CN104075931B - 一种蛋白质样品原位快速预处理方法 - Google Patents

一种蛋白质样品原位快速预处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种蛋白质样品原位快速预处理方法，于离心超滤装置内原位进行蛋白质样品的整个预处理过程，集成了蛋白质样品变性、还原、溶剂置换、烷基化、酶解及杂质去除过程，并采用微波辅助加速蛋白质样品的酶解。该方法可显著提高蛋白质样品预处理的通量，同时，整个样品预处理过程原位进行，回收率高。此外，离心超滤装置的使用可方便、快捷地实现样品的纯化及溶剂的置换，酶解产物无需额外的纯化过程，可直接与后续的高效液相色谱分离‑质谱鉴定联用。

Description

一种蛋白质样品原位快速预处理方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白质样品原位快速预处理方法。
背景技术
蛋白质的鉴定与社会人群的健康息息相关。对于大部分遗传疾病，如肿瘤和肥胖症，患者与健康人群的某些特定蛋白存在差异性表达。为实现疾病的“早发现，早治疗”，对特定蛋白质的快速及高灵敏度的鉴定具有重要意义。作为蛋白质分析的首要步骤，蛋白质样品预处理可实现杂质的去除及样品的富集，因此建立高效快捷的蛋白质样品预处理方法，在实现高灵敏度、高准确度的差异性蛋白质的研究过程中发挥重要作用，进而推动疾病的发现与治疗上的深入研究。
目前，基于凝胶的样品预处理和基于自由溶液的样品预处理是蛋白质组常用的两大技术。然而，胶上酶解耗时长，后续处理复杂，且样品损失严重。此外，酶解效率与肽段的提取效率有待提高；自由溶液酶解具有酶解时间长（通常需要10h以上）的缺点，无法满足快速处理的要求。近些年来发展的酶反应器具有酶解时间短，酶解效率高，可与多维分离平台联用，实现自动化等优点。然而，酶反应器基质材料的非特异性吸附问题会造成酶解重现性差，不利于样品的分析。（Liang,Y;Tao,D.Y.;Ma,J.F.;Sun,L.L.;Liang,Z.;Zhang,L.H.;Zhang,Y.K.J.Chromatogr.A2011,1218(20),2898-2905）
近年来大量有关超滤膜的实验结果表明，超滤膜的使用具有很好的去噪效果、样品损失量较小、易实现溶剂置换的优势。同时，微波辅助由于其高效性早已被用于样品预处理过程中。本发明结合了超滤膜的去噪性能和微波水浴辅助酶解的高效性，并提出了样品在膜上原位进行样品预处理所有步骤，进一步减少样品的损失量，从而发展出一种新型样品预处理方法，具有高效、快速、回收率高的优点。
发明内容
为了克服蛋白质样品预处理过程耗时长，操作繁琐，损失量大等不足，本发明提供一种蛋白质样品原位快速预处理方法，于离心超滤装置中集成了蛋白质的变性、还原、溶剂置换、烷基化、酶解及杂质去除整个样品预处理过程。同时，采用微波水浴辅助酶解，可有效降低酶解时间，提高酶解效率。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
（1）蛋白质样品的原位富集：采用pH为1-6.5的酸性溶液或pH为7.5-14的溶有体积浓度为1%-30%的表面活性剂（十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、TritonX-100、chaps、RapigestSF或NP-40d）或去垢剂（尿素、硫脲或盐酸胍）的碱性溶液溶解蛋白质样品，将蛋白质样品溶液加入至超滤管中实现蛋白质的原位富集；
（2）溶剂的置换：蛋白质样品溶液经步骤（1）处理后，若蛋白质样品后续还原过程所需溶液体系环境与蛋白质样品溶解液体系环境所需酸碱环境不同，则需进行pH置换，即若蛋白质溶解液体系为pH为1-6.5的酸性溶液（甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液），而后续还原过程所需溶液体系为碱性环境，则在蛋白质原位富集后将离心超滤装置离心，待超滤管内溶剂全部离心至收集管后，向超滤管中加入体积为1-20倍蛋白质溶解液体积的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液（碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液）；若蛋白质溶解液体系为pH为7.5-14的碱性缓冲溶液，而后续还原过程所需溶液体系为酸性环境，则在蛋白质原位富集后将离心超滤装置离心，待超滤管内溶剂全部离心至收集管后，向超滤管中加入体积为1-20倍蛋白质溶解液体积的pH为1-6.5的酸性溶液；若后续蛋白质样品还原过程所需溶液体系环境与蛋白质样品溶解液体系环境所需酸碱环境相同，则不需要进行pH置换；
（3）蛋白质样品的变性及还原：向步骤（2）中处理的样品溶液中加入还原剂（二硫苏糖醇（DTT）、磷酸三氯乙酯（TCEP）或β-巯基乙醇），在高温水浴下，同时进行蛋白质样品的变性及还原过程；
（4）杂质的去除：将步骤（3）中处理的样品溶液经离心后，向超滤管中加入体积为蛋白质样品还原体系溶液体积的1-20倍的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液（碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液）或水溶液并离心，去除蛋白质溶液中的小分子杂质；
（5）蛋白质样品的烷基化及酶解：向步骤（4）中离心后的超滤管中加入以pH为7.5-9的碱性缓冲溶液为溶剂配制的烷基化溶液（碘代乙酸或碘乙酰胺）及胰蛋白酶溶液后，将样品转入至盛有水的微波盒，并将微波盒转入至微波炉中，采用微波水浴辅助方法同时进行烷基化及酶解过程；
（6）酶解肽段的收集：微波水浴结束后，将离心超滤装置进行离心，保留收集管中所得溶液，向超滤管中加入蒸馏水后，再次进行离心，保留收集管中所得溶液，将两次收集管中所得溶液混合，即为所需的蛋白质酶解产物。
本发明具有以下优点：
1、样品损失小。整个蛋白质样品预处理过程包括蛋白质样品的变性、还原、烷基化、酶解及除盐过程皆在离心超滤装置中原位进行，有效减少样品转移造成的损失。
2、可实现溶剂的置换及杂质的去除。离心超滤装置的引入，可以通过离心去除溶剂，从而实现酸碱溶剂的置换；同时，由于离心超滤装置中的超滤膜具有截留大分子的功能，可实现小分子杂质的去除。
3、通量高。蛋白质样品的变性及还原过程同时进行，烷基化及酶解过程微波辅助下同时进行，整个样品预处理过程可在1h内完成。
4、处理全蛋白质组。使用蛋白质原位预处理方法可处理可溶性蛋白质及膜蛋白质。
5、酶解效率高。酶解过程在微波水浴辅助下进行，酶解时间缩短至1min，酶量提高，从而提高酶解效率。
6、处理微量样品。蛋白质样品酶解后加水进行冲洗，可有效增加酶解产物含量，同时降低样品中盐的浓度，减少了除盐步骤，进一步减少样品损失，利于微量样品的处理。
附图说明
图1为离心超滤装置示意图；
图2为蛋白质原位样品预处理流程图。
图中1：超滤管2：收集管3：蛋白质的变性及还原4：杂质的去除5：蛋白质的烷基化及酶解6：样品的冲洗7：酶解产物的收集。
具体实施方式
本发明采用的离心超滤装置为商品化（购自Millipore,Billerica,MA）的由超滤管及收集管组成的纯化装置；超滤管为底部置有热密封超滤膜（超滤膜为再生纤维素膜）的圆柱体结构；
使用时，超滤管置于收集管内。
1.蛋白溶液的配制
将大肠杆菌蛋白质样品（购自Sigma,St.Louis,MO）溶解于10mM碳酸氢铵缓冲溶液(ABC)中（pH8.7），BCA法测定其浓度后，以10mMABC为溶剂配制蛋白质样品浓度为1mg/mL。
2．蛋白溶液的变性及还原
取步骤1中制备的大肠杆菌蛋白溶液30μL(即30μg样品)置于超滤管中，并加入10mMABC补齐至60μL溶液，加入1M二硫苏糖醇（DTT）（溶解于10mMABC）6μL（终浓度为100mM），在95℃水浴下反应5min。
3．杂质的去除
步骤2中处理的样品在14000×g转速下离心10min，弃去收集管中废液。向超滤管中加入200μL10mMABC，在14000×g转速下离心15min，弃去收集管中废液。
4.蛋白溶液的烷基化及酶解
向步骤3中离心后的超滤管中加入50μL10mM碘代乙酰胺（IAA）（溶解于10mMABC）溶解的30μg胰蛋白酶溶液，将离心超滤装置转入盛有水的微波盒中并将微波盒放入微波炉中，选择开2秒停1秒的加热时间间隔模式，微波水浴下酶解30s。
5.肽段的收集
步骤4中处理的样品在14000×g转速下离心10min，保留收集管中所得溶液。向超滤管中加入100μL蒸馏水进行冲洗，14000×g转速下离心10min，保留收集管中所得溶液，并将两次收集管中所得溶液混合。
6．LTQ-OrbitrapVelos检测
步骤5中处理得到的大肠杆菌酶解产物14000×g转速下离心10min，取其上清溶液，使用LTQ-OrbitrapVelos进行检测。质谱仪分析在正离子模式下进行。喷雾电压为2.0kV，加热毛细管温度为200℃。采用Xcalibur软件记录总离子流图与MS谱图；质荷比范围为300到1800。MS/MS谱图采用数据依赖模式进行采集。从一张MS全扫描中，选择15个最强的母离子进行MS/MS的分析。MS/MS扫描的碰撞能量为35%。
7．数据分析
对采集的谱图进行数据库检索和数据分析，采用Mascot进行数据检索。数据库为ncbi.Ecoli.REVERSE。半胱氨酸残基设为固定化修饰+57.0215Da，甲硫氨酸残基设为可变修饰+15.9949Da。肽段检索采用胰蛋白酶完全酶切，最多允许两个漏切位点。肽段和MS/MS质量允许偏差分别为10ppm和0.5Da。调节Xcorr值以控制肽段鉴定的假阳性率FDR<1%(FDR定义为采用正库与反库鉴定到的肽段数量)。共鉴定到3371个蛋白group，对应22854条非冗余肽段。
该方法可显著提高蛋白质样品预处理的通量，同时，整个样品预处理过程原位进行，回收率高。此外，离心超滤装置的使用可方便、快捷地实现样品的纯化及溶剂的置换，酶解产物无需额外的纯化过程，可直接与后续的高效液相色谱分离-质谱鉴定联用。

Claims (10)

1.一种蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：整个蛋白质样品预处理过程，包括蛋白质样品的变性、还原、溶剂置换、烷基化、酶解及杂质去除过程，皆在离心超滤装置中原位进行，具体包括：
（1）采用pH为1-6.5的酸性溶液或pH为7.5-14的溶有体积浓度为1%-30%的表面活性剂或去垢剂的碱性溶液溶解蛋白质样品，将样品溶液加入至离心超滤装置的超滤管中实现蛋白质的原位富集；
（2）蛋白质样品溶液经步骤（1）处理后，若蛋白质样品后续还原过程所需溶液体系环境与蛋白质样品溶解液体系环境所需酸碱环境不同，则需进行pH置换，即将离心超滤装置离心后向超滤管中加入pH为蛋白质样品还原过程所需pH范围的溶液；若后续蛋白质样品还原过程所需溶液体系环境与蛋白质样品溶解液体系环境所需酸碱环境相同，则不需要进行pH置换。
（3）向步骤（2）中处理的样品溶液中加入还原剂，同时进行蛋白质样品的变性及还原过程；
（4）将步骤（3）中处理的样品溶液经离心后，向超滤管中加入pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或水溶液并离心，实现杂质的去除；
（5）向步骤（4）中离心后的超滤管中加入以pH为7.5-9的碱性缓冲溶液为溶剂配制的烷基化溶液及胰蛋白酶溶液后，将样品转入至盛有水的微波盒，并将微波盒转入至微波炉中，采用微波水浴辅助方法同时进行烷基化及酶解过程；
（6）酶解完成后，将离心超滤装置进行离心，保留离心超滤装置的收集管内所得溶液；向超滤管中加入蒸馏水，将离心超滤装置进行离心，保留收集管内所得溶液，将两次收集管中所得溶液混合，即为所需的蛋白质酶解产物。
2.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：所述的蛋白质样品溶剂，pH为1-6.5的酸性溶液，可为甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液；pH为7.5-14的碱性缓冲溶液，可为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液；
所述的表面活性剂为十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、TritonX-100、chaps、RapigestSF或NP-40d；去垢剂为尿素、硫脲或盐酸胍。
3.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：所述的离心超滤装置为商品化的由超滤管及收集管组成的纯化装置；超滤管为底部置有热密封超滤膜的圆柱体结构。
4.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：步骤（1）中所述的蛋白质样品溶液在超滤管中体积范围为50μL-1mL，对应蛋白质样品的质量范围为10ng-1mg。
5.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：步骤（2）中所述的溶剂pH置换方法具体如下，若蛋白质溶解液体系为权利要求2中所述的pH为1-6.5的酸性溶液，而后续还原过程所需溶液体系为碱性环境，则在蛋白质原位富集后将离心超滤装置离心，待超滤管内溶剂全部离心至收集管后，向超滤管中加入体积为1-20倍蛋白质溶解液体积的权利要求2中所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液；若蛋白质溶解液体系为权利要求2中所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液，而后续还原过程所需溶液体系为酸性环境，则在蛋白质原位富集后将离心超滤装置离心，待超滤管内溶剂全部离心至收集管后，向超滤管中加入体积为1-20倍蛋白质溶解液体积的权利要求2中所述的pH为1-6.5的酸性溶液。
6.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：步骤（3）中所述的还原剂为二硫苏糖醇（DTT）、磷酸三氯乙酯（TCEP）或β-巯基乙醇；终浓度为1-200mM；
所述的蛋白质变性及还原条件为80-100℃水浴下进行，时间为1-20min。
7.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：步骤（5）中所述的向超滤管中加入的烷基化溶液及胰蛋白酶溶液的溶剂为权利要求2中所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液，但其pH范围需调节至7.5-9；
所述的烷基化试剂为碘代乙酸或碘乙酰胺，终浓度为1-200mM；
所述的样品酶解过程中使用胰蛋白酶与蛋白质的质量比例为1:10–10:1。
8.按照权利要求1或7所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：
所述的蛋白质样品包括可溶性蛋白质和/或不可溶膜蛋白质；
步骤（5）中所述的样品烷基化及酶解过程在微波水浴辅助下同时进行，具体条件及过程为将离心超滤装置放入至盛水的微波盒中，并将微波盒放入在微波炉内，购买的微波炉功率为800W，选择加热时间间隔为开2秒停1秒或开1秒停1秒，样品的微波水浴辅助酶解时间控制在10s–600s完成。
9.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：步骤（4）中所述的向超滤管中加入的碱性缓冲溶液为权利要求2中所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液；
加入的碱性缓冲溶液或水溶液的体积为蛋白质样品还原体系溶液体积的1-20倍。
10.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：
所述的样品预处理方法中，蛋白质样品变性及还原过程同时进行，烷基化及酶解过程同时进行；
该方法可用于提取自细胞、组织及血浆中的可溶性蛋白质及膜蛋白质样品的分析中。
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