CN107014935B - 一种血浆或血清的IgG糖型检测批量前处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血浆或血清IgG糖型检测的批量前处理方法，其步骤包括：血浆或血清IgG提取、IgG切糖、糖链标记、标记后纯化得到被标记糖链，整板挥干。本发明与传统的单个糖蛋白(IgG)样品进行IgG切糖‑糖链纯化‑2‑AB标记糖链‑标记后糖链纯化步骤相比，本发明在2‑AB前省去了糖链的纯化步骤，大大缩减了样品前处理时间，还节约了成本，采用整板操作减少了样品转移的损失及繁冗步骤，能同时快速高效地处理96份血浆(或血清)样品。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析领域的糖蛋白糖型检测样品前处理方法，特别涉及血浆(或血清)IgG 2-AB标记的糖型检测批量前处理方法。
背景技术
蛋白质糖基化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式。真核细胞中约有一半的蛋白质发生过糖基化。蛋白质糖基化不仅赋予蛋白质特定的理化性质(如溶解性和稳定性)，更重要的是参与凝血、免疫、细胞生长、分泌和信号传导等生理活动。蛋白质糖基化异常与许多疾病密切相关，比如恶性肿瘤、风湿性关节炎和阿尔茨海默病等。蛋白质糖基化也为肿瘤早期诊断和治疗提供依据，绝大多数临床用肿瘤标记物和蛋白质类药物是糖蛋白。因此，研究蛋白质糖基化不仅可以加深对糖蛋白的生物功能的认识，而且对探讨疾病发生、发现疾病标记物和开发新药具有重要意义。
免疫球蛋白(英文全称，IgG)，又称抗体是一种很重要的糖蛋白，主要分布在血清中。它由两条相同的分子量较小的轻链和两条分子量较大的重链通过二硫键连接而成，抗体的糖链位于重链FC片段上，为N-连接糖。IgG的糖基化对于调节IgG的细胞毒性和抗炎、促炎等炎性潜力非常关键。自身免疫状态和IgG抗体的特定糖基化模式之间的联系已在患类风湿性关节炎和几自身免疫血管炎的患者中被观察到，其中已报道与IgG抗体的降低的半乳糖基化和唾液酸化相关。对IgG糖链结构分析已成为当前研究的热点。陶磊等人(《药物分析杂志》，2011年第11期)分析IgG1型单抗中糖链切除对其结构与功能的影响，结果表明糖链切除后抗体的圆二色谱发生改变，抗原结合能力下降，体外CDC活性基本消失。
然而糖链结构中富含多羟基且基本不含发色团，呈电中性等性质，使得糖类分析非常困难、复杂结构的检测更是异常艰难。因此，需要快速、简单且精确的方式分析糖链结构的技术，并且通过各种方法进行糖链分析。为了进行糖链分析，必须首先从包含在生物样品中分离纯化糖链。一般是将糖蛋白上的糖链切掉并分离纯化后进行分析。因为糖链本身没有发色基团，而且其在质谱仪上不易离子化，为了在分离纯化和结构鉴定过程中能够更有效地检测到糖链，一般进行柱前衍生的方法。该方法主要是对糖链进行标记，使糖链带上紫外或荧光基团，提高检测的灵敏度，同时又可以使糖链带上疏水基团，降低糖链的极性，使糖链在反相色谱柱上得到保留，利于糖链的分离。目前对糖链进行衍生化标记的试剂主要包括2-AB标记衍生糖链的方法。
中国专利申请201410844142.6、发明名称“快速全面检测单克隆抗体N糖基化位点上寡糖的方法”公开了通过酶解反应切除寡糖，然后使用2-AB溶液标记寡糖，纯化寡糖后通过LC-荧光-ESI-MS分析。然而，该方法需要通过氨丙基固相萃取柱进行纯化，过柱纯化步骤复杂并且成本较高，因此不适于批处理切除糖链和2-AB标记及纯化。此外，陶磊等人同时公开了从抗体或蛋白上切除或测定糖链的方法。然而，该方法也需要色谱柱或过柱纯化，导致不能高通量或批处理，因此限制了批处理切除糖链和2-AB标记及纯化。
中国专利申请200610084289.5、发明名称“糖链切除装置”公开了用于从碱溶液中切除糖链的装置，包括反应槽和分离纯化的离子交换柱。然而，该装置只适于从复合碳水化合物中切除糖链，且整个装置包括复杂的构成部件，因此也不适于批处理切除糖链和2-AB标记及纯化。
另外，使用2-AB试剂标记糖链的一般步骤为:(1)通过糖苷酶从糖蛋白切除糖链；(2)对获得的糖链进行纯化；(3)2-AB标记糖链；(4)标记后糖链的纯化，也就是传统的二步纯化法。其中，对于血清或血浆IgG的糖链分析，还需IgG的分离纯化步骤。因此对于血清(或血浆)IgG的糖链分析，相当于需要进行三次糖链纯化，其中在标记之前必须纯化糖链，否则可能出现杂质干扰，导致标记不完全，因此二步法存在步骤繁琐并且可能造成糖链产物的损失。同时，在一些现有技术中，在酶切前需要更换缓冲液，否则导致切糖酶活性变弱，切糖不充分，从而不能保证检测结果的灵敏度和准确度。
因此，目前需要一种能够降低成本、简化步骤，且适用批处理切除糖链和2-AB标记及纯化的方法，该方法应当适用于质谱或色谱检测用的检测平板或微孔板。
发明内容
本发明原理之一在于：本发明不再遵循先纯化糖链后进行标记的传统方法，而是直接进行标记后再进行纯化。由于相对于昂贵的抗体及其糖链样品而言，2-AB试剂更为廉价，因此在确保切除的糖链充分被2-AB试剂标记后再进行纯化，能够有效提高标记效率和产率。
本发明原理之二在于：在进行标记时，为了糖链混合物中的杂质影响标记，通过优化标记反应参数，尽可能使得标记效率达到或基本达到常规的纯化环境中的标记效率，从而通过因取消纯化糖链步骤而客观上提高或基本提高糖链的标记效率。
本发明原理之三在于：通过摸索2-AB与氰基硼氢化钠的配比，选择最适的配比，从而在保证足够的标记效率的情况下，减少荧光剂的使用，有效减少了成本。
本发明原理之四在于：还可联合使用已有的Protein G提取板，对血浆(或血清)IgG进行快速纯化和高效分离，从而能够实现快速、高通量的批处理过程。
因此，本发明目的是提供一种从血浆或血清的IgG上批处理切除糖链和纯化的方法，步骤包括：
(1)IgG提取：通过96孔Protein G提取板将血浆或血清IgG提取至2mL96孔收集板中，测定蛋白浓度后，取出250-350μL IgG溶液或120-180μg IgG于1.1mL 96孔深孔板中整板挥干；
(2)IgG切糖：在深孔板中加入变性剂变性蛋白后调节溶液pH至8.0，加入糖苷酶或切糖酶进行切除糖链；
(3)糖链标记：在挥干的深孔板中加入2-AB标记溶液，65℃反应3小时，进行2-AB标记；
(4)标记后纯化：深孔板加入乙腈溶液，上清液转移至96孔糖链纯化板，除去多余的标记试剂，在深孔板中收集洗脱出的被标记糖链，整板挥干；
其中，步骤2)中变性剂为SDS溶液，并在60℃变性反应10min，或变性剂为Igepal溶液，并在室温变性反应10分钟；以及加入的糖苷酶或切糖酶的质量g与蛋白质的质量g比约1:50～1:30；
步骤3)中，每孔加入的标记溶液为0.5mg的2-AB和1.2mg的氰基硼氢化钠，并且所述2-AB和氰基硼氢化钠预先配制在含30％乙酸的DMSO溶液中；
步骤4)中，去除多余标记试剂所用清洗液为96％的乙腈溶液，洗脱标记的糖链为超纯水。
在一个实施方案中，步骤1)中还包括IgG提取板前处理、IgG结合和清洗、IgG洗脱、IgG提取板再生和保护。
在一个具体实施方案中，所述IgG提取板前处理方法为：
①用2毫升超纯水清洗板子-真空泵抽滤，去除废液；
②用2毫升1×PBS清洗板子-真空泵抽滤，去除废液；
③用1毫升0.1M甲酸溶液清洗板子-真空泵抽滤，去除废液；
④用2毫升10×PBS进行板子的中和-真空泵抽滤，去除废液；
⑤用4毫升1×PBS平衡板子-真空泵抽滤，去除废液。
在另一具体实施方案中，所述IgG结合和清洗方法为：用2毫升1×PBS清洗板子-真空泵抽滤，去除废液。再重复2次。
在其他具体实施方案中，所述IgG洗脱的方法为：
①用1毫升0.1M甲酸溶液洗脱IgG-真空泵抽滤，收集洗脱液；
②向收集板中加入170μL中和缓冲液，并用枪头混匀；
③用锡箔纸将收集板盖好，放在震荡器轻微摇晃，避免交叉污染，直至检测样品浓度。
④在其他具体实施方案中，所述IgG提取板再生和保护的方法为：
⑤用2毫升0.1M甲酸溶液清洗板子-真空泵抽滤，去除废液；
⑥用2毫升10×PBS清洗板子-真空泵抽滤，去除废液；
⑦用4毫升1×PBS清洗板子-真空泵抽滤，去除废液；
⑧加入1毫升-真空泵抽滤，去除废液，其中存储缓冲液为20％乙醇溶于20mMTris+0.1M NaCl；
⑨加入1毫升存储缓冲液，4℃保存。
上述20％乙醇配制为20mL无水乙醇与80mL水混合而成。
在另一实施方案中，步骤1)中血浆或血清样本量为50μL，使用前用1×PBS(pH7.4)稀释7倍，Protein G提取板为96孔Protein G提取板，IgG收集为96孔收集板；蛋白浓度测定所用仪器为nano-drop蛋白浓度测定仪，测定波长为280nm，IgG的摩尔吸光系数值为2.534×105。
在另外实施方案中，步骤(2)中，SDS溶液浓度为1.33％，Igepal溶液浓度为为10％，pH调节剂为0.1M NaOH和5×PBS的混合液，加入的切糖酶为PNGase F酶，所述Igepal为(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇-辛基苯基-聚乙烯二醇。
还在其他的实施方案中，步骤(4)中，纯化标记后的糖链的纯化板为0.22μm的亲水性96孔板，纯化过程包括清洗、洗脱过程，其中，清洗过程包括：
①每个样品中加入700μL100％乙腈，用枪头混匀并全部(含75μL样品和700μL乙腈)转移到纯化板中，孵育两分钟。真空泵抽滤，去除废液；
②在纯化板的每个孔中加入200μL96％乙腈-真空泵抽滤，去除废液，重复四次；
③将纯化板放在1毫升或2毫升收集板上，每个孔中加入200μL96％乙腈；
④1000转/分钟，离心5分钟。
其中，洗脱过程包括：
①每个孔中加入100μL超纯水，震荡15分钟；
②用真空抽滤法，将第一次洗脱液收集到PCR板中，重复一次；
③每个孔中加入100μL超纯水，震荡15分钟；
④纯化板离心5分钟，1000转/分钟，将第三次洗脱液收集到PCR板中；
⑤合并三次洗脱液，挥干后于-20℃保存。
在上述任一实施方案中，其中步骤4中还包括纯化板预处理过程，包括：
①在纯化板的每个孔中加入200μL70％乙醇-真空泵抽滤，去除废液；
②在纯化板的每个孔中加入200μL超纯水-真空泵抽滤，去除废液；
③在纯化板的每个孔中加入200μL96％乙腈-真空泵抽滤，去除废液。
在上述任一实施方案中，所述任一的加样、洗脱、清洗等过程，均可使用ThermoScientific仪器公司联排、多孔加样枪(型号：E1-ClipTip Eq 8-ch 15-125050，序列号：MH69055)及其配套枪头(型号：ClinTip 1250，序列号：94410817)。
有益效果
1、与传统的单个糖蛋白(IgG)样品进行IgG切糖-糖链纯化-2-AB标记糖链-标记后糖链纯化步骤相比，本发明在2-AB前省去了糖链的纯化步骤，大大缩减了样品前处理时间，还节约了成本，并且本方法能同时快速高效地处理96份血浆(或血清)样品，具有高通量特性。
2、本发明通过比对分析，确定了280nm下抗体的测定浓度的摩尔吸光系数为2.534×105。该系数能够对应于最适的抗体浓度，从而保障后续的糖链纯化过程。
3、本发明通过比对分析，确定了糖链标记2-AB和氰基硼氢化钠的加入配比为2-AB:氰基硼氢化钠＝0.5mg:1.2mg。
术语和解释
术语“摩尔吸光系数”，表示液层厚度为1cm的单位浓度溶液，对一定波长的光的吸光度.表示某物质对特定波长光的吸收能力。单位是：L/(mol*cm)，其中，
朗伯-比尔吸收定律：A＝kbc
A是物质对光的吸收程度——吸光度；k是摩尔吸光系数；b是比色皿的厚度；c是待测溶液的浓度；当知道以上的两个条件(摩尔吸光系数已知的情况下)的时候，就可求出另一个数。在测定蛋白浓度时，nano-drop的比色皿厚度已知，吸光度A(280nm)由仪器自动读出，确定抗体的摩尔吸光系数后就能对抗体浓度进行测定。因此，抗体的摩尔吸光系数准确性直接关系抗体浓度的准确性。
已知的280nm下蛋白的摩尔吸光系数由蛋白中个别存在吸光度的氨基酸贡献而得。其公式为：K280＝5500*[Trp Residues]+1490*[Tyr Residues]+125*[Cystine(Disulfide Bond)]。
本发明采用轻链(序列长度236，来源PRT数据库)和重链(序列长度469，来源PRT数据库)的序列计算出Trp、Tyr和CYS的个数分别为15、29和16，因抗体为双链结构，Trp、Tyr和二硫键的个数分别为30、58和16。带入上述公式得出K280的摩尔吸光系数为2.534×105。
术语“IgG提取板再生和保护”，指是为了重复利用IgG提取板，对提取板进行再生和保护。已知实验室已重复利用约10次左右仍然有效，这样可以降低实验成本。
附图说明
图1.血浆(或血清)IgG 2-AB标记的糖型检测批量前处理方法的操作流程示意图
图2.UPLC检测2-AB标记糖链的检测结果
图3.LC-MS/MS测定人血IgG糖型图谱
具体实施方法
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。
实施例一、实验材料与方法
实验所用仪器：
(1)本发明的方法需使用与96孔IgG提取板和96孔糖链纯化板相匹配的负压泵或正压泵(推荐使用Waters负压泵)、真空浓缩仪(可96孔板整板挥干)，对于本发明处理的糖链的检测可使用(1)配备荧光检测器的高效液相色谱仪，其中，96孔Protein G提取板为BIASeparations公司，货号NO:2375，96孔收集板为Axygen公司，货号：P-DW-20-C)板，96孔深孔板为Axygen公司，货号：P-DW-11-C。
(2)与配备荧光检测器的高效液相色谱仪相连的、具有ESI离子源的高分辨质谱仪。
(3)MALDI-TOF质谱进行检测。
实验步骤：
(一)血浆(或血清)IgG的提取纯化步骤如下：
1、IgG提取板前处理
①用2毫升超纯水清洗板子-真空泵抽滤，去除废液；
②用2毫升1×PBS清洗板子-真空泵抽滤，去除废液；
③用1毫升0.1M甲酸溶液清洗板子-真空泵抽滤，去除废液；
④用2毫升10×PBS进行板子的中和-真空泵抽滤，去除废液；
⑤用4毫升1×PBS平衡板子-真空泵抽滤，去除废液。
(二)IgG结合和清洗
①血浆(或血清)样本量为50μL，用1×PBS(pH7.4)稀释7倍后加入IgG提取板；
②用2毫升1×PBS清洗板子-真空泵抽滤，去除废液，
③再重复2次。
(三)IgG洗脱
①用1毫升0.1M甲酸溶液洗脱IgG-真空泵抽滤，收集洗脱液；
②向收集板中加入170μL中和缓冲液，并用枪头混匀；
③放在震荡器轻微摇晃，避免交叉污染，直至检测样品浓度；
④震荡结束后用nanodrop蛋白浓度测定仪进行蛋白定量，其中测定波长为280nm，IgG的摩尔吸光系数值设为2.534×105，之后用锡箔纸盖好。
(四)IgG提取板再生和保护
①用2毫升0.1M甲酸溶液清洗板子-真空泵抽滤，去除废液；
②用2毫升10×PBS清洗板子-真空泵抽滤，去除废液；
③用4毫升1×PBS清洗板子-真空泵抽滤，去除废液；
④加入1毫升存储缓冲液(20％乙醇溶于20mMTris+0.1M NaCl)-真空泵抽滤，去除废液；
⑤加入1毫升存储缓冲液(20％乙醇溶于20mMTris+0.1M NaCl)，4℃保存。
(五)IgG切除糖链
①每孔取1.3.4的IgG溶液300μL(约150μg)整板挥干，每孔加入1.33％SDS 30μL，60℃反应10min。冷却至室温后，每孔加入10％Igepal 10μL，室温反应10min；
②每孔加入20μL 0.1M NaOH溶液和5×PBS溶液15μL调剂2.1溶液的pH约为7.8左右，震荡混匀，加入PNGase F酶(酶与蛋白质量比约1:50～1:30)，37℃反应18小时；
③切糖结束后，将整板溶液进行挥干，-20℃保存。
(六)2-AB标记糖链
①标记前配置标记溶液，将醋酸加入DMSO配制成30％醋酸溶液，然后将醋酸/DMSO混合液加入2-AB中，混匀至完全溶解，再将上述溶液加入PB，混匀至完全溶解。每个样本糖链标记过程中2-AB和氰基硼氢化钠的加入配比为2-AB:氰基硼氢化钠＝0.5mg:1.2mg。
②每个样品中加入25μL标记试剂，用枪头混匀。将板子用密封膜封好，放在震荡器上震荡10分钟。将板子放入烤箱，65℃，反应3小时。
(七)标记后糖链的纯化
①纯化板预处理；
②纯化板的每个孔中加入200μL70％乙醇-真空泵抽滤，去除废液；
③纯化板的每个孔中加入200μL70％乙醇-真空泵抽滤，去除废液；
④纯化板的每个孔中加入200μL超纯水-真空泵抽滤，去除废液；
⑤纯化板的每个孔中加入200μL96％乙腈-真空泵抽滤，去除废液。
(八)清洗糖链(去除杂质)
①每个样品中加入700μL100％乙腈，用枪头混匀并全部(含75μL样品和700μL乙腈)转移到纯化板中，孵育两分钟，真空泵抽滤，去除废液；
②在纯化板的每个孔中加入200μL96％乙腈-真空泵抽滤，去除废液；
③重复四次；
④将纯化板放在1毫升或2毫升收集板上，每个孔中加入200μL96％乙腈，真空泵抽滤，去除废液。1000转/分钟，离心5分钟。
(九)糖链洗脱
①每个孔中加入100μL超纯水，震荡15分钟；
②真空抽滤将第一次洗脱液收集到PCR板1中；每个孔中加入100μL超纯水，震荡15分钟；
③真空抽滤将第二次洗脱液收集到PCR板2中；每个孔中加入100μL超纯水，震荡15分钟；
④纯化板离心5分钟，1000转/分钟，将第三次洗脱液收集到PCR板中；
⑤合并三次洗脱液，挥干后于-20℃保存。
实施例二、LC法确定2-AB标记糖链法的试剂的最适配比
选用标准抗体样品mAb(Waters公司，货号：186006552，批号：W26081603)，对该抗体用水溶解，配成浓度为5mg/mL，每管取抗体溶液40μL(IgG 200μg)，共两管，挥干样本，进行相同的变性和切糖实验(实验方法见实施例一)。切糖后溶液挥干，考察2-AB标记糖链的标记效果。
配方1按照2-AB和氰基硼氢化钠的加入配比(质量比)5mg:12mg配置总体积为250为氢的配比关系进行配置2-AB溶液。配方2按照2-AB和氰基硼氢化钠的加入配比(质量比)5mg:6mg配置总体积为1000为的配比关系进行配置2-AB溶液。实际配置中根据样本个数(每个样本需加入25μL标记试剂)优先计算好所需的2-AB和氰基硼氢化钠质量，然后按比例进行配置。配置标记溶液，先将醋酸加入DMSO配制成30％醋酸溶液，然后将醋酸/DMSO混合液加入2-AB中，混匀至完全溶解，再将上述溶液加入PB，混匀至完全溶解。
每个样本需加入25μL2-AB标记溶液，相当于配方1中每个样本2-AB和氰基硼氢化钠的加入配比(质量比)0.5mg:1.2mg，而配方2中每个样本2-AB和氰基硼氢化钠的加入配比(质量比)为1.25mg:1.5mg。
其中，含有2-AB的标记溶液的组分如表1所示。
| 配方1 | 2-AB(mg) | NaBH3CN(mg) | 乙酸(μL) | DMSO(μL) | 总体积(μL) |
| 加入比例 | 5 | 12 | 75 | 175 | 250 |
| 每个样本 | 0.5 | 1.2 | 25 | ||
| 配方2 | 2-AB(mg) | NaBH3CN(mg) | 乙酸(μL) | DMSO(μL) | 总体积(μL) |
| 加入比例 | 5 | 6 | 30 | 70 | 100 |
| 每个样本 | 1.25 | 1.5 | 25 |
两管样本被标记后纯化实验参见实施例1。
样品UPLC检测：经标记纯化的标准mAb的糖链样品用20μL 50％ACN水溶液进行重溶，上样10μL。
UPLC仪器型号：ACQUITY UPLC H-Class(Waters公司)
流动相：A相：50mM甲酰铵(HCOONH4)；B相：100％乙腈(ACN)；
流速：0.4mL/min，梯度：25％～38％～90％～90％～25％～25％A；0min～20.0min～22min～25min～26min～30min。
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide Column(1.7μm，2.1mm x 150mm)；柱温：60℃。
荧光检测器检测条件：激发波长:330nm；发射波长:420nm
检测结果如图2，蓝色(图2上图)所示为按配方1配置2-AB试剂的检测结果，红色(图2下图)所示为按配方2配置2-AB试剂的检测结果。比较这两组结果发现：
1、图中糖链色谱峰出峰个数与出峰时间一致，表明两种方法配置的2-AB溶液标记糖链时不存在漏标现象；
2、这两组结果各糖链色谱峰的相对峰强一致，而绝对强度配方2仅仅略高不到10个单位(即上图下图强度低不足10左右)，并没有使色谱峰强度提高很多，表明按配方1标记糖链糖链已基本标记完全。
3、由于配方2加强了荧光剂2-AB的使用量，其标记的效果通常预料到其应当显著高于配方1。但实验结果表明在大幅度减少荧光剂的比例的情况下，配方1也能实现完全标记，并且色谱峰强度与配方2没有明显区别。因此综合考虑标记效果和实验成本问题，优先考虑配方1配置2-AB标记试剂，即按每个样本2-AB和氰基硼氢化钠的加入配比(质量比)0.5mg:1.2mg进行2-AB标记实验。
实施例三、LC-MS/MS鉴定血浆(血清)IgG糖链
将实施例1所制备的人血浆IgG 2-AB标记糖链进行LC-MS/MS检测，其中可按实施例1进行人血浆(血清)样品糖基前处理后。
采用的实验条件如下：
LC系统：ACQUITY UPLC H-Class(Waters公司)。
流动相：A相：50mM HCOONH4；B相：100％ACN。
流速：0.4mL/min，梯度：25％～46％～100％～100％～25％～25％～25％A；0min～35.0min～36.5min～39.5min～43.1min～47.6min～55min。
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide Column(1.7μm，2.1mm x 150mm)；柱温：60℃。荧光检测器检测条件：激发波长:330nm；发射波长:420nm。
质谱系统：高分辨质谱SYNAPT G2-S(Waters公司)。
源温：120℃，毛细管电压：3.0kv，锥孔电压：80V，扫描范围m/z：300～2000。
数据处理软件：UNIFI 1.8，标记：2-AB，数据库：human IgG。
经标记纯化的糖链样品用20μL 50％ACN水溶液进行重溶，上样10μL。经LC分离得到的色谱峰在高分辨质谱中进行MS及MS/MS分析，所得的液相及质谱数据用waters仪器自带的UNIFI软件数据处理系统进行搜库检索，设置糖链的标记方式为2-AB标记，数据库来源类型选hunan IgG，m/z值匹配误差设置为10ppm，GU值匹配误差设置为0.2。经UNIFI软件处理得出人血浆IgG糖链的分析鉴定结果如图3所示。由图3可知几乎每个糖链色谱峰都得到了糖型归属。具体的糖链归属结果如表2所示。由表2可以看出，共鉴定出51种糖型，其中保留时间为12.14min的F(6)A2这种糖型百分含量最高，百分占比为22.63；保留时间为14.81min的F(6)A2[6]G(4)1和17.79min的F(6)A2G这两种含半乳糖的糖型的百分含量分别为第二高和第三高，百分占比分别为20.05和15.35。而唾液酸化(S表示唾液酸)的糖型占比超过25％，其他糖型的百分含量不再赘述(详见表2)。
表2LC-MS/MS鉴定人血浆IgG糖型结果
IgG抗体糖链的半乳糖糖基化和唾液酸化通常是学者关注的重点，本实例结果表明，经具体实施例1制备的IgG糖链半乳糖糖基化和唾液酸化损失较少，样本前处理方法可靠。
经上述检测后，每个样品均会得出血浆(或血清)IgG经2-AB标记的糖链的质谱定性和色谱定量结果。根据不同的样本分组，对上述结果进行统计学分析，进而得出血浆(或血清)IgG某个(或某些)糖型跟疾病或或某种状态之间统计学差异，协助阐明血浆(或血清)IgG某个(或某些)糖型差异跟疾病或或某种状态之间的关联。
Claims (10)
1.一种从血浆或血清的IgG上批处理切除糖链和纯化的方法，步骤包括：
(1)IgG提取：通过96孔Protein G提取板将血浆或血清IgG提取至2mL96孔收集板中，测定蛋白浓度后，取出250‐350μL IgG溶液于1.1mL 96孔深孔板中整板挥干；
(2)IgG切糖：在深孔板中加入变性剂变性蛋白后调节溶液pH至8.0，加入糖苷酶或切糖酶进行切除糖链；
(3)糖链标记：在挥干的深孔板中加入2‐AB标记溶液，65℃反应3小时，进行2‐AB标记；
(4)标记后纯化：深孔板加入乙腈溶液，上清液转移至96孔糖链纯化板，除去多余的标记试剂，在深孔板中收集洗脱出的被标记糖链，整板挥干；
其中，步骤(2)中变性剂为SDS溶液，并在60℃变性反应10min，或变性剂为Igepal溶液，并在室温变性反应10分钟；以及加入的糖苷酶或切糖酶的质量与蛋白的质量比为1:50～1:30；
步骤(3)中，每孔加入的标记溶液为0.5mg的2‐AB和1.2mg的氰基硼氢化钠，并且所述2‐AB和氰基硼氢化钠预先配制在含30％乙酸的DMSO溶液中；
步骤(4)中，去除多余标记试剂所用清洗液为96％的乙腈溶液，洗脱标记的糖链为超纯水。
2.权利要求1的方法，其中步骤(1)中还包括IgG提取板前处理、IgG结合和清洗、IgG洗脱、IgG提取板再生和保护。
3.权利要求2的方法，其中所述IgG提取板前处理方法为：
①用2毫升超纯水清洗板子‐真空泵抽滤，去除废液；
②用2毫升1×PBS清洗板子‐真空泵抽滤，去除废液；
③用1毫升0.1M甲酸溶液清洗板子‐真空泵抽滤，去除废液；
④用2毫升10×PBS进行板子的中和‐真空泵抽滤，去除废液；
⑤用4毫升1×PBS平衡板子‐真空泵抽滤，去除废液。
4.权利要求3的方法，其中所述IgG结合和清洗方法为：用2毫升1×PBS清洗板子‐真空泵抽滤，去除废液，再重复2次。
5.权利要求4的方法，其中所述IgG洗脱的方法为：
①用1毫升0.1M甲酸溶液洗脱IgG‐真空泵抽滤，收集洗脱液；
②向收集板中加入170μL中和缓冲液，并用枪头混匀；
③用锡箔纸将收集板盖好，放在震荡器轻微摇晃，避免交叉污染，直至检测样品浓度。
6.权利要求5的方法，其中所述IgG提取板再生和保护的方法为：
①用2毫升0.1M甲酸溶液清洗板子‐真空泵抽滤，去除废液；
②用2毫升10×PBS清洗板子‐真空泵抽滤，去除废液；
③用4毫升1×PBS清洗板子‐真空泵抽滤，去除废液；
④加入1毫升存储缓冲液‐真空泵抽滤，去除废液，其中存储缓冲液为20％乙醇溶于20mMTris+0.1M NaCl；
⑤加入1毫升存储缓冲液，4℃保存。
7.权利要求6的方法，其中步骤(1)中血浆或血清样本量为50μL，使用前用pH为7.4的1×PBS稀释7倍，Protein G提取板为96孔Protein G提取板，IgG收集为96孔收集板；蛋白浓度测定所用仪器为nano‐drop蛋白浓度测定仪，测定波长为280nm，IgG的摩尔吸光系数值为2.534×105；以及，
其中步骤(2)中，SDS溶液浓度为1.33％，Igepal溶液浓度为10％，pH调节剂为0.1MNaOH和5×PBS的混合液，加入的切糖酶为PNGase F酶，所述Igepal为(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇‐辛基苯基‐聚乙烯二醇。
8.权利要求6的方法，其中步骤(4)中，纯化标记后的糖链的纯化板为0.22μm的亲水性96孔板，纯化过程包括清洗、洗脱过程，其中，清洗过程包括：
①每个样品中加入700μL 100％乙腈，用枪头混匀并全部转移到纯化板中，孵育两分钟，真空泵抽滤，去除废液；
②在纯化板的每个孔中加入200μL96％乙腈‐真空泵抽滤，去除废液，重复四次；
③将纯化板放在1毫升或2毫升收集板上，每个孔中加入200μL96％乙腈；
④1000转/分钟，离心5分钟。
9.权利要求8的方法，其中纯化过程中的洗脱过程包括：
①每个孔中加入100μL超纯水，震荡15分钟；
②用真空抽滤法，将第一次洗脱液收集到PCR板中，重复一次；
③每个孔中加入100μL超纯水，震荡15分钟；
④纯化板离心5分钟，1000转/分钟，将第三次洗脱液收集到PCR板中；
⑤合并三次洗脱液，挥干后于‐20℃保存。
10.权利要求1‐9中任一项的方法，其中步骤(4)中还包括纯化板预处理过程，包括：
①在纯化板的每个孔中加入200μL70％乙醇‐真空泵抽滤，去除废液；
②在纯化板的每个孔中加入200μL超纯水‐真空泵抽滤，去除废液；
③在纯化板的每个孔中加入200μL96％乙腈‐真空泵抽滤，去除废液。
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