CN110672767A - 一种重组蛋白糖谱分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组蛋白糖谱分析方法，包括如下步骤：S1、配制溶液，具体包括S101、配制蛋白质变性液，S102、配制PNGase F溶液；S103、配制Triton X‑100溶液。本发明利用糖谱分析研究，来反映糖蛋白的修饰情况和批间一致性；建立一种基于HPLC‑HILIC的N连接糖糖谱分析方法，用于质控此样品N连接糖糖基化修饰的批间一致性。本发明中样品预处理根据样品中的蛋白浓度进行不同处理，便于后续试验分析同时提高分析准确度。本发明中进一步提出了去除多余的2‑AB标记液的方法，有效去除多余2‑AB标记液，进一步保证分析准确性；本发明进一步采用UPLC分析中利用乙腈平衡系统至基线平稳，用下述的洗脱条件平衡色谱柱一针再进样分析，进一步提高分析准确性。

Description

一种重组蛋白糖谱分析方法
技术领域
本发明属于蛋白糖谱分析技术领域，具体为一种重组蛋白糖谱分析方法。
背景技术
糖蛋白是一类高度复杂且具有明显异质性的大分子，其中糖基化异质性是其固有特性，影响其生物活性、蛋白构象、稳定性、可溶性、药代动力学和免疫原性，最终影响其安全性、有效性和半衰期。重组人红细胞生成素(Fc)融合蛋白是利用基因工程技术，将EPO基因融合Fc基因片段后转入CHO细胞内，高效表达一种高度复杂的糖蛋白，用于治疗慢性肾功能衰竭和癌症化疗引起的贫血等。理论上这个蛋白有4个N连接糖基化位点。糖的完整性直接影响此蛋白在人体内的代谢稳定性和生物学活性，而完整的糖修饰多以唾液酸结束，已有研究表明，唾液酸化程度与此蛋白的活性呈正比关系，EPO四天线糖型含量的增加能显著增强EPO在老鼠体内的生物活性。
对于重组糖蛋白药物的质量研究和控制，近年来EMA、ICH、CFDA等先后出台相应的指导文件，提出需要对糖蛋白进行糖基化鉴定和修饰程度质控。在我国早期的细胞因子类(如EPO)的研究中，主要通过质控唾液酸的含量来间接反映其糖基化修饰程度；而随着技术的进步，尤其是国内外抗体类药物的研究，逐步开始要求进行糖谱分析研究，来反映糖蛋白的修饰情况和批间一致性；发明人经过长时间试验，提出了一种重组蛋白糖谱分析方法，用于对重组糖蛋白进行糖基化鉴定和修饰程度质控。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决背景技术涉及的技术问题，提供一种重组蛋白糖谱分析方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种重组蛋白糖谱分析方法，包括如下步骤：
S1、配制溶液，包括S101、配制蛋白质变性液；
S102、配制PNGase F溶液；
S103、配制Triton X-100溶液；
S104、配制酶切缓冲液；
S105、配制甲酸铵溶液；
S2、样品检测，包括S201、样品预处理；
S202、糖链的酶切处理：离心管中加入50μL上述得到的蛋白溶液、100μL酶切缓冲液和10μL蛋白变性液，混匀后沸水浴10min，室温冷却5min，加入10μL 15％TritonX100，混匀再加入8μL的PNGase F(250U/mL)，混匀后37℃恒温箱中酶切2h；
S203、除蛋白和干燥：将酶切完成的溶液加入至10k超滤离心管中，14000×g离心30分钟，收集过滤液约130μL并转移至1.5mL的洁净EP管中，室温下真空离心干燥2h；
S204、2-AB标记液的配制：取700μL DMSO至1.5mL洁净离心管中，加入300μL冰醋酸，漩涡混匀得到标记缓冲液，加入到50mg 2-AB中，漩涡混匀，待完全溶解后，再加入到63mg氰基硼氢化钠中，漩涡混匀至完全溶解(可65℃预热加速溶解)，即为2-AB标记液，避光保存，一个小时内使用；
S205、糖链的衍生；取10μL新配制的2-AB标记液加入至干燥糖链中，振动混匀至均一的乳白色溶液，多层封口膜封住管口置于65℃烘干箱中衍生2h，衍生结束室温冷却3分钟后加入190μL去离子水混匀用于下步；
S206、去除多余的2-AB标记液；
S207、UPLC分析：按照UPLC设备操作规程，灌注完成后，用25％水：75％乙腈平衡系统约15min(流速0.1ml/min)，接上色谱柱，用25％水：75％乙腈冲洗色谱柱约5min(流速0.3ml/min)，再切换至起始条件(25％流动相A：75％乙腈)，平衡1～1.5h至基线平稳，用下述的洗脱条件平衡色谱柱一针再进样分析；
S3、数据处理及结果判断：包括S301、确定积分条件积分得到糖谱，峰宽20，阈值32，最小峰面积60000，积分时间为5～60分钟，共积分14个峰(见图2)，RT窗口15.00％，更新RT为平均所有峰的保留时间参比和相对保留时间参比均为峰3，峰匹配除了峰3为最大面积，其余峰的峰匹配均为最接近的，积分得到的典型的糖谱；S302、结果判断，在检测待检样品时，应同时处理对照品作为质控；在规定的积分条件下，对照品应积到14个目标峰，用归一化法计算各峰面积占14个峰总面积的比例，若各峰面积的比例(％)符合下表糖谱标准，实验结果成立，否则应重检；样品结果与对照品一致且符合下表规定，判为合格；
S4、检测后处理：在试验结束后应切换50％水溶液冲洗系统后再用85％乙腈保存色谱柱和UPLC系统；每次使用完后拆下色谱柱，接上配套的PEEK头，置于阴凉处妥善保存；用两通连接设备管路；并及时清理实验台面、实验所用耗材及实验样品。
其中，所述S101中配制蛋白质变性液：称取0.02g十二烷基胺磺酸钠溶解于10mL超纯水中，再加入71μLβ-巯基乙醇，混匀，4℃保存备用。
其中，所述S102中配制PNGase F溶液：先将装PNGase F(50U，粉末状)的棕色玻璃瓶正立状态轻轻敲十下，加入200μL超纯水溶解并混匀，形成250U/mLPNGase F溶液，并用PCR管分装，每管20μL，-20℃保存备用；
其中，所述S103、配制Triton X-100溶液：称取0.15g Triton X-100，加入超纯水至1mL混匀形成15％TritonX-100溶液，4℃保存备用；
其中，所述S104中配制酶切缓冲液：称取1.51g十二水磷酸氢二钠、0.13g二水磷酸二氢钠，用100mL超纯水溶解，其可用磷酸或者氢氧化钠调节pH为7.5±0.1。
其中，所述S105中配制甲酸铵溶液：称取甲酸铵3.15g，用900mL超纯水溶解，用甲酸调pH至4.5，再用超纯水定容至1L，0.22μm针头过滤器过滤，超声15min，配制成50mmol/L，pH4.5的甲酸铵溶液。
其中，所述S201中样品预处理，包括S2011、将SUBS-4对照品和样品用稀释缓冲液(20mmol/LPB+30mmol/LNaCl，pH7.0)稀释至3mg/ml；
S2012、若待测样品的缓冲液不是稀释缓冲液时，取300μL蛋白溶液加入10K超滤离心管14000×g离心10min，加入300μL原液缓冲液再离心10min，再重复操作1次，蛋白回收率以90％计估算，最后用适量的原液缓冲液分两次洗下蛋白，使蛋白浓度在3mg/ml或以上，Lowry检测蛋白浓度，再用稀释缓冲液稀释至3mg/ml；
S2013、若样品中的蛋白浓度低于3mg/mL时，取500μL蛋白溶液加入10K超滤离心管14000×g离心10min，用适量的原液缓冲液分两次洗下蛋白，蛋白回收率以90％计估算，使蛋白浓度在3mg/mL或以上，Lowry法检测蛋白浓度，再用稀释缓冲液稀释至3mg/ml。
其中，S206、去除多余的2-AB标记液：包括如下步骤：S2061、重悬脱盐柱，去掉脱盐柱顶部和底部的盖子，使保存液流入柱床至底部出口不再有液滴滴出；S2062、用超纯水注满脱盐柱，使超纯水流入柱床至底部出口不再有液滴滴出，重复3次，丢弃流出液；
S2063、将衍生完成的约200μL糖链衍生物用移液枪加入脱盐柱中；
S2064、待样品流入柱床至底部出口不再有液滴滴出，再加入500μL超纯水；
S2065、待超纯水流入柱床至底部出口不再有液滴滴出后，再取1.5mL洁净离心管置于脱盐柱底部收集口，加入0.5mL超纯水洗脱并收集。
S2066、将收集到的洗脱液用0.22μm针头过滤器(SLGV R04 NL)过滤，4℃短时间保存备用。
其中S207、UPLC分析中具体色谱条件如下：柱温：40℃，进样体积：2μl，流动相A：50mmol/L甲酸铵(pH4.5)，流动相C：100％乙腈，W2475检测器参数：λex＝330nm，λem＝420nm，洗脱条件见下表：
Figure BDA0002238093570000051
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明利用糖谱分析研究，来反映糖蛋白的修饰情况和批间一致性；建立一种基于HPLC-HILIC的N连接糖糖谱分析方法，用于质控此样品N连接糖糖基化修饰的批间一致性。
2、本发明中样品预处理根据样品中的蛋白浓度进行不同处理，便于后续试验分析同时提高分析准确度。
3、本发明中进一步提出了去除多余的2-AB标记液的方法，有效去除多余2-AB标记液，进一步保证分析准确性。
4、本发明进一步采用UPLC分析中利用乙腈平衡系统至基线平稳，用下述的洗脱条件平衡色谱柱一针再进样分析，进一步提高分析准确性。
附图说明
图1为本发明的积分条件截图；
图2为本发明中积分糖谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1.实验准备
1.1主要材料如下表：
Figure BDA0002238093570000061
1.2主要仪器如下表：
Figure BDA0002238093570000071
2溶液配制
2.1蛋白质变性液
称取0.02g十二烷基胺磺酸钠溶解于10mL超纯水中，再加入71μLβ-巯基乙醇，混匀，4℃保存备用；
2.2 250U/mLPNGase F溶液
先将装PNGase F(50U，粉末状)的棕色玻璃瓶正立状态轻轻敲十下，加入200μL超纯水溶解并混匀，用PCR管分装，每管20μL，-20℃保存备用；
2.3 15％Triton X-100
称取0.15g Triton X-100，加入超纯水至1mL混匀，4℃保存备用；
2.4酶切缓冲液(50mmol/LPB，pH 7.5)
称取1.51g十二水磷酸氢二钠、0.13g二水磷酸二氢钠，用100mL超纯水溶解，其pH应为7.5±0.1，可用磷酸或者氢氧化钠调节pH。
2.5甲酸铵溶液(50mmol/L，pH4.5)
称取甲酸铵3.15g，用900mL超纯水溶解，用甲酸调pH至4.5，再用超纯水定容至1L，0.22μm针头过滤器过滤，超声15min。
3.检测方法
3.1蛋白缓冲液的更换
3.1.1将SUBS-4对照品和样品用稀释缓冲液(20mmol/L PB+30mmol/L NaCl，pH7.0)稀释至3mg/mL。
3.1.2若待测样品的缓冲液不是稀释缓冲液时，取300μL蛋白溶液加入10K超滤离心管14000×g离心10min，加入300μL原液缓冲液再离心10min，再重复操作1次，蛋白回收率以90％计估算，最后用适量的原液缓冲液分两次洗下蛋白，使蛋白浓度在3mg/mL或以上，Lowry检测蛋白浓度，再用稀释缓冲液稀释至3mg/ml。
3.1.3若样品中的蛋白浓度低于3mg/mL时，取500μL蛋白溶液加入10K超滤离心管14000×g离心10min，用适量的原液缓冲液分两次洗下蛋白，蛋白回收率以90％计估算，使蛋白浓度在3mg/mL或以上，Lowry法检测蛋白浓度，再用稀释缓冲液稀释至3mg/ml。
3.2糖链的酶切
离心管中加入50μL上述得到的蛋白溶液、100μL酶切缓冲液和10μL蛋白变性液，混匀后沸水浴10min，室温冷却5min，加入10μL 15％Triton X100，混匀再加入8μL的PNGase F(250U/mL)，混匀后37℃恒温箱中酶切2h。
3.3除蛋白和干燥
将酶切完成的溶液加入至10k超滤离心管中，14000×g离心30分钟，收集过滤液约130μL并转移至1.5mL的洁净EP管中，室温下真空离心干燥2h；
3.4 2-AB标记液的配制
取700μL DMSO至1.5mL洁净离心管中，加入300μL冰醋酸，漩涡混匀得到标记缓冲液，加入到50mg 2-AB中，漩涡混匀，待完全溶解后，再加入到63mg氰基硼氢化钠中，漩涡混匀至完全溶解(可65℃预热加速溶解)，即为2-AB标记液，避光保存，一个小时内使用；
3.5糖链的衍生
取10μL新配制的2-AB标记液加入至干燥糖链中，振动混匀至均一的乳白色溶液，多层封口膜封住管口置于65℃烘干箱中衍生2h，衍生结束室温冷却3分钟后加入190μL去离子水混匀用于下步；
3.6去除过多的2-AB(具体操作步骤如下)
重悬脱盐柱，去掉脱盐柱顶部和底部的盖子，使保存液流入柱床至底部出口不再有液滴滴出；
用超纯水注满脱盐柱，使超纯水流入柱床至底部出口不再有液滴滴出，重复3次，丢弃流出液；
将衍生完成的约200μL糖链衍生物用移液枪加入脱盐柱中；
待样品流入柱床至底部出口不再有液滴滴出，再加入500μL超纯水；
待超纯水流入柱床至底部出口不再有液滴滴出后，再取1.5mL洁净离心管置于脱盐柱底部收集口，加入0.5mL超纯水洗脱并收集。
将收集到的洗脱液用0.22μm针头过滤器(SLGV R04 NL)过滤，4℃短时间保存备用，但应尽快进行UPLC分析。
3.7 UPLC分析
按照UPLC设备操作规程，灌注完成后，用25％水：75％乙腈平衡系统约15min(流速0.1ml/min)，接上色谱柱，用25％水：75％乙腈冲洗色谱柱约5min(流速0.3ml/min)，再切换至起始条件(25％流动相A：75％乙腈)，平衡1～1.5h至基线平稳，用下述的洗脱条件平衡色谱柱一针再进样分析，具体色谱条件如下：
柱温：40℃，进样体积：2μl，流动相A：50mmol/L甲酸铵(pH4.5)，流动相C：100％乙腈，W2475检测器参数：λex＝330nm，λem＝420nm，洗脱条件见下表：
Figure BDA0002238093570000101
3.8数据处理及结果判断
3.8.1积分条件
峰宽20，阈值32，最小峰面积60000，积分时间为5～60分钟，共积分14个峰(见图2)，RT窗口15.00％，更新RT为平均所有峰的保留时间参比和相对保留时间参比均为峰3，峰匹配除了峰3为最大面积，其余峰的峰匹配均为最接近的(见图1)，积分得到的典型的糖谱见图2。
3.8.2结果判断
在检测待检样品时，应同时处理对照品作为质控。在规定的积分条件下，对照品应积到14个目标峰，用归一化法计算各峰面积占14个峰总面积的比例，若各峰面积的比例(％)符合下表糖谱标准，实验结果成立，否则应重检；样品结果与对照品一致且符合下表规定，判为合格。
Figure BDA0002238093570000111
3.9注意事项
3.9.1禁止使用100％有机相或100％水相冲洗色谱柱；
3.9.2灌注完成后，应用25％水：75％乙腈平衡系统，之后再接色谱柱；
3.9.3流动相A是含盐流动相，在试验结束后应切换50％水溶液冲洗系统后再用85％乙腈保存色谱柱和UPLC系统(每次使用完后拆下色谱柱，接上配套的PEEK头，置于阴凉处妥善保存；用两通连接设备管路)。及时清理实验台面、实验所用耗材及实验样品。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种重组蛋白糖谱分析方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、配制溶液，包括S101、配制蛋白质变性液；
S102、配制PNGase F溶液；
S103、配制Triton X-100溶液；
S104、配制酶切缓冲液；
S105、配制甲酸铵溶液；
S2、样品检测，包括S201、样品预处理；
S202、糖链的酶切处理：离心管中加入50μL上述得到的蛋白溶液、100μL酶切缓冲液和10μL蛋白变性液，混匀后沸水浴10min，室温冷却5min，加入10μL 15％Triton X100，混匀再加入8μL 250U/mL的PNGase F，混匀后37℃恒温箱中酶切2h；
S203、除蛋白和干燥：将酶切完成的溶液加入至10k超滤离心管中，14000×g离心30分钟，收集过滤液约130μL并转移至1.5mL的洁净EP管中，室温下真空离心干燥2h；
S204、2-AB标记液的配制：取700μL DMSO至1.5mL洁净离心管中，加入300μL冰醋酸，漩涡混匀得到标记缓冲液，加入到50mg 2-AB中，漩涡混匀，待完全溶解后，再加入到63mg氰基硼氢化钠中，漩涡混匀至完全溶解，即为2-AB标记液，避光保存，一个小时内使用；
S205、糖链的衍生：取10μL新配制的2-AB标记液加入至干燥糖链中，振动混匀至均一的乳白色溶液，多层封口膜封住管口置于65℃烘干箱中衍生2h，衍生结束室温冷却3分钟后加入190μL去离子水混匀用于下步；
S206、去除多余的2-AB标记液；
S207、UPLC分析：按照UPLC设备操作规程，灌注完成后，用25％水：75％乙腈平衡系统15min，流速0.1ml/min，接上色谱柱，用25％水：75％乙腈冲洗色谱柱约5min，流速0.3ml/min，再切换至起始条件，25％流动相A：75％乙腈，平衡1～1.5h至基线平稳，用下述的洗脱条件平衡色谱柱一针再进样分析；
S3、数据处理及结果判断：包括S301、确定积分条件积分得到糖谱，峰宽20，阈值32，最小峰面积60000，积分时间为5～60分钟，共积分14个峰，RT窗口15.00％，更新RT为平均所有峰的保留时间参比和相对保留时间参比均为峰3，峰匹配除了峰3为最大面积，其余峰的峰匹配均为最接近的；S302、结果判断，在检测待检样品时，应同时处理对照品作为质控；在规定的积分条件下，对照品应积到14个目标峰，用归一化法计算各峰面积占14个峰总面积的比例，若各峰面积的比例％符合相应糖谱标准，实验结果成立，否则应重检；样品结果与对照品一致且符合下表规定，判为合格；
Figure RE-FDA0002289710780000021
S4、检测后处理：在试验结束后应切换50％水溶液冲洗系统后再用85％乙腈保存色谱柱和UPLC系统；每次使用完后拆下色谱柱，接上配套的PEEK头，置于阴凉处妥善保存；用两通连接设备管路。
2.如权利要求1所述的一种重组蛋白糖谱分析方法，其特征在于：所述S101中配制蛋白质变性液，称取0.02g十二烷基胺磺酸钠溶解于10mL超纯水中，再加入71μL β-巯基乙醇，混匀，4℃保存备用。
3.如权利要求1所述的一种重组蛋白糖谱分析方法，其特征在于：所述S102中配制PNGase F溶液，先将装50U，粉末状的PNGase F于棕色玻璃瓶正立状态轻轻敲十下，加入200μL超纯水溶解并混匀，形成250U/mL PNGase F溶液，并用PCR管分装，每管20μL，-20℃保存备用。
4.如权利要求1所述的一种重组蛋白糖谱分析方法，其特征在于：所述S103、配制Triton X-100溶液；称取0.15g Triton X-100，加入超纯水至1mL混匀形成15％Triton X-100溶液，4℃保存备用。
5.如权利要求1所述的一种重组蛋白糖谱分析方法，其特征在于：所述S104中配制酶切缓冲液；称取1.51g十二水磷酸氢二钠、0.13g二水磷酸二氢钠，用100mL超纯水溶解，其可用磷酸或者氢氧化钠调节pH为7.5±0.1。
6.如权利要求1所述的一种重组蛋白糖谱分析方法，其特征在于：所述S105中配制甲酸铵溶液；称取甲酸铵3.15g，用900mL超纯水溶解，用甲酸调pH至4.5，再用超纯水定容至1L，0.22μm针头过滤器过滤，超声15min，配制成50mmol/L，pH4.5的甲酸铵溶液。
7.如权利要求1-6任一所述的一种重组蛋白糖谱分析方法，其特征在于：所述S201中样品预处理，包括S2011、将SUBS-4对照品和样品用稀释缓冲液为20mmol/L PB+30mmol/LNaCl，pH7.0稀释至3mg/ml；
S2012、若待测样品的缓冲液不是稀释缓冲液时，取300μL蛋白溶液加入10K超滤离心管14000×g离心10min，加入300μL原液缓冲液再离心10min，再重复操作1次，蛋白回收率以90％计估算，最后用适量的原液缓冲液分两次洗下蛋白，使蛋白浓度在3mg/ml或以上，Lowry检测蛋白浓度，再用稀释缓冲液稀释至3mg/ml；
S2013、若样品中的蛋白浓度低于3mg/mL时，取500μL蛋白溶液加入10K超滤离心管14000×g离心10min，用适量的原液缓冲液分两次洗下蛋白，蛋白回收率以90％计估算，使蛋白浓度在3mg/mL或以上，Lowry法检测蛋白浓度，再用稀释缓冲液稀释至3mg/ml。
8.如权利要求7所述的一种重组蛋白糖谱分析方法，其特征在于：S206、去除多余的2-AB标记液；包括如下步骤：S2061、重悬脱盐柱，去掉脱盐柱顶部和底部的盖子，使保存液流入柱床至底部出口不再有液滴滴出；
S2062、用超纯水注满脱盐柱，使超纯水流入柱床至底部出口不再有液滴滴出，重复3次，丢弃流出液；
S2063、将衍生完成的约200μL糖链衍生物用移液枪加入脱盐柱中；
S2064、待样品流入柱床至底部出口不再有液滴滴出，再加入500μL超纯水；
S2065、待超纯水流入柱床至底部出口不再有液滴滴出后，再取1.5mL洁净离心管置于脱盐柱底部收集口，加入0.5mL超纯水洗脱并收集；
S2066、将收集到的洗脱液用0.22μm针头过滤器SLGV R04 NL过滤，4℃短时间保存备用。
9.权利要求8所述的一种重组蛋白糖谱分析方法，其特征在于：S207、UPLC分析中具体色谱条件如下：柱温：40℃，进样体积：2μl，流动相A：pH4.5的50mmol/L甲酸铵，流动相C：100％乙腈，W2475检测器参数：λex＝330nm，λem＝420nm，洗脱条件见下表：
Figure RE-FDA0002289710780000051
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