6天對70.1天)，表明組2中PD-L1 TPS似乎藉由習知IHC偵測不準確的約16%的患者將在治療上受益於樣本去糖基化以將PD-L1 TPS增加至＞49%。值得注意的是，組2中患者之PFS與組3中之PFS相當，其中PD-L1 TPS在有及沒有去糖基化下為49%(圖4C；平均值，256.6天對252.9天)，指示去糖基化後的PD-L1濃度更準確地預測臨床結果。因此，去糖基化介導之PD-L1信號之增加可使~16%的患者(組2；圖4C)單獨用於免疫療法，而不是同步化療法。

接下來，為進一步研究PD-L1表現為＜1%的患者是否藉由將PD-L1 TPS增加至大於5%(圖4D；指定為組5)或＞49%(圖4D；組6)而受益於樣本去糖基化，藉由習知IHC分析具有＜1% PD-L1 TPS之肺癌患者之PFS(44個中的15個)。在組4及組5之間(p = 0.029；平均值，70.9天對175.2天)及在組4及組6之間(p = 0.0006；平均值，70.9天對248.0天)觀測到PFS顯著增加。此表明該群組中約7-11%的患者人群在樣本去糖基化後其PD-L1表現＜1%習知IHC染色，增加至＞49%染色(7%的患者人群)或≥5%染色(11%的患者人群)，及彼等患者似乎對抗PD-1/PD-L1療法具有反應(圖4D)，但否則將沒有資格進行免疫檢查點療法。實際上，該數字接近估計的潛在PD-L1假陰性患者人群(9-17%)，其等仍然在臨床試驗中對免疫療法具有反應。總體而言，樣本去糖基化鑑定有資格接受免疫檢查點抑制劑且可能從治療中獲益之顯著患者人群(7-16%)，特別係其等藉由習知IHC染色假陰性偵測PD-L1為0-49%之患者。

PD-L1 去糖基化增強其在一小部分腫瘤相關免疫細胞中之偵測： 已在接受PD-L1抑制劑(諸如阿特珠單抗)之患者中評估免疫及腫瘤細胞中之PD-L1表現分數(Fehrenbacher等人，2016；Kowanetz等人，2018)。為確定去糖基化是否亦影響免疫細胞中PD-L1之偵測，首先藉由免疫墨點法在人免疫細胞(例如，Jurkat(T淋巴細胞)及THP1(單核細胞))中評估PD-L1糖基化之狀態。用PNGase F預處理在Jurkat及THP1細胞中產生~33 kDa之PD-L1之均一模式(星號；非糖基化的PD-L1；圖9A)，指示PD-L1之重糖基化亦發生在人類免疫細胞中。進一步進行定量ELISA以確定在Jurkat及THP1細胞中移除N連接的糖基化後抗PD-L1信號強度是否受到影響。在PNGase F處理後，抗PD-L1信號強度在THP1細胞中顯著增強，但在Jurkat細胞中僅略微增加(圖9B)。此等結果表明，去糖基化後免疫細胞中抗PD-L1信號強度之增加程度可在不同類型之免疫細胞中有所不同。

接下來，在來自FFPE組織塊中的現有臨床樣本之腫瘤相關免疫細胞中之PD-L1偵測中驗證去糖基化之效應。由於腫瘤微環境中存在免疫細胞浸潤，包含腫瘤相關免疫細胞(淋巴細胞)的95個病例中約46個可用於再評估(圖9C-9E)。免疫細胞中PD-L1陽性信號之百分比(PD-L1%+免疫細胞)在經及未經去糖基化處理之樣本之間變化，但與腫瘤細胞相比不太顯著(p = 0.016對p ＜ 0.0001；圖9C對圖9F)。

此外，免疫細胞中去糖基化後PD-L1偵測增加之分佈按比例小於腫瘤細胞中之分佈。具體而言，PD-L1+免疫細胞之百分比的增加(圖9D；15.2%)小於腫瘤細胞之百分比的增加(圖9G；34.8%)。同樣地，與去糖基化後腫瘤細胞中10.9%之百分比相比，增加超過兩倍之百分比僅為2.2%(圖9D對圖9G)。值得注意的是，去糖基化介導之PD-L1強度變化之增加及該群組之TPS之臨床結果(圖9F-9H)與組合陽性分數(CPS)之臨床結果(圖9I-9K)相似，其中在腫瘤及免疫細胞中進行PD-L1評分(Kulangara等人，2019)，支持PD-L1之去糖基化對評分免疫細胞PD-L1表現之最小影響。簡言之，PD-L1之TPS及CPS在經及未經去糖基化處理之樣本之間顯著變化(p ＜ 0.0001；圖9F及9I)。去糖基化後PD-L1 TPS及CPS之增加之分佈亦係成比例相當的(圖9G及9J)。此外，在存在PNGase F下，患者反應與PD-L1 TPS(圖9H；p = 0.062對p = 0.430)或CPS(圖9K；p = 0.065對p = 0.424)中任一者之間的相關性證實接近顯著的趨勢。此等結果表明，在去糖基化後藉由TPS或CPS中之任一者量測PD-L1濃度更準確地預測抗PD-1/PD-L1臨床結果。

總而言之，當前群組之樣本去糖基化增強一小部分腫瘤相關免疫細胞(淋巴細胞)中PD-L1之偵測。此外，免疫細胞中陽性反應細胞數量兩倍以上之增加比在腫瘤細胞中顯著降低(2.2%對10.9%)，意指此兩種細胞類型之間的聚糖組合物之分佈可能不同。數據指示PD-L1⁺ 免疫細胞偵測之改善具有統計學意義(圖9C；p = 0.016)。有趣地，在該群組中，在評分PD-L1 TPS或CPS時未觀測到患者PFS相關性之影響之統計學顯著性(圖9H及9K)，表明蛋白質去糖基化可能改善某些患者群體中免疫細胞之PD-L1評分。

藉由蛋白質去糖基化之抗原修復提高 PD-L1 作為免疫療法之生物標誌物之預測能力： 最後，為研究腫瘤細胞中經去糖基化之PD-L1是否增加PD-L1作為生物標誌物在臨床實踐中指導抗PD-1/PD-L1療法之預測能力，使用經及未經PNGase F處理之兩組共95例之中位數值(H分數=57.5)，將PD-L1 H分數值分為高或低。藉由習知IHC未觀測到具有高濃度PD-L1之患者之PFS之統計學上顯著的益處(圖5A；p = 0.346)，此與多個臨床試驗之結果一致。

然而，由於藉由在IHC載玻片上用PNGase F預處理樣本進行去糖基化，與具有低濃度PD-L1之患者比較(圖5B；p = 0.015)，具有高濃度PD-L1之患者展示對免疫療法之顯著改善的反應，此導致估計的風險比(HR)從0.82降至0.58(圖5A及5B)。使用PD-L1 H分數之各中位數值作為在經或未經PNGase F處理之組中之截止值觀測到類似的結果(圖5C及5D)。與使用PD-L1 H分數(圖10A-10D)或PD-L1 TPS(圖10E-10H)之中位數值作為截止值之OS分析的結果一起，N連接的糖基化之移除增強PD-L1作為指導免疫療法之生物標誌物之預測能力。

臨床反應亦藉由肺成像篩查證實，其證實在去糖基化後的三個隨機選擇的病例(病例6、7及11)中H分數增加超過兩倍。有趣地，來自3名患者中的2名之腫瘤在PD-1抑制劑治療下展示明顯的收縮(箭頭；圖3C及5E中之病例6；圖3C及5F中之病例11)，其進一步說明識別反應最快的患者組之目標。

總體而言，此等結果表明在IHC染色之前從腫瘤樣本移除聚糖部分導致PD-L1表現之更準確評估，以允許更佳地預測對抗PD-1/PD-L1療法之臨床反應。在目前的發現之基礎上，提出一種模型(圖5G)，其顯示PD-L1之重糖基化阻礙PD-L1抗體之偵測，此可導致來自各種生物分析(諸如IHC、ELISA、免疫螢光顯微術及免疫墨點法)之不準確讀數。在此，證實藉由酶促消化從組織樣本移除PD-L1 N連接的糖基化增加靶蛋白之同質性並更精確地進行基於抗體之PD-L1偵測以防止假陰性讀數。因此，在偵測之前PD-L1之去糖基化可係比習知IHC更準確地定量其表現以鑑定可從免疫檢查點療法獲得最大益處之患者之方法。實例 2- 材料及方法

細胞培養： 在37℃於5% CO2下培養的所有人類細胞系獲自美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection) (Manassas，VA，USA)，包括乳癌(BT-549、BT-20、MDA-MB-231、MCF-7)、肺癌(H1437、A549、Calu3、H1299、H1355、H358、H1435、H226、H322)及免疫(Jurkat T淋巴細胞、THP1單核細胞)細胞系。人類乳癌細胞系(BT-549、BT-20、MDA-MB-231、MCF-7)及H1435細胞係女性衍生之細胞系；所用的其他細胞系係男性衍生之細胞。所有細胞系均由德克薩斯大學MD安德森癌症中心(The University of Texas MD Anderson Cancer Center)的STR DNA指紋圖譜獨立驗證並被鑑定為支原體陰性。將BT-549、BT-20、MDA-MB-231、MCF-7及A549細胞維持在補充有10%胎牛血清(FBS)及1%抗生素混合物之杜貝卡氏改良伊格培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(DMEM)/F12中。將Calu3細胞在補充有10% FBS及1%抗生素混合物之伊格最低要求培養基(Eagle's Minimum Essential Medium)中培養。將所用的其他細胞培養在補充有10% FBS及1%抗生素混合物之RPMI-1640中。

人類組織樣本： 按照中國醫科大學附屬醫院(CMUH106-REC1-145)、長庚紀念醫院(201800036B0)、哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院及德克薩斯大學醫學MD安德森癌症中心(LAB05-0127)之機構審查委員會批准的指南收集人類組織樣本。在收集組織樣本時，在所有病例中從患者獲得書面知情同意書以公開可識別之影像。所有組織樣本均在免疫療法之前收集。所有臨床資訊均驗證吾人的結果，沒有選擇偏差。從罹患肺癌(n = 44)、頭頸癌(n = 22)、食道癌(n = 13)、膀胱癌(n = 5)及其他癌症(n = 13)之患者獲得共95個人類組織樣本(性別：68名男性及27名女性；平均值±SD年齡，59.29± 11.18歲；中位數年齡，59.00歲；範圍，25-92歲)。從所有95名患者獲得無疾病進展存活期(PFS)，總體存活期(OS)可用於49名患者。男性及女性之PFS(p = 0.395)或OS(p = 0.639)之差異並不顯著，如學生t測試測定。相關性測試用於證實患者年齡與未經去糖基化(p = 0.26)及經去糖基化(p = 0.42)之PD-L1 H分數無顯著關聯。客觀反應率(ORR)及疾病控制率(DCR)(n = 該群組中95例中的93例具有可用的免疫療法反應率)分別為10.8%及39.8%，其等與臨床試驗研究中在具有14-23%之ORR及36%之DCR之未選擇的患者中報導的相當(Califano等人，2018；Huang等人，2016；Shukuya及Carbone，2016)。

對於人類腫瘤組織微陣列(TMA)，92例直腸癌之研究獲得中國醫科大學附屬醫院機構審查委員會(CMUH106-REC1-145)的批准。所有患者均獲得知情同意書(性別：66名男性及26名女性；平均值±SD年齡，59.43 ±12.99歲；中位數年齡，59歲；範圍，31–90歲)。皮爾森相關性測試進一步用於證實患者年齡與未經去糖基化(p = 0.84)及經去糖基化(p = 0.39)之PD-L1 H分數無顯著關聯。多器官及肺之人類癌TMA分別購自Biomax，#BC000119 (n = 200)及#NSC151 (n = 149)。對於使用不同截止值作為臨限值的研究，從表現PD-L1之三個獨立肺癌患者群組(總共233例)量測平均值，包括接受免疫療法的95個癌症患者中的44個之組、多器官癌TMA中200個病例中的40個、及149個例肺癌TMA。其中，進一步分析一個患者人群，其中藉由未去糖基化之習知IHC偵測到PD-L1表現低於1%。然後對於去糖基化後的彼等患者樣本，建立臨床定義的PD-L1陽性細胞截止值，包括≥5%、≥25%、＞49%及＞74%。

藉由免疫墨點法 (IB) 偵測細胞裂解物中之去糖基化： 使細胞在RIPA緩衝液(150 mM NaCl、50 mM Tris [pH 7.5]、1% Nonidet P-40及蛋白酶抑制劑混合物)中裂解並使用Vibra-Cell超音波儀進行超音波處理。按照製造商的說明書對PNGase F (NEB Inc.，P0704)處理稍作修改，將5-20 μg細胞裂解物與糖蛋白變性緩衝液及水混合，以構成10-μl總反應體積。藉由在100℃下加熱10 min使混合物變性並在冰上冷卻，然後加入2 μl 10× GlycoBuffer 2、2 μl 10% Nonidet P-40及6 μl水，以構成總共20 μl反應體積。將變性的混合物在37℃下培養過夜，不用或使用1 μl PNGase F，以使最終甘油濃度保持等於5%，並用指定的抗體進行IB分析。

藉由免疫螢光共聚焦顯微術偵測去糖基化： 將接種在8孔室載玻片中的細胞於4℃下固定在4%多聚甲醛中過夜。用PBS洗滌三次後，將固定的細胞與1×糖蛋白變性緩衝液(0.5% SDS及40 mM DTT)一起培養，藉由在100℃下加熱10 min使其變性，並在冰上冷卻。從室取出變性緩衝液，並用PBS洗滌細胞三次，不用或使用包含PNGase F(5%)之PBS在37℃下處理過夜，及然後進行免疫螢光共聚焦顯微術。簡言之，然後將細胞用0.5% Triton X-100透化15 min，並用5%牛血清白蛋白(BSA)在室溫下阻斷1 h。在與PD-L1抗體(1:100；Abcam，ab58810)在4℃下培養過夜後，將細胞與標記有異硫氰酸螢光素(1:500)之抗兔二級抗體在室溫下培養1 h。用包含於安裝試劑中之DAPI將核染色。使用Zeiss LSM 710雷射顯微鏡捕獲共聚焦螢光影像。在所有情況下，透過核之中間平面獲得光學切片，如使用核複染所確定的。

基於定量 ELISA 之方法中的去糖基化樣本： 將以1×10³ 個細胞/孔接種於ELISA 96孔板中之細胞於4℃下固定在4%多聚甲醛中過夜。用PBS洗滌三次後，將固定的細胞與1×糖蛋白變性緩衝液一起培養，藉由在100℃下加熱10 min進行變性，並在冰上冷卻。然後從孔移除變性緩衝液，用PBS洗滌三次，不用或使用包含PNGase F之PBS於37℃下處理過夜，接著係基於定量ELISA之方法。為偵測BT-549細胞中之PD-L1或Con A(陽性對照)，將細胞預處理而增加PNGase F的量(1、2、5%)，以用於與不含PNGase F(0%)之細胞進行比較。在37℃下培養過夜後，然後將經PNGase F預處理之細胞用1% BSA溶液在37℃下阻斷3 h。用含有0.05%吐溫20 (Tween 20)之PBS(PBST)沖洗三次後，將細胞與抗PD-L1抗體(阻斷緩衝液中1:100；純系28-8 mAb)在4℃下培養過夜或用HRP共軛Con A(阻斷緩衝液中1:100)在室溫下培養2 h。然後將細胞用PBST洗滌三次，同時振盪1 min，並在室溫下用過氧化物酶-AffiniPure山羊抗兔IgG二級抗體(在阻斷緩衝液中1:5,000)培養1 h(Con A組除外)。藉由振盪將細胞用PBST洗滌三次以上，且加入過氧化物酶受質TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)並在室溫下培養30 min。加入停止(STOP)溶液終止反應。使用BioTek Synergy Neo多模式讀取器在450 nm下測定表示化學發光強度之光密度並藉由減去在570 nm下的讀數進行校正。對於肺癌細胞中之PD-L1偵測，將經PNGase F預處理之細胞(1% PNGase F)在37℃下培養過夜，接著用1% BSA溶液在37℃下阻斷3 h。用PBST沖洗三次後，將細胞與或不與(僅二級Ab對照)抗PD-L1抗體(純系28-8 mAb之阻斷緩衝液中1:100；阿特珠單抗之阻斷緩衝液中1:500)在4℃下一起培養過夜。然後將細胞用PBST洗滌三次，同時振盪1 min，並用過氧化物酶-AffiniPure山羊抗兔IgG(對於純系28-8 mAb；在阻斷緩衝液中1:5000)或抗人類IgG(對於阿特珠單抗，在阻斷緩衝液中1:5,000)二級抗體在室溫下一起培養1 h。將細胞用PBST再洗滌三次，同時振盪，且加入TMB作為過氧化物酶受質並在室溫下培養30 min。加入停止(STOP)溶液終止反應。使用BioTek Synergy Neo多模式讀取器在450 nm下測定表示化學發光強度之光密度並藉由減去在570 nm下的讀數進行校正。

以基於定量 ELISA 之方法偵測 PD-L1 抗體結合親和力： 基於上述基於ELISA之定量進行飽和結合分析以測定抗PD-L1純系28-8 mAb對細胞表面PD-L1抗原之結合親和力。為計算具有經純系28-8 mAb半飽和之抗原位點之細胞的數量，將細胞以一系列細胞數量(2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625及0.03125×10³ 個細胞/孔)接種於ELISA 96孔板中並於4℃下固定在4%多聚甲醛中過夜。用PBS洗滌三次後，將固定的細胞與1%糖蛋白變性緩衝液一起培養，藉由在100℃下加熱10 min使其變性，並在冰上冷卻。然後從孔移除變性緩衝液，用PBS洗滌三次，並使用(1%)或不用(0%)PNGase F在37℃下處理過夜。然後將經PNGase F預處理之細胞用1% BSA溶液在37℃下阻斷3 h。用PBST沖洗三次後，將細胞與抗PD-L1抗體(阻斷緩衝液中1:100；純系28-8 mAb)在4℃下培養過夜。然後將細胞用PBST洗滌三次，同時振盪1 min，並在室溫下用過氧化物酶-AffiniPure山羊抗兔IgG二級抗體(在阻斷緩衝液中1:5,000)培養1 h。藉由振盪將細胞用PBST洗滌三次以上，且加入TMB作為過氧化物酶受質並在室溫下培養30 min。加入停止(STOP)溶液終止反應。使用BioTek Synergy Neo多模式讀取器在450 nm下測定表示化學發光強度之光密度並藉由減去在570 nm下的讀數進行校正。藉由表示解離常數(Kd)估計值之上述結合數據估計細胞經抗PD-L1 mAb半飽和之細胞數量及然後使用GraphPad Prism(版本7；Prism Software Inc.，San Diego，USA)轉化以產生Scatchard圖。

IHC 分析中之樣本之去糖基化： 將福馬林固定的石蠟包埋(FFPE)組織切片在40℃下培養過夜及然後在58-65℃下培養1–3 h，用二甲苯及乙醇脫蠟，並在蒸餾水中水合。用10 mM檸檬酸(pH 6.0)在微波中進行抗原修復10 min (1000W進行2 min及200W進行8 min)並在室溫下冷卻60 min。用PBS洗滌兩次後，將組織切片與1×糖蛋白變性緩衝液在室溫下一起培養3 h，用PBS洗滌四次，不用或使用包含PNGase F(5%)之PBS在37℃下處理過夜(12–18 h)，並進行IHC染色。簡言之，然後在室溫下用3% H₂ O₂ /甲醇阻斷切片10 min並用PBS洗滌三次。將PBS中之正常血清(10%)在室溫下在潮濕室中加入至切片30 min。擦去正常血清後，在40℃下將PD-L1初級抗體(1:100；Abcam，ab205921，純系28-8 mAb)加入至潮濕室中之切片過夜，用PBS洗滌三次，並與抗兔二級抗體(1:200)在室溫下在潮濕室中一起培養1 h。然後用PBS洗滌切片三次並在室溫下在潮濕室中加入過氧化物酶共軛抗生物素蛋白生物素錯合物(1:100) 1 h。用PBS洗滌三次以上後，將切片與AEC色原受質一起培養5–10 min，用蒸餾水洗滌三次，用Mayer蘇木精複染30 s，再用蒸餾水洗滌三次，並用來自Lerner Laboratories Inc.之水容器安裝。

IHC 染色之驗證： 根據美國病理學家病理學及實驗室品質中心的所有相關指南(Fitzgibbons等人，2014)進行IHC分析之驗證。為設定最佳截止值，使用肺癌腫瘤微陣列(Biomax，#NSC151)中之PD-L1 mAb純系28-8進行PD-L1 IHC染色以驗證IHC性能。樣本呈現不同百分比之染色的細胞，範圍從驗證組中腫瘤細胞之陰性(0%)至強陽性(100%)染色。將從驗證組獲得的此等染色百分比應用於手稿中描述的其他臨床樣本。進行的所有染色程式導致PD-L1膜染色之特徵性腫瘤細胞模式。

IHC 染色之評估： 兩名病理學家之任務係使用已建立的半定量方法獨立地評估IHC結果，以估計Histoscore (H分數) (Detre等人，1995)，其藉由染色強度及藉由腫瘤細胞中PD-L1陽性細胞之百分比定義的TPS計算得。簡言之，對於如前所述進行的H分數評估(Wang等人，2018)，在400×放大率下隨機選擇10個視野，並將惡性細胞中之染色強度評分為0、1、2或3，分別係陰性染色、弱染色、中間染色及強紅色染色之存在。然後在每個視野中計數細胞總數及在每種強度下染色的細胞數量，並使用以下公式計算陽性細胞之平均百分比：H分數=[1×(在強度類別1下染色之細胞之%) + 2 × (在強度類別2下染色之細胞之%) + 3 × (在強度類別3下染色之細胞之%)]。每次染色獲得在0至300範圍內之最終H分數並計算所有病例之H分數之平均值。H分數高於平均值之病例被認為係高表現及H分數等於或低於平均值之病例被認為係低表現。

定量及統計分析： 除非另有說明，否則每個樣本一式三份進行分析。所有誤差條表示標準偏差(SD)。使用GraphPad Prism program(版本7；Prism Software Inc.，San Diego，USA)進行統計分析。學生t測試用於比較兩組獨立樣本。雙尾威爾卡森符號等級檢定用於比較兩組匹配的樣本。除非另有說明，否則雙尾皮爾森相關性測試用於確定兩個變量之間的線性相關性。對數秩 (Mantel-Cox)及Mantel-Haenszel測試用於評估存活曲線及風險比之比較之統計顯著性。p值＜0.05在統計學上視為顯著的。NS，不顯著；沒有統計方法用於預定樣本尺寸。 * * *

根據本發明，無需過度實驗即可製作及執行本文揭示及主張的所有方法。雖然已根據較佳實施例描述本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者應明瞭，可在不脫離本發明之概念、精神及範圍下對方法及方法之步驟或步驟順序進行改變。更具體言之，應明瞭，化學及生理學同時相關的某些試劑可代替本文所述之試劑，同時可獲得相同或相似的結果。熟習此項技術者明瞭的所有此等類似的替代及修改均被認為係在由隨附申請專利範圍限定的本發明之精神、範圍及概念內。參考文獻 以下參考文獻在其等提供補充本文所述的其等示例性程式或其他細節之示例性程式或其他細節之程度上以引用的方式具體地併入本文中。 Abbondanzo等人，1990。 Allred等人，1990。 Brown等人，1990。 Califano等人，Future Oncol. 14，2415-2431，2018。 Detre等人，J Clin Pathol. 48，876-878，1995。 Fehrenbacher等人，Lancet. 387，1837-1846，2016。 Fitzgibbons等人，Arch Pathol Lab Med. 138，1432-1443，2014。 Garon等人，N Engl J Med.，2015。 Huang等人，Onco Targets Ther. 9，5867-5874，2016。國際專利公開案第WO1995001994號國際專利公開案第WO1998042752號國際專利公開案第WO2000037504號國際專利公開案第WO2001014424號 Kim及Leahy，Methods Enzymol. 533:259-63，2013。 Kita等人，Mol Cell Proteomics. 6(8):1437-45，2007。 Kowanetz等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 115，E10119-E10126，2018。 Kulangara等人，Arch Pathol Lab Med. 143，330-337，2019。 Ma等人，J Hematol Oncol.，2016。 Maley等人，Anal Biochem. 180(2):195-204，1989。 Matthew等人，Ann Transl Med，5(18):375，2017。 Pardoll，Nat Rev Cancer，12(4): 252-64，2012。 Phillips等人，Appl Immunohistochem Mol Morphol. 23，541-549，2015。 Shukuya及Carbone，J Thorac Oncol. 11，976-988，2016。 Suzuki等人，Glycoconj J. 12(3):183-93，1995。美國專利第3,817,837號美國專利第3,850,752號美國專利第3,939,350號美國專利第3,996,345號美國專利第4,275,149號美國專利第4,277,437號美國專利第4,366,241號美國專利第5,844,905號美國專利第5,885,796號美國專利第8,008,449號美國專利第8,017,114號美國專利第8,119,129號美國專利第8,329,867號美國專利第8,354,509號美國專利第8,735,553號美國專利公開號第US20110008369號美國專利公開案第US20140294898號 Wang等人，Cancer Cell. 33，752-769 e758，2018。

以下附圖構成本說明書的一部分並包括在內以進一步證實本發明之某些態樣。藉由參考此等附圖中之一者或多者並結合本文給出的特定實施例之詳細描述，可更佳地理解本發明。

圖 1A-1H 在各種生物分析中， N- 連接的糖基化之移除增強人類癌細胞中之抗 PD-L1 信號。 (A及B) BT-549 (A)及A549 (B)(用(+)PNGase F (5%)或不用(-) PNGase F(5%)在37℃下處理過夜，用DAPI及抗PD-L1抗體(Abcam，ab58810)染色)之免疫螢光共聚焦顯微術。條形圖，10 μm。定量顯示於右圖。數據代表在3個不同視野中隨機選擇之3個獨立實驗。(C及D) 在37℃下用漸增濃度之PNGase F(1、2、5%)處理過夜的BT-549細胞中Con A (C)及PD-L1 (Abcam，ab205921，純系28-8 mAb) (D)濃度之ELISA與未處理的細胞(0%)之比較。(E) 在37℃下用(+) PNGase F(1%)處理過夜的肺癌細胞中PD-L1濃度(Abcam，ab205921，純系28-8mAb)之ELISA與沒有(-)處理的細胞之比較。陰性對照，僅二級Ab對照。(F)左圖：結合至抗PD-L1純系28-8 mAb之A549細胞裂解物之飽和結合分析。右圖：從藉由飽和結合分析測定的Kd值換算得的結合至抗PD-L1抗體的細胞數量之scatchard圖。(G) 在37℃下用或不用PNGase F(5%)處理過夜的BLBC (BT-549、BT-20及MDA-MB-231)及非BLBC (MCF-7)癌細胞塊之IHC染色之H分數之代表性影像(左圖)及定量(右圖)。條形圖，50 μm。(H) 在37℃下用或不用PNGase F(5%)處理過夜的一組肺癌細胞塊之IHC染色之H分數之代表性影像(上圖)及定量(下圖)。條形圖，50 μm。所有誤差條代表平均值±SD。*p ＜ 0.05，**p＜ 0.01，***p ＜ 0.001，學生t測試。

圖 2A-2G ：去糖基化顯著增強人腫瘤組織微陣列中主要患者樣本群中之抗 PD-L1 信號。(A)代表藉由人類多器官癌組織微陣列(TMA) (n = 200)之IHC染色在37℃下用或不用PNGase F(5%)處理過夜的PD-L1蛋白表現之H分數值。威爾卡森(Wilcoxon)符號等級檢定。(B)餅狀圖，突出顯示來自(A)的透過PNGase F處理移除N連接的糖基化後H分數之倍數變化。(C) (A)之IHC染色之兩個代表性病例。條形圖，50 μm。(D)代表藉由人類肺癌TMA (n = 149)之IHC染色在37℃下用或不用PNGase F(5%)處理過夜的PD-L1蛋白表現之H分數值。威爾卡森符號等級檢定。(E)餅狀圖，突出顯示來自(D)的透過PNGase F處理移除N連接的糖基化後H分數之倍數變化。(F) (D)之IHC染色之兩個代表性病例。條形圖，50 μm。(G) 來自未去糖基化及經去糖基化(縮寫為去糖基化(deglyco))之指定截止值之三組獨立之表現PD-L1陽性細胞(PD-L1 TPS；%)之肺癌患者群體(總共n = 233)之平均群體。誤差條代表平均值±SD。

圖 3A-3G ：去糖基化後改進的 PD-L1 偵測與針對抗 PD-1/PD-L1 療法之反應相關。 (A)代表在37℃下用或不用PNGase F(5%)處理過夜的PD-L1蛋白表現之H分數，其係來自已接受或正接受抗PD-1/PD-L1免疫療法之多種癌症類型患者(n = 95)之治療前保存之FFPE腫瘤組織塊之IHC染色。威爾卡森符號等級檢定。(B)餅狀圖，突顯來自(A)的透過PNGase F處理移除N連接的糖基化後H分數之倍數變化。(C) 來自(A)之IHC染色之代表性病例。條形圖，50 μm。(D)在來自(A)之用或不用PNGase F處理的患者組織載玻片中，代表PD-L1蛋白表現之H分數與抗PD-1/PD-L1療法之對應PFS之間的皮爾森(Pearson)相關性測試。(E)在來自(A)之用或不用PNGase F處理的患者組織載玻片中，PD-L1陽性細胞百分比(TPS)與抗PD-1/PD-L1療法之對應PFS之間的皮爾森相關性測試。(F及G) 在來自(A)之用或不用PNGase F處理的患者組織載玻片(n = 49，OS可用)中，PD-L1 H分數(F)或PD-L1 TPS(G)與抗PD-1/PD-L1療法之對應OS之間的皮爾森相關性測試。

圖 4A-4D ：去糖基化後增加的 PD-L1 信號有利於治療選擇。 (A及B)在來自圖3A之用或不用PNGase F處理的肺癌患者組織載玻片(n = 44)中，PD-L1 H分數(A)或PD-L1 TPS (B)與抗PD-1/PD-L1療法之對應PFS之間的皮爾森相關性測試。(C)在未去糖基化或經去糖基化(縮寫為去糖基化(deglyco))之指定截止值中表現PD-L1 TPS之肺癌患者之PFS。對於組(1)，n = 12。對於組(2)，n = 7。對於組(3)，n = 25。(D)在未去糖基化或經去糖基化(縮寫為去糖基化(deglyco))之指定截止值中表現PD-L1 TPS＜1%之肺癌之PFS。對於組(4)，n = 10。對於組(5)，n = 5。對於組(6)，n = 3。誤差條(線)代表平均值±SD。*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001，NS，不顯著，學生t測試。

圖 5A-5D ：藉由蛋白質去糖基化之抗原修復提高 PD-L1 作為免疫療法之生物標誌物之預測能力 。(A及B)藉由PNGase F處理在不具有(A)或具有(B)去糖基化下處理的癌症患者樣本之PFS。H分數等於或高於總共95例之中位數值(H分數 = 57.5)的病例被認為係高表現及H分數低於中位數值的病例被認為係低表現。(C及D)藉由PNGase F處理在不具有(C)或具有(D)去糖基化下處理的癌症患者樣本之PFS。H分數等於或高於個體組中位數值的病例[分別地，未糖基化組(C)的H分數=40及經糖基化組(D)的H分數=90]被認為係高表現及彼等H分數小於各自中位數值的病例被認為係低表現。指示每組的群組大小。p值係藉由對數秩(Mantel-Cox)測試確定。風險比(HR)及95%置信區間(CI)係藉由Mantel-Haenszel方法確定。(E及F)圖3A之病例6(E)及病例11(F)之電腦斷層攝影(CT)掃描及胸部X射線之圖示，抗PD-1(納武單抗)前後免疫療法。(G)透過樣本去糖基化之PD-L1抗原修復之建議模型。簡言之，PD-L1之聚糖結構阻礙靶向PD-L1抗原之基於抗體的偵測。樣本去糖基化增加PD-L1之同質性並更準確地評估PD-L1表現以允許更好地估計PD-L1濃度以防止臨床環境中的假陰性讀數。

圖 6A-6F ：在免疫螢光及基於 ELISA 之分析中，人 類 癌細胞中的去糖基化後抗 PD-L1 信號增強 。與圖1相關。(A)在37℃下使用(+)或不用(-)PNGase F(5%)處理過夜並用指定的抗體進行免疫墨點法(IB)的肺癌細胞之細胞裂解物。抗PD-L1抗體用於IB，細胞信號傳導(13684)。星號指示非糖基化的PD-L1。(B)以指定抗體進行之非BLBC及BLBC細胞之IB。(C) 在37℃下使用(+)或不用(-)PNGase F(5%)處理過夜並用指定的抗體進行IB的BLBC細胞之細胞裂解物。(D) H1299(在37℃下用(+)或不用(-)PNGase F(5%)處理過夜，用DAPI及抗PD-L1抗體(Abcam，ab58810)染色)之免疫螢光共聚焦顯微術。條形圖，10 μm。定量顯示於右圖。數據代表在3個不同視野中隨機選擇的3個獨立實驗。(E)左圖：結合至抗PD-L1抗體(純系28-8)之H1299細胞裂解物之飽和結合分析。右圖：從藉由飽和結合分析測定的Kd值換算得的結合至抗PD-L1抗體的細胞數量之scatchard圖。(F)藉由抗PD-L1抗體阿特珠單抗(MDACC)進行在37℃下用(+)PNGase F(1%)處理過夜的A549及H1299細胞中PD-L1濃度之ELISA與無(-)處理的細胞之比較。陰性對照，僅二級Ab對照。所有誤差條代表平均值 ± SD。*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，學生t測試。

圖 7A-7E ：在不同癌症類型的主要患者人群樣本中移除 N 連接的糖基化後抗 PD-L1 信號增強 。與圖2相關。(A)圖2A之多器官癌TMA中五個群組(包含乳房浸潤性導管癌、肺鱗狀細胞癌、結腸腺癌、前列腺腺癌及胰腺腺癌各40例)之個體分析。(B)代表藉由PNGase F(5%)預處理在進行或不進行去糖基化下處理的人類直腸癌TMA(n = 92)之IHC染色之PD-L1蛋白表現之H分數值。藉由威爾卡森符號等級檢定分析結果。(C)餅狀圖，突出顯示來自(B)的透過PNGase F處理移除N連接的糖基化後H分數之倍數變化。(D) (B)之IHC染色之兩個代表性病例。條形圖，50 µm。(E)肺癌腫瘤微陣列(Biomax，＃NSC151)中PD-L1 IHC染色之代表性影像。樣本呈現不同百分比之染色的細胞，其寬廣範圍為從腫瘤細胞之陰性(0%)至強陽性(100%)染色。條形圖，50 µm。小插圖：PD-L1膜染色(箭頭)；條形圖，20 µm。

圖 8A-8H ： N 連接的糖基化之移除改善臨床樣本中之 PD-L1 偵測並與患者對抗 PD-1/PL1 療法之反應相關聯 。與圖3相關。(A)來自顯示於圖3A中之患者組織載玻片(n = 95)之IHC染色之在37℃下用或不用PNGase F(5%)處理過夜的腫瘤細胞中PD-L1陽性信號之百分比(TPS；腫瘤比例分數；陽性細胞%)。威爾卡森符號等級檢定。(B)餅狀圖，突出顯示來自(A)的透過PNGase F處理移除N連接的糖基化後PD-L1 TPS之倍數變化。(C及D) 來自圖3A之用或不用PNGase F處理的患者組織載玻片中PD-L1 H分數(C)或PD-L1 TPS(D)與納武單抗療法(n = 39)之對應無疾病進展存活期(PFS)之間的相關性。(E及F) 來自圖3A之用或不用PNGase F處理的患者組織載玻片中PD-L1 H分數(E)或PD-L1 TPS(F)與抗PD-1療法(納武單抗、帕姆單抗及卡瑞利珠單抗(camrelizumab)；n = 75)之對應PFS之間的相關性。(G及H) 來自圖3A之用或不用PNGase 處理的患者組織載玻片中PD-L1 H分數(G)或PD-L1 TPS (H)與抗PD-L1療法(阿特珠單抗及度伐魯單抗；n = 12)之對應PFS之間的相關性。顯示單尾p值，皮爾森校正測試。

圖 9A-9K ：樣本去糖基化增強一小部分腫瘤相關淋巴細胞中之 PD-L1 偵測。 與圖3相關。(A)在37℃下用(+)或不用(-)PNGase F(5%)處理人類免疫細胞(包括Jurkat(T淋巴細胞)及THP1(單核細胞))之細胞裂解物過夜並用PD-L1抗體(Cell Signaling，13684)進行IB。*，非糖基化的PD-L1。(B)在37℃下用或不用PNGase F(1%)處理Jurkat及THP1細胞過夜並進行ELISA以確定PD-L1濃度以用於比較。誤差條代表平均值±SD。*p＜0.05，學生t測試。(C)來自顯示於圖3A中之患者組織載玻片(n = 46，包含腫瘤相關免疫細胞)之IHC染色之在37℃下用或不用PNGase F(5%)處理過夜的免疫細胞(PD-L1+免疫細胞%)中PD-L1陽性信號之百分比。威爾卡森符號等級檢定。(D)餅狀圖，突出顯示來自(C)之透過PNGase F處理移除N連接的糖基化後PD-L1+免疫細胞百分比之倍數變化。(E) (C)之IHC染色之兩個代表性病例。PD-L1+腫瘤細胞(TPS；腫瘤比例分數)，白色箭頭；PD-L1+免疫細胞，紅色箭頭。條形圖，50 μm。(F)來自(C)之IHC染色之在37℃下用或不用PNGase F(5%)處理過夜的腫瘤細胞(TPS；陽性細胞%)中PD-L1陽性信號之百分比。威爾卡森符號等級檢定。(G)餅狀圖，突出顯示來自(F)的透過PNGase F處理移除N連接的糖基化後PD-L1 TPS之倍數變化。(H)在來自(F)之用或不用PNGase F處理的患者組織載玻片中，PD-L1 TPS與抗PD-1/PD-L1療法之對應PFS之間的相關性。皮爾森校正測試；單尾。(I)來自(C)之IHC染色之在37℃下用或不用PNGase F(5%)處理過夜的腫瘤及免疫細胞(CPS；組合陽性分數)中之PD-L1陽性信號。威爾卡森符號等級檢定。(J)餅狀圖，突出顯示來自(I)之藉由PNGase F處理移除N連接的糖基化後PD-L1 CPS之倍數變化。(K)在來自(I)之用或不用PNGase F處理的患者組織載玻片中，PD-L1 CPS與抗PD-1/PD-L1療法之對應PFS之間的相關性。皮爾森校正測試；單尾。

圖 10A-10H ：藉由蛋白質去糖基化之抗原修復提高 PD-L1 作為免疫療法之預測生物標誌物之效用 。與圖5相關。(A及B)藉由PNGase F處理在不具有(A)或具有(B)去糖基化下處理的癌症患者樣本之總存活期(OS)。H分數等於或高於總共49例之中位數值(H分數 = 15.0)的病例被認為係高表現及H分數低於中位數值的病例被認為係低表現。(C及D)藉由PNGase F處理在不具有(C)或具有(D)去糖基化下處理的癌症患者樣本之OS。H分數等於或高於個體組中位數值的病例[分別地，未糖基化組(C)的H分數=8.0及經糖基化組(D)的H分數=30.0]被認為係高表現及彼等H分數小於各自中位數值的病例被認為係低表現。(E及F)藉由PNGase F處理在不具有(E)或具有(F)去糖基化下處理的癌症患者樣本之OS。PD-L1 TPS等於或高於總共49例之中位數值(PD-L1 TPS = 30%)的病例被認為係高表現及PD-L1 TPS低於中位數值的病例被認為係低表現。(G及H)藉由PNGase F處理在不具有(G)或具有(H)去糖基化下處理的癌症患者樣本之OS。PD-L1 TPS等於或高於個體組中位數值的病例[分別地，未糖基化組(G)的PD-L1 TPS=15%及經糖基化組(H)的PD-L1 TPS=40%]被認為係高表現及彼等PD-L1 TPS小於各自中位數值的病例被認為係低表現。指示每組的群組大小。p值藉由對數秩(Mantel-Cox)測試確定。藉由Mantel-Haenszel方法確定風險比(HR)及95%置信區間(CI)。

Claims

一種偵測免疫檢查點蛋白質濃度之體外方法，該方法包括： (a)取得固定的樣本； (b)將該樣本中之蛋白質去糖基化； (c)使該樣本與抗免疫檢查點蛋白質抗體接觸；及 (d)量測該抗體與該免疫檢查點蛋白質之結合，從而偵測該免疫檢查點蛋白質之濃度。
如請求項1之方法，其中該固定的樣本為福馬林固定的樣本或多聚甲醛固定的樣本。
如請求項2之方法，其中該福馬林固定的樣本進一步定義為福馬林固定的石蠟包埋(FFPE)樣本。
如請求項1至3之方法，其中該固定的樣本係從唾液、血液、尿液、正常組織或腫瘤組織中分離。
如請求項1至3之方法，其中該固定的樣本係從腫瘤組織分離。
如請求項1之方法，其中該固定的樣本不包含活細胞。
如請求項1之方法，其中免疫檢查點蛋白質為PD-L1、PD-L2、TIM-3、B7-H3、B7-H4、VISTA、CD40、PD-1、CTLA-4或OX-40L。
如請求項1之方法，其中該免疫檢查點蛋白質係PD-L1。
如請求項8之方法，其中該抗免疫檢查點蛋白質抗體係抗PD-L1抗體。
如請求項1之方法，其中去糖基化包括使該固定的樣本與去糖基化酵素接觸。
如請求項10之方法，其中該去糖基化酵素移除N連接的糖基化。
如請求項10之方法，其中該去糖基化酵素係肽-N-糖苷酶(PNGase F)。
如請求項12之方法，其中將該樣本與PNGase F一起培養12-16小時。
如請求項12之方法，其中將該樣本與1-10%濃度之PNGase F一起培養。
如請求項12之方法，其中將該樣本與5%濃度之PNGase F一起培養。
如請求項1之方法，其中量測包括進行免疫墨點法、免疫組織化學、ELISA或免疫螢光。
如請求項1之方法，其中量測法包括進行免疫組織化學。
如請求項1之方法，該方法進一步包括對被鑑定為具有比對照樣本增加免疫檢查點蛋白質濃度之個體投與抗癌療法。
如請求項18之方法，其中使用非去糖基化樣本，該個體已先前經確定不表現或低表現免疫檢查點蛋白質。
如請求項18之方法，其中該抗癌療法為化療法、放射療法、基因療法、手術、激素療法、抗血管生成療法或免疫療法。
如請求項18之方法，其中該抗癌療法係免疫療法。
如請求項21之方法，其中該免疫療法係免疫檢查點抑制劑。
如請求項22之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係PD-L1抑制劑。
如請求項23之方法，其中該PD-L1抑制劑為阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維單抗(avelumab)、度伐魯單抗(durvalumab)、BMS-936559或CK-301。
如請求項24之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係PD-1抑制劑。
如請求項25之方法，其中該PD-1抑制劑係帕姆單抗(pembrolizumab)或納武單抗(nivolumab)。
如請求項24之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係CTLA-4抑制劑。
如請求項27之方法，其中該CTLA-4抑制劑係易普利單抗(ipilimumab)或曲美目單抗(tremelimumab)。
如請求項18之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係經靜脈內、經腹膜內、經氣管內、經腫瘤內、經肌肉內、經內視鏡、經病灶內、經皮、經皮下、經區域或藉由直接注射或灌注投與。
如請求項1之方法，其中該個體罹患癌症。
如請求項30之方法，其中該癌症為乳癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、胰臟癌、黑色素瘤、肝細胞癌、腎細胞癌、泌尿上皮細胞癌或霍奇金淋巴瘤(Hogkin’s lymphoma)。
如請求項1之方法，其中該個體係人類。
一種包含免疫檢查點抑制劑之醫藥組合物，其係用於根據如請求項1至33中任一項之方法確定該免疫檢查點蛋白質濃度增加的個體。
如請求項33之方法，其中該免疫檢查點蛋白質為PD-L1、PD-L2、TIM-3、B7-H3、B7-H4、VISTA、CD40、PD-1、CTLA-4或OX-40L。
如請求項33之方法，其中該免疫檢查點蛋白質係PD-L1。
如請求項33或35之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係PD-L1抑制劑。
如請求項36之方法，其中該PD-L1抑制劑為阿特珠單抗、阿維單抗、度伐魯單抗、BMS-936559或CK-301。
一種包含有效量之免疫檢查點抑制劑之組合物，其係用於治療個體之癌症，其中根據如請求項1至33中任一項已經確定該個體具有增加之該免疫檢查點蛋白質濃度。
如請求項38之組合物，其中該免疫檢查點蛋白質為PD-L1、PD-L2、TIM-3、B7-H3、B7-H4、VISTA、CD40、PD-1、CTLA-4或OX-40L。
如請求項38之組合物，其中該免疫檢查點蛋白質係PD-L1。
如請求項38或40之組合物，其中該免疫檢查點抑制劑係PD-L1抑制劑。
如請求項41之組合物，其中該PD-L1抑制劑為阿特珠單抗、阿維單抗、度伐魯單抗、BMS-936559或CK-301。
一種預測罹患癌症的個體中對免疫檢查點抑制劑之反應之方法，該方法包括根據如請求項1至33中任一項之方法量測從該個體獲得的樣本中該免疫檢查點蛋白質之濃度，其中若該樣本中該免疫檢查點蛋白質之表現增加，則預測該患者會對該免疫檢查點抑制劑產生有利的反應。
如請求項43之方法，其中該免疫檢查點蛋白質為PD-L1、PD-L2、TIM-3、B7-H3、B7-H4、VISTA、CD40、PD-1、CTLA-4或OX-40L。
如請求項43之方法，其中該免疫檢查點蛋白質係PD-L1。
如請求項43或45之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係PD-L1抑制劑。
如請求項46之方法，其中該PD-L1抑制劑為阿特珠單抗、阿維單抗、度伐魯單抗、BMS-936559或CK-301。
如請求項43之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係PD-1抑制劑。
如請求項48之方法，其中該PD-1抑制劑為帕姆單抗或納武單抗。
如請求項43之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係CTLA-4抑制劑。
如請求項50之方法，其中該CTLA-4抑制劑為易普利單抗或曲美目單抗。
如請求項43之方法，其中量測法包括進行免疫墨點法、免疫組織化學、ELISA或免疫螢光。
如請求項43之方法，其進一步包括將該免疫檢查點抑制劑投與預測具有有利反應之該個體。
如請求項53之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係經靜脈內、經腹膜內、經氣管內、經腫瘤內、經肌肉內、經內視鏡、經病灶內、經皮、經皮下、經區域或藉由直接注射或灌注投與。
一種治療個體的癌症之方法，該方法包括對該個體投與有效量之免疫檢查點抑制劑，其中根據如請求項1至33中任一項之方法已經確定該個體具有增加之免疫檢查點蛋白質濃度。
如請求項55之方法，其中該免疫檢查點蛋白質為PD-L1、PD-L2、TIM-3、B7-H3、B7-H4、VISTA、CD40、PD-1、CTLA-4或OX-40L。
如請求項55之方法，其中該免疫檢查點蛋白質係PD-L1。
如請求項55或57之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係PD-L1抑制劑。
如請求項58之方法，其中該PD-L1抑制劑為阿特珠單抗、阿維單抗、度伐魯單抗、BMS-936559或CK-301。
如請求項55之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係PD-1抑制劑。
如請求項60之方法，其中該PD-1抑制劑為帕姆單抗或納武單抗。
如請求項55之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係CTLA-4抑制劑。
如請求項62之方法，其中該CTLA-4抑制劑為易普利單抗或曲美目單抗。
如請求項55之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係經靜脈內、經腹膜內、經氣管內、經腫瘤內、經肌肉內、經內視鏡、經病灶內、經皮、經皮下、經區域或藉由直接注射或灌注投與。
如請求項55至64之方法，其中該個體係人類。
如請求項55至64之方法，其中該癌症為乳癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、胰臟癌、黑色素瘤、肝細胞癌、腎細胞癌、泌尿上皮細胞癌或霍奇金淋巴瘤。
如請求項55至64之方法，該方法進一步包括投與另一抗癌療法。
如請求項67之方法，其中該另一抗癌療法為化療法、放射療法、基因療法、手術、激素療法、抗血管生成療法或免疫療法。
如請求項67之方法，其中該另一抗癌療法係與該免疫檢查點抑制劑同時投與。