CN1982431A - 一种微型快速蛋白水解酶反应器及其制备 - Google Patents
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Abstract
本发明设计和制作了一种微型快速蛋白水解酶反应器。在毛细管中使用多种聚合物单体在高级醇混合溶液中进行原位聚合，得到连续、均匀的多孔结构整体聚合物基质，通过对基质表面的基团进行活化和修饰，可以将胰蛋白酶分子牢固地结合在整体基质上，制得微型固定化胰蛋白酶反应器。制成的反应器具有较高的活性，可以迅速水解蛋白质分子。与传统水溶液中蛋白质水解方法相比较，使用该反应器蛋白质水解反应速度显著提高，副反应少，对蛋白质的质谱检测、鉴定没有干扰。同时，该反应器的稳定性好，可长时间反复使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种微型快速蛋白水解酶反应器及其制备，通过将胰蛋白酶固定到多孔整体基质上，进行蛋白质的快速酶解。该反应器具有连续、均匀的多孔结构可以显著提高底物在基质中的传质和对流，制得的酶反应器具有较高的反应活性，大幅度提高酶与底物的反应速度。
背景技术
随着人类基因组的完成，蛋白组的研究逐渐成为了人们研究的热点。为了满足对大量蛋白质进行序列分析和快速鉴定的要求，需要发展快速、高效的蛋白质研究方法。对蛋白质的鉴定，必须使用蛋白水解酶对蛋白质进行水解。目前，使用最多的方法是在水溶液中直接添加胰蛋白酶直接进行蛋白质水解；但是该方法由于无法添加大量的酶，耗时较长，同时，由于体系中胰蛋白酶的存在，会对后续的蛋白质肽段的质谱检测产生干扰，影响蛋白质鉴定的准确性。因此，现在发展出了固定化的蛋白水解酶反应器。
目前，蛋白水解酶反应器主要有颗粒填充反应器和整体基质反应器两大类。制备颗粒填充反应器时，一般需要先对颗粒载体表面进行活化和修饰，再填入反应器中。但是，在填充柱中，液流主要通过填料之间的空隙，从流动相向固定化酶的传质和从固定化酶向流动相的传质主要由扩散速率决定，依赖于填料、孔的大小、流速和底物的扩散系数。对于蛋白质这种大分子，其扩散速率较低，而填充柱中填料之间存在大量的空隙，即使使用均匀大小的球体，也仍然存在较大的空隙，在实际的应用中，空隙将会更大，所以此类反应器的活性不高，无法在高流速情况下工作。
多孔整体反应器是近年来发展起来的一种新型的反应器。首先，整体基质可以通过改变优化合成的条件，同时得到可用于对流的大孔以及用于扩散的小孔，其孔的直径分布在700-2000纳米范围内。所以，在整体基质反应器中，可以允许溶液在其孔内进行对流，传质得到显著提高，即使在较高的流速下，也可以得到较理想的传质。特别是在底物是蛋白质这样扩散系数小的大分子时，更加适用。在大孔的整体基质固定化蛋白酶反应器中，较快的传质将使得底物可以较容易与酶的活性部位接近，可大大提高酶解反应的速度。另外，使用聚合物整体基质作为蛋白酶的载体，具有渗透性好、溶质在填料孔道内的扩散及传质速率高以及高柱容量等优点，尤其适用于生物大分子物质的快速分离分析。
目前，已经报道了一些用于蛋白质水解的整体基质蛋白酶反应器，在这些反应器当中都使用一些特殊的反应单体，如丙烯酸吖内酯、丙烯酰琥珀酰亚胺等。以上所述的整体基质虽然都可以制得高效的酶反应器，但是这些活性单体的价格都较为昂贵，限制了它们的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低的微型快速蛋白水解酶反应器及其制备，使用价格低廉的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、丙烯酰胺和乙叉二甲基丙烯酸作为反应单体，制得了多孔整体基质，通过对基质表面进行修饰和活化，可以方便地将胰蛋白酶固定在基质表面制得酶反应器。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种微型快速蛋白水解酶反应器，在毛细管中使用甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)作为功能单体、乙叉二甲基丙烯酸作为交联剂、丙烯酰胺作为调节聚合物骨架亲水性的共单体、在高级醇混合溶液中进行原位聚合，得到连续、均匀的多孔结构刚性整体聚合物基质，通过分别使用氨水和戊二醛对基质表面的基团进行活化和修饰，可以将胰蛋白酶分子牢固地结合(固定于)在整体基质上，制得微型固定化高活性的胰蛋白酶反应器。
所述蛋白水解酶反应器制备的具体步骤如下：
(1)甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)作为功能单体，乙叉二甲基丙烯酸作为交联剂，丙烯酰胺作为调节聚合物骨架亲水性的共单体，在高级醇的混合溶液中进行混合；
其中三种单体，甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙叉二甲基丙烯酸及丙烯酰胺间的质量比为：3∶5∶2；
(2)在聚合溶液中加入引发剂后，装入毛细管内，在一定条件下进行原位聚合反应，得到整体基质；
(3)将毛细管内原位聚合得到的基质，依次用氨水和戊二醛溶液进行活化处理；
(4)固载胰蛋白酶分子。
所述三种单体加入混合溶剂中后应加热至50-70℃，震荡混匀；使用高级醇的混合溶液作为致孔剂，高级醇为正丙醇、1，4-丁二醇、环己醇、正癸醇或十二醇等各种醇，其用量为占聚合物总质量的60-80％；其中，良溶剂：正丙醇或环己醇；弱溶剂：1，4-丁二醇、正癸醇或十二醇，在混合溶液中二元高级醇良溶剂与弱溶剂的质量比范围为10-90％；引发剂可为AIBN，其加入量占单体总质量的0.5-2％；在室温下加入引发剂后，除气，用注射器取上述溶液注入毛细管中，两端用硅橡胶封闭，置于50-70℃水浴中反应不少于6小时；
用氨水和戊二醛溶液进行活化处理过程为，整体基质连续通入10-40％的氨水溶液，在35-45℃下反应5-8小时，用水清洗干净后，通入5-30％的戊二醛溶液在室温下反应5-8小时；
固载胰蛋白酶分子过程为，整体基质通入含苯甲脒的2-4mg/mL的胰蛋白酶溶液，室温下反应不少于12h，溶液中苯甲脒的质量百分比为胰蛋白酶质量百分比的1.5-2.5倍。
毛细管在应用前其内壁预先经带双键功能团的硅烷试剂中改性。
本发明反应器可以采用柱状或芯片形式；在使用原位聚合反应器内基质是可以使用热引发或光引发聚合。
本发明具有如下优点：
1.由于在基质中引入丙烯酰胺可以对其骨架的亲水性进行调节更加适合于蛋白酶的固载，同时使得该反应器具有良好的通透性和生物亲和性，在较高流速下也可以快速水解蛋白质，具有实现高通量蛋白质分析、鉴定的潜力。通过调节单体的比例和含量，可以对酶反应器的基质结构进行调整以适应不同的条件。
2.使用多孔结构整体基质酶反应器，可以增进底物在反应器中的传质过程，提高反应速度，快速水解蛋白质。本发明反应器具有较高的活性，可以迅速水解蛋白质分子，能够在10min以内快速水解浓度在1mg/mL的蛋白质分子。
3.与传统水溶液中蛋白质水解方法相比较，使用该反应器蛋白质水解反应速度显著提高，副反应少，对蛋白质的质谱检测、鉴定没有干扰。同时，本发明反应器稳定性高，可以长时间重复使用。
4.成本低廉，应用潜力大。本发明反应器内用于固载蛋白酶的基质是通过原位聚合方法在毛细管内直接聚合而成；通过分别使用氨水和戊二醛对基质表面进行活化，可以将胰蛋白酶固定于基质表面制得高活性的蛋白水解酶反应器；基质骨架内添加丙烯酰胺单体，可以对反应器的亲水性进行调节。反应器内用于固载蛋白酶的基质为一种连续、均匀的多孔结构物质，其孔径范围在10-9至10-5米；具有良好的通透性，适用的线流速范围在0-20cm/min；其压力适用范围为0-20MPa。是一种可以和高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、毛细管电色谱(CEC)、加压电色谱(pCEC)以及芯片(chip)等液相分离方法与质谱联用系统进行在线耦合、联用的快速酶解蛋白质装置。
附图说明
图1为微型快速蛋白水解酶反应器基质的合成示意图。
图2为微型快速蛋白水解酶反应器基质的扫描电镜图。
图3为微型快速蛋白水解酶反应器的压力与流量关系图。
图4为本发明一个实施例中微型快速蛋白水解酶反应器的柱形式；其中a为反应器，b为空管。
图5为本发明一个实施例中微型快速蛋白水解酶反应器的的芯片形式；其中a为反应器，b、c为分离通道。
图6为本发明一个实施例中微型快速蛋白水解酶反应器，水解小分子底物N-苯酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)以及一个月后的重复实验的电泳分离谱图。
图7为本发明一个实施例中微型快速蛋白水解酶反应器，水解细胞色素c及其产物的电泳分离对比谱图。
图8为本发明一个实施例中微型快速蛋白水解酶反应器和高效液相色谱与质谱联用系统耦合使用，水解细胞色素c产物的色谱分离谱图。
图9为本发明一个实施例中使用不同浓度胰蛋白酶制得的反应器水解小分子底物N-苯酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)，在不同反应流速下的活性情况。
具体实施方式
实施例1
1)整体基质的制备：按图1所示，选择以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、丙烯酰胺和乙叉二甲基丙烯酸(EDMA)作为单体在毛细管内合成整体基质。毛细管内壁预先经带双键功能团的硅烷试剂(甲级丙烯酸(3-三甲氧基硅氧基)丙酯，γ-MAPS)改性，单体在其中聚合并通过化学键固定在毛细管壁上。具体是将这样的多孔材料原位聚合在毛细管中制作成整体基质酶反应器并应用于多种底物的水解实验。称取GMA90mg，丙烯酰胺60mg和EDMA 150mg、溶于700mg环己醇/十二醇(质量比85/15)的混合溶剂中，加热至50℃以上，震荡混匀，冷却到室温后，加入含量占单体总质量比1％的AIBN作为引发剂，通氮气10min后，超声除气5min。在室温下，用注射器取上述溶液注入毛细管中，两端用硅橡胶封闭，置于55℃水浴中反应7小时。
2)酶反应器的表征：其扫描电镜如图2，其压力与流量关系如图3。其外观上采取图4的整体柱、图5的芯片形式；
3)整体基质的活化：将制得的整体基质用甲醇冲洗30min，然后连续通入10％的氨水溶液，在40℃下反应5小时，用水清洗干净后，通入25％的戊二醛溶液在室温下反应5小时。最后通入含50mM苯甲脒的2mg/mL的胰蛋白酶(trypsin)溶液，反应12h，反应结束后。酶反应器放入含10mMCaCl2和0.02％NaN3的50mMTris-HCl缓冲溶液中，在4℃下保存。
4)使用胰蛋白酶反应器水解小分子底物N-苯酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)，如图6。
实施例2
1)整体基质的制备：按图1所示，选择以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、丙烯酰胺和乙叉二甲基丙烯酸(EDMA)作为单体在毛细管内合成整体基质。毛细管内壁预先经带双键功能团的硅烷试剂(甲级丙烯酸(3-三甲氧基硅氧基)丙酯，γ-MAPS)改性，单体在其中聚合并通过化学键固定在毛细管壁上。具体是将这样的多孔材料原位聚合在毛细管中制作成整体基质酶反应器并应用于多种底物的水解实验。称取GMA90mg，丙烯酰胺60mg和EDMA 150mg、溶于700mg环己醇/十二醇(质量比50/50)的混合溶剂中，加热至80℃，震荡混匀，冷却到室温后，加入含量占单体总质量比2％的AIBN作为引发剂，通氮气10min后，超声除气5min。在室温下，用注射器取上述溶液注入毛细管中，两端用硅橡胶封闭，置于70℃水浴中反应6小时。
2)酶反应器的表征：其扫描电镜如图2，其压力与流量关系如图3。其外观上采取图4的整体柱、图5的芯片形式
3)整体基质的活化：将制得的整体基质用甲醇冲洗30min，然后连续通入20％的氨水溶液，在40℃下反应5小时，用水清洗干净后，通入10％的戊二醛溶液在室温下反应5小时。最后通入含50mM苯甲脒的4mg/mL的胰蛋白酶(trypsin)溶液，反应12h，反应结束后。酶反应器放入含10mMCaCl2和0.02％NaN3的50mMTris-HCl缓冲溶液中，在4℃下保存。
4)使用胰蛋白酶反应器水解大分子底物细胞色素c，如图7、8和表1。
实施例3
1)整体基质的制备：按图1所示，选择以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、丙烯酰胺和乙叉二甲基丙烯酸(EDMA)作为单体在毛细管内合成整体基质。毛细管内壁预先经带双键功能团的硅烷试剂(甲级丙烯酸(3-三甲氧基硅氧基)丙酯，γ-MAPS)改性，单体在其中聚合并通过化学键固定在毛细管壁上。具体是将这样的多孔材料原位聚合在毛细管中制作成整体基质酶反应器并应用于多种底物的水解实验。称取GMA90mg，丙烯酰胺60mg和EDMA150mg、溶于700mg正丙醇/1，4-丁二醇(质量比60/40)的混合溶剂中，加热至50℃以上，震荡混匀，冷却到室温后，加入含量占单体总质量比1％的AIBN作为引发剂，通氮气10min后，超声除气5min。在室温下，用注射器取上述溶液注入毛细管中，两端用硅橡胶封闭，置于55℃水浴中反应7小时。
2)酶反应器的表征：其扫描电镜如图2，其压力与流量关系如图3。其外观上采取图4的整体柱、图5的芯片形式；
3)整体基质的活化：将制得的整体基质用甲醇冲洗30min，然后连续通入40％的氨水溶液，在40℃下反应5小时，用水清洗干净后，通入30％的戊二醛溶液在室温下反应5小时。最后通入含50mM苯甲脒的2-4mg/mL的胰蛋白酶(trypsin)溶液，反应12h，反应结束后。酶反应器放入含10mMCaCl2和0.02％NaN3的50mMTris-HCl缓冲溶液中，在4℃下保存。
4)使用不同浓度胰蛋白酶制得的反应器水解小分子底物N-苯酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)，在不同反应流速下的活性情况。如图9。
表1为本发明微型快速蛋白水解酶反应器，水解细胞色素c产物经多极质谱检测和数据库检索后的结果。
| 溶液体系 | 水溶液 | 添加20％乙腈 |
| 反应时间 | 8min | |
| 序列 | EDLIAYLK | |
| GITWKEETLMEYLENPK | GITWKEETLMEYLENPK | |
| IFVQK | ||
| KTEREDLIAYLK | ||
| KTGQAPGFTYTDANK | KTGQAPGFTYTDANK | |
| KTGQAPGFTYTDANKNK | ||
| KYIPGTK | KYIPGTK | |
| TEREDLIAYLKK | ||
| TGPNLHGLFGR | ||
| TGPNLHGLFGRK | ||
| TGQAPGFTYTDANK | TGQAPGFTYTDANK | |
| TGQAPGFTYTDANKNK | ||
| 序列符合率 | 50.0％ | 62.5％ |
Claims (8)
1.一种微型快速蛋白水解酶反应器，其特征在于：在毛细管中使用甲基丙烯酸缩水甘油酯作为功能单体、乙叉二甲基丙烯酸作为交联剂、丙烯酰胺作为调节聚合物骨架亲水性的共单体、在高级醇混合溶液中进行原位聚合，得到连续、均匀的多孔结构刚性整体聚合物基质，通过对基质表面的基团进行活化和修饰，可以将胰蛋白酶分子牢固地结合在整体基质上，制得微型固定化胰蛋白酶反应器。
2.一种权利要求1所述微型快速蛋白水解酶反应器的制备方法，其特征在于：
1)甲基丙烯酸缩水甘油酯作为功能单体，乙叉二甲基丙烯酸作为交联剂，丙烯酰胺作为调节聚合物骨架亲水性的共单体，在高级醇的混合溶液中进行混合；
其中三种单体，甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙叉二甲基丙烯酸及丙烯酰胺间的质量比为：3∶5∶2；
2)在聚合溶液中加入引发剂后，装入毛细管内进行原位聚合反应，得到整体基质；
3)将毛细管内原位聚合得到的基质，依次用氨水和戊二醛溶液进行活化处理；
4)固载胰蛋白酶分子。
3.按照权利要求2所述微型快速蛋白水解酶反应器的制备方法，其特征在于：所述高级醇为，良溶剂：正丙醇或环己醇；弱溶剂：1，4-丁二醇、正癸醇或十二醇；其用量为占聚合物总质量的60-80％；在二元高级醇混合溶液中的良溶剂与弱溶剂质量比范围为85-50％。。
4.按照权利要求2所述微型快速蛋白水解酶反应器的制备方法，其特征在于：所述引发剂为AIBN，其加入量占单体总质量的0.5-2％；在室温下加入引发剂后，除气，用注射器取上述溶液注入毛细管中，两端用硅橡胶封闭，置于50-70℃水浴中反应不少于6小时。
5.按照权利要求2所述微型快速蛋白水解酶反应器的制备方法，其特征在于：所述用氨水和戊二醛溶液进行活化处理过程为，整体基质连续通入10-40％的氨水溶液，在35-45℃下反应5-8小时，用水清洗干净后，通入5-30％的戊二醛溶液在室温下反应5-8小时。
6.按照权利要求2所述微型快速蛋白水解酶反应器的制备方法，其特征在于：所述固载胰蛋白酶分子过程为，整体基质通入含苯甲脒的2-4mg/mL的胰蛋白酶溶液，室温下反应不少于12h，溶液中苯甲脒的质量百分比为胰蛋白酶质量百分比的1.5-2.5倍。
7.按照权利要求2所述微型快速蛋白水解酶反应器的制备方法，其特征在于：所述毛细管在应用前其内壁预先经带双键功能团的硅烷试剂中改性。
8.按照权利要求2所述微型快速蛋白水解酶反应器的制备方法，其特征在于：所述三种单体加入混合溶剂中后加热至50-70℃，震荡混匀。
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2005
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