JP2008309501A - 糖鎖の解析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】一連の糖鎖解析の過程から、蛍光試薬等による糖鎖の標識過程およびクロマトグラフィー等による糖鎖画分の脱塩・精製過程を必要としない、簡便かつ高感度なＦｃ結合糖鎖の解析方法を提供する。
【解決手段】ＩｇＧまたはそのＦｃ部分を含む誘導体が含まれる試料をプロテアーゼにより消化し、得られた糖ペプチドの質量分析を行い、糖鎖を検出し、次いで、得られた検出結果に基づいて糖鎖解析を行う、ＩｇＧのＦｃ結合糖鎖の分析方法。本分析方法を、疾患が癌またはリューマチである、糖鎖の異常を伴う患者を診断するためのガラクトース含量の測定に用いる。
【選択図】図１

Description

本発明は、ＩｇＧ Ｆｃ結合糖鎖の分析方法に関する。

哺乳類の抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの５種類のクラスが存在することが明らかとなっているが、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療には血中半減期が長く、各種エフェクター機能を有する等の機能特性からＩｇＧクラスの抗体が主として利用されている（非特許文献１）。ヒトＩｇＧクラスの抗体は、更にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の４種類のサブクラスに分類されている。これらのサブクラスのヒト血清中における存在比は、約１８：６：２：１である。ＩｇＧクラスの抗体のエフェクター機能である抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性という）や補体依存性細胞障害活性（以下、ＣＤＣ活性という）については、これまでに多数の研究が行われ、ヒトＩｇＧのサブクラスによってＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性が異なることが報告されている（非特許文献２）。

糖蛋白質の糖鎖は、蛋白質部分との結合様式により、アスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖）とセリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（Ｏ−グリコシル結合糖鎖）の２種類に大別される。Ｎ−グリコシド結合糖鎖は、様々な構造を有しているが（非特許文献３）、いずれの場合も以下の構造式（Ｉ）に示す基本となる共通のコア構造を有することが知られている。

［化１］
Ｍａｎα１→６
Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ （Ｉ）
Ｍａｎα１→３
Ｎ−グリコシド結合糖鎖中、アスパラギンと結合する末端は還元末端、反対側の末端は非還元末端と呼ばれている。Ｎ−グリコシド結合糖鎖には、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃという）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあることが知られている。

ＩｇＧは抗原結合部位を含むＦａｂ部分、Ｆｃ部分、Ｆａｂ部分とＦｃ部分をつなぐヒンジ領域の３つの領域に分けられる。ヒトＩｇＧのＦｃ部分にはＮ−グリコシド結合糖鎖が結合する部位が２箇所存在しており、ヒト血清中のＩｇＧでは通常、この部位にシアル酸やバイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンの付加が少ない２本の枝を持つコンプレックス型糖鎖が結合している。このコンプレックス型糖鎖の非還元末端でのガラクトースの付加および還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加に関しては多様性があることが知られている（非特許文献４）。

ヒトＩｇＧの糖鎖に関しては、ヒト型ＣＤＲ移植抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブクラス）のＦｃ部分に結合する糖鎖のバイセクティングに位置するＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃともいう）が抗体のＡＤＣＣ活性に影響することが報告されている（非特許文献５）。また、複数のヒトＩｇＧ１サブクラス抗体において、Ｆｃ部分に結合する糖鎖の還元末端に通常結合するフコースがないと抗体のＡＤＣＣ活性が上昇することが報告されている（非特許文献６、７、特許文献１）。さらに、抗ＣＤ２０抗体のヒトＩｇＧのすべてのサブクラスにおいて、Ｆｃ部分に結合する糖鎖の非還元末端に通常結合するフコースがないと抗体のＡＤＣＣ活性が上昇することが報告されている（非特許文献８）。これらの報告は、Ｆｃ部分に結合する糖鎖の構造がＡＤＣＣ活性を介したヒトＩｇＧのエフェクター機能に極めて重要な影響を及ぼすことを示している。

一方で、ヒト血清ＩｇＧの糖鎖は健常者と非健常者で異なることが示唆されている。例えば、リュウマチ患者では健常者に比べて血清ＩｇＧ糖鎖の非還元末端に付加するガラクトースの量が少ないことが報告されている（非特許文献９、１０）。一方、肺がん、胃がん、前立腺がんの患者の血清ＩｇＧにおいては、糖鎖の非還元末端に付加するガラクトースの量が健常人よりも多いことが示唆されている（非特許文献１１）。このように、ヒトＩｇＧの糖鎖を簡便に解析する方法はヒトの各種疾患の診断に有用であると考えられる。

一般に、糖蛋白質中の糖鎖の分析は、糖蛋白質から糖鎖を遊離し、遊離した糖鎖を分析することにより行われる。糖鎖の遊離方法には、ヒドラジン分解など化学的な方法とＰＮＧａｓｅＦなどを使用した、酵素的な方法がある（非特許文献３）。また、多くの場合、検出感度向上のため、遊離した糖鎖の蛍光試薬等による標識が行われる（非特許文献１２、特許文献２）。遊離・標識された糖鎖は、多くの場合蛋白質や塩を除くために糖鎖画分の精製を行った後に、クロマトグラフィー、電気泳動、質量分析等の手法で分析される。しかし、蛍光試薬等による糖鎖の標識や蛋白質および塩を除くための精製は作業が煩雑である。また、糖鎖画分の精製回収にはクロマトグラフィーによる分離過程が一般的であるが、この分離過程は微量にしか存在しない糖鎖の損失につながる恐れがある。

一般の糖蛋白質の糖鎖分析における上記のような問題点は、ＩｇＧの糖鎖分析にも当てはまる。これらの問題点を解決する方法として、ＩｇＧから遊離した糖鎖の蛍光標識を行わずにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ―ＭＳにより分析する方法が知られている（非特許文献１３）。しかしこの方法は、塩および蛋白質を除去する脱塩・精製過程を含む。またＩｇＧを還元カルボキシメチル化した後にＬｙｓＣで消化して糖ペプチドを調製し、得られた糖ペプチドを高速液体クロマトグラフィーで分離後ＥＳＩ−ＭＳにより分析する方法も報告されている（非特許文献１４）。しかし、この方法は、高速液体クロマトグラフィーによる糖ペプチドの精製を必要とし、さらにＩｇＧの還元カルボキシル化という煩雑な過程を含む。質量分析によりＦｃ由来糖ペプチドのＩｇＧ結合糖鎖の解析を行う別の方法として、ＩｇＧのジスルフィド結合を還元・切断してからトリプシンで処理することによりＦｃ由来糖ペプチドを調製し、さらに逆相液体クロマトグラフィーで糖ペプチド画分を精製して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析する方法が知られている（非特許文献１５）。しかし、この方法も高速液体クロマトグラフィーによる糖ペプチドの精製を必要とし、さらにＩｇＧのジスルフィド結合の還元・切断という煩雑な過程を含む。また、ＩｇＧから糖鎖を分離せずにＩｇＧをそのまま質量分析（ＥＳ−ＩＭＳ）することによりＩｇＧの糖鎖を分析する方法が報告されている（非特許文献１６）。この方法では、糖鎖の蛍光標識や糖鎖画分と非糖鎖画分の分離を必要としないが、高速液体クロマトグラフィーによる脱塩の過程を含む。さらにこの方法はガラクトースとフコースの付加の相違を区別することが出来ないなど、分解能が不十分でありＩｇＧ糖鎖の詳細な解析には適していない。一方、糖鎖画分のクロマトグラフィーによる精製の過程を一切排除した糖鎖分析法も報告されている（特許文献２）。しかし、この方法は、糖鎖を蛍光標識する過程を含む。このように、糖鎖標識の過程およびクロマトグラフィー等による糖鎖画分の脱塩・精製過程を一切含まない、簡便なＩｇＧ結合糖鎖の分析法は知られていない。

ＩｇＧのＦｃ部分を含むＦｃ融合蛋白質の中には、Ｆｃ部分以外の部分にＮ−グリコシド結合糖鎖を含むものがある。また骨髄腫患者の抗体の約２５％には、Ｆｃ部分のみならずＦａｂ部分にもＮ−グリコシド結合糖鎖が結合している（非特許文献１７）。このように、Ｆａｂ部分にもＮ−グリコシド結合糖鎖が結合しているＩｇＧや、Ｆｃ部分以外の部分にもＮ−グリコシド結合糖鎖が結合しているＦｃ融合蛋白質において、Ｆｃ部分結合糖鎖のみを特異的に分析する方法は、ＩｇＧを利用した治療薬の開発やヒト血清ＩｇＧの糖鎖分析による診断において、重要であると考えられる。Ｆｃ部分に結合する糖鎖のみを特異的に分析するための方法として、抗体分子のプロテアーゼ消化により得られるＦｃ由来糖ペプチドを分析する方法が知られている。しかし、上述のように、クロマトグラフィー等による糖鎖画分の脱塩・精製過程を経ずに、ＩｇＧのＦｃ由来糖ペプチドを、簡便に分析する方法は知られていない。
モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １（１９９５） ケミカル・イムノロジー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），６５，８８（１９９７） 生物化学実験法２３−分子糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年） バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），３６，１３０，（１９９７） グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），５，８１３（１９９５） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２６７３３−２６７４０（２００２） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，３４６６−３４７３（２００３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３０６，１５１−１６０（２００５） Ｎａｔｕｒｅ，３１６，４５２−４５７（１９８５） Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２８，６２１−６２８（２０００） 生物物理化学 ２０００；４４補冊２：１４ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９５，１９７（１９８４） Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０，４７７−４８６（２０００） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７０，２７１８−２７２５（１９９８） Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，１３，１０４９−５４（１９９５） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４１，４１０−４１９（２００６） Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１５，２５９−２７３（１９９３） ＷＯ２００２／０３１１４０ 特開２００５−２９１９５８号公報

本発明の目的は、一連の糖鎖解析の過程から、蛍光試薬等による糖鎖の標識過程およびクロマトグラフィー等による糖鎖画分の脱塩・精製過程を必要としない、簡便かつ高感度なＦｃ結合糖鎖の解析方法を提供することにある。

本発明は、以下の（１）〜（１９）に関する。
（１）ＩｇＧまたはそのＦｃ部分を含む誘導体が含まれる試料をプロテアーゼにより消化し、得られた糖ペプチドの質量分析を行い、糖鎖を検出し、次いで得られた検出結果に基づいて糖鎖解析を行うことを特徴とする、ＩｇＧのＦｃ結合糖鎖の分析方法。
（２）ＩｇＧがヒトＩｇＧである、（１）に記載の方法。
（３）ＩｇＧがＩｇＧ１である、（１）または（２）に記載の方法。
（４）試料が人の体液から採取された試料である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）体液が血清である、（４）に記載の方法。
（６）プロテアーゼが酸性プロテアーゼである、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）酸性プロテアーゼがペプシンである、（６）に記載の方法。
（８）糖ペプチドのペプチド部分が、Ｆｃ結合糖鎖が結合するアスパラギン残基のN末端側１３、１５、または１９アミノ酸残基から該アスパラギン残基のC末端側３アミノ酸残基までのペプチドからなる、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９）糖ペプチドが、Ｆｃ結合糖鎖が結合するアスパラギン残基のN末端側１３アミノ酸残基から該アスパラギン残基のＣ末端側３アミノ酸残基までを含む糖ペプチドである、（８）に記載の方法。
（１０）糖ペプチドを精製することなく質量分析を行う、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法。
（１１）糖鎖の標識を行わずに質量分析を行う、（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）質量分析をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより行う、（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の方法。
（１３）質量分析を行う工程において使用されるマトリックス試薬が、α−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸または２’,４’,６’−トリハイドロキシアセトフェノンである、（１２）に記載の方法。
（１４）ＩｇＧが異なるＦｃ結合糖鎖を有するＩｇＧ分子を含むＩｇＧである、（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）試料が２以上のＩｇＧまたはそのＦｃ部分を含む誘導体を含む試料である、（１）〜（１４）のいずれか１項に記載の方法。
（１６）糖鎖解析がガラクトース含量を測定することである、（１）〜（１５）のいずれか１項に記載の方法。
（１７）糖鎖解析がＮ−アセチルグルコサミン含量および／またはフコース含量を測定することである、（１）〜（１５）のいずれか１項に記載の方法。
（１８）糖鎖の異常を伴う疾患を診断するための、（１）〜（１７）のいずれか１項に記載の方法。
（１９）疾患が癌またはリューマチである、（１８）に記載の方法。

本発明は、ＩｇＧをプロテアーゼにより消化して得られるＦｃ部分由来の糖ペプチドを分析することによりＦｃ部分に結合する糖鎖を簡便に解析する方法を提供する。本発明の方法では、糖鎖の修飾反応および糖ペプチドの脱塩・精製過程を必要としないため、試料の前処理過程における損失を防ぐことができ、高感度な解析を行うことができる。

哺乳類の抗体はＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの５種類のクラスに分類され、ＩｇＧはさらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の４種類のサブクラスに分類されるが、本発明において用いられるＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のいずれでも良い。また、ＩｇＧの各々のサブクラスについて、多型またはアロタイプによるアミノ酸残基の微細な差異が存在するが、本発明におけるＩｇＧは、いずれの多型またはアロタイプでも良い。

ＩｇＧは、パパインなどのプロテアーゼで消化することにより、抗原結合活性を持つＦａｂ断片と抗原結合活性を持たないＦｃ断片に分けることができるが、本発明においてＦａｂ部分とは、ＩｇＧの中でＦａｂ断片に対応する部分をいい、Ｆｃ部分とはＦｃ断片に対応する部分をいう。また、Ｆａｂ部分とＦｃ部分をつなぐ部分をヒンジという。ＩｇＧのＦｃ部分は２本の重鎖からなる。各々の重鎖には、通常Ｎ−グリコシド結合糖鎖が結合するアスパラギン残基が１つだけ存在する。したがって、ＩｇＧのＦｃ部分には通常２本のＮ−グリコシド結合糖鎖が存在している。

本発明においてＩｇＧのＦｃ部分を含む誘導体とは、ＩｇＧのＦｃ部分を含む誘導体であれば、いかなるものでも良い。当該誘導体としては、例えばＩｇＧのＦｃ部分を含むＩｇＧ断片や、ＩｇＧのＦｃ部分を含む分子と、酵素やサイトカインなどの蛋白質とを融合させた物質などがあげられる。またＩｇＧの活性改変などを目的として、Ｆｃ部分の１個または複数個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に人工的に改変したり、ＩｇＧのＦｃ部分に結合する糖鎖を人工的に改変したＩｇＧも、本発明におけるＩｇＧに包含される。

本発明におけるＩｇＧまたはそのＦｃ部分を含む誘導体を含む試料（以下、これらをまとめてＩｇＧ含有試料という）としては、生物としては動物、植物、細菌、ウイルスがあげられるが、好ましくは動物があげられる。動物としてはヒト、サル、ラット、マウス等いずれの動物でもよいが、ヒトが好ましい。生物由来の試料としては、例えば、血漿、血清、汗、唾液、尿、膵液、羊水、髄液などがあげられ、好ましくは血漿、血清、尿があげられる。

また本発明におけるＩｇＧ含有試料としては、トランスジェニック動物や培養細胞などを用いて、組換え蛋白質技術によって製造された試料であってもよい。
本発明においてＩｇＧとしては、ＩｇＧ分子を含むものであれば異なるＦｃ結合糖鎖を有するＩｇＧ分子を含んでいてもよい。本発明において例えば３種類のＦｃ結合糖鎖を有するＩｇＧ分子を含むＩｇＧがある場合、一度に３種類のＩｇＧ分子それぞれについて、Ｆｃ結合糖鎖の分析を行うことができる。

本発明において糖鎖とは、１つ以上の単位糖（単糖および／またはその誘導体）から構成される物質をいう。２つ以上の単位糖から構成される場合は、各々の単位糖は通常グリコシド結合により結合している。アミノ基などと反応し得る糖鎖の末端を還元末端、還元末端でない糖鎖の末端を非還元末端と呼ぶ。ここでＮ−アセチルノイラミン酸など、負電荷を持つ単位糖を含む糖鎖を酸性糖鎖、負電荷を持つ単位糖を含まない糖鎖を中性糖鎖というが、本発明における糖鎖は中性糖鎖と酸性糖鎖の両方を含む。

また本発明においてＩｇＧ含有試料には２以上のＩｇＧまたはそのＦｃ部分を含む誘導体を含んでいてもよい。例えば、ＩｇＧ含有試料中に異なるＦａｂ部分を有するＩｇＧが２以上あってもよく、異なるタイプのＩｇＧが２以上含まれていてもよい。
本発明においてペプチドとは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合したものをいう。アミノ酸（Ｈ_２ＮＣＨＲＣＯＯＨ、Ｒはアミノ酸の側鎖）がペプチドに組み込まれた時、−ＮＨ−ＣＨＲＣＯ−部分をアミノ酸残基という。特に、遊離のα−アミノ基を持つアミノ酸残基をＮ末端アミノ酸残基、遊離のα−カルボキシル基を持つアミノ酸残基をＣ末端アミノ酸残基という。ここで、Ｍ個のアミノ酸が分枝することなくペプチド結合したペプチドにおいて、Ｎ末端アミノ酸残基からi番目のアミノ酸残基をＡ_ｉとする（ｉは１以上Ｍ以下の自然数）。この時、アミノ酸残基Ａ_ｉ−ｋ（ｋはｉ−１以下の自然数）を「アミノ酸残基Ａ_ｉのＮ末端側ｋ残基目のアミノ酸残基」、アミノ酸残基Ａ_ｉ＋ｋ（ｋはＭ−ｉ以下の自然数）を「アミノ酸残基Ａ_ｉのＣ末端側ｋ残基目のアミノ酸残基」という。

本発明において糖ペプチドとは、ペプチドに糖鎖が共有結合したものをいう。糖ペプチドにおける糖鎖とペプチドの結合様式としては、ペプチドのアスパラギン残基の側鎖に糖鎖の還元末端が結合する場合（Ｎ−グリコシド結合糖鎖）、ペプチドのセリン残基またはスレオニン残基の側鎖に糖鎖の還元末端が結合する場合（Ｏ−グリコシル結合糖鎖）、などがあげられる。ペプチドの場合と同様に、糖ペプチドにおいても、遊離のα−アミノ基を持つアミノ酸残基をＮ末端アミノ酸残基、遊離のα−カルボキシル基を持つアミノ酸残基をＣ末端アミノ酸残基という。

本発明においてＦｃ結合糖鎖とは、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に結合している糖鎖をいうが、糖鎖の結合様式としてはＮ−グリコシド結合糖鎖であってもＯ−グリコシド結合であってもよいが、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が好ましい。
本発明におけるＦｃ部分由来の糖ペプチドは、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の場合は、好ましくはＦｃ結合糖鎖が結合するアスパラギン残基のＮ末端側１３、１５、または１９アミノ酸残基目から該アスパラギン残基のＣ末端側３アミノ酸残基目までのペプチドからなる糖ペプチドであり、さらに好ましくは該アスパラギン残基のＮ末端側１９アミノ酸残基目から該アスパラギン残基のＣ末端側３アミノ酸残基目までのペプチドからなる糖ペプチドである。具体的には、ペプチド部分のアミノ酸配列が配列番号１〜３のいずれかで示される糖ペプチドがあげられる。

本発明において使用されるプロテアーゼとしては、ＩｇＧ分子からＦｃ部分由来の糖ペプチドを調製することができるものであればいずれのプロテアーゼでも良いが、プロテアーゼの形態としては、粉末、溶液等いかなる形態であってもよい。例えばアガロースビーズのような固相に固定化されたプロテアーゼ等があげられる。
また本発明において使用されるプロテアーゼとしては、分析の際の障害となり得る非糖ペプチドの生成を最小限に抑えつつ、Ｆｃ部分由来の糖ペプチドを効率的に調製するプロテアーゼが好ましい。酸性プロテアーゼとは、ペプチド結合を切断する触媒活性が酸性ｐＨで最大になるプロテアーゼをいうが、酸性ｐＨ条件下でＩｇＧのプロテアーゼ消化を行うと、Ｆｃ結合糖鎖の近傍が優先的に消化され、Ｆａｂ部分などそれ以外の部分は容易に消化されないため、本発明においては酸性プロテアーゼが好ましく用いられる。酸性プロテアーゼとしては、ペプシン、ＨＩＶプロテアーゼ、レニン、カテプシンＥ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、プロテアーゼＡなどがあげられるが、好ましくはペプシンがあげられる。

本発明におけるＩｇＧ分子のプロテアーゼ消化のｐＨは、Ｆｃ部分由来の糖ペプチドが生成する限りどのようなｐＨであっても良いが、好ましくはｐＨ１〜６、より好ましくはｐＨ２〜５、特に好ましくはｐＨ３〜４である。プロテアーゼ消化の反応時間は、Ｆｃ部分由来の糖ペプチドが生成する限りどのような反応時間であっても良いが、好ましくは１０秒間〜２４時間、より好ましくは１分間〜４時間、さらに好ましくは５分間〜１時間である。プロテアーゼ消化の温度は、Ｆｃ部分由来の糖ペプチドが生成する限りどのような温度であっても良いが、好ましくは４℃〜３７℃、より好ましくは１５℃〜３７℃、さらに好ましくは２５℃〜３７℃である。

本発明において質量分析とは、レーザー照射などによりイオン化した試料を、質量数／電荷数（ｍ／ｚ）に従って分離し、各イオンの相対強度を測定する分析方法をいう。
本発明においては、ＩｇＧ含有試料をプロテアーゼにより消化し、得られた糖ペプチドを精製することなく質量分析を行い、糖鎖を検出し、次いで得られた検出結果に基づいて糖鎖解析を行うことにより、Ｆｃ結合糖鎖の分析を行うことができる。すなわち、Ｆｃ部分由来糖ペプチド以外のＩｇＧ分子由来のペプチドやＦａｂ断片等が含まれる試料であっても、質量分析によりＦｃ部分由来糖ペプチドを検出してＦｃ結合糖鎖を分析することができる。また、試料が微量のリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グアニジンを含む場合であってもＦｃ部分由来糖ペプチドを検出することができる。

本発明において使用される質量分析の方法は当該分野において周知である（丹羽、最新のマススペクトロメトリー、化学同人（１９９５））。
本発明における質量分析には、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法を始めとした任意のイオン化手法を使用することができる。また質量分析には、飛行時間型（ＴＯＦ）、四重極型、磁場型など、任意の質量分離方式を使用することができるが、ＴＯＦを用いた方法が好ましく用いられる。

本発明においてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳとは、Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒの略語である。ＭＡＬＤＩとは、田中らによって見いだされ、Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐらによって開発された質量分析の技法である（Ｋａｒａｓ Ｍ．，Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ｆ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８，６０，２２９９−２３０１）。この方法では、試料とマトリックス溶液を混合した後、混合溶液をプレート上で乾固し、結晶状態にする。パルスレーザー照射により、大きなエネルギーがマトリックス上に与えられ、（Ｍ＋Ｈ）^＋、（Ｍ＋Ｎａ）^＋などの試料由来イオンとマトリックス由来イオンとが脱離する。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、ＭＡＬＤＩを利用して飛行時間を元に質量を測定するものである。イオンが一定の加速電圧Ｖで加速される場合、イオンの質量をｍ、イオンの速度をｖ、イオンの電荷数をｚ、電気素量をｅ、イオンの飛行時間をｔとしたとき、イオンのｍ／ｚは、ｍ／ｚ＝２ｅＶｔ^２／Ｌ^２で表すことができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定には、島津製作所のＫｒａｔｏｓのＫＯＭＰＡＣＴ ＭＡＬＤＩ ＩＩ／ＩＩＩやブルカーダルトニクス社のＲＥＦＬＥＸ^ＴＭＩＩＩなどの質量分析計を使用することができる。

本発明の質量分析において使用されるマトリックス試薬としては、質量分析に使用できるものであればいずれも使用できるが、好ましくは、２，５−ジヒドロキシベンゾイックアシッド、α−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸、２’,４’,６’−トリハイドロキシアセトフェノン、シナピン酸、ｔｒａｎｓ−３−インドール−アクリル酸、１，５−ジアミノ−ナフタレン、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸、９−ニトロ−アントラセン、２−ピコリン酸、３−ヒドロキシ−ピコリン酸、ニコチン酸、アントラニル酸、５−クロロ−サリチル酸、２’−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸、ジスラノール、および３−アミノ−キノリンがあげられ、より好ましくはα−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸または２’,４’,６’−トリハイドロキシアセトフェノンがあげられる。

本発明において質量分析に供される試料の質量分析計への導入法としては、ＩｇＧ含有試料のプロテアーゼ消化液を含む容器から、例えばシリンジ、ピペット、または自動サンプリング装置等の手段を介して質量分析計に導入してもよいし、ＭＡＬＤＩ用３８４マイクロプレート等の質量分析用のプレート上でプロテアーゼ消化を行って直接導入してもよい。

本発明における糖鎖の解析には、糖鎖を同定することが含まれる。糖鎖の同定とは、解析対象試料に含まれる１つまたは複数の糖鎖成分を特定することである。例えば糖蛋白質の糖鎖分析においては、糖蛋白質に結合する糖鎖を特定することをいい、糖蛋白質に結合する糖鎖が複数ある場合は、それら複数の糖鎖を特定することをいう。糖蛋白質の糖鎖を同定する方法としては、糖蛋白質から糖ペプチドを分離し、得られた糖ペプチドの質量分析を行い、次いで得られた検出結果に基づいて糖鎖解析を行い、糖鎖を同定する方法があげられる。

また本発明における糖鎖解析は、糖鎖を定量することが含まれる。本発明において糖鎖の定量とは、例えば分析の対象となる試料に含まれる２以上の糖鎖の量比（モル比）を求めることを包含する。具体的にはＩｇＧまたはそのＦｃを含む誘導体に結合する２以上の糖鎖の量比を求めることをいう。
本発明における糖鎖の検出とは、例えば質量分析においては、観測される質量スペクトルにおいてシグナルとして認識されるピークを見出すことをいう。認識されたピークが特定の目的分子に対応する場合は、その目的分子のピークが検出されたことになる。質量分析で検出されたＦｃ部分由来の糖ペプチドのピークの大きさの比を計算することにより、ＩｇＧまたはそのＦｃを含む誘導体に結合する糖鎖の定量を行うことができる。ピークの大きさは、例えば、ピークのある質量範囲の面積またはピーク全部の面積を指標として測定してもよいし、ピークの高さを指標として測定してもよい。

本発明により、ＩｇＧまたはそのＦｃを含む誘導体のＦｃ結合糖鎖を分析することができる。本発明により分析できる糖鎖は、ＩｇＧまたはそのＦｃを含む誘導体のＦｃ結合糖鎖であればいかなる糖鎖であっても良い。また本発明により当該糖鎖中のガラクトース含量や、Ｎ−アセチルグルコサミン含量、フコース含量等も測定することができる。
本発明の分析方法により、糖鎖の異常を伴う疾患を診断することができる。例えば、リュウマチ患者では健常者に比べて血清ＩｇＧ糖鎖の非還元末端に付加するガラクトースの量が少ないことが報告されている一方（Ｎａｔｕｒｅ，３１６，４５２−４５７（１９８５）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２８，６２１−６２８（２０００））、肺がん、胃がん、前立腺がんの患者の血清ＩｇＧにおいては、糖鎖の非還元末端に付加するガラクトースの量が健常人よりも多いことが示唆されているため（生物物理化学 ２０００；４４補冊２：１４）、本発明のＩｇＧのＦｃ結合糖鎖中のガラクトース含量を測定する方法により、これらの疾患を診断することができる。

ヒトＩｇＧのＮ−アセチルグルコサミン含量やフコース含量が抗体のＡＤＣＣ活性に影響することが知られているため（グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），５，８１３（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２６７３３−２６７４０（２００２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，３４６６−３４７３（２００３）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３０６，１５１−１６０（２００５）、ＷＯ２００２／０３１１４０）、本発明のＦｃ結合糖鎖中のＮ−アセチルグルコサミン含量やフコース含量を測定する方法により、ＡＤＣＣ活性を測定することができる。

以下に本発明の実施例を示すが、本発明の内容はこれに限定されるものではない。

組み換えヒトＩｇＧ１のＦｃ結合糖鎖の解析
抗ケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）キメラ抗体ＫＭ２７６０［Ｒ．Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４，２１２７−２１３３（２００４）］を生産するラットミエローマＹＢ２／０細胞培養上清をウルトラフリー０．５−１０Ｋ（ミリポア社製）を用いて緩衝液Ａ（１０ｍＭ酢酸−トリエタノールアミン、ｐＨ５．０）に置換した。緩衝液Ａを用いて濃度を２．０ｍｇ／ｍＬにした当該溶液５μＬに５μＬの１２ｍＭギ酸を加えることにより、ｐＨを３．８にした。この溶液１０μＬに５μＬの０．２７ｍｇ／ｍＬペプシン溶液（シグマ社製のペプシンを水に溶かしたもの）を加えて混合し、３７℃で1時間温置した。この反応液１５μＬに５μＬの３０ｍＭトリエタノールアミンを加えて反応液を中性ｐＨにすることにより、ペプシン消化反応を停止した。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ用のプレートに０．５μＬの薄膜溶液（α−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸をアセトンに濃度２０ｍｇ／ｍＬとなるように溶かしたもの）を滴下して薄膜を作製した。前記のペプシン消化液と後述するマトリックス溶液とを混合して、薄膜の上に載せた。マトリックス溶液は０．１％トリフルオロ酢酸とアセトニトリルを２：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で混合した溶媒に、α−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸を濃度２０ｍｇ／ｍＬとなるように懸濁し、遠心分離した上清を用いた。プレートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ―ＭＳ装置（ＲＥＦＬＥＸ^ＴＭＩＩＩ、ブルカーダルトニクス社製）に装着し、測定を行った。測定時のレーザー照射エネルギーは２５ｋｅＶに設定し、ポジティブモード／リフレクターモードで測定を行った。得られた質量スペクトルにおいて、ペプチド部分が配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる、Ｆｃ部分由来の糖ペプチドが検出された。

検出された糖鎖構造とそれに対応する略号を図１に示す。例えば、Ｇ（０）Ｆ（０）とは、以下の構造式ＩＩで示される糖鎖構造を示している。
［化２］
ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６
Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ（ＩＩ）
ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３
ペプチド部分が配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＦｃ部分由来の糖ペプチドが検出された結果を図２に示す。図２の矢印で示した複数のピークは、異なる糖鎖構造に由来する糖ペプチドを示している。

図２で示された糖ペプチドピークの面積の比を計算することにより、抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０のＦｃ結合糖鎖の量比を定量した。その結果を表１に示す。

（表１）本発明の方法および従来の方法により得られたＫＭ２７６０の糖鎖量比
また図２には特に示していないが、配列番号４で示されるのアミノ酸配列からなるペプチドにＧ（０）Ｆ（０）糖鎖およびＧ（１）Ｆ（０）糖鎖が結合したＦｃ部分由来の糖ペプチドや、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるペプチドにＧ（０）Ｆ（０）糖鎖およびＧ（１）Ｆ（０）糖鎖が結合したＦｃ部分由来糖ペプチドのピークも検出された。

組み換えヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のＦｃ結合糖鎖の解析
ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４型の抗ＣＤ２０キメラ抗体［Ｒ．Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．３０６，１５１−１６０（２００５）］を生産するチャイニーズハムスター卵巣組織由来細胞（ＣＨＯ細胞）の各培養上清中の各抗体のＦｃ結合糖鎖を分析した。分析の方法は実施例１と同様にして行った。得られた質量スペクトルを図３に示す。ヒトＩｇＧ２とヒトＩｇＧ３のスペクトルでは、ペプチド部分が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる糖ペプチドが検出された。ヒトＩｇＧ４のスペクトルでは、ペプチド部分が配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する糖ペプチドが検出された。

図３で示された糖ペプチドピークの面積の比を計算することにより、Ｆｃ結合糖鎖を定量した。その結果を表２に示す。表２に示したように、本発明の方法によりヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４の各Ｆｃ結合糖鎖の同定と定量を行うことができた。

（表２）ヒトＩｇＧ２，ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４の糖鎖量比

ヒト血清から精製したＩｇＧのＦｃ結合糖鎖の解析
市販のヒト血清（シグマ社、カタログ番号Ｓ７０２３、ロット番号０３４Ｋ８９３７）を緩衝液Ｂ（１５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）に対して透析した。緩衝液Ｂで平衡化した陰イオン交換レジン（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を担体とするカラムに透析したヒト血清を通液することによりＩｇＧを主成分として含む透過液を回収し、実施例１と同様の方法で分析した。得られた質量スペクトルを図４に示す。ペプチド部分が配列番号１、２、または３のそれぞれ示されるアミノ酸配列からなるＦｃ部分由来の糖ペプチドが検出された。また図４に示したように、配列番号１で示されるアミノ酸配列（ヒトＩｇＧ１の配列に相当）からなるペプチドにＧ（０）Ｆ（１）、Ｇ（１）Ｆ（０）、Ｇ（１）Ｆ（１）、Ｇ（０）Ｆ（１）ＧＮ（１）、Ｇ（２）Ｆ（１）、またはＧ（１）Ｆ（１）ＧＮ（１）糖鎖が結合したＦｃ部分由来の糖ペプチド、配列番号２で示されるアミノ酸配列（ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ３に相当）からなるペプチドにＧ（０）Ｆ（１）、Ｇ（１）Ｆ（１）、Ｇ（２）Ｆ（１）、またはＧ（１）Ｆ（１）ＧＮ（１）糖鎖が結合したＦｃ部分由来の糖ペプチド、配列番号３で示されるアミノ酸配列（ヒトＩｇＧ４に相当）からなるペプチドにＧ（０）Ｆ（１）またはＧ（１）Ｆ（１）糖鎖が結合したＦｃ部分由来の糖ペプチドのピークが検出された。

健常人およびリウマチ患者の血清ＩｇＧ１のＦｃ結合糖鎖の解析
３５人分の健常人の血清または２４人分のリウマチ患者の血清（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社製）から以下のようにしてＩｇＧを精製した。緩衝液Ｃ（０．２Ｍ ホウ酸、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）で平衡化したプロテインＡ（Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を担体とするカラムに、血清を通液し、カラムを緩衝液Ｃで洗浄した。プロテインＡに結合したヒトＩｇＧを緩衝液Ｄ（０．１Ｍ クエン酸、ｐＨ３．５）で溶出した。このＩｇＧのＦｃ結合糖鎖を実施例３と同様の方法で分析した。得られた質量分析スペクトルにおいて、ペプチド部分が配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒトＩｇＧ１のＦｃ部分由来の糖ペプチドのピークを検出した。検出されたヒトＩｇＧ１のＦｃ部分由来の糖ペプチドの面積をもとにして、以下の式１によりヒトＩｇＧ１のＦｃ結合糖鎖1本あたりに結合するガラクトースの数（Ｎｏ＿Ｇａｌ）を計算した。

[式１]
Ｎｏ＿Ｇａｌ
＝[Ｇ１Ｆ０＋Ｇ１Ｆ１＋Ｇ１Ｆ０ＧＮ１＋Ｇ１Ｆ１ＧＮ１
＋２ｘ｛Ｇ２Ｆ０＋Ｇ２Ｆ１＋Ｇ２Ｆ０ＧＮ１＋Ｇ２Ｆ１ＧＮ１｝] ／１００

ただし、式１において、
Ｇ１Ｆ０：Ｇ（１）Ｆ（０）ピークの面積／Ｔｏｔａｌ ｘ １００
Ｇ２Ｆ０：Ｇ（２）Ｆ（０）ピークの面積／Ｔｏｔａｌ ｘ １００
Ｇ１Ｆ１：Ｇ（１）Ｆ（１）ピークの面積／Ｔｏｔａｌ ｘ １００
Ｇ２Ｆ１：Ｇ（２）Ｆ（１）ピークの面積／Ｔｏｔａｌ ｘ １００
Ｇ１Ｆ０ＧＮ１：Ｇ（１）Ｆ（０）ＧＮ（１）ピークの面積／Ｔｏｔａｌ ｘ １００
Ｇ２Ｆ０ＧＮ１：Ｇ（２）Ｆ（０）ＧＮ（１）ピークの面積／Ｔｏｔａｌ ｘ １００
Ｇ１Ｆ１ＧＮ１：Ｇ（１）Ｆ（１）ＧＮ（１）ピークの面積／Ｔｏｔａｌ ｘ １００
Ｇ２Ｆ１ＧＮ１：Ｇ（２）Ｆ（１）ＧＮ（１）ピークの面積／Ｔｏｔａｌ ｘ １００
Ｔｏｔａｌ：質量分析スペクトルにおいて検出されたヒトＩｇＧ１由来のＦｃ部分由来の糖ペプチドピークの面積の合計
をそれぞれ示す。

図５に、各検体のＮｏ＿Ｇａｌを示した。健常人３５人分およびリウマチ患者２４人分のＮｏ＿Ｇａｌの平均値と標準偏差（カッコ内）は、それぞれ、０．８９（０．１２）および０．６７（０．１３）であり、Ｎｏ＿Ｇａｌの平均値は健常人に比べてリウマチ患者の方が低かった。健常人とリウマチ患者のＮｏ＿Ｇａｌの平均値の差が有意であるかどうかを調べるためにt検定を行った結果、Ｐ値は１０^−８となり、両者の差は有意であることが確認された。

ヒトＩｇＧ１のＦｃとサイトカインを融合した組換えタンパク質のＦｃ結合糖鎖の解析
ヒトＩｇＧ１のＦｃとヒト腫瘍壊死因子受容体のリガンド結合部分を融合した組み換え蛋白質（エンブレル^ＴＭ、アムジェン社製）のＦｃ結合糖鎖の分析を以下のようにして行った。エンブレルの緩衝液をウルトラフリー０．５−１０Ｋ（ミリポア社製）を用いて緩衝液Ｅ（１０ｍＭリン酸カリウム溶液、ｐＨ４．８）に置換し、蛋白質濃度を２．０ｍｇ／ｍＬに調整した。この溶液５μＬに５μＬの１０ｍＭギ酸―トリエタノールアミン溶液を加えてｐＨを３．８にした。この溶液１０μＬに５μＬの０．２７ｍｇ／ｍＬペプシン溶液（シグマ社製のペプシンを水に溶かしたもの）を加えて混合し、３７℃で1時間温置した。この反応液１５μＬに５μＬの３０ｍＭのトリエタノールアミンを加えて反応液を中性ｐＨにすることにより、ペプシン消化反応を停止した。

実施例１と同様の方法により、ペプシン消化したエンブレルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる分析を行った。得られた質量スペクトルにおいて、ペプチド部分が配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる、Ｆｃ部分由来の糖ペプチドが検出された。これらの糖ペプチドピークの面積の比を計算することにより、エンブレルのＦｃ結合糖鎖の量比を定量した。その結果を表３に示す。表３に示したように、本発明の方法により、Ｆｃ以外の部分にもＮ型糖鎖が結合しているＦｃ融合蛋白質のＦｃ結合糖鎖を解析することができた。

（表３）エンブレルのＦｃ結合糖鎖量比

本発明により、ＩｇＧまたはそのＦｃ部分を含む誘導体のＦｃ結合糖鎖の分析方法が提供される。本発明の方法は、簡便かつ高感度でＩｇＧのＦｃ結合糖鎖を分析することができ、血清ＩｇＧの糖鎖分析による疾患の診断やＩｇＧを利用した医薬の開発において有用である。

図１は、代表的なヒトＩｇＧのＦｃ結合糖鎖の模式図と対応する略号を示している。 図２は、ペプシンで消化した抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。Ｆｃ部分由来の糖ペプチドのピークを矢印で示し、対応する糖鎖の略号を示した。 図３は、ペプシンで消化したヒトＩｇＧ２抗体（下段）、ヒトＩｇＧ３抗体（中段）、ヒトＩｇＧ４抗体（上段）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。Ｆｃ部分由来の糖ペプチドのピークを矢印で示し、対応する糖鎖の略号を示した。 図４は、ヒト血清から精製したＩｇＧのペプシン消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。いくつかのＦｃ部分由来の糖ペプチドピークを矢印で示した。○はペプチド部分が配列番号１で示されるアミノ酸配列、△はペプチド部分が配列番号２で示されるアミノ酸配列、□はペプチド部分が配列番号３で示されるアミノ酸配列であるＦｃ部分由来の糖ペプチドのピークである。 図５は、３５人分の健常人の血清ＩｇＧ１および２４人分のリウマチ患者の血清ＩｇＧ１の糖鎖を分析した結果を示す。横軸は各検体を、縦軸（Ｎｏ＿Ｇａｌ）はヒトＩｇＧ１のＦｃ結合糖鎖1本あたりに結合するガラクトースの数を表す。

Claims (19)

1. ＩｇＧまたはそのＦｃ部分を含む誘導体が含まれる試料をプロテアーゼにより消化し、得られた糖ペプチドの質量分析を行い、糖鎖を検出し、次いで得られた検出結果に基づいて糖鎖解析を行うことを特徴とする、ＩｇＧのＦｃ結合糖鎖の分析方法。
2. ＩｇＧがヒトＩｇＧである、請求項１に記載の方法。
3. ＩｇＧがＩｇＧ１である、請求項１または２に記載の方法。
4. 試料が人の体液から採取された試料である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 体液が血清である、請求項４に記載の方法。
6. プロテアーゼが酸性プロテアーゼである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 酸性プロテアーゼがペプシンである、請求項６に記載の方法。
8. 糖ペプチドのペプチド部分が、Ｆｃ結合糖鎖が結合するアスパラギン残基のN末端側１３、１５、または１９アミノ酸残基から該アスパラギン残基のC末端側３アミノ酸残基までのペプチドからなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 糖ペプチドが、Ｆｃ結合糖鎖が結合するアスパラギン残基のN末端側１３アミノ酸残基から該アスパラギン残基のＣ末端側３アミノ酸残基までを含む糖ペプチドである、請求項８に記載の方法。
10. 糖ペプチドを精製することなく質量分析を行う、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 糖鎖の標識を行わずに質量分析を行う、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 質量分析をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより行う、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 質量分析を行う工程において使用されるマトリックス試薬が、α−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸または２’,４’,６’−トリハイドロキシアセトフェノンである、請求項１２に記載の方法。
14. ＩｇＧが異なるＦｃ結合糖鎖を有するＩｇＧ分子を含むＩｇＧである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 試料が２以上のＩｇＧまたはそのＦｃ部分を含む誘導体を含む試料である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 糖鎖解析がガラクトース含量を測定することである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 糖鎖解析がＮ−アセチルグルコサミン含量および／またはフコース含量を測定することである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
18. 糖鎖の異常を伴う疾患を診断するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 疾患が癌またはリューマチである、請求項１８に記載の方法。