JP2017524128A - 血清試料中の糖タンパク質のグリカンをマッピングするための改善された方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、哺乳動物の液体試料中の組換え糖タンパク質のグリカンを分析するための方法に関する。具体的には、この方法は、試料から組換え糖タンパク質を親和性精製し、固定化された糖タンパク質からグリカン含有断片を酵素的に放出し、同位体標識されたグリカンを含有する参照標準を添加し、グリカンを蛍光標識し、およびＬＣ−ＭＳを用いてグリカンを分析するステップを含む。本発明はまた、固定化された組換え糖タンパク質断片のグリカンを分析するステップをさらに含み、さらに、液体試料の予備洗浄ステップ、および固定化された組換え糖タンパク質断片からグリカンを放出するステップを含む方法に関する。方法は、９６ウェルプレート試料調製などの、少量の試料容積の使用およびハイスループットで操作する可能性を考慮し、したがって、臨床試験または前臨床試験において、哺乳動物の組換え糖タンパク質の薬物動態パラメータを測定するのに適している。

Description

本発明は、哺乳動物の液体試料中の組換え糖タンパク質のグリカンを分析するための方法に関する。具体的には、この方法は、試料から組換え糖タンパク質を親和性精製し、固定化された糖タンパク質からグリカン含有断片を酵素的に放出し、同位体標識されたグリカンを含有する参照標準を添加し、グリカンを蛍光標識し、およびＬＣ−ＭＳを用いてグリカンを分析するステップを含む。本発明はまた、固定化された組換え糖タンパク質断片のグリカンを分析するステップをさらに含み、さらに、液体試料の予備洗浄ステップ、および固定化された組換え糖タンパク質断片からグリカンを放出するステップを含む方法に関する。方法は、臨床試験または前臨床試験で哺乳動物において、生物医薬品などの組換え糖タンパク質の薬物動態パラメータを測定するのに適している。本発明は、液体クロマトグラフィー−質量分析、好ましくは逆相ナノ−液体クロマトグラフィー−質量分析（ＲＰ−ナノ−ＬＣ−ＭＳ）技術を用いて使用され得る。方法は、９６ウェルプレート試料調製などの、少量の試料容積の使用およびハイスループットで操作する可能性を考慮する。また、高感度を提供し、グリカン構造の分析を個別に行うことができる。

生物学的薬剤は最も複雑な医薬品に属する。生物学的薬剤の１つの重要なクラスは、糖タンパク質、特に、典型的には約１５０ｋＤａの分子量を有する糖タンパク質であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。近年、いくつかの調査により、これらの構造が、対応する生物学的薬剤の安全性および有効性に影響を及ぼし得ることが示されたため、治療用タンパク質のグリコシル化が注目された。さらに、薬物動態学（ＰＫ）におけるグリカン構造が有し得る効果が関心を集めるようになってきた。

ＩｇＧは、Ｆｃ部分の各々の重鎖上、通常、アミノ酸２９７付近に保存されたＮ−グリコシル化部位を有する。これらの部位に結合したＮ−グリカンの異種性は非常に高く、十数種の異なるグリカンが見いだされている。この混合物からのグリカンの同定および定量は複雑であり、包括的な分析アプローチが必要である。いくつかのグリカンの構造異性体は、識別をさらにより困難にする。

Ｎ−グリコシル化は、生物医薬品の安全性および有効性にとって重要な問題であり、治療用抗体または治療用Ｆｃ融合タンパク質などの糖タンパク質の薬物動態に影響を及ぼす可能性がある。したがって、薬物動態学上の糖タンパク質の個々のグリカン構造の包括的な分析が必要である。Ｆｃグリカンへの関心は、以下の主要なトピックス、抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存的な細胞傷害（ＣＤＣ）におけるＦｃグリカンの役割、ならびに末端ガラクトース残基に結合するアシアロ糖タンパク質受容体または末端マンノースおよびＮ−アセチルグルコサミン残基に結合するマンノース受容体などの糖受容体の結果として、循環からのクリアランス速度に対するグリカンの役割を含む。

Ｎ−グリコシル化は、液体クロマトグラフィー、質量分析を用いてまたは両方の技術の組み合わせによって、ＰＮＧａｓｅＦによるグリカンの酵素的放出後に試験することができる（ＣｈｅｎおよびＦｌｙｎｎ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７年、３７０巻、１４７−６１頁）。感度を高めるために、Ｎ−グリカンは、多くの場合、蛍光標識で誘導体化される。Ｎ−グリカンの定量分析について、還元アミノ化を通じた蛍光色素による標識が広く用いられ、高感度を提供する。すべてのＮ−グリカンは、サイズまたは分枝とは無関係にただ１つの標識を有し、したがって、蛍光シグナル強度から定量的な情報を得ることができる。このタグは、ＵＶまたは蛍光検出を提供するだけでなく、エレクトロスプレーイオン化における効率を改善することもできる。シアル酸含有グリカンの分析について、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）または８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）などの負に帯電したタグによる標識、および陰イオン化モードにおけるＭＳ検出は頻繁に使用される（Ｐｒｉｅｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１０年、８２巻、１４９８−５０８頁）。

負に帯電した標識は、ＭＳにおける陰イオン化と組み合わせて、酸性Ｎ−グリカンを分析するために頻繁に使用されている（Ｐｒｉｅｎら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０年、２０巻、６２９−４７頁）。オリゴマンノース構造を特徴付けるために、２−ＡＡ誘導体化Ｎ−グリカンが、逆相クロマトグラフィーとネガティブモード質量分析法の組み合わせによって分析された（Ｐｒｉｅｎら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０年、２０巻、６２９−４７頁）。

ＷＯ２０１４／０６０５５１において、１つのアプローチにおける、ＲＰ−ＬＣ−ＭＳによる中性および酸性Ｎ−グリカンの効率的および高感度な分析が記載されている。従来の方法は、主に、オリゴマンノース型Ｎ−グリカンの異性体分離に限定されていた。ＷＯ２０１４／０６０５５１において、アントラニル酸（２−ＡＡ）を使用して、Ｎ−グリカンを標識した後、ギ酸を用いた酸性条件下で逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＬＣ）カラムを用いて分離する。負に荷電した２−ＡＡは、ＲＰ−ＬＣにおいて２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）よりも逆相カラムにおいてより強い保持を生じ、２−ＡＡ標識されたＮ−グリカンの効率的なイオン化および検出を可能にする。ＲＰ−ＬＣに使用される酸性条件は、イオン対形成試薬を必要とせずに末端シアリル化を有する酸性２−ＡＡ Ｎ−グリカンの効率的な分離をもたらす。この方法は、ＲＰ−ナノ−ＬＣ−ＭＳ、ならびにアトモル感度およびハイスループットを可能にする９６ウェルプレート試料調製とともに使用することができる。

Ｎ−グリコシル化分析は、タンパク質分子に結合され得る無数のＮ−グリカン改変体およびそれらの相対量の大きな相違のために複雑である。例えば、組換えヒトＩｇＧ抗体について、個々のオリゴマンノースＮ−グリカンの相対量は、最も豊富なＮ−グリカンに対して０．０２％から７０％超の範囲であり得、これは三桁の相違である（Ｈｉｇｅｌら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３年、４０５巻、２４８１−９３頁）。Ｎ−グリカン分析に頻繁に使用される技術は、ＣＥ、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ、ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩおよびＥＳＩ−ＭＳならびにこれらの技術の様々な組み合わせである（Ｍａｒｉｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０年、６巻、７１３−２３頁）。ＬＣはグリカン混合物を分離することができるため、ＬＣ−ＭＳが有利な組み合わせである；その後、グリカン改変体を個別に同定し、オンラインＭＳによって定量することができる。しかしながら、様々な分析用途について、従来のＬＣ−ＭＳは、特に試料量が非常に限られている場合には、十分に感度が高くない可能性がある。初期の生物医薬品開発（クローンまたはプール選択）中および前臨床試験中に、マイクロタイタープレートからの微量の組換えタンパク質だけが、通常、タンパク質およびグリカン分析に利用可能である。グリコシル化された生物医薬品の薬物動態におけるグリカン改変体の影響を研究するために、目的の組換え糖タンパク質は、他のタンパク質との混合物中の試料、例えば血清中にさらに存在し、その大部分がまたグリコシル化される。さらに、目的の組換え糖タンパク質の量は経時的に減少する。したがって、高感度、特異性および低い試料消費が必要とされる。典型的には、多数の試料が存在するため、したがって、目的の糖タンパク質は、理想的にはハイスループットフォーマットで再現可能な様式で試料から単離されなければならず、一連の試料内の個々の試料の分析は互いに比較可能でなければならない。さらに、糖タンパク質は、１を超えるＮ−グリコシル化部位を有し、各々のグリコシル化部位でグリカン構造の差異があってもよい。

プロテオミクスにおいて、例えばナノ−ＬＣ−ＭＳの使用によって、分析システムの寸法を縮小することによって、試料容積の制限が回避されている。ナノ−ＬＣ−ＭＳの使用によるＮ−グリカン分析のアプローチは、文献ではまれである。３つの調査が、グリカン分析のためのナノ−ＬＣの実施可能性を報告している。Ｗｕｈｒｅｒらは、オリゴ糖分析のためにＨＩＬＩＣ−ＭＳをナノスケールまで小型化した（Ｗｕｈｒｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００４年、７６巻、８３３−８頁）。彼らは、フェムトモル濃度の感度を有する非誘導体化Ｎ−グリカンを分析している。グリカンの誘導体化を避けることは、試料調製を短くするが、標識による改善されたＭＳ検出の利益が失われる（Ｗｕｈｒｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００４年、７６巻、８３３−８頁；Ｒｕｈａａｋら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１０年、３９７巻、３４５７−８１頁）。Ｋａｌａｙらは、２−ＡＢ Ｎ−グリカンを分析するために、オンライン蛍光を用いて順相ナノスケールＨＰＬＣ−ＭＳを使用した（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１２年、４２３巻、１５３−１６２頁）。彼らのアプローチは、良好なクロマトグラフィー分解能を達成するために、長く時間を費やす勾配を用いることとなった。最近、ナノ−逆相クロマトグラフィー（ナノ−ＲＰＣ）を利用した一研究が公表されている。Ｒｉｔａｍｏら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３年、４０５巻、２４６９−８０頁）は、過メチル化Ｎ−グリカンを分離するためにナノ−ＬＣシステムを使用してきた。彼らは、ナノ−ＲＰカラム上の種々の構造異性体の分離を達成している。しかしながら、Ｎ−グリカンの過メチル化は複雑であり、毒性試薬が使用され、副生成物が形成される可能性はむしろ高いため、これが日常的に使用されるかは疑わしい。以前に、オンラインＭＳを用いたＲＰ−ＬＣは、異なる還元末端標識されたＮ−グリカンの分析に広く適用可能であることが報告されている（ＣｈｅｎおよびＦｌｙｎｎ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７年、３７０巻、１４７−６１頁；Ｐｒａｔｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００９年、３８５巻、６９−７９頁）。ＲＰ−ナノ−ＬＣ−ＭＳを用いた単一の２−ＡＡ標識Ｎ−グリカン、例えば約４００アトモルについて全体的な感度がＷＯ２０１４／０６０５５１に報告されている。さらに、この方法は、９６ウェルベースの試料調製ワークフローと組み合わせることができる。

ＭＳによるタンパク質の定量は、安定な重同位体ペプチドまたはタンパク質を用いて行われることが多い。対照的に、Ｎ−グリカンの安定重同位体標識は、真核細胞の複雑であり、多数の関連した同化および異化炭水化物経路のためにほとんど不可能である。同位体標識された単糖の制御された取り込みは、リジンまたはアルギニンのような同位体標識されたアミノ酸の取り込みよりはるかに困難である。

循環中のＩｇＧ分子のクリアランスにおけるグリカンの役割は、血清クリアランスにおけるＦｃグリカン変化の影響を決定しようと試みるなかで、前臨床または臨床の薬物動態学（ＰＫ）試験を含む様々なグループによって検討されている。２つの一般的なアプローチが、これらの試験に用いられている。１つのアプローチにおいて、遺伝子突然変異、代謝阻害剤の添加、両者の組み合わせ、親和性精製または酵素処理のいずれかを介して、特定のグリカン形態で濃縮される抗体が調製されている。次に、これらの抗体試料を動物に注射し、全体のクリアランス速度への影響を決定する。しかしながら、このアプローチは、濃縮中の分子における唯一の変化がグリカン構造であるという仮定のために限界がある。グリカンの異種性はまた、結果の何らかの曖昧さにつながる可能性がある。また、同じ生成物の異なる改変体を調製し、投与する必要がある。したがって、このアプローチは、治療用組換え抗体または融合タンパク質などの生物医薬品の前臨床または臨床のｐＫ試験には適していない。

別のアプローチにおいて、薬物が投与された後にグリカン形態が分析され、循環時間とともにグリカンパターンへの変化は、クリアランス速度の差として解釈される。投与後の回収アプローチは、より多くのグリカン形態を同時に追跡することができる。単一の投与された試料への変化が追跡されるため、特定の微小不均一性の影響をモニターすることができる。本発明者らの知る限りでは、このアプローチはヒトでのみ使用されてきたが、検体サイズがより制限されている前臨床試験で典型的に使用されるより小型の哺乳動物では使用されていない。しかしながら、生物医薬品の開発においてできるだけ早く薬物動態学に関するグリカンの分析、ならびに臨床試験で必要とされる試料サイズの減少が望ましい。

Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉら（ｍＡｂｓ、２０１２年、４巻、４号、５０９−５２０頁）は、ヒトＰＫ試験から得られる血清試料由来の組換えモノクローナルＩｇＧ１抗体を分析した。抗体は、セファロースビーズに架橋されたそのリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより血清から精製された。グリカンは、酸性溶出した抗体から放出され、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）で標識され、順相高速液体クロマトグラフィーにより分析された。しかしながら、このアッセイは、かなり高い試料容量で投与後１４日までしか分析が可能でなく、他の血清タンパク質で汚染されやすい。

Ｃｈｅｎら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００９年、１９巻、３号、２４０−２４９頁）は、ヒトにおける薬物動態試験の血清試料中のモノクローナル抗体を分析した。抗体は、レジンに架橋されたリガンドを用いて親和性精製され、酸性で溶出させた。放出されたグリカンを２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）で標識し、ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＭＳで分析した。この単離法は、血清から特定の抗体の７０％だけを得ることができた。また、この方法は、１を超えるグリコシル化部位を有する糖タンパク質について、同じ分子の他の血清タンパク質または他のグリカンから放出されたグリカンからの干渉を受けやすい。

Ｇｏｅｔｚｅら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１年、２１巻、７号、９４９−９５９頁）は、ヒトにおける薬物動態試験の血清試料中のモノクローナルＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体を分析した。抗体は、レジンに架橋されたそれぞれのリガンドを用いて親和性精製された。抗体を酸性で溶出し、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃまたはトリプシンのいずれかで消化した。グリコシル化されたペプチドをＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。この方法は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２のいずれかのコンセンサスＦｃグリコシル化に特異的であるという利点を提供する。適用されたペプチドマッピングアプローチによって、妨害不純物の潜在的なプールは減少し、分析されるべきｍＡｂと同じサブクラスの内在性ＩｇＧのみとなる。しかしながら、この方法は、０．５ｍｌの試料容量を必要とし、これは、例えばげっ歯類を用いた前臨床試験においてしばしば入手できない場合がある。また、この分析は、試料中のＮ−グリカン構造の相対的比率を決定することのみを可能にし、単一のＮ−グリカン構造の独立した分析を可能にしない。

国際公開第２０１４／０６０５５１号

ＣｈｅｎおよびＦｌｙｎｎ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７年、３７０巻、１４７−６１頁 Ｐｒｉｅｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１０年、８２巻、１４９８−５０８頁 Ｐｒｉｅｎら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０年、２０巻、６２９−４７頁 Ｈｉｇｅｌら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３年、４０５巻、２４８１−９３頁 Ｍａｒｉｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０年、６巻、７１３−２３頁 Ｗｕｈｒｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００４年、７６巻、８３３−８頁 Ｒｕｈａａｋら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１０年、３９７巻、３４５７−８１頁 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１２年、４２３巻、１５３−１６２頁 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３年、４０５巻、２４６９−８０頁 Ｐｒａｔｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００９年、３８５巻、６９−７９頁 Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉら、ｍＡｂｓ、２０１２頁、４巻、４号、５０９−５２０頁 Ｃｈｅｎら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００９年、１９巻、３号、２４０−２４９頁 Ｇｏｅｔｚｅら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１年、２１巻、７号、９４９−９５９頁

これらの方法のいずれも、グリコシル化部位に構造差異を有する１を超えるグリコシル化部位、例えば、融合タンパク質の２つのドメインを含み得る抗体以外の組換え糖タンパク質を分析しなかった。さらに、試料中のグリカンの比率よりはむしろ、血清などの一連の哺乳動物試料中の組換え糖タンパク質の個々のグリカンを分析する方法が必要であった。また、低試料消費および試料調製物をハイスループット様式で操作できるように高い感度が必要とされた。

（発明の要旨）
したがって、本発明は、哺乳動物の液体試料中の目的の組換え糖タンパク質のグリカンを分析する方法であって、ａ）目的の組換え糖タンパク質を含む、哺乳動物の２つ以上の液体試料を用意するステップ；ｂ）上記各試料の組換え糖タンパク質を、試料中の組換え糖タンパク質に特異的な親和性リガンドがカップリングした別個の固体支持体上に、固定化するステップ；ｃ）組換え糖タンパク質の酵素的切断によって、固体支持体から、上記各試料の組換え糖タンパク質のグリカン含有断片を、別個の溶出液に放出させるステップ；ｄ）場合により、別個の溶出液中の上記各試料の組換え糖タンパク質のグリカン含有断片から、グリカンを放出させるステップ；ｅ）上記各試料のグリカンを、蛍光標識の第一の安定同位体で標識するステップ；およびｆ）ＬＣ−ＭＳを用いて、上記各試料のステップｅ）の標識されたグリカンを別々に分析し、上記２つ以上の試料を比較するステップを含み、ここで、蛍光標識の第二の安定同位体で標識されたグリカンを含む参照標準が、ステップｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）の前に上記各試料に添加され、参照標準は、ステップｆ）の標識されたグリカンとともに分析される方法に関する。

本発明はまた、ステップｃ）において上記固体支持体に固定化されたままの、上記各試料の組換え糖タンパク質の第二のグリカン含有断片のグリカンを分析するステップをさらに含む方法に関し、ａａ）ステップｂ）の前に、哺乳動物の２つ以上の各液体試料を予備洗浄して、固体支持体に非特異的に結合する糖タンパク質を除去するステップ；ｄｄ）ステップｃ）の後に固体支持体上に残っている、上記各試料の組換え糖タンパク質の固定化された第二のグリカン含有断片から、グリカンを別個の溶液に放出させるステップ；ｅｅ）上記各試料のグリカンを蛍光標識の第一の安定同位体で標識するステップ；およびｆｆ）ＬＣ−ＭＳを用いて、上記各試料のステップｅｅ）の標識されたグリカンを別々に分析し、上記２つ以上の試料を比較するステップを含み、ここで、蛍光標識の第二の安定同位体で標識されたグリカンを含む参照標準が、ステップｄｄ）、ｅｅ）またはｆｆ）の前に上記各試料に添加され、参照標準は、ステップｆｆ）の標識グリカンとともに分析される方法に関する。予備洗浄ステップａａ）は、試料を固体支持体と接触させるステップを含んでもよく、ここで、固体支持体は、ステップｂ）で使用される固体支持体と同じ材料で作られているが、上記親和性リガンドがカップリングしていない。

本発明によれば、分析されるべきグリカンは、高マンノース型、ハイブリッド型または複合型のＮ−グリカンからなる群から選択されるＮ−グリカンであってもよい。

本発明の方法において使用される蛍光標識は、安定な軽同位体変種および安定な重同位体変種を有し、例えば、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）または２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）であり得る。好ましくは、蛍光標識は、^１２［Ｃ］および^１３［Ｃ］同位体対、より好ましくは^１２［Ｃ_６］および^１３［Ｃ_６］同位体対、さらにより好ましくは^１２［Ｃ_６］−２−アミノ安息香酸（^１２［Ｃ_６］−２−ＡＡ）および^１３［Ｃ_６］−２−アミノ安息香酸（^１３［Ｃ_６］−２−ＡＡ）同位体対である。

本発明による方法において使用される参照標準は、蛍光標識の安定な（第二の）同位体を用いて、好ましくは蛍光標識の安定な重同位体を用いて標識されたグリカンを含む。好ましくは、参照標準は、試料中で分析されたものと少なくとも同じグリカン構造を含む。参照標準は、グリカン構造を個々に分析することを可能にする。

本発明の方法において分析される組換え糖タンパク質は、好ましくは融合タンパク質または抗体、より好ましくはＦｃ融合タンパク質または抗体である。組換えタンパク質がＦｃ融合タンパク質または抗体である実施形態において、ステップｃ）において固体支持体から放出される組換え糖タンパク質のグリカン含有断片は、好ましくはＦｃドメインである。

一実施形態において、組換え糖タンパク質は抗体であり、抗体の可変領域は、固体支持体上に固定化された親和性リガンドに結合し、好ましくは親和性リガンドは抗原である。好ましい実施形態において、抗体は、ＩｇＧ抗体、より好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体、さらにより好ましくはヒトもしくはヒト化ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である。

別の実施形態において、組換え糖タンパク質は、Ｆｃドメインおよびエフェクタードメインを含むＦｃ融合タンパク質であり、エフェクタードメインは、固体支持体上に固定化された親和性リガンドに結合し、ここで、親和性リガンドは、結合パートナーまたはＦｃ融合タンパク質のエフェクタードメインに特異的に結合する抗体である。

組換え糖タンパク質のＦｃドメインを含有するグリカンを固体支持体から放出させるために本発明の方法において使用される酵素は、好ましくはパパイン、フィシン、システインプロテアーゼＳｐｅＢ（ＦａｂｕｌＯＵＳ）またはシステインプロテイナーゼＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標））などのエンドプロテアーゼであり、好ましくはエンドプロテアーゼは、システインプロテイナーゼＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標））である。

本発明の方法の一実施形態において、組換えタンパク質は、抗体またはＦｃ融合タンパク質であり、予備洗浄ステップは、ａａｉ）Ｆｃ結合タンパク質を使用して、固体支持体上にＦｃ含有糖タンパク質を固定化するステップであって、上記Ｆｃ結合タンパク質は、好ましくはプロテインＧまたはプロテインＡから選択され、より好ましくは、上記Ｆｃ結合タンパク質はプロテインＧであるステップ；およびａａｉｉ）Ｆｃ含有糖タンパク質を溶出するステップであって、上記予備洗浄ステップで使用される固体支持体は、ステップｂ）で使用される固体支持体と同じ材料で作られているが、上記親和性リガンドがカップリングしていないステップを含む。

本発明の方法において使用されるＬＣ−ＭＳは、好ましくは逆相ＬＣ−ＭＳまたはナノＬＣ−ＭＳであり、より好ましくはＬＣ−ＭＳは逆相ナノＬＣ−ＭＳである。

本発明の方法の特定の実施形態において、固体支持体は、マイクロビーズ、好ましくはセファロースビーズ、アガロースビーズまたは磁気ビーズ、より好ましくはセファロースビーズを含むレジンである。親和性リガンドは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、臭化シアン、エポキシ、カルボジイミドまたはチオプロピルを介して、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を介して固体支持体にカップリングさせることができる。

本発明の方法の好ましい実施形態において、哺乳動物の２つ以上の液体試料は、マルチウェルフィルタープレート、好ましくは２４、９６または３８４ウェルフィルタープレート、より好ましくは９６ウェルフィルタープレートを用いた分析用に調製される。

組換えタンパク質を含む哺乳動物の液体試料は体液であり、好ましくは血清もしくは血漿、尿、脳脊髄液、羊水、唾液、汗、精液、涙、痰、膣分泌物、膣洗浄液および結腸洗浄液からなる群から選択され；より好ましくは上記試料は血漿または血清試料である。好ましくは、分析される試料は、約１μｌから約１０００μｌ、約５μｌから約５００μｌ、約１０μｌから約２００μｌ、約１０μｌから約１００μｌ、約２５μｌから約１００μｌまたは約４０μｌから約７５μｌ、好ましくは約５０μｌの容量を有する。好ましい実施形態において、哺乳動物の２つ以上の液体試料を同じ対象から得た。本発明の方法において分析される哺乳動物の液体試料は、ヒト、サル、げっ歯類、イヌ、ネコまたはブタの試料、好ましくはマウス、ラット、ハムスターまたはウサギなどのげっ歯類の試料であり得る。

本発明の方法は、目的の組換え糖タンパク質のグリカンの少なくとも１つの特異的グリカン構造の薬物動態パラメータを決定するために、好ましくはそれらのＣ_ｍａｘ、ｔ_ｍａｘ、ＡＵＣまたはｔ_１／２を決定するために使用され得る。

特定の実施形態において、グリカンは、哺乳動物の上記２つ以上の各液体試料のアリコートにおいて分析され、場合により、上記組換え糖タンパク質の濃度は、哺乳動物の上記２つ以上の液体試料のさらなるアリコートにおいて、例えばＥＬＩＳＡにより分析された。

好ましくは、分析されるアリコートは、約１μｌから約１０００μｌ、約５μｌから約５００μｌ、約１０μｌから約２００μｌ、約１０μｌから約１００μｌ、約２５μｌから約１００μｌまたは約４０μｌから約７５μｌ、好ましくは約５０μｌの容量を有する。

本発明はまた、糖タンパク質ベースの医薬組成物を調製する方法に関し、本発明の方法に従って哺乳動物の液体試料中の組換え糖タンパク質のグリカンを分析し、糖タンパク質を医薬組成物として製剤化するステップを含む。

さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物の液体試料中の目的のＦｃ融合タンパク質のグリカンを分析する方法に関し、ａ）Ｆｃドメインおよびエフェクタードメインを含有するＦｃ融合タンパク質を含む、哺乳動物からの２つ以上の液体試料を用意するステップ；ａａ）哺乳動物の２つ以上の各液体試料を予備洗浄するステップであって、Ｆｃ結合タンパク質を使用して、別個の固体支持体上に上記各試料のＦｃ融合タンパク質を固定化するステップであって、上記Ｆｃ結合タンパク質は、好ましくはプロテインＧまたはプロテインＡから選択され、より好ましくは、上記Ｆｃ結合タンパク質はプロテインＧであるステップ；およびＦｃ融合タンパク質を溶出するステップを含むステップ；ｂ）上記各試料のＦｃ融合タンパク質を、試料中のＦｃ融合タンパク質のエフェクタードメインに特異的な親和性リガンドがカップリングした別個の固体支持体上に固定化するステップであって、親和性リガンドは結合パートナーであり、またはＦｃ融合タンパク質のエフェクタードメインに特異的に結合する抗体であるステップ；ｃ）Ｆｃ融合タンパク質に特異的なエンドペプチダーゼで切断することによって、固体支持体から、上記各試料のＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインを、別個の溶出液に放出するステップ；ｄｄ）ステップｃ）の後に固体支持体上に残っている、上記各試料のＦｃ融合タンパク質の固定化されたエフェクタードメインから、グリカンを別個の溶液に放出するステップ；ｅｅ）上記各試料のグリカンを蛍光標識の第一の安定同位体で標識するステップ；ならびにｆｆ）ＬＣ−ＭＳを用いて、上記各試料のステップｅｅ）の標識されたグリカンを別々に分析し、上記２つ以上の試料を比較するステップを含み、ここで、蛍光標識の第二の安定同位体で標識されたグリカンを含む参照標準が、ステップｄｄ）、ｅｅ）またはｆｆ）の前に上記各試料に添加され、参照標準は、ステップｆｆ）の標識グリカンとともに分析される。

Ｆｃ融合タンパク質および抗体について例示されたグリカンＰＫプロファイリング法のワークフローの概略図である。Ａ）Ｆｃ融合タンパク質特異的な試料調製物を示す。 Ｆｃ融合タンパク質および抗体について例示されたグリカンＰＫプロファイリング法のワークフローの概略図である。Ｂ）抗体特異的な試料調製を示す。 Ｆｃ融合タンパク質および抗体について例示されたグリカンＰＫプロファイリング法のワークフローの概略図である。Ｃ）Ｆｃ融合タンパク質試料（１）および抗体試料（２）のＮ−グリカンプロセッシングを示す。 Ｆｃ融合タンパク質および抗体について例示されたグリカンＰＫプロファイリング法のワークフローの概略図である。Ｄ）グリカンの標識後の洗浄、続くＲＰ ナノＬＣ−ＭＳ分析を示す。 Ａ）相対的なＮ−グリカン組成を示す（左）および少量のＮ−グリカンを示す拡大表示（右）の、品質管理（ＱＣ）試料から得られたグリカンマップを示す図である。誤差バーは標準偏差を表す。誤差バーのない２つの列のＧ１ＦおよびＧ０Ｆは、拡大表示のグラフを超えて延びている。ＱＣ試料濃度は、１０μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの間であった。Ｂ）分析したグリカン構造の概略図である。ここで、ＧｌｃＮＡｃ＝黒四角、Ｆｕｃ＝三角、Ｍａｎ＝黒丸およびＧａｌ＝明るい丸である。 ナノＬＣ−ＭＳベースのｍＡｂ１グリカンＰＫデータ（黒菱形）およびＥＬＩＳＡデータ（黒四角）の比較を示す図である。比較を可能にするために、各々の曲線の最大値に対する４つのグリカンからの独立した結果が示されている（平均±ＳＤ、ｎ＝１５）。（Ａ）Ｇ０ＦのＰＫプロファイル（グリカンの約７０％）が示される。（Ｂ）Ｇ１ＦのＰＫプロファイルが示される。（Ｃ）Ｇ２ＦのＰＫプロファイルが示される。（Ｄ）Ｍ６Ｇ０Ｆ／Ｍ５Ｇ１ＦのＰＫプロファイル（０．１％未満のグリカン）が示される。 ナノＬＣ−ＭＳベースのｍＡｂ１グリカンＰＫデータ（黒菱形）およびＥＬＩＳＡデータ（黒四角）の比較を示す図である。比較を可能にするために、各々の曲線の最大値に対する４つのグリカンからの独立した結果が示されている（平均±ＳＤ、ｎ＝１５）。（Ｅ）Ｍ３のＰＫプロファイルが示される。（Ｆ）Ｍ３Ｇ１ＦのＰＫプロファイルが示される。（Ｇ）Ｍ３Ｇ０ＦのＰＫプロファイルが示される。 ナノＬＣ−ＭＳによって得られた、ナノＬＣ−ＭＳベースのｍＡｂ１高マンノースグリカンＰＫプロファイルおよびＥＬＩＳＡプロファイルの比較を示す図である。（Ａ）ＥＬＩＳＡ（黒四角）と比較したＭ６（黒菱形）のＰＫプロファイル。（Ｂ）ＥＬＩＳＡ（黒四角）と比較したＭ５（黒菱形）のＰＫプロファイル。 各々の時点についてのｍＡｂ１のグリカンマップを示す図である。ウサギにおける単回皮下投与後に回収されたｍＡｂ１ Ｎ−グリカンの平均割合が示される。全表示（左）および拡大表示（右）が示される。 Ｆｃ部分および受容部分に分離された２つの異なるバッチ（ＦＰ１およびＦＰ２）の融合タンパク質Ｎ−グリカンを示す図である。グリカンマップは、ＦＰ１ Ｆｃ部分（左上）、ＦＰ１受容体部分（右上）、ＦＰ２ Ｆｃ部分（左下）およびＦＰ２受容体部分（右下）の相対的なＮ−グリカン組成を示す。拡大表示は、少量のＮ−グリカンを示す。 Ｆｃ部分および受容部分に分離された２つの異なるバッチ（ＦＰ１およびＦＰ２）の融合タンパク質Ｎ−グリカンを示す図である。分析されたグリカン構造の概略図。ここで、ＧｌｃＮＡｃ＝黒四角、Ｆｕｃ＝三角、Ｍａｎ＝暗い丸、Ｇａｌ＝明るい丸およびＳＡ＝菱形である。 ＥＬＩＳＡによって決定されたＦＰ１およびＦＰ２のＰＫプロファイルを示す図である。誤差バーは、動物間（ｎ＝５）の変動性を表す。 ナノＬＣ−ＭＳベースの融合タンパク質グリカンＰＫプロファイルとＥＬＩＳＡプロファイルの比較を示す図である。ＥＬＩＳＡ（黒菱形）によって測定された相対的なタンパク質濃度と比較した、ナノＬＣ−ＭＳによって測定されたＦＰ１およびＦＰ２のＦｃドメインの主要なＮ−グリカン（黒四角）の平均ＰＫプロファイルが示される。５匹の動物の平均＋標準偏差が与えられる。 ナノＬＣ−ＭＳベースの融合タンパク質グリカンＰＫプロファイルとＥＬＩＳＡプロファイルの比較を示す図である。ＥＬＩＳＡ（黒菱形）によって測定された相対的なタンパク質濃度と比較した、ナノＬＣ−ＭＳによって測定されたＦＰ１およびＦＰ２の受容体部分（エフェクタードメイン）の主要なＮ−グリカン（黒四角）の平均ＰＫプロファイルが示される。５匹の動物の平均＋標準偏差が与えられる。 ＦＰ１ Ｆｃ部分（左）および受容体部分（右）に位置するＮ−グリカンについてのグリカンマップを別々に示す図である。 ＦＰ２ Ｆｃ部分（左）および受容体部分（右）に位置するＮ−グリカンについてのグリカンマップを別々に示す図である。 末端糖部分の影響を示す図である。融合タンパク質１（ＦＰ１）および融合タンパク質２（ＦＰ２）のＦｃ部分について、末端シアリル化（菱形）、末端ガラクトシル化（四角）および末端Ｎ−アセチルグルコサミン（三角）の割合が示される。 末端糖部分の影響を示す図である。融合タンパク質１（ＦＰ１）および融合タンパク質２（ＦＰ２）の受容体部分（エフェクタードメイン）について、末端シアリル化（菱形）、末端ガラクトシル化（四角）および末端Ｎ−アセチルグルコサミン（三角）の割合が示される。

本明細書で使用するとき、「蛍光標識」は、ＬＣ−ＭＳ分析において使用される蛍光化合物である。典型的には、還元アミノ化を用いてオリゴ糖に蛍光標識を導入し、その後の分離における検出を容易にし、好ましくはこのような蛍光標識は、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）または２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）である。２−ＡＡは、アントラニル酸としても知られている２−アミノ安息香酸である。本発明の目的で、蛍光標識は、蛍光標識の第一の安定な同位体（例えば、軽アイソタイプ）および蛍光標識の第二の安定な同位体（例えば、重アイソタイプ）を含む同位体対として利用可能である。本発明に有用なこのような同位体対の例は、同位体２−ＡＡ、例えば安定な同位体変種である^１２［Ｃ_６］−２−ＡＡおよび^１３［Ｃ_６］−２−ＡＡである（Ｐｒｉｅｎ、Ｊ．Ｍ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８２巻、１４９８−５０８頁（２０１０年））。例えば、２−ＡＡのこのような同位体変種で標識されたグリカンは、ポジティブモードマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）またはオンラインネガティブモードエレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ^ｎ）および／またはナノスプレー質量分析法（ＮＳＩ−ＭＳ）（Ｐｒｉｅｎ、Ｊ．Ｍ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８２巻、１４９８−５０８頁（２０１０年））を用いて分析され得る。蛍光標識の安定な同位体対の他の例は、^１２［Ｃ_６］−アニリン／^１３［Ｃ_６］−アニリンおよび^１２［Ｃ_６］−２−ＡＢ／^１３［Ｃ_６］−２−ＡＢである。

炭水化物部分は、オリゴ糖について一般的に使用される命名法を参照して本明細書に記載される。この命名法を用いる炭水化物化学の総説は、例えば、ＨｕｂｂａｒｄおよびＩｖａｔｔ、Ａｎｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０巻、５５５−５８３頁（１９８１年）に見出すことができる。

本発明の目的で、「グリカン」とは、遊離形態であるまたはタンパク質もしくは脂質などの別の分子に結合した糖または糖の集合体（すなわち、糖類または炭水化物）を意味する。本明細書において言及するとき、「Ｎ−グリカン」は、コンセンサス配列：−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（例えば、共通のコア構造であるＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｎ−Ａｓｎを含む）において、ポリペプチド鎖のアスパラギン残基に共有結合したグリカンである。本明細書において言及するとき、「酸性グリカン」は、（非還元末端で）少なくとも１つの末端シアル酸を含むＮ−グリカンである。本明細書において言及するとき、「中性グリカン」は、何らシアル酸を含まないＮ−グリカンである。本明細書において言及するとき、「グリコシル化」は、特定の糖ヌクレオチド供与体基質を利用して、グリコシルトランスフェラーゼによって一般に触媒される、ポリペプチド、脂質、ポリヌクレオチド、炭水化物または他の有機化合物への炭水化物への酵素触媒による共有結合である。本発明の目的で、「多糖」は、反復単糖、好ましくは長さが１０個を超える単糖単位で構成されるグリカンである。本明細書において言及するとき、「糖」は、任意の炭水化物、好ましくは味が甘い低分子量炭水化物を意味する（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｖａｒｋｉ Ａ、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ＲＤ、Ｅｓｋｏ ＪＤ、ｅｔ ａｌ、編集の用語解説。Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ）：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；２００９年）。単糖について以下の省略形が使用される：Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、マンノース（Ｍａｎ）、ガラクトース（Ｇａｌ）およびシアル酸（ＳＡ）。

本発明の目的で、用語「糖タンパク質」とは、少なくとも１つのグリカン側鎖を有する、抗体および融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）を含む、ペプチドおよびタンパク質を意味する。

用語「組換え糖タンパク質」とは、本明細書で使用するとき、生細胞内での組換えＤＮＡの発現から生じるグリコシル化タンパク質を意味する。組換えＤＮＡ分子は、分子クローニングなどの遺伝子組換えの実験的な方法によって形成されたＤＮＡ分子であり、複数の供給源からの遺伝物質を一緒にし、生物においては他に見出されない配列を作り出す。この文脈において、組換え糖タンパク質はまた、液体試料が得られた哺乳動物に対して、タンパク質が内因性でないことも含む。換言すれば、組換え糖タンパク質は、試料を得る前に哺乳動物に投与されている。好ましい組換え糖タンパク質は、高等真核細胞において発現された治療用組換え糖タンパク質である。これに関して、例示的に有用な高等真核細胞は、以下の細胞株から選択される。

これに関して特に好ましいのは、抗体などの生物医薬的に有用な糖タンパク質を発現するために当該技術分野において広く用いられているＣＨＯ細胞またはＣＨＯ由来細胞（例えば、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１またはＣＨＯ−ＤＧ５５）である。

糖タンパク質は、宿主細胞と同種であってもよく、または異種であってもよく、すなわち、利用される宿主細胞に対して外来であってもよく、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞によって産生されるヒト糖タンパク質などであり得る。特定の実施形態において、宿主細胞によって発現される糖タンパク質は、培地中に直接分泌される。

適切な哺乳動物の、特にヒトの糖タンパク質の例としては、以下の分子が挙げられる：サイトカイン；サイトカイン受容体；ケモカイン、例えばＴＮＦおよびＴＥＣＫ；ケモカイン受容体、例えばＴＮＦＲおよびＣＣＲ９；成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体化ホルモン；グルカゴン；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；凝固因子、例えば第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子およびフォンビルブラント因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ；微生物タンパク質、例えばβ−ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子の受容体；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養因子−３、−４、−５または６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）；神経成長因子、例えばＮＧＦ−β；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、例えばａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）；形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−１（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インスリン様増殖因子結合タンパク質、ＣＤタンパク質、例えばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９；エリスロポエチン；骨誘導性因子、免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−βおよび−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１からＩＬ−２１；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；細胞表面膜タンパク質；輸送タンパク質；ホーミング受容体；調節タンパク質；崩壊促進因子；ならびにウイルス抗原、例えばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２エンベロープタンパク質の一部。

本発明の文脈における好ましい糖タンパク質は、融合タンパク質である。用語「融合タンパク質」とは、本明細書で使用するとき、アミノ酸リンカー、好ましくはＦｃドメイン、アルブミンまたはトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）に融合されたエフェクタードメインによってしばしば分離される、互いに融合された（すなわち、１つのポリペプチドとして発現された）２つのタンパク質またはタンパク質断片を含むキメラタンパク質を意味する。したがって、融合タンパク質は、好ましくはＦｃ融合タンパク質、トランスフェリン融合タンパク質またはアルブミン融合タンパク質であり、より好ましくは融合タンパク質はＦｃ融合タンパク質である。典型的には、融合タンパク質におけるＦｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の、好ましくはＩｇＧ１重鎖のＣＨ２とＣＨ３領域およびヒンジ領域を含む。Ｆｃドメイン、アルブミンまたはトランスフェリンとの融合は、通常、インビボでの半減期を増加させおよび／またはエフェクタードメインの溶解性を増加させる。アミノ酸リンカーは、エンドプロテイナーゼのための切断部位をさらに含んでもよい。エフェクタードメインは、全長の治療的に関連するタンパク質またはその断片、特に治療的に関連する受容体または膜タンパク質の細胞外部分であり得る。治療的に関連するＦｃ融合タンパク質の非限定的な例は、ＬＦＡ−３／Ｆｃ（アレファセプト（Ａｌｅｆｅｃｅｐｔ））、ＴＮＦＲ−Ｆｃ（エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ））、ＣＴＬＡ−４／Ｆｃ（アバタセプト（Ａｂａｔａｃｅｐｔ）およびベラタセプト（Ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ））、ＶＥＧＦＲ１／２−Ｆｃ（アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ））、ｒＦＶＩＩＩＦｃおよびｒＦＩＸＦｃ、ＩＬ−１Ｒ１−Ｆｃ（リロナセプト（Ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ））、トロンボポエチン−Ｆｃ（ロミプロスチム（Ｒｏｍｉｐｌｏｓｔｉｍ））およびアンギオポイエチン−１／２アンタゴニストペプチド−Ｆｃ（トレバナニブ（Ｔｒｅｂａｎａｎｉｂ））である。

適切な哺乳動物の、特にヒトの糖タンパク質の、融合タンパク質において使用されるのに適したエフェクタータンパク質の例としては、以下の分子が挙げられる：サイトカイン；サイトカイン受容体；ケモカイン、例えばＴＮＦおよびＴＥＣＫ；ケモカイン受容体、例えばＴＮＦＲおよびＣＣＲ９；成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体化ホルモン；グルカゴン；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；凝固因子、例えば第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子およびフォンビルブラント因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ；微生物タンパク質、例えばβ−ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子の受容体；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養因子−３、−４、−５または６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）；神経成長因子、例えばＮＧＦ−β；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、例えばａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）；形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−１（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インスリン様増殖因子結合タンパク質、ＣＤタンパク質、例えばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９；エリスロポエチン；骨誘導性因子、免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−βおよび−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１からＩＬ−２１；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；細胞表面膜タンパク質；輸送タンパク質；ホーミング受容体；調節タンパク質；崩壊促進因子；ならびにウイルス抗原、例えばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２エンベロープタンパク質の一部。

本発明の文脈における別の好ましい糖タンパク質は、抗体である。用語「抗体」は、本明細書で使用するとき、抗体全体および任意の抗原結合断片（すなわち、抗原結合部分）またはその一本鎖を含む。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖またはその抗原結合部分を含む糖タンパク質を意味する。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｈと略記する）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略記する）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣ_Ｌで構成される。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、より保存され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。各々のＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、以下のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。典型的には、抗体は、ＣＨ２ドメインにおいて、アスパラギン残基Ｎ２９７でグリコシル化される。有意な数の抗体はまた、それらの可変領域にさらなるグリコシル化部位（すなわち、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒトリペプチド）を有し、Ｎ結合グリコシル化は、血清ＩｇＧの重（ＶＨ）鎖および軽（ＶＬ）鎖と、いくつかのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の両方の可変（Ｖ）ドメインにおいて見出すことができる。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される抗原結合断片の例としては、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｖ_ＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_ＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）Ｖ_ＨからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４−５４６頁（１９８９年））；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；または（ｖｉｉ）場合により合成リンカーによって連結され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せが挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶ_ＬおよびＶ_Ｈは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え方法を用いて、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が対をなし、一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）として知られ、例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８年、２４２巻：４２３−４２６頁、およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８年、８５巻：５８７９−５８８３頁を参照されたい）として作製されることを可能にする合成リンカーにより連結され得る。このような一本鎖抗体はまた、抗体の抗原結合部分および抗原結合断片という用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知な慣用技術を用いて得られ、断片はインタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。

用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とは、本明細書で使用するとき、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体を意味する。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、単一の結合特異性を示し、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を意味する。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化された細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。

用語「組換えヒト抗体」には、本明細書で使用するとき、組換え手段によって調製、発現、作製または単離されるすべてのヒト抗体を含み、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）他のＤＮＡ配列にヒト免疫グロブリン遺伝子配列をスプライシングすることを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体が挙げられる。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態において、このような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列にトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞突然変異誘発）に供され得、したがって、組換え抗体のＶ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列に由来し、それられに関連するが、インビボでヒト抗体の生殖系列レパートリー内に天然には存在しない配列である。

本明細書で使用するとき、「異種抗体」は、このような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物に関して定義される。この用語は、トランスジェニック非ヒト動物からなっていない生物において見出され、および一般的にトランスジェニック非ヒト動物以外の種から見出されるものに対応するアミノ酸配列またはコード核酸配列を有する抗体を指す。

用語「ペプチド」とは、本明細書で使用するとき、ペプチドアミド結合によって連結されたアミノ酸モノマーの鎖を意味する。ペプチドは、約１０個以下のアミノ酸の短鎖であり得る。ペプチドは、約７０個以上のアミノ酸の長鎖またはその中間のいずれかのものであってもよい。本発明の文脈において、エンドプロテイナーゼによって放出される組換え糖タンパク質の断片は、それがグリカンを有する場合、ペプチドまたは糖ペプチドと呼ばれる。

本明細書でするとき、「親和性リガンド」とは、目的の組換え糖タンパク質に特異的に結合するリガンドを意味する。この親和性リガンドは、アフィニティークロマトグラフィーを用いて、哺乳動物の液体試料中の、例えば、血清または血漿中の他の化合物から目的の組換え糖タンパク質を分離するために使用される。典型的には、組換え糖タンパク質が抗体である場合、親和性リガンドは抗原である。他の組換えタンパク質について、親和性リガンドは、典型的には、組換えタンパク質の結合パートナーまたは基質である。組換えタンパク質が融合タンパク質である場合、親和性リガンドは、典型的には、融合タンパク質のエフェクタードメインの結合パートナーまたは基質であり、例えば、受容体のリガンドまたはその逆である。あるいは、親和性リガンドは、上記組換えタンパク質に特異的な抗体または融合タンパク質の上記エフェクタードメインに特異的な抗体であってもよい。特に、組換え糖タンパク質の断片を含む固定化されたグリカンのうちのグリカンをさらに分析する場合、好ましくはアフィニティーリガンドはグリコシル化され、すなわち、グリカンを有しないまたは少なくともＮ−グリカンを含まない。当業者は、プロテインＡおよびプロテインＧまたは任意の他の一般的なＦｃドメイン結合タンパク質は、内因性抗体を含有する哺乳動物の液体試料中の、特に血清および血漿についての、目的とする特定の組換えＦｃ融合タンパク質または抗体に対する親和性リガンドとして適切ではないことを理解する。

用語「抗原」は、本明細書で使用するとき、適応免疫応答を引き起こす物質であり、免疫原とも呼ばれ得る物質である。抗原は、抗体の抗原結合部位に結合する。抗原は、典型的には、高分子量であり、タンパク質または多糖類である。本明細書で使用するとき、抗原はまた、エピトープ、例えばペプチドを含む、抗原の免疫原性部分を指してもよい。ペプチド、脂質、核酸および多数の他の物質はまた、抗原として機能し得るまた、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または他の合成マトリックスなどのより大きなキャリアタンパク質に化学的に結合する場合、ハプテンと呼ばれるより小さな物質に対して免疫応答が生じ得る。

本明細書で使用するとき、「特異的結合」、「選択的結合」および「選択的に結合する」ならびに「特異的なリガンド」とは、融合タンパク質のエフェクタードメインなどの所定の組換え糖タンパク質に結合するまたは抗体に結合する親和性リガンドを意味する。例えば、一実施形態において、リガンドは、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００機器における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定した場合、約１０^−７Ｍ未満、例えば、約１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満または１０^−１０Ｍ以下などの親和性（ＫＤ）で組換え糖タンパク質に結合し、液体試料中の非特異的抗原または他の糖タンパク質への結合についてその親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で所定の組換え糖タンパク質に結合する。したがって、本発明の文脈において、「特異的なリガンド」とは、リガンドが組換え糖タンパク質に選択的に結合し、それにより、試料中に存在する他の糖タンパク質から、特に試料中に存在する他の抗体から組換え糖タンパク質を分離することを意味する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書において、「抗原に選択的に結合する抗体」という用語と交換可能に使用され、「抗原が抗体に特異的である」というように逆に、同様に使用され得る。

用語「溶出液」とは、本明細書で使用するとき、固体支持体から放出される物質に関する。これは、溶出中に使用される緩衝液もしくは溶液または異なる緩衝液もしくは溶液を含み得る。

本明細書で使用するとき、「ＬＣ」とは、質量分析と組み合わせることができる液体クロマトグラフィーを意味し、本明細書において「ＬＣ−ＭＳ」と称される。ＬＣ−ＭＳは、さらに、タンデムＭＳを含むことができる。用語「逆相ＬＣ」または「ＨＰＬＣ」（ＲＰ−ＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ）は、本明細書で使用するとき、非極性固定相および水性である中程度の極性移動相を有し、例えば、ＲＭｅ_２ＳｉＣｌで表面修飾されたシリカが挙げられ、この場合、Ｒは、直鎖アルキル基、例えば、Ｃ_１８Ｈ_３７またはＣ_８Ｈ_１７（ＬｅｈｔｏおよびＨｏｕ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅｓ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＆ Ｃｏ．、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、２０１１年、１７０頁）。本発明の文脈においては、逆相において使用される移動相がＭＳとより適合性が高く、従って順相ＬＣ−ＭＳよりも感度が高いため、「逆相ＬＣ−ＭＳ」が好ましい。

本明細書で使用するとき、「ナノ−ＬＣ」またはナノ−ＨＰＬＣ（ＲＰ−ナノ−ＬＣまたはＲＰ−ナノ−ＨＰＬＣ）は、従来のＬＣまたはＨＰＬＣと比較して、それぞれ、ＬＣについて使用されるカラムの減少した内径（１０−１５０μｍ）、およびより遅い流速（１０−１０００ｎｌ／分）によって特徴付けられる。このダウンスケーリングは、ナノ−ＬＣシステムの高いプレート数および低フェムトモル濃度およびサブフェムトモル濃度範囲のタンパク質性試料を分析する能力をもたらす（Ｃｈｅｒｖｅｔら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６年、６８巻：１５０７−１２頁）。液体クロマトグラフィーの分野における理解および通常の一般知識と一致して、本発明によれば、ナノ−ＬＣおよびナノ−ＨＰＬＣは、本発明の目的で、それぞれ、ＬＣおよびＨＰＬＣの適切であり、意図された形態であること、ならびにＲＰ−ナノ−ＬＣおよびＲＰ−ナノ−ＨＰＬＣは、それぞれ、ＲＰ−ＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣの適切な形態および意図された形態、さらには好ましい形態であることが理解される。同様のことが、本発明の目的で、ＬＣおよびＲＰ−ＣＬの適切であり、意図された形態である、それぞれ、マイクロ−ＬＣおよびキャピラリ−ＬＣ、またはＲＰ−マイクロ−ＬＣおよびＲＰ−キャピラリ−ＬＣの同様に周知であり、確立された技術にもあてはまる。ＬＣ、ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳまたはＨＰＬＣ−ＭＳという用語が本明細書において使用される場合、これはまた、それらの好ましい実施形態、ナノ−ＬＣ、ナノ−ＨＰＬＣ、ナノ−ＬＣ−ＭＳまたはナノ−ＨＰＬＣ−ＭＳおよびそれらの逆相形態を包含する。

本発明の目的で、ＲＰ−ＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣの「移動相」は、好ましくは、ｐＨおよびイオン化状態を制御し、イオン対形成試薬として作用するイオン変性剤による、水中の有機修飾剤（例えば、アセトニトリルまたはメタノール）の勾配である。アニオン性イオン対試薬（例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））は、ペプチドのプロトン化された塩基性基に結合する。０．１％ＴＦＡの添加は溶離剤を酸性化し、ペプチドおよびタンパク質のカルボキシル基をプロトン化させ、分子のより大きな疎水性をもたらす。カチオン性イオン対形成試薬（例えば、トリエチルアンモニウムイオン）は、ペプチドのイオン化されたカルボキシル基に結合する（「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｌｉｂｒａｒｙ、６１巻、Ｋａｓｔｎｅｒ Ｍ編集、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂ．Ｖ．、２０００年、１５３頁）。また、ジエチルアミン（ＤＥＡ）をイオン対形成試薬として使用することができる（Ｍｅｌｍｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ（２０１１年）、１２１８巻、１号、１１８−１２３頁）。例えば、２−ＡＢ標識されたＮ−グリカンの順相またはＨＩＬＩＣクロマトグラフィーについて、適切な移動相は、例えば、７５％アセトニトリル中の６０ｍＭｏｌのギ酸アンモニウム（移動相Ａ）および５４％アセトニトリル中の１１５ｍＭｏｌのギ酸アンモニウム（移動相Ｂ）からなる（Ｍｅｌｍｅｒら、Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ（２０１０年）、３９８巻：９０５−９１４頁）。

本明細書で使用するとき、「イオントラップ質量分析」は、質量／電荷の比率が所望の範囲にあるイオンが、最初に高周波電気四重極電界の影響下で安定した経路を描くようにされ、次に、それらの相対的な質量／電荷比に応じて経路不安定性を選択的に誘導するようにその電界を調整することにより、検出器、例えば、四重極イオントラップに分離され、提示される構成である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｉｃｇｌｏｓｓａｒｉｅｓ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｍａｓｓ＿ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ａｓｐを参照されたい）。本発明の方法の感度は、より感度の高いナノＥＳＩ源を使用することによって改善することができる。

本発明の目的で、すべての「Ｎ−グリカン」は、共通のコア糖配列、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを有すると理解され、（１）マンノース残基だけがコアに結合した「オリゴマンノース」（高マンノース）、（２）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃＴｓ）によって開始される「アンテナ」がコアに結合した「複合体」；および（３）マンノース残基だけがコアのＭａｎα１−６アームに結合し、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃＴｓ）によって開始される１つまたは２つのアンテナがＭａｎα１−３アーム上にある「ハイブリッド」の３つのグループに分類される（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、第二版、Ｖａｒｋｉら編集、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ）：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；２００９年；第８章）。

本発明の目的で、一般的に、「１回の実施で」、「１回のアプローチで」または「単回の（分析）アプローチで」、酸性もしくは中性のグリカン、Ｎ−グリカンまたはグリカンの分析への言及は、ＭＳ分析がＬＣまたはＲＰ−ＬＣステップに直接連結される（すなわち、換言すると、オンラインで実施される）ことを意味する。これは、ＲＰ−ＬＣとＭＳ分析の間にさらなる分析または調製ステップがないことを意味する。これは、蛍光検出がＲＰ−ＬＣとＭＳの間で起こることを排除するものではないことが理解される。実際に、ＲＰ−カラム上で分離される２−ＡＡ標識されたグリカンの蛍光検出は、標識されたグリカンを通過する蛍光検出器（ＦＬＤ）が、典型的にはＨＰＬＣ／ＬＣシステムのモジュールであるため、ＬＣシステムから出て、ＭＳに進行する前に通常（および有利に）起こる。これはまた、「ＬＣ−ＭＳ」または「ＲＰ−ＬＣ−ＭＳ」と呼ばれる。

用語「酵素的切断」とは、本明細書で使用するとき、酵素を伴い、ほとんどの非特異的に結合した糖タンパク質の溶出を回避しながら組換え糖タンパク質の放出を可能にする糖タンパク質の任意の切断を意味する。酵素的切断は、エンドグルカナーゼまたはエンドプロテイナーゼを使用して行うことができ、ここで、エンドプロテイナーゼが好ましい。この酵素は、目的の組換え糖タンパク質に対して選択的である必要がある。これは、特異的な切断部位がまれであり、好ましくは目的の組換え糖タンパク質だけに存在し、または付加的にいくつかの他の糖タンパク質、例えば、糖タンパク質の特定のファミリーまたは同じドメインを全てが含む糖タンパク質のグループに存在することを意味する。より選択的な酵素は、固体支持体からの非特異的に結合した糖タンパク質の断片の溶出を回避する。好ましくは、酵素は、組換え糖タンパク質を効率的におよび特異的に（例えば、既知の切断部位でのみ）切断する。適切な酵素は、例えば、特定のコンセンサス配列で特異的に目的の組換え糖タンパク質内で切断し、狭い基質特異性（または高い選択性）を有するエンドプロテイナーゼである。好ましくは、エンドプロテイナーゼは、目的の組換え糖タンパク質または目的の組換え糖タンパク質に含まれるドメインに対して特異的（および／または選択的）である。例えば、適切なエンドプロテアーゼは、目的の組換え糖タンパク質または目的の組換え糖タンパク質を含む本質的に同じドメインを含むタンパク質のグループを特異的に切断するだけである。本質的に同じドメインを含むタンパク質のグループの例は、抗体およびＦｃ融合タンパク質であり、全てはＦｃドメインを含む。適切な酵素は、目的の組換え糖タンパク質中にまたは目的の組換え糖タンパク質内の各々の同一のポリペプチド鎖内に優先的にただ１つの切断部位を有する。用語「エンドペプチダーゼ」、「エンドプロテイナーゼ」、「プロテイナーゼ」または「プロテアーゼ」は、本明細書において交換可能に用いられる。

好ましくは、放出されるグリカン含有断片は、１つのグリカンを含むペプチドである、または放出されるＦｃドメインの場合、各々、１つのグリカンを含む２つの同一のペプチドである。例えば、固体支持体から組換え糖タンパク質のＦｃドメインを含有するグリカンを放出するための、本発明の方法に適したエンドプロテアーゼは、パパイン、フィシン、システインプロテアーゼＳｐｅＢ（ＦａｂＵＬＯＵＳ）またはシステインプロテイナーゼＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標））などのエンドプロテアーゼである。好ましくは、エンドプロテイナーゼは、システインプロテイナーゼＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標））である。例えば、ＩｄｅＳは、定常配列ＥＬＬＧＧＰＳの２つのグリシン間のヒンジ領域においてヒトＩｇＧを特異的に切断し、ＳｐｅＢは、配列ＫＴＨＴＣＰＰＣ内のスレオニンとシステインの間のヒンジ領域において切断する。酵素的切断はまた、特定のＮ−またはＯ−グリコシル化部位に特異性を有するグリカナーゼを用いて行うことができる。このようなグリカナーゼは、ＩｇＧ Ｆｃドメイン含有の糖タンパク質中のＮ−グリカンに特異的であり、還元末端で第一のＧｌｃＮＡｃ後で切断する、例えば、ＥｎｄｏＳＧｌｙｃａｎａｓｅ（ＩｇＧＺＥＲＯ（登録商標））である。

あるいは、因子ＩＸ−アルブミン（ＦＩＸ−アルブミン）などの融合タンパク質は、ＦＩＸの活性化ペプチドのＮ末端に由来するアミノ酸１３７−１５３に基づくリンカー配列を２つのドメイン間に含む。ＦＸＩａまたはＦＶＩＩａ／ＴＦのいずれかによる、ＦＩＸ−組換えアルブミン融合タンパク質の活性化は、リンカーを切断し、それにより融合タンパク質のＦＩＸａ部分およびｒＨＡ部分を分離する。したがって、ＦＸＩａおよび／またはＦＶＩＩａ／ＴＦは、ＦＩＸ−アルブミンを選択的に切断するのに適している。また、第Ｘａ因子は、多くの条件下で非常に低い非特異的切断を示す部位特異的プロテアーゼである。したがって、第Ｘａ因子は、第Ｘａ因子切断部位（配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇのアルギニンの後の切断）を含む糖タンパク質を切断するために使用され得る。第Ｘａ因子キットは、例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ（６９０３６−３）から入手可能である。同様に、トロンビンは、組換え融合タンパク質の配列ＬｅｕＶａｌＰｒｏＡｒｇＧｌｙＳｅｒのアルギニンとグリシンの間を特異的に切断するための部位特異的プロテアーゼである。

用語「固体支持体」とは、本明細書で使用するとき、特にアフィニティークロマトグラフィーにおいて、固体支持体の上にリガンドを固定化するために使用することができる任意の固体表面を意味する。典型的には、アフィニティークロマトグラフィーに適した「固体支持体」はレジンであり、例えば、大きな表面積を有するマイクロビーズを含むレジンである。本発明において特に好適なレジンは、セファロースビーズ、アガロースビーズまたは磁気ビーズであり、ここで、セファロースビーズが好ましい。用語「固定化された」とは、直接的または間接的のいずれかでの、固体支持体への共有結合または非共有結合を意味する。典型的には、親和性リガンドは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、臭化シアン、エポキシド、カルボジイミドまたはチオプロピル反応性基を介して固体支持体に共有結合される。上記の反応性基の１つで活性化された市販のマイクロビーズは、当該技術分野において公知であり、例えば、ＮＨＳ活性化セファロースである。組換え糖タンパク質が固体支持体に固定化されたまたはカップリングされたその特異的な親和性リガンドに結合すると、組換え糖タンパク質は、親和性リガンドへの非共有結合を介して固体支持体上に固定化される。

用語「哺乳動物の液体試料」とは、本明細書で使用するとき、細胞、タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの生物学的材料を含む、特定の時点での哺乳動物から得られる任意の液体試料を意味する。典型的には、液体試料は、血清または血漿などの体液である。しかしながら、液体試料はまた、全血、尿、脳脊髄液、羊水、唾液、汗、精液、涙、痰、膣分泌物、膣洗浄液または結腸洗浄液であってもよい。好ましくは、試料は、本発明の方法に供される前に、例えば、遠心分離によって、細胞または破片から除去される。液体試料が目的の組換え糖タンパク質を含むためには、上記組換え糖タンパク質の哺乳動物への投与後に、試料が得られていなければならない。本発明の文脈において、組換え糖タンパク質は、生物医薬的または治療的に活性な組換え糖タンパク質として理解されるべきである。当業者は、液体試料または液体試料の「アリコート」を本発明で使用できることを理解する。液体試料のアリコートだけを用いて、本発明の方法に従って分析する場合、同じ試料の他のアリコートは、タンパク質濃度などの異なるパラメータについて分析されてもよく、または後の分析のために凍結保存されてもよい。

用語「定量下限（ＬＬＯＱ）」とは、本明細書で使用するとき、適切な正確さおよび精度で定量的に決定され得る試料中の分析物の最低濃度を意味し、ここで、分析物は組換え糖タンパク質である。ＬＬＯＱは、典型的には、μｇ／ｍｌとして与えられる。当業者は、それが分析に使用される試料の量に強く依存することを理解する。

用語「参照標準」とは、本明細書で使用するとき、分析されるべきグリカンを標識するために使用される同位体変種とは異なる蛍光標識の同位体変種で標識された既知の相対分布を有するグリカンの標準化された混合物を意味する。同位体標識は、例えば、蛍光標識の安定な（好ましくは重）同位体変種、例えば、^１３［Ｃ_６］−２ＡＡを用いて、還元末端でグリカンに導入することができる。グリカンの混合物は、分析される少なくともグリカン構造を含む。この混合物はさらに標準化されており、これは、グリカンの同一の混合物が、実験の各々の試料に添加され、または互いに比較される各々の試料に添加されることを意味する。好ましくは、組換え糖タンパク質の１つのバッチのグリカンは、放出され、標識され、および使用するまで凍結保存される。参照標準の使用は、試料調製およびナノＬＣ−ＭＳ分析における変動を補償し、より正確な結果をもたらす。したがって、それは、好ましくは試料に可能な限り早く添加される。さらに、参照標準は、グリカン構造を個々に分析することを可能にする。これは、各々のグリカン構造の量が、各々の試料内のグリカンの相対的な割合というよりはむしろ、参照標準における個々のグリカンの既知の相対分布に基づいて、参照標準のそれぞれのグリカン構造に対して個々に定量され得ることを意味する。したがって、個々のグリカン構造のＰＫパラメータを決定することができる。

用語「ハイスループット」は、本明細書で使用するとき、多数の試料、例えば、１０個超、５０個超、１００個超、５００個超または１０００個超の試料の、迅速であり、かつ、非常に並行的な試料調製を可能にするモードまたは方法に関する。

本発明の目的で、％への言及は、他に明確な記述がない限り、（ｖ／ｖ）を指すと理解される。

本明細書で使用するとき、用語「約」は、数値（例えば、ｐＨ値または割合値）と一緒に使用される場合、その値から２０％、好ましくは１０％、より好ましくは５％、さらにより好ましくは２％、最も好ましくは１％の偏差を包含することが意図される。数値と一緒に使用される場合、同時に、本発明による好ましい実施形態としての正確な数値を個々に開示するものと理解されるべきである。

本明細書で使用するとき、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の両方を包含するものとして解釈されるべきであり、両者の意味は、具体的に意図され、したがって、個別に開示された、本発明による実施形態である。

したがって、本発明は、哺乳動物の液体試料中の目的の組換え糖タンパク質のグリカンを分析する方法であって、ａ）目的の組換え糖タンパク質を含む、哺乳動物の２つ以上の液体試料を用意するステップ；ｂ）上記各試料の組換え糖タンパク質を、試料中の組換え糖タンパク質に特異的な親和性リガンドがカップリングした別個の固体支持体上に、固定化するステップ；ｃ）組換え糖タンパク質の酵素的切断によって、固体支持体から、上記各試料の組換え糖タンパク質のグリカン含有断片を、別個の溶出液に放出するステップ；ｄ）場合により、別個の溶出液中の上記各試料の組換え糖タンパク質のグリカン含有断片から、グリカンを放出させるステップ；ｅ）上記各試料のグリカンを、蛍光標識の第一の安定同位体で標識するステップ；およびｆ）ＬＣ−ＭＳを用いて、上記各試料のステップｅ）の標識されたグリカンを別々に分析し、上記２つ以上の試料を比較するステップを含み、ここで、蛍光標識の第二の安定同位体で標識されたグリカンを含む参照標準が、ステップｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）の前に上記各試料に添加され、参照標準は、ステップｆ）の標識されたグリカンとともに分析される方法に関する。参照標準は、プロセス中の初期に添加されることが好ましい。したがって、参照標準は、ステップｆ）の前に、好ましくはステップｅ）の前にまたはステップｄ）の前に、さらに好ましくはステップｃ）の前に添加され得る。本発明の方法のすべてのステップは、哺乳動物から得られた２つ以上の各液体試料について別々に実施される。

本発明はまた、ステップｃ）において上記固体支持体に固定化されたままの、上記各試料の組換え糖タンパク質の第二のグリカン含有断片のグリカンを分析するステップをさらに含む方法に関し、方法は追加で、ａａ）ステップｂ）の前に、哺乳動物の２つ以上の各液体試料を予備洗浄して、固体支持体に非特異的に結合する糖タンパク質を除去するステップ；ｄｄ）ステップｃ）の後に固体支持体上に残っている、上記各試料の組換え糖タンパク質の固定化された第二のグリカン含有断片から、グリカンを別個の溶液に放出させるステップ；ｅｅ）上記各試料のグリカンを蛍光標識の第一の安定同位体で標識するステップ；およびｆｆ）ＬＣ−ＭＳを用いて、上記各試料のステップｅｅ）の標識されたグリカンを別々に分析し、上記２つ以上の試料を比較するステップを含み、ここで、蛍光標識の第二の安定同位体で標識されたグリカンを含む参照標準が、ステップｄｄ）、ｅｅ）またはｆｆ）の前に上記各試料に添加され、参照標準は、ステップｆｆ）の標識グリカンとともに分析される。予備洗浄ステップａａ）は、試料を固体支持体と接触させるステップを含んでもよく、ここで、固体支持体は、ステップｂ）で使用される固体支持体と同じ材料で作られているが、上記親和性リガンドがカップリングしていない。参照標準は、プロセス中の初期に添加されることが好ましい。したがって、参照標準は、標識されたグリカンをＬＣ−ＭＳを用いて分析する（ステップｆｆ）前に、好ましくは分析すべきグリカンを標識する（ステップｅｅ）前に添加されてもよく、より好ましくは、エフェクタードメインのグリカンを放出させる（ステップｄｄ）前にカラム上に添加されてもよい。ステップｃ）において固体支持体に固定化されたままの上記各試料の組換え糖タンパク質の第二グリカン含有グリカンのグリカンをさらに分析する場合、好ましくは参照試料は、ステップｃ）の前に上記各試料に添加されていない。当業者は、本発明の方法の全てのステップが、哺乳動物から得られた２つ以上の各液体試料について別々に実施されることを理解する。

好ましくは、蛍光標識は、グリカンが糖タンパク質断片から放出された後に行われる。グリカンの放出は、当業者に周知の方法によって化学的または酵素的に行うことができる。

血清試料などの哺乳動物の液体試料からの親和性精製は、予備洗浄ステップを必要とすることがある。酵素切断後に固定された第二のグリカン含有断片のグリカンを分析すべき場合には、予備洗浄ステップが特に有利である。予備洗浄ステップは、試料を固体支持体と接触させるステップを含んでもよく、ここで、固体支持体は、カップリングされた親和性リガンドなしで組換え糖タンパク質を固定化する（ステップｂ）ために使用される固体支持体と同じ材料で作製される。非特異的に結合する糖タンパク質または糖脂質は、固体支持体に結合したままである。したがって、組換え糖タンパク質は、フロースルー、すなわち固体支持体に結合しない材料中に存在し得る。あるいは、予備洗浄ステップは、固体支持体上に組換え糖タンパク質を固定化し、続いて、固体支持体から組換え糖タンパク質を溶出させる上流の第二親和性精製ステップであってもよい。

別の態様において、本発明は、哺乳動物の液体試料中の目的のＦｃ融合タンパク質のグリカンを分析する方法に関し、ａ）Ｆｃドメインおよびエフェクタードメインを含有するＦｃ融合タンパク質を含む、哺乳動物からの２つ以上の液体試料を用意するステップ；ａａ）哺乳動物の２つ以上の各液体試料を予備洗浄するステップであって、Ｆｃ結合タンパク質を使用して、別個の固体支持体上に上記各試料のＦｃ融合タンパク質を固定化するステップであって、上記Ｆｃ結合タンパク質は、好ましくはプロテインＧまたはプロテインＡから選択され、より好ましくは上記Ｆｃ結合タンパク質はプロテインＧであるステップ；およびＦｃ融合タンパク質を溶出するステップを含む、ステップ；ｂ）上記各試料のＦｃ融合タンパク質を、試料中のＦｃ融合タンパク質のエフェクタードメインに特異的な親和性リガンドがカップリングした別個の固体支持体上に固定化するステップであって、親和性リガンドは、結合パートナーであり、またはＦｃ融合タンパク質のエフェクタードメインに特異的に結合する抗体であるステップ；ｃ）Ｆｃ融合タンパク質に特異的なエンドペプチダーゼで切断することによって、固体支持体から、上記各試料のＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインを別個の溶出液に放出するステップ；ｄｄ）ステップｃ）の後に固体支持体上に残っている、上記各試料のＦｃ融合タンパク質の固定化されたエフェクタードメインからグリカンを別個の溶液に放出するステップ；ｅｅ）上記各試料のグリカンを蛍光標識の第一の安定同位体で標識するステップ；ならびにｆｆ）ＬＣ−ＭＳを用いて、上記各試料のステップｅｅ）の標識されたグリカンを別々に分析し、上記２つ以上の試料を比較するステップを含み、ここで、蛍光標識の第二の安定同位体で標識されたグリカンを含む参照標準が、ステップｄｄ）、ｅｅ）またはｆｆ）の前に上記各試料に添加され、参照標準は、ステップｆｆ）の標識グリカンとともに分析される。

本発明の方法によれば、分析されるべきグリカンは、好ましくはＮ−グリカンである。分析されるべきＮ−グリカンは、高マンノース型、ハイブリッド型または複合型Ｎ−グリカンであり得る。あるいは、分析されるべきグリカンはまた、Ｏ−グリカンであり得る。

本発明の方法において使用される蛍光標識は、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）または８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）などのＬＣ−ＭＳ分析に適した任意の標識であり得る。しかしながら、分析されるべきグリカンおよび同じ蛍光標識の異なる同位体変種を有する参照標準を標識するために利用可能な、安定な軽同位体変種および安定な重同位体変種が存在しなければならない。好ましくは、蛍光標識は、^１２［Ｃ］および^１３［Ｃ］同位体対、より好ましくは^１２［Ｃ_６］および^１３［Ｃ_６］同位体対、さらにより好ましくは^１２［Ｃ_６］−２−アミノ安息香酸（^１２［Ｃ_６］−２−ＡＡ）および^１３［Ｃ_６］−２−アミノ安息香酸（^１３［Ｃ_６］−２−ＡＡ）同位体対である。

本発明の方法による２−ＡＡを用いた標識は、抗体または融合タンパク質などの組換え糖タンパク質の中性または酸性グリカンのマッピング（すなわち、分析）に特に有利であることが理解される。分析されるべきグリカンは、好ましくはＮ−グリカン、特に、オリゴマンノース、ハイブリッドまたは複合型のいずれかであるＮ−グリカンである。一実施形態において、Ｎ−グリカンは、Ｇ１Ｆ異性体、特に１，３または１，６ガラクトシル化を有するＧ１Ｆ異性体である。

本発明による方法において使用される参照標準は、蛍光標識の安定な（第二の）同位体で、好ましくは蛍光標識の安定な重同位体で標識されたグリカンを含む。好ましくは、参照標準は、試料中で分析されたものと少なくとも同じグリカン構造を含む。分析されるべきグリカンが、糖ペプチドなどの組換え糖タンパク質のグリカン含有断片の形態である場合、参照標準は、同等に、糖ペプチドなどの組換え糖タンパク質のグリカン含有断片の形態であるグリカンを含む。参照標準の使用は、試料調製およびナノＬＣ−ＭＳ分析における変動を補償し、より正確な結果をもたらす。したがって、それは、好ましくは試料に可能な限り早く添加される。さらに、参照標準は、試料を標準化することができるため、グリカン構造を個別に分析することを可能にする。これは、各々のグリカン構造の量が、参照標準における個々のグリカンの既知の相対分布に基づいて、参照標準のそれぞれのグリカン構造に対して個別に定量され得ることを意味する。したがって、個々のグリカン構造のＰＫパラメータを決定することができる。参照標準は、目的の組換え糖タンパク質のグリカンを放出し、グリカンを蛍光標識の安定な同位体変種の１つで標識することによって調製することができる。参照標準は、本発明におけるステップｅ）およびｅｅ）において同じであるまたは異なっていてもよい。好ましくは、ステップｅ）およびｅｅ）における参照標準は同じである。例えば、特異的融合タンパク質のグリカンを分析するために、ステップｅ）とｅｅ）の参照標準はともに、上記全長融合タンパク質から放出されたグリカンを含むことができる。あるいは、ステップｅ）における参照標準は、融合タンパク質のＦｃドメイン、アルブミンまたはトランスフェリンなどの融合パートナーから放出されたグリカンを含み得、ステップｅｅ）における参照標準は、融合タンパク質の、ＴＮＦＲの細胞外ドメインなどのエフェクタードメインから放出されたグリカンを含み得る。しかしながら、参照標準は、分析されるべきグリカンのグリカン構造を含有しなければならず、参照標準のグリカン内のグリカン構造の相対的割合を知るべきである。上記のような参照標準を使用することにより、各々のグリカン構造の相対量を別々に決定することが可能になる。

本発明の方法において分析される組換え糖タンパク質は、好ましくは融合タンパク質または抗体であり、より好ましくはＦｃ融合タンパク質または抗体である。組換えタンパク質がＦｃ融合タンパク質または抗体である実施形態において、ステップｃ）において固体支持体から放出される組換え糖タンパク質のグリカン含有断片は、好ましくはＦｃドメインである。

Ｆｃドメイン含有糖タンパク質について、本発明の方法は、ａ）Ｆｃドメインを有する目的の組換え糖タンパク質を含む哺乳動物の２つ以上の液体試料を用意するステップ；ｂ）上記各試料の組換え糖タンパク質を、試料中の組換え糖タンパク質に特異的な親和性リガンドがカップリングした別個の固体支持体上に、固定化するステップ；ｃ）組換え糖タンパク質の酵素的切断により、固体支持体から上記各試料の組換え糖タンパク質のグリカン含有断片、好ましくはＦｃドメインを、別個の溶出液に放出させるステップ；ｄ）場合により、別個の溶出液中の組換え糖タンパク質のＦｃドメインから、グリカンを放出させるステップ；ｅ）上記各試料のグリカンを、蛍光標識の第一の安定な同位体で標識するステップ；およびｆ）ＬＣ−ＭＳを使用して上記各試料のステップｅ）の標識されたグリカンを個別に分析し、上記２つ以上の試料を比較するステップを含んでもよく、ここで、蛍光標識の第二の安定な同位体で標識されたグリカンを含む参照標準が、ステップｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）の前に上記各試料に添加され、参照標準は、ステップｆ）の標識されたグリカンとともに分析される。

１つの特に好ましい実施形態において、組換え糖タンパク質は抗体であり、抗体の可変領域は、固体支持体上に固定化された親和性リガンドに結合し、好ましくは、親和性リガンドは抗原である。好ましい実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択されるＩｇＧ抗体であり、より好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である。抗体は、キメラ、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体であってもよく、好ましくは、抗体は、ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である。

別の特に好ましい実施形態において、組換え糖タンパク質は、Ｆｃドメインおよびエフェクタードメインを含むＦｃ融合タンパク質であり、エフェクタードメインは、固体支持体上に固定化された親和性リガンドに結合し、ここで、親和性リガンドは、結合パートナーまたはＦｃ融合タンパク質のエフェクタードメインに特異的に結合する抗体である。

固体支持体に固定化された上記各試料の組換え糖タンパク質の第二のグリカン含有断片のグリカンをさらに分析する場合、液体試料の予備洗浄ステップが必要である。好ましくは、予備洗浄ステップは、ステップｂ）における組換え糖タンパク質の固定化の上流の第二の親和性クロマトグラフィーであり、溶出後に試料中の組換え糖タンパク質を濃縮する。好ましくは、目的の組換えタンパク質の回収率は高く、例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上または１００％である。Ｆｃドメイン含有糖タンパク質について、組換え糖タンパク質を富化するためにＦｃ結合タンパク質を使用してもよい。Ｆｃドメイン含有糖タンパク質について、予備洗浄ステップは、好ましくは、ａａｉ）Ｆｃ結合タンパク質を用いて、固体支持体上にＦｃ含有糖タンパク質を固定化するステップであって、上記固体支持体が、ステップｂ）で使用されるカップリングされた親和性リガンドなしで、ステップｂ）において組換え糖タンパク質を固定化するために使用される固体支持体と同じ材料で作製されるステップ、およびａａｉｉ）Ｆｃ含有糖タンパク質を溶離するステップを含む。好ましくは、Ｆｃ結合タンパク質は、プロテインＧまたはプロテインＡであり、より好ましくは上記Ｆｃ結合タンパク質はプロテインＧである．Ｆｃ結合タンパク質への結合および強力な洗浄後、ＩｇＧまたはＦｃ融合タンパク質が溶出される。Ｆｃ結合タンパク質からＩｇＧおよび融合タンパク質を溶出させるための適切な方法は、当業者に公知であり、限定されないが、低ｐＨのグリシンまたはアルギニン緩衝液などの酸性条件の使用を含む。抗体のその抗原への結合または治療用融合タンパク質のその標的への結合と比較して、プロテインＧ（またはプロテインＡ）のＦｃドメインに対する親和性が典型的に低いことに起因して、回復はほぼ完了する。分析を間違える可能性のある非特異的に結合した内因性の糖タンパク質は、固体支持体に結合したままである。予備洗浄した試料を中和し、固定化されたアフィニティーリガンドを有するアフィニティーカラムに添加する。

Ｆｃ融合タンパク質について、酵素的切断によるＦｃ融合タンパク質の固定化および放出（ステップｂおよびｃ）後、固体支持体上に残っているＦｃ融合タンパク質のエフェクタードメインのグリカンは溶液中に放出される。グリカンは、グリカン放出後に蛍光標識で標識され、参照標準と一緒に分析される。蛍光標識の第二の安定同位体で標識されたグリカンを含む参照標準は、エフェクタードメインのグリカンを放出する（ステップｄｄ）前に、分析されるべきグリカンを標識する（ステップｅｅ）前に、またはＬＣ−ＭＳを用いて標識されたグリカンを分析する（ステップｆｆ）前に、カラム上に添加される。

好ましくは、参照標準は、２−ＡＡの安定な同位体変種などの、蛍光標識の安定同位体変種で標識されたエフェクタードメインおよびＦｃドメイングリカンの混合物からのＮ−グリカンを含む。

一実施形態において、組換えタンパク質は、抗体またはＦｃ融合タンパク質であり、予備洗浄ステップは、ａａｉ）Ｆｃ結合タンパク質を使用して、固体支持体上にＦｃ含有糖タンパク質を固定化するステップであって、上記Ｆｃ結合タンパク質は、好ましくはプロテインＧまたはプロテインＡから選択され、より好ましくは上記Ｆｃ結合タンパク質はプロテインＧであるステップ；およびａａｉｉ）Ｆｃ含有糖タンパク質を溶出するステップであって、上記予備洗浄ステップで使用される固体支持体は、ステップｂ）で使用される固体支持体と同じ材料で作られているが、上記親和性リガンドがカップリングしていないステップを含む。

糖タンパク質のグリカン含有断片を放出する、本発明の方法による酵素的切断は、エンドグルカナーゼまたはエンドプロテイナーゼを用いて行うことができ、ここで、エンドプロテイナーゼが好ましい。好ましくは、エンドプロテイナーゼは、組換え糖タンパク質を効率的におよび特異的に（例えば、既知の切断部位でのみ）切断する。より好ましくは、酵素は、目的の組換え糖タンパク質に対してさらに選択的である。これは、特異的切断部位がまれであり、目的の組換え糖タンパク質および糖タンパク質の特定のファミリーなどの他のいくつかの糖タンパク質、またはＦｃ含有糖タンパク質などの同一ドメインをすべて含む糖タンパク質のグループにのみ存在することを意味する。より選択的な酵素は、固体支持体からの非特異的に結合した糖タンパク質の断片の溶出を回避または低減する。好ましくは、放出されたグリカン含有断片は、１つのグリカンを含むペプチドであるまたは放出されたＦｃドメインの場合、各々、１つのグリカンを含む２つのペプチドである。例えば、固体支持体から組換え糖タンパク質のグリカン含有Ｆｃドメインを放出させるための、本発明の方法に適したエンドプロテイナーゼは、パパイン、フィシン、システインプロテアーゼＳｐｅＢ（ＦａｂｕｌＯＵＳ）またはシステインプロテイナーゼＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標））などのエンドプロテアーゼであり、好ましくは、エンドプロテイナーゼは、システインプロテイナーゼＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標））である。ＩｄｅＳは、定常配列ＥＬＬＧＧＰＳの２つのグリシン間のヒンジ領域にあるヒトＩｇＧを特異的に切断する。エンドプロテイナーゼを用いた酵素的切断は、典型的には非常に効率的であり、その結果、グリカン含有糖タンパク質断片をほぼ完全に放出させる。（例えば、アルギニンまたはグリシンを使用して）それぞれのリガンドを介して固定化された治療用抗体または融合タンパク質の酸性溶出と比較して、酵素的切断による溶出は、多くの場合、より効率的で完全であり、したがって、本発明の方法の感度がより高くなる。Ｌｙｓまたはトリプシンのカルボニル側で特異的に加水分解するＬｙｓ−Ｃなどの非選択的なエンドプロテイナーゼは、大部分の糖タンパク質内で数回切断し、本発明の文脈において十分には適さない。

酵素的切断はまた、特定のＮ−またはＯ−グリコシル化部位に特異性を有するグリカナーゼを用いて行うことができる。このようなグリカナーゼは、例えば、Ｆｃドメイン含有糖タンパク質中のＮ−グリカンに選択的であるエンドＳグリカナーゼ（ＩｇＧＺＥＲＯ（登録商標））である。しかしながら、ＦｃドメインのＮ−グリカン中のＧｌｃＮＡｃ−β１，４−ＧｌｃＮＡｃ結合を切断し、したがって、フコースを欠損しているグリカンを放出する。このようにして、エンドＳグリカナーゼは、フコシル化が目的ではない場合にのみ適している。

融合タンパク質において、エフェクタードメイン、およびＦｃドメイン、アルブミンまたはトランスフェリンなどの融合パートナーのＮ−グリカンを別々に分析して、部位特異性に関するさらなる情報を得ることができる。以下では、本発明による方法は、Ｆｃ融合タンパク質について例示される。しかしながら、当業者は、この方法を他の融合タンパク質に適合させる方法を知っている。Ｆｃ部分およびエフェクタードメインＮ−グリカンの個々の分析について、２つの部分を分離しなければならない。したがって、融合タンパク質は、そのエフェクタードメインとともに、セファロースレジンなどの固体支持体上に固定化され、Ｆｃ部分は、ＩｄｅＳ酵素などの酵素を用いて酵素的に放出される。ＩｄｅＳは、Ｆａｂ２およびＦｃ断片を産生するヒンジ領域より下で、高い特異性でＩｇＧおよび関連分子を選択的に切断するエンドペプチダーゼである。ＩｄｅＳはまた、ＩｇＧ Ｆｃドメイン含有融合タンパク質を切断する。融合タンパク質は、ジスルフィド架橋によって連結され、相互作用パートナーまたは抗原およびＦｃドメインに結合することができるエフェクタードメイン（例えば、受容体部分）に切断される。あるいは、エフェクタードメインのグリカンとＦｃドメインのグリカンとの間を選択的に切断する、任意の他のエンドプロテイナーゼを使用することができる。あるいは、他の融合タンパク質について、適切なエンドプロテイナーゼは、エフェクタードメインのグリカンとアルブミンまたはトランスフェリンなどの融合パートナーのグリカンの間を切断する。好ましくは、エンドプロテイナーゼは、エフェクタードメインのグリカンとＦｃドメインのグリカンの間の融合タンパク質のみを切断する。さらにより好ましくは、エンドプロテイナーゼは、試料内の融合タンパク質またはグループ（または融合タンパク質を含むタンパク質のファミリー）を選択的に切断するが、試料内のすべてのタンパク質を切断することはない。これは、この方法のさらなる特異性を提供し、非特異的に結合した糖タンパク質の断片による汚染を低減させる。例えば、ＩｄｅＳ酵素は、抗体およびＦｃ融合タンパク質のヒンジ領域の下のＩｇＧ Ｆｃドメインを切断し、したがって、Ｆｃドメインを有さない他の混入糖タンパク質による放出されたＦｃドメインの汚染を低減させる。融合タンパク質はまた、エフェクタードメインと融合パートナーの間の分子クローニングによって導入された特異的切断部位を含むことができ、これはこの方法で使用することができる。

本発明の方法において使用される蛍光標識は、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）または８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）などのＬＣ−ＭＳ分析に適した任意の標識であり得る。しかしながら、分析されるべきグリカンおよび同じ蛍光標識の異なる同位体変種を有する参照標準を標識するために利用可能な、安定な軽同位体変種および安定な重同位体変種が存在しなければならない。好ましくは、蛍光標識は、^１２［Ｃ］および^１３［Ｃ］同位体対、より好ましくは^１２［Ｃ_６］および^１３［Ｃ_６］同位体対、さらにより好ましくは^１２［Ｃ_６］−２−アミノ安息香酸（^１２［Ｃ_６］−２−ＡＡ）および^１３［Ｃ_６］−２−アミノ安息香酸（^１３［Ｃ_６］−２−ＡＡ）同位体対である。

本発明の方法による２−ＡＡを用いた標識は、抗体または融合タンパク質などの組換え糖タンパク質の中性または酸性グリカンのマッピング（すなわち、分析）に特に有利であることが理解される。分析されるべきグリカンは、好ましくはＮ−グリカン、特に、オリゴマンノース、ハイブリッドまたは複合型のいずれかであるＮ−グリカンである。一実施形態において、Ｎ−グリカンは、Ｇ１Ｆ異性体、特に１，３または１，６ガラクトシル化を有するＧ１Ｆ異性体である。

本発明の方法におけるグリカンの蛍光標識後、ゲル濾過を用いてアクセス標識（ａｃｃｅｓｓ ｌａｂｅｌ）を分離することができる。例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０カラムは水で平衡化されてもよく、蛍光標識されたグリカン、遊離した蛍光標識および場合により参照標準を含む混合物は、ゲル濾過カラムに添加される。標識されたグリカンおよび参照標準を水で溶出し、真空遠心分離機で水を蒸発させた後、乾燥試料をＬＣ−ＭＳ分析のために水に溶解し得る。当業者は、９６ウェルプレートまたは他のサイズなどのマルチウェルプレートを使用することによって、ゲル濾過は多数の試料を並行して用いて行うことができることを理解する。

組換え糖タンパク質のグリカン含有断片からのグリカンの放出は、当業者に周知な方法によって化学的にまたは酵素的に行うことができる。

例えば、その後の標識（または場合によっては分析）のためのグリカンの化学的放出は、当業者に周知であるヒドラジン分解またはアルカリ性β−脱離によって影響され得る。化学的除去のための例示的な有用キットは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって提供されるＧｌｙｃｏＰｒｏｆｉｌｅ（商標）ＩＶケミカル脱グリコシル化キットである。

酵素的方法によるグリカンの放出が好ましく、当業者に問題を生じさせない。続く標識（または分析）のためにグリカンを除去する特に好ましい方法は、ＰＮＧａｓｅＦ（ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ）を用いた消化である。様々な適切なＰＮＧａｓｅＦ酵素は、大部分が遺伝子操作されたまたは最適化されたＰＮＧａｓｅＦである、異なる商標名（例えば、Ｎ−グリカナーゼ（登録商標））で市販されているが、発明の文脈において、遺伝子操作されたまたは最適化されたＰＮＧａｓｅＦを使用することは必須ではない。酵素的放出はまた、タンパク質に結合した最初の単糖を残しているグリカンコアの２つのＮ−アセチルグルコサミン間で切断する、エンドグリコシダーゼＨ（もしくはＥｎｄｏＳグリカナーゼＩｇＧＺＥＲＯ（商標）などの類似した酵素活性を有する酵素）またはエンドグリコシダーゼＦ２を使用することによって行うことができる。しかしながら、グリカンがフコースを有するかどうかの情報は、このようにして失われる。さらに、エンドグリコシダーゼＨおよびエンドグリコシダーゼＦ２は、オリゴマンノースおよびハイブリッド二分岐性グリカンにのみ特異的である。

血清などの哺乳動物の液体試料中のグリカン分析について、オンカラム脱グリコシル化は、ステップｂ）の前に予備洗浄ステップと組み合わせてのみ使用されるべきであり、これは、セファロースレジンに非特異的に結合する内因性の血清糖タンパク質が、追加の洗浄ステップによって除去され得ないためである。Ｆｃ部分の唯一のＮ−グリコシル化部位を有する抗体は、酵素的溶出ステップに特に適している。酵素であるＩｄｅＳは、ジスルフィド結合のＣ末端のＩｇＧ重鎖を選択的に切断し、それにより、続いて、高効率で脱グリコシル化され得る２つのグリコシル化された重鎖断片を放出する。理論的には、１を超える酵素的溶出ステップを次々に行うことができる。組換え糖タンパク質の固定されたグリカン含有断片のグリカン分析について、固体支持体への組換え糖タンパク質の固定化（ステップｂ））の前に、予備洗浄ステップと組み合わせてオンカラム脱グリコシル化を実施する。好ましくは、予備洗浄ステップは、試料中の組換え糖タンパク質を富化するために親和性精製を含む。

本発明の方法において使用されるＬＣ−ＭＳは、好ましくは逆相ＬＣ−ＭＳまたはナノＬＣ−ＭＳであり、より好ましくはＬＣ−ＭＳは逆相ナノＬＣ−ＭＳである。

抗体、融合タンパク質または他の糖タンパク質を親和性精製するための方法は、当業者に公知である。使用される固体支持体は、レジン、例えばマイクロビーズ、好ましくはセファロースビーズ、アガロースビーズまたは磁気ビーズ、より好ましくはセファロースビーズを含むレジンであってもよい。しかしながら、アフィニティークロマトグラフィーに適した任意の固体支持体またはレジンは、本発明の方法に使用することができる。親和性リガンドは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、臭化シアン、エポキシ、カルボジイミドまたはチオプロピルを介して、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を介して固体支持体にカップリングさせることができる。さらに、親和性リガンドを固体支持体にカップリングさせるための方法は、当該技術分野において公知である。典型的には、上記のリンカーの１つを用いて活性化されたレジンは市販されている。

典型的には、本発明の方法を用いて分析される組換え糖タンパク質は、治療的に関連する組換え糖タンパク質である。治療的に関連する組換え糖タンパク質は、多くの場合、その治療標的に対して非常に高い親和性および特異性を有する。したがって、治療標的は、哺乳動物の液体試料から組換え糖タンパク質を捕捉し、それを固体支持体に固定化するための親和性リガンドとして十分に適している。例えば、抗体の、それぞれの抗原を用いた親和性精製は、抗体とその抗原との強い相互作用のために、非常に高い親和性および特異性の利点を有する。治療用抗体のその抗原に対する親和性は、典型的には、ピコモルから低ナノモルの範囲である。エタネルセプトなどの治療的に関連する融合タンパク質は、典型的には、類似した親和性でそれらの治療標的に結合する。しかしながら、この高い親和性結合の１つの主な欠点は、酸性溶出後の抗体または融合タンパク質の回収が限定されることである。したがって、酵素的切断を用いて糖タンパク質のグリカン含有断片を溶出することにより、回収率を改善することができる。

親和性リガンドは、任意の結合パートナーであってもよく、限定されないが、受容体のリガンド、基質、抗原または抗体が挙げられる。治療的に関連する糖タンパク質について、親和性リガンドは、好ましくは治療標的またはその断片である。親和性リガンドはまた、治療標的の変異体またはその断片、好ましくは、野生型の治療標的またはその断片と比較してより高い親和性で組換え糖タンパク質に結合する変異体であり得る。組換え糖タンパク質が抗体である場合、親和性リガンドは、好ましくは抗体に結合する抗原、より好ましくは高親和性で抗体に結合する抗原である。抗原は、例えば、短いペプチドを含む、１を超えるタンパク質の複合体、全長タンパク質またはその断片であってもよい。融合タンパク質について、親和性リガンドは、好ましくは、融合タンパク質のエフェクタードメインに結合する結合パートナーであり得る。親和性リガンドはまた、融合タンパク質のエフェクタードメインに結合する抗体であってもよい。目的の任意の他の糖タンパク質について、親和性リガンドは、同様に、結合パートナーであってもよく、または目的の組換え糖タンパク質に結合する抗体であってもよい。好ましくは、親和性リガンドはグリコシル化されていない。

本発明の方法の好ましい実施形態において、哺乳動物の２つ以上の液体試料またはそれらのアリコートは、マルチウェルフィルタープレート、好ましくは２４、９６または３８４ウェルフィルタープレート、より好ましくは９６ウェルフィルタープレートを用いて、分析用に調製される。フィルター膜は、好ましくは、ニトロセルロース膜またはポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜などの低タンパク質結合および／または親水性膜である。これらのフィルタープレートは、添加された試薬またはレジンに応じて、アフィニティークロマトグラフィー、酵素消化、蛍光標識およびゲル濾過に適している。

組換えタンパク質を含む哺乳動物の液体試料は体液であり、好ましくは、血清または血漿、尿、脳脊髄液、羊水、唾液、汗、精液、涙、痰、膣分泌物、膣洗浄液および結腸洗浄からなる群から選択される；好ましくは、上記試料は、血漿または血清試料である。好ましくは、分析されるべき試料は、約１μｌから約１０００μｌ、約５μｌから約５００μｌ、約１０μｌから約２００μｌ、約１０μｌから約１００μｌ、約２５μｌから約１００μｌ、または約４０μｌから約７５μｌ、好ましくは約５０μｌの容積を有する。好ましい実施形態において、哺乳動物の２つ以上の液体試料は、同じ対象から得られた。本発明の方法において分析される哺乳動物の液体試料は、ヒト、サル、げっ歯類、イヌ、ネコまたはブタの試料、好ましくはマウス、ラット、ハムスターまたはウサギなどのげっ歯類の試料であり得る。

本発明の方法は、目的の組換え糖タンパク質のグリカンの少なくとも１つの特定のグリカン構造の薬物動態パラメータ、好ましくはＣ_ｍａｘ、ｔ_ｍａｘ、ＡＵＣまたはｔ_１／２を決定するために使用され得る。好ましくは、哺乳動物の２つ以上の液体試料を同じ対象から異なる時間点で得た。この場合、少なくとも約２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、３３６時間、５０４時間、６７２時間、８４０時間が、最初の時点と最後の時点の間にあってもよい。好ましくは、哺乳動物の２つ以上の液体試料は、５個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上または５０個以上の試料である。

本発明の方法は、（ｉ）蛍光標識の第一の安定同位体で標識された上記各試料からのグリカンと蛍光標識の第二の同位体で標識されたそのそれぞれの参照標準グリカンの抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）の曲線下面積を決定して、第一の同位体試料グリカン対第二の同位体参照標準の比を経時的に形成させるステップ、ならびに（ｉｉ）場合により参照標準における個々のグリカンの既知の相対分布に基づいて、グリカンの割合を上記各試料について計算するステップをさらに含んでもよい。さらに、各々の個々のグリカンについての２つ以上の試料の比またはグリカンの割合は、例えば、時間に対してプロットして比較することができる。好ましくは、グリカンはＮ−グリカンである。

例えば、時間に対してプロットされた一定の重同位体標準Ｎ−グリカン（重シグナル）に対する試料Ｎ−グリカン（軽シグナル）のＬ／Ｈ比は、各々のＮ−グリカンのグリカンについてグリカンＰＫプロファイルをもたらす。あるいは、計算された試料Ｎ−グリカン割合を時間に対してプロットしてもよく、各々のＮ−グリカンのグリカンＰＫプロファイルを得ることができる。決定されたグリカンＰＫプロファイルは、それぞれのＥＬＩＳＡプロファイルと比較することができ、グリカンマップの計算の基礎となる。当業者は、安定な重同位体が分析されるべきグリカンを標識するために使用される場合、安定な軽同位体は参照標準の標識として同様に使用され得ることを理解する。換言すると、参照標準のグリカンが、分析されるべきグリカンとは異なるアイソタイプ変種の蛍光標識で標識されている限り、安定な軽および重同位体の蛍光標識が同様に適している。「重」グリカン参照標準組成は、標識されたグリカン分子の数に正比例する標識のみに依存するＵＶシグナルを用いて決定されるため、当業者は、グリカンの割合（％）がモルを指すことを理解する。

グリカンはまた、本発明の方法に従って、哺乳動物の上記２つ以上の各液体試料のアリコートにおいて分析することができる。好ましくは、分析されるべきアリコートは、約１μｌから約１０００μｌ、約５μｌから約５００μｌ、約１０μｌから約２００μｌ、約１０μｌから約１００μｌ、約２５μｌから約１００μｌ、または約４０μｌから約７５μｌ、好ましくは約５０μｌの容積を有する。場合により、上記組換え糖タンパク質の濃度は、哺乳動物の上記２つ以上の液体試料のさらなるアリコートにおいて分析することができる。一実施形態において、上記組換え糖タンパク質の濃度は、試料中の特定のタンパク質の濃度を決定するために、当業者に公知であるＥＬＩＳＡまたは任意の他の方法によって分析される。

本発明の方法に関連して実施されるべき液体クロマトグラフィー−ＭＳは、好ましくは逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＬＣ−ＭＳ）、より好ましくは逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ）または超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ−ＭＳ）である。この場合、本発明に関連して実施されるＲＰ−ＬＣの他の好ましい場合と同様に、これらのクロマトグラフィー法は、逆相液体クロマトグラフィーカラムで行われる。好ましくは、ＲＰ−ＬＣは、グリカンに結合した２−ＡＡ標識のカルボキシ基が中性である条件下で実施される。逆相ＬＣは、順相ＬＣと比較してより高感度の分析を可能にするため、本発明の方法において好ましい。これは、移動相が質量分析により適合性があるためである。場合により、イオン対形成試薬を移動相に使用しない。好ましくは、酸性移動相は、ＲＰ−ＬＣに使用される。

本発明の方法に関連して実施されるべき液体クロマトグラフィーは、好ましくは、ナノ−ＬＣまたはナノ−ＨＰＬＣであり、さらにより好ましくは逆相ナノ−ＬＣまたは逆相ナノ−ＨＰＬＣである。ナノ−ＬＣは、従来のＬＣまたはＨＰＬＣと比較して、ＬＣ（１０〜１５０μｍ）およびより遅い流速（１０〜１０００ｎｌ／分）について使用されるカラムの内径の減少によって特徴付けられる。このダウンスケーリングは、低いフェムトモル濃度およびサブフェムトモル濃度の範囲でタンパク質性試料を分析する能力をもたらし（Ｃｈｅｒｖｅｔら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６年、６８巻：１５０７−１２頁）、したがって、分析されるべき試料体積および投与後の組換え糖タンパク質のグリカンを検出する期間を減少させることが可能である。

ＲＰ−ＬＣ中に使用される適切な移動相は、ギ酸を含む。これに関して、移動相中のギ酸の好ましい量は、約０．１％から約２．０％のギ酸である。したがって、典型的な好ましい量は、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％または約１．９％のギ酸を含む。移動相中の約１．０％量のギ酸が特に好ましい。

ＲＰ−ＬＣ中に使用される別の適切な移動相は、酢酸を含む。これに関して、移動相中の酢酸の好ましい量は、再度、約０．１％から約２．０％の酢酸である。したがって、典型的な好ましい量は、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％または約１．９％の酢酸を含む。移動相中に約１．０％量の酢酸が特に好ましい。

さらに、ＲＰ−ＬＣ中に使用される移動相の適切なｐＨ値は、約１から約４の範囲、より好ましくは約１．５から約３の範囲、さらにより好ましくは約１．８から約２．９の範囲、なおより好ましくは約１．９から約２．７５の範囲、特に好ましくは約２から約２．７の範囲である。特に、約２．１から約２．１８の範囲のｐＨ値が好ましい。したがって、本明細書に記載されるおよび／または請求される方法および使用によるＲＰ−ＬＣ中に用いられる好ましい移動相は、約１．９，２，２．１，２．２，２．３，２．４，２．５，２．６または２．７のｐＨ値を有し、約２．１または約２．１８のｐＨ値が特に好ましい。

本発明の方法の過程において、ＬＣまたはＲＰ−ＬＣによる蛍光（好ましくは２−ＡＡ）標識されたグリカンの分離は、有利には、約４℃からほぼ室温の範囲の温度で、または室温（本発明の目的では室温を２３℃として定義する）で実施することができる。しかしながら、好ましくは、分離は、室温より高い温度で行われる。これに関して、約４０℃から約６０℃の範囲の温度が好ましく、約５０℃が特に好ましい。

本発明によるナノＲＰ−ＬＣまたはナノＬＣカラムの適切な流速は、当業者によって容易に知られるまたは決定される。一般的に、適切な流速は、典型的には、約５０〜１０００ｎｌ／分の範囲にある。好ましいのは、例えば，約１００〜５００ｎｌ／分の範囲の流速である。したがって、流速の好ましい値は、約１００ｎｌ／分、約２００ｎｌ／分、約３００ｎｌ／分、約４００ｎｌ／分または約５００ｎｌ／分であり、約３００ｎｌ／分の流速が特に好ましい。

上記したように、本発明の方法は、特に好ましいＬＣまたはＲＰ−ＬＣを質量分析（ＭＳ）分析に直接連結させることによって行われる方法を用いて、蛍光標識されたグリカン（好ましくは２−ＡＡ標識されたグリカン）をＬＣまたはＲＰ−ＬＣを介して分離した後に、それらをＭＳに供することを含む。これに関して適切な質量分析法には、陽イオン化質量分析などのイオントラップ質量分析が含まれる。

好ましい実施形態において、本発明の方法は、アトモル濃度の個々の標識されたグリカン、例えば、８００ａｍｏｌ程度に低い、好ましくは６００ａｍｏｌ程度に低い、より好ましくは４００ａｍｏｌ程度に低い濃度の分析を可能にする。別の好ましい実施形態において、本方法は、２０μｇ／ｍｌ以下、１０μｇ／ｍｌ以下、５μｇ／ｍｌ以下、２μｇ／ｍｌ以下、１μｇ／ｍｌ以下、０．５μｇ／ｍｌ以下、０．２μｇ／ｍｌ以下または０．１μｇ／ｍｌ以下の、哺乳動物の２つ以上の各液体試料における組換え糖タンパク質濃度で組換え糖タンパク質のグリカンを分析することを可能にする。さらに別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、各々１．０μｇ以下、０．５μｇ以下、０．２５μｇ以下、０．１μｇ以下、０．０５μｇ以下、０．０２５μｇ以下、０．０１μｇ以下または０．００５μｇ以下の組換え糖タンパク質を含む哺乳動物の２つ以上の液体試料中の組換え糖タンパク質のグリカンを分析することを可能にする。さらに別の好ましい実施形態において、少なくともステップｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）ならびに／または少なくともステップａａ）、ｄｄ）およびｅｅ）は高スループット様式で操作される。

本発明はまた、先行する請求項のいずれか一つに記載の哺乳動物の液体試料中の組換え糖タンパク質のグリカンを分析するステップ、および糖タンパク質を医薬組成物として製剤化するステップを含む、糖タンパク質ベースの医薬組成物を調製する方法に関する。場合により、組換え糖タンパク質は、糖タンパク質を医薬組成物として製剤化する前に糖鎖工学的に操作される（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。

本明細書中に引用される全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明されるが、本出願の特許請求の範囲によって与えられる保護の範囲を限定するものと見なすべきではない。

材料
２−アミノ安息香酸、エタノールアミン、ギ酸、ピコリンボラン、ＤＭＳＯ、^１３Ｃアミノ安息香酸はＳｉｇｍａ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。ＰＮＧａｓｅＦはＲｏｃｈｅ（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。酢酸、アセトニトリルおよび塩酸は、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。プロテインＧ、ＮＨＳ活性化セファロース、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−１０ ９６ウェルプレートおよび９６ウェルディープウェルプレートは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。ＴＮＦ−αはＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。リン酸緩衝生理食塩水は、Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。

マルチスクリーンＴＨＳ ＨＶフィルタープレートは、Ｍｉｌｉｐｏｒｅから得た。ファブリケーターはＧｅｎｏｖｉｓ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）であった。９６ウェルプレートは、Ｎｕｎｃ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。ＡｃｒｏＰｒｅｐ（商標）Ａｄｖａｎｃｅ Ｏｍｅｇａ（商標）１０Ｋ ９６ウェルフィルタープレートは、Ｐａｌｌ（Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。前臨床ウサギ血清試料は、Ｓａｎｄｏｚの臨床バイオアナリティクスから得た。

［実施例１］
ＩｇＧ１生物製剤の薬物動態におけるグリコール改変体の影響
前臨床ウサギ試験
前臨床試験は、ニュージーランドシロウサギで行った。１０ｍｇ／ｋｇ体重のＩｇＧ１ ｍＡｂ１（抗ＴＮＦ−α抗体）の単回皮下投与後、１回の投与前血液試料を含め、一定期間にわたって血液試料を採取した。血清試料を投与後１２個の時点で採取した。詳細なサンプリングを表１に示す。血清中のｍＡｂ１の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。残りの血清から２×５０μｌアリコートをグリカンＰＫプロファイリングに使用した。第一のアリコートを分析し、第二のアリコートをバックアップアリコートとして使用した。

抗原の再構成
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生された組換えヒト抗原（ＴＮＦ−α）を製造業者の指示書に従って再構成した。抗原をＨ_２Ｏ（１ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、室温で２時間再構成した。

^１３Ｃ２−ＡＡ標識したグリカン標準の調製
脱塩したｍＡｂのＮ−グリカン（１ｍｇ）を、ＰＮＧａｓｅＦ消化を用いて、一晩（１７時間）３７℃で放出させた。Ａｍｉｃｏｎ ３０Ｋフィルター装置を用いてＮ−グリカンをタンパク質から分離し、スピードバックを用いて乾燥させた。ピコリンボランおよび［^１３Ｃ］２−ＡＡを７０：３０（ｖ／ｖ％）のＤＭＳＯ−酢酸に溶解して、それぞれ６３および５０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。標識溶液（１５μＬ）および脱イオン水（１０μＬ）を、１５ｎｍｏｌの酵素的に放出され、乾燥されたグリカンに添加した。標識反応は、３７℃で１７時間行った。

Ｇ−１０カラム上のゲル濾過によって、余分な標識を除去した。カラムを１０ｍｌのＨ_２Ｏで馴化した。試料を脱イオン水で１００μｌに希釈し、カラムに適用した。カラムを７００μｌのＨ_２Ｏですすいだ後、精製した蛍光標識Ｎ−グリカンを６００μｌのＨ_２Ｏで溶出した。精製された［^１３Ｃ］２−ＡＡ標識Ｎ−グリカンを分注し、使用するまで−２０℃で保存する。

固定化抗原を含む９６ウェルプレートアフィニティーカラムの調製
親水性低タンパク質結合膜を含む９６ウェルフィルタープレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＴＨＳ ＨＶフィルタープレート）の膜を１ｍＭ ＨＣｌ（１００μＬ）で湿潤させた後、１ウェルあたり２００μＬのＮＨＳ活性化セファロース−イソプロパノールスラリーを添加した。イソプロパノールを遠心分離によって除去し、カラムを１ｍＭ ＨＣｌ（１５０μＬ）で４回洗浄した。抗原溶液（１００μＬ；５０μｌ／ｍｌ）をカラムに遠心分離し、カップリング反応を周囲温度で２時間行った。アフィニティーカラムを洗浄し、残りのＮＨＳ基は、エタノールアミン緩衝液（１５０μＬ）を用いて不活性化させた。最後に、カラムをＰＢＳで平衡化した。

ＩｇＧ１生物薬剤の親和性精製およびグリカン放出
血清試料（５０μＬ）をＰＢＳで１００μＬに希釈し、遠心分離によって親和性精製カラムに適用した。結合したｍＡｂをＰＢＳで数回洗浄し、血清および非特異的に結合したタンパク質を除去した。ファブリケーター溶液（１Ｕ／μｌ）をカラムに遠心分離し、ｍＡｂのグリコシル化Ｆｃ部分を放出させた。反応は３７℃で３０分間行った。放出されたＦｃ部分をＰＢＳで溶出し、^１３Ｃ−２−ＡＡ標識されたＮ−グリカン標準液とともにＰＮＧａｓｅＦを添加した。この混合物を３７℃で１７時間インキュベートした。残りのタンパク質は、１０Ｋのカットオフ膜を有する９６ウェルプレートを用いた限外濾過によって除去された。グリカン標準とともに放出されたＮ−グリカンを真空遠心分離によって乾燥させた。

Ｎ−グリカン標識
遊離還元末端Ｎ−グリカンおよび^１３Ｃ２−ＡＡ標識したグリカン標準を含む乾燥試料をＨ_２Ｏ（１０μＬ）に溶解し、２−ＡＡ標識溶液（１５μＬ；ＤＭＳＯと酢酸の７：３混合液中の１００ｍｇ／ｍＬピコリンボラン、５０ｍｇ／ｍＬの２−ＡＡ）を添加し、３７℃で１７時間インキュベートした。

ゲル濾過
その後、ゲル濾過により過剰の標識を除去する。特注の９６ウェルプレートＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０カラムを８００μＬのＨ_２Ｏで平衡化した。標識された試料をＨ_２Ｏで１００μＬまで充填し、ゲル濾過カラムに適用した。２−ＡＡおよび^１３Ｃ２−ＡＡ標識したＮ−グリカンをＨ_２Ｏ（１５０μＬ）で溶出した。最後に、試料を真空遠心分離によって乾燥させ、ナノＬＣ−ＭＳ分析のために２０μＬのＨ_２Ｏに溶解させた。

標識したＮ−グリカンのナノＬＣ
標識した試料Ｎ−グリカンおよび重同位体標準をＲＰナノＬＣ−ＭＳによって分析した。ナノＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００）を、製造業者のマニュアルに従い、予備濃縮カラム（３μｍ粒子、７５μｍ×２ｃｍ）および分析用カラム（２μｍ粒子、７５μｍ×２５ｃｍ）を用いて、「予備濃縮」モードに設定した。カラムコンパートメントを４０℃に保持した。ナノポンプの移動相は、Ｈ_２Ｏ中の０．５％ギ酸（成分Ａ）および５０％ＡＣＮ中の０．５％ギ酸（成分Ｂ）からなっていた。キャピラリーポンプの移動相は、Ｈ_２Ｏ中の０．５％ギ酸および１％ＡＣＮ（成分Ｃ）からなっていた。分析用カラムを２％の成分Ｂを用いて３００ｎｌ／分の流速で平衡化した。予備濃縮カラムを１００％の成分Ｃを用いて平衡化した。ユーザー定義の注入の所定操作により、８μｌの試料溶液を２０μｌの試料ループ中の泳動溶液（０．１％ギ酸、超純水中１％ＡＣＮ）の間に積み重ねた。試料ループを毛細管ポンプフローのインラインで２分間切り替え、最適な捕捉を可能にした。次の注入試料の前に、ループを泳動溶液で洗浄した。捕捉後、予備濃縮カラムをナノポンプフローに切り替え、成分Ｂを６０分かけて３０％に、次に５分かけて９５％に上昇させた。９５％の成分Ｂを５分間保持した後、最後に、カラムを２％の成分Ｂで１５分間再平衡化した。カラム出口を３ｎｌのフローセルを備えたＵＶ検出器に接続した。

質量分析
ナノＬＣの出口は、オンラインのナノ供給源（Ｂｒｕｋｅｒ ＣａｐｔｉｖｅＳｐｒａｙ（登録商標））を備えたイオントラップＥＳＩ−ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ ＡｍａＺｏｎ）に直接連結させた。イオントラップは、キャピラリ電圧が１．７ｋＶである高分解能モードで動作させた。供給源の温度を２００℃に設定し、３ｌ／分の乾燥ガスフローを用いて、供給源を加熱した。

データ解釈は、ＥＩＣからそれぞれの軽試料グリカンおよびその適切な重同位体標準の面積を決定することによって行われる。この軽−重比（Ｌ／Ｈ）は、各々の時点での各々のＮ−グリカンおよび動物について決定される。Ｌ／Ｈ比を時間に対してプロットすることにより、各々のＮ−グリカンについてのＰＫプロファイルが得られる。Ｎ−グリカン割合は、各々の時点の重同位体標準グリカンの既知の相対分布を用いて計算することができる。

ｍＡｂ１ Ｎ−グリコシル化および試験の適格化
親和性精製を適格化して制御するために、既知の量のｍＡｂ１をＮＺＷウサギ血清にスパイクすることによってＱＣ試料を調製した。ＱＣ試料は、ＥＬＩＳＡによって時前に決定された試験の濃度範囲をカバーした。図２Ａは、ｍＡｂ１ ＱＣ試料の平均割合を示す。試料は、１０μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌの間の濃度をカバーした。１つの血清ブランクを含む計４つのＱＣ試料（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を使用した。ＱＣ試料から得られたグリカンの平均割合は、ｍＡｂ１ Ｎ−グリカン組成を表す。グリコシル化抗体断片の開発された酵素的溶出を用いて、非常に高い選択性および純度が達成され得た。ｍＡｂ１の干渉Ｎ−グリカンは、分析から除外された２つの少量のバイセクト改変体を除いて、共精製されなかった。さらなる血清関連Ｎ−グリカンは検出されなかった。感度は、１０μｇ／ｍｌ（ＬＬＯＱ）の濃度で少なくとも０．１％の割合ですべてのＮ−グリカンを分析するために少なくとも十分であった。しかしながら、改善されたナノＥＳＩ供給源を用いて、感度が約０．１μ／ｍｌに改善することができる。

Ｎ−グリカンは、主に、コアフコースを有する複合二分岐鎖であった（図２Ｂ）。図２Ａから分かるように、最も豊富なＮ−グリカンは、末端のＮ−アセチルグルコサミン残基を有するＧ０Ｆ（６５％）であり、続いて、１つのさらなる末端ガラクトースを有するＧ１Ｆ（１６％）であった。高マンノースグリカンＭ５（９．５％）は、３番目に豊富なＮ−グリカンであった。他の全てのＮ−グリカンは、３％未満の割合を有した。ｍＡｂ１は、末端シアル酸を有するＮ−グリカンを含まなかった。

前臨床試験：ｍＡｂ１のグリカンＰＫプロファイルおよびＥＬＩＳＡ
決定されたグリカンＬ／Ｈ比をサンプリング時間に対してプロットして、各々のＮ−グリカンのＰＫプロファイルを得た。各々のＮ−グリカンの平均Ｌ／Ｈ比を最大値に標準化した。ＥＬＩＳＡデータを同様に標準化した。次に、ＥＬＩＳＡの相対濃度およびＬ／Ｈ値をグラフで比較した。図３は、Ｎ−グリカンの得られた曲線を示す。平均ＥＬＩＳＡプロファイルは菱形で描かれ、エラーバーは変動性を表す。最も豊富な複合型Ｇ０Ｆは、ＥＬＩＳＡプロファイルと比較して非常に類似したＰＫプロファイルを有した（図３Ａ）。最大濃度（ｔ_ｍａｘ）は、２つのグラフで一致して７２時間後に達成された。排出の開始時にわずかな違いがあったが、エラーバーが完全に重なるため、ＰＫプロファイルは同等とみなすことができる。この知見は、ＥＬＩＳＡが最も豊富なＮ−グリカンが最も寄与するすべての糖形態の平均プロフィールを表すため、相対的存在量がほぼ７０％である主要なＮ−グリカンについて予想された。

約１６％を占める、２番目に豊富な複合型Ｎ−グリカンＧ１Ｆはまた、ＥＬＩＳＡプロファイルと比較した場合、非常に類似したＰＫプロファイルを示した（図３Ｂ）。再び、両方の曲線について７２時間でｔ_ｍａｘに達した。

２％の割合を有する複合型Ｇ２Ｆは、ほぼ完全な一致を示し、ＥＬＩＳＡプロファイルと最もよく一致した（図３Ｃ）。ｔ_ｍａｘは、ＥＬＩＳＡ曲線の７２時間と比較して６０時間で早く到達した。６０時間と７２時間の時点の間の非常に小さな差異、および追加のサンプリング点がないという事実に起因して、２つのプロファイルは依然として同一と見なすことができる。

ナノＬＣ−ＭＳアプローチでは区別できず、わずか０．１％の相対含量を有する２つの異性体であるＭ６Ｇ０Ｆ／Ｍ５Ｇ１Ｆハイブリッド型グリカンのプロファイルは、依然としてＥＬＩＳＡプロファイルに類似しているように見える（図３Ｄ）。低い存在量はＬＬＯＱに近く、これは、結果として、他のより豊富なグリカンよりもＬ／Ｈ値の精度が低くなった。しかしながら、類似のｔ_ｍａｘおよび類似の曲線から、ＰＫが同一であるまたは少なくとも類似していると結論付けることができる。

これらの結果は、各々のＮ−グリカンについて個別にＰＫプロファイルを得ることができることを実証する。グリカンＰＫプロファイルは、最も豊富なグリカンについてＥＬＩＳＡと非常に類似していた。０．５％より少ない部分を有するＮ−グリカンについてだけ、グラフは、存在量が少ないため変動がより高かったので、明確ではなかった。

高マンノース型Ｎ−グリカンＭ５およびＭ６のグリカンＰＫプロファイルは、全く異なる画像を示した。Ｍ５およびＭ６についてそれぞれ９．５％および２％の相対的存在量を有するＮ−グリカンの曲線を図４に示す。Ｍ６は、ＥＬＩＳＡによって決定された平均プロファイルから極端に逸脱したＰＫプロファイルを有した（図４Ａ）。最大濃度は２４時間後に達成され、続いて、Ｍ５への変換または排出速度の増加により循環からほぼ完全に除去された。

高マンノースグリカンＭ５はまた、ＥＬＩＳＡと比較した場合、異なるＰＫプロファイルを有した（図４Ｂ）。ｔ_ｍａｘは、４８時間後に２４時間早くに達し、さらなるクリアランスは、４８時間と１６８時間の間に速くなった。これらの結果は、ｍＡｂ１の高マンノースグリカンＰＫプロファイルは、グリコ改変体を含む全てのタンパク質改変体の平均濃度を表すＥＬＩＳＡと比較して異なることを実証する。これらの知見はまた、高マンノースグリカンの変換理論およびクリアランスの増加を強化するために、各々の時点について決定されたグリカンマップ（図５参照）において反映される。Ｍ３Ｇ１Ｆ、Ｍ３Ｇ０Ｆおよびコア構造Ｍ３のＰＫプロファイルを（図３ＥからＧ）に示す。同じｍ／ｚ値を有する汚染物質が同時溶出したため、Ｇ０のＰＫプロファイルを得ることができなかった。

Ｍ５およびＭ６の選択的クリアランス
ｍＡｂ１ Ｎ−グリコシル化の組成を図２に示す。重同位体グリカン標準の既知の相対量および実験的に得られたＬ／Ｈ比に基づいて、各々のＮ−グリカンの割合を計算した。図５は、前臨床試験の結果として得られたグリカンマップを示す。８時間と３３６時間の間の時間点についてグリカンマップを計算した。２時間、５０４時間および６７２時間で、多数のウサギについて、ｍＡｂ１の血清濃度はこの試験のＬＬＯＱである１０μｇ／ｍｌを下回り、したがって、グリカンマップは計算できなかった。

最も豊富なＮ−グリカンＧ０ＦおよびＧ１Ｆの平均割合は一定のままであり、以前の観察を裏付けしている（図５左）。拡大図は、少量のグリカンを示す（図５右）。割合は、高マンノースグリカンを除いて、すべてのＮ−グリカンについて一定であった。Ｍ５およびＭ６部分は経時的に減少した。Ｍ６は循環から除去されたが、Ｍ５部分は９％の初期の割合から約４％に減少した。

高マンノース種Ｍ６−Ｍ９は、ヒトのＭ５のようなより小さい高マンノースグリカンに変換されることが文献から知られている（Ｃｈｅｎら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００９）２１、９４９−５９；Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉら、ＭＡｂｓ（２０１２）４（４）、５０９−５２０）。マウスにおいて同様の観察がなされた。高マンノース種Ｍ７−Ｍ９はＭ６に変換される（Ｙｕら、ｍＡｂｓ（２０１２）４（４）、４７５−８７）。血清中の抗体のインビトロのインキュベーションについて両方の観察がなされた。本試験において、主にＭ５が循環から選択的に除去された。Ｍ４またはＭ３（コア構造）のようなより小さいグリカンの増加は観察されなかった。Ｍ５の末端マンノース残基の連結がＭ６−Ｍ９のものと異なるため、Ｍ５の更なる変換は、血清中に他の特異性を有する更なる酵素を必要とする。Ｍ５またはむしろＭ５を含む糖タンパク質は、循環からの特定のクリアランス機構によって、例えば、マンノース受容体を介して、除去される可能性が非常に高い。

循環からのＭ５の不完全な除去は、Ｆｃ部分の構造コンホメーションを用いて説明することができる。いくつかの調査は、Ｍ５と同様のサイズを有する、末端ガラクトシル化を伴うＮ−グリカンを含むＩｇＧグリコフォームが、Ｆｃ部分のコンホメーションをオープンコンホメーション、つまり、他のタンパク質が結合するためにＮ−グリカンを接近させるＵ字コンホメーションに変化させることを示した（Ｋｒａｐｐら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３年）、３２５巻、９７９−９８９頁）。これは、Ｍ５がＮ−グリカンと対になって、Ｆｃ部分をオープンコンホメーションにするのに十分な大きさのグリコフォームをもたらすことを意味する。タンパク質生合成中のグリコシル化された重鎖の対形成は無作為ではないことが示された（Ｍａｓｕｄａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．（２０００年）、４７３巻、３４９−５７頁）。ＩｇＧ２生物医薬品について、グリコフォームＭ５：Ｍ５が好ましいことが実証された（Ｇｏｅｔｚｅら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００９年）、１９巻、２４０−９頁）。本試験におけるｍＡｂ１について、同様の観察がなされた（表２）。無作為的な対形成を仮定すると、すべてのグリコフォームは簡単に計算することができ、これは、グリコフォームを含むＭ５に示される。ｍＡｂ１のインタクトなＦｃ部分から生成されたＭＳデータは、Ｍ５：Ｍ５グリコフォームが計算値より４倍高かったことを示す。Ｍ５：Ｍ５は、タンパク質生合成中に強く支持された。このグリコフォームは、Ｆｃ部分のＵ字コンホメーションをもたらし、次に、マンノース受容体に結合することによって、循環からのクリアランスが増加する可能性がある。前臨床試験で観察された残りの４％のＭ５は、閉じたＦｃコンホメーションのために十分に小さいＭ５：Ｇ０Ｆグリコフォームであり得る。これは、循環からの不完全なクリアランスを説明する。

結論
個々のＮ−グリカンの薬物動態を調査するための新しいアプローチを利用して、ＩｇＧ１生物医薬品の前臨床的ウサギ試験を分析した。固定化抗原を用いた９６ウェルプレートベースのハイスループット親和性精製および安定な重同位体標準の質量分析定量化を用いて、５０μｌの血清試料からのグリカンＰＫデータが、１０から９０μｇ／ｍｌの間のｍＡｂ濃度について得られた。グリカンＰＫプロファイルをＥＬＩＳＡデータと比較して、高マンノースグリカンＭ５およびＭ６が異なるＰＫプロファイルを有することを実証した。グリカンマップは、Ｍ６が最初の４８時間で完全に除去され、Ｍ５レベルが９．５％から約４％に減少したことを示した。

提示された前臨床試験から得られた結果は、別のグループによって健常なヒト対象から得られた結果と同様であった（Ｇｏｅｔｚｅら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００９年）、１９巻、２４０−９頁）。これらの知見は、前臨床試料を用いたグリカンＰＫプロファイリングの価値を実証する。安定な重同位体２−ＡＡグリカン標準の使用は、これまでに記載されていない質量分析による個々のＮ−グリカンのＰＫプロファイリングを可能にし、これまで使用されてきたＮ−グリカンの相対分析と比較して単一のＮ−グリカンの独立した分析を可能にする。

要約すると、高い感度を有するグリカンＰＫプロファイリングについての新しいアプローチは、前臨床試料と連動する。さらに、前臨床試験から得られた結果は、ヒト対象の結果が前臨床試験の知見と同一であることを実証する。初期の生物医薬品開発中の実施により、前臨床試験中に既にＮ−グリコシル化の効果を調べることができる。これは、臨床段階に入る前に、Ｎ−グリコシル化、グリコエンジニアリングを最適化するための予防作用の実施を可能にする。

［実施例２］
治療用融合タンパク質の薬物動態におけるグリコール改変体の影響
前臨床ウサギ試験
前臨床試験はヒマラヤウサギで行った。Ｆｃ融合タンパク質エタネルセプト（ＦＰ１またはＦＰ２）の２つの異なるバッチの８ｍｇ／ｋｇ体重の単回皮下投与後、１回の投与前血液試料を含め、一定期間にわたって血液試料を採取した。サンプリングを表３に列挙するように行った。各々のサンプリング時点で、少なくとも６００μｌの血清を採取した。血清中のＦＰ１およびＦＰ２の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。残りの血清から２×５０μｌのアリコートをグリカンＰＫプロファイリングに使用した。続いて、第一のアリコートを分析し、第二のアリコートをバックアップアリコートとして使用した。

^１３Ｃ２−ＡＡ標識されたグリカン標準の調製
脱塩したＦＰ１融合タンパク質（１ｍｇ）のＮ−グリカンは、ＰＮＧａｓｅＦ消化を用いて、一晩（１７時間）３７℃で放出させた。Ａｍｉｃｏｎ ３０Ｋフィルター装置を用いてＮ−グリカンを融合タンパク質から分離し、スピードバックを用いて乾燥させた。ピコリンボランおよび［^１３Ｃ］２−ＡＡを７０：３０（ｖ／ｖ％）のＤＭＳＯ−酢酸に溶解して、それぞれ６３および５０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。標識溶液（１５μＬ）および脱イオン水（１０μＬ）を１５ｎｍｏｌの酵素的に放出され、乾燥されたグリカンに添加した。標識反応は、３７℃で１７時間行った。

Ｇ−１０カラム上のゲル濾過によって、余分な標識を除去した。カラムを１０ｍｌのＨ_２Ｏで馴化した。試料を脱イオン水で１００μｌに希釈し、カラムに適用した。カラムを７００μｌのＨ_２Ｏですすいだ後、精製した蛍光標識Ｎ−グリカンを６００μｌのＨ_２Ｏで溶出した。精製された［^１３Ｃ］２−ＡＡ標識Ｎ−グリカンを分注し、使用するまで−２０℃で保存する。

固定化プロテインＧを含む９６ウェルプレートアフィニティーカラムの調製
プロテインＧセファロース（２００μＬ）を、親水性低タンパク質結合膜（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＴＨＳ ＨＶフィルタープレート）を含む９６ウェルフィルタープレートの各々のウェルに添加した。プロテインＧセファロースは２０％エタノール中に保存され、これを親和性精製前に除去しなければならない。したがって、カラムをＰＢＳ（１５０μＬ）で４回平衡化した。遠心分離により液体を除去した。

固定化抗原を含む９６ウェルプレートアフィニティーカラムの調製
９６ウェルフィルタープレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＴＨＳ ＨＶフィルタープレート）の膜を１ｍＭ ＨＣｌ（１００μＬ）で湿潤させた後、１ウェルあたり２００μＬのＮＨＳ活性化セファロース−イソプロパノールスラリーを添加した。イソプロパノールを遠心分離によって除去し、カラムを１ｍＭ ＨＣｌ（１５０μＬ）で４回洗浄した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に発現される抗原の再構成は、上記の実施例１に記載されるように行われた。抗原溶液（１００μＬ）をカラムに遠心分離し、カップリング反応を周囲温度で２時間行った。アフィニティーカラムを洗浄し、残りのＮＨＳ基は、エタノールアミン緩衝液（１５０μＬ）を用いて不活性化させた。最後に、カラムをＰＢＳで平衡化した。

融合タンパク質の親和性精製およびグリカン放出
血清試料（５０μＬ）を９６ウェルプレートの平衡化されたプロテインＧカラムに添加し、カラムに通して遠心分離した。続いてカラムをＰＢＳ（１５０μＬ）で６回遠心分離により洗浄した。結合したＩｇＧを３回、１００μＬ溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン ｐＨ２．７）で溶出した。溶出液を直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。溶出液は、標的タンパク質ならびに血清由来の他のＩｇＧを含有した。

平衡化された９６ウェルプレートの固定化抗原カラムに溶出液を添加し、カラムに通して遠心分離した。次に、カラムをＰＢＳ（１５０μＬ）で６回洗浄した。ファブリケーター溶液（１００μｌ、１Ｕ／μｌ）をカラムに遠心分離し、融合タンパク質のグリコシル化Ｆｃ部分を放出させた。反応は３７℃で３０分間行った。放出されたＦｃ部分をＰＢＳで溶出した。^１３Ｃ−２−ＡＡ標識されたＮ−グリカン標準を伴うＰＮＧａｓｅＦを、溶出されたＦｃ部分におよび抗原結合部分を有するカラムに添加した。消化物を３７℃で１７時間インキュベートした。抗原結合タンパク質部分から放出されたＮ−グリカンをＨ_２Ｏで溶出した。残りのタンパク質は、１０Ｋのカットオフ膜を有する９６ウェルプレートを用いた限外濾過によって除去された。グリカン標準とともに放出されたＮ−グリカンを真空遠心分離によって乾燥させた。

Ｎ−グリカン標識、過剰の２−ＡＡ標識試薬を除去するためのゲル濾過、ならびにＲＰナノＬＣ−ＭＳによる標識試料Ｎ−グリカンおよび重同位体標準の分析を実施例１に記載されるように行った。

２つのバッチのグリカンマップは異なるＮ−グリコシル化を示す
モノクローナル抗体のＮ−グリカンＰＫプロファイリングは、ｍＡｂがＦｃ部分の各々の重鎖上にただ１つの保存されたＮ−グリコシル化部位を有するため、他の生物医薬品のＰＫプロファイリングよりも一般的にあまり複雑にならない。したがって、部位特異性を有するＮ−グリカンを分析する必要はない。より複雑なグリコシル化された生物医薬品について、部位特異性は、クリアランスのメカニズムまたは半減期の延長を理解するのに役立ち得るさらなる情報を提供する。例えば、融合タンパク質は、ＩｇＧ Ｆｃ部分および受容体部分のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの鎖からなる。ｍＡｂの場合と同様に、鎖はジスルフィド架橋によって連結されている。Ｆｃ部分は、鎖あたり１つのＮ−グリカンを有し、受容体部分は１分子あたり計６つのＮ−グリカンを生成する２つのさらなるＮ−グリコシル化部位を有する。

Ｆｃ部分および受容体部分Ｎ−グリカンの個々の分析について、２つの部分をエンドプロテイナーゼＩｄｅＳ酵素を用いて分離し、生成した断片を個別に分析した。分離後、ＰＮＧａｓｅＦを用いてＦｃ部分および受容体部分を脱グリコシル化した。グリカンを２−ＡＡで標識し、ナノＬＣＭＳで分析した。得られたグリカンマップを図６に示す。

２つの融合タンパク質のバッチは、異なるＮ−グリコシル化パターンを有した。融合タンパク質１（ＦＰ１）のグリコシル化はより異種性であったが、融合タンパク質２（ＦＰ２）はわずかなＮ−グリカンの割合が高い。両方のバッチは、それらの受容体部分に高い割合の末端シアル酸を含有した。見出されたＦｃグリコシル化は、複合二分岐Ｎ−グリカンおよびコアフコシル化の高い割合を有する抗体にとって典型的であった；いくつかは追加のシアル酸を有した。ＦＰ１とＦＰ２の間の主な相違は末端基であった。ＦＰ１は末端ＧｌｃＮＡｃ残基の割合が高い。対照的に、ＦＰ２は高程度の末端ガラクトシル化を有するが、シアル化は同等であった。

ウサギの前臨床試験におけるＦＰ１およびＦＰ２の平均ＰＫプロファイル
前臨床試験はヒマラヤウサギで行われた。ＦＰ１またはＦＰ２の単回皮下投与後、試料を採取し、ＦＰ１およびＦＰ２の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。サンプリングスケジュールを表３に示す。試験の各々のアームからの５匹の動物が、グリカンＰＫプロファイリングのために含められた。

両方のアームの５匹の動物のＥＬＩＳＡ結果を図７に示す。ＰＫプロフィールは異なっていた。ＦＰ１は、ＦＰ２よりも高濃度であったが、エラーバーは重複していた。両方のプロフィールは、１８時間後に最も高い濃度の時点であるｔ_ｍａｘに達した。ＦＰ１のクリアランスはより速く、７２時間で一致する結果となった。

ＥＬＩＳＡプロファイルおよび異なるＮ−グリコシル化の相違を、可能性のある関係について調べていた。

個々のＮ−グリカンＰＫプロファイルと平均ＥＬＩＳＡデータの比較
ＥＬＩＳＡの相対濃度は、平均プロファイルを最大濃度に正規化することによって決定された。決定されたＬ／Ｈ比に基づいて平均プロファイルを最大Ｌ／Ｈ比に正規化することにより、個々のＮ−グリカンプロファイルの相対濃度を決定した。図８は、適切な平均ＥＬＩＳＡプロファイル（黒菱形）と比較した、ナノＬＣ−ＭＳ（黒四角）によって決定された両方の融合タンパク質ＦＰ１およびＦＰ２のＦｃ部分（図８Ａ）および受容体部分（図８Ｂ）の主要なＮ−グリカンの平均ＰＫプロファイルを示す。

様々な動物のデータの変動性は高く、これはエラーバーによって反映され、受容体部分に位置するＮ−グリカンの変動性がより高い。ＦＰ１ Ｇ０Ｆ、ＦＰ１ ＳＧ２ＦおよびＦＰ２ Ｇ１ＦのＮ−グリカンプロファイルは、それぞれのＥＬＩＳＡと比較して、より遅い時点に向かってｔ_ｍａｘのシフトを示した。ＦＰ２ ＳＧ２Ｆのみが同一のｔ_ｍａｘを有した。この過程は、クリアランス速度の低下を伴い、血清中半減期の延長を示す。しかしながら、ＦＰ２のグリカンＰＫプロファイルは、ＦＰ１のグリカンＰＫプロファイルよりもＥＬＩＳＡプロファイルに近かった。

ＦＰ１およびＦＰ２のグリカンマップ
グリカンマップは、ナノＬＣ−ＭＳによって決定されたＬ／Ｈ比に基づいて得られた。スパイクされた安定な重同位体２−ＡＡ標識されたＮ−グリカン標準の既知の分布を用いて、グリカンマップを高精度で計算した。ＦＰ１からのＦｃおよび受容体部分のグリカンマップを図９に示す。Ｆｃ部分のＮ−グリカンは、主に、中性の複合二分岐Ｎ−グリカンであった。主要なグリカンは、Ｇ０Ｆ（白菱形）およびＧ１Ｆ（黒三角）であった。他のすべてのＮ−グリカンは１０％未満であった。ＦＣ部分のグリカンの割合は経時的に一定であった。

受容体部分は、より高い割合の酸性Ｎ−グリカンを含む。ＳＧ２Ｆ（白四角）は最も豊富なＮ−グリカンであった。Ｆｃ部分とは対照的に、受容体部分の割合は経時的に変化した。Ｇ０Ｆ（白菱形）およびＧ２Ｆ（白三角形）の部分は経時的に減少したが、ＳＧ２Ｆ（白四角）およびＳＧ２（黒菱形）の部分はより高い割合に向かう傾向を示した。３２時間での偏差（Ｆｃ部分）は、親和性精製またはナノＬＣ−ＭＳ分析中の変動に起因し、およびＮ−グリコシル化パターンの一時的な変化がないことに起因する可能性が最も高い。

ＦＰ２について同様の結果が得られた。得られたグリカンマップを図１０に示す。Ｆｃ部分について、グリカンマップは、主要なＮ−グリカンＧ１Ｆ（黒三角）、Ｇ２Ｆ（白三角）、Ｇ０Ｆ（白菱形）およびＳＧ２Ｆ（白四角）およびすべての少量のグリカンは一定の割合を有したことを示す。受容体部分は異なる画像を示した。主要なＮ−グリカンＳＧ２Ｆ（白四角）は（他のグリカンに対して）わずかに増加し、Ｎ−グリカンＧ２Ｆ（白三角）は（他のグリカンと比較して）経時的に劇的に減少した。

少量のＮ−グリカンのシフトについて以下に検討する。Ｆｃ部分で６時間と１２時間の間に観察された変動は、低タンパク質濃度がより高い変動をもたらすことに起因するが、Ｎ−グリカンの割合の有意に変化に起因しない可能性が最も高かった。

受容体部分の末端ガラクトシル化はクリアランスを加速した
末端ガラクトシル化（Ｇ１ＦおよびＧ２Ｆ）を有するＮ−グリカンおよびＮ−グリカンＧ０Ｆは、末端Ｎ−アセチルグルコサミンを有する。Ｇ２Ｆは、ＦＰ１およびＦＰ２の経時的なパーセントの減少を示した（図９および１０、右）。Ｇ１Ｆは、ＦＰ１に局在化した場合にわずかに減少したが、ＦＰ２に結合した場合には一定のままであった（図９および１０、右）。Ｇ０Ｆについて同様の観察が行われた（図９および図１０右）。これらの結果は、末端ガラクトシル化されたＧ２Ｆを有するＦＰ１およびＦＰ２が循環から特異的に除去されたことを明確に示す。このクリアランスの背後にある機構は、アシアロ糖タンパク質受容体であり得る。この受容体は、露出したガラクトース残基に選択的に結合する。さらに、受容体は、末端ガラクトース残基の数が多いものから少ないものへの順で親和性の減少を示し、これは、Ｇ１Ｆのあまり顕著でない減少または一定の部分が観察されたことを説明することができる。

Ｇ１ＦおよびＧ０Ｆ Ｎ−グリカンについてのＦＰ１とＦＰ２の間の差異は、タンパク質上の異なるＮ−グリコシル化部位の占有、および受容体が結合するための異なる接近可能性のために生じ得る。

受容体部分でのシアル酸によるＮ−グリカンのキャッピングは半減期を延長した
先に述べたように、主要なＮ−グリカンＳＧ２Ｆは、相対的に高い割合に向かうわずかな傾向を示した。ＦＰ１で、ＳＧ２の量は経時的に増加し、ＦＰ２で、ＳＧ１Ｆは同じ傾向を示した。他の酸性Ｎ−グリカンは、一定の割合を有した（図９および１０、右）。

これらの観察は、少なくとも１つの末端シアル酸が、ガラクトシル化されたＮ−グリカン構造に付加されると、タンパク質の選択的クリアランスが妨げられる可能性があるという結論に至る。経時的に増加する異なるＮ−グリカンに対するＦＰ１とＦＰ２の間の相違もやはり、それらの構造が結合するグリコシル化部位における相違のために生じている可能性がある。

ＦＰ１およびＦＰ２のシアリル化、ガラクトシル化および末端ＧｌｃＮＡｃ
結合したすべてのＮ−グリカンの末端基の概要を図１１に示す。少量のＮ−グリカンもまた含まれた。Ｎ−グリカンは、３つの異なるグループに分けられた：シアリル化グループは、１つまたは２つの末端シアル酸を含むすべてのＮ−グリカンを含み、ガラクトシル化グループは、少なくとも１つの末端ガラクトース部分を有するすべてのＮ−グリカンを含み、末端ＧｌｃＮＡｃグループは、末端Ｎ−アセチルグルコサミンを有するＮ−グリカンを含む。２つの特性を有するＮ−グリカンについて、どの属性がＰＫに影響を及ぼす可能性がより高いか決定されなければならなかった。例えば、一方のアームに末端シアル酸を有し、他方のアームに末端ＧｌｃＮＡｃを有するＳＧ１Ｆについて、このＮ−グリカンが、結合した末端シアル酸基の遮蔽効果に起因して、末端ＧｌｃＮＡｃグリカンのような挙動よりもシアル酸グリカンのような挙動を示す可能性がより高いため、シアリル化基の一部であることが決定された。末端ガラクトース残基が末端ＧｌｃＮＡｃよりも高い影響を有するＧ１Ｆについても同様のことがあてはまる。

ＦＰ１およびＦＰ２のＦｃ部分で末端基は変化しなかった。６時間（ＦＰ２）または３２時間（ＦＰ１）での２つの偏差は、低標的タンパク質濃度での方法変動に最も起因している可能性があった。Ｆｃ部分とは対照的に、受容体部分の末端基は、ガラクトシル化の減少を示し、これは末端シアリル化の増加により相殺された。ＧｌｃＮＡｃ群に属するＮ−グリカンは一定であった。

結論
血清試料から融合タンパク質を回収するためのワークフローが確立されている。プロテインＧクロマトグラフィーを用いる第一の親和性ステップにおいて、血清の複雑さは劇的に減少した。セファロースレジンに非特異的に結合する傾向にある血清関連タンパク質、ならびにすべての非ＩｇＧ Ｆｃ部分含有タンパク質が除去された。予備洗浄された血清を抗原カラムに適用し、洗浄およびＦｃ部分の酵素溶出後、２つのタンパク質部分のＮ−グリカンを個別に分析した。安定な重同位体２−ＡＡ標識されたグリカン標準の組み込みにより、Ｎ−グリカンプロセシング中の変動およびナノＬＣＭＳ分析が補償され、試験における個々のグリカンの時間経過が高精度で決定された。

２つの異なるバッチの融合タンパク質をウサギ試験において比較し、各々のＮ−グリカンのＰＫプロファイルおよびＮ−グリカンの経時的な相対分布を決定した。結果は、受容体部分に位置する末端ガラクトシル化されたＮ−グリカンを有する融合タンパク質が平均分子より速くクリアランスされ、末端シアル酸が血清中半減期を延長させることを示す。このクリアランスは、肝臓に位置し、末端ガラクトシル化されたＮ−グリカンに対するその親和性で知られているアシアロ糖タンパク質受容体の受容体媒介プロセスである可能性が最も高い。

要約すると、この試験は、融合タンパク質のＮ−グリコシル化がＰＫに影響を及ぼすことを示した。末端ガラクトシル化されたＮ−グリカンは迅速にクリアランスされるが、末端シアリル化は血清中半減期を延長させる。これは、アシアロ糖タンパク質受容体媒介性結合に起因する可能性が最も高く、Ｎ−グリカンが受容体部分に位置する場合にのみ生じる。Ｆｃ部分Ｎ−グリコシル化（複合二分岐）は、以前の試験と一致して、ＰＫに影響を及ぼさない。したがって、この方法は、生物医薬品の詳細な部位特異的Ｎ−グリカンＰＫプロファイリングを可能にする。さらに、この種の調査は、部位特異性およびドメイン特異性のないＮ−グリカンプロファイリングとは対照的に有利であることが実証された。

上記を考慮して、本発明はまた以下の項目に関することが理解される。
項目
１．哺乳動物の液体試料中の目的の組換え糖タンパク質のグリカンを分析する方法であって、
ａ）目的の組換え糖タンパク質を含む、哺乳動物の２つ以上の液体試料を用意するステップ；
ｂ）上記各試料の組換え糖タンパク質を、試料中の組換え糖タンパク質に特異的な親和性リガンドがカップリングした別個の固体支持体上に、固定化するステップ；
ｃ）組換え糖タンパク質の酵素的切断によって、固体支持体から、上記各試料の組換え糖タンパク質のグリカン含有断片を、別個の溶出液に放出するステップ；
ｄ）場合により、別個の溶出液中の組換え糖タンパク質のグリカン含有断片から、グリカンを放出させるステップ；
ｅ）上記各試料のグリカンを、蛍光標識の第一の安定同位体で標識するステップ；および
ｆ）ＬＣ−ＭＳを用いて、上記各試料のステップｅ）の標識されたグリカンを別々に分析し、上記２つ以上の試料を比較するステップ
を含み、ここで、蛍光標識の第二の安定同位体で標識されたグリカンを含む参照標準が、ステップｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）の前に上記各試料に添加され、参照標準は、ステップｆ）の標識されたグリカンとともに分析される、方法。

２．ステップｃ）において上記固体支持体に固定化されたままの、上記各試料の組換え糖タンパク質の第二のグリカン含有断片のグリカンを分析するステップをさらに含み、
ａａ）ステップｂ）の前に、哺乳動物の２つ以上の各液体試料を予備洗浄して、固体支持体に非特異的に結合する糖タンパク質を除去するステップ；
ｄｄ）ステップｃ）の後に固体支持体上に残っている、上記各試料の組換え糖タンパク質の固定化された第二のグリカン含有断片から、グリカンを別個の溶液に放出するステップ；
ｅｅ）上記各試料のグリカンを蛍光標識の第一の安定同位体で標識するステップ；および
ｆｆ）ＬＣ−ＭＳを用いて、上記各試料のステップｅｅ）の標識されたグリカンを別々に分析し、上記２つ以上の試料を比較するステップ
を含み、ここで、蛍光標識の第二の安定同位体で標識されたグリカンを含む参照標準が、ステップｄｄ）、ｅｅ）またはｆｆ）の前に上記各試料に添加され、参照標準は、ステップｆｆ）の標識グリカンとともに分析される、項目１に記載の方法。

３．前洗浄ステップａａ）が、試料を固体支持体と接触させるステップを含み、固体支持体が、項目１のステップｂ）で使用される固体支持体と同じ材料で作られているが、上記親和性リガンドがカップリングしていない、項目２に記載の方法。

４．分析されるべきグリカンが、高マンノース型、ハイブリッド型または複合型Ｎ−グリカンからなる群から選択されるＮ−グリカンである、項目１から３のいずれか１つに記載の方法。

５．蛍光標識が、安定な軽いい同位体および安定な重い同位体の変異体を有し、好ましくは参照標準が、蛍光標識の安定な重い同位体で標識されたグリカンを含む、項目１から４のいずれか１つに記載の方法。

６．蛍光標識が、^１２［Ｃ］および^１３［Ｃ］同位体対、好ましくは^１２［Ｃ_６］および^１３［Ｃ_６］同位体対、より好ましくは^１２［Ｃ_６］−２−アミノ安息香酸（^１２［Ｃ_６］−２−ＡＡ）および^１３［Ｃ_６］−２−アミノ安息香酸（^１３［Ｃ_６］−２−ＡＡ）同位体対である、項目１から５のいずれか１つに記載の方法。

７．参照標準が、試料において分析されたものと少なくとも同じグリカン構造を含む、項目１から６のいずれか１つに記載の方法。

８．方法が個々にグリカン構造を分析する、項目１から７のいずれか１つに記載の方法。

９．組換え糖タンパク質が融合タンパク質または抗体である、項目１から８のいずれか１つに記載の方法。

１０．組換え糖タンパク質が、Ｆｃ融合タンパク質または抗体である、項目９に記載の方法。

１１．ステップｃ）において固体支持体から放出される組換え糖タンパク質のグリカン含有断片がＦｃドメインである、項目１から１０のいずれか１つに記載の方法。

１２．組換え糖タンパク質が抗体であり、抗体の可変領域が、固体支持体上に固定化された親和性リガンドに結合する、項目１０または１１に記載の方法。

１３．親和性リガンドが抗原である、項目１２に記載の方法。

１４．組換え糖タンパク質が、抗体、好ましくはＩｇＧ抗体、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体、より好ましくはヒトもしくはヒト化ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である、項目１０から１３のいずれか１つに記載の方法。

１５．組換え糖タンパク質が、Ｆｃドメインおよびエフェクタードメインを含むＦｃ融合タンパク質であり、エフェクタードメインが、固体支持体上に固定化された親和性リガンドに結合し、ここで、親和性リガンドが、結合パートナーまたはＦｃ融合タンパク質のエフェクタードメインに特異的に結合する抗体である、項目１０または１１に記載の方法。

１６．固体支持体から組換え糖タンパク質のグリカン含有断片を放出させるために使用される酵素が、エンドプロテイナーゼ、好ましくはパパイン、フィシン、システインプロテアーゼＳｐｅＢ（ＦａｂＵＬＯＵＳ）またはシステインプロテイナーゼＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標））、より好ましくはシステインプロテイナーゼＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標））である、項目１０から１５のいずれか１項に記載の方法。

１７．固体支持体から組換え糖タンパク質のグリカン含有断片を放出させるために使用される酵素が、グリカナーゼ、好ましくはエンドＳグリカナーゼ（ＩｇＧＺＥＲＯ）である、項目１０から１５のいずれか１つに記載の方法。

１８．予備洗浄ステップが、
ａａｉ）Ｆｃ結合タンパク質を使用して、固体支持体上にＦｃ含有糖タンパク質を固定化するステップであって、上記Ｆｃ結合タンパク質は、好ましくはプロテインＧまたはプロテインＡから選択され、より好ましくは、上記Ｆｃ結合タンパク質はプロテインＧであるステップ；ならびに
ａａｉｉ）Ｆｃ含有糖タンパク質を溶出するステップであって、
上記予備洗浄ステップで使用される固体支持体は、項目１のステップｂ）で使用される固体支持体と同じ材料で作られているが、上記親和性リガンドがカップリングしていないステップ
を含む、項目１０から１７のいずれか１つに記載の方法。

１９．ＬＣ−ＭＳが逆相ＬＣ−ＭＳである、項目１から１８のいずれか１つに記載の方法。

２０．ＬＣ−ＭＳが、ナノＬＣ−ＭＳ、好ましくは逆相ナノＬＣ−ＭＳである、項目１から１９のいずれか１つに記載の方法。

２１．固体支持体が、マイクロビーズ、好ましくはセファロースビーズ、アガロースビーズもしくは磁気ビーズ、より好ましくはセファロースビーズを含むレジンである、項目１から２０のいずれか１つに記載の方法。

２２．親和性リガンドが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、臭化シアン、エポキシ、カルボジイミドもしくはチオプロピルを介して、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を介して固体支持体にカップリングされている、項目１から２１のいずれか１つに記載の方法。

２３．哺乳動物の２つ以上の液体試料が、マルチウェルフィルタープレート中で、好ましくは２４、９６もしくは３８４ウェルフィルタープレート中で、より好ましくは９６ウェルフィルタープレート中で分析するために調製される、項目１から２２のいずれか１つに記載の方法。

２４．哺乳動物の液体試料が、体液、好ましくは血清もしくは血漿、尿、脳脊髄液、羊水、唾液、汗、精液、涙、痰、膣分泌物、膣洗浄液および結腸洗浄液からなる群から選択され；好ましくは上記試料は血漿または血清試料である、項目１から２３のいずれか１つに記載の方法。

２５．哺乳動物の２つ以上の液体試料が同じ対象から得られたものである、項目１から２４に記載のいずれか１つの方法。

２６．目的の組換え糖タンパク質のグリカンの少なくとも１つの特異的グリカン構造の薬物動態パラメータ、好ましくはＣ_ｍａｘ、ｔ_ｍａｘ、ＡＵＣまたはｔ_１／２が決定される、項目２５に記載の方法。

２７．哺乳動物の２つ以上の液体試料が、同じ対象からの異なる時点で得られたものである、項目２５または２６に記載の方法。

２８．少なくとも約２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、３３６時間、５０４時間、６７２時間、８４０時間が、最初の時間点と最後の時間点の間にある、項目２７に記載の方法。

２９．哺乳動物の２つ以上の液体試料が、５個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上または５０個以上の試料である、項目１から２８のいずれか１つに記載の方法。

３０．（ｉ）蛍光標識の第一の安定同位体で標識された上記各試料からのグリカンと蛍光標識の第二の同位体で標識されたそのそれぞれの参照標準グリカンの抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）の曲線下面積を決定して、第一の同位体試料グリカン対第二の同位体参照標準の比を経時的に形成させ、ならびに
（ｉｉ）参照標準における個々のグリカンの既知の相対分布に基づくＮ−グリカンの割合を上記各試料について計算する、項目１から２９のいずれか１つに記載の方法。

３１．グリカンが、哺乳動物の上記２つ以上の各液体試料のアリコートにおいて分析される、項目１から３０のいずれか１つに記載の方法。

３２．分析されるべき試料またはアリコートが、約１μｌから約１０００μｌ、約５μｌから約５００μｌ、約１０μｌから約２００μｌ、約１０μｌから約１００μｌ、約２５μｌから約１００μｌまたは約４０μｌから約７５μｌ、好ましくは約５０μｌの容量を有する、項目１から３１のいずれか１つに記載の方法。

３３．上記組換え糖タンパク質の濃度が、哺乳動物の上記２つ以上の液体試料のさらなるアリコートにおいて分析される、項目３１または３２に記載の方法。

３４．上記組換え糖タンパク質の濃度がＥＬＩＳＡによって分析される、項目３３に記載の方法。

３５．哺乳動物の液体試料が、ヒト、サル、げっ歯類、イヌ、ネコまたはブタ試料である、項目１から３４のいずれか１つに記載の方法。

３６．哺乳動物の液体試料が、げっ歯類試料であり、げっ歯類がマウス、ラット、ハムスターまたはウサギである、項目３５の記載の方法。

３７．方法が、アトモル濃度の個々の標識されたグリカン、例えば、８００ａｍｏｌ程度に低い、好ましくは６００ａｍｏｌ程度に低い、より好ましくは４００ａｍｏｌ程度に低い濃度の分析を可能にする、項目１から３６のいずれか１つに記載の方法。

３８．方法が、１０μｇ／ｍｌ以下、５μｇ／ｍｌ以下、２μｇ／ｍｌ以下、１μｇ／ｍｌ以下、０．５μｇ／ｍｌ以下、０．２μｇ／ｍｌ以下または０．１μｇ／ｍｌ以下の、哺乳動物の２つ以上の各液体試料における組換え糖タンパク質濃度で組換え糖タンパク質のグリカンを分析することを可能にする、項目１から３７のいずれか１つに記載の方法。

３９．方法が、各々０．５μｇ以下、０．２５μｇ以下、０．１μｇ以下、０．０５μｇ以下、０．０２５μｇ以下、０．０１μｇ以下または０．００５μｇ以下の組換え糖タンパク質を含む哺乳動物の２つ以上の液体試料中の組換え糖タンパク質のグリカンを分析することを可能にする、項目１から３８のいずれか１つに記載の方法。

４０．少なくともステップｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）ならびに／または少なくともステップａａ）、ｄｄ）およびｅｅ）が高スループット様式で操作される、項目１から３９のいずれか１つに記載の方法。

４１．糖タンパク質ベースの医薬組成物を調製する方法であって、項目１から４０のいずれか１つに記載の哺乳動物の液体試料中の組換え糖タンパク質のグリカンを分析し、糖タンパク質を医薬組成物として製剤化するステップを含む方法。

４２．哺乳動物の液体試料中の目的のＦｃ融合タンパク質のグリカンを分析する方法であって、
ａ）Ｆｃドメインおよびエフェクタードメインを含有するＦｃ融合タンパク質を含む、哺乳動物からの２つ以上の液体試料を用意するステップ；
ａａ）哺乳動物の２つ以上の各液体試料を予備洗浄するステップであって、
ｉ）Ｆｃ結合タンパク質を使用して、別個の固体支持体上に上記各試料のＦｃ融合タンパク質を固定化するステップであって、上記Ｆｃ結合タンパク質は、好ましくはプロテインＧまたはプロテインＡから選択され、より好ましくは上記Ｆｃ結合タンパク質はプロテインＧであるステップ；および
ｉｉ）Ｆｃ融合タンパク質を溶出するステップ
を含むステップ；
ｂ）上記各試料のＦｃ融合タンパク質を、試料中のＦｃ融合タンパク質のエフェクタードメインに特異的な親和性リガンドがカップリングした別個の固体支持体上に固定化するステップであって、親和性リガンドは、結合パートナーであり、またはＦｃ融合タンパク質のエフェクタードメインに特異的に結合する抗体であるステップ；
ｃ）Ｆｃ融合タンパク質に特異的なエンドペプチダーゼで切断することによって、固体支持体から、上記各試料のＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインを別個の溶出液に放出するステップ；
ｄｄ）ステップｃ）の後に固体支持体上に残っている、上記各試料のＦｃ融合タンパク質の固定化されたエフェクタードメインからグリカンを別個の溶液に放出するステップ；
ｅｅ）上記各試料のグリカンを蛍光標識の第一の安定同位体で標識するステップ；ならびに
ｆｆ）ＬＣ−ＭＳを用いて、上記各試料のステップｅｅ）の標識されたグリカンを別々に分析し、上記２つ以上の試料を比較するステップ
を含み、
ここで、蛍光標識の第二の安定同位体で標識されたグリカンを含む参照標準が、ステップｄｄ）、ｅｅ）またはｆｆ）の前に上記各試料に添加され、参照標準は、ステップｆｆ）の標識グリカンとともに分析される、方法。

Claims (15)

1. 哺乳動物の液体試料中の目的の組換え糖タンパク質のグリカンを分析する方法であって、
   ａ）目的の組換え糖タンパク質を含む、哺乳動物の２つ以上の液体試料を用意するステップ；
   ｂ）前記各試料の組換え糖タンパク質を、試料中の組換え糖タンパク質に特異的な親和性リガンドがカップリングした別個の固体支持体上に、固定化するステップ；
   ｃ）組換え糖タンパク質の酵素的切断によって、前記固体支持体から、前記各試料の組換え糖タンパク質のグリカン含有断片を、別個の溶出液に放出させるステップ；
   ｄ）場合により、前記別個の溶出液中の組換え糖タンパク質のグリカン含有断片から、グリカンを放出させるステップ；
   ｅ）前記各試料のグリカンを、蛍光標識の第一の安定同位体で標識するステップ；および
   ｆ）ＬＣ−ＭＳを用いて、前記各試料のステップｅ）の標識されたグリカンを別々に分析し、前記２つ以上の試料を比較するステップ
   を含み、
   ここで、蛍光標識の第二の安定同位体で標識されたグリカンを含む参照標準が、ステップｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）の前に前記各試料に添加され、前記参照標準は、ステップｆ）の標識されたグリカンとともに分析される、方法。
2. ステップｃ）において固体支持体に固定化されたままの、前記各試料の組換え糖タンパク質の第二のグリカン含有断片のグリカンを分析するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法であって、
   ａａ）ステップｂ）の前に、哺乳動物の前記２つ以上の各液体試料を予備洗浄して、前記固体支持体に非特異的に結合する糖タンパク質を除去するステップ；
   ｄｄ）ステップｃ）の後に前記固体支持体上に残っている、前記各試料の組換え糖タンパク質の固定化された第二のグリカン含有断片から、グリカンを別個の溶液に放出させるステップ；
   ｅｅ）前記各試料のグリカンを蛍光標識の第一の安定同位体で標識するステップ；および
   ｆｆ）ＬＣ−ＭＳを用いて、前記各試料のステップｅｅ）の標識されたグリカンを別々に分析し、前記２つ以上の試料を比較するステップ
   を含み、
   ここで、蛍光標識の第二の安定同位体で標識されたグリカンを含む参照標準が、ステップｄｄ）、ｅｅ）またはｆｆ）の前に前記各試料に添加され、前記参照標準は、ステップｆｆ）の標識グリカンとともに分析される、方法。
3. 蛍光標識が、^１２［Ｃ］および^１３［Ｃ］同位体対、好ましくは^１２［Ｃ_６］および^１３［Ｃ_６］同位体対、より好ましくは^１２［Ｃ_６］−２−アミノ安息香酸（^１２［Ｃ_６］−２−ＡＡ）および^１３［Ｃ_６］−２−アミノ安息香酸（^１３［Ｃ_６］−２−ＡＡ）同位体対である、請求項１または２に記載の方法。
4. 組換え糖タンパク質が、融合タンパク質または抗体、好ましくはＦｃ融合タンパク質または抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. ステップｃ）において、固体支持体から放出される組換え糖タンパク質のグリカン含有断片が、Ｆｃドメインである、請求項４に記載の方法。
6. 組換え糖タンパク質が
   （ａ）抗体であり、前記抗体の可変領域が、固体支持体上に固定化された親和性リガンドと結合し、好ましくは前記親和性リガンドが抗原であり；または
   （ｂ）Ｆｃドメインおよびエフェクタードメインを含むＦｃ融合タンパク質であり、前記エフェクタードメインが、固体支持体上に固定化された親和性リガンドに結合し、ここで、前記親和性リガンドは結合パートナーであり、もしくは前記Ｆｃ融合タンパク質のエフェクタードメインに特異的に結合する抗体である、請求項４または５に記載の方法。
7. 組換え糖タンパク質のグリカン含有断片を固体支持体から放出させるために使用される酵素が、エンドプロテイナーゼ、好ましくはパパイン、フィシン、システインプロテアーゼＳｐｅＢまたはシステインプロテイナーゼＩｄｅＳ、より好ましくはシステインプロテイナーゼＩｄｅＳである、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 予備洗浄ステップが、
   ａａｉ）Ｆｃ結合タンパク質を使用して、固体支持体上にＦｃ含有糖タンパク質を固定化するステップであって、前記Ｆｃ結合タンパク質が、好ましくはプロテインＧまたはプロテインＡから選択され、より好ましくは、前記Ｆｃ結合タンパク質がプロテインＧであるステップ；および
   ａａｉｉ）前記Ｆｃ含有糖タンパク質を溶出するステップであって、
   前記予備洗浄ステップで使用される前記固体支持体が、請求項１のステップｂ）で使用される固体支持体と同じ材料で作られているが、前記親和性リガンドがカップリングしていないステップ
   を含む、請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
9. （ａ）ＬＣ−ＭＳが、逆相ＬＣ−ＭＳもしくはナノＬＣ−ＭＳであり、好ましくは前記ＬＣ−ＭＳが逆相ナノＬＣ−ＭＳであり；
   （ｂ）固体支持体が、マイクロビーズ、好ましくはセファロースビーズ、アガロースビーズもしくは磁気ビーズ、より好ましくはセファロースビーズを含むレジンであり；
   （ｃ）親和性リガンドが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、臭化シアン、エポキシ、カルボジイミドもしくはチオプロピルを介して、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を介して、前記固体支持体にカップリングしており；および／または
   （ｄ）哺乳動物の前記２つ以上の液体試料が、マルチウェルフィルタープレート中で、好ましくは２４、９６もしくは３８４ウェルフィルタープレート中で、より好ましくは９６ウェルフィルタープレート中で、分析するために調製される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 哺乳動物の前記液体試料が、
    （ａ）体液、好ましくは血清もしくは血漿、尿、脳脊髄液、羊水、唾液、汗、精液、涙、痰、膣分泌物、膣洗浄液および結腸洗浄液からなる群から選択され；好ましくは、前記試料は血漿または血清試料であり；ならびに／または
    （ｂ）ヒト、サル、げっ歯類、イヌ、ネコもしくはブタから得られる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 目的の組換え糖タンパク質のグリカンの少なくとも１つの特異的グリカン構造の薬物動態パラメータ、好ましくはＣ_ｍａｘ、ｔ_ｍａｘ、ＡＵＣまたはｔ_１／２が決定される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. グリカンが、哺乳動物の前記２つ以上の各液体試料のアリコートにおいて分析され、場合により組換え糖タンパク質の濃度が、哺乳動物の前記２つ以上の液体試料のさらなるアリコートにおいて分析される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 分析される試料またはアリコートが、約１μｌから約１０００μｌ、約５μｌから約５００μｌ、約１０μｌから約２００μｌ、約１０μｌから約１００μｌ、約２５μｌから約１００μｌまたは約４０μｌから約７５μｌ、好ましくは約５０μｌの容量を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 糖タンパク質ベースの医薬組成物を調製する方法であって、請求項１から１３のいずれか一項に記載の哺乳動物の液体試料中の組換え糖タンパク質のグリカンを分析するステップ；および、前記糖タンパク質を前記医薬組成物として製剤化するステップを含む、方法。
15. 哺乳動物の液体試料中の目的のＦｃ融合タンパク質のグリカンを分析する方法であって、
    ａ）Ｆｃドメインおよびエフェクタードメインを含有するＦｃ融合タンパク質を含む、哺乳動物からの２つ以上の液体試料を用意するステップ；
    ａａ）哺乳動物の前記２つ以上の各液体試料を予備洗浄するステップであって、
    ｉ）Ｆｃ結合タンパク質を使用して、別個の固体支持体上に前記各試料のＦｃ融合タンパク質を固定化するステップであって、前記Ｆｃ結合タンパク質は、好ましくはプロテインＧまたはプロテインＡから選択され、より好ましくは前記Ｆｃ結合タンパク質はプロテインＧであるステップ；および
    ｉｉ）前記Ｆｃ融合タンパク質を溶出するステップ
    を含むステップ；
    ｂ）前記各試料のＦｃ融合タンパク質を、試料中のＦｃ融合タンパク質のエフェクタードメインに特異的な親和性リガンドがカップリングした別個の固体支持体上に、固定化するステップであって、前記親和性リガンドは結合パートナーであり、または前記Ｆｃ融合タンパク質のエフェクタードメインに特異的に結合する抗体であるステップ；
    ｃ）Ｆｃ融合タンパク質に特異的なエンドペプチダーゼで切断することによって、前記固体支持体から、前記各試料のＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインを、別個の溶出液に放出させるステップ；
    ｄｄ）ステップｃ）の後に前記固体支持体上に残っている、前記各試料のＦｃ融合タンパク質の固定化されたエフェクタードメインから、グリカンを別個の溶液に放出させるステップ；
    ｅｅ）前記各試料のグリカンを蛍光標識の第一の安定同位体で標識するステップ；ならびに
    ｆｆ）ＬＣ−ＭＳを用いて、前記各試料のステップｅｅ）の標識されたグリカンを別々に分析し、前記２つ以上の試料を比較するステップ
    を含み、
    ここで、蛍光標識の第二の安定同位体で標識されたグリカンを含む参照標準が、ステップｄｄ）、ｅｅ）またはｆｆ）の前に前記各試料に添加され、前記参照標準は、ステップｆｆ）の標識グリカンとともに分析される、方法。

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