CN111303347B - 一种核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的制备方法 - Google Patents

一种核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种核‑壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的制备方法，包括以下步骤：先制备单分散的苯乙烯‑丙烯腈‑甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵微球；然后在制备制备核‑壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球：采用本发明制备的核‑壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物，可通过改变微球表面所负载的季铵阳离子含量对固化模板蛋白的数量进行调控；在表面印迹聚合过程中，可通过改变紫外光照的强度和表面聚合的时间对印迹聚合物层的厚度进行调节。这类材料将在生物大分子的分离、提纯、药物缓释等方面有很好的应用前景，可在色谱柱的填充、有机固相合成的载体材料、医药领域以及生物化学等众多重要领域具有广泛的应用。

Description

一种核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的制备方法
技术领域
本发明涉及一种核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的制备方法。
背景技术
为克服传统分子印迹聚合物对于蛋白质分子可接近性差、印迹位点包埋较深和识别较慢等缺点，表面分子印迹技术应运而生。采用表面分子印迹技术制备的蛋白质分子印迹聚合物形状可控，印迹位点建立在基质表面，蛋白质分子易于靠近印迹位点，具有较高的吸附速率和解离速率，并可降低非特异性吸附，提高选择性识别能力，同时减少包埋现象的发生。表面分子印迹微球可方便地用作固相萃取及液相色谱的固定相，因而在生物分子的分离纯化中发挥重要作用。
采用传统自由基聚合法制备得到具有核-壳结构的分子印迹聚合物，印迹壳层的厚度无法进行调控，同时自由聚合形成的识别位点不均一，亲和性较差。国内外热衷于对硅球、纳米管等载体材料表面进行多步化学反应，而获得相应的功能基团对模板蛋白进行表面固化和预组装。
温敏性高分子材料是指对外界温度刺激具有明显响应性的智能高分子材料。温敏性高分子材料中常含有醚键，酰胺，羟基等官能团，其中N-异丙基丙烯酰胺是目前应用最为广泛的一种单体。其临界温度为32℃至34℃，当外界温度高于该温度时，聚合物形态呈现为收缩状态；当温度低于该温度时，呈溶胀状态。因此可通过调节外界温度以实现对聚合物状态的调控，从而实现对模板分子的捕捉和释放，有利于对模板蛋白的特异性识别。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的制备方法，该方法通过可控活性自由基分散聚合法一步合成表面带有带有电荷和Iniferter基团的功能性载体材料，实现对模板蛋白固化数量和印迹膜厚度的精准调控，对模板蛋白表现较高的选择性识别性能。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备单分散的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵微球：
在氩气保护下将2g聚乙烯吡咯烷酮和90mL乙醇-水溶液混合并搅拌均匀，乙醇-水溶液中乙醇与水的体积比为8:1，然后依次加入甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、苯乙烯、丙烯腈三种单体，搅拌均匀后加入10mL浓度为0.01255mol/L N,N’-二乙基二硫代氨基甲酸苄酯乙醇溶液混匀，其中N,N’-二乙基二硫代氨基甲酸苄酯与苯乙烯、丙烯腈、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的摩尔比为1:107.65:188.37:13.13～39.39，然后使用250w、波长为365nm的高压汞灯照射5h，制备成单分散的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球；
(2)制备核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球：
将100mg牛血清蛋白加入至50mL浓度为0.01mol·L、pH为6.20磷酸缓冲溶液中，充分溶解后加入1g苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球并置于冰箱中预组装6h使其固化完全，然后离心分离得到固化后的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球；
将固化后的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球重新分散至50mL浓度为0.01mol·L、pH为6.20磷酸缓冲溶液中，然后加入N-异丙基丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺搅拌10-50min，其中N-异丙基丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比为1:6～1:12，搅拌速度为200～400r/min，气体氛围为氩气，得到混合物；
将混合物置于反应容器中并用功率为250w高压汞灯照射10～50min引发聚合反应得到反应产物，反应容器与高压汞灯间的距离为15cm，将得到的反应产物用甲醇-乙酸混合液洗涤3～5次，其中甲醇和乙酸的体积比为9:1，然后再用浓度为0.01mol·L氯化钠水溶液洗脱模板蛋白3～5次，最后在25℃下真空干燥48h，得到核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球。
本发明的优点：本发明制备的微球可通过改变微球表面所负载的季铵阳离子含量对固化模板蛋白的数量进行调控；可通过改变紫外光照的强度和表面聚合的时间对印迹聚合物层的厚度进行调节的方法。印迹材料在较高温度环境中可选择性识别目标蛋白，在较低温度环境中，可释放模板蛋白，表现出较高的特异性识别特点。通过可控活性自由基分散聚合法一步合成表面带有带有电荷和Iniferter基团的功能性载体材料，实现对模板蛋白固化数量和印迹膜厚度的精准调控，对模板蛋白表现较高的选择性识别性能，为复杂环境中目标蛋白的富集与分离提供了一种新型的可行性可行方法。
附图说明
图1是实施例一制备的单分散的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球的扫描电子显微镜照片。
图2是实施例一制备的核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的投射电子显微镜照片。
图3是实施例二制备的单分散的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球的扫描电子显微镜照片。
图4是实施例二制备的核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的投射电子显微镜照片。
具体实施方式
实施例一：
一种核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备单分散的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵微球：
在氩气保护下将2g聚乙烯吡咯烷酮和90mL乙醇-水溶液混合并搅拌均匀，乙醇-水溶液中乙醇与水的体积比为8:1，然后依次加入甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、苯乙烯、丙烯腈三种单体，搅拌均匀后加入10mL浓度为0.01255mol/L N,N’-二乙基二硫代氨基甲酸苄酯乙醇溶液混匀，其中N,N’-二乙基二硫代氨基甲酸苄酯与苯乙烯、丙烯腈、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的摩尔比为1:107.65:188.37:13.13，然后使用250w、波长为365nm的高压汞灯照射5h，制备成单分散的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球；
(2)制备核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球：
将100mg牛血清蛋白加入至50mL浓度为0.01mol·L、pH为6.20磷酸缓冲溶液中，充分溶解后加入1g苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球并置于冰箱中预组装6h使其固化完全，然后离心分离得到固化后的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球；
将固化后的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球重新分散至50mL浓度为0.01mol·L、pH为6.20磷酸缓冲溶液中，然后加入N-异丙基丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺搅拌10min，其中N-异丙基丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比为1:6，搅拌速度为300r/min，气体氛围为氩气，得到混合物；
将混合物置于反应容器中并用功率为250w高压汞灯照射25min引发聚合反应得到反应产物，反应容器与高压汞灯间的距离为15cm，将得到的反应产物用甲醇-乙酸混合液洗涤5次，其中甲醇和乙酸的体积比为9:1，然后再用浓度为0.01mol·L氯化钠水溶液洗脱模板蛋白3次，最后在25℃下真空干燥48h，得到核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球。
实施例二：
一种核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备单分散的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵微球：
在氩气保护下将2g聚乙烯吡咯烷酮和90mL乙醇-水溶液混合并搅拌均匀，乙醇-水溶液中乙醇与水的体积比为8:1，然后依次加入甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、苯乙烯、丙烯腈三种单体，搅拌均匀后加入10mL浓度为0.01255mol/L N,N’-二乙基二硫代氨基甲酸苄酯乙醇溶液混匀，其中N,N’-二乙基二硫代氨基甲酸苄酯与苯乙烯、丙烯腈、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的摩尔比为1:107.65:188.37:26.26，然后使用250w、波长为365nm的高压汞灯照射5h，制备成单分散的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球；
(2)制备核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球：
将100mg牛血清蛋白加入至50mL浓度为0.01mol·L、pH为6.20磷酸缓冲溶液中，充分溶解后加入1g苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球并置于冰箱中预组装6h使其固化完全，然后离心分离得到固化后的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球；
将固化后的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球重新分散至50mL浓度为0.01mol·L、pH为6.20磷酸缓冲溶液中，然后加入N-异丙基丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺搅拌30min，其中N-异丙基丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比为1:6，搅拌速度为400r/min，气体氛围为氩气，得到混合物；
将混合物置于反应容器中并用功率为250w高压汞灯照射25min引发聚合反应得到反应产物，反应容器与高压汞灯间的距离为15cm，将得到的反应产物用甲醇-乙酸混合液洗涤5次，其中甲醇和乙酸的体积比为9:1，然后再用浓度为0.01mol·L氯化钠水溶液洗脱模板蛋白3次，最后在25℃下真空干燥48h，得到核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球。
实施例三：
一种核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备单分散的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵微球：
在氩气保护下将2g聚乙烯吡咯烷酮和90mL乙醇-水溶液混合并搅拌均匀，乙醇-水溶液中乙醇与水的体积比为8:1，然后依次加入甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、苯乙烯、丙烯腈三种单体，搅拌均匀后加入10mL浓度为0.01255mol/L N,N’-二乙基二硫代氨基甲酸苄酯乙醇溶液混匀，其中N,N’-二乙基二硫代氨基甲酸苄酯与苯乙烯、丙烯腈、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的摩尔比为1:107.65:188.37:39.39，然后使用250w、波长为365nm的高压汞灯照射5h，制备成单分散的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球；
(2)制备核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球：
将100mg牛血清蛋白加入至50mL浓度为0.01mol·L、pH为6.20磷酸缓冲溶液中，充分溶解后加入1g苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球并置于冰箱中预组装6h使其固化完全，然后离心分离得到固化后的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球；
将固化后的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球重新分散至50mL浓度为0.01mol·L、pH为6.20磷酸缓冲溶液中，然后加入N-异丙基丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺搅拌50min，其中N-异丙基丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比为1:12，搅拌速度为200r/min，气体氛围为氩气，得到混合物；
将混合物置于反应容器中并用功率为250w高压汞灯照射50min引发聚合反应得到反应产物，反应容器与高压汞灯间的距离为15cm，将得到的反应产物用甲醇-乙酸混合液洗涤3次，其中甲醇和乙酸的体积比为9:1，然后再用浓度为0.01mol·L氯化钠水溶液洗脱模板蛋白5次，最后在25℃下真空干燥48h，得到核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球。

Claims (1)

1.一种核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备单分散的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵微球：
在氩气保护下将2g聚乙烯吡咯烷酮和90 mL乙醇-水溶液混合并搅拌均匀，乙醇-水溶液中乙醇与水的体积比为8:1，然后依次加入甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、苯乙烯、丙烯腈三种单体，搅拌均匀后加入10mL浓度为0.01255 mol/L N,N’-二乙基二硫代氨基甲酸苄酯乙醇溶液混匀，其中N,N’-二乙基二硫代氨基甲酸苄酯与苯乙烯、丙烯腈、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的摩尔比为1:107.65:188.37:13.13~39.39，然后使用250w、波长为365nm的高压汞灯照射5h，制备成单分散的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球；
（2）制备核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球：
将100mg牛血清蛋白加入至50mL浓度为0.01mol/L、pH为6.20磷酸缓冲溶液中，充分溶解后加入1g苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球并置于冰箱中预组装6 h使其固化完全，然后离心分离得到固化后的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球；
将固化后的苯乙烯-丙烯腈-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合物微球重新分散至50mL浓度为0.01mol/L、pH为6.20磷酸缓冲溶液中，然后加入N-异丙基丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺搅拌10-50min，其中N-异丙基丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比为1:6~1:12，搅拌速度为200~400r/min，气体氛围为氩气，得到混合物；
将混合物置于反应容器中并用功率为250w高压汞灯照射10~50min引发聚合反应得到反应产物，反应容器与高压汞灯间的距离为15cm，将得到的反应产物用甲醇-乙酸混合液洗涤3 ~ 5次，其中甲醇和乙酸的体积比为9:1，然后再用浓度为0.01mol/L氯化钠水溶液洗脱模板蛋白3~5次，最后在25℃下真空干燥48h，得到核-壳型温敏性蛋白质分子印迹聚合物微球。
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