KR20170032400A - 혈청 샘플에서의 당단백질의 글리칸의 개선된 맵핑 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포유동물 액체 샘플에서 재조합 당단백질의 글리칸을 분석하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 방법은 샘플로부터 재조합 당단백질을 친화도 정제하는 단계, 고정된 당단백질로부터 글리칸 함유 단편을 효소에 의해 방출시키는 단계, 동위원소 표지된 글리칸을 함유하는 참조 표준물질을 첨가하는 단계, 글리칸을 형광 표지하는 단계, 및 LC-MS를 사용하여 글리칸을 분석하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 액체 샘플을 예비-제거하는 단계 및 고정된 재조합 당단백질 단편으로부터 글리칸을 방출시키는 단계를 추가로 포함하는 고정된 재조합 당단백질 단편의 글리칸을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 관한 것이다. 방법은 96-웰 플레이트 샘플 제조와 같이 작은 샘플 부피의 사용 및 고처리량 작동 가능성을 허용하고, 따라서 임상 또는 전임상 연구에서 포유동물에서의 재조합 당단백질의 약동학적 파라미터를 측정하는데 적합하다.

Description

혈청 샘플에서의 당단백질의 글리칸의 개선된 맵핑 방법{IMPROVED METHOD OF MAPPING GLYCANS OF GLYCOPROTEINS IN SERUM SAMPLES}

본 발명은 포유동물 액체 샘플에서 재조합 당단백질의 글리칸을 분석하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 방법은 샘플로부터 재조합 당단백질을 친화도 정제하는 단계, 고정된 당단백질로부터 글리칸 함유 단편을 효소에 의해 방출시키는 단계, 동위원소 표지된 글리칸을 함유하는 참조 표준물질을 첨가하는 단계, 글리칸을 형광 표지하는 단계, 및 LC-MS를 사용하여 글리칸을 분석하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 액체 샘플을 예비-제거하는 단계 및 고정된 재조합 당단백질 단편으로부터 글리칸을 방출시키는 단계를 추가로 포함하는 고정된 재조합 당단백질 단편의 글리칸을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 특히 임상 또는 전임상 연구에서 포유동물에서의 생물의약품과 같은 재조합 당단백질의 약동학적 파라미터를 측정하는데 적합하다. 본 발명은 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법, 바람직하게는 역상 나노-액체 크로마토그래피-질량 분광분석법 (RP-나노-LC-MS) 기술과 함께 사용될 수 있다. 이 방법은 96-웰 플레이트 샘플 제조와 같이 작은 샘플 부피의 사용 및 고처리량 작동 가능성을 허용한다. 또한, 이 방법은 높은 감도를 제공하고 글리칸 구조를 개별적으로 분석할 수 있도록 한다.

생물학적 약물은 가장 복잡한 의약품에 속한다. 중요한 생물학적 약물 중의 한 클래스는 당단백질, 특히 약 150 kDa의 분자 질량을 갖는 전형적인 당단백질인 모노클로날 항체 (mAb)이다. 최근 몇 년간, 몇 가지의 연구에서 이들 구조가 대응하는 생물학적 약물의 안전성 및 효능에 영향을 미칠 수 있다는 사실이 밝혀짐에 따라, 치료용 단백질의 글리코실화에 초점이 맞춰졌다. 또한, 약동학 (PK)에 대한 글리칸 구조의 가능한 효과가 관심을 끌고 있다.

IgG는 그의 Fc 부분에서, 대체로 아미노산 297 주위에서 각각의 중쇄 상에 보존된 N-글리코실화 부위를 갖는다. 이들 부위에 부착된 N-글리칸의 이질성은 매우 높고, 12개 초과의 상이한 글리칸이 발견될 수 있다. 이 혼합물로부터의 글리칸의 확인 및 정량은 복잡하고, 포괄적인 분석 방법을 필요로 한다. 여러 글리칸의 구조 이성질체는 식별을 훨씬 더 어렵게 만든다.

N-글리코실화는 생물의약품의 안전성 및 효능에 대한 중요한 문제이고, 치료용 항체 또는 치료용 Fc-융합 단백질과 같은 당단백질의 약동학에 영향을 미칠 가능성이 있다. 따라서, 약동학에서 당단백질의 개별 글리칸 구조를 포괄적으로 분석하는 것이 필요하다. Fc 글리칸에 대한 관심은 다음과 같은 주요 주제를 수반한다: 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)에서의 Fc 글리칸의 역할 및 말단 갈락토스 잔기에 결합하는 아시알로당단백질 수용체 또는 말단 만노스 및 N-아세틸글루코사민 잔기에 결합하는 만노스 수용체와 같은 당수용체의 결과로서 순환계로부터의 제거율에 대한 글리칸의 역할.

N-글리코실화는 액체 크로마토그래피, 질량 분광분석법 또는 두 기술의 조합을 사용하여 PNGaseF에 의한 글리칸의 효소에 의한 방출 후에 연구될 수 있다 (Chen and Flynn, Analytical Biochemistry 2007, 370, 147-61). 감도를 높이기 위해, N-글리칸은 종종 형광 표지로 유도체화된다. N-글리칸의 정량 분석을 위해, 환원성 아민화를 통해 형광 염료로 표지하는 것이 널리 사용되고, 고감도를 제공한다. 모든 N-글리칸은 크기 또는 분지화와 무관하게 하나의 표지만을 보유하고, 따라서 형광 신호 강도로부터 정량적인 정보를 얻을 수 있다. 태그는 UV 또는 형광 검출을 제공할 뿐만 아니라, 전기분무 이온화의 효율을 향상시킬 수 있다. 시알산 함유 글리칸의 분석을 위해, 2-아미노벤조산 (2-AA) 또는 8-아미노나프탈렌-1,3,6-트리술폰산 (ANTS)과 같은 음으로 하전된 태그를 사용한 표지화, 및 음이온화 모드에서의 MS 검출이 자주 사용된다 (Prien et al., Analytical Chemistry 2010, 82, 1498-508).

MS에서 음이온화와 함께 음으로 하전된 표지화는 산성 N-글리칸을 분석하는데 자주 사용되어 왔다 (Prien et al., Glycobiology 2010, 20, 629-47). 올리고만노스 구조의 특성 규명을 위해, 2-AA 유도체화된 N-글리칸은 역상 크로마토그래피와 음성 모드 질량 분광분석의 조합에 의해 분석되었다 (Prien et al., Glycobiology 2010, 20, 629-47).

WO 2014/060551에는, 하나의 방법에 RP-LC-MS에 의한 중성 및 산성 N-글리칸의 효율적이고 민감한 분석이 기재되어 있다. 이전의 방법은 올리고 만노스형 N-글리칸의 이성질체 분리에 주로 제한되어 왔다. WO 2014/060551에서는, 포름산을 사용하는 산성 조건 하에 역상 액체 크로마토그래피 (RP-LC) 컬럼을 사용하여 분리하기 전에 안트라닐산 (2-AA)을 사용하여 N-글리칸을 표지한다. 음으로 하전된 2-AA는 RP-LC에서 2-아미노 벤즈아미드 (2-AB)보다 역상 컬럼에서 더 강하게 유지되고, 2-AA로 표지된 N-글리칸의 효율적인 이온화 및 검출을 가능하게 한다. RP-LC에 사용된 산성 조건은 이온쌍 형성 시약을 필요로 하지 않으면서 말단 시알릴화를 보유하는 산성 2-AA N-글리칸의 효율적인 분리를 유도한다. 이 방법은 RP-나노-LC-MS 및 아토몰 수준의 (attomolar) 민감도 및 고처리량을 허용하는 96-웰 플레이트 샘플 제조와 함께 사용할 수 있다.

N-글리코실화 분석은 단백질 분자에 부착된 무수한 N-글리칸 변이체 및 그의 상대적인 양의 큰 차이 때문에 복잡하다. 예를 들어, 재조합 인간 IgG 항체의 경우, 개별적인 올리고만노스 N-글리칸의 상대적인 양은 0.02% 내지 가장 풍부한 N-글리칸의 경우의 70% 초과일 수 있고, 그 차이는 10³의 차이를 포괄한다 (Higel et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry 2013, 405, 2481-93). N-글리칸 분석에 자주 사용되는 기술은 CE, HPAEC-PAD, HPLC, MALDI 및 ESI-MS 및 이러한 기술의 다양한 조합이다 (Marino et al., Nature Chemical Biology 2010, 6, 713-23). LC-MS는 LC가 글리칸 혼합물을 분리할 수 있기 때문에 유리한 조합이고; 이후에 글리칸 변이체는 온-라인 (on-line) MS에 의해 개별적으로 확인되고 정량될 수 있다. 그러나, 다양한 분석 응용 분야에 있어서, 통상적인 LC-MS는 특히 샘플의 양이 강하게 제한되는 경우, 충분히 민감하지 않을 수 있다. 생물의약품 개발 초기 (클론 또는 풀 선택) 및 전임상 연구 동안, 미세 역가 플레이트로부터 단지 미량의 재조합 단백질만이 대체로 단백질 및 글리칸 분석을 위해 이용가능하다. 글리코실화된 생물의약품의 약동학에 대한 글리칸 변이체의 영향을 연구하기 위해, 관심 재조합 당단백질은 또한 샘플, 예를 들어, 혈청에, 그 대부분이 또한 글리코실화된 다른 단백질과 혼합된 상태로 존재한다. 또한, 관심 재조합 당단백질의 양은 시간이 지남에 따라 감소한다. 따라서, 높은 감도, 특이성 및 낮은 샘플 소비가 요구된다. 일반적으로, 많은 샘플 수가 존재하기 때문에, 관심 당단백질은 이상적으로는 고처리량 방식으로 재현가능한 방식으로 샘플로부터 분리되어야 하고, 일련의 샘플 내의 개별 샘플의 분석은 서로 대등하여야 한다. 더욱이, 당단백질은 하나 초과의 N-글리코실화 부위를 가질 수 있고, 여기서 각각의 글리코실화 부위에서 글리칸 구조가 상이하다.

단백질체학에서, 예를 들어 나노-LC-MS의 사용에 의해 분석 시스템의 규모를 줄임으로써 샘플 용량의 한계를 피할 수 있었다. 나노 LC-MS의 사용에 의한 N-글리칸 분석은 문헌에서 보기 힘들다. 3개의 조사가 글리칸 분석을 위한 나노-LC의 실현가능성을 보고하였다. 우러 (Wuhrer) 등은 올리고당 분석을 위해 HILIC-MS를 나노 수준으로 소형화하였다 (Wuhrer et al., Analytical Chemistry 2004, 76, 833-8). 이들은 펨토몰 (femtomolar) 감수성으로 유도체화된 N-글리칸을 분석하였다. 글리칸 유도체화를 피함으로써 샘플 제조가 단축되지만, 표지에 따른 개선된 MS 검출의 이점은 상실된다 ([Wuhrer et al., Analytical Chemistry 2004, 76, 833-8]; [Ruhaak et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry 2010, 397, 3457-81]). 칼레이 (Kalay) 등은 2-AB N-글리칸을 분석하기 위해 온-라인 형광을 이용한 정상 상 나노 규모 HPLC-MS를 사용하였다 (Analytical Biochemistry 2012, 423, 153-162). 이들의 방법은 우수한 크로마토그래피 분해능을 달성하기 위해 길고 시간 소모적인 구배를 유발하였다. 나노 역상 크로마토그래피 (나노-RPC)를 이용한 연구가 최근 발표되었다. 리타모 (Ritamo) 등은 과메틸화 N-글리칸을 분리하기 위해 나노-LC 시스템을 사용하였다 (Analytical and Bioanalytical Chemistry 2013, 405, 2469-80). 이들은 나노-RP-컬럼에서 다양한 구조 이성질체에 대한 분리를 달성하였다. 그러나, N-글리칸의 과메틸화는 복잡하고, 독성 시약이 사용되고, 부산물이 형성될 가능성이 있고, 따라서 일상적인 사용에 의문의 여지가 있다. 이전에 온-라인 MS를 이용한 RP-LC가 상이하게 환원 말단 표지된 N-글리칸의 분석에 광범위하게 적용될 수 있다고 보고되었다 ([Chen and Flynn, Analytical Biochemistry 2007, 370, 147-61]; [Prater et al., Analytical Biochemistry 2009, 385, 69-79] 참조). 단일 2-AA 표지된 N-글리칸에 대한 전반적인 민감도, 예를 들어 RP-나노-LC-MS를 사용하여 약 400 아토몰이 WO 2014/060551에 보고되었다. 이 방법은 96 웰 기반 샘플 제조 작업 흐름과 추가로 조합될 수 있다.

MS에 의한 단백질의 정량은 안정한 무거운 동위원소 펩티드 또는 단백질을 사용하여 종종 수행된다. 대조적으로 N-글리칸의 안정한 무거운 동위원소 표지는 진핵 세포의 복잡한 다중 연결된 동화 및 이화 탄수화물 경로로 인해 거의 불가능하다. 동위원소 표지된 단당류의 제어된 도입은 리신 또는 아르기닌과 같은 동위원소 표지된 아미노산의 혼입보다 훨씬 더 어렵다.

혈청 제거율에 대한 Fc 글리칸 변화의 영향을 결정하기 위한 시도로서, 전임상 또는 임상 약동학 (PK) 연구를 포함하여 순환계에서 IgG 분자를 제거할 때 글리칸의 역할을 다양한 그룹에서 조사하였다. 2개의 일반적인 방법이 이들 연구에서 사용되었다. 한 방법에서, 유전자 돌연변이, 대사 억제제의 첨가, 이 둘의 조합, 친화도 정제 또는 효소 처리를 통해 특정 글리칸 형태가 풍부한 항체가 제조되었다. 이어서, 이 항체 샘플을 동물에게 주사하여 전체 제거율에 대한 영향을 확인한다. 그러나, 이 방법은 풍부화 동안 분자의 유일한 변화가 글리칸 구조라는 가정 때문에 제한이 있다. 글리칸의 이질성은 또한 결과의 모호성을 초래할 수 있다. 또한, 동일한 생성물의 다른 변이체를 제조하고 투여할 필요가 있다. 따라서, 이 방법은 치료용 재조합 항체 또는 융합 단백질과 같은 생물의약품의 전임상 또는 임상 pK 연구에 적합하지 않다.

다른 방법에서, 약물이 투여된 후 글리칸 형태가 분석되고, 순환 시간을 갖는 글리칸 패턴의 변화가 제거율의 차이로 해석된다. 투여 후 수거 방법은 많은 글리칸 형태를 동시에 따를 수 있다. 단일 투여 샘플에 대한 변경이 추적되기 때문에, 특정 미세이질성 (microheterogeneity)의 영향을 모니터링할 수 있다. 본 발명자들이 아는 바로는, 이 방법은 인간에게만 사용되었지만, 샘플 크기가 더 제한적인 전임상 연구에 일반적으로 사용되는 보다 작은 포유동물에서는 사용되지 않았다. 그러나, 임상 시험에 필요한 샘플 크기의 감소 뿐만 아니라 생물의약품 개발에서의 가능한 한 이른 약동학에 대한 글리칸 분석이 바람직하다.

알레싼드리 (Alessandri) 등 (mAbs, 2012, 4(4), 509-520)은 인간 PK 연구로부터 얻은 혈청 샘플로부터 재조합 모노클로날 IgG1 항체를 분석하였다. 항체는 혈청으로부터 세파로스 비드에 가교결합된 그의 리간드를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 글리칸은 산 용리된 항체로부터 방출되고, 2-아미노 벤즈아미드 (2-AB)로 표지되고, 정상 상 고처리량 액체 크로마토그래피에 의해 분석되었다. 그러나, 이 검정은 매우 높은 샘플 부피를 사용한 투여 후에 단지 14일까지만 분석할 수 있었고, 다른 혈청 단백질과의 오염이 일어나기 쉬웠다.

첸 (Chen) 등 (Glycobiology 2009, 19 (3), 240-249)은 인간의 약동학 연구를 위한 혈청 샘플에서 모노클로날 항체를 분석하였다. 항체는 수지에 가교결합된 리간드를 사용하여 친화도 정제하고 산으로 용리시켰다. 방출된 글리칸을 2-아미노 벤즈아미드 (2-AB)로 표지하고, RP-HPLC/MS로 분석하였다. 이 단리 방법은 혈청으로부터 특정 항체의 70%만을 얻을 수 있었다. 또한, 이 방법은 하나 초과의 글리코실화 부위를 갖는 당단백질에 대해 다른 혈청 단백질으로부터 방출된 글리칸 또는 동일 분자의 다른 글리칸으로부터 간섭을 받을 수 있다.

괴체 (Goetze) 등 (Glycobiology 2011, 21(7), 949-959)은 인간의 약동학 연구를 위한 혈청 샘플에서 모노클로날 IgG1 및 IgG2 항체를 분석하였다. 항체는 수지에 가교결합된 각각의 리간드를 사용하여 친화도 정제되었다. 항체를 산으로 용리시키고, 엔도프로테이나제 Lys-C 또는 트립신으로 소화시켰다. 글리코실화된 펩티드를 LC-MS/MS를 사용하여 분석하였다. 이 방법은 인간 IgG1 또는 인간 IgG2의 컨센서스 Fc 글리코실화에 특이적이라는 이점을 제공한다. 적용된 펩티드 맵핑 방법은 간섭하는 불순물의 잠재적 풀을 분석되는 mAb와 동일한 서브클래스의 내인성 IgG로만 감소시킨다. 그러나, 이 방법은 예를 들어 설치류를 사용하는 전임상 연구에서와 같이 종종 이용할 수 없는 0.5 ml의 샘플 부피가 필요로 한다. 또한, 이 분석은 단일 N-글리칸 구조의 독립적인 분석을 위한 것이 아니라, 단지 샘플 내의 N-글리칸 구조의 상대적인 비율을 결정하는 것만을 허용한다.

이들 방법 중 어느 것도 융합 단백질의 두 도메인에서와 같이 글리코실화 부위에서 구조적 차이를 갖는 하나 초과의 글리코실화 부위를 포함할 수 있는 항체 이외의 다른 재조합 당단백질을 분석하지 못하였다. 또한, 샘플 내의 글리칸의 비율보다는, 혈청과 같은 일련의 포유동물 샘플에서 재조합 당단백질의 개별적인 글리칸을 분석하는 방법에 대한 필요성이 존재하였다. 적은 샘플 소비 및 샘플 제조가 고처리량 방식으로 작동할 수 있도록 높은 감도가 또한 필요하였다.

따라서, 본 발명은 a) 관심 재조합 당단백질을 포함하는 2개 이상의 포유동물 액체 샘플을 제공하는 단계; b) 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질을, 샘플 내의 재조합 당단백질에 특이적인 친화성 리간드에 커플링된 별개의 고체 지지체 상에 고정시키는 단계; c) 재조합 당단백질의 효소 절단에 의해 고체 지지체로부터 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편을 별개의 용리액으로 방출시키는 단계; d) 임의로, 별개의 용리액에서 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편으로부터 글리칸을 방출시키는 단계; e) 각각의 상기 샘플의 글리칸을 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지하는 단계; 및 f) LC-MS를 사용하여 각각의 상기 샘플의 단계 e)의 표지된 글리칸을 별개로 분석하고, 상기 2개 이상의 샘플을 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 형광 표지의 제2 안정한 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 참조 표준물질이 단계 c), d), e) 또는 f) 전에 각각의 상기 샘플에 첨가되고, 참조 표준물질은 단계 f)의 표지된 글리칸과 함께 분석되는 것인, 포유동물 액체 샘플에서 관심 재조합 당단백질의 글리칸을 분석하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 단계 c)에서 고체 지지체에 고정된 채로 남아있는 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 제2 글리칸 함유 단편의 글리칸을 분석하는 단계를 추가로 포함하고, 이 단계는 aa) 단계 b) 전에 고체 지지체에 비-특이적으로 결합하는 당단백질을 제거하기 위해 2개 이상의 포유동물 액체 샘플을 각각 예비-제거하는 단계; dd) 단계 c) 이후에 고체 지지체 상에 남아있는 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 고정된 제2 글리칸 함유 단편으로부터 글리칸을 별개의 용액으로 방출시키는 단계; ee) 각각의 상기 샘플의 글리칸을 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지하는 단계; 및 ff) LC-MS를 사용하여 각각의 상기 샘플의 단계 ee)의 표지된 글리칸을 별개로 분석하고, 상기 2개 이상의 샘플을 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 형광 표지의 제2 안정한 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 참조 표준물질이 단계 dd), ee) 또는 ff) 전에 각각의 상기 샘플에 첨가되고, 참조 표준물질은 단계 ff)의 표지된 글리칸과 함께 분석되는 것인 방법에 관한 것이다. 예비-제거 단계 aa)는 샘플을 고체 지지체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 고체 지지체는 단계 b)에서 사용된 고체 지지체와 동일한 물질로 제조되지만, 상기 친화성 리간드에 커플링되지 않는다.

본 발명에 따르면, 분석되는 글리칸은 고만노스형, 하이브리드형 또는 복합형 N-글리칸으로 이루어진 군으로부터 선택된 N-글리칸일 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 형광 표지는 안정한 가벼운 및 안정한 무거운 동위원소 변이체를 갖고, 예를 들어 2-아미노 벤즈아미드 (2-AB) 또는 2-아미노벤조산 (2-AA)일 수 있다. 바람직하게, 형광 표지는 ¹²[C] 및 ¹³[C] 동위원소 쌍, 보다 바람직하게는 ¹²[C₆] 및 ¹³[C₆] 동위원소 쌍, 훨씬 더 바람직하게는 ¹²[C₆]-2-아미노벤조산 (¹²[C₆]-2-AA) 및 ¹³[C₆]-2-아미노벤조산 (¹³[C₆]-2-AA) 동위원소 쌍이다.

본 발명에 따른 방법에 사용되는 참조 표준물질은 형광 표지의 안정한 (제2) 동위원소로, 바람직하게는 형광 표지의 안정한 무거운 동위원소로 표지된 글리칸을 포함한다. 바람직하게는, 참조 표준물질은 샘플에서 분석된 것과 적어도 동일한 글리칸 구조를 포함한다. 참조 표준물질은 글리칸 구조를 개별적으로 분석할 수 있게 한다.

본 발명의 방법에서 분석되는 재조합 당단백질은 바람직하게는 융합 단백질 또는 항체, 보다 바람직하게는 Fc-융합 단백질 또는 항체이다. 재조합 단백질이 Fc-융합 단백질 또는 항체인 실시양태에서, 단계 c)에서 고체 지지체로부터 방출된 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편은 바람직하게는 Fc 도메인이다.

하나의 실시양태에서, 재조합 당단백질은 항체이고, 항체의 가변 영역은 고체 지지체 상에 고정된 친화성 리간드에 결합하고, 바람직하게는 친화성 리간드는 항원이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 IgG 항체, 보다 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 항체이고, 훨씬 더 바람직하게는 인간 또는 인간화된 IgG1 또는 IgG2 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 재조합 당단백질은 Fc-도메인 및 이펙터 도메인을 포함하는 Fc-융합 단백질이고, 이펙터 도메인은 고체 지지체 상에 고정된 친화성 리간드에 결합하고, 여기서 친화성 리간드는 Fc-융합 단백질의 이펙터 도메인에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 또는 항체이다.

재조합 당단백질의 글리칸 함유 Fc-도메인을 고체 지지체로부터 방출시키기 위해 본 발명의 방법에 사용되는 효소는 바람직하게는 엔도프로테이나제, 예를 들어 파파인, 피신, 시스테인 프로테아제 SpeB (패뷸러스 (FabULOUS)) 또는 시스테인 프로테이나제 IdeS (패브리케이터(FabRICATOR)®)이고, 바람직하게는 엔도프로테이나제는 시스테인 프로테이나제 IdeS (패브리케이터®)이다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 재조합 단백질은 항체 또는 Fc-융합 단백질이고, 예비-제거 단계는 aai) Fc-결합 단백질을 사용하여 고체 지지체 상에 Fc-함유 당단백질을 고정시키고, 여기서 상기 Fc-결합 단백질은 바람직하게는 단백질 G 또는 단백질 A로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 Fc-결합 단백질은 단백질 G인 단계; 및 aaii) Fc-함유 당단백질을 용리시키는 단계를 포함하고; 여기서 상기 예비-제거 단계에서 사용되는 고체 지지체는 단계 b)에서 사용된 고체 지지체와 동일한 물질로 만들어지지만, 상기 친화성 리간드에 커플링되지 않는다.

본 발명의 방법에 사용되는 LC-MS는 바람직하게는 역상 LC-MS 또는 나노LC-MS이고, 보다 바람직하게는 LC-MS는 역상 나노LC-MS이다.

본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 고체 지지체는 마이크로비드, 바람직하게는 세파로스 비드, 아가로스 비드 또는 자기 비드, 보다 바람직하게는 세파로스 비드를 포함하는 수지이다. 친화성 리간드는 N-히드록시숙신이미드 (NHS), 시아노겐 브로마이드, 에폭시, 카르보디이미드 또는 티오프로필을 통해, 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 통해 고체 지지체에 커플링될 수 있다.

본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 2개 이상의 포유동물 액체 샘플은 다중 웰 필터 플레이트, 바람직하게는 24, 96 또는 384 웰 필터 플레이트, 보다 바람직하게는 96 웰 필터 플레이트를 사용하여 분석을 위해 제조된다.

재조합 단백질을 포함하는 포유동물 액체 샘플은 체액이고, 바람직하게는 혈청 또는 혈장, 소변, 뇌척수액, 양수, 타액, 땀, 정액, 눈물, 가래, 질 분비물, 질 세척액 및 결장 세척액으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 보다 바람직하게는 상기 샘플은 혈장 또는 혈청 샘플이다. 바람직하게는, 분석되는 샘플의 부피는 약 1 ㎕ 내지 약 1000 ㎕, 약 5 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 약 25 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 또는 약 40 ㎕ 내지 약 75 ㎕, 바람직하게는 약 50 ㎕이다. 바람직한 실시양태에서, 2개 이상의 포유동물 액체 샘플은 동일한 대상체로부터 얻었다. 본 발명의 방법에서 분석되는 포유동물 액체 샘플은 인간, 원숭이, 설치류, 개, 고양이 또는 돼지 샘플, 바람직하게는 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 또는 토끼 샘플일 수 있다.

본 발명의 방법은 관심 재조합 당단백질의 글리칸의 적어도 하나의 특정 글리칸 구조의 약동학적 파라미터를 결정하기 위해, 바람직하게는 그의 C_max, t_max, AUC 또는 t_1/2을 결정하기 위해 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 글리칸은 포유동물의 상기 2개 이상의 각각의 액체 샘플의 분취액에서 분석되고, 임의로 상기 재조합 당단백질의 농도는 예를 들어 ELISA에 의해 상기 2개 이상의 포유동물 액체 샘플의 추가의 분취액에서 분석된다.

바람직하게는, 분석되는 분취액의 부피는 약 1 ㎕ 내지 약 1000 ㎕, 약 5 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 약 25 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 또는 약 40 ㎕ 내지 약 75 ㎕, 바람직하게는 약 50 ㎕이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 포유동물 액체 샘플에서 재조합 당단백질의 글리칸을 분석하는 단계, 및 당단백질을 당단백질 기반 제약 조성물로 제제화하는 단계를 포함하는, 당단백질 기반 제약 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 a) Fc-도메인 및 이펙터 도메인을 함유하는 Fc-융합 단백질을 포함하는 포유동물로부터 2개 이상의 액체 샘플을 제공하는 단계; aa) Fc-결합 단백질을 사용하여 별개의 고체 지지체 상에 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질을 고정시키고, 여기서 상기 Fc-결합 단백질은 바람직하게는 단백질 G 또는 단백질 A로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 Fc-결합 단백질은 단백질 G인 단계; 및 Fc-융합 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는, 2개 이상의 포유동물 액체 샘플을 각각 예비-제거하는 단계; b) 샘플 내의 Fc-융합 단백질의 이펙터 도메인에 특이적인 친화성 리간드에 커플링된 별개의 고체 지지체 상에 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질을 고정시키고, 여기서 친화성 리간드는 Fc-융합 단백질의 이펙터 도메인에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 또는 항체인 단계; c) Fc-융합 단백질에 특이적인 엔도펩티다제로 절단함으로써 고체 지지체로부터 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질의 Fc-도메인을 별개의 용리액으로 방출시키는 단계; dd) 단계 c) 이후에 고체 지지체 상에 남아있는 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질의 고정된 이펙터 도메인으로부터 글리칸을 별개의 용액으로 방출시키는 단계; ee) 각각의 상기 샘플의 글리칸을 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지하는 단계; 및 ff) LC-MS를 사용하여 각각의 상기 샘플의 단계 ee)의 표지된 글리칸을 별개로 분석하고, 상기 2개 이상의 샘플을 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 단계 dd), ee) 또는 ff) 전에 형광 표지의 제2 안정한 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 참조 표준물질을 각각의 상기 샘플에 첨가하고, 참조 표준물질은 단계 ff)의 표지된 글리칸과 함께 분석되는 것인, 포유동물 액체 샘플에서 관심 Fc-융합 단백질의 글리칸을 분석하는 방법에 관한 것이다.

도 1: Fc-융합 단백질 및 항체에 대해 예시된 글리칸 PK 프로파일링 방법의 작업 흐름의 개략도. 작업 흐름은 a) Fc-융합 단백질 특이적 샘플 제조 및 b) 항체 특이적 샘플 제조, c) Fc-융합 단백질 샘플 (1) 및 항체 샘플 (2)의 N-글리칸 처리, 및 d) 표지 후 글리칸의 세정 및 후속 RP 나노LC-MS 분석을 보여준다.
도 2: a) 상대적인 N-글리칸 조성을 보여주는 품질 관리 (QC) 샘플로부터 얻은 글리칸 지도 (왼쪽) 및 중요하지 않은 풍부한 N-글리칸을 보여주는 확대도 (오른쪽). 오류 막대는 표준 편차를 나타낸다. 오류 막대가 없는 두 개의 기둥, 즉 G1F 및 G0F는 확대도의 그래프를 넘어 연장된다. QC 샘플 농도는 10 ㎍/ml와 100 ㎍/ml 사이였다. b) 분석된 글리칸 구조에 대한 개략적인 개요: GlcNAc = 채워진 정사각형, Fuc = 삼각형, Man = 어두운 원형 및 Gal = 밝은 원형.
도 3: 나노LC-MS 기반 mAb1 글리칸 PK 데이터 (채워진 다이아몬드) 및 ELISA 데이터 (채워진 정사각형)의 비교. 비교를 가능하게 하기 위해 각각의 곡선의 최대값과 관련하여 4개의 글리칸으로부터의 독립적인 결과가 제시된다 (평균 ± SD, n = 15). (a)에서 G0F의 PK 프로파일 (약 70%의 글리칸), (b)에서 G1F의 PK 프로파일, (c)에서 G2F의 PK 프로파일, (d)에서 M6G0F/M5G1F의 PK 프로파일 (<0.1%의 글리칸), (e)에서 M3의 PK 프로파일, (f)에서 M3G1F의 PK 프로파일 및 (g)에서 M3G0F의 PK 프로파일이 제시된다.
도 4: 나노LC-MS와 ELISA 프로파일에 의해 얻은 나노LC-MS 기반 mAb1 고만노스 글리칸 PK 프로파일의 비교. (a) ELISA (채워진 정사각형)에 비교한 M6 (채워진 다이아몬드)의 PK 프로파일. (b) ELISA (채워진 정사각형)에 비교한 M5 (채워진 다이아몬드)의 PK 프로파일.
도 5: 각각의 시점에 대한 mAb1의 글리칸 지도. 토끼에서 단일 피하 투여 후 회수된 mAb1 N-글리칸의 평균 백분율이 제시된다. 전체도 (왼쪽) 및 확대도 (오른쪽)가 제시된다.
도 6: Fc 부분 및 수용체 부분으로 분리된 2개의 상이한 배치 (FP1 및 FP2)의 융합 단백질 N-글리칸. a) 글리칸 지도는 FP1 Fc 부분 (왼쪽 위), FP1 수용체 부분 (오른쪽 위), FP2 Fc 부분 (왼쪽 아래) 및 FP2 수용체 부분 (오른쪽 아래)의 상대적인 N-글리칸 조성을 보여준다. 확대도는 중요하지 않은 풍부한 N-글리칸을 보여준다. b) 분석된 글리칸 구조에 대한 개략적인 개요: GlcNAc = 채워진 정사각형, Fuc = 삼각형, Man = 어두운 원형, Gal = 밝은 원형 및 SA = 다이아몬드.
도 7: ELISA에 의해 결정된 FP1 및 FP2의 PK 프로파일. 오류 막대는 동물 사이의 가변성을 나타낸다 (n = 5).
도 8: 나노LC-MS 기반 융합 단백질 글리칸 PK 프로파일과 ELISA 프로파일의 비교. ELISA (채워진 다이아몬드)에 의해 측정된 상대적인 단백질 농도와 비교한, 나노LC-MS (채워진 정사각형)에 의해 측정된 FP1 및 FP2의 Fc-도메인 (a) 및 FP1 및 FP2의 수용체 부분 (이펙터 도메인) (b)의 주요 N-글리칸의 평균 PK 프로파일이 제시된다. 5마리의 동물의 평균 및 표준 편차가 제시된다.
도 9: FP1 Fc 부분 (왼쪽) 및 수용체 부분 (오른쪽)에 위치하는 N-글리칸에 대한 글리칸 지도가 별개로 제시된다.
도 10: FP2 Fc 부분 (왼쪽) 및 수용체 부분 (오른쪽)에 위치하는 N-글리칸에 대한 글리칸 지도가 별개로 제시된다.
도 11: 말단 당 모이어티의 영향. 말단 시알릴화 (다이아몬드), 말단 갈락토실화 (정사각형) 및 말단 N-아세틸글루코사민 (삼각형)의 백분율이 융합 단백질 1 (FP1) 및 융합 단백질 2 (FP2)의 Fc 부분 (a) 및 융합 단백질 1 (FP1) 및 융합 단백질 2 (FP2)의 수용체 부분 (이펙터 도메인) (b)에 대해 제시된다.

본원에서 사용되는 "형광 표지"는 LC-MS 분석에 사용되는 형광 화합물이다. 전형적으로, 환원성 아민화는 올리고당에 형광 표지을 도입하여 후속 분리에서 검출을 용이하게 하기 위해 사용되고, 바람직하게는 상기 형광 표지는 2-아미노 벤즈아미드 (2-AB) 또는 2-아미노벤조산 (2-AA)이다. 2-AA는 안트라닐산으로도 알려진 2-아미노벤조산이다. 본 발명의 목적을 위해, 형광 표지는 형광 표지의 제1 안정한 동위원소 (예를 들어, 가벼운 이소형) 및 형광 표지의 제2 안정한 동위원소 (예를 들어, 무거운 이소형)를 함유하는 동위원소 쌍으로서 이용가능하다. 본 발명에 유용한 상기 동위원소 쌍의 예는 동위원소 2-AA, 예를 들면, 안정한 동위원소 변이체 ¹²[C₆]-2-AA 및 ¹³[C₆]-2-AA이다 ([Prien, J.M., et al., Analytical Chemistry 82, 1498-508 (2010)] 참조). 예를 들어 2-AA의 동위원소 변이체로 표지된 글리칸은 양성 모드 (positive mode) 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분광분석 (MALDI-TOF MS) 또는 온-라인 음성 모드 전기분무 질량 분광분석 (ESI-MS/MSⁿ) 및/또는 나노분무 질량 분광분석 (NSI-MS)를 사용하여 분석될 수 있다 (Prien, J.M., et al., Analytical Chemistry 82, 1498-508 (2010)). 형광 표지의 안정한 동위원소 쌍 다른 예는 ¹²[C₆]-아닐린/¹³[C₆]-아닐린 및 ¹²[C₆]-2-AB/¹³[C₆]-2-AB이다.

탄수화물 모이어티는 올리고당에 일반적으로 사용되는 명명법을 참조하여 본원에 설명된다. 이 명명법을 사용하는 탄수화물 화학에 대한 검토는 예를 들어 문헌 [Hubbard and Ivatt, Ann. Rev. Biochem. 50, 555-583 (1981)]에 기재되어있다.

본 발명의 목적을 위해, "글리칸"은 자유 형태 또는 단백질 또는 지질과 같은 다른 분자에 부착된 임의의 당 또는 당의 집합체 (즉, 당류 또는 탄수화물)를 지칭한다. 본원에서 언급되는 "N-글리칸"은 컨센서스 서열에서 폴리펩티드 사슬의 아스파라긴 잔기에 공유 연결된 글리칸이다: -Asn-X-Ser/Thr (예를 들어, 공통 코어 구조 Manα1-6 (Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-N-Asn을 포함함). 본원에서 언급되는 바와 같이, "산성 글리칸"은 (비-환원 말단에) 적어도 하나의 말단 시알산을 함유하는 N-글리칸이다. 본원에서 언급되는 바와 같이, "중성 글리칸"은 임의의 시알산도 함유하지 않는 N-글리칸이다. 본원에서 언급되는 바와 같이, "글리코실화"는 특정 당 뉴클레오티드 공여자 기질을 이용하여 일반적으로 글리코실트랜스퍼라제에 의해 촉매되는, 탄수화물의 폴리펩티드, 지질, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물 또는 다른 유기 화합물에 대한 효소-촉매 공유 부착이다. 본 발명의 목적을 위해, "다당류"는 바람직하게는 10개 초과의 단당류 단위 길이의 반복되는 단당류로 이루어진 글리칸이다. 본원에서 언급되는 바와 같이, "당"은 임의의 탄수화물, 바람직하게는 단맛이 나는 저분자량 탄수화물을 지칭한다 (문헌 [Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009]의 용어 해설 참조). 단당류에 대한 다음 약어가 사용된다: N-아세틸글루코사민 (GlcNAc), 푸코스 (Fuc), 만노스 (Man), 갈락토스 (Gal) 및 시알산 (SA).

본 발명의 목적을 위해, 용어 "당단백질"은 적어도 하나의 글리칸 측쇄를 갖는 항체 및 융합 단백질 (예를 들어, Fc-융합 단백질)을 포함하는 펩티드 및 단백질을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 당단백질"은 살아있는 세포 내에서 재조합 DNA의 발현에 의해 생성된 글리코실화 단백질을 의미한다. 재조합 DNA 분자는 분자 클로닝과 같은 유전자 재조합의 실험적 방법에 의해 형성되어 여러 공급원으로부터의 유전 물질을 조합하고, 생물학적 유기체에서 발견되지 않는 서열을 생성하는 DNA 분자이다. 본원에서, 재조합 당단백질은 또한 단백질이 그의 액체 샘플이 얻어진 포유동물에 대해 내인성이 아닌 것을 포함한다. 즉, 재조합 당단백질은 샘플을 수득하기 전에 포유동물에 투여되었다. 바람직한 재조합 당단백질은 고등 진핵 세포에서 발현된 치료적 재조합 당단백질이다. 이와 관련하여, 예시적인 유용한 고등 진핵 세포는 다음 세포주로부터 선택된다:

이와 관련하여, 항체와 같은 생물제약상 유용한 당단백질을 발현하기 위해 관련 기술 분야에서 널리 사용되는 CHO 세포 또는 CHO 유래 세포 (예를 들어, CHO-DXB11 또는 CHO-DG55)가 바람직하다.

상기 당단백질은 숙주 세포에 상동성일 수 있거나, 또는 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 숙주 세포에 의해 생산된 인간 당단백질과 같이 사용되는 숙주 세포에 대해 이종성, 즉 외래성일 수 있다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포에 의해 발현된 당단백질은 배지에 직접 분비된다.

적합한 포유동물, 특히 인간의 당단백질의 예는 다음 분자를 포함한다: 시토카인; 시토카인 수용체; 케모카인, 예컨대 TNF 및 TECK; 케모카인 수용체, 예컨대 TNFR 및 CCR9; 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 인간 대식구 염증 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮬러 (mullerian)-억제 물질; 릴랙신 (relaxin) A-사슬; 릴랙신 B-사슬; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 및 폰 빌레브란트 (von Willebrand) 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대 유로키나제 또는 인간 소변 또는 조직형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 엔케팔리나제; RANTES; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양성 인자, 예컨대 골-유래 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-베타; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함하는 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I); 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, CD 단백질, 예컨대 CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19; 에리트로포이에틴; 골 유도 인자, 면역 독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨 (IL), 예컨대 IL-1 내지 IL-21; 수퍼옥시드 디스뮤타제; T 세포 수용체; 세포 표면 막 단백질; 수송 단백질; 귀소 수용체; 조절 단백질; 붕괴 촉진 인자; 및 바이러스 항원, 예컨대 HIV-1 또는 HIV-2 외피 단백질의 일부.

본 발명의 측면에서 바람직한 당단백질은 융합 단백질이다. 본원에서 사용되는 용어 "융합 단백질"은 종종 아미노산 링커에 의해 분리되는, 서로 융합된 (즉, 하나의 폴리펩티드로서 발현된) 2개의 단백질 또는 단백질 단편을 함유하는 키메라 단백질, 바람직하게는 Fc 도메인, 알부민 또는 트랜스페린에 융합된 이펙터 도메인을 지칭한다. 따라서, 융합 단백질은 바람직하게는 Fc-융합 단백질, 트랜스페린-융합 단백질 또는 알부민-융합 단백질이고, 보다 바람직하게는 융합 단백질은 Fc-융합 단백질이다. 전형적으로, 융합 단백질 내의 Fc-도메인은 CH2 및 CH3 영역 및 IgG 중쇄의, 바람직하게는 IgG1 중쇄의 힌지 영역을 함유한다. Fc-도메인, 알부민 또는 트랜스페린에 대한 융합은 대체로 생체 내 반감기를 증가시키고/시키거나 이펙터 도메인의 용해도를 증가시킨다. 아미노산 링커는 엔도프로테이나제의 절단 부위를 추가로 포함할 수 있다. 이펙터 도메인은 전장 치료상 관련 단백질 또는 그의 단편, 특히 치료상 관련 수용체 또는 막 단백질의 세포외 부분일 수 있다. 치료상 관련 Fc-융합 단백질의 비-제한적인 예는 LFA-3/Fc (알레페셉트), TNFR-Fc (에타네르셉트), CTLA-4/Fc (아바타셉트 및 벨라타셉트), VEGFR1/2-Fc (아플리베르셉트), rFVIIIFc 및 rFIXFc, IL-1R1-Fc (릴로나셉트), 트롬보포이에틴-Fc (로미플로스팀) 및 안지오포이에틴-1/2 길항제 펩티드-Fc (트레바나닙)이다.

융합 단백질에 사용하기 적합한 포유동물, 특히 인간의 이펙터 단백질의 예는 다음기 분자를 포함한다: 시토카인; 시토카인 수용체; 케모카인, 예컨대 TNF 및 TECK; 케모카인 수용체, 예컨대 TNFR 및 CCR9; 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 인간 대식구 염증 단백질 (MIP-1-알파); 뮬러-억제 물질; 릴랙신 A-사슬; 릴랙신 B-사슬; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대 유로키나제 또는 인간 소변 또는 조직형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 엔케팔리나제; RANTES; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양성 인자, 골-유래 신경영양성 인자 (BDNF), 예컨대 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-베타; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함하는 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I); 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, CD 단백질, 예컨대 CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19; 에리트로포이에틴; 골 유도 인자, 면역 독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨 (IL), 예컨대 IL-1 내지 IL-21; 수퍼옥시드 디스뮤타제; T 세포 수용체; 세포 표면 막 단백질; 수송 단백질; 귀소 수용체; 조절 단백질; 붕괴 촉진 인자; 및 바이러스 항원, 예컨대 HIV-1 또는 HIV-2 외피 단백질의 일부.

본 발명의 측면에서 또 다른 바람직한 당단백질은 항체이다. 본원에서 언급되는 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, 항원-결합 부분) 또는 단일쇄를 포함한다. "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (V_H로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역으로 구성되어 (V_L로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, 즉 C_L을 포함한다. V_H 및 V_L 영역은 보다 보존된 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 영역 내에 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 다시 분할될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전통적인 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 일반적으로, 항체는 아스파라긴 잔기 N297에서 CH2 도메인에서 글리코실화된다. 유의한 수의 항체는 또한 그의 가변 영역에서 추가의 글리코실화 부위 (즉, Asn-X-Ser/Thr 트리펩티드)를 갖고, N-연결 글리코실화는 혈청 IgG 및 일부 모노클로날 항체 (mAb)의 중쇄 (V_H) 및 경쇄 (V_L) 둘 모두의 가변 (V) 도메인에서 발견될 수 있다. 항체의 용어 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 항원-결합 단편의 예는 다음을 포함한다: (i) V_L, V_H, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (ⅲ) V_H 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (ⅳ) 항체의 단일 아암 (arm)의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (ⅴ) V_H 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., Nature. 341:544-546 (1989)); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합. Fv 단편의 2개의 도메인, 즉 V_L 및 V_H가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 V_L 및 V_H의 영역이 쌍을 이루어 일가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 알려짐, 예를 들어, 문헌 [Bird et al., Science 1988, 242:423-426]; 및 [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85:5879-5883] 참조)를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들 수 있게 하는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이러한 단일쇄 항체는 또한 항체의 항원-결합 부분 및 항원-결합 단편이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 얻고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.

본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체" (mAb)는 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 보이는 항체를 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 단일 결합 특이성을 보이고 인간 생식 계열 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화된 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.

본원에서 사용되는 용어 "재조합 인간 항체"는 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열에 대해 트랜스제닉 또는 염색체 도입(transchromosomal) 상태인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마 (transfectoma)로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체와 같은, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 그러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이 유발 (또는, 인간 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물이 이용될 때, 생체 내 체세포 돌연변이 유발)에 적용될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 V_H 및 V_L 영역의 아미노산 서열은 인간 생식 계열 V_H 및 V_L 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 천연적으로 생체 내에서 인간 항체 생식 계열 레퍼토리 내에 존재하지 않을 수 있는 서열이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "이종성 항체"는 이 항체를 생산하는 트랜스제닉 비-인간 유기체와 관련하여 정의된다. 이 용어는 트랜스제닉 비-인간 동물로 이루어지 않은 유기체에서 발견되는 것에 대응하는 아미노산 서열 또는 코딩 핵산 서열을 갖고, 일반적으로 트랜스제닉 비-인간 동물의 종 이외의 다른 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "펩티드"는 펩티드 아미드 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체의 사슬을 지칭한다. 펩티드는 약 10개 아미노산 이하의 짧은 사슬일 수 있다. 펩티드는 또한 약 70개 아미노산 이상의 긴 사슬 또는 그 사이에 있는 임의의 사슬일 수 있다. 본 발명의 측면에서, 엔도프로테이나제에 의해 방출되는 재조합 당단백질의 단편은 글리칸을 갖는 경우, 펩티드 또는 당펩티드로 지칭된다.

본원에서 사용되는 "친화성 리간드"는 관심 재조합 당단백질에 특이적으로 결합하는 리간드를 의미한다. 이러한 친화성 리간드는 친화도 크로마토그래피를 사용하여 혈청 또는 혈장과 같은 포유동물 액체 샘플에서 관심 재조합 당단백질을 다른 화합물로부터 분리하기 위해 사용된다. 전형적으로, 재조합 당단백질이 항체일 경우, 친화성 리간드는 항원이다. 다른 재조합 단백질의 경우, 친화성 리간드는 전형적으로 상기 재조합 단백질의 결합 파트너 또는 기질이다. 재조합 단백질이 융합 단백질일 경우, 친화성 리간드는 전형적으로 융합 단백질의 이펙터 도메인의 결합 파트너 또는 기질, 예를 들어 수용체에 대한 리간드 또는 그 반대이다. 대안적으로, 친화성 리간드는 상기 재조합 단백질에 특이적인 항체 또는 융합 단백질의 상기 이펙터 도메인에 특이적인 항체일 수 있다. 바람직하게는, 특히 재조합 당단백질의 고정된 글리칸 함유 단편의 글리칸이 추가로 분석되는 경우, 친화성 리간드는 비-글리코실화되고, 즉, 글리칸 또는 적어도 N-글리칸을 함유하지 않는다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 단백질 A 및 단백질 G 또는 임의의 다른 일반적인 Fc-도메인 결합 단백질이 내인성 항체를 함유하는 포유동물 액체 샘플에서, 특히 혈청 및 혈장의 경우 특정 재조합 Fc-융합 단백질 또는 관심 항체에 대한 친화성 리간드로서 적합하지 않음을 이해할 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "항원"은 적응 면역 반응을 유발하는 물질이고, 또한 면역원으로 지칭될 수도 있다. 항원은 항체의 항원 결합 부위에 결합한다. 항원은 전형적으로 고분자량이고, 단백질 또는 다당류이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 항원은 에피토프, 예를 들어, 펩티드를 포함하는 항원의 면역원성 부분을 지칭할 수도 있다. 펩티드, 지질, 핵산 및 많은 다른 물질도 항원으로 기능할 수 있다. 면역 반응은 소 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 또는 다른 합성 매트릭스와 같은 더 큰 담체 단백질에 화학적으로 커플링되는 경우, 합텐 (hapten)으로 불리는 보다 작은 물질에 대해서도 생성될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "특이적 결합", "선택적 결합" 및 "선택적으로 결합하다" 및 "에 특이적인 리간드"는 융합 단백질의 이펙터 도메인과 같은 미리 결정된 재조합 당단백질에 또는 항체에 결합하는 친화성 리간드를 의미한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 리간드는 BIACORE 3000 기기에서 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술에 의해 결정될 때 약 10^-7 M 미만, 예컨대 약 10^-8 M, 약 10^-9 M, 또는 약 10^-10 M 미만 또는 훨씬 더 낮은 농도의 친화도 (KD)로 재조합 당단백질에 결합하고, 액체 샘플 내의 비-특이적 항원 또는 다른 당단백질에 대한 결합을 위한 친화도보다 적어도 2배 더 큰 친화도로 미리 결정된 재조합 당단백질에 결합한다. 따라서, 본 발명의 측면에서, "에 특이적인 리간드"는 리간드가 재조합 당단백질에 우선적으로 결합하여 샘플에 존재하는 다른 당단백질로부터, 특히 샘플에 존재하는 다른 항체로부터 상기 재조합 당단백질을 분리한다는 것을 의미한다. "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"라는 문구는 본원 명세서에서 "항원에 선택적으로 결합하는 항체"라는 용어와 교환가능하게 사용되고, "항원은 항체에 특이적이다"는 것과 동등하게 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "용리액"은 고체 지지체로부터 방출되는 물질에 관한 것이다. 이것은 용리 동안 사용된 완충제 또는 용액 또는 다른 완충제 또는 용액을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "LC"는 본원에서 "LC-MS"로 지칭되는 질량 분광분석과 조합될 수 있는 액체 크로마토그래피를 의미한다. LC-MS는 직렬 MS를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "역상 LC" 또는 "HPLC" (RP-LC 또는 RP-HPLC)는 비-극성 고정상 및 수성의, 중간 정도로 극성인 이동상, 예를 들어 RMe₂SiCl (여기서, R은 직쇄 알킬기, 예컨대 C₁₈H₃₇ 또는 C₈H₁₇임)로 표면 변형된 실리카를 갖는다 (Lehto and Hou, Chemistry and Analysis of Radionuclides, Wiley-VCH Verlag & Co., Weinheim, Germany, 2011, page 170). 본 발명의 측면에서, 역상에서 사용되는 이동상은 MS와 보다 상용성이고 따라서 정상 상 LC-MS보다 민감하기 때문에, "역상 LC-MS"가 바람직하다.

본원에서 사용되는 "나노-LC" 또는 나노-HPLC (RP-나노-LC 또는 RP-나노-HPLC)는 각각 종래의 LC 또는 HPLC에 비해 LC에 사용된 컬럼의 감소된 내경 (10-150 ㎛) 및 보다 느린 유속 (10-1000 nl/min)을 특징으로 한다. 이러한 규모 축소는 나노-LC 시스템의 높은 플레이트 수 및 낮은 펨토몰 및 펨토몰 미만의 범위에서 단백질 샘플을 분석하는 능력을 제시한다 (Chervet et al., Analytical Chemistry 1996, 68:1507-12). 액체 크로마토그래피의 분야에서의 이해 및 통상적인 일반 지식과 일치하게, 본 발명에 따라 나노-LC 및 나노-HPLC는 본 발명의 목적을 위해 각각 LC 및 HPLC의 적합하고 의도된 형태, RP-나노-LC 및 RP-나노-HPLC는 각각 RP-LC 및 RP-HPLC의 적합하고 의도된 형태, 심지어 심지어 바람직한 형태임을 이해할 것이다. 이것은 본 발명의 목적을 위해 각각 LC, 및 RP-LC의 적절하고 의도된 형태인 마이크로-LC 및 모세관-LC, 또는 RP-마이크로-LC 및 RP-모세관-LC의 또한 공지되고 확립된 기술에 동일하게 적용된다. LC, HPLC, LC-MS 또는 HPLC-MS라는 용어가 본원에서 사용되는 경우, 이것은 또한 이들의 바람직한 실시양태, 나노-LC, 나노-HPLC, 나노-LC-MS 또는 나노-HPLC-MS 및 이들의 역상 형태를 포함한다.

본 발명의 목적을 위해, RP-LC 또는 RP-HPLC의 "이동상"은 바람직하게는 pH 및 이온화 상태를 제어하거나 이온쌍 형성 시약으로서 작용하는 이온 조절제와 함께, 물 내의 유기 개질제 (예를 들어, 아세토니트릴 또는 메탄올)의 구배이다. 음이온성 이온쌍 시약 (예를 들어, 트리플루오로아세트산 (TFA))은 펩티드의 양성자화된 염기성 기에 결합한다. 0.1% TFA의 첨가는 용리액을 산성화시켜 펩티드 및 단백질의 카르복실기를 양성자화시켜 분자의 보다 큰 소수성을 유도한다. 양이온성 이온쌍 형성 시약 (예를 들어, 트리에틸암모늄 이온)은 펩티드의 이온화된 카르복실기에 결합한다 ("Protein Liquid Chromatography", Journal of Chromatography Library, vol. 61, edited by Kastner M, Elsevier Science B.V., 2000, page 153). 디에틸아민 (DEA)은 또한 이온쌍 형성 시약으로서 사용될 수 있다 (Melmer et al., Journal of Chromatography A (2011), Volume: 1218 (1): 118-123). 예를 들어 2-AB 표지된 N-글리칸의 정상 상 또는 HILIC 크로마토그래피의 경우, 적합한 이동상은 예를 들어 75% 아세토니트릴 내의 60 mM 포름산암모늄 (이동상 A) 및 54% 아세토니트릴 내의 115 mM의 포름산암모늄 (이동상 B)로 이루어진다 (Melmer et al., Anal Bioanal Chem (2010), Volume 398: 905-914).

본원에서 사용되는 "이온 트랩 질량 분광분석법"은 고주파 사중극자 전기장의 영향 하에 안정한 경로를 설명하기 위해 질량/전하 비의 원하는 범위를 갖는 이온을 먼저 만든 후, 그 각각의 질량/전하 비에 따라 경로 불안정성을 선택적으로 유도하기 위해 전기장을 조정함으로써 검출기에 제시되는 배열이다 (예를 들어, 사중극자 이온 트랩) (http://www.genomicglossaries.com/content/mass_spectrometry.asp 참조)). 본 발명의 방법의 감도는 보다 민감한 나노 ESI 공급원을 사용함으로써 개선될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 모든 "N-글리칸"은 공통 코어 당 순서, 즉 Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn-X-Ser/Thr을 갖는 것으로 이해되고, 다음과 같은 3개의 종류로 분류된다: (1) 만노스 잔기만이 코어에 부착된 "올리고만노스" (고만노스); (2) N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 (GlcNAcT)에 의해 개시된 "안테나"가 코어에 부착된 "복합체"; (3) 만노스 잔기만이 코어의 Manα1-6 아암에 부착되고 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 (GlcNAcT)에 의해 개시된 하나 또는 두 개의 안테나가 Manα1-3 아암에 있는 "하이브리드" (Essentials of Glycobiology, 2nd edition, Varki et al., editors, Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009, Chapter 8).

본 발명의 목적을 위해, "하나의 실시로", "하나의 방법으로" 또는 "단일 (분석) 방법으로" 산성 또는 중성 글리칸, N-글리칸 또는 일반적인 글리칸을 분석한다는 것에 대한 언급은 MS 분석이 LC 또는 RP-LC 단계에 직접 커플링됨 (즉, 이 단계와 온-라인으로 수행됨)을 의미한다. 이것은 RP-LC와 MS 분석 사이에 추가의 분석 또는 예비 단계가 없다는 것을 의미한다. 이것은 형광 검출이 RP-LC와 MS 사이에서 발생할 것을 배제하지 않는다는 것이 이해될 것이다. 사실, RP-컬럼에서 분리된 2-AA 표지 글리칸의 형광 검출은 표지된 글리칸이 통과하는 형광 검출기 (FLD)가 일반적으로 HPLC/LC 시스템의 모듈이기 때문에 LC 시스템을 떠나 MS로 진행하기 전에 정상적으로 (및 유리하게) 일어난다. 이것은 "LC-MS" 또는 "RP-LC-MS"라고도 언급된다.

본원에서 사용되는 용어 "효소적 절단"은 효소를 수반하고 대부분의 비-특이적으로 결합된 당단백질의 용리를 피하면서 재조합 당단백질의 방출을 허용하는 당단백질의 임의의 절단을 나타낸다. 효소적 절단은 엔도글리카나제 또는 엔도프로테이나제를 사용하여 수행될 수 있고, 엔도프로테이나제가 바람직하다. 효소는 관심 재조합 당단백질에 대해 선택적이어야 한다. 이것은 특이적 절단 부위가 드물고, 바람직하게는 관심 재조합 당단백질에만 또는 추가로 당단백질의 특정 군 또는 모두 동일한 도메인을 포함하는 당단백질의 군과 같은 몇몇 다른 당단백질에만 존재한다는 것을 의미한다. 보다 선택적인 효소는 고체 지지체로부터 비-특이적으로 결합된 당단백질 단편의 용리를 방지한다. 바람직하게는, 효소는 재조합 당단백질을 효율적으로 및 특이적으로 (예를 들어, 단지 알려진 절단 부위에서만) 절단한다. 적합한 효소는 예를 들어 특정 컨센서스 서열에서 특이적으로 관심 재조합 당단백질 내에서 절단하고 좁은 기질 특이성 (또는 높은 선택성)을 갖는 엔도프로테이나제이다. 바람직하게는, 엔도프로테이나제는 관심 재조합 당단백질 또는 관심 재조합 당단백질에 함유된 도메인에 대해 특이적 (및/또는 선택적)이다. 예를 들어, 적합한 엔도프로테이나제는 관심 재조합 당단백질 또는 관심 재조합 당단백질을 포함하는 본질적으로 동일한 도메인을 포함하는 단백질의 군만을 특이적으로 절단한다. 본질적으로 동일한 도메인을 포함하는 단백질의 군에 대한 예는 항체 및 Fc-융합 단백질이고, 모두 Fc-도메인을 함유한다. 적합한 효소는 관심 재조합 당단백질 또는 관심 재조합 당단백질 내의 각각의 동일한 폴리 펩티드 사슬 내에 오직 하나의 절단 부위를 우선적으로 갖는다. 용어 "엔도펩티다제", 엔도프로테이나제", "프로테이나제" 또는 "프로테아제"는 본원에서 교환가능하게 사용된다.

바람직하게는, 방출된 글리칸 함유 단편은 하나의 글리칸을 함유하는 펩티드이거나, 방출된 Fc-도메인의 경우에는 각각 하나의 글리칸을 함유하는 2개의 동일한 펩티드이다. 예를 들어, 고체 지지체로부터 재조합 당단백질의 글리칸 함유 Fc-도메인을 방출하는 본 발명의 방법에 적합한 엔도프로테이나제는 엔도프로테이나제, 예컨대 파파인, 피신, 시스테인 프로테아제 SpeB (패뷸러스) 또는 시스테인 프로테이나제 IdeS (패브리케이터®)이고, 바람직하게 엔도프로테이나제는 시스테인 프로테이나제 IdeS (패브리케이터®)이다. 예를 들어, IdeS는 불변 서열 ELLGGPS의 두 글리신 사이의 힌지 영역에서 인간 IgG를 특이적으로 절단하고, SpeB는 서열 KTHTCPPC 내의 트레오닌과 시스테인 사이의 힌지 영역에서 절단한다. 효소적 절단은 또한 특정 N- 또는 O-글리코실화 부위에 대한 특이성을 갖는 글리카나제를 사용하여 수행될 수도 있다. 이러한 글리카나제는 예를 들어, 환원 말단에서 제1 GlcNAc 다음에 절단되는 IgG Fc-도메인 함유 당단백질에서 N-글리칸에 특이적인 엔도스글리카나제(EndoSGlycanase) (IgGZERO®)이다.

대안적으로, 인자 IX-알부민 (FIX-알부민)과 같은 융합 단백질은 FIX의 활성화 펩티드의 N 말단으로부터 유래된 아미노산 137-153에 기초한, 2개의 도메인 사이의 링커 서열을 포함한다. FXIa 또는 FVIIa/TF에 의한 FIX-재조합 알부민 융합 단백질의 활성화는 링커를 절단하고, 이에 의해 융합 단백질의 FIXa 및 rHA 모이어티를 분리시킨다. 따라서, FXIa 및/또는 FVIIa/TF는 FIX-알부민을 선택적으로 절단하는데 적합하다. 또한, 인자 Xa는 많은 조건 하에서 매우 낮은 비-특이적 절단을 보이는 부위-특이적 프로테아제이다. 따라서, 인자 Xa는 인자 Xa 절단 부위 (서열 Ile-Glu/Asp-Gly-Arg의 아르기닌 다음의 절단)를 함유하는 당단백질을 절단하기 위해 사용될 수 있다. 인자 Xa 키트는 노바겐 (Novagen) (69036-3)에서 입수할 수 있다. 마찬가지로, 트롬빈은 재조합 융합 단백질 내의 서열 LeuValProArgGlySer의 아르기닌과 글리신 사이의 특이적 절단을위한 부위-특이적 프로테아제이다.

본원에서 사용되는 용어 "고체 지지체"는 특히 친화도 크로마토그래피에서 그 위에 리간드를 고정하기 위해 사용될 수 있는 임의의 고체 표면을 의미한다. 전형적으로, 친화도 크로마토그래피에 적합한 "고체 지지체"는 수지, 예컨대 큰 표면적을 갖는 마이크로비드를 포함하는 수지이다. 본 발명에서 특히 적합한 수지는 세파로스 비드, 아가 로스 비드 또는 자기 비드이고, 세파로스 비드가 바람직하다. 용어 "고정된"은 고체 지지체에 대한 직접 또는 간접적인 공유 또는 비공유 결합을 나타낸다. 전형적으로, 친화성 리간드는 예를 들어 N-히드록시숙신이미드 (NHS), 시아노겐 브로마이드, 에폭시드, 카르보디이미드 또는 티오프로필 반응기를 통해 고체 지지체에 공유 커플링된다. 상기 반응성 기 중 하나를 사용하여 활성화된 상업적으로 이용가능한 마이크로비드는 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, NHS-활성화 세파로스이다. 일단 재조합 당단백질이 고체 지지체에 고정화되거나 커플링된 그의 특이적 친화성 리간드에 결합하면, 재조합 당단백질은 친화성 리간드에 비공유 결합을 통해 고체 지지체 상에 고정된다.

본원에서 사용되는 용어 "포유동물 액체 샘플"은 세포, 단백질, DNA 또는 RNA와 같은 생물학적 물질을 포함하는, 특정 시점에서 포유동물로부터 얻은 임의의 액체 샘플을 의미한다. 전형적으로, 액체 샘플은 혈청 또는 혈장과 같은 체액이다. 그러나, 액체 샘플은 또한 전혈, 소변, 뇌 척수액, 양수, 타액, 땀, 정액, 눈물, 가래, 질 분비물, 질 세척액 및 결장 세척액일 수 있다. 바람직하게는, 샘플을 본 발명의 방법에 적용되기 전에, 예를 들어 원심분리에 의해 세포 또는 잔해로부터 제거된다. 액체 샘플이 관심 재조합 당단백질을 함유하기 위해서, 샘플은 상기 재조합 당단백질을 포유동물에 투여한 후에 얻어져야 한다. 본 발명과 측면에서, 재조합 당단백질은 생물의약의 또는 치료상 활성인 재조합 당단백질로 이해되어야 한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 액체 샘플 또는 액체 샘플의 "분취액"이 본 발명에서 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 액체 샘플의 분취액만이 본 발명의 방법에 따라 분석되기 위해 사용되는 경우, 동일한 샘플의 다른 분취액은 단백질 농도와 같은 상이한 파라미터에 대해 분석되거나, 추후 분석을 위해 동결 보존될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "정량 하한 (LLOQ)"은 적합한 정밀도 및 정확도로 정량적으로 결정될 수 있는 샘플 내의 분석물의 최저 농도를 지칭하고, 여기서 분석물은 재조합 당단백질이다. LLOQ는 전형적으로 ㎍/ml로 제시된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 LLOQ가 분석에 사용된 샘플 부피에 크게 의존한다는 것을 이해한다.

본원에서 사용되는 용어 "참조 표준물질"은 분석되는 글리칸을 표지하기 위해 사용되는 동위원소 변이체와 상이한 형광 표지의 동위원소 변이체로 표지된 공지된 상대 분포를 갖는 글리칸의 표준화된 혼합물을 말한다. 동위원소 표지는 예를 들어 형광 표지의 안정한 (바람직하게는 무거운) 동위원소 변이체, 예를 들어 ¹³[C₆]-2AA를 사용하여 환원 말단에서 글리칸 내로 도입될 수 있다. 글리칸의 혼합물은 적어도 분석되는 글리칸 구조를 함유한다. 혼합물은 추가로 표준화되고, 이것은 글리칸의 동일한 혼합물이 실험의 각각의 샘플에 또는 서로 비교되는 각각의 샘플에 첨가된다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 재조합 당단백질의 한 배치의 글리칸은 방출되고, 표지되고, 사용하기 전까지 동결 보존된다. 참조 표준물질의 사용은 샘플 제조 및 나노LC-MS 분석의 변화를 보상하여, 보다 정확한 결과를 제시한다. 따라서, 참조 표준물질은 바람직하게는 샘플에 가능한 한 빨리 첨가된다. 또한, 참조 표준물질은 글리칸 구조를 개별적으로 분석할 수 있게 한다. 이것은 각각의 글리칸 구조의 양을, 각각의 샘플 내의 글리칸의 상대적인 비율보다는 참조 표준물질 내의 개별 글리칸의 알려진 상대적인 분포를 기준으로 하여 참조 표준물질의 각각의 글리칸 구조에 대해 개별적으로 정량할 수 있음을 의미한다. 따라서, 개별적인 글리칸 구조의 PK 파라미터를 결정할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "고처리량"은 다수의 샘플, 예컨대 10개 초과, 50개 초과, 100개 초과, 500개 초과 또는 1000개 초과의 샘플의 신속하고 동시적인 샘플 제조를 가능하게 하는 모드 또는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적을 위해, %에 대한 언급은 달리 명시하지 않는 한 (v/v)를 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 수치 (예를 들어, pH 값 또는 백분율 값)와 함께 사용될 때 용어 "약"은 해당 값으로부터 20%, 바람직하게는 10%, 보다 바람직하게는 5%, 훨씬 더 바람직하게는 2%, 가장 바람직하게는 1%의 편차를 포함하는 것이 의도된다. 수치와 함께 사용되는 경우, 이것은 본 발명에 따른 바람직한 실시양태로서 정확한 수치를 개별적으로 개시하는 것으로 동시에 이해되어야 한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "포함하는"이라는 용어는 "포괄하는" 및 "이루어진" 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 하고, 두 의미는 구체적으로 의도되고, 따라서 개별적으로 개시된 본 발명에 따른 실시양태이다.

따라서, 본 발명은 a) 관심 재조합 당단백질을 포함하는 2개 이상의 포유동물 액체 샘플을 제공하는 단계; b) 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질을, 샘플 내의 재조합 당단백질에 특이적인 친화성 리간드에 커플링된 별개의 고체 지지체 상에 고정시키는 단계; c) 재조합 당단백질의 효소 절단에 의해 고체 지지체로부터 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편을 별개의 용리액으로 방출시키는 단계; d) 임의로, 별개의 용리액에서 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편으로부터 글리칸을 방출시키는 단계; e) 각각의 상기 샘플의 글리칸을 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지하는 단계; 및 f) LC-MS를 사용하여 각각의 상기 샘플의 단계 e)의 표지된 글리칸을 별개로 분석하고, 상기 2개 이상의 샘플을 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 형광 표지의 제2 안정한 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 참조 표준물질이 단계 c), d), e) 또는 f) 전에 각각의 상기 샘플에 첨가되고, 참조 표준물질은 단계 f)의 표지된 글리칸과 함께 분석되는 것인, 포유동물 액체 샘플에서 관심 재조합 당단백질의 글리칸을 분석하는 방법에 관한 것이다. 참조 표준물질은 공정 동안 초기에 첨가되는 것이 바람직하다. 따라서, 참조 표준물질은 단계 f) 전에, 바람직하게는 단계 e) 전에 또는 단계 d) 전에, 훨씬 더 바람직하게는 단계 c) 전에 첨가될 수 있다. 본 발명의 방법의 모든 단계는 포유동물로부터 얻은 2개 이상의 액체 샘플 각각에 대해 별개로 수행된다.

본 발명은 또한 단계 c)에서 고체 지지체에 고정된 채로 남아있는 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 제2 글리칸 함유 단편의 글리칸을 분석하는 단계를 추가로 포함하고, 이 단계는 aa) 단계 b) 전에 고체 지지체에 비-특이적으로 결합하는 당단백질을 제거하기 위해 2개 이상의 포유동물 액체 샘플을 각각 예비-제거하는 단계; dd) 단계 c) 이후에 고체 지지체 상에 남아있는 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 고정된 제2 글리칸 함유 단편으로부터 글리칸을 별개의 용액으로 방출시키는 단계; ee) 각각의 상기 샘플의 글리칸을 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지하는 단계; 및 ff) LC-MS를 사용하여 각각의 상기 샘플의 단계 ee)의 표지된 글리칸을 별개로 분석하고, 상기 2개 이상의 샘플을 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 형광 표지의 제2 안정한 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 참조 표준물질이 단계 dd), ee) 또는 ff) 전에 각각의 상기 샘플에 첨가되고, 참조 표준물질은 단계 ff)의 표지된 글리칸과 함께 분석되는 것인 방법에 관한 것이다. 예비-제거 단계 aa)는 샘플을 고체 지지체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 고체 지지체는 단계 b)에서 사용된 고체 지지체와 동일한 물질로 제조되지만, 상기 친화성 리간드에 커플링되지 않는다. 참조 표준물질은 공정 동안 초기에 첨가되는 것이 바람직하다. 따라서, 참조 표준물질은 LC-MS를 사용한 표지된 글리칸의 분석 (단계 ff) 전에, 바람직하게는 분석되는 글리칸의 표지 (단계 ee) 전에 첨가되고, 보다 바람직하게는 이펙터 도메인의 글리칸의 방출 (단계 dd) 전에 컬럼에 첨가될 수 있다. 단계 c)에서 고체 지지체에 고정된 채로 남아있는 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 제2 글리칸 함유 단편의 글리칸이 추가로 분석되는 경우, 바람직하게는 참조 표준물질이 단계 c) 전에 각각의 상기 샘플에 첨가되지 않는다. 통상의 기술자는 본 발명의 방법의 모든 단계가 포유동물로부터 얻은 2개 이상의 각각의 액체 샘플에 대해 별개로 수행됨을 이해할 것이다.

바람직하게는, 형광 표지는 글리칸이 당단백질 단편으로부터 방출된 후에 수행된다. 글리칸의 방출은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다.

혈청 샘플과 같은 포유동물 액체 샘플로부터의 친화도 정제는 예비-제거 단계를 필요로 할 수 있다. 예비-제거 단계는 효소적 절단 후 고정된 제2 글리칸 함유 단편의 글리칸이 분석될 경우 특히 유리하다. 예비-제거 단계는 샘플을 고체 지지체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 고체 지지체는 커플링된 친화성 리간드 없이 재조합 당단백질의 고정 (단계 b)에 사용되는 고체 지지체와 동일한 물질로 제조된다. 비-특이적으로 결합하는 당단백질 또는 당지질은 고체 지지체에 결합된 채로 남아 있다. 따라서, 재조합 당단백질은 통과액 (flow through), 즉 고체 지지체에 결합하지 않는 물질에 존재할 수 있다. 대안적으로, 예비-제거 단계는 고체 지지체 상에 재조합 당단백질을 고정한 후, 고체 지지체로부터 재조합 당단백질을 용리시키는 상류의 제2 친화도 정제 단계일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 a) Fc-도메인 및 이펙터 도메인을 함유하는 Fc-융합 단백질을 포함하는 포유동물로부터 2개 이상의 액체 샘플을 제공하는 단계; aa) Fc-결합 단백질을 사용하여 별개의 고체 지지체 상에 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질을 고정시키고, 여기서 상기 Fc-결합 단백질은 바람직하게는 단백질 G 또는 단백질 A로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 Fc-결합 단백질은 단백질 G인 단계; 및 Fc-융합 단백질을 용리시키는 단계를 포함하는, 2개 이상의 포유동물 액체 샘플을 각각 예비-제거하는 단계; b) 샘플 내의 Fc-융합 단백질의 이펙터 도메인에 특이적인 친화성 리간드에 커플링된 별개의 고체 지지체 상에 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질을 고정시키고, 여기서 친화성 리간드는 Fc-융합 단백질의 이펙터 도메인에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 또는 항체인 단계; c) Fc-융합 단백질에 특이적인 엔도펩티다제로 절단함으로써 고체 지지체로부터 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질의 Fc-도메인을 별개의 용리액으로 방출시키는 단계; dd) 단계 c) 이후에 고체 지지체 상에 남아있는 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질의 고정된 이펙터 도메인으로부터 글리칸을 별개의 용액으로 방출시키는 단계; ee) 각각의 상기 샘플의 글리칸을 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지하는 단계; 및 ff) LC-MS를 사용하여 각각의 상기 샘플의 단계 ee)의 표지된 글리칸을 별개로 분석하고, 상기 2개 이상의 샘플을 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 단계 dd), ee) 또는 ff) 전에 형광 표지의 제2 안정한 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 참조 표준물질을 각각의 상기 샘플에 첨가하고, 참조 표준물질은 단계 ff)의 표지된 글리칸과 함께 분석되는 것인, 포유동물 액체 샘플에서 관심 Fc-융합 단백질의 글리칸을 분석하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 분석되는 글리칸은 바람직하게는 N-글리칸이다. 분석되는 N-글리칸은 고만노스형, 하이브리드형 또는 복합형 N-글리칸일 수 있다. 대안적으로, 분석되는 글리칸은 또한 O-글리칸일 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 형광 표지는 LC-MS 분석에 적합한 임의의 표지, 예컨대 2-아미노 벤즈아미드 (2-AB) 또는 2-아미노벤조산 (2-AA) 또는 8-아미노나프탈렌-1,3,6-트리술폰산 (ANTS)일 수 있다. 그러나, 분석되는 글리칸 및 동일한 형광 표지의 다른 동위원소 변이체를 갖는 참조 표준물질을 표지하기 위해 이용가능한 안정한 가벼운 및 안정한 무거운 동위원소 변이체가 존재하여야 한다. 바람직하게, 형광 표지는 ¹²[C] 및 ¹³[C] 동위원소 쌍, 보다 바람직하게는 ¹²[C₆] 및 ¹³[C₆] 동위원소 쌍, 훨씬 더 바람직하게는 ¹²[C₆]-2-아미노벤조산 (¹²[C₆]-2-AA) 및 ¹³[C₆]-2-아미노벤조산 (¹³[C₆]-2-AA) 동위원소 쌍이다.

본 발명의 방법에 따라 2-AA로 표지하는 것은 항체 또는 융합 단백질과 같은 재조합 당단백질의 중성 또는 산성 글리칸을 맵핑 (즉, 분석)하는데 특히 유리하다는 것이 이해될 것이다. 분석되는 글리칸은 바람직하게는 N-글리칸, 특히 올리고만노스, 하이브리드 또는 복합형인 N-글리칸이다.

한 실시양태에서, N-글리칸은 G1F 이성질체, 특히 1,3 또는 1,6 갈락토실화를 갖는 G1F 이성질체이다.

본 발명에 따른 방법에 사용되는 참조 표준물질은 형광 표지의 안정한 (제2) 동위원소로, 바람직하게는 형광 표지의 안정한 무거운 동위원소로 표지된 글리칸을 포함한다. 바람직하게는, 참조 표준물질은 샘플에서 분석된 것과 적어도 동일한 글리칸 구조를 포함한다. 분석되는 글리칸이 당펩티드와 같은 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편의 형태인 경우, 참조 표준물질은 당펩티드와 같은 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편 형태의 글리칸을 동등하게 포함한다. 참조 표준물질을 사용하면, 샘플 제조 및 나노LC-MS 분석의 차이를 보상하여 보다 정확한 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 참조 표준물질은 바람직하게는 가능한 한 빨리 샘플에 첨가된다. 또한, 참조 표준물질은 샘플이 표준화될 수 있기 때문에 개별적으로 글리칸 구조를 분석할 수 있도록 한다. 이는 각각의 글리칸 구조의 양을 참조 표준물질의 개별 글리칸의 알려진 상대적 분포에 기초하여 참조 표준물질의 각각의 글리칸 구조에 대해 개별적으로 정량할 수 있음을 의미한다. 따라서, 각각의 글리칸 구조의 PK 파라미터를 결정할 수 있다. 참조 표준물질은 관심 재조합 당단백질의 글리칸을 방출하고 형광 표지의 안정한 동위원소 변이체 중 하나를 사용하여 글리칸을 표지함으로써 제조될 수 있다. 참조 표준물질은 본 발명의 단계 e) 및 ee)에서 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게는, 단계 e) 및 ee)의 참조 표준물질은 동일하다. 예를 들어, 특정 융합 단백질의 글리칸 분석을 위해, 단계 e) 및 ee)의 참조 표준물질은 둘 모두 상기 전장 융합 단백질로부터 방출된 글리칸을 포함할 수 있다. 대안적으로, 단계 e)의 참조 표준물질은 융합 파트너, 예컨대 융합 단백질의 Fc-도메인, 알부민 또는 트랜스페린으로부터 방출된 글리칸을 포함할 수 있고, 단계 ee)에서 참조 표준물질은 이펙터 도메인으로부터 방출된 글리칸, 예컨대 융합 단백질의 TNFR의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 그러나, 참조 표준물질은 분석되는 글리칸의 글리칸 구조를 포함하여야 하고, 참조 표준물질의 글리칸 내의 글리칸 구조의 상대적 비율을 알아야 한다. 상기한 바와 같은 참조 표준물질을 사용하여 각각의 글리칸 구조의 상대적 양을 별개로 결정할 수 있다.

본 발명의 방법에서 분석되는 재조합 당단백질은 바람직하게는 융합 단백질 또는 항체, 보다 바람직하게는 Fc-융합 단백질 또는 항체이다. 재조합 단백질이 Fc-융합 단백질 또는 항체인 실시양태에서, 단계 c)에서 고체 지지체로부터 방출된 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편은 바람직하게는 Fc 도메인이다.

Fc-도메인을 함유하는 당단백질의 경우, 본 발명의 방법은 하기 단계: a) Fc-도메인을 갖는 관심 재조합 당단백질을 포함하는 2개 이상의 포유동물 액체 샘플을 제공하는 단계; b) 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질을, 샘플 내의 재조합 당단백질에 특이적인 친화성 리간드에 커플링된 별개의 고체 지지체 상에 고정시키는 단계; c) 고체 지지체로부터 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편, 바람직하게는 Fc-도메인을 재조합 당단백질의 효소적 절단에 의해 별개의 용리액 내에 방출시키는 단계; d) 임의로 상기 용리액 내의 재조합 당단백질의 Fc-도메인으로부터 글리칸을 방출시키는 단계; e) 각각의 상기 샘플의 글리칸을 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지하는 단계; 및 f) LC-MS를 사용하여 각각의 상기 샘플의 단계 e)의 표지된 글리칸을 별개로 분석하고, 상기 2개 이상의 샘플을 비교하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 형광 표지의 제2 안정한 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 참조 표준물질은 단계 c), d), e) 또는 f) 전에 각각의 상기 샘플을 첨가되고 상기 표준 표준물질은 단계 f)의 표지된 글리칸과 함께 분석된다.

하나의 특히 바람직한 실시양태에서, 재조합 당단백질은 항체이고, 항체의 가변 영역은 고체 지지체 상에 고정된 친화성 리간드에 결합하고, 바람직하게는 친화성 리간드는 항원이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 보다 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 항체로부터 선택된 IgG 항체이다. 항체는 키메라, 인간 또는 인간화 IgG 항체일 수 있고, 바람직하게는 항체는 인간 또는 인간화 IgG1 또는 IgG2 항체이다.

다른 특히 바람직한 실시양태에서, 재조합 당단백질은 Fc-도메인 및 이펙터 도메인을 포함하는 Fc-융합 단백질이고, 이펙터 도메인은 고체 지지체 상에 고정된 친화성 리간드에 결합하고, 여기서 친화성 리간드는 Fc-융합 단백질의 이펙터 도메인에 결합하는 결합 파트너 또는 특이적 항체이다.

고체 지지체에 고정된 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 제2 글리칸 함유 단편의 글리칸을 추가로 분석할 때, 액체 샘플의 예비-제거 단계가 요구된다. 바람직하게는 예비-제거 단계는 단계 b)에서 재조합 당단백질의 고정의 상류의 제2 친화도 크로마토그래피이고, 용리 후에 샘플 내의 재조합 당단백질을 풍부하게 한다. 바람직하게는, 관심 재조합 단백질의 회수율은 예를 들어 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%로 높다. Fc-도메인을 함유하는 당단백질의 경우, Fc-결합 단백질은 재조합 당단백질을 풍부하게 하기 위해 사용될 수 있다. Fc-도메인 함유 당단백질의 경우, 예비-제거 단계는 바람직하게는 aai) Fc-결합 단백질을 사용하여 고체 지지체 상에 Fc-함유 당단백질을 고정시키고, 여기서 고체 지지체는 단계 b)에서 사용된 커플링된 친화성 리간드 없이 단계 b)에서 재조합 당단백질을 고정하기 위해 사용된 고체 지지체와 동일한 물질로 제조되는 것인 단계, 및 aaii) Fc-함유 당단백질을 용리시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, Fc-결합 단백질은 단백질 G 또는 단백질 A이고, 보다 바람직하게는 상기 Fc-결합 단백질은 단백질 G이다. Fc-결합 단백질에 대한 결합 및 강한 세척 후에, IgG 또는 Fc-융합 단백질이 용리된다. Fc-결합 단백질로부터 IgG 및 융합 단백질을 용리시키기에 적합한 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 낮은 pH의 글리신 또는 아르기닌 완충제과 같은 산성 조건의 사용을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 항체의 그의 항원에 대한 또는 치료용 융합 단백질의 그의 표적에 대한 결합에 비해 Fc-도메인에 대한 단백질 G (또는 단백질 A)의 친화도가 전형적으로 더 낮기 때문에, 회수가 거의 완료된다. 분석을 왜곡시킬 수 있는 비-특이적으로 결합된 내인성 당단백질은 고체 지지체에 결합된 상태로 남아 있다. 예비-제거된 샘플을 중화시키고, 고정된 친화성 리간드를 갖는 친화도 컬럼에 첨가한다.

Fc-융합 단백질의 경우, Fc-융합 단백질의 고정 및 효소적 절단에 의한 방출 (단계 b 및 c) 후, 고체 지지체 상에 잔류하는 Fc-융합 단백질의 이펙터 도메인의 글리칸이 용액 내로 방출된다. 글리칸은 글리칸 방출 후에 형광 표지로 표지되고, 참조 표준물질과 함께 분석된다. 형광 표지의 제2 안정한 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 참조 표준물질은 이펙터 도메인의 글리칸의 방출 (단계 dd) 전에, 분석되는 글리칸의 표지 (단계 ee) 전에 또는 LC-MS를 사용한 표지된 글리칸의 분석 (단계 ff) 전에 컬럼에 첨가될 수 있다.

바람직하게는, 참조 표준물질은 이펙터 도메인 및 2-AA의 안정한 동위원소 변이체와 같은 형광 표지의 안정한 동위원소 변이체로 표지된 Fc-도메인 글리칸의 혼합물로부터의 N-글리칸을 포함한다.

하나의 실시양태에서, 재조합 단백질은 항체 또는 Fc-융합 단백질이고, 예비-제거 단계는 aai) Fc-결합 단백질을 사용하여 고체 지지체 상에 Fc 함유 당단백질을 고정시키고, 여기서 상기 Fc-결합 단백질은 바람직하게는 단백질 G 또는 단백질 A이고, 보다 바람직하게는 상기 Fc-결합 단백질은 단백질 G인 단계; 및 aaii) Fc-함유 당단백질을 용리시키는 단계를 포함하고; 상기 예비-제거 단계에서 사용되는 고체 지지체는 단계 b)에서 사용된 고체 지지체와 동일한 물질로 만들어지지만, 상기 친화성 리간드에 커플링되지 않는다.

당단백질의 글리칸 함유 단편을 방출하는, 본 발명의 방법에 따른 효소적 절단은 엔도글리카나제 또는 엔도프로테이나제를 사용하여 수행될 수 있고, 엔도프로테이나제가 바람직하다. 바람직하게는, 엔도프로테이나제는 재조합 당단백질을 효율적으로 및 특이적으로 (예를 들어, 알려진 절단 부위에서만) 절단한다. 보다 바람직하게는, 효소는 추가로 관심 재조합 당단백질에 대해 선택적이다. 이것은 특정 절단 부위가 드물고, 관심 재조합 당단백질 및 소수의 당단백질, 예컨대 당단백질의 특정 패밀리, 또는 동일한 도메인을 모두 포함하는 당단백질, 예컨대 Fc-함유 당단백질의 군에만 존재한다는 것을 의미한다. 보다 선택적인 효소는 고체 지지체로부터 비-특이적으로 결합된 당단백질의 단편의 용리를 방지하거나 감소시킨다. 바람직하게는, 방출된 글리칸 함유 단편은 하나의 글리칸을 함유하는 펩티드이거나, 방출된 Fc-도메인의 경우 각각 하나의 글리칸을 함유하는 2개의 펩티드이다. 예를 들어, 고체 지지체로부터 재조합 당단백질의 글리칸 함유 Fc-도메인을 방출시키는 본 발명의 방법에 적합한 엔도프로테이나제는 파파인, 피신, 시스테인 프로테아제 SpeB (패뷸러스) 또는 시스테인 프로테이나제 IdeS (패브리케이터®)와 같은 엔도프로테이나제이고, 바람직하게 엔도프로테이나제는 시스테인 프로테이나제 IdeS (패브리케이터®)이다. IdeS는 불변 서열 ELLGGPS의 두 글리신 사이의 힌지 영역에서 인간 IgG를 특이적으로 절단한다. 엔도프로테이나제를 이용한 효소 절단은 일반적으로 매우 효율적고, 따라서 글리칸 함유 당단백질 단편의 거의 완전한 방출을 유도한다. (예를 들어, 아르기닌 또는 글리신을 사용하여) 그 각각의 리간드를 통해 고정된 치료용 항체 또는 융합 단백질의 산성 용리에 비해, 효소 절단을 통한 용리는 종종 보다 효율적이고 완전하고, 따라서 본 발명의 방법의 감도가 보다 높아진다. 비-선택적 엔도프로테이나제, 예컨대 Lys의 카르보닐 측면에서 특이적으로 가수분해하는 Lys-C 또는 대부분의 당단백질 내에서 여러 번 절단하는 트립신은 본 발명의 측면에서 적절하지 않다.

효소적 절단은 특정 N- 또는 O-글리코실화 부위에 대한 특이성을 갖는 글리카나제를 사용하여 수행될 수도 있다. 상기 글리카나제는 예를 들어 Fc-도메인 함유 당단백질에서 N-글리칸에 대해 선택적인 엔도스글리카나제 (IgGZERO®)이다. 그러나, 이것은 Fc-도메인의 N-글리칸에서 GlcNAc-β1,4-GlcNAc 결합을 절단하여 푸코스 결여 글리칸을 방출한다. 따라서, 엔도스글리카나제는 푸코실화가 관심 대상이 아닌 경우에만 적합하다.

융합 단백질에서, 이펙터 도메인의 N-글리칸 및 융합 파트너, 예컨대 Fc-도메인, 알부민 또는 트랜스페린을 개별적으로 분석하여 부위 특이성에 대한 보다 많은 정보를 얻을 수 있다. 아래에서, 본 발명에 따른 방법은 Fc-융합 단백질에 대해 예시될 것이다. 그러나, 통상의 기술자는 방법을 다른 융합 단백질에 변용하는 방법을 알고 있다. Fc 부분 및 이펙터 도메인 N-글리칸의 개별 분석을 위해, 두 부분을 분리해야 한다. 따라서, 융합 단백질은 이펙터 도메인이 고체 지지체, 예컨대 세파로스 수지에 고정되고, Fc 부분은 IdeS 효소와 같은 효소를 사용하여 효소적으로 방출된다. IdeS는 Fab2 및 Fc 단편을 생성하는 힌지 영역 아래에서 IgG 및 높은 특이성을 갖는 관련 분자를 선택적으로 절단하는 엔도펩티다제이다. 또한, IdeS는 IgG Fc-도메인 함유 융합 단백질을 절단한다. 융합 단백질은 디술피드 다리에 의해 연결되고 상호작용 파트너 또는 항원 및 Fc-도메인에 결합할 수 있는 이펙터 도메인 (예를 들어, 수용체 부분)으로 절단된다. 대안적으로, 이펙터 도메인의 글리칸과 Fc-도메인의 글리칸 사이에서 선택적으로 절단하는 임의의 다른 엔도프로테이나제를 사용할 수 있다. 대안적으로, 다른 융합 단백질의 경우, 적절한 엔도프로테이나제는 이펙터 도메인의 글리칸과 융합 파트너, 예컨대 알부민 또는 트랜스페린의 글리칸 사이를 절단한다. 바람직하게는, 엔도프로테이나제는 이펙터 도메인의 글리칸과 Fc 도메인의 글리칸 사이의 융합 단백질만을 절단한다. 훨씬 더 바람직하게는, 엔도프로테이나제는 샘플 내의 모든 단백질은 아니지만, 샘플 내의 융합 단백질 또는 군 (또는 융합 단백질을 포함하는 단백질의 패밀리)을 선택적으로 절단한다. 이것은 방법의 추가의 특이성을 제공하고, 비-특이적으로 결합된 당단백질 단편의 오염을 감소시킨다. 예를 들어, IdeS 효소는 항체 및 Fc-융합 단백질에서 힌지 영역 아래의 IgG Fc-도메인을 절단하고, 따라서 Fc-도메인을 갖지 않는 다른 오염 당단백질에 의한 방출된 Fc-도메인의 오염을 감소시킨다. 또한, 융합 단백질은 이 방법에서 사용될 수 있는, 이펙터 도메인과 융합 파트너 사이의 분자 클로닝에 의해 도입된 특이적 절단 부위를 함유할 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용되는 형광 표지는 LC-MS 분석에 적합한 임의의 표지, 예컨대 2-아미노 벤즈아미드 (2-AB), 2-아미노 벤조산 (2-AA) 또는 8-아미노나프탈렌-1,3,6-트리술폰산 (ANTS)일 수 있다. 그러나, 분석되는 글리칸 및 동일한 형광 표지의 다른 동위원소 변이체를 갖는 참조 표준물질을 표지하기 위해 이용가능한 안정한 가벼운 및 안정한 무거운 동위원소 변이체가 존재하여야 한다. 바람직하게는, 형광 표지는 ¹²[C] 및 ¹³[C] 동위원소 쌍, 보다 바람직하게는 ¹²[C₆] 및 ¹³[C₆] 동위원소 쌍, 훨씬 더 바람직하게는 ¹²[C₆]-2-아미노벤조산 (¹²[C₆]-2-AA) 및 ¹³[C₆]-2-아미노벤조산 (¹³[C₆]-2-AA) 동위원소 쌍이다.

본 발명의 방법에 따라 2-AA로 표지하는 것은 항체 또는 융합 단백질과 같은 재조합 당단백질의 중성 또는 산성 글리칸을 맵핑 (즉, 분석)하는데 특히 유리하다는 것이 이해될 것이다. 분석되는 글리칸은 바람직하게는 N-글리칸, 특히 올리고만노스, 하이브리드 또는 복합형인 N-글리칸이다. 한 실시양태에서, N-글리칸은 G1F 이성질체, 특히 1,3 또는 1,6 갈락토실화를 갖는 G1F 이성질체이다.

본 발명의 방법에서 글리칸의 형광 표지 후에, 접근 표지는 겔 여과를 사용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 세파덱스 (Sephadex) G10 컬럼은 물로 평형화될 수 있고, 형광 표지된 글리칸, 자유 형광 표지 및 임의로 참조 표준물질을 포함하는 혼합물을 겔 여과 컬럼에 첨가한다. 표지된 글리칸 및 참조 표준물질은 물로 용리시킨 후, 진공 원심분리기에서 물을 증발시키고, 건조된 샘플을 LC-MS 분석을 위해 물에 용해시킬 수 있다. 통상의 기술자는 다중 웰 플레이트, 예컨대 96웰 플레이트 또는 다른 크기를 사용함으로써 겔 여과를 많은 샘플을 사용하여 동시에 수행할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편으로부터 글리칸의 방출은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다.

예를 들어, 후속 표지화 (또는 경우에 따라 분석)를 위한 글리칸의 화학적 방출은 히드라진 분해 또는 알칼리성 β-제거에 의해 영향받을 수 있고, 이 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 화학적 제거를 위한 예시적인 유용한 키트는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 제공하는 글리코프로파일(GlycoProfile)™ IV 화학적 탈글리코실화 키트이다.

효소 방법에 의한 글리칸의 방출이 바람직하고, 이것은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 어떠한 문제도 유발하지 않는다. 후속 표지화 (또는 분석)를 위한 특히 바람직한 글리칸 제거 방법은 PNGaseF (펩티드 N-글리코시다제 F)로 소화시키는 것이다. 다양한 적합한 PNGaseF 효소가 대부분 조작되거나 최적화된 PNGaseF인, 상이한 상표명 (예컨대, N-글리카나제®)으로 상업적으로 제공되지만, 조작된 또는 최적화된 PNGaseF의 사용이 본 발명의 측면에서 필수적인 것은 아니다. 또한, 효소적 방출은 글리칸 코어의 두 N-아세틸글루코사민 사이를 절단하여 제1 단당류를 단백질에 부착된 상태로 유지하는 엔도글리코시다제 H (또는 유사한 효소 활성을 갖는 효소, 예컨대 엔도스글리카나제 IgGZERO™) 또는 엔도글리코시다제 F2를 사용하여 수행할 수도 있다. 그러나, 글리칸이 푸코스를 보유했는지의 여부에 관한 정보는 상기 방식에서 상실된다. 또한, 엔도글리코시다제 H 및 엔도글리코시다제 F2는 올리고만노스 및 하이브리드 이중-안테나 글리칸에만 특이적이다.

혈청과 같은 포유동물 액체 샘플에서 글리칸을 분석하는 경우, 컬럼 내 탈글리코실화는 세파로스 수지에 비-특이적으로 결합하는 내인성 혈청 당단백질이 추가의 세척 단계에 의해 제거될 수 없기 때문에, 단계 b) 전에 예비-제거 단계와 조합하여서만 사용해야 한다. Fc 부분에 단 하나의 N-글리코실화 부위만 있으면, 항체는 효소적 용리 단계에 특히 적합하다. 효소 IdeS는 디술피드 연결의 IgG 중쇄 C-말단을 선택적으로 절단하여, 나중에 고효율로 탈글리코실화될 수 있는 2개의 글리코실화된 중쇄 단편을 방출한다. 이론적으로, 하나 초과의 효소적 용리 단계가 수행될 수 있다. 재조합 당단백질의 고정된 글리칸 함유 단편의 글리칸 분석을 위해, 고체 지지체에 재조합 당단백질을 고정하기 (단계 b) 전에 예비-제거 단계와 조합하여 컬럼 내 탈글리코실화를 수행한다. 바람직하게는, 예비-제거 단계는 샘플 내의 재조합 당단백질을 풍부하게하기 위해 친화도 정제를 포함한다.

본 발명의 방법에 사용되는 LC-MS는 바람직하게는 역상 LC-MS 또는 나노LC-MS이고, 보다 바람직하게는 LC-MS는 역상 나노LC-MS이다.

항체, 융합 단백질 또는 다른 당단백질을 친화도 정제하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 사용되는 고체 지지체는 수지, 예컨대 마이크로비드, 바람직하게는 세파로스 비드, 아가로스 비드 또는 자기 비드, 보다 바람직하게는 세파로스 비드를 포함하는 수지일 수 있다. 그러나, 친화도 크로마토그래피에 적합한 임의의 고체 지지체 또는 수지가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 친화성 리간드는 N-히드록시숙신이미드 (NHS), 시아노겐 브로마이드, 에폭시, 카르보디이미드 또는 티오프로필을 통해, 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 통해 고체 지지체에 커플링될 수 있다. 다시, 친화성 리간드를 고체 지지체에 커플링시키는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 상기 링커 중 하나를 사용하여 활성화된 수지는 상업적으로 이용가능하다.

전형적으로 본 발명의 방법을 사용하여 분석되는 재조합 당단백질은 치료상 관련되는 재조합 당단백질이다. 치료상 관련되는 재조합 당단백질은 종종 그의 치료 표적에 대한 매우 높은 친화도 및 특이성을 갖는다. 따라서, 치료 표적은 포유동물 액체 샘플로부터 재조합 당단백질을 포획하고 그것을 고체 지지체에 고정하는 친화성 리간드로서 매우 적합하다. 예를 들어, 각각의 항원을 사용한 항체의 친화도 정제는 항체와 그의 항원과의 강한 상호작용으로 인해 매우 높은 친화도 및 특이성의 이점을 갖는다. 그의 항원에 대한 치료용 항체의 친화도는 전형적으로 피코몰 내지 낮은 나노몰 범위이다. 에타네르셉트와 같은 치료상 관련되는 융합 단백질은 전형적으로 유사한 친화도로 치료 표적에 결합한다. 그러나, 이러한 고친화도 결합의 한 가지 주요 단점은 산성 용리 후에 항체 또는 융합 단백질의 제한된 회수이다. 따라서, 효소적 절단을 이용하여 당단백질의 글리칸 함유 단편을 용리함으로써 회수가 개선될 수 있다.

친화성 리간드는 수용체에 대한 리간드, 기질, 항원 또는 항체를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 결합 파트너일 수 있다. 치료상 관련되는 당단백질의 경우, 친화성 리간드는 바람직하게는 치료 표적 또는 그의 단편이다. 친화성 리간드는 또한 치료 표적 또는 그의 단편의 돌연변이체, 바람직하게는 야생형 치료 표적 또는 그의 단편에 비해 더 높은 친화도로 재조합 당단백질에 결합하는 돌연변이체일 수 있다. 재조합 당단백질이 항체인 경우, 친화성 리간드는 바람직하게는 항체에 결합하는 항원, 보다 바람직하게는 높은 친화도로 항체에 결합하는 항원이다. 항원은 예를 들어 짧은 펩티드를 포함하는 하나 초과의 단백질, 전장 단백질 또는 그의 단편의 복합체일 수 있다. 융합 단백질의 경우, 친화성 리간드는 바람직하게는 융합 단백질의 이펙터 도메인에 결합하는 결합 파트너일 수 있다. 친화성 리간드는 또한 융합 단백질의 이펙터 도메인에 결합하는 항체일 수 있다. 임의의 다른 관심 당단백질에 대해서도, 친화성 리간드는 마찬가지로 관심 재조합 당단백질에 결합하는 결합 파트너 또는 항체일 수 있다. 바람직하게는, 친화성 리간드는 글리코실화되지 않는다.

본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 2개 이상의 포유동물 액체 샘플 또는 그의 분취액은 다중 웰 필터 플레이트, 바람직하게는 24, 96 또는 384 웰 필터 플레이트, 보다 바람직하게는 96 웰 필터 플레이트를 사용하여 분석을 위해 제조된다. 필터 막은 바람직하게는 낮은 단백질 결합 및/또는 소수성 막, 예컨대 니트로셀룰로스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막이다. 이러한 필터 플레이트는 첨가된 시약 또는 수지에 따라 친화도 크로마토그래피, 효소 소화, 형광 표지 및 겔 여과에 적합하다.

재조합 단백질을 포함하는 포유동물 액체 샘플은 체액이고, 바람직하게는 혈청 또는 혈장, 소변, 뇌척수액, 양수, 타액, 땀, 정액, 눈물, 가래, 질 분비물, 질 세척액 및 결장 세척액으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 바람직하게 상기 샘플은 혈장 또는 혈청 샘플이다. 바람직하게는, 분석되는 샘플의 부피는 약 1 ㎕ 내지 약 1000 ㎕, 약 5 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 약 25 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 또는 약 40 ㎕ 내지 약 75 ㎕, 바람직하게는 약 50 ㎕이다. 바람직한 실시양태에서, 2개 이상의 포유동물 액체 샘플은 동일한 대상체로부터 수득하였다. 본 발명의 방법에서 분석되는 포유동물 액체 샘플은 인간, 원숭이, 설치류, 개, 고양이 또는 돼지 샘플, 바람직하게는 마우스, 래트, 햄스터 또는 토끼와 같은 설치류 샘플일 수 있다.

본 발명의 방법은 관심 재조합 당단백질의 글리칸의 적어도 하나의 특정 글리칸 구조의 약동학적 파라미터, 바람직하게는 C_max, t_max, AUC 또는 t_{1/ 2}을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 2개 이상의 포유동물 액체 샘플은 동일한 대상체로부터의 상이한 시점에 수득하였고, 여기서 적어도 약 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h, 168 h, 336 h, 504 h, 672 h, 840 h는 제1 시점과 마지막 시점 사이에 있을 수 있다. 바람직하게는, 2개 이상의 포유동물 액체 샘플은 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상 또는 50개 이상의 샘플이다.

본 발명의 방법은 (i) 시간에 따른 제1 동위원소 샘플 글리칸 대 제2 동위원소 참조 표준물질의 비를 얻기 위해, 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지된 각각의 샘플로부터의 글리칸의 및 형광 표지의 제2 동위원소로 표지된 그의 각각의 참조 표준물질 글리칸의 추출된 이온 크로마토그램 (EIC)의 곡선 하 면적을 결정하는 단계, 및 (ii) 각각의 상기 샘플에 대해 참조 표준물질 내의 개별적인 글리칸의 공지된 상대적인 분포를 기초로 하여 글리칸의 백분율을 선택적으로 계산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 각각의 개별적인 글리칸에 대해 2개 이상의 샘플의 비율 또는 글리칸 백분율이 비교될 수 있고, 예를 들어, 시간에 대해 플롯팅될 수 있다. 바람직하게는, 글리칸은 N-글리칸이다.

예를 들어, 시간에 대해 플롯팅된, 샘플 N-글리칸 (가벼운 신호) 대 일정한 무거운 동위원소 표준 N-글리칸 (무거운 신호)의 L/H 비율은 각각의 N-글리칸에 대한 글리칸 PK 프로파일을 제시한다. 대안적으로, 계산된 샘플 N-글리칸 백분율을 시간에 대해 플롯팅하여, 각각의 N-글리칸의 글리칸 PK 프로파일을 얻을 수 있다. 결정된 글리칸 PK 프로파일은 각각의 ELISA 프로파일과 비교될 수 있고, 글리칸 지도의 계산을 위한 기초가 된다. 통상의 기술자는 안정한 무거운 동위원소가 분석되는 글리칸을 표지하기 위해 사용될 때, 안정한 가벼운 동위원소가 참조 표준물질의 표지로서 동등하게 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 달리 말하면, 참조 표준물질의 글리칸이 분석되는 글리칸과 상이한 이소형 변이체의 형광 표지로 표지되는 한, 안정한 가벼운 동위원소 형광 표지 및 무거운 동위원소 형광 표지가 동등하게 적합하다. 통상의 기술자는 "무거운" 글리칸 참조 표준물질 조성이 표지된 글리칸 분자의 수에 직접 비례하는 표지에만 의존하는 UV 신호를 사용하여 결정되기 때문에, 글리칸의 백분율 (%)은 몰을 의미한다는 것을 이해할 것이다.

상기 글리칸은 또한 포유동물의 상기 2개 이상의 각각의 액체 샘플의 분취액에서 본 발명의 방법에 따라 분석될 수 있다. 바람직하게는, 분석되는 분취액의 부피는 약 1 ㎕ 내지 약 1000 ㎕, 약 5 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 약 25 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 또는 약 40 ㎕ 내지 약 75 ㎕, 바람직하게는 약 50 ㎕이다. 임의로, 상기 재조합 당단백질의 농도는 상기 2개 이상의 포유동물 액체 샘플의 추가의 분취액에서 분석될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 재조합 당단백질의 농도는 ELISA 또는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다른 방법에 의해 샘플 내의 특정 단백질의 농도를 결정하기 위해 분석된다.

본 발명의 방법과 관련하여 수행되는 액체 크로마토그래피-MS는 바람직하게는 역상 액체 크로마토그래피 (RP-LC-MS), 보다 바람직하게는 역상 고처리량 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC-MS) 또는 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC-MS)로 분석하였다. 이 경우, 본 발명과 관련하여 수행되는 RP-LC의 다른 바람직한 경우와 같이, 이들 크로마토그래피 방법은 역상 액체 크로마토그래피 컬럼에서 수행된다. 바람직하게는, RP-LC는 글리칸에 부착된 2-AA 표지의 카르복시기가 중성인 조건 하에서 수행된다. 역상 LC가 본 발명의 방법에서 바람직하고, 그 이유는 이동상이 질량 분광 분석법과의 상용성이 보다 우수하여 정상 상 LC에 비해 보다 민감한 분석을 가능하게 하기 때문이다. 임의로, 이온쌍 시약은 이동상에 사용되지 않는다. 바람직하게는, 산성 이동상이 RP-LC를 위해 사용된다.

본 발명의 방법과 관련하여 수행되는 액체 크로마토그래피는 바람직하게는 나노-LC 또는 나노-HPLC, 보다 바람직하게는 역상 나노-LC 또는 역상 나노-HPLC이다. 나노-LC는 각각 종래의 LC 또는 HPLC에 비해 LC에 사용되는 컬럼의 감소된 내경 (10-150 ㎛) 및 더 느린 유속 (10-1000 nl/min)을 특징으로 한다. 이러한 규모 축소는 낮은 펨토몰 및 펨토몰 미만의 범위에서 단백질 샘플을 분석하는 능력을 제시하고 (Chervet et al., Analytical Chemistry 1996, 68:1507-12), 따라서 분석되는 샘플 부피 및 투여 후 재조합 당단백질의 글리칸 검출을 위한 지속 시간을 감소시킬 수 있다.

RP-LC 동안 사용되는 적합한 이동상은 포름산을 포함한다. 이와 관련하여, 이동상 내의 포름산의 바람직한 양은 약 0.1% 내지 약 2.0% 포름산이다. 따라서, 바람직한 바람직한 양은 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1.0%, 약 1.1%, 약 1.2%, 약 1.3%, 약 1.4%, 약 1.5%, 약 1.6%, 약 1.7%, 약 1.8% 또는 약 1.9% 포름산을 포함한다. 이동상 내의 약 1.0% 포름산의 양이 특히 바람직하다.

RP-LC 동안 사용되는 또 다른 적합한 이동상은 아세트산을 포함한다. 이와 관련하여, 이동상 내의 아세트산의 바람직한 양은 다시 약 0.1% 내지 약 2.0% 아세트산이다. 따라서, 바람직한 바람직한 양은 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1.0%, 약 1.1%, 약 1.2%, 약 1.3%, 약 1.4%, 약 1.5%, 약 1.6%, 약 1.7%, 약 1.8% 또는 약 1.9%의 아세트산을 포함한다. 이동상 내의 약 1.0% 양의 아세트산이 특히 바람직하다.

또한, RP-LC 동안 사용되는 이동상의 적합한 pH 값은 약 1 내지 약 4, 보다 바람직하게는 약 1.5 내지 약 3, 보다 바람직하게는 약 1.8 내지 약 2.9, 훨씬 더 바람직하게는 약 1.9 내지 약 2.75, 특히 바람직하게는 약 2 내지 약 2.7이다. 특히 약 2.1 내지 약 2.18의 pH 값이 바람직하다. 따라서, 본원에서 설명된 및/또는 특허 청구된 방법 및 용도에 따라 RP-LC 동안 사용되는 바람직한 이동상은 약 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6 또는 2.7의 pH 값을 가질 것이고, 약 2.1 또는 약 2.18의 pH 값이 특히 바람직하다.

본 발명의 방법의 과정에서, LC 또는 RP-LC에 의한 형광 (바람직하게는 2-AA) 표지된 글리칸의 분리는 유리하게는 약 4℃ 내지 약 실온의 온도, 또는 실온에서 수행될 수 있다 (실온은 본 발명의 목적을 위해 23℃로 규정됨). 그러나, 바람직하게는, 분리는 실온 초과의 온도에서 수행된다. 이와 관련하여, 약 40℃ 내지 약 60℃의 온도가 바람직하고, 약 50℃가 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 나노RP-LC 또는 나노LC 컬럼의 적절한 유속은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 공지되거나 결정될 것이다. 일반적으로, 적절한 유속은 전형적으로 분당 약 50-1000 nl이다. 예를 들어, 분당 약 100-500 nl의 유속이 바람직하다. 따라서, 유속의 바람직한 값은 분당 약 100 nl, 분당 약 200 nl, 분당 약 300 nl, 분당 약 400 nl 또는 분당 약 500 nl이고, 분당 약 300 nl의 유속이 특히 바람직하다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 방법은 LC 또는 RP-LC를 통한 그의 분리 후에 형광 표지된 글리칸 (바람직하게는 2-AA 표지된 글리칸)을 질량 분광 분석 (MS)에 적용하는 것을 포함하고, LC 또는 RP-LC를 MS 분석과 직접 커플링시켜 수행되는 방법이 특히 바람직하다. 이와 관련하여 적합한 질량 분광 분석법은 양이온 질량 분광법과 같은 이온-트랩 질량 분광법을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 아토몰 농도의 개개의 표지된 글리칸, 예를 들어 800 amol만큼 낮은 농도, 바람직하게는 600 amol만큼 낮은 농도, 보다 바람직하게는 400 amol만큼 낮은 농도의 분석을 허용한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 20 ㎍/ml 이하, 10 ㎍/ml 이하, 5 ㎍/ml 이하, 2 ㎍/ml 이하, 1 ㎍/ml 이하, 0.5 ㎍/ml 이하, 0.2 ㎍/ml 이하 또는 0.1 ㎍/ml 이하의 포유동물의 2개 이상의 각각의 액체 샘플의 재조합 당단백질 농도에서 재조합 당단백질의 글리칸을 분석하는 것을 허용한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 1.0 ㎍ 이하, 0.5 ㎍ 이하, 0.25 ㎍ 이하, 0.1 ㎍ 이하, 0.05 ㎍ 이하, 0.025 ㎍ 이하, 0.01 ㎍ 이하 또는 0.005 ㎍ 이하의 재조합 단백질을 각각 포함하는 2개 이상의 포유동물 액체 샘플에서 재조합 당단백질의 글리칸을 분석하는 것을 허용한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 적어도 단계 b), c), d) 및 e) 및/또는 적어도 단계 aa), dd) 및 ee)는 고처리량 방식으로 조작된다.

또한, 본 발명은 상기 청구항 중 어느 한 항에 따른 포유동물 액체 샘플에서 재조합 당단백질의 글리칸을 분석하는 단계, 및 당단백질을 당단백질 기반 제약 조성물로 제제화하는 단계를 포함하는, 당단백질 기반 제약 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 임의로, 재조합 당단백질은 당단백질을 제약 조성물로 제제화하기 전에 당조작된다.

본원에서 인용된 모든 간행물은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

본 발명은 하기의 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시되고, 이것은 본원의 특허 청구 범위에 의해 부여되는 보호 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.

실시예

재료

2-아미노벤조산, 에탄올아민, 포름산, 피콜린 보란, DMSO, ¹³C 아미노벤조산은 시그마 (독일 뮌헨)으로부터 입수하였다. PNGaseF는 로슈 (Roche, 독일 펜즈베르크)로부터 입수하였다. 아세트산, 아세토니트릴 및 염산은 머크 (Merck, 독일 다름쉬타트)로부터 입수하였다. 단백질 G, NHS 활성화 세파로스, 세파덱스® G-10 96-웰 플레이트 및 96-웰 딥 웰 플레이트는 지이 헬쓰케어 (GE Healthcare, 독일 뮌헨) 제품이었다. TNF-α는 페프로테크 (Peprotech, 독일 함부르크) 제품이었다. 인산염 완충 염수는 깁코/라이프 테크놀로지스 (Gibco/Life technologies, 독일 다름쉬타트)에서 입수하였다.

멀티스크린 (Multiscreen) THS HV 필터 플레이트는 밀리포어 (Milipore)에서 입수하였다. 패브리케이터는 제노비스 (Genovis, 스웨덴 룬드)에서 입수하였다. 96-웰 플레이트는 넝크/써모 사이언티픽 (Nunc/Thermo Scientific, 독일 뮌헨)에서 제조하였다. AcroPrep™ 어드밴스 오메가(Advance Omega)™ 10K 96-웰 필터 플레이트는 팔 (Pall, 독일 드라이아이히)에서 입수하였다. 전임상 토끼 혈청 샘플은 산도즈 (Sandoz)의 임상 생체 분석물로부터 얻은 것이다.

실시예 1: IgG1 생물의약품의 약동학에 대한 글리콜-변이체의 영향

전임상 토끼 연구

전임상 연구는 뉴질랜드 흰 토끼에서 수행하였다. 10 mg/kg (체중)의 IgG1 mAb1 (항-TNF-α 항체)의 단일 피하 투여 후, 혈액 샘플을 하나의 투여 전 혈액 샘플을 포함하여 일정 기간에 걸쳐 채취하였다. 혈청 샘플은 투여 후 12개의 시점에서 채취하였다. 자세한 샘플링 내역은 표 1에 제시되어 있다. 혈청 내 mAb1의 농도는 ELISA에 의해 결정되었다. 나머지 혈청에서 2 x 50 ㎕ 분취액을 글리칸 PK 프로파일링에 사용하였다. 첫 번째 분취액을 분석하고, 두 번째 분취액을 백업 분취액으로 사용하였다.

<표 1>

IgG1의 전임상 연구 샘플링 일정. 각각의 샘플링 시점에서 ~500 ㎕의 혈청을 채취하였다.

항원 재구성

이. 콜라이(E. coli)에서 생산된 재조합 인간 항원 (TNF-α)을 제조자의 지시에 따라 재구성하였다. 항원을 H₂O (1 mg/ml)에 용해시키고, 실온에서 2시간 동안 재구성하였다.

¹³ C 2-AA 표지된 글리칸 표준물질의 제조

탈염된 mAb (1 mg)의 N-글리칸은 37℃에서 밤새 (17시간) PNGaseF 소화를 사용하여 방출되었다. 아미콘 (Amicon) 30K 필터 장치를 사용하여 N-글리칸을 단백질로부터 분리하고, 스피드백 (speedvac)을 사용하여 건조시켰다. 피콜린 보란 및 [¹³C] 2-AA를 70:30 (% v/v) DMSO-아세트산에 용해시켜 각각 63 및 50 mg/ml의 농도를 제공하였다. 15 nmol의 효소에 의해 방출되고 건조된 글리칸에 표지화 용액 (15 ㎕) 및 탈이온수 (10 ㎕)를 첨가하였다. 표지화 반응은 37℃에서 17시간 동안 수행되었다.

과량의 표지는 G-10 컬럼에서의 겔 여과에 의해 제거하였다. 컬럼을 10 ml H₂O로 조건화하였다. 샘플을 탈이온수로 100 ㎕로 희석하고, 컬럼에 적용하였다. 700 ㎕ H₂O로 컬럼을 세척한 후, 정제된 형광 표지된 N-글리칸을 600 ㎕ H₂O로 용리시켰다. 정제된 [¹³C] 2-AA 표지된 N-글리칸을 분취하고, 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

고정된 항원을 갖는 96-웰 플레이트 친화도 컬럼의 제조

친수성 저-단백질 결합 막 (멀티스크린 THS HV 필터 플레이트)을 포함하는 96웰 필터 플레이트의 막을 웰당 200 ㎕ NHS 활성화 세파로스-이소프로판올 슬러리의 첨가 전에 1 mM HCl (100 ㎕)로 젖게 하였다. 이소프로판올을 원심분리에 의해 제거하고, 컬럼을 1 mM HCl (150 ㎕)로 4회 세척하였다. 항원 용액 (100 ㎕, 50 ㎕/ml)을 원심분리하여 컬럼에 넣고, 실온에서 2시간 동안 커플링 반응이 발생하도록 하였다. 친화도 컬럼을 세척하고, 남아있는 NHS 기를 에탄올아민 완충제 (150 ㎕)를 사용하여 불활성화시켰다. 마지막으로, 컬럼을 PBS로 평형화하였다.

IgG1 생물의약품 및 글리칸 방출의 친화도 정제

혈청 샘플 (50 ㎕)을 PBS로 100 ㎕로 희석하고, 원심분리에 의해 친화도 정제 컬럼에 적용하였다. 결합된 mAb를 PBS로 수 회 세척하여 혈청 및 비-특이적 결합 단백질을 제거하였다. 패브리케이터 용액 (1 U/㎕)을 컬럼 내로 원심분리하여 mAb의 글리코실화된 Fc 부분을 방출시켰다. 반응은 37℃에서 30분간 수행되었다. 방출된 Fc 부분은 PBS로 용리시키고, ¹³C-2-AA 표지된 N-글리칸 표준물질과 함께 PNGaseF를 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 17시간 동안 인큐베이션하였다. 나머지 단백질은 10 K 컷-오프 막을 갖는 96-웰 플레이트를 사용한 한외여과에 의해 제거하였다. 글리칸 표준물질을 갖는 방출된 N-글리칸은 진공 원심분리에 의해 건조시켰다.

N- 글리칸 표지화

자유 환원 말단 N-글리칸 및 ¹³C-2-AA 표지된 글리칸 표준물질을 함유하는 건조 샘플을 H₂O (10 ㎕) 내에 용해시키고, 2-AA 표지화 용액 (15 ㎕; DMSO 및 아세트산의 7:3 혼합물 내의 100 mg/ml의 피콜린 보란, 50 mg/ml 2-AA)을 첨가하고, 37℃에서 17시간 동안 배양하였다.

겔 여과

이어서, 과량의 표지를 겔 여과에 의해 제거하였다. 맞춤 제작 96-웰 플레이트 세파덱스 G-10 컬럼을 800 ㎕ H₂O로 평형화하였다. 표지된 샘플을 H₂O를 사용하여 100 ㎕까지 채우고, 겔 여과 컬럼에 적용하였다. 2-AA 및 ¹³C 2-AA 표지된 N-글리칸을 H₂O (150 ㎕)로 용리시켰다. 마지막으로, 샘플을 진공 원심분리에 의해 건조시키고, 나노LC-MS 분석을 위해 20 ㎕ H₂O 내에 용해시켰다.

표지된 N- 글리칸의 나노LC

표지된 샘플 N-글리칸 및 무거운 동위원소 표준물질을 RP 나노LC-MS로 분석하였다. 나노LC (써모/디오넥스 얼티미트 (Thermo/Dionex Ultimate) 3000)는 예비 농축 컬럼 (3 ㎛ 입자, 75 ㎛ x 2 cm) 및 분석 컬럼 (2 ㎛ 입자, 75 ㎛ x 25 ㎝)을 사용하여 제조자의 매뉴얼에 따라 "예비 농축" 모드로 설치하였다. 컬럼 컴파트먼트를 40℃에서 유지하였다. 나노 펌프의 이동상은 H₂O 내의 0.5% 포름산 (성분 A) 및 50% ACN 내의 0.5% 포름산 (성분 B)으로 이루어졌다. 모세관 펌프의 이동상은 H₂O 내의 0.5% 포름산 및 1% ACN (성분 C)으로 이루어졌다. 분석 컬럼을 유속 300 nl/min에서 2% 성분 B로 평형화하였다. 예비 농축 컬럼을 100% 성분 C로 평형화하였다. 사용자가 정의한 정해진 주입 과정을 사용하여, 8 ㎕ 샘플을 20 ㎕ 샘플 루프 내의 로딩 용액 (초순수 중 0.1% 포름산, 1% ACN) 사이에 쌓았다. 최적 포획을 보장하기 위해 샘플 루프를 2분 동안 모세관 펌프 유동에 직렬로 이어지도록 전환하였다. 다음 주입 샘플 전에 루프를 로딩 용액으로 세척하였다. 포획 후, 예비 농축 컬럼을 나노 펌프 유동으로 전환하고, 성분 B를 60분에 걸쳐 30%로 증가시키고, 이어서 5분에 걸쳐 95%로 상승시켰다. 95% 성분 B를 5분 동안 유지한 후, 컬럼을 최종적으로 15분 동안 2% 성분 B에서 재평형화하였다. 컬럼 출구는 3 nl 유동-셀이 구비된 UV 검출기에 연결되었다.

질량 분광 분석

나노LC의 출구는 온-라인 나노 공급원 (브루커 캡티브스프레이(Bruker CaptiveSpray)®)가 장착된 이온 트랩 ESI-MS (브루커 아마존 (Bruker AmaZon))에 직접 커플링되었다. 이온 트랩은 1.7 kV의 모세관 전압에서 향상된 분해능 모드로 작동되었다. 공급원 온도를 200℃로 설정하고, 3 l/min의 건조 가스 유속을 사용하여 공급원을 가열하였다.

데이터 해석은 각각의 가벼운 샘플 글리칸의 면적 및 그의 EIC로부터의 적절한 무거운 동위원소 표준물질을 결정함으로써 수행된다. 상기 가벼운 대 무거운 비율 (L/H)은 각각의 시점 및 동물에서 각각의 N-글리칸에 대해 결정된다. 시간에 대해 L/H 비율을 플롯팅함으로써, 각각의 N-글리칸에 대한 PK 프로파일을 얻는다. N-글리칸 백분율은 각각의 시점에 대한 무거운 동위원소 표준물질 글리칸의 알려진 상대적인 분포로 계산할 수 있다.

mAb1 N- 글리코실화 및 연구의 조건

친화도 정제를 제한하고 제어하기 위해, QC 샘플을 알려진 양의 mAb1을 NZW 토끼 혈청 내에 첨가하여 준비하였다. QC 샘플은 이전에 ELISA에 의해 결정된 연구의 농도 범위를 포함하였다. 도 2a는 mAb1 QC 샘플의 평균 백분율을 보여준다. 샘플은 10 ㎍/ml와 100 ㎍/ml 사이의 농도를 포괄하였다. 하나의 혈청 블랭크를 포함하여 총 4개의 QC 샘플 (0 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml)가 이중으로 사용되었다. QC 샘플로부터 얻은 글리칸의 평균 백분율은 mAb1 N-글리칸 조성을 나타낸다. 글리코실화 항체 단편의 개발된 효소 용리로 매우 높은 선택성 및 순도가 달성될 수 있다. mAb1의 간섭 N-글리칸은 분석으로부터 제외된 2개의 중요하지 않은 풍부한 이분 변이체를 제외하고는 함께 정제되지 않았다. 추가적인 혈청 관련 N-글리칸은 검출되지 않았다. 감도는 10 ㎍/ml (LLOQ)의 농도에서 적어도 0.1%의 백분율로 모든 N-글리칸을 분석하기에 적어도 충분하였다. 그러나, 향상된 나노 ESI 공급원을 사용하여 감도를 약 0.1 μ/ml로 향상시킬 수 있다.

N-글리칸은 주로 코어 푸코스를 갖는 복잡한 이중안테나성이었다 (도 2b). 도 2a에서 알 수 있듯이, 가장 풍부한 N-글리칸은 말단 N-아세틸글루코사민 잔기를 갖는 G0F (65%)이고, 이어서 하나의 추가의 말단 갈락토스를 갖는 G1F (16%)이었다. 높은 만노스 글리칸 M5 (9.5%)가 세 번째로 가장 풍부한 N-글리칸이었다. 다른 모든 N-글리칸은 3% 미만의 백분율을 보였다. mAb1은 말단 시알산을 갖는 N-글리칸을 포함하지 않았다.

전임상 연구: mAb1 및 ELISA의 글리칸 PK 프로파일

결정된 글리칸 L/H 비율을 샘플링 시간에 대해 플롯팅하여 각각의 N-글리칸에 대한 PK 프로파일을 얻었다. 각각의 N-글리칸의 평균 L/H 비율은 최대로 정규화되었다. ELISA 데이터도 동일한 방식으로 정규화되었다. ELISA 및 L/H 값의 상대적 농도를 그래픽으로 비교하였다. 도 3은 N-글리칸의 생성되는 곡선을 보여준다. 평균 ELISA 프로파일은 가변성을 나타내는 오류 막대가 있는 다이아몬드로 표시된다. 가장 풍부한 복합형 G0F는 ELISA 프로파일과 비교하여 매우 유사한 PK 프로파일을 보였다 (도 3a). 최대 농도 (t_max)는 두 그래프 모두에서 일치하게 72 h 후에 달성되었다. 제거 개시시에 약간의 차이가 있었지만, 오류 막대가 완전히 겹쳐서 PK 프로파일이 비교가능하다고 간주될 수 있다. ELISA가 가장 풍부한 N-글리칸이 가장 많이 기여하는 모든 글리코형의 평균 프로파일을 나타내기 때문에, 이 발견은 거의 70%의 상대적 풍부도를 갖는 주요 N-글리칸에 대해 예상되었다.

약 16%를 차지하는 두 번째로 가장 풍부한 복합형 N-글리칸 G1F는 ELISA 프로파일과 비교할 때 매우 유사한 PK 프로파일을 나타내었다 (도 3b). 다시, t_max는 두 곡선 모두에서 72 h에 도달하였다.

2%의 백분율로 복합형 G2F는 거의 완벽한 일치성을 보인 ELISA 프로파일과 가장 잘 일치하였다 (도 3c). t_max는 ELISA 곡선의 72 h에 비해 60 h으로 보다 일찍 도달하였다. 60 h 시점과 72 h 시점 사이의 아주 작은 차이 및 추가 샘플링 지점이 없다는 사실 때문에, 두 프로파일은 여전히 동일한 것으로 간주될 수 있다.

나노LC-MS 방법으로 구별할 수 없고 상대적인 함량이 단지 0.1%인 2개의 이성질체인 M6G0F/M5G1F 하이브리드형 글리칸의 프로파일은 여전히 ELISA 프로파일과 유사하게 보인다 (도 3d). 낮은 풍부도는 LLOQ에 가깝고, 따라서 다른 보다 풍부한 글리칸보다 L/H 값의 정밀도가 낮았다. 그러나, 유사한 t_max 및 유사한 곡선으로부터, PK는 동일하거나 적어도 유사하다고 결론지을 수 있다.

이러한 결과는 PK 프로파일을 각각의 N-글리칸에 대해 개별적으로 얻을 수 있음을 보여준다. 글리칸 PK 프로파일은 가장 풍부한 글리칸에 대한 ELISA와 매우 유사하였다. 단지 0.5% 미만의 부분을 갖는 N-글리칸의 경우, 그래프는 작은 풍부도에 의한 보다 높은 가변성 때문에 명확하게 나타나지 않았다.

고만노스형 N-글리칸 M5 및 M6의 글리칸 PK 프로파일은 완전히 상이한 그림을 보였다. M5 및 M6에 대해 각각 9.5% 및 2%의 상대적인 풍부도를 보이는 N-글리칸의 곡선이 도 4에 제시된다. M6은 ELISA에 의해 결정된 평균 프로파일에서 극단적으로 벗어난 PK 프로파일을 가졌다 (도 4a). 최대 농도는 24 h 후 달성되고, M5로의 전환 또는 제거율의 증가에 의해 순환계로부터 거의 완전한 제거가 이어졌다.

고만노스 글리칸 M5는 또한 ELISA와 비교할 때 상이한 PK 프로파일을 가졌다 (도 4b). t_max는 48시간 후에 24 h 더 빨리 도달하였고, 또한 제거는 48 h과 168 h 사이에 더 빨랐다. 이러한 결과는 mAb1의 고만노스 글리칸 PK 프로파일이 글리코-변이체를 포함한 모든 단백질 변이체의 평균 농도를 나타내는 ELISA와 비교하여 상이하다는 것을 입증한다. 이러한 발견은 또한 고만노스 글리칸의 전환 이론 및 증가된 제거율의 이론을 강화하기 위해 각각의 시점에서 결정된 글리칸 지도에도 반영되었다 (도 5 참조). M3G1F, M3G0F 및 코어 구조 M3의 PK 프로파일이 도 3e-g에 제시된다. 동일한 m/z 값을 갖는 오염 물질의 공동 용리로 인해 G0에 대한 PK 프로파일을 얻을 수 없었다.

M5 및 M6의 선택적 제거

mAb1 N-글리코실화의 조성을 도 2에 제시한다. 무거운 동위원소 글리칸 표준물질의 공지된 상대적인 양 및 실험적으로 얻은 L/H 비율에 기초하여, 각각의 N-글리칸의 백분율을 계산하였다. 도 5는 전임상 연구에서 얻은 글리칸 지도를 보여준다. 글리칸 지도는 8 h과 336 h 사이의 시점에 대해 계산되었다. 2 h, 504 h 및 672 h에, mAb1의 혈청 농도는 이 연구의 LLOQ인, 많은 토끼에 대해 10 ㎍/ml 미만이었고, 따라서 글리칸 지도를 계산할 수 없었다.

가장 풍부한 N-글리칸 G0F 및 G1F의 평균 백분율은 일정하게 유지되어, 이전 관찰 결과를 확인해준다 (도 5 왼쪽). 확대된 도면은 중요하지 않은 풍부한 글리칸을 보여준다 (도 5 오른쪽). 백분율은 고만노스 글리칸을 제외한 모든 N-글리칸에서 일정하게 유지되었다. M5 및 M6 부분은 시간이 지남에 따라 감소하였다. M6은 순환계로부터 제거되었지만, M5 부분은 9%의 초기 백분율로부터 약 4%로 감소하였다.

고만노스 종 M6-M9가 인간에서 M5와 같은 더 작은 고만노스 글리칸으로 변환된다는 것은 문헌에 공지되어 있다 ([Chen et al., Glycobiology (2009) 21, 949-59]; [Alessandri et al., MAbs (2012) 4(4), 509-520]). 마우스에서, 유사한 관찰이 이루어졌다. 고만노스 종 M7-M9는 M6으로 전환된다 (Yu et al., mAbs (2012) 4(4), 475-87). 혈청 내 항체의 시험관 내 인큐베이션에 대한 두 가지 관찰이 이루어졌다. 현재 연구에서, 주로 M5는 순환계로부터 선택적으로 제거되었다. M4 또는 M3 (코어 구조)과 같은 보다 작은 글리칸의 증가는 관찰되지 않았다. M5의 말단 만노스 잔기의 연결이 M6-M9의 그것과 상이하기 때문에, M5의 추가의 전환은 혈청에서 다른 특이성을 갖는 추가의 효소를 필요로 할 것이다. M5 또는 오히려 당단백질을 함유한 M5가 만노스 수용체를 통해 순환계로부터 특정 제거 메커니즘에 의해 제거될 가능성이 매우 높다.

<표 2>

M5를 함유하는 글리코형

^*값은 무작위 조합의 가정을 기초로 하여 계산된다.

순환계로부터 M5의 불완전한 제거는 Fc 부분의 구조적 입체형태로 설명될 수 있다. 여러 연구에 따르면, M5와 크기가 유사한 말단 갈락토실화를 갖는 N-글리칸을 함유하는 IgG 글리코형이 Fc 부분의 입체형태를 개방형 입체형태, 즉 N-글리칸을 다른 단백질이 결합하기 위해 접근가능하도록 만드는 편자 입체형태로 변화시키는 것으로 나타났다 (Krapp et al., J. Mol. Biol. (2003), 325, 979-989). 이것은 M5가 N-글리칸과 쌍을 이루어, Fc 부분을 개방된 입체형태로 만드는 데 충분한 크기의 글리코형을 생성한다는 것을 의미한다. 단백질 생합성 동안 글리코실화된 중쇄의 쌍 형성은 무작위로 이루어지지 않는 것으로 밝혀졌다 (Masuda et al., FEBS Lett. (2000), 473, 349.57). IgG2 생물의약품의 경우, 글리코형 M5:M5가 선호된다는 것이 증명되었다 (Goetze et al., Glycobiology (2009) 19, 240-9)). 본 연구에서 mAb1에 대해, 유사한 관찰이 이루어졌다 (표 2). 무작위 쌍 형성을 가정하면, 모든 글리코형을 쉽게 계산할 수 있고, 이것은 M5 함유 글리코형에 대해 제시된다. mAb1의 무손상 Fc 부분으로부터 생성된 MS 데이터는 M5:M5 글리코형이 계산된 값보다 4배 더 높음을 보여준다. M5:M5는 단백질 생합성 동안 강하게 선호되었다. 이 글리코형은 Fc 부분의 편자 입체형태 및 이에 따라 만노스 수용체에 대한 결합에 의해 순환계로부터 증가된 제거를 유도할 가능성이 있다. 전임상 연구에서 관찰된 나머지 4% M5는 폐쇄된 Fc 입체형태에 충분히 작은 M5:G0F 글리코형일 수 있다. 이것은 순환계로부터의 불완전한 제거를 설명할 것이다.

결론

개별 N-글리칸 약동학을 연구하기 위한 새로운 방법을 이용하여 IgG1 생물의약품에 대한 전임상 토끼 연구를 분석하였다. 고정된 항원 및 안정한 무거운 동위원소 표준 질량 분광 분석 정량을 이용한 96 웰 플레이트 기반 고처리량 친화도 정제를 사용하여 50 ㎕ 혈청 샘플로부터의 글리칸 PK 데이터를 10 내지 90 ㎍/ml의 mAb 농도에 대해 수득하였다. 글리칸 PK 프로파일을 ELISA 데이터와 비교하여, 고만노스 글리칸 M5 및 M6이 상이한 PK 프로파일을 가짐을 입증하였다. 글리칸 지도는 M6이 처음 48 h 동안 완전히 제거되었고, M5 수준은 9.5%로부터 약 4%로 감소함을 보여주었다.

제시된 전임상 연구에서 얻은 결과는 다른 그룹에 의해 건강한 인간 대상체에서 얻은 결과와 유사하였다 (Goetze et al., Glycobiology (2009) 19, 240-9). 이러한 발견은 전임상 샘플을 이용한 글리칸 PK 프로파일링의 가치를 입증한다. 안정한 무거운 동위원소 2-AA 글리칸 표준물질의 사용은 지금까지 기술되지 않은 질량 분광 분석에 의한 개별 N-글리칸의 PK 프로파일링을 가능하게 하고, 지금까지 사용된 N-글리칸의 상대적인 분석과 비교하여 단일 N-글리칸의 독립적인 분석을 가능하게 한다.

요약하면, 고감도의 글리칸 PK 프로파일링을 위한 이 새로운 방법은 전임상 샘플에 대해 수행될 수 있다. 또한, 전임상 연구로부터 얻은 결과는 인간 대상체의 결과가 전임상 연구의 발견과 동일함을 보여준다. 초기 생물의약품 개발 중 실행은 전임상 연구 동안 이미 N-글리코실화 효과에 대한 조사를 허용한다. 이를 통해, 임상 단계에 들어가기 전에 N-글리코실화, 당조작을 최적화하기 위한 예방 조치를 실행할 수 있다.

실시예 2: 치료 융합 단백질의 약동학에 대한 글리콜-변이체의 영향

전임상 토끼 연구

전임상 연구는 히말라야 토끼에서 수행되었다. Fc-융합 단백질 에타네르셉트 (FP1 또는 FP2)의 2개의 상이한 배치의 8 mg/kg (체중)의 단일 피하 투여 후, 하나의 투여 전 혈액 샘플을 비롯한 혈액 샘플을 일정 기간에 걸쳐 채취하였다. 샘플 채취는 표 3에 제시된 바와 같이 수행되었다. 각각의 샘플 채취 시점에서 최소 600 ㎕의 혈청을 채취하였다. 혈청 내의 FP1 및 FP2의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 나머지 혈청으로부터, 2 x 50 ㎕ 분취액을 글리칸 PK 프로파일링에 사용하였다. 첫 번째 분취액을 이어서 분석하고, 두 번째 분취액을 백업 분취액으로 사용하였다.

¹³ C 2-AA 표지된 글리칸 표준물질의 제조

탈염된 FP1 융합 단백질 (1 mg)의 N-글리칸은 37℃에서 밤새 (17시간) PNGaseF 소화를 사용하여 방출되었다. 아미콘 30K 필터 장치를 사용하여 N-글리칸을 융합 단백질로부터 분리하고, 스피드백을 사용하여 건조시켰다. 피콜린 보란 및 [¹³C] 2-AA를 70:30 (% v/v) DMSO-아세트산에 용해시켜 각각 63 및 50 mg/ml의 농도를 제공하였다. 15 nmol의 효소에 의해 방출되고 건조된 글리칸에 표지화 용액 (15 ㎕) 및 탈이온수 (10 ㎕)를 첨가하였다. 표지화 반응은 37℃에서 17시간 동안 수행되었다.

과량의 표지는 G-10 컬럼에서의 겔 여과에 의해 제거하였다. 컬럼을 10 ml H₂O로 조건화하였다. 샘플을 탈이온수로 100 ㎕로 희석하고, 컬럼에 적용하였다. 700 ㎕ H₂O로 컬럼을 세척한 후, 정제된 형광 표지된 N-글리칸을 600 ㎕ H₂O로 용리시켰다. 정제된 [¹³C] 2-AA 표지된 N-글리칸을 분취하고, 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

고정된 단백질 G가 존재하는 96-웰 플레이트 친화도 컬럼의 제조

친수성 저단백질 결합 막 (멀티스크린 THS HV 필터 플레이트)을 포함하는 96-웰 필터 플레이트의 각각의 웰에 단백질 G 세파로스 (200 ㎕)를 첨가하였다. 단백질 G 세파로스는 친화도 정제 전에 제거되어야 하는 20% 에탄올에 보관하였다. 따라서, 컬럼을 PBS (150 ㎕)로 4회 평형화하였다. 액체를 원심분리에 의해 제거하였다.

고정화 항원이 존재하는 96-웰 플레이트 친화도 컬럼의 제조

웰당 200 ㎕ NHS 활성화된 세파로스-이소프로판올 슬러리를 첨가하기 전에 96웰 필터 플레이트 (멀티스크린 THS HV 필터 플레이트)의 막을 1 mM HCl (100 ㎕)로 젖게 하였다. 이소프로판올을 원심분리에 의해 제거하고, 컬럼을 1 mM HCl (150 ㎕)로 4회 세척하였다. 이. 콜라이에서 발현된 항원의 재구성은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 항원 용액 (100 ㎕)을 원심분리하여 컬럼에 넣고, 실온에서 2시간 동안 커플링 반응이 발생하도록 하였다. 친화도 컬럼을 세척하고, 남아있는 NHS 기를 에탄올아민 완충제 (150 ㎕)를 사용하여 불활성화시켰다. 마지막으로, 컬럼을 PBS로 평형화하였다.

융합 단백질 및 글리칸 방출의 친화도 정제

혈청 샘플 (50 ㎕)을 96웰 플레이트의 평형화된 단백질 G 컬럼에 첨가하고, 컬럼을 통해 원심분리하였다. 이어서, 컬럼을 원심분리에 의해 PBS (150 ㎕)로 6회 세척하였다. 결합된 IgG는 100 ㎕ 용리 완충제 (0.1 M 글리신 pH 2.7)로 3회 용리되었다. 용리액을 1 M Tris HCl pH 8.0로 즉시 중화시켰다. 용리액에는 표적 단백질뿐만 아니라 혈청으로부터의 다른 IgG가 포함되어 있다.

용리액을 96웰 플레이트의 평형화된 고정된 항원 컬럼에 첨가하고 컬럼을 통해 원심분리하였다. 이어서, 컬럼을 PBS (150 ㎕)로 6회 세척하였다. 패브리케이터 용액 (100 ㎕, 1 U/㎕)을 컬럼 내로 원심분리하여 융합 단백질의 글리코실화된 Fc 부분을 방출시켰다. 반응은 37℃에서 30분간 수행되었다. 방출된 Fc 부분은 PBS로 용리시켰다. ¹³C-2-AA 표지된 N-글리칸 표준물질과 함께 PNGaseF를 용리된 Fc 부분에 및 항원 결합 부분과 함께 컬럼에 첨가하였다. 소화물을 37℃에서 17시간 동안 인큐베이션하였다. 항원 결합 단백질 부분으로부터 방출된 N-글리칸은 H₂O로 용리시켰다. 나머지 단백질은 10K 컷-오프 막을 갖는 96-웰 플레이트를 사용한 한외여과에 의해 제거하였다. 글리칸 표준물질을 갖는 방출된 N-글리칸은 진공 원심분리에 의해 건조시켰다.

N-글리칸 표지, 과량의 2-AA 표지화 시약을 제거하기 위한 겔 여과 및 RP 나노LC-MS에 의한 표지된 샘플 N-글리칸 및 무거운 동위원소 표준물질의 분석을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.

2개의 배치의 글리칸 지도는 상이한 N- 글리코실화를 나타낸다

mAb는 Fc 부분에 각각의 중쇄에 단지 하나의 보존된 N-글리코실화 부위만을 가지고 있기 때문에, 모노클로날 항체의 N-글리칸 PK 프로파일링은 다른 생물의약품의 PK 프로파일링보다 덜 정교하다. 따라서, 부위 특이성을 가지고 N-글리칸을 분석할 필요는 없다. 보다 복잡한 글리코실화된 생물의약품에 대한 부위 특이성은 제거 또는 연장된 반감기의 메커니즘을 이해하는데 도움이 될 수 있는 추가의 정보를 제공한다. 예를 들어, 융합 단백질은 IgG Fc 부분의 CH2 및 CH3 도메인 및 수용체 부분을 함유하는 2개의 사슬로 이루어진다. mAb와 마찬가지로, 사슬은 디술피드 다리로 연결된다. Fc 부분은 사슬당 하나의 N-글리칸을, 수용체 부분은 2개의 추가의 N-글리코실화 부위를 보유하여, 분자당 총 6개의 N-글리칸을 만든다.

Fc 부분 및 수용체 부분 N-글리칸의 개별 분석을 위해, 두 부분을 엔도프로테이나제 IdeS 효소를 사용하여 분리하고, 생성된 단편을 개별적으로 분석하였다. 분리 후, Fc 부분 및 수용체 부분을 PNGaseF를 사용하여 탈글리코실화하였다. 글리칸을 2-AA로 표지하고, 나노LCMS로 분석하였다. 생성된 글리칸 지도는 도 6에 도시된다.

2개의 융합 단백질 배치는 상이한 N-글리코실화 패턴을 가졌다. 융합 단백질 1 (FP1)의 글리코실화는 보다 이질성이었고, 융합 단백질 2 (FP2)는 소수의 N-글리칸만 더 높은 백분율을 보였다. 두 배치 모두 그의 수용체 부분에 높은 백분율의 말단 시알산을 포함하였다. 발견된 Fc 글리코실화는 복잡한 이중-안테나 N-글리칸 및 코어 푸코실화의 높은 부분을 갖는 항체에 대해 전형적이었고; 일부는 추가의 시알산을 보유하였다. FP1과 FP2의 주요 차이점은 말단 기이었다. FP1은 높은 백분율의 말단 GlcNAc 잔기를 가졌다. 이와 대조적으로, FP2는 높은 수준의 말단 갈락토실화를 가졌지만, 시알릴화는 유사하였다.

토끼의 전임상 연구에서 FP1 및 FP2의 평균 PK 프로파일

전임상 연구는 히말라야 토끼에서 수행되었다. FP1 또는 FP2의 단일 피하 투여 후, 샘플을 채취하여 FP1 및 FP2의 농도를 ELISA에 의해 결정하였다. 샘플 채취 일정은 표 3에 제시된다. 연구의 각각의 아암으로부터 5마리의 동물이 글리칸 PK 프로파일링에 포함되었다.

<표 3>

FP1 및 FP2의 전임상 연구의 샘플 채취 일정. 투여 전에, 투여 전 샘플을 각각의 토끼에서 채취하였다.

두 아암의 5마리의 동물의 ELISA 결과를 도 7에 제시한다. PK 프로파일은 상이하였다. FP1은 FP2보다 더 높은 농도를 가졌지만, 오류 막대는 겹쳐진다. 두 프로파일은 18 h 후에, 최고 농도의 시점인 t_max에 도달하였다. FP1의 제거가 더 빨랐고, 72 h에서 일치성이 나타났다.

ELISA 프로파일의 불일치 및 상이한 N-글리코실화가 가능한 관계에 대해 조사되고 있었다.

개별 N- 글리칸 PK 프로파일과 평균 ELISA 데이터의 비교

ELISA의 상대적인 농도는 평균 프로파일을 최대 농도로 정규화하여 결정하였다. 개별적인 N-글리칸 프로파일의 상대적인 농도는 결정된 L/H 비율에 기초하여 평균 프로파일을 최대 L/H 비율로 정규화함으로써 결정되었다. 도 8은 적절한 평균 ELISA 프로파일 (채워진 다이아몬드)과 비교하여 나노LC-MS (채워진 정사각형)에 의해 결정된 두 융합 단백질 FP1 및 FP2의 Fc 부분 (도 8a) 및 수용체 부분 (도 8b)의 주요 N-글리칸의 평균 PK 프로파일을 보여준다.

오류 막대에 의해 반영되는, 상이한 동물의 데이터의 가변성이 높았고, 수용체 부분에 위치한 N-글리칸에 대한 가변성이 더 높았다. FP1 G0F, FP1 SG2F과 FP2 G1F의 N-글리칸 프로파일은 각각의 ELISA에 비해 더 늦은 시점을 향한 t_max의 변화를 보여주었다. 오직 FP2 SG2F만 동일한 t_max를 보였다. 이 과정은 혈청 반감기가 연장되고, 제거율이 감소함을 나타낸다. 그러나, FP2의 글리칸 PK 프로파일은 FP1의 글리칸 PK 프로파일보다 ELISA 프로파일에 더 근접하였다.

FP1 및 FP2의 글리칸 지도

글리칸 지도는 나노LC-MS에 의해 결정된 L/H 비율에 기초하여 얻었다. 스파이킹된 안정한 무거운 동위원소 2-AA 표지된 N-글리칸 표준물질의 공지된 분포를 사용하여 글리칸 지도가 높은 정밀도로 계산되었다. FP1로부터의 Fc 및 수용체 부분의 글리칸 지도가 도 9에 도시되어 있다. Fc 부분의 N-글리칸은 주로 중성의 복잡한 이중안테나성 N-글리칸이었다. 주요 글리칸은 G0F (비어 있는 다이아몬드) 및 G1F (채워진 삼각형)이었다. 다른 모든 N-글리칸은 10% 미만이었다. FC 부분의 글리칸의 백분율은 시간이 지남에 따라 일정하였다.

수용체 부분은 보다 높은 비율의 산성 N-글리칸을 포함한다. SG2F (비어 있는 정사각형)는 가장 풍부한 N-글리칸이었다. Fc 부분과 대조적으로, 수용체 부분의 백분율은 시간에 따라 변하였다. G0F (비어 있는 다이아몬드) 및 G2F (비어 있는 삼각형)의 부분은 시간이 지남에 따라 감소하는 반면, SG2F (비어 있는 정사각형) 및 SG2 (채워진 다이아몬드)의 부분은 보다 높은 백분율로 향하는 경향을 보였다. 32 h에서의 편차 (Fc 부분)는 친화도 정제 또는 나노LC-MS 분석 동안의 변화 및 N-글리코실화 패턴의 일시적인 변화 부재로 인한 것일 가능성이 가장 높았다.

FP2에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다. 생성되는 글리칸 지도는 도 10에 제시되어 있다. Fc 부분에 있어서, 글리칸 지도는 주요 N-글리칸인 G1F (채워진 삼각형), G2F (비어 있는 삼각형), G0F (비어 있는 다이아몬드) 및 SG2F (비어 있는 정사각형) 및 모든 중요하지 않은 풍부한 글리칸은 일정한 백분율을 보였다. 수용체 부분은 상이한 그림을 보였다. 주요 N-글리칸인 SG2F (비어 있는 정사각형)는 (다른 글리칸에 비해) 약간 증가했고, N-글리칸 G2F (비어 있는 삼각형)는 (다른 글리칸에 비해) 시간이 지남에 따라 급격히 감소하였다.

중요하지 않은 풍부한 N-글리칸의 변이는 아래에서 논의된다. Fc 부분에서 6 h 내지 12 h에 관찰된 변이는 N-글리칸 백분율의 상당한 변화로 인한 것이 아니라, 보다 높은 변이를 유발하는 낮은 단백질 농도에 의한 것일 가능성이 가장 높았다.

수용체 부분의 말단 갈락토실화는 제거를 가속화하였다.

말단 갈락토실화를 갖는 N-글리칸 (G1F 및 G2F) 및 N-글리칸 G0F는 말단 N-아세틸글루코사민을 보유한다. G2F는 FP1 및 FP2에 대해 시간에 따라 감소하는 백분율을 보였다 (도 9 및 10, 오른쪽). G1F는 FP1에 위치할 때 약간 감소되었지만, FP2에 결합될 때에는 일정하게 유지되었다 (도 9 및 10, 오른쪽). 동일한 관찰이 G0F에 대해서도 이루어졌다 (도 9 및 10, 오른쪽). 상기 결과는 말단 갈락토실화된 G2F를 갖는 FP1 및 FP2가 순환계로부터 특이적으로 제거됨을 명확하게 나타낸다. 상기 제거 이면의 메커니즘은 아시알로당단백질 수용체일 수 있다. 이 수용체는 노출된 갈락토스 잔기에 선택적으로 결합한다. 이 수용체는 또한 말단 갈락토스 잔기의 수가 감소함에 따라 친화도 감소를 보이고, 이것은 각각 G1F의 덜 현저한 감소 또는 일정한 부분에 대한 관찰을 설명할 수 있다.

G1F 및 G0F N-글리칸에 대한 FP1과 FP2의 차이는 단백질에 대한 상이한 N-글리코실화 부위 점유 및 수용체가 결합하기 위한 상이한 접근가능성으로 인해 발생할 수 있다.

수용체 부분에 시알산을 갖는 N- 글리칸을 캡핑하면 반감기가 증가하였다.

앞에서 설명한 바와 같이, 주요 N-글리칸 SG2F는 보다 높은 상대적인 백분율을 향한 약간의 경향을 보인다. FP1에서, SG2의 양은 시간이 지남에 따라 증가했고, FP2 및 SG1F에서 동일한 경향을 보였다. 다른 산성 N-글리칸은 일정한 백분율을 보였다 (도 9와 10, 오른쪽).

이러한 관찰은 적어도 하나의 말단 시알산이 갈락토실화된 N-글리칸 구조에 부가됨으로써 단백질이 선택적으로 제거되는 것을 방해할 수 있다는 결론을 제시한다. 시간 경과에 따라 증가하는 상이한 N-글리칸에 대한 FP1과 FP2 간의 불일치는 구조가 부착되는 글리코실화 부위의 차이로 인해 다시 발생할 수 있다.

FP1 및 FP2의 시알릴화 , 갈락토실화 및 말단 GlcNAc

부착된 모든 N-글리칸의 말단 기에 대한 개요가 도 11에 제시되어 있다. 중요하지 않은 풍부한 N-글리칸도 포함되어 있다. N-글리칸은 다음과 같이 3개의 상이한 군으로 나뉘었다: 시알릴화 군은 1개 또는 2개의 말단 시알산을 갖는 모든 N-글리칸을 포함하고, 갈락토실화 군은 적어도 하나의 말단 갈락토스 모이어티를 갖는 모든 N-글리칸을 포함하고, 말단 GlcNAc 군은 말단 N-아세틸글루코사민을 갖는 N-글리칸을 포함한다. 두 가지 특성을 갖는 N-글리칸의 경우, 어떤 특성이 PK에 영향을 미칠 가능성이 더 큰 지 결정해야 하였고, 예를 들어 한 아암에 말단 시알산이 있고 다른 아암에 말단 GlcNAc가 있는 SG1F의 경우, 이 N-글리칸은 부착된 말단 시알산 기의 차폐 효과로 인해 말단 GlcNAc 글리칸보다는 시알산 글리칸과 더 유사하게 작용하기 때문에 시알릴화 군의 일부로 결정되었다. 이것은 말단 갈락토스 잔기가 말단 GlcNAc보다 높은 영향을 갖는 G1F에도 동일하게 적용된다.

말단 기는 FP1 및 FP2의 Fc 부분에서 변하지 않았다. 6 h (FP2) 또는 32 h (FP1)에서의 두 편차는 낮은 표적 단백질 농도에서의 방법 변화로 인한 것일 가능성이 가장 컸다. Fc 부분과 대조적으로, 수용체 부분의 말단 기는 말단 시알릴화가 증가함에 따라 보충된 감소된 갈락토실화를 나타냈다. GlcNAc 그룹에 속하는 N-글리칸은 일정하였다.

결론

혈청 샘플로부터 융합 단백질을 회수하기 위한 작업 흐름이 확립되었다. 단백질 G 크로마토그래피를 사용하는 제1 친화도 단계에서 혈청의 복잡성이 크게 감소하였다. 세파로스 수지에 비-특이적으로 결합하는 경향이 있는 혈청 관련 단백질뿐만 아니라 모든 비-IgG Fc 부분 함유 단백질도 제거되었다. 예비-제거된 혈청을 항원 컬럼에 적용하고, 세척 및 Fc 부분의 효소적 용리 후에, 두 단백질 부분의 N-글리칸을 개별적으로 분석하였다. 안정한 무거운 동위원소인 2-AA로 표지된 글리칸 표준물질의 혼입으로 인해, N-글리칸 처리 및 나노LCMS 분석 동안 변이가 보상되었고, 연구에서 개별 글리칸의 시간 경로가 고정밀도로 결정되었다.

융합 단백질의 2개의 다른 배치를 토끼 연구에서 비교하였고, 각각의 N-글리칸의 PK 프로파일 및 시간에 따른 N-글리칸의 상대적 분포를 결정하였다. 결과는 수용체 부분에 위치한 말단 갈락토실화된 N-글리칸을 갖는 융합 단백질이 평균 분자보다 빨리 제거되고 말단 시알산이 혈청 반감기를 증가시킨다는 것을 보여준다. 이 제거는, 간에서 발견되고 말단 갈락토실화된 N-글리칸에 대한 그의 친화도가 공지되어 있는 아시알로당단백질 수용체의 수용체 매개 과정일 가능성이 가장 높다.

요약하면, 이 연구는 융합 단백질의 N-글리코실화가 PK에 영향을 준다는 것을 보여주었다. 말단 갈락토실화된 N-글리칸은 더 빨리 제거되고, 말단 시알릴화는 혈청 반감기를 증가시킨다. 이것은 아시알로-당단백질 수용체-매개 결합 때문일 가능성이 가장 높고, N-글리칸이 수용체 부분에 존재하는 경우에만 발생한다. Fc 부분 N-글리코실화 (복합 이중-안테나)는 이전의 연구와 일치하게 PK에 영향을 주지 않는다. 따라서, 이 방법은 생물의약품의 상세한 부위 특이적 N-글리칸 PK 프로파일링을 허용한다. 이러한 종류의 조사는 부위 또는 도메인 특이성이 없는 N-글리칸 프로파일링과 대조적으로 유리하다는 것이 추가로 입증되었다.

상기 내용에 비추어, 본 발명은 또한 다음 항목에 관련됨이 이해될 것이다:

항목

1. a) 관심 재조합 당단백질을 포함하는 2개 이상의 포유동물 액체 샘플을 제공하는 단계;

b) 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질을, 샘플 내의 재조합 당단백질에 특이적인 친화성 리간드에 커플링된 별개의 고체 지지체 상에 고정시키는 단계;

c) 재조합 당단백질의 효소 절단에 의해 고체 지지체로부터 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편을 별개의 용리액으로 방출시키는 단계;

d) 임의로, 별개의 용리액에서 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편으로부터 글리칸을 방출시키는 단계;

e) 각각의 상기 샘플의 글리칸을 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지하는 단계; 및

f) LC-MS를 사용하여 각각의 상기 샘플의 단계 e)의 표지된 글리칸을 별개로 분석하고, 상기 2개 이상의 샘플을 비교하는 단계

를 포함하고, 여기서 형광 표지의 제2 안정한 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 참조 표준물질이 단계 c), d), e) 또는 f) 전에 각각의 상기 샘플에 첨가되고, 참조 표준물질은 단계 f)의 표지된 글리칸과 함께 분석되는 것인, 포유동물 액체 샘플에서 관심 재조합 당단백질의 글리칸을 분석하는 방법.

2. 항목 1에 있어서, 단계 c)에서 고체 지지체에 고정된 채로 남아있는 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 제2 글리칸 함유 단편의 글리칸을 분석하는 단계를 추가로 포함하고, 이 단계는

aa) 단계 b) 전에 고체 지지체에 비-특이적으로 결합하는 당단백질을 제거하기 위해 2개 이상의 포유동물 액체 샘플을 각각 예비-제거하는 단계;

dd) 단계 c) 이후에 고체 지지체 상에 남아있는 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 고정된 제2 글리칸 함유 단편으로부터 글리칸을 별개의 용액으로 방출시키는 단계;

ee) 각각의 상기 샘플의 글리칸을 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지하는 단계; 및

ff) LC-MS를 사용하여 각각의 상기 샘플의 단계 ee)의 표지된 글리칸을 별개로 분석하고, 상기 2개 이상의 샘플을 비교하는 단계

를 포함하고, 여기서 형광 표지의 제2 안정한 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 참조 표준물질이 단계 dd), ee) 또는 ff) 전에 각각의 상기 샘플에 첨가되고, 참조 표준물질은 단계 ff)의 표지된 글리칸과 함께 분석되는 것인 방법.

3. 항목 2에 있어서, 예비-제거 단계 aa)가 샘플을 고체 지지체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 고체 지지체는 항목 1의 단계 b)에서 사용된 고체 지지체와 동일한 물질로 제조되지만, 상기 친화성 리간드에 커플링되지 않는 것인 방법.

4. 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, 분석되는 글리칸이 고만노스형, 하이브리드형 또는 복합형 N-글리칸으로 이루어진 군으로부터 선택된 N-글리칸인 방법.

5. 항목 1 내지 항목 4 중 어느 한 항목에 있어서, 형광 표지가 안정한 가벼운 및 안정한 무거운 동위원소 변이체를 갖고, 바람직하게는 참조 표준물질이 형광 표지의 안정한 무거운 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 것인 방법.

6. 항목 1 내지 항목 5 중 어느 한 항목에 있어서, 형광 표지가 ¹²[C] 및 ¹³[C] 동위원소 쌍, 바람직하게는 ¹²[C₆] 및 ¹³[C₆] 동위원소 쌍, 보다 바람직하게는 ¹²[C₆]-2-아미노벤조산 (¹²[C₆]-2-AA) 및 ¹³[C₆]-2-아미노벤조산 (¹³[C₆]-2-AA) 동위원소 쌍인 방법.

7. 항목 1 내지 항목 6 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 참조 표준물질이 상기 샘플에서 분석된 것과 적어도 동일한 글리칸 구조를 포함하는 것인 방법.

8. 항목 1 내지 항목 7 중 어느 한 항목에 있어서, 방법이 글리칸 구조를 개별적으로 분석하는 것인 방법.

9. 항목 1 내지 항목 8 중 어느 한 항목에 있어서, 재조합 당단백질이 융합 단백질 또는 항체인 방법.

10. 항목 9에 있어서, 재조합 당단백질이 Fc-융합 단백질 또는 항체인 방법.

11. 항목 1 내지 항목 10 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 c)에서 고체 지지체로부터 방출된 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편이 Fc 도메인인 방법.

12. 항목 10 또는 항목 11에 있어서, 재조합 당단백질이 항체이고, 항체의 가변 영역이 고체 지지체 상에 고정된 친화성 리간드에 결합하는 것인 방법.

13. 항목 12에 있어서, 친화성 리간드가 항원인 방법.

14. 항목 10 내지 항목 13 중 어느 한 항목에 있어서, 재조합 당단백질이 항체, 바람직하게는 IgG 항체, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 항체, 보다 바람직하게는 인간 또는 인간화된 IgG1 또는 IgG2 항체인 방법.

15. 항목 10 또는 항목 11에 있어서, 재조합 당단백질이 Fc-도메인 및 이펙터 도메인을 포함하는 Fc-융합 단백질이고, 이펙터 도메인이 고체 지지체 상에 고정된 친화성 리간드에 결합하고, 상기 친화성 리간드는 Fc-융합 단백질의 이펙터 도메인에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 또는 항체인 방법.

16. 항목 10 내지 항목 15 중 어느 한 항목에 있어서, 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편을 고체 지지체로부터 방출시키기 위해 사용되는 효소가 엔도프로테이나제, 바람직하게는 파파인, 피신, 시스테인 프로테아제 SpeB (패뷸러스) 또는 시스테인 프로테이나제 IdeS (패브리케이터®), 보다 바람직하게는 시스테인 프로테이나제 IdeS (패브리케이터®)인 방법.

17. 항목 10 내지 항목 15 중 어느 한 항목에 있어서, 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편을 고체 지지체로부터 방출시키기 위해 사용되는 효소가 글리카나제, 바람직하게는 엔도스글리카나제 (IgGZERO)인 방법.

18. 항목 10 내지 항목 17 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 예비-제거 단계가

aai) Fc-결합 단백질을 사용하여 고체 지지체 상에 Fc-함유 당단백질을 고정시키고, 여기서 상기 Fc-결합 단백질은 바람직하게는 단백질 G 또는 단백질 A로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 Fc-결합 단백질은 단백질 G인 단계; 및

aaii) Fc-함유 당단백질을 용리시키는 단계

를 포함하고; 여기서 상기 예비-제거 단계에서 사용되는 고체 지지체는 항목 1의 단계 b)에서 사용된 고체 지지체와 동일한 물질로 만들어지지만, 상기 친화성 리간드에 커플링되지 않는 것인 방법.

19. 항목 1 내지 항목 18 중 어느 한 항목에 있어서, LC-MS가 역상 LC-MS인 방법.

20. 항목 1 내지 항목 19 중 어느 한 항목에 있어서, LC-MS가 나노LC-MS, 바람직하게는 역상 나노LC-MS인 방법.

21. 항목 1 내지 항목 20 중 어느 한 항목에 있어서, 고체 지지체가 마이크로비드, 바람직하게는 세파로스 비드, 아가로스 비드 또는 자기 비드, 보다 바람직하게는 세파로스 비드를 포함하는 수지인 방법.

22. 항목 1 내지 항목 21 중 어느 한 항목에 있어서, 친화성 리간드가 N-히드록시숙신이미드 (NHS), 시아노겐 브로마이드, 에폭시, 카르보디이미드 또는 티오프로필을 통해, 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 통해 고체 지지체에 커플링되는 것인 방법.

23. 항목 1 내지 항목 22 중 어느 한 항목에 있어서, 2개 이상의 포유동물 액체 샘플이 다중 웰 필터 플레이트, 바람직하게는 24, 96 또는 384 웰 필터 플레이트, 보다 바람직하게는 96 웰 필터 플레이트에서 분석하기 위해 제조되는 것인 방법.

24. 항목 1 내지 항목 23 중 어느 한 항목에 있어서, 포유동물 액체 샘플이 바람직하게는 혈청 또는 혈장, 소변, 뇌척수액, 양수, 타액, 땀, 정액, 눈물, 가래, 질 분비물, 질 세척액 및 결장 세척액으로 이루어진 군으로부터 선택된 체액이고; 바람직하게는 상기 샘플이 혈장 또는 혈청 샘플인 방법.

25. 항목 1 내지 항목 24 중 어느 한 항목에 있어서, 2개 이상의 포유동물 액체 샘플이 동일한 대상체로부터 얻은 것인 방법.

26. 항목 25에 있어서, 관심 재조합 당단백질의 글리칸의 적어도 하나의 특정 글리칸 구조의 약동학적 파라미터, 바람직하게는 C_max, t_max, AUC 또는 t_{1/ 2}이 결정되는 것인 방법.

27. 항목 25 또는 항목 26에 있어서, 2개 이상의 포유동물 액체 샘플이 동일한 대상체로부터 상이한 시점에 얻어진 것인 방법.

28. 항목 27에 있어서, 적어도 약 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h, 168 h, 336 h, 504 h, 672 h, 840 h이 제1 시점과 마지막 시점 사이에 있는 것인 방법.

29. 항목 1 내지 항목 28 중 어느 한 항목에 있어서, 2개 이상의 포유동물 액체 샘플이 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상 또는 50개 이상의 샘플인 방법.

30. 항목 1 내지 항목 29 중 어느 한 항목에 있어서,

(i) 시간에 따른 제1 동위원소 샘플 글리칸 대 제2 동위원소 참조 표준물질의 비를 얻기 위해, 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지된 각각의 샘플로부터의 글리칸의 및 형광 표지의 제2 동위원소로 표지된 그의 각각의 참조 표준물질 글리칸의 추출된 이온 크로마토그램 (EIC)의 곡선 하 면적이 결정되고,

(ii) 각각의 상기 샘플에 대해 참조 표준물질 내의 개별적인 글리칸의 공지된 상대적인 분포를 기초로 하여 N-글리칸의 백분율이 계산되는 것인 방법.

31. 항목 1 내지 항목 30 중 어느 한 항목에 있어서, 글리칸이 상기 2개 이상의 포유동물 액체 샘플 각각의 분취액에서 분석되는 것인 방법.

32. 항목 1 내지 항목 31 중 어느 한 항목에 있어서, 분석되는 샘플 또는 분취액의 부피가 약 1 ㎕ 내지 약 1000 ㎕, 약 5 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 약 25 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 또는 약 40 ㎕ 내지 약 75 ㎕, 바람직하게는 약 50 ㎕인 방법.

33. 항목 31 또는 항목 32에 있어서, 상기 재조합 당단백질의 농도가 상기 2개 이상의 포유동물 액체 샘플의 추가의 분취액에서 분석되는 것인 방법.

34. 항목 33에 있어서, 상기 재조합 당단백질의 농도가 ELISA에 의해 분석되는 것인 방법.

35. 항목 1 내지 항목 34 중 어느 한 항목에 있어서, 포유동물 액체 샘플이 인간, 원숭이, 설치류, 개, 고양이 또는 돼지 샘플인 방법.

36. 항목 35에 있어서, 포유동물 액체 샘플이 설치류 샘플이고, 설치류가 마우스, 래트, 햄스터 또는 토끼인 방법.

37. 항목 1 내지 항목 36 중 어느 한 항목에 있어서, 방법이 아토몰 농도의 개개의 표지된 글리칸, 예를 들어 800 amol만큼 낮은 농도, 바람직하게는 600 amol만큼 낮은 농도, 보다 바람직하게는 400 amol만큼 낮은 농도의 분석을 허용하는 것인 방법.

38. 항목 1 내지 항목 37 중 어느 한 항목에 있어서, 방법이 10 ㎍/ml 이하, 5 ㎍/ml 이하, 2 ㎍/ml 이하, 1 ㎍/ml 이하, 0.5 ㎍/ml 이하, 0.2 ㎍/ml 이하 또는 0.1 ㎍/ml 이하의 포유동물의 2개 이상의 각각의 액체 샘플의 재조합 당단백질 농도에서 재조합 당단백질의 글리칸을 분석하는 것을 허용하는 것인 방법.

39. 항목 1 내지 항목 38 중 어느 한 항목에 있어서, 방법이 0.5 ㎍ 이하, 0.25 ㎍ 이하, 0.1 ㎍ 이하, 0.05 ㎍ 이하, 0.025 ㎍ 이하, 0.01 ㎍ 이하 또는 0.005 ㎍ 이하의 재조합 단백질을 각각 포함하는 2개 이상의 포유동물 액체 샘플에서 재조합 당단백질의 글리칸을 분석하는 것을 허용하는 것인 방법.

40. 항목 1 내지 항목 39 중 어느 한 항목에 있어서, 적어도 단계 b), c), d) 및 e) 및/또는 적어도 단계 aa), dd) 및 ee)가 고처리량 방식으로 조작되는 것인 방법.

41. 항목 1 내지 항목 40 중 어느 한 항목에 따라 포유동물 액체 샘플에서 재조합 당단백질의 글리칸을 분석하는 단계, 및 당단백질을 당단백질 기반 제약 조성물로 제제화하는 단계를 포함하는, 당단백질 기반 제약 조성물의 제조 방법.

42. a) Fc-도메인 및 이펙터 도메인을 함유하는 Fc-융합 단백질을 포함하는 포유동물로부터 2개 이상의 액체 샘플을 제공하는 단계;

aa) i) Fc-결합 단백질을 사용하여 별개의 고체 지지체 상에 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질을 고정시키고, 여기서 상기 Fc-결합 단백질은 바람직하게는 단백질 G 또는 단백질 A로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 Fc-결합 단백질은 단백질 G인 단계; 및

ii) Fc-융합 단백질을 용리시키는 단계

를 포함하는, 2개 이상의 포유동물 액체 샘플을 각각 예비-제거하는 단계;

b) 샘플 내의 Fc-융합 단백질의 이펙터 도메인에 특이적인 친화성 리간드에 커플링된 별개의 고체 지지체 상에 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질을 고정시키고, 여기서 친화성 리간드는 Fc-융합 단백질의 이펙터 도메인에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 또는 항체인 단계;

c) Fc-융합 단백질에 특이적인 엔도펩티다제로 절단함으로써 고체 지지체로부터 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질의 Fc-도메인을 별개의 용리액으로 방출시키는 단계;

dd) 단계 c) 이후에 고체 지지체 상에 남아있는 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질의 고정된 이펙터 도메인으로부터 글리칸을 별개의 용액으로 방출시키는 단계;

ee) 각각의 상기 샘플의 글리칸을 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지하는 단계; 및

ff) LC-MS를 사용하여 각각의 상기 샘플의 단계 ee)의 표지된 글리칸을 별개로 분석하고, 상기 2개 이상의 샘플을 비교하는 단계

를 포함하고, 여기서 단계 dd), ee) 또는 ff) 전에 형광 표지의 제2 안정한 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 참조 표준물질을 각각의 상기 샘플에 첨가하고, 참조 표준물질은 단계 ff)의 표지된 글리칸과 함께 분석되는 것인, 포유동물 액체 샘플에서 관심 Fc-융합 단백질의 글리칸을 분석하는 방법.

Claims (15)

1. a) 관심 재조합 당단백질을 포함하는 2개 이상의 포유동물 액체 샘플을 제공하는 단계;
   b) 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질을, 샘플 내의 재조합 당단백질에 특이적인 친화성 리간드에 커플링된 별개의 고체 지지체 상에 고정시키는 단계;
   c) 재조합 당단백질의 효소 절단에 의해 고체 지지체로부터 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편을 별개의 용리액으로 방출시키는 단계;
   d) 임의로, 별개의 용리액에서 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편으로부터 글리칸을 방출시키는 단계;
   e) 각각의 상기 샘플의 글리칸을 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지하는 단계; 및
   f) LC-MS를 사용하여 각각의 상기 샘플의 단계 e)의 표지된 글리칸을 별개로 분석하고, 상기 2개 이상의 샘플을 비교하는 단계
   를 포함하고, 여기서 형광 표지의 제2 안정한 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 참조 표준물질이 단계 c), d), e) 또는 f) 전에 각각의 상기 샘플에 첨가되고, 참조 표준물질은 단계 f)의 표지된 글리칸과 함께 분석되는 것인, 포유동물 액체 샘플에서 관심 재조합 당단백질의 글리칸을 분석하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 단계 c)에서 고체 지지체에 고정된 채로 남아있는 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 제2 글리칸 함유 단편의 글리칸을 분석하는 단계를 추가로 포함하고, 이 단계는
   aa) 단계 b) 전에 고체 지지체에 비-특이적으로 결합하는 당단백질을 제거하기 위해 2개 이상의 포유동물 액체 샘플을 각각 예비-제거하는 단계;
   dd) 단계 c) 이후에 고체 지지체 상에 남아있는 각각의 상기 샘플의 재조합 당단백질의 고정된 제2 글리칸 함유 단편으로부터 글리칸을 별개의 용액으로 방출시키는 단계;
   ee) 각각의 상기 샘플의 글리칸을 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지하는 단계; 및
   ff) LC-MS를 사용하여 각각의 상기 샘플의 단계 ee)의 표지된 글리칸을 별개로 분석하고, 상기 2개 이상의 샘플을 비교하는 단계
   를 포함하고, 여기서 형광 표지의 제2 안정한 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 참조 표준물질이 단계 dd), ee) 또는 ff) 전에 각각의 상기 샘플에 첨가되고, 참조 표준물질은 단계 ff)의 표지된 글리칸과 함께 분석되는 것인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 형광 표지가 ¹²[C] 및 ¹³[C] 동위원소 쌍, 바람직하게는 ¹²[C₆] 및 ¹³[C₆] 동위원소 쌍, 보다 바람직하게는 ¹²[C₆]-2-아미노벤조산 (¹²[C₆]-2-AA) 및 ¹³[C₆]-2-아미노벤조산 (¹³[C₆]-2-AA) 동위원소 쌍인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 당단백질이 융합 단백질 또는 항체, 바람직하게는 Fc-융합 단백질 또는 항체인 방법.
5. 제4항에 있어서, 단계 c)에서 고체 지지체로부터 방출된 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편이 Fc 도메인인 방법.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 재조합 당단백질이
   (a) 항체이며, 그의 가변 영역이 고체 지지체 상에 고정된 친화성 리간드에 결합하고, 바람직하게는 친화성 리간드가 항원인 항체; 또는
   (b) Fc-도메인 및 이펙터 도메인을 포함하는 Fc-융합 단백질이며, 이펙터 도메인이 고체 지지체 상에 고정된 친화성 리간드에 결합하고, 상기 친화성 리간드는 Fc-융합 단백질의 이펙터 도메인에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 또는 항체인 Fc-융합 단백질인 방법.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체로부터 재조합 당단백질의 글리칸 함유 단편을 방출시키기 위해 사용되는 효소가 엔도프로테이나제, 바람직하게는 파파인, 피신, 시스테인 프로테아제 SpeB 또는 시스테인 프로테이나제 IdeS, 보다 바람직하게는 시스테인 프로테이나제 IdeS인 방법.
8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 예비-제거 단계가
   aai) Fc-결합 단백질을 사용하여 고체 지지체 상에 Fc-함유 당단백질을 고정시키고, 여기서 상기 Fc-결합 단백질은 바람직하게는 단백질 G 또는 단백질 A로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 Fc-결합 단백질은 단백질 G인 단계; 및
   aaii) Fc-함유 당단백질을 용리시키는 단계
   를 포함하고; 여기서 상기 예비-제거 단계에서 사용되는 고체 지지체는 제1항의 단계 b)에서 사용된 고체 지지체와 동일한 물질로 만들어지지만, 상기 친화성 리간드에 커플링되지 않는 것인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   (a) LC-MS가 역상 LC-MS 또는 나노LC-MS이고, 바람직하게는 LC-MS가 역상 나노LC-MS이고/이거나;
   (b) 고체 지지체가 마이크로비드, 바람직하게는 세파로스 비드, 아가로스 비드 또는 자기 비드, 보다 바람직하게는 세파로스 비드를 포함하는 수지이고/이거나;
   (c) 친화성 리간드가 N-히드록시숙신이미드 (NHS), 시아노겐 브로마이드, 에폭시, 카르보디이미드 또는 티오프로필을 통해, 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 통해 고체 지지체에 커플링되고/되거나;
   (d) 2개 이상의 포유동물 액체 샘플이 다중 웰 필터 플레이트, 바람직하게는 24, 96 또는 384 웰 필터 플레이트, 보다 바람직하게는 96 웰 필터 플레이트에서의 분석을 위해 제조되는 것인 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 액체 샘플이
    (a) 바람직하게는 혈청 또는 혈장, 소변, 뇌척수액, 양수, 타액, 땀, 정액, 눈물, 가래, 질 분비물, 질 세척액 및 결장 세척액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 체액이고; 바람직하게는 상기 샘플은 혈장 또는 혈청 샘플이고/이거나;
    (b) 인간, 원숭이, 설치류, 개, 고양이 또는 돼지로부터 얻어지는 것인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 재조합 당단백질의 글리칸의 적어도 하나의 특정 글리칸 구조의 약동학적 파라미터, 바람직하게는 C_max, t_max, AUC 또는 t_1/2이 결정되는 것인 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 글리칸이 상기 2개 이상의 포유동물 액체 샘플 각각의 분취액에서 분석되고, 임의로 상기 재조합 당단백질의 농도가 상기 2개 이상의 포유동물 액체 샘플의 추가의 분취액에서 분석되는 것인 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 분석되는 샘플 또는 분취액의 부피가 약 1 ㎕ 내지 약 1000 ㎕, 약 5 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 약 25 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 또는 약 40 ㎕ 내지 약 75 ㎕, 바람직하게는 약 50 ㎕인 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따라 포유동물 액체 샘플에서 재조합 당단백질의 글리칸을 분석하는 단계, 및 당단백질을 당단백질 기반 제약 조성물로 제제화하는 단계를 포함하는, 당단백질 기반 제약 조성물의 제조 방법.
15. a) Fc-도메인 및 이펙터 도메인을 함유하는 Fc-융합 단백질을 포함하는 포유동물로부터 2개 이상의 액체 샘플을 제공하는 단계;
    aa) i) Fc-결합 단백질을 사용하여 별개의 고체 지지체 상에 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질을 고정시키고, 여기서 상기 Fc-결합 단백질은 바람직하게는 단백질 G 또는 단백질 A로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 Fc-결합 단백질은 단백질 G인 단계; 및
    ii) Fc-융합 단백질을 용리시키는 단계
    를 포함하는, 2개 이상의 포유동물 액체 샘플을 각각 예비-제거하는 단계;
    b) 샘플 내의 Fc-융합 단백질의 이펙터 도메인에 특이적인 친화성 리간드에 커플링된 별개의 고체 지지체 상에 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질을 고정시키고, 여기서 친화성 리간드는 Fc-융합 단백질의 이펙터 도메인에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 또는 항체인 단계;
    c) Fc-융합 단백질에 특이적인 엔도펩티다제로 절단함으로써 고체 지지체로부터 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질의 Fc-도메인을 별개의 용리액으로 방출시키는 단계;
    dd) 단계 c) 이후에 고체 지지체 상에 남아있는 각각의 상기 샘플의 Fc-융합 단백질의 고정된 이펙터 도메인으로부터 글리칸을 별개의 용액으로 방출시키는 단계;
    ee) 각각의 상기 샘플의 글리칸을 형광 표지의 제1 안정한 동위원소로 표지하는 단계; 및
    ff) LC-MS를 사용하여 각각의 상기 샘플의 단계 ee)의 표지된 글리칸을 별개로 분석하고, 상기 2개 이상의 샘플을 비교하는 단계
    를 포함하고, 여기서 단계 dd), ee) 또는 ff) 전에 형광 표지의 제2 안정한 동위원소로 표지된 글리칸을 포함하는 참조 표준물질을 각각의 상기 샘플에 첨가하고, 참조 표준물질은 단계 ff)의 표지된 글리칸과 함께 분석되는 것인, 포유동물 액체 샘플에서 관심 Fc-융합 단백질의 글리칸을 분석하는 방법.

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