KR102386584B1

KR102386584B1 - Adamts13 효소 활성을 결정하기 위한 방법 및 시스템

Info

Publication number: KR102386584B1
Application number: KR1020197013181A
Authority: KR
Inventors: 러셀 필립 그랜트; 크리스토퍼 미쉘 슈포드; 메간 노리스 브래들리
Original assignee: 래버러토리 코포레이션 오브 아메리카 홀딩스
Priority date: 2016-10-11
Filing date: 2017-10-11
Publication date: 2022-04-14
Also published as: JP2019532649A; EP3526339A1; WO2018071502A1; US11959124B2; US20180163249A1; CN110139935A; AU2017343623A1; JP2022123057A; AU2017343623A8; US10858689B2; CA3038122A1; US20210062242A1; KR20190067844A

Abstract

샘플 내 트롬보스폰딘 유형 1 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제, 멤버 13 (ADAMTS13) 효소의 활성 분석을 위한 방법 및 시스템이 개시된다. 본원에 개시된 방법 및 시스템은 환자에서의 혈전성 혈소판감소성 자반증의 진단에 유용할 수 있다.

Description

ADAMTS13 효소 활성을 결정하기 위한 방법 및 시스템

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2016년 10월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 62/406,693의 이점을 주장하며, 그의 전문은 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 환자에서의 혈전성 혈소판감소성 자반증의 진단에 유용할 수 있는, ADAMTS13 (트롬보스폰딘 유형 1 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제, 멤버 13)의 활성을 결정하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다.

혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)은 혈액 응괴가 소혈관에서 형성되도록 야기하는 혈액 장애이다. 이는 낮은 혈소판 계수 (혈소판감소증)로 이어지며, 한편 응괴는 신장, 심장 및 뇌를 포함한 많은 기관을 손상시킬 수 있다. 치료 없이, TTP에 대한 치명률은 약 90%이다. 전형적인 치료는 혈장 교환이며, 이는 치명률을 6개월에 약 10%로 감소시킨다.

TTP의 대부분의 사례는 혈액 당단백질 폰 빌레브란트 인자 (vWF)를 특이적으로 절단하는 프로테아제인 ADAMTS13의 감소된 활성으로부터 발생한다. ADAMTS13은 고전단 응력의 순환 병태 하에 티로신-1605 및 메티오닌-1606 사이의 vWF를 특이적으로 절단한다. ADAMTS13은 또한 폰 빌레브란트 인자-절단 프로테아제로서 지칭되고 있다. ADAMTS13 활성의 선천성 및 후천성 (자가면역) 결핍 둘 다는 정상 혈장에서 발견되는 더 작은 다량체보다 더 혈소판 점착성인 비통상적으로 큰 vWF 인자 다량체의 존재를 특징으로 하며, 이는 TTP를 초래한다.

대부분의 TTP 사례는 특발성이고 순환으로부터의 ADAMTS13의 증가된 클리어런스 또는 ADAMTS13 단백질분해 활성의 직접 억제를 통해 순환하는 기능적 효소 수준을 감소시키는 ADAMTS13에 대한 항체와 연관되지만, ADAMTS13에 대한 항체는 통상적으로 선천성 결핍을 갖는 환자에서 검출되지 않는다. 연구는 ADAMTS13에 대한 IgG-특이적 자가항체에 대한 정량적 면역검정이 ADAMTS13에 대하여 항체를 검출하기 위한 기능적 (즉, 억제) 검정보다 더 민감성이라는 것을 제시한 바 있다.

대증적으로, 신체 전반에 걸친 소혈관 내 혈액 응괴의 형성인 TTP는 혈전성 미세혈관병증 (TMA)을 특징으로 하며, 이는 미세혈관병증성 용혈성 빈혈 및 혈소판감소증으로 이어질 수 있다. ADAMTS13 활성의 측정은 상이한 기저 원인을 갖는 다수의 임상적으로 유사한 병태로부터 TTP를 분화시키는데 역할을 할 수 있다. 임신, 기관 이식 및 특정 약제와 연관될 수 있는 이들 증후군은 일반적으로 유의하게 감소된 ADAMTS13 활성 수준을 나타내지 않는다. 용혈성 요독성 증후군 (HUS)은 임상적으로 TTP와 유사하지만, 급성 신부전과 연관된다. 설사-연관 HUS가 대부분의 사례를 차지하고, 통상적으로 시가-독소-생산 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) (O157:H7)에 의한 감염에 의해 야기된다. 설사-음성 또는 비정형 HUS (aHUS)는 소아 및 성인 둘 다에서 발생하는 비제어된 보체 활성화에 의해 야기되는 것으로 생각되고, TTP의 많은 임상적 특색을 공유하지만; 그러나, aHUS는 ADAMTS13 활성의 극심한 감소 (즉, <10%)와 연관되지 않는다. 사실상, 또한 업쇼-슐만 증후군으로도 지칭되는 선천성 ADAMTS13 활성 결핍은 정상 ADAMTS13 활성의 10% 미만의 ADAMTS13 활성 수준과 연관된 상염색체 열성 장애이다. 임상적 특색 단독에 기반한 질환 분류는 신뢰불가능할 수 있고 부적절한 치료 또는 유효한 치료의 개시에서의 지연을 초래할 수 있다. 따라서, 혈소판감소증 및 미세혈관병증성 용혈의 실험실 증거를 나타내는 환자에서, ADAMTS13 활성의 측정은 다른 임상적으로 유사한 병태로부터 TTP를 구별하는데 있어서 귀중할 수 있다.

일반적으로, TTP가 임상적 제시에 기반하여 의심될 때 증상의 급성도 및 중증도 때문에 구명 총 혈장 교환 (TPE) 요법이 ADAMTS13 활성 테스팅 전에 개시된다. 많은 사례에서 TPE는 정상 ADAMTS13 활성 테스트 결과가 수득되는 경우에 중단될 것이다. 이와 같이, ADAMTS13 테스트 결과가 더 빨리 수득되면, TPE 요법은 더 빨리 중단될 수 있으며, 이는 1) (불필요한) TPE 요법과 연관된 비용을 감소시키고, 2) 임상의가 증상에 대한 대안적인 원인 및 이에 따라 적절한 요법에 초점을 맞추도록 한다. (Connell, N. T. et al. Transfusion 2016, 56 (2), 354-359).

이에 따라, TTP를 가질 위험이 있거나 또는 그를 갖는 것으로 의심되는 개체로부터의 샘플 내 ADAMTS13 활성을 측정하기 위한 개선된 실험실 테스트에 대한 필요가 있다. 보다 비용-효율적이며, 이로써 보다 빈번한 테스팅을 가능하게 하고 또한 임상 테스팅 결과를 더 빨리 제공하는 개선된 실험실 테스트에 대한 필요가 있다.

본 발명은 환자에서의 TTP의 진단에 유용할 수 있는, ADAMTS13의 활성을 결정하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 ADAMTS13을 질량 분광측정법 및/또는 액체 크로마토그래피 - 탠덤 질량 분광분석법 (LC-MS/MS)에 의해 측정하는 방법을 포함한다.

예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 샘플 내 ADAMTS13 효소 활성을 결정하기 위한 방법을 포함한다: (a) 샘플을 ADAMTS13에 대한 외인성 펩티드 기질과 함께, ADAMTS13에 의한 외인성 펩티드 기질의 효소적 절단을 가능하게 하는 조건 하에 인큐베이션하여 효소적 절단 산물을 생산하는 단계; (b) 효소적 절단 산물을 이온화하여 절단 산물의 다중 하전된 기체-상 이온을 생성하는 단계; 및 (c) 상기 다중 하전된 기체-상 이온을 질량 분광측정법에 의해 분석하여 샘플 내 효소적 절단 산물의 존재 또는 양을 결정하며, 여기서 샘플 내 효소적 절단 산물의 존재 또는 양은 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 존재 또는 양을 나타내는 것인 단계.

특정 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 양을 결정하기 위한 방법을 포함할 수 있다: (a) 샘플을 ADAMTS13에 대한 합성 펩티드 기질 및 샘플에 대한 산물 펩티드의 동위원소 표지된 등가물과 함께, ADAMTS13에 의한 합성 펩티드 기질의 효소적 절단을 가능하게 하는 조건 하에 인큐베이션하는 단계; (b) 인큐베이션 중인 샘플에서 효소적 절단을 종결시키는 단계; (c) 액체 크로마토그래피 또는 또 다른 정제 기술을 사용하여 효소적 절단 산물 및 내부 표준을 샘플의 다른 구성성분으로부터 부분적으로 정제하는 단계; 및 (d) 부분적으로 정제된 효소적 절단 산물 및 표준을 질량 분광측정법에 의해 분석하여 샘플 내 효소적 절단 산물 및 내부 표준의 양을 결정하며, 여기서 효소적 절단 산물 및 내부 표준의 결정된 양의 비는 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 양을 나타내는 것인 단계.

다른 실시양태에서, 본 발명은 샘플 내 ADAMTS13의 활성을 결정하기 위한 시스템을 포함할 수 있으며, 시스템은 하기를 포함한다: (a) 샘플을 ADAMTS13에 대한 외인성 펩티드 기질과 함께, ADAMTS13에 의한 외인성 펩티드 기질의 효소적 절단을 가능하게 하는 조건 하에 인큐베이션하여 효소적 절단 산물을 생성하기 위한 스테이션; (b) 효소적 절단 산물을 이온화하여 상기 절단 산물의 다중 하전된 기체-상 이온을 생성하기 위한 스테이션; 및 (c) 다중 하전된 기체-상 이온을 질량 분광측정법에 의해 분석하여 샘플 내 효소적 절단 산물의 존재 및/또는 양을 결정하기 위한 스테이션으로서, 여기서 효소적 절단 산물의 양은 샘플 내 ADAMTS13의 활성을 나타내는 것인 스테이션. 일부 실시양태에서, 시스템은 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하기 위한 스테이션을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 시스템은 액체 크로마토그래피를 사용하여 효소적 절단 산물을 크로마토그래피적으로 분리하기 위한 스테이션을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법 및 시스템 둘 다는 다양한 실시양태를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 방법은, 인큐베이션 단계 후에 그러나 이온화 단계 전에, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계를 포함할 수 있으며, 이에 따라 이온화 단계가 부분적으로 정제된 효소적 절단 산물에 대해 수행되도록 한다. 특정 실시양태에서, 시스템은 이러한 단계를 수행하기 위한 스테이션을 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계는 원심분리를 포함하고, 이온화 단계는 효소적 절단 산물을 포함하는 상청액에 대해 수행된다. 추가적으로 및/또는 대안적으로, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계는 효소적 절단 산물을 포함하는 용리액을 생성하기 위한 액체 크로마토그래피를 포함할 수 있고, 이온화 단계는 용리액에 대해 수행된다. 추가적으로 및/또는 대안적으로, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계는 효소적 절단 산물을 포함하는 용리액을 생성하기 위한 모세관 전기영동을 포함하고, 이온화 단계는 용리액에 대해 수행된다. 추가적으로 및/또는 대안적으로, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계는 효소적 절단 산물을 포함하는 용리액을 생성하기 위한 고체 상 추출을 포함하고, 이온화 단계는 용리액에 대해 수행된다. 추가적으로 및/또는 대안적으로, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계는 효소적 절단 산물을 포함하는 용리액을 생성하기 위한 여과를 포함하고, 이온화 단계는 용리액에 대해 수행된다. 추가적으로 및/또는 대안적으로, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계는 효소적 절단 산물을 포함하는 보유 분획을 생성하기 위한 여과를 포함하고, 이온화 단계는 보유 분획에 대해 수행된다. 추가적으로 및/또는 대안적으로, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계는 효소적 절단 산물의 친화성 강화의 사용을 포함하고, 이온화 단계는 친화성 강화된 효소적 절단 산물에 대해 수행된다. 특정 실시양태에서, 친화성 강화 기술은 고정화된 금속 친화성 수지를 사용한다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 친화성 강화 기술은 항체 또는 항체의 단편, 예컨대 Fab 단편을 활용할 수 있다. 또는, 친화성 강화 기술은 스트렙타비딘을 활용할 수 있다. 또는, 친화성 강화 기술은 단백질-G, 또는 단백질-A를 활용할 수 있다. 또는, 친화성 강화 기술은 압타머를 활용할 수 있다.

특정 실시양태에서, 방법 및 시스템은 분석 및/또는 부분적 정제 전에 인큐베이션을 종결시키기 위한 단계를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 방법 및/또는 시스템은 인큐베이션 중인 샘플에서 효소적 절단을 종결시키는 단계 (또는 이러한 단계를 수행하기 위한 스테이션)를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 종결시키는 단계는 침전 시약을 인큐베이션 중인 샘플에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 다양한 침전 시약이 사용될 수 있다. 이에 따라, 대안적 실시양태에서, 침전 시약은 메탄올, 및/또는 아세토니트릴, 및/또는 아세톤, 및/또는 2-프로판올, 및/또는 술페이트, 및/또는 트리클로로아세트산, 및/또는 과염소산을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 반응의 종결은 pH를 효소가 기능적이기에 적합한 범위 밖의 범위로 변화시킴으로써 수행된다. 예를 들어, 종결시키는 단계는 인큐베이션 중인 샘플의 pH를 pH 5 미만, 또는 대안적으로 pH 9 초과로 조정하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 종결시키는 단계는 온도를 효소가 기능적이기에 적합한 범위 밖의 범위로 조정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종결시키는 단계는 인큐베이션 중인 샘플을 50℃ 초과의 온도로 가열하는 것 또는 대안적으로, 인큐베이션 중인 샘플을 15℃ 미만의 온도로 냉각시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 종결시키는 단계는 인큐베이션 중인 샘플에 ADAMTS13의 억제제를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 억제제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)일 수 있다.

반응에 사용되는 기질은 ADAMTS13의 활성의 측정을 가능하게 하도록 디자인된다. 특정 실시양태에서, 기질은 폰 빌레브란트 인자 A2 도메인 (vWF A2 도메인), 또는 그의 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 외인성 펩티드 기질은 vWF 아미노산 서열 또는 그의 부분에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 기질은 기능적 ADAMTS13 절단 부위를 포함한다. 한 실시양태에서, 기질은 기능적 ADAMTS13 엑소부위를 포함한다. 한 실시양태에서, 기질은 외인성 펩티드를 포함한다. 외인성 펩티드는 합성 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 외인성 기질은 vWF73 (서열식별번호: 3)의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 유사성을 갖는 합성 펩티드이다. 한 실시양태에서, 펩티드는 서열식별번호: 3이다.

일부 실시양태에서, 펩티드 기질은 하나 이상의 친화성 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 친화성 태그는 MYC-태그, FLAG-태그, 폴리His-태그, 또는 GST-태그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 친화성 태그는 항체에 대한 에피토프를 함유한다. 추가적으로 및/또는 대안적으로, 외인성 펩티드 기질은 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산은 비오티닐화된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산은 안정한 동위원소 표지된 아미노산이다.

기질은, ADAMTS13과 함께 인큐베이션 시, 2개의 보다 작은 펩티드로 절단된다. 생성되는 산물은 외인성 기질로서 사용된 펩티드에 따른다. 예를 들어, 서열식별번호: 3의 외인성 기질 (또는 N-말단 단부에 추가적인 또는 더 적은 아미노산을 갖는 기질)을 사용하여, 효소적 절단 산물은 DREQAPNLVY (서열식별번호: 4)의 서열을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 기질 펩티드의 C-말단 단부 상에 추가적인 아미노산이 있는 경우에 다른 산물이 형성될 수 있는 것으로 고려된다.

이온화 단계는 다중 하전된 이온의 형성을 초래한다. 특정 실시양태에서, 이온화 단계는 이온화 기술, 예컨대 전기분무 이온화, 대기압 화학적 이온화 또는 대기압 광이온화를 사용하여 효소적 절단 산물을 이온화하는 것을 포함한다. 이온화 기술은 전기분무 이온화, 대기압 화학적 이온화 및 대기압 광이온화로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

분석하는 단계는 이온화 단계에서 형성된 다중 하전된 이온의 특징화 및 정량화를 가능하게 한다. 특정 실시양태에서, 분석하는 단계는 ADAMTS13의 비활성을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분석하는 단계는 탠덤 질량 분광측정법을 사용한다. 서열식별번호: 4의 산물을 생성하기 위해 서열식별번호: 3의 기질을 사용하여, 분석하는 단계는, 특정 실시양태에서, 602.8±2, 182.1±2, 281.1±2, 462.7±2, 512.3±2, 600.3±2, 605.3±2, 811.4±2, 924.5±2 및 1023.5±2로 이루어진 군으로부터 선택된 m/z를 갖는 이온을 사용할 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 방법 및 시스템은 내부 표준을 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 내부 표준은 이온화 단계 전에 첨가된다. 대안적으로, 내부 표준은 기질과 공동으로 첨가될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 내부 표준은 인큐베이션 단계 전에 샘플에 첨가될 수 있다. 또는, 내부 표준은 인큐베이션 중인 샘플에 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 내부 표준의 존재 또는 양은 효소적 절단 산물의 존재 또는 양과 함께 결정된다. 특정 실시양태에서, 내부 표준의 결정된 양 및 효소적 절단 산물의 결정된 양 사이의 비는 형성된 효소적 절단 산물의 양을 나타내는 것이다. 일부 실시양태에서, 내부 표준의 결정된 양 및 효소적 절단 산물의 결정된 양 사이의 비는 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 양 (예를 들어, 비활성)을 나타내는 것이다.

다양한 내부 표준이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 내부 표준은 절단 산물과는 상이한 펩티드이다. 그러나, 일부 다른 실시양태에서, 내부 표준은 효소적 절단 산물의 동위원소 표지된 등가물이다.

다양한 생물학적 샘플이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 샘플은 환자로부터 수득된 생물학적 유체이다. 예를 들어, 생물학적 유체는 혈장 또는 혈청일 수 있다. 또는 다른 유형의 생물학적 유체 (예를 들어, 타액, 객담, 땀, 뇌 척수액)가 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 방법 및 시스템은, 임의적인 부분적 정제 단계 전에 또는 후에, 그러나 종결 단계 후에, 인큐베이션 중인 샘플 내 효소적 절단 산물의 분자 구조를 변형시키는 단계 (및/또는 이러한 단계를 수행하기 위한 스테이션)를 이용할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 변형시키는 단계는 효소적 절단 산물을 추가로 가수분해하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가수분해는 효소를 사용하여 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 효소는 트립신, 펩신, 또는 LysC 중 하나일 수 있다. 또는, 다른 효소가 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 가수분해는 화학적 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 화학적 시약은 포름산 또는 브로민화시아노겐 중 하나일 수 있다. 또는, 다른 화학적 시약이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소적 절단 산물은 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 유도체화는 효소적으로 촉매된다. 또는, 유도체화는 화학적 첨가를 포함할 수 있다.

이들 및 다른 실시양태가 본원에 기재된다.

본 발명은 하기 비제한적 도면을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다. 도면은 본 발명의 특정 실시양태 및/또는 특색을 예시하고 본 발명의 임의의 설명(들)을 보충하도록 의도된다. 도면은 기재된 설명이, 해당 경우도 그러하다는 것을 명백하게 나타내지 않는 한, 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.
도 1은 ADAMTS13에 대한 절단 부위는 밑줄표시되고 엑소부위는 이탤릭체로 제시된, vWF (서열식별번호: 1)의 부분적 아미노산 서열 및 vWF의 A2 도메인 (서열식별번호: 2)을 제시한다.
도 2는 ADAMTS13에 대한 절단 부위는 밑줄표시되고 엑소부위는 이탤릭체로 제시된, vWF의 A2 도메인 (서열식별번호: 2)에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
도 3은 ADAMTS13 절단 부위는 밑줄표시되고 엑소부위는 이탤릭체로 제시된, vWF 아미노산 서열에 기반한 ADAMTS13에 대한 합성 폴리펩티드 기질 (서열식별번호: 3)의 아미노산 서열 및 생성된 절단 산물 ("DRE 펩티드"; 서열식별번호: 4)의 아미노산 서열을 제시한다.
도 4는 본 발명의 한 실시양태에 따른 LC-MS/MS에 의한 DRE 펩티드 (서열식별번호: 4)의 검출에 의한 ADAMTS13 활성의 검정에 대한 워크플로우의 개관을 제시한다. 내부 표준 (서열식별번호: 5)이 또한 제시된다.

하기 설명은 본 발명의 다양한 측면 및 실시양태를 상술한다. 어떠한 특정한 실시양태도 본 발명의 범주를 정의하도록 의도되지는 않는다. 오히려, 실시양태는 단지 본 발명의 범주 내에 적어도 포함된 다양한 방법 및 시스템의 비제한적 예를 제공한다. 설명은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 관점으로부터 판독될 것이며; 따라서, 통상의 기술자에게 널리 알려진 정보가 반드시 포함되지는 않는다.

약어

다양한 약어가 본 출원에서 사용될 수 있다. 전부는 아니더라도 대부분의 경우에서, 이러한 약어의 의미는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 이들 약어는 의미가 제공되어 있는 하기 약어를 포함한다. 다른 약어가 본원에 정의된다.

ADAMTS13 = 트롬보스폰딘 유형 1 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제, 멤버 13 효소

DRE = 서열 DREQAPNLVY (서열식별번호: 4)를 갖는, vWF73의 효소적 절단의 산물로서 형성될 수 있는, 10개 아미노산 폴리펩티드; 도 3에 예시됨.

LC = 액체 크로마토그래피

LC-MS/MS = 액체 크로마토그래피 - 탠덤 질량 분광측정법

MS = 질량 분광측정법

MS/MS = 탠덤 질량 분광측정법

TTP = 혈전성 혈소판감소성 자반증

vWF = 폰 빌레브란트 인자 단백질 (당단백질)

vWF73 = vWF 잔기 Asp-1596 내지 Arg-1668의 천연 아미노산 서열로부터 유래된 73개 아미노산 잔기 폴리펩티드 (도 3에 예시됨)

정의

하기 용어는, 달리 나타내지 않는 한, 하기 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다:

본원에 사용된 바와 같은, 단수 용어는 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 하나 이상을 지칭할 수 있다.

본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 값을 결정하는데 이용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 고유 변이, 또는 연구 대상 사이에 존재하는 변이를 포함하는 것을 나타내기 위해 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "효소 활성" 또는 "효소적 활성"은 참조 표준 또는 정상 풀링된 혈장의 보정 곡선과 비교 시 ADAMTS13 비활성의 척도를 지칭한다. 상기 용어는 용어 "양" 또는 "수준"과 함께 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "엑소부위"는 효소가 인식하여 절단을 개시하는 ADAMTS13 기질의 부분을 지칭한다. 엑소부위 없는 기질은 일반적으로 효소에 의해 효율적으로 절단되는 것으로 인식되지 않을 것이다 (Kokame et al., Blood, 2004, 103:607-612).

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체", "개체", 및 "환자"는 상호교환가능하게 사용된다. 이들 용어의 사용은 의료 전문가, 예컨대 의사와의 임의의 종류의 관계를 암시하지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, 어구 "액체 크로마토그래피" 또는 "LC"는 샘플 내 하나 이상의 분자 또는 분석물의 샘플 내 다른 분석물로부터의 분리를 위한 프로세스를 지칭하는데 사용된다. LC는 유체가 미분된 물질의 칼럼을 통해 균일하게 이동하므로 유체 용액의 하나 이상 분석물의 저속화를 수반한다. 저속화는 하나 이상의 고정상 및 이동상 사이의 혼합물의 구성성분의 분배로부터 초래된다. LC는, 예를 들어, 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 및 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 포함한다. 일부 경우에, LC는 물 및/또는 물-혼화성 유기 용매, 예컨대 메탄올 또는 아세토니트릴로 구성된 이동상과 조합하여 소수성 고정상을 갖는 역상 LC를 지칭한다. 일부 경우에서, LC는 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 정상 액체 크로마토그래피, 또는 친수성 상호작용 크로마토그래피를 지칭할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모세관 전기영동" (CE)은 전기장에 노출되는 동안 전해질 용액에서의 그의 이온성 이동도에 기반한, 샘플 내 하나 이상의 분자 또는 분석물의 샘플 내 다른 분석물로부터의 분리를 위한 프로세스를 지칭한다. CE는, 예를 들어, 모세관 구역 전기영동 (CZE)을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "분리하다" 또는 "정제하다" 등은 샘플 매트릭스로부터 관심 분석물 이외의 모든 물질의 제거를 지칭하기 위해 반드시 사용되지는 않는다. 대신에, 일부 실시양태에서, 상기 용어는 샘플 매트릭스 내에 존재하는 하나 이상의 다른 구성성분에 비해 하나 이상의 관심 분석물의 양을 강화시키는 절차를 지칭하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, "분리" 또는 "정제"는, 예를 들어, 질량 분광측정법에 의해, 분석물의 검출을 방해할 수 있는 샘플로부터의 하나 이상의 구성성분의 양을 제거 또는 저하시키는데 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "질량 분광측정법" 또는 "MS"는 샘플 내 분자의 식별 및/또는 정량화를 위한 기술을 지칭한다. MS는 샘플 내 분자를 이온화하여 하전된 분자 (이온)를 기체 상으로 형성하고; 하전된 분자를 그의 질량-대-전하 비에 따라 분리하고; 하전된 분자를 검출하는 것을 포함한다. MS는 샘플 내 분자의 정성적 및 정량적 검출 둘 다를 가능하게 한다. 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 적합한 수단에 의해 이온화 및 검출될 수 있다. 어구 "탠덤 질량 분광측정법" 또는 "MS/MS"는 샘플 내 분자의 식별 및/또는 정량화를 위한 기술을 지칭하기 위해 본원에 사용되며, 여기서 질량 분광측정법의 다중 라운드는, 동시에 하나 초과의 질량 분석기를 사용하여 또는 순차적으로 단일 질량 분석기를 사용하여 발생한다. 본원에 사용된 바와 같은, "질량 분광계"는 분자를 이온화하고 하전된 분자를 검출하기 위한 수단을 포함하는 장치이다.

본원에 사용된 바와 같은, "전기분무 이온화" 또는 "ESI"는 샘플 내 분자를 분자의 단편화를 피하면서 이온화하기 위한 질량 분광측정법에 사용되는 기술을 지칭한다. 샘플은 전기분무에 의해 미세 에어로졸 내로 분산된다. 샘플은 전형적으로 용매, 통상적으로 물과 혼합된 휘발성 유기 화합물 (예를 들어, 메탄올 또는 아세토니트릴)과 혼합될 것이다. 에어로졸은 이어서 하전된 액적으로부터의, 및 궁극적으로, 샘플 내 분자의 기체-상 이온으로부터의 추가의 용매 증발을 보조하기 위해 가열될 수 있는 오리피스를 통해 질량 분광계로 전달된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "안정한 동위원소 표지된"은 주어진 원자의 비-방사성 동위원소로 분자를 강화시켜 분자 내 상기 원자의 평균 질량을 변경시키고 이로써 상기 분자의 평균 질량을 변경시키는 프로세스를 포괄한다. 일반적으로, 이는 천연에서 및 천연 분자 (예를 들어, 탄소-12 또는 질소-14)에서 더 빈번하게 발견되는 가벼운 동위원소를, 덜 흔한 무거운 동위원소 (예를 들어, 탄소-13 또는 질소-15)로 대체함으로써 달성된다.

본원에 사용된 바와 같은, "사중극자 분석기"는 MS에 사용되는 일종의 질량 분석기이다. 이는 서로 고도로 평행하게 세팅된 4개의 원형 로드 (2개 쌍)로 이루어진다. 사중극자는 관련 기술분야에 알려진 바와 같은 삼중 사중극자 포맷일 수 있다. 사중극자 분석기는 샘플의 하전된 입자를 그의 질량-대-전하 비에 기반하여 조직하는 기기의 구성성분이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 사중극자 분석기의 사용이 증가된 특이도의 결과로 이어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 1개 쌍의 로드는 양전위로 세팅되고 다른 세트의 로드는 음전위로 세팅된다. 검출되도록 하기 위해, 이온은 정렬된 로드와 접경되고 그와 평행한 궤적 경로의 중심을 통해 통과해야 한다. 사중극자가 직류 및 고주파 전압의 주어진 진폭에서 작동될 때, 단지 주어진 질량-대-전하 비의 이온만이 공진하고 안정한 궤적을 가져 사중극자를 통해 통과하고 검출될 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, "양이온 모드"는 양으로 하전된 이온이 질량 분석기에 의해 검출되는 모드를 지칭하고, "음이온 모드"는 음으로 하전된 이온이 질량 분석기에 의해 검출되는 모드를 지칭한다. "선택된 이온 모니터링" 또는 "SIM"의 경우에, 직류 및 고주파 전압의 진폭은 단지 특정한 질량만을 관찰하도록 세팅된다.

용어 "원심분리"는 원심분리기로의 불균질 혼합물의 침강을 위한 구심력의 적용을 수반하는 프로세스를 지칭한다. 샘플, 예를 들어, 튜브 내에 함유된 샘플에 대한 유효 중력의 증가는 보다 신속하고 완전하게 침전물 (펠릿)이 튜브의 바닥에 모이게 한다. 남아있는 용액은 "상청액"이라 명명된다.

TTP는 본 문서의 다른 부분에서, 예를 들어, 섹션 "발명의 배경"에서 보다 상세하게 논의된, 알려진, 비교적 희귀한 혈액 장애이다.

용어 "기질" 또는 "효소 기질"은 효소가 작용하는 물질을 지칭하기 위해 본원에 사용된다.

용어 "외인성" 기질은 샘플 외부로부터 기원하는 기질이다. 특정 실시양태에서, "외인성" 기질은 "합성" 기질이다.

용어 "합성"은, 예를 들어, 실험실 또는 다른 유사한 설비에서 생산된 사람이 만든 분자를 지칭하기 위해 여기서 사용된다. 이는 화학적 합성 뿐만 아니라 재조합 분자 기술 (즉, 재조합 핵산 구축물로부터의 발현) 둘 다를 포괄할 것이다.

용어 "서열"은, 또한 "1차 구조"로서 기재될 수 있는, 폴리펩티드 내 아미노산의 순서를 지칭하기 위해, 또는 아미노산의 특정한 순서를 갖는 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드 분자를 지칭하기 위해 사용될 수 있다.

"서열 동일성" 또는 "서열 유사성"은 2개 이상의 아미노산 서열의 맥락에서, 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 대응관계를 위해 비교 및 정렬될 때, 동일한 것이거나 또는 동일한 아미노산의 명시된 퍼센트 (예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 서열 유사성을 측정하기 위한 다양한 도구, 예컨대 미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 미국 국립 의학 도서관의 국립 생물 정보 센터로부터 이용가능한 단백질 BLAST가 이용가능하다. 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이, 테스트 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우에, 테스트 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우에, 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서 서열 비교 알고리즘은, 프로그램 파라미터에 기반하여, 참조 서열 대비 테스트 서열에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.

용어 "절단", "효소 절단" 또는 "효소적 절단"은 효소 프로테아제 (펩티다제 또는 프로테이나제)에 의해 야기되는 폴리펩티드의 효소적 가수분해의 프로세스 또는 결과를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.

용어 "절단 부위"는 폴리펩티드 내의 프로테아제에 의한 절단의 위치를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 용어 "절단 부위"는 "특이적 절단 부위"를 포괄하고 그를 나타내기 위해 사용될 수 있으며, 이는 프로테아제가 그에 대해 특이적인 폴리펩티드 내의 절단 부위를 의미한다.

용어 "절단 산물"은 프로테아제에 의한 효소적 절단으로부터 생성되는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.

폰 빌레브란트 인자 (vWf)는 혈액 혈장에 존재하는 큰 다량체 당단백질이고 내피 (바이벨-펠라드 소체 내의), 거핵구 (혈소판의 α-과립), 및 내피하 결합 조직에서 매우 큰 vWF로서 구성적으로 생산된다. 염기성 vWF 단량체는 특이적 기능을 갖는 다수의 특이적 도메인을 함유하는 2050개-아미노산 단백질이다. vWF 단량체는 번역후에 N-글리코실화되고, 디술피드 결합을 통해 시스테인 잔기의 가교에 의해 내형질 세망에서 이량체로 및 골지체에서 다량체로 배열된다. vWF 다량체는 80개 초과의 vWF 단량체를 함유할 수 있다. vWF의 주요 알려진 기능은 다른 단백질, 특히 인자 VIII의 결합이고, 이는 상처 부위에 대한 혈소판 부착에서 중요한 것으로 알려져 있다.

ADAMTS13은 또한 폰 빌레브란트 인자-절단 프로테아제 (vWFCP)로서 알려진 메탈로프로테이나제이다. 이는 vWF를 절단하는 아연-함유 메탈로프로테아제 효소이다. 이는 혈액에서 분비되고 큰 vWf 다량체를 분해하여, 그들의 활성을 저하시킨다.

ADAMTS13 활성의 존재 또는 양을 결정하기 위한 방법

본 발명은 다양한 방식으로 구체화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 ADAMTS13 활성을 질량 분광측정법에 의해 측정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서 탠덤 MS/MS가 사용된다. 일부 실시양태에서, ADAMTS13 활성은 LC-MS/MS에 의해 측정된다. 또한 ADAMTS13 활성을 측정하기 위한 시스템이 포함된다.

도 1 및 2는 ADAMTS13에 대한 절단 부위가 밑줄표시된, vWF의 부분적 아미노산 서열 (도 1에서 서열식별번호: 1; 도 1 및 2에서 서열식별번호: 2)을 제시한다다. 본원에 기재된 방법은 vWF A2 도메인의 부분 (잔기 D1459-L1664)을 기질로서 (도 2에서 및 도 1에서 볼드체로 제시된 서열식별번호: 2) 이용할 수 있다. 또한 ADAMTS13 절단 부위 (밑줄표시됨) (잔기 1605-1606) 및 엑소부위 (이탤릭체) (잔기 1660-1668)가 제시된다 (도 1 및 2 참조). 도 3은 ADAMTS13 절단 부위 (밑줄표시된 폰트)를 갖는 기질 펩티드 및 도 3에 제시된 기질 폴리펩티드의 ADAMTS13 절단의 산물인 생성된 N-말단 펩티드 산물 DREQAPNLVY (서열식별번호: 4) (즉, "DRE 펩티드")를 제시한다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 도 4에 개략적으로 예시된 바와 같이 수행된다. 본 발명의 예시적 실시양태는 샘플 내 ADAMTS13의 활성을 결정하기 위한 방법이며, 이는 샘플을 ADAMTS13에 대한 합성 펩티드 기질 (서열식별번호: 3)과 함께, ADAMTS13에 의한 합성 펩티드 기질의 효소적 절단을 가능하게 하는 조건 하에 인큐베이션하여 DRE 펩티드 (서열식별번호: 4)를 생성하는 단계, 임의적으로, 인큐베이션 중인 샘플에서 효소적 절단을 종결시키는 단계; 임의적으로, 액체 크로마토그래피를 사용하여 효소적 절단 산물을 크로마토그래피적으로 분리하는 단계; 및 효소적 절단 산물을 질량 분광측정법에 의해 분석하여 샘플 내 효소적 절단 산물의 존재 또는 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플 내 효소적 절단 산물의 존재 또는 양은 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 존재 또는 양을 나타내는 것이다. 도 4에 제시된 바와 같이, 방법은, 예를 들어, [¹³C, ¹⁵N] - 류신으로 안정한 동위원소 표지된 DRE 펩티드와 같은 내부 표준 (서열식별번호: 5)을 이용할 수 있다. 알려진 바와 같이, 다른 유형의 내부 표준이 이용될 수 있다. 예를 들어, 내부 표준은 비표지될 수 있지만 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있거나, 또는 펩티드 내 또 다른 아미노산이 표지될 수 있다. 내부 표준, 뿐만 아니라 기질 펩티드(들)는 화학적 합성 또는 재조합 방법에 의해 만들어질 수 있다.

이에 따라, 특정 실시양태에서, ADAMTS13 활성은 환자로부터 수득된 혈장 샘플을 도 1에 제시된 서열 (서열식별번호: 1)에 기반한 합성 폴리펩티드 기질과 함께 인큐베이션함으로써 결정될 수 있다. 합성 기질은 도 1에 제시된 서열보다 더 작을 수 있다. 한 실시양태에서, vWF73이라 명명된 합성 기질은 잔기 Asp-1596 내지 Arg-1668인 vWF의 부분적 아미노산에 기반한 도 3에 제시된 73개 아미노산 잔기 폴리펩티드 (서열식별번호: 3)이다. vWF73은 절단 부위 Tyr-1605/Met-1606을 보유한다. 합성 기질은 도 3에서 및 도 1에서 볼드체로 제시된 서열과 동일한 서열을 반드시 보유하지는 않으며; 서열의 변이 및 변형은 가능하다. 일부 실시양태에서, 기질은 도 1에 제시되지 않은 아미노산 잔기 서열 (서열식별번호: 1)을 가질 수 있고/거나, 친화성 태그 또는 비-천연 아미노산의 포함과 같은 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 이의 예는 MYC 태그 (EQKLISEEDL- 서열식별번호: 6), FLAG 태그 (DYKDDDDK- 서열식별번호: 7), 폴리HIS 태그 (HHHHHH - 서열식별번호: 8), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 태그 또는 비오티닐화 아미노산을 포함할 수 있다. 그러나, ADAMTS13에 대한 절단 부위는 합성 기질 내에 존재한다. 대안적 실시양태에서, 합성 기질은 vWF73 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 유사성을 갖는다.

ADAMTS13에 의한 합성 기질의 절단은 검출가능한 산물을 초래한다. 예를 들어, 시험관내 vWF73의 절단 시, 10개 아미노산 잔기 펩티드는 서열 DREQAPNLVY를 갖는 기질의 N-말단으로부터 형성되며, 이는 "DRE 산물"이라 명명된다. 한 실시양태에서, ADAMTS13 활성은 인큐베이션 기간 동안 생성된 DRE 산물의 양에 비례한다. 이어서 DRE 산물은 질량 분광측정법에 의해 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 인큐베이션은 효소의 메탄올 침전에 의해 종결될 수 있고 DRE 산물을 함유하는 상청액은 질량 분광측정법을 사용하여 직접적으로 분석될 수 있다. 특정 실시양태에서, DRE 산물은 DRE-산물을 측정하기 위한 탠덤 질량 분광측정법 (MS/MS)과 커플링된 액체 크로마토그래피 (LC) 또는 또 다른 정제 기술 (예를 들어, 모세관 전기영동)에 의해 분석될 수 있다.

샘플 내 ADAMTS13 활성의 양은 내부 표준을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 동위원소 희석 질량 분광측정법을 사용하여, 절단 산물의 (예를 들어, DRE 산물의) 안정한 동위원소-표지된 유사체는 내부 표준으로서 샘플에 첨가되고 MS 또는 LC-MS/MS에 의해 효소적 절단 산물과 공동으로 측정되어 변이에 대해 정규화한다. 한 실시양태에서, 내부 표준은 합성 기질 펩티드와 공동으로 첨가될 수 있다. 다른 실시양태에서, 내부 표준은 ADAMTS13에 의한 합성 기질의 절단 후에 첨가될 수 있다. 한 실시양태에서, 측정된 분석물:내부 표준 비는 형성된 DRE-산물의 양에 비례하고, 이로써, ADAMTS13 활성에 정비례한다. 따라서, 측정된 분석물:내부 표준 비는 샘플 내에 존재하는 ADAMTS13 효소적 활성의 양을 나타내는 것이다. ADAMTS13 활성은 "퍼센트 정상 활성"의 단위로 표현될 수 있으며, 100% 정상 활성은, 예를 들어, 정상 ADAMTS13 활성 수준을 갖는 환자로부터 유래된 풀링된 혈장에 의해 정의된다.

본 발명의 실시양태에 따른 방법은 샘플을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서, 용어 "제공하는"은 광범위하게 해석되어야 한다. 용어는 생물학적 샘플이 제공된 대상체를 독점적으로 지칭하는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 외부 임상 실험실의 기술자는, 예를 들어, 샘플이 추출 및/또는 크로마토그래피에 의한 정제를 위해 제조될 때, 샘플을 "제공한다"고 말할 수 있다.

샘플은 임의의 특정한 샘플 유형에 제한되지는 않는다. 샘플은 ADAMTS13을 함유하지만, 일반적으로, 또한 다른 구성성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 추출 및/또는 크로마토그래피에 의한 정제를 위해 가공 및 제조되어져 있는 샘플이다. 이러한 프로세싱은 후속 정제 단계의 유효성을 최적화하는데 유용할 수 있다. 이러한 프로세싱 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있다.

본 발명은 샘플 취급의 임의의 특정한 수단에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 이는 추출 및/또는 크로마토그래피에 의한 부분적 정제 전에 샘플을 2개 이상의 분획으로 분리하는데 유용할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 이러한 분획 중 2개 이상은, 예를 들어, 특정한 칼럼 화학에 대한 분리의 민감도 또는 선택도를 개선시키는 것을 돕기 위해, 상이하게 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 다중 액체 크로마토그래피 시스템에 걸친 반복 주입을 위한 단일 샘플을 제조하는 것을 포함한다.

본 발명은 임의의 특정한 샘플 크기 또는 조성에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 샘플은 또한 다른 구성성분, 예컨대 용매, 완충제, 항응고제 등을 포함할 수 있다. 샘플이 생물학적 샘플을 포함하는 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 조직 균질물, 타액, 양수, 담즙, 점액, 복막액, 또는 림프액 중 하나 이상일 수 있다. 본 발명은 임의의 특정한 부피의 생물학적 샘플에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 적어도 약 0.5-250 μL, 적어도 약 1-100 μL, 또는 적어도 약 2-50 μL 부피이다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 적어도 약 2-50 μL 부피이다.

인큐베이션 중인 샘플에서의 효소적 절단의 종결은 임의의 특정한 방법에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 샘플에서의 ADAMTS13에 의한 효소적 절단의 종결은 적절한 인큐베이션 기간 후에 샘플에 침전 시약을 ADAMTS13 효소적 반응을 종결시키기에 충분한 양으로 첨가함으로써 달성된다. 침전 시약은 메탄올, 아세토니트릴, 아세톤, 2-프로판올, 황산암모늄, 트리클로로아세트산 또는 과염소산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 온도가 반응을 유효하게 종결시키는데 사용될 수 있다. 샘플은 ADAMTS13을 불활성화시키기 위해 가열될 수 있거나 또는 샘플은 유효한 중단으로 반응을 저속화시키기 위해 냉각, 잠재적으로 동결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응은 ADAMTS13 활성에 도움이 되지 않는 샘플 pH를, 예를 들어, 약 pH 3 미만 또는 약 pH 9 초과로 조정함으로써 중단될 수 있다. 다른 실시양태에서, 반응은 ADAMTS13의 억제제, 예컨대 EDTA 또는 다른 프로테아제 억제제를 첨가함으로써 중단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소적 반응을 종결시킬 필요는 없을 수 있다. 예를 들어, ADAMTS13 효소적 반응은 단일 시점에서의 측정보다 오히려, 시간 경과에 걸쳐 반복된 샘플링에 의해 인큐베이션 단계 동안 연속적으로 모니터링될 수 있다.

샘플의 부분적 정제는 부분적으로 정제된 샘플을 제공한다. 부분적 정제는 방법의 다양한 스테이지에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 부분적 정제는 샘플의 인큐베이션 및 ADAMTS13 활성의 종결 후에 수행되어, ADAMTS13 효소적 절단 산물을 포함하는 샘플을 초래할 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 부분적 정제는 인큐베이션 단계 전에 수행될 수 있다. 하나 초과의 부분적 정제 단계가 본 발명의 실시양태에 따른 방법에서 사용될 수 있다. 부분적 정제는 부분적 정제의 방법 또는 결과에 의해 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 관심 구성성분 이외의, 샘플 내 다양한 구성성분 중 하나 이상의 농도는 감소되어져 있다. 예를 들어, 다른 구성성분의 농도는 부분적으로 정제된 샘플 내 효소적 절단 산물의 농도에 비해 감소될 수 있다. 또 다른 예에서, 다른 구성성분의 농도는 부분적으로 정제된 샘플 내 ADAMTS13의 농도에 비해 감소될 수 있다.

이에 따라, 용어 "제거하는" 또는 "제거"는 반드시 구성성분의 완전 제거를 암시하지는 않는다. 제거된 구성성분의 일부 양은 여전히 부분적으로 정제된 샘플 내에 존재할 수 있더라도, 관심 구성성분의 농도 대비 그의 농도는 추출전 샘플에서보다 더 낮을 것이다. 일부 실시양태에서, 부분적으로 정제된 샘플 내 효소적 절단 산물의 농도에 대한 제거된 구성성분의 상대 농도는 부분적 정제 단계 전의 샘플 내 효소적 절단 산물에 대한 그의 상대 농도의, 90% 이하, 또는 75% 이하, 또는 50% 이하, 또는 33% 이하, 또는 25% 이하, 또는 10% 이하 또는 5% 이하, 또는 1% 이하이다. 본 발명은 임의의 특정한 유형의 제거된 구성성분에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 제거된 구성성분 중 하나 이상은 질량 분광측정법에 의한 또는 액체 크로마토그래피로의 분석을 방해할 수 있는 화합물이다. 부분적 정제 방법의 한 예는 유기 용매의 첨가에 의한 반응의 종결 후의 원심분리이다. 원심분리 동안, 이에 따라 처리된 샘플의 침전된 구성성분은 제거되는 한편, 상청액은 추가로 정제 및/또는 분석된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 부분적으로 정제된 샘플은 크로마토그래피 분리 전에 하나 이상의 프로세싱 단계를 겪을 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 부분적으로 정제된 샘플은 증발된다. 이어서, 생성되는 잔류물은 용매 시스템에서 재구성된다. 임의의 적합한 용매 시스템은 잔류물을 재구성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용매 시스템은 크로마토그래피 분리와 상용성인 용매 시스템이다. 일부 실시양태에서, 재구성을 위한 용매 시스템은 물, 메탄올 또는 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 다른 실시양태에서, 부분적으로 정제된 샘플은 효소적 절단 산물을 변형시키도록 화학적 또는 효소적 처리를 겪을 수 있다. 예를 들어, 절단 산물은 화학적으로 유도체화되거나 또는 추가로 가수분해될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 산물은 다른 효소로 추가로 가수분해될 수 있다.

일부 실시양태에서, 방법은 액체 크로마토그래피를 사용하여 폴리펩티드 효소적 절단 산물, 예를 들어, DRE 산물을 크로마토그래피적으로 분리하는 단계를 수반한다 (포함한다). 본 발명은 액체 크로마토그래피를 수행하는 임의의 특정한 방식에 제한되지는 않는다. 일반적으로, 크로마토그래피 분리 단계는 적어도 하나의 액체 크로마토그래피 (LC) 칼럼을 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중 LC 칼럼, 예컨대 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상의 LC 칼럼이 사용된다. 일부 이러한 실시양태에서 2, 3, 4, 5, 6, 8 또는 10개 LC 칼럼이 사용된다. 일부 이러한 실시양태에서, 이들 LC 칼럼 중 2개 이상은 서로 평행하게 배열되고 동일한 질량 분광계에 인라인 연결된다.

본 발명은 임의의 특정한 유형의 칼럼에 제한되지는 않는다. 효소적 절단 산물의 분리에 적합한 임의의 칼럼이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 분석 칼럼이 사용된다. 일부 실시양태에서, 칼럼은 C18 칼럼이지만, C12, C8, C4, 페닐-헥실, 아미드, 아민, 또는 PFP로 구성될 수 있다.

추가로, 본 발명은 임의의 특정한 이동상에 제한되지는 않는다. 임의의 적합한 이동상은, 이동상이 특정한 LC 칼럼과 함께 사용하기에 및 LC 칼럼 내 효소적 절단 산물을 크로마토그래피적으로 분리하기에 적합하기만 하면, 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이동상은 아세토니트릴 (0 - 100%)로 구성된다. 또는, 이동상은 메탄올 (0 - 100%)로 구성될 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 이동상은 2종 이상의 용매의 상대비가 시간에 걸쳐 달라지도록 하는 구배를 이용한다. 일부 실시양태에서, 이동상은 이온 쌍형성 시약, 예컨대 트리플루오로아세트산, 포름산, 암모늄, 헵타플루오로부티르산, 및/또는 아세트산으로 구성된다.

특정 실시양태에서, 2개 이상의 LC 칼럼은 병렬로 사용되고 동일한 질량 분광계에 인라인 연결되어, 예를 들어, 처리량을 개선시킬 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 샘플 (이는 부분적으로 정제된 샘플일 수 있음)은 상이한 시간에서 2개 이상의 LC 칼럼에 도입된다. 일부 실시양태에서, 테스트 샘플의 2개 이상의 LC 칼럼에의 도입은 시차를 두며, 이는 샘플의 2개 이상의 LC 칼럼에의 도입을 분리하는 미리 결정된 시간 간격이 있다는 것을 의미한다. 적절한 시간 간격은 다양한 인자, 예컨대 용리 시간, 칼럼 화학 및 다른 LC 칼럼 중 하나 이상으로부터 용리된 효소적 절단 산물의 분석을 방해하는 것을 피하기 위한 잠재적 필요에 기반하여 선택될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, LC 칼럼은 또 다른 칼럼과 직렬로 배치될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 적합한 가드 칼럼이 이용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 방법에서 사용하기 위한 적절한 가드 칼럼을 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가드 칼럼은 또 다른 LC 칼럼과 병렬로 배치된다. 이러한 직렬의 2개 이상의 칼럼은 또한 병렬로 배열될 수 있으며, 따라서 병렬로 작동하는 2개 이상의 직렬의 칼럼이 있고, 여기서 각각의 직렬은 2개 이상의 칼럼을 함유한다. 다른 실시양태에서, 온라인 추출 칼럼이 이용될 수 있다. 예를 들어, 온라인 고체 상 추출 칼럼이 방법의 일부 실시양태에서 사용될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 효소적 절단 산물은 전기영동에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 효소적 절단 산물은 모세관 전기영동을 사용하여 잠재적 간섭 물질로부터 분리된다.

일부 실시양태에서, 방법은 정제된 또는 분리된 효소적 절단 산물을 질량 분광측정법에 의해 분석하여 효소적 절단 산물의 존재 또는 양을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, LC 칼럼 중 2개 이상이 동일한 질량 분광계 내로 공급된다. 일부 추가 실시양태에서, LC 칼럼 중 3개 이상이 동일한 질량 분광계 내로 공급된다. 일부 실시양태에서, 질량 분광계는 조합된 LC-MS 시스템의 파트이다.

본 발명은 임의의 특정한 유형의 질량 분광계에 제한되지는 않는다. 임의의 적합한 질량 분광계가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 탠덤 질량 분광계를 이용한다. 일부 이러한 실시양태에서, 효소적 절단 산물을 분석하는 것은 효소적 절단 산물을 이온화하는 것, 이온화된 효소적 절단 산물을 분석하는 것, 효소적 절단 산물 이온을 2개 이상의 단편 이온으로 단편화하는 것, 및 단편 이온을 분석하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 임의의 특정한 이온화 방법을 사용하는 질량 분광계에 제한되지는 않는다. 방법은 효소적 절단 산물로부터의 다중 하전된 이온의 생성에 적합한 이온화 기술을 활용할 수 있다. 적합한 이온화 방법은 광이온화, 전기분무 이온화, 대기압 화학적 이온화, 및 전자 포획 이온화를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 그리고 단편화를 이용하는 실시양태에서, 임의의 적합한 단편화 기술이 사용될 수 있다. 적합한 기술은 충돌 유도 해리, 전자 포획 해리, 전자 전달 해리, 적외선 다광자 해리, 방사성 해리, 전자-탈착 해리, 및 표면-유도 해리를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서, 탠덤 질량 분광계는 MDS-사이엑스 API5500 삼중 사중극자 질량 분광계이다. 일부 실시양태에서, 탠덤 질량 분광계는 대기압 이온화 공급원을 갖고, 분석하는 단계는 광이온화, 전기분무 이온화 (ESI), 대기압 화학적 이온화 (APCI), 전자 포획 이온화, 전자 이온화, 고속 원자 충격/액체 2차 이온화 (FAB/LSI), 전계 이온화, 전계 탈착, 열분무/플라즈마분무 이온화, 입자 빔 이온화, 및 소위 "하이브리드 이온화" 기술, 예컨대 레이저 절제 전기분무 이온화 (LAESI), 탈착 전기분무 이온화 (DESI) 또는 매트릭스 보조 레이저 탈착 전기분무 이온화 (MALDESI)로 이루어진 군으로부터 선택된 이온화 방법을 포함한다. 이온화 방법은 양이온 모드 또는 음이온 모드일 수 있다. 분석하는 단계는 또한 다중 반응 모니터링 (MRM, 또한 선택된 반응 모니터링 또는 SRM으로서 지칭됨) 또는 선택된 이온 모니터링 (SIM)을 포함할 수 있고, 2종 이상의 생체분자는 동시에 또는 순차적으로 분석된다. 일부 실시양태에서, 분석하는 단계는 사중극자 분석기를 사용한다. 일부 실시양태에서, 질량 분광계는 삼중 사중극자 질량 분광계이다. 일부 실시양태에서, 분석하는 단계는 사중극자-비행시간 (Q-TOF) 또는 사중극자-오비트랩 기기 상에서의 산물 이온 스캐닝으로, 예컨대 병렬 반응 모니터링 (PRM)으로 수행될 수 있다.

방법은, 일부 실시양태에서, 내부 표준을 사용하는 것을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 내부 표준은 이온화 단계 전의 임의의 적합한 시점에서 도입될 수 있다. 임의의 적합한 내부 표준이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 내부 표준은 효소적 절단 산물의 안정한 동위원소 표지된 등가물이다. 일부 이러한 실시양태에서, 내부 표준은 하나 이상의 아미노산의 안정한 동위원소 강화에 의해 표지된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 내부 표준은 [¹³C, ¹⁵N] - 류신을 갖는 DRE 펩티드이다. 또는, 사용된 다른 동위원소 및/또는 아미노산이 표지될 수 있다.

일부 실시양태에서, 샘플 내 ADAMTS13 효소적 활성의 양은 정량화될 필요가 없다. 일부 실시양태에서, 방법은 샘플 내 ADAMTS13 효소적 활성의 존재 또는 부재를 결정하는데 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 방법은 샘플 내 ADAMTS13 효소적 활성의 양을 결정하는데 사용된다. 예를 들어, 일부 실시양태 및/또는 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 샘플 내 ADAMTS13 활성의 양을 결정하기 위한 방법을 제공한다: 샘플을 ADAMTS13에 대한 합성 펩티드 기질 (및 내부 표준)과 함께, ADAMTS13에 의한 합성 펩티드 기질의 효소적 절단을 가능하게 하는 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 임의적으로, 인큐베이션 중인 샘플에서 효소적 절단을 종결시키는 단계, 임의적으로, 액체 크로마토그래피를 사용하여 효소적 절단 산물 및 내부 표준을 샘플의 다른 구성성분으로부터 크로마토그래피적으로 분리하는 단계, 및 효소적 절단 산물 및 내부 표준을 이온화하여 샘플 내 효소적 절단 산물 및 내부 표준의 양을 결정하기 위해 질량 분광측정법에 의해 분석되는 다중 하전된 이온을 생성하며, 여기서 효소적 절단 산물 및 내부 표준의 결정된 양의 비는 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 양을 나타내는 것인 단계.

일부 실시양태에서, 방법은 임의의 정량 하한치 (LLOQ) 및/또는 정량 상한치 (ULOQ)에 의해 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, LLOQ는 2%이고 ULOQ는 100%이다.

샘플 내 활성의 양은 외부 표준 곡선과의 비교에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, DRE 펩티드의 수량은 연속 희석된 (예를 들어, 2% ADAMTS13 활성까지) 대략 100% ADAMTS13을 갖는 풀링된 정상 혈장을 사용하여 생성된 보정 표준의 외부 표준 곡선과 비교될 수 있다. 방법은 구체적 숫자의 보정 수준에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 단지 단일 포인트가 보정 곡선을 생성하는데 필요하다. 일부 실시양태에서, 캘리브레이터가 샘플 내에 첨가될 수 있다.

보고서를 작성하는 방법

적어도 한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 ADAMTS13의 감소된 활성과 연관된 질환 또는 병태를 진단하기 위한 보고서를 작성하는 방법을 제공한다. 이러한 질환 또는 병태의 한 예는 TTP이다. 이러한 방법은 샘플을 ADAMTS13에 대한 합성 펩티드 기질 및 내부 표준 산물 펩티드와 함께, ADAMTS13에 의한 합성 펩티드 기질의 효소적 절단을 가능하게 하는 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 임의적으로, 인큐베이션 중인 샘플에서 효소적 절단을 종결시키는 단계, 임의적으로, 액체 크로마토그래피를 사용하여 효소적 절단 산물 및 내부 표준을 샘플의 다른 구성성분으로부터 크로마토그래피적으로 분리하는 단계, 효소적 절단 산물 및 내부 표준을 이온화하여 질량 분광측정법에 의해 분석되는 다중 하전된 이온을 생성하여 샘플 내 효소적 절단 산물 및 내부 표준의 양을 결정하며, 여기서 효소적 절단 산물 및 내부 표준의 결정된 양의 비는 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 양을 나타내는 것인 단계, 및 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 양을 상술하는 보고서를 작성하는 단계를 포함할 수 있다.

샘플 내 ADAMTS13의 활성의 양에 대한 정보에 기반하여, 대상체가 이러한 활성의 비정상적으로 낮은 양을 갖는지 여부를 평가할 수 있다. 이러한 정보는 대상체에서 ADAMTS13 활성의 비정상적 수준과 연관될 수 있는 하나 이상의 질환 또는 장애를 진단하는데 유용할 수 있다. 보고서를 작성하는 단계를 제외한 모든 단계의 특색 및 실시양태는 바로 상기에 기재되어 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 방법은 1개 초과의 칼럼, 예를 들어, 동일한 질량 분광계에 병렬로 인라인 연결된 2개 이상의 칼럼을 이용할 수 있다.

한 실시양태에서, 10% 미만의 ADAMTS13 활성 수준은 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)을 고도로 나타내지만, 특정 실시양태에서 또 다른 의학적으로 달성된 진단 제품 또는 절차에 의한 진단의 확증 없이 단독 진단 절차로서 사용되지 않아야 한다. 반대로, 10% 초과의 ADAMTS13 활성 수준은 TTP의 임상적 진단을 완전히 배제할 수 없다. 임상적으로 진단된 TTP를 갖는 환자 중 많게는 40%가 10% 초과의 ADAMTS13 수준을 갖는다. ADAMTS13 활성의 정상 또는 경도 내지 중등도 결핍을 가질 수 있는 다른 병태는 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 및 조혈 줄기 세포 및 실질 기관 이식, 간 질환, DIC, 패혈증, 임신 또는 특정 약제 (예를 들어, 티클로피딘, 클로피도그렐, 시클로스포린, 미토마이신 C, 퀴닌)의 영향과 연관된 다른 혈전성 미세혈관병증을 포함한다.

일부 실시양태에서, ADAMTS13 활성 측정은 샘플 내 ADAMTS13 억제제의 존재 및/또는 양을 결정하는데 사용될 수 있다. 기지의 낮은 활성을 갖는 샘플을 기지의 정상 활성을 갖는 샘플과 기지의 비로 혼합함으로써, 생성되는 혼합된 샘플의 활성이 측정될 수 있다. 혼합물의 기지의 비 및 개별 샘플의 기지의 활성에 기반하여, 혼합물에서의 측정된 활성을 혼합물에서의 예상된 활성과 비교할 수 있으며, 그에 의해 예상된 활성보다 더 낮은 측정된 활성은 낮은 활성 샘플 내 억제제의 존재 및 양을 나타내는 것이다. 일부 경우에서, 낮은 활성 샘플은 열 불활성화될 수 있다.

시스템

또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플 내 ADAMTS13 활성의 존재 또는 양을 결정하기 위한 시스템을 제공한다. 예를 들어, 시스템은 샘플을 ADAMTS13에 대한 합성 펩티드 기질과 함께, ADAMTS13에 의한 합성 펩티드 기질의 효소적 절단을 가능하게 하는 조건 하에 인큐베이션하기 위한 스테이션, 및 효소적 절단 산물을 다중 하전하고 (즉, 이온화하고) 질량 분광측정법에 의해 분석하여 샘플 내 효소적 절단 산물의 양을 결정하기 위한 스테이션으로서, 여기서 효소적 절단 산물의 양은 샘플 내 ADAMTS13의 활성을 나타내는 것인 스테이션을 포함한다. 시스템은 또한 액체 크로마토그래피 또는 다른 분리 방법 (예를 들어, 모세관 전기영동)을 사용하여 효소적 절단 산물을 크로마토그래피적으로 분리하기 위한 스테이션을 포함할 수 있다.

이러한 시스템은 본 발명의 실시양태에 따른 방법에 대해 상기 기재된 것들과 유사한 다양한 실시양태 및 하위실시양태를 포함할 수 있다. 이들 시스템은 다양한 스테이션을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "스테이션"은 광범위하게 정의되며, 상술된 방법을 수행하기에 적합한 임의의 적합한 장치 또는 장치들의 집합을 포함한다. 스테이션은 임의의 특정한 방식으로 서로에 대해 일체형으로 연결되거나 또는 배치될 필요는 없다. 본 발명은 서로에 대해 스테이션의 임의의 적합한 배열을 포함한다. 예를 들어, 스테이션은 심지어 동일한 룸에 있을 필요가 없다. 그러나 일부 실시양태에서, 스테이션은 일체형 유닛으로 서로에 연결된다.

본 발명의 실시양태에 따른 방법 및 시스템은 다양한 이점을 보유한다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 시스템에서의 LC-MS/MS의 사용은 특히 유리하다. ADAMTS13의 이전 검정은 면역검정 절차 (Kato et al., 2006, Transfusion 46:1444-1452), 형광 공명 에너지 전달 (FRET) (Kokame et al., Br. J. Hematol., 2005, 129:93-100), 또는 (SELDI-TOF)-질량 분광측정법 (Jin et al., J. Thrombosis and Haemostasis, 2006, 4:333-338)을 이용한 바 있다. 본원에 기재된 방법 및 시스템은 면역검정과의 비교 시 증가된 민감도 (예를 들어, 2%의 LLOQ) 및 특이도, FRET와의 비교 시 증가된 처리량 및 감소된 비용, 및 예를 들어 (SELDI-TOF)-MS와의 비교 시 탠덤 질량 분광측정법에 의한 분석을 용이하게 하는 전기분무 이온화에 의한 다중-하전된 이온의 생성으로 인한 증가된 특이도를 제공한다.

비제한적 실시양태

비제한적 실시양태는 하기를 포함한다:

1. 하기 단계를 포함하는, 샘플 내 트롬보스폰딘 유형 1 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제, 멤버 13 (ADAMTS13) 효소 활성을 결정하기 위한 방법:

(a) 샘플을 ADAMTS13에 대한 외인성 펩티드 기질과 함께, ADAMTS13에 의한 외인성 펩티드 기질의 효소적 절단을 가능하게 하는 조건 하에 인큐베이션하여 효소적 절단 산물을 생산하는 단계;

(b) 효소적 절단 산물을 이온화하여 상기 절단 산물의 다중 하전된 기체-상 이온을 생성하는 단계; 및

(c) 상기 다중 하전된 기체-상 이온을 질량 분광측정법에 의해 분석하여 샘플 내 효소적 절단 산물의 존재 또는 양을 결정하며, 여기서 샘플 내 효소적 절단 산물의 존재 또는 양은 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 존재 또는 양을 나타내는 것인 단계.

2. 단락 1에 있어서, 단계 (a) 후에 그러나 단계 (b) 전에, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 단계 (b)는 부분적으로 정제된 효소적 절단 산물에 대해 수행되는 것인 방법.

3. 단락 2에 있어서, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계가 원심분리를 포함하며, 여기서 단계 (b)는 효소적 절단 산물을 포함하는 상청액에 대해 수행되는 것인 방법.

4. 단락 2에 있어서, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계가 효소적 절단 산물을 포함하는 용리액을 생성하기 위한 액체 크로마토그래피를 포함하며, 여기서 단계 (b)는 용리액에 대해 수행되는 것인 방법.

5. 단락 2에 있어서, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계가 효소적 절단 산물을 포함하는 용리액을 생성하기 위한 모세관 전기영동을 포함하며, 여기서 단계 (b)는 용리액에 대해 수행되는 것인 방법.

6. 단락 2에 있어서, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계가 효소적 절단 산물을 포함하는 용리액을 생성하기 위한 고체 상 추출을 포함하며, 여기서 단계 (b)는 용리액에 대해 수행되는 것인 방법.

7. 단락 2에 있어서, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계가 효소적 절단 산물을 포함하는 용리액을 생성하기 위한 여과를 포함하며, 여기서 단계 (b)는 용리액에 대해 수행되는 것인 방법.

8. 단락 2에 있어서, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계가 효소적 절단 산물을 포함하는 보유 분획을 생성하기 위한 여과를 포함하며, 여기서 단계 (b)는 보유 분획에 대해 수행되는 것인 방법.

9. 단락 2에 있어서, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계가 효소적 절단 산물의 친화성 강화의 사용을 포함하며, 여기서 단계 (b)는 친화성 강화된 효소적 절단 산물에 대해 수행되는 것인 방법.

10. 단락 9에 있어서, 친화성 강화 기술이 고정화된 금속 친화성 수지를 사용하는 것인 방법.

11. 단락 9에 있어서, 친화성 강화 기술이 항체를 활용하는 것인 방법.

12. 단락 9에 있어서, 친화성 강화 기술이 항체의 단편, 예컨대 Fab 단편을 활용하는 것인 방법.

13. 단락 9에 있어서, 친화성 강화 기술이 스트렙타비딘을 활용하는 것인 방법.

14. 단락 9에 있어서, 친화성 강화 기술이 단백질-G를 활용하는 것인 방법.

15. 단락 9에 있어서, 친화성 강화 기술이 단백질-A를 활용하는 것인 방법.

16. 단락 9에 있어서, 친화성 강화 기술이 압타머를 활용하는 것인 방법.

17. 단락 1에 있어서, 단계 (a) 및 (b) 사이에, 및 임의적으로 단락 2의 부분적 정제 단계 전에, 인큐베이션 중인 샘플에서 효소적 절단을 종결시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

18. 단락 17에 있어서, 종결시키는 단계가 침전 시약을 인큐베이션 중인 샘플에 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.

19. 단락 18에 있어서, 침전 시약이 메탄올을 포함하는 것인 방법.

20. 단락 18에 있어서, 침전 시약이 아세토니트릴을 포함하는 것인 방법.

21. 단락 18에 있어서, 침전 시약이 아세톤을 포함하는 것인 방법.

22. 단락 18에 있어서, 침전 시약이 2-프로판올을 포함하는 것인 방법.

23. 단락 18에 있어서, 침전 시약이 술페이트를 포함하는 것인 방법.

24. 단락 18에 있어서, 침전 시약이 트리클로로아세트산을 포함하는 것인 방법.

25. 단락 18에 있어서, 침전 시약이 과염소산을 포함하는 것인 방법.

26. 단락 17에 있어서, 종결시키는 단계가 인큐베이션 중인 샘플의 pH를 pH 5 미만으로 조정하는 것을 포함하는 것인 방법.

27. 단락 17에 있어서, 종결시키는 단계가 인큐베이션 중인 샘플의 pH를 pH 9 초과로 조정하는 것을 포함하는 것인 방법.

28. 단락 17에 있어서, 종결시키는 단계가 인큐베이션 중인 샘플을 50℃ 초과의 온도로 가열하는 것을 포함하는 것인 방법.

29. 단락 17에 있어서, 종결시키는 단계가 인큐베이션 중인 샘플을 15℃ 미만의 온도로 냉각시키는 것을 포함하는 것인 방법.

30. 단락 17에 있어서, 종결시키는 단계가 ADAMTS13의 억제제를 인큐베이션 중인 샘플에 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.

31. 단락 30에 있어서, 억제제가 에틸렌디아민테트라아세트산인 방법.

32. 단락 1에 있어서, 외인성 기질이 vWF73의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 유사성을 갖는 합성 펩티드인 방법.

33. 단락 1에 있어서, 외인성 펩티드 기질이 폰 빌레브란트 인자 서열에 대해 적어도 70% 서열 유사성을 갖는 것인 방법.

34. 단락 1에 있어서, 외인성 펩티드 기질이 ADAMTS13에 대한 절단 부위를 포함하는 것인 방법.

35. 단락 1에 있어서, 합성 펩티드 기질이 하나 이상의 친화성 태그를 포함하는 것인 방법.

36. 단락 35에 있어서, 하나 이상의 친화성 태그가 MYC-태그, FLAG-태그, 폴리His-태그 및 GST-태그로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

37. 단락 35에 있어서, 하나 이상의 친화성 태그가 항체에 대한 에피토프를 포함하는 것인 방법.

38. 단락 1에 있어서, 외인성 펩티드 기질이 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.

39. 단락 38에 있어서, 하나 이상의 비-천연 아미노산이 비오티닐화되는 것인 방법.

40. 단락 38에 있어서, 하나 이상의 비-천연 아미노산이 안정한 동위원소 표지된 아미노산인 방법.

41. 단락 1에 있어서, 효소적 절단 산물이 DREQAPNLVY의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.

42. 단락 1에 있어서, 단계 (b)가 전기분무 이온화, 대기압 화학적 이온화 및 대기압 광이온화로 이루어진 군으로부터 선택된 이온화 기술을 사용하여 효소적 절단 산물을 이온화하는 것을 포함하는 것인 방법.

43. 단락 1에 있어서, 분석하는 단계 (c)가 탠덤 질량 분광측정법을 사용하는 것인 방법.

44. 단락 1에 있어서, 분석하는 단계 (c)가 602.8±2, 182.1±2, 281.1±2, 462.7±2, 512.3±2, 600.3±2, 605.3±2, 811.4±2, 924.5±2 및 1023.5±2로 이루어진 군으로부터 선택된 m/z를 갖는 이온을 사용하는 것인 방법.

45. 단락 1에 있어서, 분석하는 단계 (c)가 ADAMTS13의 비활성을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.

46. 단락 1에 있어서, 내부 표준이 이온화 단계 (b) 전에 첨가되는 것인 방법.

47. 단락 46에 있어서, 내부 표준이 기질과 공동으로 첨가되는 것인 방법.

48. 단락 46에 있어서, 내부 표준이 인큐베이션 단계 (a) 전에 샘플에 첨가되는 것인 방법.

49. 단락 46에 있어서, 내부 표준이 인큐베이션 중인 샘플에 첨가되는 것인 방법.

50. 단락 46에 있어서, 내부 표준이 효소적 절단 산물의 동위원소 표지된 등가물인 방법.

51. 단락 46에 있어서, 내부 표준의 존재 또는 양이 단계 (c)에서의 효소적 절단 산물의 존재 또는 양과 함께 결정되는 것인 방법.

52. 단락 51에 있어서, 내부 표준의 결정된 양 및 효소적 절단 산물의 결정된 양 사이의 비가 단계 (a)에서 형성된 효소적 절단 산물의 양을 나타내는 것인 방법.

53. 단락 51에 있어서, 내부 표준의 결정된 양 및 효소적 절단 산물의 결정된 양 사이의 비가 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 양을 나타내는 것인 방법.

54. 단락 1에 있어서, 샘플이 환자로부터 수득된 생물학적 유체인 방법.

55. 단락 54에 있어서, 생물학적 유체가 혈장인 방법.

56. 단락 54에 있어서, 생물학적 유체가 혈청인 방법.

57. 단락 1, 2 및 17 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a) 및 (b) 사이에, 및 임의적으로 부분적 정제 단계 전에 또는 후에, 그러나 종결 단계 후에, 인큐베이션 중인 샘플에서 효소적 절단 산물의 분자 구조를 변형시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

58. 단락 57에 있어서, 변형시키는 단계가 효소적 절단 산물을 추가로 가수분해하는 것을 포함하는 것인 방법.

59. 단락 58에 있어서, 가수분해가 효소를 사용하여 수행되는 것인 방법.

60. 단락 59에 있어서, 효소가 트립신인 방법.

61. 단락 59에 있어서, 효소가 펩신인 방법.

62. 단락 59에 있어서, 효소가 LysC인 방법.

63. 단락 59에 있어서, 가수분해가 화학적 시약을 사용하여 수행되는 것인 방법.

64. 단락 63에 있어서, 화학적 시약이 포름산인 방법.

65. 단락 63에 있어서, 화학적 시약이 브로민화시아노겐인 방법.

66. 단락 57에 있어서, 효소적 절단 산물이 유도체화되는 것인 방법.

67. 단락 66에 있어서, 유도체화가 효소적으로 촉매되는 것인 방법.

68. 단락 66에 있어서, 유도체화가 화학적 첨가인 방법.

69. 하기 단계를 포함하는, 샘플 내 트롬보스폰딘 유형 1 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제, 멤버 13 (ADAMTS13) 효소의 활성의 양을 결정하기 위한 방법:

(a) 샘플을 ADAMTS13에 대한 합성 펩티드 기질 및 샘플에 대한 산물 펩티드의 동위원소 표지된 등가물과 함께, ADAMTS13에 의한 합성 펩티드 기질의 효소적 절단을 가능하게 하는 조건 하에 인큐베이션하는 단계;

(b) 인큐베이션 중인 샘플에서 효소적 절단을 종결시키는 단계;

(c) 액체 크로마토그래피 또는 또 다른 정제 기술을 사용하여 효소적 절단 산물 및 내부 표준을 샘플의 다른 구성성분으로부터 부분적으로 정제하는 단계; 및

(d) 부분적으로 정제된 효소적 절단 산물 및 표준을 질량 분광측정법에 의해 분석하여 샘플 내 효소적 절단 산물 및 내부 표준의 양을 결정하며, 여기서 효소적 절단 산물 및 내부 표준의 결정된 양의 비는 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 양을 나타내는 것인 단계.

70. 환자로부터 수득된 샘플에서 트롬보스폰딘 유형 1 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제, 멤버 13 (ADAMTS13) 효소의 감소된 활성과 연관된 질환 또는 병태를 진단하는데 유용한 보고서를 작성하는 방법이며, 임의의 상기 단락의 임의의 방법을 수행하는 것 및 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 양을 상술하는 보고서를 작성하는 것을 포함하는 방법.

71. 단락 70에 있어서, 질환 또는 병태가 혈전성 혈소판감소성 자반증인 방법.

72. 임의의 상기 단락의 임의의 방법을 수행하는 것을 포함하는, 대상체에서 혈전성 혈소판감소성 자반증을 진단하는 방법이며, 여기서 10% 정상 값 미만의 ADAMTS13 활성 수준은 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)을 고도로 나타내는 것인 방법.

73. 하기를 포함하는, 샘플 내 트롬보스폰딘 유형 1 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제, 멤버 13 (ADAMTS13) 효소의 활성을 결정하기 위한 시스템:

(a) 샘플을 ADAMTS13에 대한 외인성 펩티드 기질과 함께, ADAMTS13에 의한 외인성 펩티드 기질의 효소적 절단을 가능하게 하는 조건 하에 인큐베이션하여 효소적 절단 산물을 생성하기 위한 스테이션;

(b) 효소적 절단 산물을 이온화하여 상기 절단 산물의 다중 하전된 기체-상 이온을 생성하기 위한 스테이션; 및

(c) 다중 하전된 기체 상 이온을 질량 분광측정법에 의해 분석하여 샘플 내 효소적 절단 산물의 존재 및/또는 양을 결정하기 위한 스테이션으로서, 여기서 효소적 절단 산물의 양은 샘플 내 ADAMTS13의 활성을 나타내는 것인 스테이션.

74. 단락 73에 있어서, 액체 크로마토그래피를 사용하여 효소적 절단 산물을 크로마토그래피적으로 분리하기 위한 스테이션을 추가로 포함하는 시스템.

하기 실시예는 본원에 개시된 대상물의 대표적 실시양태를 실시하기 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 지침을 제공하도록 포함되어 있다. 본 개시내용 및 관련 기술분야의 일반적 수준에 비추어, 기술자들은 하기 실시예가 단지 예시적인 것으로 의도되고 수많은 변화, 변형, 및 변경이 본원에 개시된 대상물의 범주로부터 벗어나지 않으면서 이용될 수 있다는 것을 인지할 수 있다.

실시예

ADAMTS13 활성은 환자의 혈장을 합성 기질과 함께 최적화된 (즉, 비-생리학적) 조건 하에 인큐베이션함으로써 결정된다. vWF73이라고 명명된 합성 기질은 vWF 잔기 아스파르트산-1596 내지 아르기닌-1668의 천연 아미노산 서열로부터 유래된 73개 아미노산 잔기 펩티드이며, 이로써, ADAMTS13 절단 부위 (티로신-1605/메티오닌-1606)를 보유한다. 시험관내 vWF73의 절단 시, 10개 아미노산 잔기 산물 펩티드는 기질의 N-말단으로부터 형성되며, 산물 펩티드는 서열 DREQAPNLVY (서열식별번호: 4)를 갖는다. ADAMTS13 활성은 30분 인큐베이션 동안 생성된 산물 펩티드의 양에 비례하며, 이는 탠덤 질량 분광측정법 (MS/MS)과 커플링된 액체 크로마토그래피 (LC)를 사용하여 메탄올 침전 후 동위원소 희석에 의해 측정된다. 검정은 임상적으로 정상 개체로부터 유래된 풀링된 혈장을 사용하여 외부적으로 보정되고 혈장 내 ADAMTS13에 대한 WHO 제1 국제 표준 (12/252)에 대하여 표준화된다. "퍼센트 정상 활성"의 단위로 표현된 표준화된 ADAMTS13 활성은, 2 내지 100% 정상 활성에 스패닝되도록 합성 매트릭스를 함께 사용하여 풀링된 정상 혈장의 희석으로부터 생성된 외부 보정 곡전으로부터 외삽된다.

시편

권장된 샘플은 완충 나트륨 시트레이트 내에 분배된 0.1-0.8 mL 혈청 또는 혈장이다. 약 10 - 20 μL가 각각의 검정에 대해 사용된다. 혈청은 표준 샘플링 튜브 또는 분리 겔을 함유하는 튜브를 사용하여 수집된다. 혈청/혈장은 수집 1시간 이내에 세포로부터 제거되어 플라스틱 트랜스포트 튜브로 전달되어야 한다. 혈청 및 혈장은 사용될 때까지 -20℃에서 동결 저장되어야 한다.

시약 제조

ADAMTS13 검정을 위해, 생성 완충제 (10 mM 비스-트리스, 10 mM 염화칼슘, pH 6.0)를 사용한다.

50 μg/mL에서의 DRE 펩티드 및 내부 표준 (IS), NH2-DREQAPNL*VY-OH (서열식별번호: 5) L* = [¹⁵N, ¹³C6]-류신) (SIL.vWF10)의 스톡 용액은 1 mL의 0.001% 쯔비터젠트 3-16을 NAT.vWF10 또는 SIL.vWF10의 단일 0.05 mg 바이알에 직접적으로 첨가하여 50 μg/mL 농도를 생성함으로써 제조한다. 용액을 혼합하고 사용 전에 실온에서 적어도 15분 동안 유지한다. 용액을 2시간 이내에 사용하거나 또는 동결시키고, < -70℃에서 최대 2년 동안 안정하다.

기질 펩티드 (vWF73)의 스톡 기질 용액은 아미노산 분석에 의한 농도 할당 (전형적으로, 100 내지 1000 μmol/L)으로 30% 아세토니트릴, 0.1% 포름산 중에서 제조업체로부터 직접적으로 구입한다. 스톡 기질은 < -70℃에서 최대 2년 동안 저장될 수 있다.

vWF73의 서열은 하기 및 도 1-3에 제시된다.

작업 기질-내부 표준 혼합물 (900 nmol/L vWF73, 50 ng/mL) (SIL.vWF10)은 스톡 용액을 0.001% 쯔비터젠트 3 16 내로 적절하게 희석함으로써 제조한다. 이는 < -70℃에서 최대 3개월 동안 저장된다. 분취물은 2회의 동결/해동 후에 폐기한다.

0.001% 쯔비터젠트 3-16 중 작업 시스템 적합성 테스트 용액 (10 ng/mL NAT.vWF10)을 제조한다. 이는 < -70℃에서 최대 2년 동안 저장된다.

블랭크 매트릭스 (PBS 중 60 mg/mL BSA)를 제조한다.

풀링된 정상 혈장 (PNP)을 사용하여 낮은 품질 및 중간 품질 컷-오프 대조군을 생성한다. PNP를 제조하기 위해, 20명의 표면상 정상 개체로부터의 5회 반복 시편을 3.2% 나트륨 시트레이트 튜브 내로 수집한다 (총 100개의 시편). 시편을 정상 절차에 따라 처리하고, 임의의 용혈된 시편을 폐기하고, 풀링하고 즉시 사용하거나 또는 동결시킨다. 이들은 < -70℃에서 최대 2개월 동안 저장된다. 열 불활성 풀링된 정상 혈장 (HIPNP)을 제조하기 위해, PNP의 10 내지 50 mL 분취물을 12 내지 16시간 동안 56℃에서 수조에서 인큐베이션한다. HIPNP는 냉장 (2 - 8℃) 시 최대 1주 동안 또는 < -10℃에서 최대 1년 동안 저장될 수 있다.

보정 및 참조 표준

DRE 펩티드의 수량을 2% ADAMTS13 활성까지 연속 희석된 100% ADAMTS13을 갖는 PNP를 사용하여 생성된 보정 표준의 외부 표준 곡선과 비교한다. 허용되는 보정 곡선 피팅은 범위 전체에 걸쳐 85 내지 115%인 것으로서 정의된다. 추가적인 표준화는 참조 표준으로서 혈장 내 ADAMTS13에 대한 WHO 제1 국제 표준을 이용하며, 이는, 비희석된 경우에, 91.0% 활성을 나타낸다. 참조 표준에 대한 평균 회수는 90 내지 110%이어야 한다. 참조 표준 회수를 사용하여 캘리브레이터 값에 따라 조정한다. 예를 들어, 참조 표준 회수가 112.3%이면, 20% 캘리브레이터에 대한 할당된 값은 17.81% (20%/1.123)일 것이다.

매트릭스 대조군

하기 매트릭스 대조군 (QC)을 풀링된 정상 혈장 (PNP)에서 제조한다. QC의 제조에 사용된 PNP의 로트는 작업 캘리브레이터에 사용된 PNP의 로트와 상이하여야 한다.

낮은 QC는 PNP를 HI-PNP로 희석하여 정상 (즉, PNP)의 5-15% 사이의 평균 ADAMTS13 활성을 갖도록 제조한다. 중간 QC는 ADAMTS13 항체를 PNP 내로 첨가하여 약 1:50 항체 혼합물을 생성하고, 이어서 (추가적인 PNP로) 희석하여 20-40% 사이의 ADAMTS13 활성을 갖는 희석을 식별함으로써 제조한다.

ADAMTS13 검정 절차

수조를 45℃ (±3℃)로 예열하고, 블랭크, 표준, 대조군, 샘플, 및 동결된 시약을 주위 조건 하에 해동시킨다. 블랭크, 표준, 대조군 및 샘플의 13 μL의 분취물을 1.2-mL, 96 딥 웰 플레이트, (플레이트 A)의 별개의 웰 내로 피펫팅한다. 다음에, 생성 완충제의 923 μL의 분취물을 플레이트 A의 각각의 웰 내로 피펫팅한다. 이어서 플레이트를 (예를 들어, 호일로) 밀봉하고 시약이 혼합되도록 볼텍싱한다.

이 시점에서, 작업 기질/내부 표준 혼합물의 분취물 (25 μL)을 새로운 1.2-mL, 96 딥 웰 플레이트의 매칭 웰 (즉, 플레이트 B) 내로 첨가한다. 플레이트 둘 다는 이중 블랭크 (0.001% 쯔비터젠트 3-16)에 대한 웰을 포함한다. 이 시점에서, 플레이트 A로부터의 희석된 샘플 25 μL를 플레이트 B 내의 작업 기질/내부 표준으로 전달한다. 이어서 플레이트 B를 (예를 들어, 접착제 실란트로) 밀봉하고 원심분리 및 볼텍싱에 적용하여 완전 전달 및 혼합을 보장한다. 이어서 플레이트 B를 45℃ (±3℃) 수조에서 30분 (±1분) 동안 인큐베이션한다. 이어서 플레이트 B를 원심분리하고 메탄올 250 μL를 각각의 웰에 첨가하여 반응을 종결시킨다.

이 시점에서 샘플은 LC/MS-MS 분석을 위한 준비를 한다. 웰을 (예를 들어, 호일로) 밀봉한 후에 샘플 (즉, 플레이트 B)을 볼텍싱하고 (5분) 원심분리한다 (예를 들어, 약 3250 rpm에서 10분). 이어서 상청액의 각각의 샘플 (200 μL)의 분취물을 플레이트 B에서 새로운 플레이트, 플레이트 C로 전달한다. (예를 들어, 호일로) 밀봉한 후에, 샘플을 냉각시키고, LC-MS/MS에 적용한다. LC는 아세토니트릴 구배를 갖는 역상 C18 고정상을 이용한다. 로딩은 로딩을 개선시키기 위한 추가적인 수성 시약을 적용하기 위한 제2 펌프를 포함한다. DMSO는 아세토니트릴 구배에 포함될 수 있다. MS/MS는 2개의 정성자 (즉, 추가적인 단편)를 이용하여, 하기 표 1에 제시된 바와 같이, 정량자 신호가 오염물(들)에 의해 손상되지 않는다는 것을 보장한다.

표 1. 분석물 및 내부 표준 검출

분석적 측정가능한 범위

검증 시 결정된 바와 같은 정량 하한치 (LLOQ) 및 정량 상한치 (ULOQ)는 하기 표 2에 열거된다.

표 2. 정량 한계

임상적으로 보고가능한 범위

검증 시 결정된 바와 같은 보고가능한 하한치 (LRL) 및 상한치 (URL)는 하기 표 3에 열거된다.

표 3. 보고가능한 한계

참조 구간 & 해석

하기인 것으로 검정의 검증 동안 확립된 정상 참조 구간: >66% 정상 ADAMTS13 활성. 66% 미만의 수준은 기저 병태를 시사한다.

본 발명의 바람직한 실시양태가 예시되고 기재되었지만, 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 이에 대한 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 인지될 것이다. 본 출원에 지칭된 모든 인쇄된 특허 및 공개는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Laboratory Corporation of America Holdings <120> Methods and Systems for Determining ADAMTS13 Enzyme Activity <130> 057618-1046892 <150> 62406693 <151> 2016-10-11 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2050 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp 1 5 10 15 Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr 20 25 30 Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro 35 40 45 Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys 50 55 60 Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys 65 70 75 80 Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Gln Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr 85 90 95 Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr 100 105 110 Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr 115 120 125 Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile 130 135 140 Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys 145 150 155 160 Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly 165 170 175 Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val 180 185 190 Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser 195 200 205 Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr 210 215 220 Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln 225 230 235 240 Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val 245 250 255 Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg 260 265 270 Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met 275 280 285 Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val 290 295 300 Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 305 310 315 320 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys 325 330 335 Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly 340 345 350 Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu 355 360 365 Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn 370 375 380 Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu 385 390 395 400 Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro 405 410 415 Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp 420 425 430 Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys 435 440 445 Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys 450 455 460 Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu 465 470 475 480 Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val 485 490 495 Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu 500 505 510 Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala 515 520 525 Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu 530 535 540 Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp 545 550 555 560 Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu 565 570 575 Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala 580 585 590 Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys 595 600 605 Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala Ser 610 615 620 Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly 625 630 635 640 Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His 645 650 655 Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn 660 665 670 Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp 675 680 685 Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro 690 695 700 Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu 705 710 715 720 Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val 725 730 735 Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn 740 745 750 Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly 755 760 765 Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr 770 775 780 Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln 785 790 795 800 Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly 805 810 815 Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly 820 825 830 Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro 835 840 845 Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro 850 855 860 Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly 865 870 875 880 Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg 885 890 895 Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu 900 905 910 Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp 915 920 925 Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe 930 935 940 Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile 945 950 955 960 Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr 965 970 975 Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu 980 985 990 Ser Leu Val Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly 995 1000 1005 Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His 1010 1015 1020 Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr 1025 1030 1035 Asp Val Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg 1040 1045 1050 Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr 1055 1060 1065 Asp Ala Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser 1070 1075 1080 Asn Val Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val 1085 1090 1095 Thr Leu Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val 1100 1105 1110 Arg Ile Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp 1115 1120 1125 Val Trp Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro 1130 1135 1140 Asp Gly Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg 1145 1150 1155 Gly Leu Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val 1160 1165 1170 Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr 1175 1180 1185 Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe 1190 1195 1200 Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu 1205 1210 1215 Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly 1220 1225 1230 Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala 1235 1240 1245 Leu Ser Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly 1250 1255 1260 Arg Leu Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn 1265 1270 1275 Val Tyr Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly 1280 1285 1290 His Ile Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln 1295 1300 1305 Leu Ser Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly 1310 1315 1320 Ile Cys Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly 1325 1330 1335 Thr Val Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val 1340 1345 1350 Gln Arg Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys 1355 1360 1365 Leu Val Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu 1370 1375 1380 Phe Ala Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala 1385 1390 1395 Ile Cys Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val 1400 1405 1410 Ile Ala Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val 1415 1420 1425 Asp Trp Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser 1430 1435 1440 Leu Val Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp 1445 1450 1455 Gly Asn Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe 1460 1465 1470 Cys Pro Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu 1475 1480 1485 Glu Ala Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln 1490 1495 1500 Phe Leu Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys 1505 1510 1515 Thr Cys Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys 1520 1525 1530 Pro Thr Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg 1535 1540 1545 Leu Arg Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val 1550 1555 1560 Cys Asp Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu 1565 1570 1575 Arg Gly Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro 1580 1585 1590 Asn Phe Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser 1595 1600 1605 Pro Pro Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr 1610 1615 1620 Gln Cys Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser 1625 1630 1635 Thr Val Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn 1640 1645 1650 Asp Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys 1655 1660 1665 Val His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu 1670 1675 1680 Gly Cys Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met 1685 1690 1695 Gly Leu Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser 1700 1705 1710 Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys 1715 1720 1725 Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro 1730 1735 1740 Arg Gly Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp 1745 1750 1755 Ala Ser Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val 1760 1765 1770 Lys Glu Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln 1775 1780 1785 Leu Glu Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys 1790 1795 1800 Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala 1805 1810 1815 Cys Met Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met 1820 1825 1830 Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val 1835 1840 1845 Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro 1850 1855 1860 Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys 1865 1870 1875 Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly 1880 1885 1890 Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys 1895 1900 1905 Asp Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp 1910 1915 1920 Glu Lys Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys 1925 1930 1935 Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys 1940 1945 1950 Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu 1955 1960 1965 Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp 1970 1975 1980 Ile His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser 1985 1990 1995 Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro 2000 2005 2010 Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly 2015 2020 2025 Ser Val Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys 2030 2035 2040 Ser Pro Arg Lys Cys Ser Lys 2045 2050 <210> 2 <211> 265 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala 1 5 10 15 Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro 20 25 30 Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser 35 40 45 Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu 50 55 60 Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp Ser Ile His Val Thr 65 70 75 80 Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu 85 90 95 Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr 100 105 110 Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser 115 120 125 Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn 130 135 140 Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg 145 150 155 160 Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala 165 170 175 Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu 180 185 190 Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu 195 200 205 Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro 210 215 220 Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly 225 230 235 240 Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala 245 250 255 Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile 260 265 <210> 3 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro 1 5 10 15 Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro 20 25 30 Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly 35 40 45 Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg 50 55 60 Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg 65 70 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 4 Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X = [13C,15N]-Leucine <400> 5 Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Xaa Val Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> artificial sequence <400> 6 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> artificial sequence <400> 7 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> artificial sequence <400> 8 His His His His His His 1 5

Claims

하기 단계를 포함하는, 샘플 내 트롬보스폰딘 유형 1 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제, 멤버 13 (ADAMTS13) 효소 활성을 결정하기 위한 방법:
(a) 샘플을 ADAMTS13에 대한 외인성 합성 펩티드 기질과 함께, ADAMTS13에 의한 외인성 합성 펩티드 기질의 효소적 절단을 가능하게 하는 조건 하에 인큐베이션하여 효소적 절단 산물을 생산하는 단계;
(b) 효소적 절단 산물을 이온화하여 상기 절단 산물의 다중 하전된 기체-상 이온을 생성하는 단계; 및
(c) 상기 다중 하전된 기체-상 이온을 탠덤(tandem) 질량 분광측정법에 의해 분석하여 샘플 내 효소적 절단 산물의 존재 또는 양을 결정하며, 여기서 샘플 내 효소적 절단 산물의 존재 또는 양은 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 존재 또는 양을 나타내는 것인 단계.
제1항에 있어서, 단계 (a) 후에 그러나 단계 (b) 전에, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 단계 (b)는 부분적으로 정제된 효소적 절단 산물에 대해 수행되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계가 원심분리를 포함하며, 여기서 단계 (b)는 효소적 절단 산물을 포함하는 상청액에 대해 수행되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계가 효소적 절단 산물을 포함하는 용리액을 생성하기 위한, 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동 및 고체 상 추출 또는 여과 중 하나 이상을 포함하며, 여기서 단계 (b)는 용리액에 대해 수행되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계가 효소적 절단 산물을 포함하는 보유 분획을 생성하기 위한 여과를 포함하며, 여기서 단계 (b)는 보유 분획에 대해 수행되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 효소적 절단 산물을 부분적으로 정제하는 단계가 효소적 절단 산물의 친화성 강화의 사용을 포함하며, 여기서 단계 (b)는 친화성 강화된 효소적 절단 산물에 대해 수행되는 것인 방법.
제6항에 있어서, 친화성 강화 기술이 고정화된 금속 친화성 수지, 항체, 항체 단편, 스트렙타비딘, 단백질-G, 단백질-A 또는 압타머 중 하나 이상을 사용하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 단계 (a) 및 (b) 사이에, 및 임의적인 부분적 정제 단계 전에, 인큐베이션 중인 샘플에서 효소적 절단을 종결시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 종결시키는 단계가 침전 시약을 인큐베이션 중인 샘플에 첨가하는 것; 인큐베이션 중인 샘플의 pH를 pH 5 미만 또는 pH 9 초과로 조정하는 것; 인큐베이션 중인 샘플을 50℃ 초과의 온도로 가열하는 것; 인큐베이션 중인 샘플을 15℃ 미만의 온도로 냉각시키는 것; 또는 ADAMTS13의 억제제를 인큐베이션 중인 샘플에 첨가하는 것 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 외인성 합성 펩티드 기질이 서열식별번호: 3에 대해 적어도 70% 서열 유사성을 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 효소적 절단 산물이 서열식별번호: 4를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (b)가 전기분무 이온화, 대기압 화학적 이온화 및 대기압 광이온화 중 적어도 하나를 포함하는 이온화 기술을 사용하여 효소적 절단 산물을 이온화하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 분석하는 단계 (c)가 602.8±2, 182.1±2, 281.1±2, 462.7±2, 512.3±2, 600.3±2, 605.3±2, 811.4±2, 924.5±2 및 1023.5±2 중 적어도 하나를 포함하는 질량/전하 비 (m/z)를 갖는 이온을 사용하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 분석하는 단계 (c)가 ADAMTS13의 비활성을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 내부 표준이 하기 시점: (i) 단계 (a) 전에; (ii) 단계 (a) 동안; 또는 (iii) 단계 (a) 후에, 그러나 단계 (b) 전에 중 어느 하나에서 샘플에 첨가되고, 내부 표준의 존재 또는 양이 단계 (c)에서의 효소적 절단 산물의 존재 또는 양과 함께 결정되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 내부 표준의 존재 또는 양이 단계 (c)에서의 효소적 절단 산물의 존재 또는 양과 함께 결정되고, 내부 표준이 효소적 절단 산물의 동위원소 표지된 등가물인 방법.
제16항에 있어서, 내부 표준의 결정된 양 및 효소적 절단 산물의 결정된 양 사이의 비가 단계 (a)에서 형성된 효소적 절단 산물의 양 및/또는 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 양을 나타내는 것인 방법.
제1항에 있어서, 샘플이 환자로부터 수득된 생물학적 유체의 샘플인 방법.
제18항에 있어서, 생물학적 유체가 혈장 또는 혈청인 방법.
제8항에 있어서, 단계 (a) 및 (b) 사이에, 및 임의적인 부분적 정제 단계 전에 또는 후에, 그러나 종결 단계 후에, 효소적 절단 산물의 분자 구조를 변형시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제20항에 있어서, 변형시키는 단계가 효소적 절단 산물을 추가로 가수분해하는 것을 포함하는 것인 방법.
제21항에 있어서, 가수분해가 효소 또는 화학적 시약을 사용하여 수행되는 것인 방법.
제21항에 있어서, 가수분해가 트립신, 펩신, LysC, 포름산 또는 브로민화시아노겐 중 적어도 하나를 사용하여 수행되는 것인 방법.
제20항에 있어서, 효소적 절단 산물이 변형시키는 단계 동안 유도체화되는 것인 방법.
제24항에 있어서, 유도체화가 효소적으로 촉매화된 유도체화 또는 화학적 첨가인 방법.
제1항에 있어서, 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 양을 상술하는 보고서를 작성하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 샘플은 환자로부터 수득된 것이고, 여기서 보고서는 환자에서 트롬보스폰딘 유형 1 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제, 멤버 13 (ADAMTS13) 효소의 감소된 활성과 연관된 질환 또는 병태를 진단하는데 유용한 것인 방법.
제26항에 있어서, 질환 또는 병태가 혈전성 혈소판감소성 자반증인 방법.
하기 단계를 포함하는, 샘플 내 트롬보스폰딘 유형 1 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제, 멤버 13 (ADAMTS13) 효소의 활성의 양을 결정하기 위한 방법:
(a) 샘플을 ADAMTS13에 대한 합성 펩티드 기질 및 절단 산물 펩티드의 동위원소 표지된 등가물과 함께, ADAMTS13에 의한 합성 펩티드 기질의 효소적 절단을 가능하게 하는 조건 하에 인큐베이션하여 비표지된 절단 산물 펩티드를 형성하는 단계;
(b) 인큐베이션 중인 샘플에서 효소적 절단을 종결시키는 단계;
(c) 효소적 절단 산물 및 내부 표준을 샘플의 다른 구성성분으로부터 부분적으로 정제하는 단계; 및
(d) 부분적으로 정제된 효소적 절단 산물 및 표준을 탠덤 질량 분광측정법에 의해 분석하여 샘플 내 효소적 절단 산물 및 내부 표준의 양을 결정하며, 여기서 효소적 절단 산물 및 내부 표준의 결정된 양의 비는 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 양을 나타내는 것인 단계.
하기 단계를 포함하는, 대상체에서 혈전성 혈소판감소성 자반증을 진단하기 위한 정보를 수집하는 방법이며:
(a) 대상체로부터 수득된 샘플을 ADAMTS13에 대한 외인성 합성 펩티드 기질과 함께, ADAMTS13에 의한 외인성 합성 펩티드 기질의 효소적 절단을 가능하게 하는 조건 하에 인큐베이션하여 효소적 절단 산물을 생산하는 단계;
(b) 효소적 절단 산물을 이온화하여 상기 절단 산물의 다중 하전된 기체-상 이온을 생성하는 단계; 및
(c) 상기 다중 하전된 기체-상 이온을 탠덤 질량 분광측정법에 의해 분석하여 샘플 내 효소적 절단 산물의 존재 또는 양을 결정하며, 여기서 샘플 내 효소적 절단 산물의 존재 또는 양은 샘플 내 ADAMTS13의 활성의 존재 또는 양을 나타내는 것인 단계,
여기서 10% 정상 값 미만의 ADAMTS13 활성 수준은 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)을 고도로 나타내는 것인 방법.
하기를 포함하는, 샘플 내 트롬보스폰딘 유형 1 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제, 멤버 13 (ADAMTS13) 효소의 활성을 결정하기 위한 시스템:
(a) 샘플을 ADAMTS13에 대한 외인성 합성 펩티드 기질과 함께, ADAMTS13에 의한 외인성 합성 펩티드 기질의 효소적 절단을 가능하게 하는 조건 하에 인큐베이션하여 효소적 절단 산물을 생성하기 위한 스테이션;
(b) 효소적 절단 산물을 이온화하여 상기 절단 산물의 다중 하전된 기체-상 이온을 생성하기 위한 스테이션; 및
(c) 다중 하전된 기체 상 이온을 탠덤 질량 분광측정법에 의해 분석하여 샘플 내 효소적 절단 산물의 존재 및/또는 양을 결정하기 위한 스테이션으로서, 여기서 효소적 절단 산물의 양은 샘플 내 ADAMTS13의 활성을 나타내는 것인 스테이션.
제30항에 있어서, 액체 크로마토그래피를 사용하여 효소적 절단 산물을 크로마토그래피적으로 분리하기 위한 스테이션을 추가로 포함하는 시스템.
삭제