CN104419746B - 基于固载的混合蛋白质为筛选库的蛋白酶底物筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种基于固载的混合蛋白质为筛选库的蛋白酶底物筛选方法。具体地说，是将混合蛋白质通过化学作用键合到固相载体上作为筛选库，将该蛋白库与蛋白酶孵育，蛋白库中蛋白酶的底物蛋白被酶切后所产生的肽段进入溶液，非底物蛋白不能被酶切而完整的保留在固相载体上，固液分离后，采用生物质谱进行溶液中底物肽段的定性定量鉴定，从而得到特异性蛋白酶的底物蛋白信息。本发明是利用蛋白酶与其底物的高度特异性作用，以及固液分离的简便性，将底物蛋白从固载的混合蛋白库中筛选出来的方法。
Description
技术领域
本发明是一种基于固载的混合蛋白质为筛选库的蛋白酶底物筛选方法。蛋白酶酶切其底物具有高特异性和高选择性。固载在固相载体上的蛋白库中的底物蛋白能够被蛋白酶酶切，产生的肽段进入溶液，而非底物蛋白不能被酶切仍旧保留在固相载体上，通过固液分离法即选择性地将底物的酶切肽段与非底物蛋白进行分离，结合生物质谱进行底物蛋白定性定量分析,从而得到特异性蛋白酶的底物蛋白。
背景技术
蛋白酶作为生命体内重要的调节酶，参与细胞增值、分化、凋亡等信号转导途径。在生物体特定的生理条件下，蛋白酶被激活，酶切底物蛋白，调节生命活动的整个过程。蛋白酶的异常激活可以产生异常的细胞增值和存活信号而导致疾病的发生。因此，对于蛋白酶底物的研究，有利于了解其参与信号转导的蛋白种类及相互作用关系，并进一步阐述机理。
通常大规模筛选蛋白酶底物的方法，分为两种，一种是基于凝胶电泳的方法，另一种是基于蛋白质端基标记的方法。基于凝胶电泳的方法（文献1：Identification of caspase-3degradome by two-dimensional gelelectrophoresis and matrix-assisted laserdesorption/ionization-time of flight analysis.Proteomics2004,4(11),3429-3436.文献2：Shotgun proteome analysis of proteincleavage in apoptotic cells.Proteomics2005,5,21232130.文献3：Global mapping of the topography and magnitude of proteolyticevents in apoptosis.Cell2008,134,679691.），是利用体外或者体内蛋白酶酶切的实验组和未酶切的对照组在SDS-PAGE胶上的位置不同进行比较分析，寻找差异的蛋白酶的底物蛋白进行质谱鉴定。由于疏水性强、难溶的、极碱性的蛋白以及分子量很高或很低的蛋白难以实现较好的胶上分离、分辨分析，而且凝胶电泳实验整个处理过程繁琐，对实验者操作技能要求较高，因此该方法应用受到限制。而基于蛋白质端基标记的底物筛选方法(文献4：A quantitative proteomics design for systematic identificationof protease cleavage events.Mol.Cell.Proteomics2010,9(10),2327-2333.文献5：Global Sequencing of Proteolytic Cleavage Sitesin Apoptosis by Specific Labeling of Protein N Termini.Cell2008,134(5),866-876.),是将体外或者体内蛋白酶酶切反应后的实验组和对照组分别引入不同的端基标记分子，然后进行选择性分离富集，将蛋白酶酶切底物的端基标记肽段筛选出来进行分析鉴定。该方法对于酶切位点的定位更加准确可靠，因而得到了迅速的发展。然而，该方法所产生的端基标记的酶切肽段受大量背景肽段干扰，需要选择性较好的富集材料和标记定量方法，还要进行样品除盐等多步操作，容易产生样品损失，引入一定的误差。
上述文献对固载的混合蛋白质为筛选库的蛋白酶底物筛选方法未作任何记载，也未作任何启示。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确、可靠、操作简单的蛋白酶底物的筛选方法，该方法可适用于大规模蛋白酶底物的体外筛选。
为实现上述目的，发明人仔细研究了固载的混合蛋白库与蛋白酶的特异性酶切作用，发现只有底物蛋白才能被酶切，产生的肽段从固相载体上释放进入溶液，而非底物蛋白由于不能被酶切而保留在固相载体上，从而实现底物蛋白肽段与非底物蛋白的分离，有效降低了非底物蛋白的背景干扰。
因此，本发明提出一种基于固载的混合蛋白质为筛选库的蛋白酶底物筛选方法。该方法采用的技术方案为：
一种筛选蛋白酶底物的方法，将蛋白质固载于固相载体上，利用蛋白酶的高特异性酶切反应，以及固液分离操作进行底物肽段筛选，进而通过质谱进行底物蛋白的鉴定。
其中蛋白固载于固相载体表面的过程以及蛋白酶特异性酶切反应的过程可按本领域常规方法操作。
所述载体为琼脂糖微球或酰肼微球，蛋白固载于琼脂糖微球或酰肼微球上。所用的特异性蛋白酶为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族（caspase-3,caspase-7,caspase-2,caspse-8等）、金黄色葡萄菌V8蛋白酶（GluC）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、凝血酶（Thrombin）、弹性蛋白酶（Elastase）、组织蛋白酶（Cathepsin G,Cathepsin K）等，蛋白酶能够特异性切割底物蛋白特定位置上的氨基酸位点。利用固载的蛋白库和蛋白酶的特异性作用，酶切产生的蛋白酶底物的肽段释放进入溶液中，固液分离后采用质谱进行定性定量鉴定。固液分离的简便性，有效降低了非底物蛋白的背景干扰，避免了样品除盐等操作造成的损失，适合规模化蛋白酶底物分析。
一种基于固载的混合蛋白质为蛋白库的蛋白酶底物筛选方法,混合蛋白质通过化学作用键合到固相载体上作为筛选蛋白库，将该蛋白库与特异性蛋白酶孵育，蛋白库中与特异性蛋白酶相应的底物蛋白被特异性蛋白酶酶切后所产生的肽段进入溶液，而蛋白库中与特异性蛋白酶不相应的非底物蛋白不能被特异性蛋白酶酶切而完整的保留在固相载体上，固液分离后，采用生物质谱进行底物肽段定性定量分析，从而得到特异性蛋白酶的底物蛋白信息。
蛋白酶与其底物具有高度特异性作用；底物蛋白被酶切后所产生的肽段能够直接从固相载体上释放进入溶液，非底物蛋白不能被酶切而仍旧完整地保留在固相载体上。
特异性蛋白酶可以是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族（caspase-3,caspase-7,caspase-2,caspse-8等），也可以是金黄色葡萄菌V8蛋白酶（GluC）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、凝血酶（Thrombin）、弹性蛋白酶（Elastase）、组织蛋白酶（Cathepsin G,Cathepsin K）等中的一种或二种以上。
具体操作过程为：
1)固载蛋白库的构建：混合蛋白质通过化学作用键合到固相载体上；
2)底物蛋白酶切反应：将固载的混合蛋白库与蛋白酶孵育反应后，底物蛋白被酶切后所产生的肽段释放进入溶液，非底物蛋白不能被酶切而完整的保留在固相载体上；
3)底物蛋白分析鉴定：通过固液分离，得到溶液中的底物蛋白肽段，采用质谱进行底物肽段的定性定量分析。
所述的混合蛋白质为细胞提取的蛋白质、组织提取的蛋白质等中的一种或二种以上。
所述的固相载体是酰肼微球（Affi-Hz hydrazide Gel,Bio-Rad），蛋白质通过酰肼化学的方法固载于酰肼微球上。
所述的固相载体是琼脂糖微球（CNBr-activated Sepharose4B，GEHealthcare），蛋白质通过溴化氢法固载于琼脂糖微球上。
当蛋白酶为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3和7时，其酶切反应条件为：固载的蛋白浓度为0.2-5μg/μl,50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（pH=7.4），100mM氯化钠，5mM或10mM二硫苏糖醇，1mM乙二胺四乙酸,1%或10%（wt/v）蔗糖,蛋白酶与固载蛋白库中蛋白质的质量比值（wt/wt）范围为1:10-1:100,在37℃下反应1h以上。
当蛋白酶为黄色葡萄菌V8蛋白酶、凝血酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G时，其酶切反应的条件为：固载的蛋白浓度为0.2-5μg/μl，150mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（pH=7.4）,50mM氯化钠,蛋白酶与固载蛋白库中蛋白质的质量比值（wt/wt）范围为1:10-1:100，在37℃下反应1h以上。
当蛋白酶为基质金属蛋白酶2时，其酶切反应的条件为：固载的蛋白浓度为0.2-5μg/μl，150mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（pH=7.4）,50mM氯化钠,5mM氯化钙,10μM氯化锌，蛋白酶与固载蛋白库中蛋白质的质量比值（wt/wt）范围为1:10-1:100，在37℃下反应1h以上。
当蛋白酶为组织蛋白酶K时，其酶切反应条件为：固载的蛋白浓度为0.2-5μg/μl，100mM醋酸钠(pH=5.5），2.5mM乙二胺四乙酸，2.5mM二硫苏糖醇，蛋白酶与固载蛋白库中蛋白质的质量比值（wt/wt）范围为1:10-1:100，在37℃下反应1h以上。
本发明所建立的蛋白酶底物的筛选方法是基于蛋白酶与固载的底物蛋白的高特异性作用，以及固液分离的简便性双重特征而进行的。该方法操作简便、特异性强、可信度高，可用于生物样品中高特异性蛋白酶的底物筛选。
附图说明
图1为琼脂糖微球固载的混合蛋白库用于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）底物的筛选流程图。
图2为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）酶切底物的定量结果分析。图2A为所有定量肽段log2Ratio分布情况。图2B为所有定量肽段在天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶底物数据库中的分布情况。图2C为所含不同数目的上调肽段（log2Ratio≥2.0）的潜在底物蛋白在天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶底物数据库中的分布情况。
图3潜在的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）底物蛋白与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶底物数据库中已知底物蛋白的比较分析。
具体实施方式
本发明方法的最大特征在于:利用蛋白酶与底物的高特异性酶切作用，以及固液分离的简便性，从固载的蛋白库中筛选出蛋白酶的底物蛋白。在实施方式上，可以分成三大步,第一步是固载蛋白库的构建，即蛋白质固载在固相载体上。凡是能够将蛋白质通过化学作用键合的固相载体均适用；第二步是蛋白酶体外特异性酶切反应。将蛋白酶与固载的蛋白库孵育反应，只有底物蛋白才能被酶切，从固相载体上释放，而非底物蛋白由于不能酶被酶切而保留在载体上，然后通过固液分离得到溶液中的底物蛋白肽段。第三步采用生物质谱对底物蛋白进行定性定量分析。若蛋白酶酶切肽段过大过长，超出质谱检测范围，需要将蛋白酶酶切肽段进行二次酶解之后，再做质谱分析。
以下具体介绍基于琼脂糖微球的蛋白库中蛋白酶底物的筛选方法。
蛋白质经过琼脂糖微球固载后用于蛋白酶底物的筛选，以天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）底物的筛选为例说明本发明的蛋白酶底物的筛选方法，蛋白酶酶切的底物肽段用LTQ-Orbitrap XL（Thermo,San Jose,CA)质谱检测。
附图1给出了琼脂糖微球固载的混合蛋白库用于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）底物的筛选流程示意图。为了消除实验操作过程中可能产生的自然降解的背景肽段干扰，获得更加准确的结果，本方法设定对照组和实验组，并采用定量蛋白质组学方法进行比较分析。所述方法具体按照以下四个步骤进行：（1）固载蛋白库的构建。蛋白质固载于琼脂糖微球上作为筛选库；（2）蛋白酶特异性酶切反应。蛋白库分为两等份，一份不加天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3作为对照组，用以确定自然降解的背景肽段；另一份加入天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3作为实验组，用以确定蛋白酶酶切的底物蛋白。酶切反应时，蛋白酶识别并酶切固载的底物蛋白，产生的肽段进入溶液，非底物蛋白不能被酶切，仍旧保留在琼脂糖微球上，然后离心分离得到溶液中的实验组底物蛋白酶切肽段和对照组自然降解的背景肽段。（3）二次酶切。由于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3直接酶切的底物肽段太长太大，因此需要进行二次酶切。即将对照组和实验组获得肽段同时分别进行胰蛋白酶酶解。（4）二甲基标记与质谱定量分析。按照二甲基标记策略，将对照组和实验组分别进行轻、重标记。待标记完全，二者混合除盐后，按照定量蛋白质组学方法，用LTQ-Orbitrap XL质谱检测，用Mascot（version2.1）、MSQuant（version2.0）和StatQuant(version1.2.2)进行数据库搜索及定量分析。本例以琼脂糖微球为蛋白载体，但并不仅限于琼脂糖微球，其他材料如酰肼微球等均可使用；本例以LTQ-Orbitrap质谱为检测手段，但检测手段可以扩展到LTQ-Orbitrap-Velos、LTQ-Orbitrap-Elite等质谱仪器;本例以天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3为例，但所述的蛋白酶还可以扩展到其他高特异性的蛋白酶，如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶7(caspase-7),天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶2(caspase-2),天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8(caspase-8),金黄色葡萄菌V8蛋白酶（GluC）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、凝血酶（Thrombin）、弹性蛋白酶（Elastase）、组织蛋白酶（Cathepsin G,Cathepsin K）等。
实施例1基于琼脂糖微球为载体的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3底物的筛选。
蛋白样品的制备:人源急性T细胞白血病细胞（Jurkat）蛋白通过非变性裂解提取。108个Jurkat细胞中加入4mL冰浴的非变性裂解液，裂解液组成如下：50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（pH=7.4）、1mM二硫苏糖醇、150mM氯化钠、1%(v/v)非离子表面活性剂Triton X-100、1mM乙二胺四乙酸、2%(v/v)蛋白酶抑制剂（protease inhibitor cocktail，Sigma）、2/5片的磷酸酶抑制剂（PhosSTOP，Roche）、1mM苯甲基磺酰氟。冰浴超声功率400W,超声3s,间歇5s，重复超声180次。然后4℃，16000g离心机上离心20min，取上清液蛋白，按照BCA蛋白浓度测定方法测定蛋白浓度为6.5mg/mL，放置-80℃冰箱中备用。
琼脂糖微球固载蛋白库的构建：利用溴化氢法将Jurkat非变性细胞裂解蛋白与溴化氰活化的琼脂糖微球（CNBr-activated sepharose4B，GE Healthcare）按照说明书所示质量比（wt/wt）为1:25-1:50混合进行固载反应。取0.67mL上述蛋白裂解液，加入100mg，1mM盐酸洗涤过的溴化氢活化的琼脂糖微球，于4℃，200rpm振荡进行固载反应18h。之后，1000g离心，用洗涤缓冲液（50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（pH=7.4)、1mM二硫苏糖醇、4μM亮肽素,0.1μM抑肽酶、1%（v/v）非离子表面活性剂Triton X-100）洗涤琼脂糖微球三次，抑制内源性的蛋白酶活性的同时洗非特异性吸附的蛋白。然后，用甘氨酸封闭液（50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（pH=7.4)、1M甘氨酸、1mM二硫苏糖醇、2%(v/v)蛋白酶抑制剂（protease inhibitor cocktail）、1%(v/v)非离子表面活性剂Triton X-100）于4℃过夜封闭反应，封闭未被固载的琼脂糖活性位点。待封闭完全，再用上述洗涤缓冲液洗涤琼脂糖微球三次，50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（pH=7.4）洗涤一次。
蛋白酶特异性酶切反应：将上述琼脂糖微球固载的蛋白库等分为两份，一份作为不加天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）的空白对照组，另一份作为加天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）的实验组。两份蛋白微球分别重悬于500μL蛋白酶切反应缓冲液（50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（pH=7.4）、1mM乙二胺四乙酸、100mM氯化钠、1mM二硫苏糖醇、1%（wt/v）蔗糖）中，实验组加入5μg天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3，而空白组不加天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3，反应2h后，离心去除琼脂糖微球，取上清液。用100μL，25mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液（pH=7.4）洗涤两次，合并上清液，并加入2.5μL1mM天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的抑制剂（z-DEVD-fmk）终止反应。
二次酶切及定量标记：将上述实验组和对照组所得到的上清液冷冻干燥后，分别复溶于100μL溶液（8M尿素、100mM四乙基溴化铵（pH=8.0）），加入终浓度为20mM二硫苏糖醇，37℃反应2h后，加入终浓度为40mM碘代乙酰胺,25℃避光反应45min，之后，各加入100mM四乙基溴化铵（pH=8.0)缓冲液稀释至600μL，最后分别加入15μg序列纯胰蛋白酶，37℃酶解反应过夜。
二甲基标记方法按照常规在柱标记方法进行（文献6：Multiplex peptidestable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.Nat.Protoc.2009,4(4),484-494.）。采用30mg C18柱子进行在柱标记，实验组肽段采用8mL含4%氘代甲醛（CD2O）和0.6M氰基硼氢化钠（NaBH3CN）各240μL的PBS(pH=7.5)溶液进行重标标记，对照组肽段采用8mL含4%甲醛（CH2O）和0.6M氰基硼氢化钠（NaBH3CN）各240μL的PBS(pH=7.5)溶液进行轻标标记。标记完全后，各用2mL洗脱液（80%乙腈，0.1%三氟乙酸）洗脱并将轻、重标记的两组样品肽段混合，冻干，待做质谱。
质谱定量及结果处理：将冻干的轻、重标记混合后的肽段复溶于100μL0.1%甲酸中，取20μL进行LTQ-Orbitrap XL质谱分析。采用在线二维SCX-RP-LC-MS/MS系统(文献7：A fully automated system with online sampleloading,isotope dimethyl labeling and multidimensional separation forhigh-throughput quantitative proteome analysis.Anal Chem.2010,82,29072915.)进行质谱分析。经过50,100,150,200,250,300,350,400,500mM和1000mM共10个醋酸铵盐梯度洗脱，并用140min反相梯度系统分析。质谱重复鉴定三次。所得结果采用软件Mascot（version2.1）进行搜索数据库（IPI human3.52）、MSQuant（version2.0）进行定量和StatQuant(version1.2.2)进行结果整合分析。
结果分析：定量到的所有肽段log2Ratio值分布见图2A。定量蛋白质组学研究中，通常把定量结果变化在两倍以上的看作显著变化。为了提高结果的可靠性，我们将所定量到的所有肽段与已知的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶底物数据库CASBAH进行比较，如图2B所示，结果显示log2Ratio≥2.0，即四倍以上变化的肽段在数据库中的比值趋于恒定，因此，我们设定上调四倍以上的肽段为显著变化的肽段，即约有7149条肽段为显著上调。
蛋白质组学中，认为至少有两条唯一肽段鉴定到的蛋白才比较可信。因此，我们将鉴定蛋白的上调肽段数目与已知蛋白数据库进行比较，分析上调肽段数目与上调变化的蛋白之间的关系。如图2C，结果显示当上调肽段数为2时，数据库中的底物蛋白所占的比例已经达到27.5%，与文献报道(文献8：Caspasesubstrates and cellular remodeling.Annu.Rev.Biochem.2011，80,1055-1087.)的结果相当。上调肽段数目越多，数据库中的底物蛋白所占的比值也相对较大。
通过如上分析，设定筛选参数为：上调肽段为log2Ratio≥2.0，且上调肽段数目至少为2时，所定量的蛋白为可信的底物蛋白。结果显示，1098个潜在的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3底物蛋白被定量到。
进一步，我们将1098个潜在的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3底物蛋白进行分析分类,如图3所示。一类是“Hot”底物蛋白，该类蛋白所含上调肽段数目至少为4。此类蛋白中底物所占的比例达到40%，即5个潜在的底物蛋白中就有2个是已知的底物蛋白，可信度大大提高。第二类为“Warm”蛋白，此类蛋白所含的上调肽段数目为2或者3,已知底物所占的比例仅接近20%。这类蛋白可能是由于丰度较低，或者蛋白本身可酶切的位点不多等原因，往往容易被忽视掉，这部分蛋白也是很重要的一部分。
以上结果说明，通过本发明所建立的体外筛选蛋白酶底物的方法，操作简单、准确，可靠，可适用于大规模蛋白酶底物的体外筛选。
Claims (8)
1.一种基于固载的混合蛋白质为蛋白库的蛋白酶底物筛选方法,其特征在于：混合蛋白质通过化学作用键合到固相载体上作为筛选蛋白库，将该蛋白库与特异性蛋白酶孵育，蛋白库中与特异性蛋白酶相应的底物蛋白被特异性蛋白酶酶切后所产生的肽段进入溶液，而蛋白库中与特异性蛋白酶不相应的非底物蛋白不能被特异性蛋白酶酶切而完整的保留在固相载体上，固液分离后，采用生物质谱进行底物肽段定性定量分析，从而得到特异性蛋白酶的底物蛋白信息；
特异性蛋白酶选自天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)，金黄色葡萄菌V8蛋白酶(GluC)，基质金属蛋白酶-2(MMP-2)，凝血酶(Thrombin)，弹性蛋白酶(Elastase)，组织蛋白酶(Cathepsin)中的一种。
2.按照权利要求1所述方法，其特征在于：
所述天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶7(Caspase-7),天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶2(Caspase-2)或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8(Caspse-8)；所述组织蛋白酶(Cathepsin)为组织蛋白酶G(Cathepsin G)或组织蛋白酶K(Cathepsin K)。
3.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述的固相载体是酰肼微球，蛋白质通过酰肼化学的方法固载于酰肼微球上。
4.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述的固相载体是琼脂糖微球，蛋白质通过溴化氢法固载于琼脂糖微球上。
5.按照权利要求1或2所述方法，其特征在于：当蛋白酶为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶7(Caspase-7)时，其酶切反应条件为：固载的蛋白浓度为0.2-5μg/μl,50mM的pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，100mM氯化钠，5mM或10mM二硫苏糖醇，1mM乙二胺四乙酸,1％或10％(wt/v)蔗糖,蛋白酶与固载蛋白库中蛋白质的质量比值(wt/wt)范围为1:10-1:100,在37℃下反应1h以上。
6.按照权利要求1或2所述方法，其特征在于：当蛋白酶为金黄色葡萄菌V8蛋白酶(GluC)、凝血酶(Thrombin)、弹性蛋白酶(Elastase)或组织蛋白酶G(Cathepsin G)时，其酶切反应的条件为：固载的蛋白浓度为0.2-5μg/μl，PH值为7.4的150mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液,50mM氯化钠,蛋白酶与固载蛋白库中蛋白质的质量比值(wt/wt)范围为1:10-1:100，在37℃下反应1h以上。
7.按照权利要求1或2所述方法，其特征在于：当蛋白酶为基质金属蛋白酶-2(MMP-2)时，其酶切反应的条件为：固载的蛋白浓度为0.2-5μg/μl，PH值为7.4的150mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液,50mM氯化钠,5mM氯化钙,10μM氯化锌，蛋白酶与固载蛋白库中蛋白质的质量比值(wt/wt)范围为1:10-1:100，在37℃下反应1h以上。
8.按照权利要求1或2所述方法,其特征在于：当蛋白酶为组织蛋白酶K(Cathepsin K)时，其酶切反应条件为：固载的蛋白浓度为0.2-5μg/μl，pH值为5.5的100mM醋酸钠缓冲液，2.5mM乙二胺四乙酸，2.5mM二硫苏糖醇，蛋白酶与固载蛋白库中蛋白质的质量比值(wt/wt)范围为1:10-1:100，在37℃下反应1h以上。
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