CN103131690A - 一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法，具体步骤为：将带活性基团的无机纳米材料掺杂到有机整体材料中，在毛细管内制备有机-无机复合基质；对整体材料进行表面改性，键合活性基团，并将一种蛋白酶与其结合，进一步将另一种蛋白酶结合到纳米材料表面的活性基团上，得到含有两种酶解蛋白的有机-无机复合纳米整体酶解柱。本发明的优势在于：同时固定两种蛋白酶，可以起到更好的酶解效果，此外，采用纳米材料掺杂，可以极大地提高基质的比表面积，结合更多的蛋白酶，也能够提高材料的机械强度。通过不同的结合方式固定两种蛋白酶，且此方法制备简单，容易操作。

Description

一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法
【技术领域】
本发明涉及蛋白质酶解技术领域，具体的说，是一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法。
【背景技术】
以规模化分析细胞或生物体内蛋白质为主要任务的蛋白质组学研究已成为后基因组学研究的重要内容。蛋白质组学样品的复杂性和宽动态范围使得蛋白质鉴定成为研究的瓶颈。近年来，蛋白质经多维色谱分离后直接流出固定化酶解柱，分离后的蛋白质得以快速酶解后再直接用质谱鉴定。这项技术的核心为固定化酶解柱。固定化酶解柱可显著缩短蛋白质的酶解时间，减少酶的自降解，易于在线联用且可反复使用。所以这项技术得到突破，将大大加快蛋白组学的研究进程。
对于膜蛋白等具有重要生理功能的蛋白，由于其疏水性较强，而其跨膜区通常缺少精氨酸或赖氨酸残基，普遍采用的胰蛋白酶无法实现有效酶解和获得可信的蛋白质鉴定。利用不同蛋白酶对蛋白质切割特异性的差异并使其共同作用，将大大提高酶解效率，有助于质谱检测到互补性的肽段，进而提高鉴定结果的可信度。最近，Caterina制备了环氧硅胶整体基质双酶在线酶解柱，chymotrypsin和trypsin的共同存在不仅缩短酶解时间，而且提高酶解效率和蛋白鉴定的可信度。(Caterina T，Enrica C，Karin C，Guy F，Gabriella M，J.Sep.Sci.2009，32，1120-1128)，然而chymotrypsin和trypsin是同时与环氧基反应，所以酶之间存在相互酶解，影响酶的固定量。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：将修饰活性基团的无机纳米材料掺杂到有机整体材料中，在毛细管中制备有机-无机复合基质；对整体材料改性，键合活性基团，并将一种蛋白酶与其结合，进一步将第二种蛋白酶结合到纳米材料表面的活性基团上，得到含有两种酶解蛋白的有机-无机复合纳米整体酶解柱。
一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法，具体步骤如下：
一、有机-无机复合基质的制备
将修饰活性基团的无机纳米材料掺杂到有机整体材料中，20～80℃下反应12～24h，在毛细管中制备有机-无机复合基质；
所述的无机纳米材料为纳米二氧化硅、二氧化钛、氧化锌、石墨化碳中的一种；粒径为10nm～500nm；
所述的无机纳米材料的形状为球形、六方柱、棒状；且无机纳米材料表面修饰氨基或羧基活性基团；
所述的无机纳米材料的质量mg与有机整体材料的体积mL之比为2∶1～25∶1。
所述的有机整体材料为聚丙烯酰胺整体材料、聚甲基丙烯酸酯整体材料或其它高分子整体材料；
所述的无机纳米材料表面结合酶解蛋白，也可以通过在修饰活性基团的无机纳米材料上先固定一种蛋白酶的方式引入；
二、对有机整体材料改性，键合活性基团
将戊二醛溶液连续泵入步骤一得到的有机-无机复合基质中反应12～24h，对有机整体材料进行改性，在其表面化学键合，得到含醛基化的有机-无机复合基质；
所述的有机整体材料的改性，通过质量分数为5～10％的戊二醛引入醛基；
三、蛋白酶的固定
在0～10℃的条件下将含有1～10mg/mL第一种蛋白酶的磷酸盐缓冲液连续泵入到步骤二得到的有机-无机复合基质中反应12～24h，将此种蛋白酶结合到醛基化的有机-无机复合基质表面；将含有0.1～1mol/L Cu(II)的水溶液通入键合第一种蛋白酶的有机-无机复合基质反应2～10h，将Cu离子螯合到无机纳米材料表面的活性基团上，再进一步通入1～10mg/mL第二种蛋白酶磷酸盐缓冲液将第二种蛋白酶结合到无机纳米材料表面的铜离子上；最后用pH为7.0～8.5的缓冲液洗去未固定的第一种蛋白酶和第二种蛋白酶，得到含有两种酶解蛋白的有机-无机复合纳米整体酶解柱。
所述的两种蛋白酶是通过改性后有机整体材料表面的醛基的共价键合作用或氨基酸与铜离子的螯合作用得到固定；
所述的第一种蛋白酶为trypsin、Glu-C、proteinase K、chymotrypsin、elastase中的一种。
所述的第二种蛋白酶为trypsin、Glu-C、proteinase K、chymotrypsin、elastase中的一种。
所述的铜离子可通过CuSO4，CuCl2，，CuNO3溶液中任一种引入。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
本发明引入无机纳米材料提高基质的比表面积，结合更多的蛋白酶，提高酶解效率的同时也提高了酶解柱的机械强度；且无机纳米材料和有机整体材料上可以通过不同的结合方式负载不同的蛋白酶，提高蛋白质鉴定的可信度，且制备方法简单，容易操作；特别适用于疏水性蛋白等特殊结构蛋白质的在线酶解。
【附图说明】
图1有机-无机复合纳米整体酶解柱的示意图；
图2有机-无机复合纳米整体酶解柱对牛血清白蛋白酶解后的MALDI-TOF图。
【具体实施方式】
以下提供本发明一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法的具体实施方式。
实施例1
首先在SBA-15纳米材料上修饰羧基：制备3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷-亚氨基二乙酸溶液(GLYMO-IDA)，0.425gIDA溶于10mL H2O，用10M NaOH调至pH＝11，放入冰水浴中，磁力搅拌，缓慢滴加100μL GLYMO，升温至65℃反应6h，重复上述操作两次；再把0.05mgSBA-15分散于25mL无水乙醇中，加入制备好的GLYMO-IDA溶液，用盐酸调至pH＝6时，在40℃下反应24h；最后用无水乙醇清洗3次，真空干燥。
依次称取依次称取0.18g甲基丙烯酸缩水甘油酯、0.12g二甲基丙烯酸乙二酯、0.40g环己醇、0.045g十二醇和0.003g AIBN于离心管中；将200μL上述溶液加入到含有3.5mg修饰羧基的SBA-15纳米材料的离心管，分散均匀后快速地引入到毛细管中，用硅橡胶两端封口后，在65℃的水浴锅中反应20h；无水乙醇、水、氨水、水和磷酸盐缓冲液冲洗，而后连续6h泵入含5％(v/v)戊二醛的磷酸盐溶液，磷酸盐缓冲液冲洗后连续泵入含有3mg/mL的trypsin、50mM NaCNBH3的磷酸盐溶液，在4℃下反应24h；依次用含10％ACN的磷酸盐缓冲液和1M Tris-HCl冲洗酶解柱4h；水洗后通入100mM CuSO4溶液，在4℃下反应2h；水洗后连续泵入含有5mg/mL的chymotrypsin、50mMNaCNBH3的磷酸盐溶液，4℃下反应4h；最后用NH4HCO3溶液冲洗。用制备的有机-无机复合纳米整体酶解柱对1mg/mL牛血清白蛋白在37℃条件下进行酶解，在5s内酶解效率达到82％，相比于固定一种蛋白酶的酶解柱，酶解效率高出许多，且可信度相对较高。
实验结果表明本发明通过无机纳米材料和有机整体材料引入两种蛋白酶，提高了蛋白质鉴定的可信度，且纳米材料的存在，增加酶的固定量，提高酶解效率。且制备方法简单，容易操作。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
一、有机-无机复合基质的制备
将修饰活性基团的无机纳米材料掺杂到有机整体材料中，20～80℃下反应12～24h，在毛细管中制备有机-无机复合基质；
二、对有机整体材料改性，键合活性基团
将戊二醛溶液连续泵入步骤一得到的有机-无机复合基质中反应12～24h，对有机整体材料进行改性，在其表面化学键合，得到含醛基化的有机-无机复合基质；
三、蛋白酶的固定
在0～10℃的条件下将含有1～10mg/mL第一种蛋白酶的磷酸盐缓冲液连续泵入到步骤二得到的有机-无机复合基质中反应12～24h，将此种蛋白酶结合到醛基化的有机-无机复合基质表面；将含有0.1～1mol/L Cu(II)的水溶液通入键合第一种蛋白酶的有机-无机复合基质反应2～10h，将Cu离子螯合到无机纳米材料表面的活性基团上，再进一步通入1～10mg/mL第二种蛋白酶磷酸盐缓冲液将第二种蛋白酶结合到无机纳米材料表面的铜离子上；最后用pH为7.0～8.5的缓冲液洗去未固定的第一种蛋白酶和第二种蛋白酶，得到含有两种酶解蛋白的有机-无机复合纳米整体酶解柱。
2.一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法，其特征在于，在所在步骤一中，所述的无机纳米材料为纳米二氧化硅、二氧化钛、氧化锌、石墨化碳中的一种；粒径为10nm～500nm。
3.一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法，其特征在于，在所在步骤一中，所述的无机纳米材料的形状为球形、六方柱、棒状；且无机纳米材料表面修饰氨基或羧基活性基团。
4.一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法，其特征在于，在所在步骤一中，所述的无机纳米材料的质量mg与有机整体材料的体积mL之比为2∶1～25∶1。
5.一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法，其特征在于，在所在步骤一中，所述的有机整体材料为聚丙烯酰胺整体材料、聚甲基丙烯酸酯整体材料或其它高分子整体材料。
6.一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法，其特征在于，在所在步骤二中，所述的有机整体材料的改性，通过质量分数为5～10％的戊二醛引入醛基。
7.一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法，其特征在于，在所在步骤三中，所述的两种蛋白酶是通过改性后有机整体材料表面的醛基的共价键合作用或氨基酸与铜离子的螯合作用得到固定。
8.一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法，其特征在于，在所在步骤三中，所述的第一种蛋白酶为trypsin、Glu-C、proteinase K、chymotrypsin、elastase中的一种；
所述的第二种蛋白酶为trypsin、Glu-C、proteinase K、chymotrypsin、elastase中的一种。
9.一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法，其特征在于，在所在步骤三中，所述的铜离子可通过CuSO4，CuCl2，，CuNO3溶液中任一种引入。
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