JP7045373B2 - オリゴヌクレオチドの混合物の分離分析方法 - Google Patents

オリゴヌクレオチドの混合物の分離分析方法 Download PDF

Info

Publication number
JP7045373B2
JP7045373B2 JP2019525688A JP2019525688A JP7045373B2 JP 7045373 B2 JP7045373 B2 JP 7045373B2 JP 2019525688 A JP2019525688 A JP 2019525688A JP 2019525688 A JP2019525688 A JP 2019525688A JP 7045373 B2 JP7045373 B2 JP 7045373B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
column
oligonucleotides
liquid chromatography
mass
filler
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2019525688A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2018235904A1 (ja
Inventor
潤治 貴家
裕史 青木
謙 小木戸
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Showa Denko KK
Original Assignee
Showa Denko KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Showa Denko KK filed Critical Showa Denko KK
Publication of JPWO2018235904A1 publication Critical patent/JPWO2018235904A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7045373B2 publication Critical patent/JP7045373B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/16—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the fluid carrier
    • B01D15/166—Fluid composition conditioning, e.g. gradient
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/20—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the sorbent material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/30—Partition chromatography
    • B01D15/305—Hydrophilic interaction chromatography [HILIC]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
    • B01D15/424—Elution mode
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/285—Porous sorbents based on polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3291—Characterised by the shape of the carrier, the coating or the obtained coated product
    • B01J20/3293—Coatings on a core, the core being particle or fiber shaped, e.g. encapsulated particles, coated fibers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/74—Optical detectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
    • B01J20/28016—Particle form

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Description

本発明は、オリゴヌクレオチドの混合物を液体クロマトグラフィーにより分離し分析する方法に関する。
近年、合成オリゴヌクレオチドの医療分野への応用に関心が高まっている。例えば、リボザイム、アプタマー、アンチセンス、及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などが挙げられ、これらはヌクレオチド医薬品と呼ばれている。
このようなオリゴヌクレオチドは、通常、ホスホロアミダイト法により合成される。この方法での生成物は、目的のオリゴヌクレオチドの他に、様々な鎖長を有するオリゴヌクレオチドや副反応に起因する不純物を含む。このため、合成オリゴヌクレオチドの分離・分析法についても種々検討されている。
親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）による方法は、低濃度の揮発性の塩を含む溶離液で実施できる。このため、質量分析計を検出器として使用でき、高感度の分析が可能になる。また、オリゴヌクレオチドの分取目的で分離を実施した場合も、溶離液からのオリゴヌクレオチドの分離における脱塩等の工程が容易になる点で優れている。
非特許文献１にはシグマアルドリッチ社のＡｓｃｅｎｔｉｓ Ｓｉｌｉｃａカラムを用いた方法が記載されている。このカラムは直径３μｍの多孔性未修飾シリカ基材（孔径１２ｎｍ）を充てん剤とする。溶離液として、ギ酸アンモニウム緩衝液／アセトニトリル混合溶液を用い、アセトニトリル濃度を下げるグラジエント法により、２量体から１０量体の合成オリゴヌクレオチドを高度に分離したと報告されている。
また、非特許文献２には東ソー社のＡｍｉｄｅ－８０カラムを用いた方法が記載されている。このカラムは直径３μｍの多孔性シリカ基材（孔径８ｎｍ）にアミド基含有構造が結合された充てん剤を有する。溶離液はギ酸アンモニウム水溶液／アセトニトリル混合で、アセトニトリル濃度を下げるグラジエントを適用することにより、ホスホロチオネート化された１５量体から２０量体の合成オリゴヌクレオチドを高度に分離したと報告されている。
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，１２５５ （２０１２） ２３７－２４３ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ， １０４０ （２０１７） ２８２－２８８
従来のシリカ基材を利用する充てん剤を充てんしたカラムでは、シリカ基材が溶解するため、アルカリ性溶液の通液ができない。そのため、タンパク質やオリゴヌクレオチド、副反応物等の吸着によりカラムの分離性能が低下した時のそれらの除去による性能回復や、連続使用時の溶出画分へのキャリーオーバーの低減、カラムと装置の殺菌等に有効な、強アルカリ、特に水酸化ナトリウム水溶液による洗浄ができなかった。
加えて、オリゴヌクレオチドの医療分野等へのさらなる利用を考慮すれば、オリゴヌクレオチドのより優れた分離分析方法が望まれている。
したがって、本発明の課題は、アルカリ性溶液による洗浄を行うことができ、またオリゴヌクレオチドの分離分析が高感度で行える方法を提供することにある。
本発明は以下の分離分析方法を提供する。
［１］架橋有機高分子からなる多孔質粒子の表面にジオールが固定されてなる充てん剤を充てんしたカラムを用いた液体クロマトグラフィーによりオリゴヌクレオチドの混合物を分離分析する方法。
［２］前記ジオールの構造が、式（Ｉ）
Ｒ－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2（ＯＨ） （Ｉ）
（式中、Ｒは多孔質粒子の部分構造を表す。）
で示される構造を含む前記１に記載の方法。
［３］架橋有機高分子が架橋ポリビニルアルコールである前記１または２に記載の方法。
［４］液体クロマトグラフィーの移動相（溶離液）が揮発性塩水溶液と水溶性有機溶媒の混合液である前記１から３のいずれか１項に記載の方法。
［５］カラムで分離されて溶出した成分を紫外可視光検出器及び／または質量分析計により検出する前記１から４のいずれか１項に記載の方法。
［６］液体クロマトグラフィーを移動相のグラジエント溶出にて行う前記１から５のいずれか１項に記載の方法。
［７］液体クロマトグラフィーの実施前または実施後に、カラムにｐＨ１０．０からｐＨ１３．０のアルカリ性溶液を通液してカラムを洗浄する工程を有する前記１から６のいずれか１項に記載の方法。
［８］オリゴヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドである前記１から７のいずれか１項に記載の方法。
本発明によれば、シリカ基材を利用する充てん剤を利用するカラムを用いた方法よりも高感度のオリゴヌクレオチドの分離分析を行うことができる。
また、カラムの洗浄にアルカリ性溶液を用いることができることから、カラムの洗浄及び殺菌を簡便に行うことができ、さらに、医薬品目的のオリゴヌクレオチドの分取がより容易になる。
実施例１で得られた紫外検出法（波長２６０ｎｍ）クロマトグラム、及び質量分析法マスクロマトグラム。 比較例１で得られた紫外検出法（波長２６０ｎｍ）クロマトグラム、及び質量分析法マスクロマトグラム。
本発明の一実施態様におけるオリゴヌクレオチドの混合物の分離分析方法は、オリゴヌクレオチドの混合物を液体クロマトグラフィーにより分離し分析する方法であり、その液体クロマトグラフィー用のカラムの充てん剤として架橋有機高分子からなる多孔質粒子の表面にジオール構造が固定されてなるものを用いる。
オリゴヌクレオチドの混合物とは、典型的には、オリゴヌクレオチドの合成により得られた反応混合物である。例えば、固相担体上でヌクレオチドモノマーを連続的に反応させて合成したものであり、ホスホロアミダイト法により合成されたヌクレオチドオリゴマーが挙げられる。合成オリゴヌクレオチドの目的の鎖長は１０から１１０量体である。本発明による方法では、試料としては、１０から７０量体が好ましく分離され、１９から６２量体がさらに好ましく分離される。
カラムの充てん剤の基材として用いる架橋有機高分子としては、架橋（メタ）アクリル系樹脂や、架橋ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などが好ましい。架橋（メタ）アクリル系樹脂を用いる場合は、モノマー単位に水酸基、あるいは水酸基に変換可能な官能基を持つモノマー単位を含む必要がある。強アルカリ性条件でも使用可能であるという面で、架橋ポリビニルアルコールがより好ましい。
架橋ポリビニルアルコールは、酢酸ビニルと、トリアリルイソシアヌレート等の不飽和二重結合を複数有する架橋性モノマーを共重合させた後に、けん化させて得られる。共重合体のモノマー組成の質量比に関して特に制限はないが、その後のジオール基を導入する反応処理により十分な親水性を発現させるためには、全モノマー中、架橋性モノマーの比率を９０質量％以下にすることが好ましく、８０質量％以下にすることがより好ましく、７０質量％以下にすることがさらに好ましい。また多孔質粒子を液体クロマトグラフィー用充てん剤として利用する場合の実用上の機械的強度を確保するためには、全モノマー中、架橋性モノマーの比率を１０質量％以上にすることが好ましく、２０質量％以上にすることがより好ましく、３０質量％以上にすることがさらに好ましい。機械的強度が不足すると、移動相を送液した際に発生する圧力により充てん剤が変形しカラムを閉塞することにより装置が使用可能な圧力範囲を超えてしまう場合がある。
けん化によって得られた架橋ポリビニルアルコールの水酸基の密度は１．２ｍｍｏｌ／ｇから１０．５ｍｍｏｌ／ｇの範囲であることが好ましく、１．６ｍｍｏｌ／ｇから９．３ｍｍｏｌ／ｇの範囲であることがより好ましく、２．０ｍｍｏｌ／ｇから８．０ｍｍｏｌ／ｇの範囲であることがさらに好ましい。この範囲にすることで、粒子表面にジオールを導入するためのグリシドールが十分付加することができ、充てん剤に適正な親水性を付与できる。
水酸基の密度は、水酸基に反応する試薬を反応させた後に生じる、多孔質粒子の増加質量から計算で求めることができる。例えば、実施例に示した方法などが好ましく用いることができる。
前記架橋性有機高分子を多孔質の粒子として得る方法としては、モノマー、モノマーと相溶する非重合性の有機溶剤及び重合開始剤を混合して得た油相を水相に懸濁させ所望の大きさの油滴とし、続いて加熱撹拌することによって粒子を得る懸濁重合法が一般的である。そのほか、油相をＳＰＧ（シラスポーラスガラス）膜に代表される多孔質膜、あるいは石英基板に形成されたマイクロ流路を通じて水相中に滴下させて所望の大きさの粒子を形成する方法が用いられる。いずれの粒子形成方法とも、油相に混合した非重合性の有機溶剤が占める容積が細孔を形成する。このようにして造粒された油相は、引き続き水相中で加熱撹拌することにより重合反応を進行させ、架橋性重合体として強度が付与される。重合反応後、有機溶剤を用いた洗浄により非重合性有機溶剤等を除去し多孔質体として得る。
前記粒子は、球状であることが好ましい。
粒子の粒径としては、十分な分離性能及び高感度を得るために体積平均粒径として１から３０μｍが好ましい。過剰な圧力上昇を招きにくい点を考慮すれば、体積平均粒径として３から１０μｍがさらに好ましく、３から５μｍが特に好ましい。
体積平均粒径の測定は、コールターカウンターあるいは画像解析式粒度分布測定器で行うことができる。所望の粒径を得るために、メッシュを用いた篩分級や、風力分級機を用いた粒径制御を行うこともできる。
多孔質を形成する細孔の大きさとしては、分離性能と機械的強度とを両立するために平均細孔径として３から３０ｎｍが好ましく、１０から２５ｎｍが十分な分離性能を得る点においてさらに好ましい。細孔径が小さすぎると、比表面積が小さくなり親水性相互作用を発現する能力が十分に得られない場合がある。細孔径が大きすぎると機械的強度が保てず、カラム内に発生する圧力により粒子がつぶれてしまう場合がある。
平均細孔径の測定は、ガス吸着式比表面積測定器を用いて行うことができる。
本発明の一実施態様におけるカラム用充てん剤は前記の架橋有機高分子からなる多孔質粒子の表面にジオールが固定されてなる構造を有するものである。好ましいジオールの構造としては、隣り合った炭素原子に１つずつの水酸基が結合している構造である。より好ましくは、粒子の表面に、式（Ｉ）
Ｒ－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2（ＯＨ） （Ｉ）
（式中、Ｒは多孔質粒子の部分構造を表す。）
で示される構造を有するものである。
粒子表面に固定されたジオール構造の量は、多孔質粒子の質量に対して０．２ｍｍｏｌ／ｇから８ｍｍｏｌ／ｇが好ましく、さらに好ましくは０．５から４ｍｍｏｌ／ｇである。
この構造は、表面に水酸基を有する架橋有機高分子からなる多孔質粒子に、グリシドールのような水酸基とエポキシ基を有する化合物を反応させることにより、製造することができる。グリシドールの反応は、アルカリ性条件でも、酸性条件でも実施することができる。
液体クロマトグラフィーに使用する移動相（溶離液）としては、揮発性塩水溶液と水溶性有機溶媒の混合液が好適に用いられる。揮発性塩としてはギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムなどが挙げられる。水溶性有機溶媒としては炭素数１から３のアルコール化合物やニトリル化合物が好ましい。好ましい混合液は、ギ酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルの組み合わせである。
揮発性塩水溶液の濃度は特に制限はないが、１から１００ｍＭが好ましく、５から７０ｍＭがさらに好ましく、２０から５０ｍＭが特に好ましい。揮発性塩水溶液のｐＨはオリゴヌクレオチドが溶出される範囲であれば制限はなく、５．０から９．０が好ましく、６．５から７．５がさらに好ましい。
揮発性塩水溶液と水溶性有機溶媒の混合比率は、特に制限はない。混合比率は混合前の体積を用いて表される。水溶性有機溶媒の比率は、塩の析出やオリゴヌクレオチドの溶解性の問題が生じない程度まで、高めることができる。また、水溶性有機溶媒の比率は、親水性相互作用が、十分に働く程度にまで低くすることができる。通常は、水溶性有機溶媒の比率は、３０％から９０％が好ましい。
本発明の典型的な分離分析方法は、以下の通りである。
上記の充てん剤を充てんしたカラムを液体クロマトグラフに取り付け、あらかじめ適切な溶離液（移動相）を通液してカラムを平衡化する。次いで、試料であるオリゴヌクレオチドの混合物を同溶離液に溶解した溶液を注入して液体クロマトグラフィーを行う。
通液する溶離液中の水溶性有機溶媒濃度を順次減少させる、いわゆるグラジエント溶出法を採用することもできる。グラジエント溶出することにより、オリゴヌクレオチドの合成過程中に含まれる不純物と目的のオリゴヌクレオチドとの分離を一層容易にすることができる。その後は、再度平衡化時に通液した溶離液を通液し、カラムを平衡化させる。
測定時のカラム温度は２５から８０℃が好ましく、３０から６０℃がさらに好ましく、４０から５０℃が最も好ましい。
液体クロマトグラフィーの装置としては、市販のものが使用できる。例えば、株式会社島津製作所製Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）やウォーターズ社製Ａｃｑｕｉｔｙ（登録商標）等の装置が挙げられる。
カラムについても、上記で規定する範囲ものであれば市販のものを使用することができる。例えば、昭和電工株式会社製Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標） ＨＩＬＩＣｐａｋ（登録商標） ＶＮ－５０ ２Ｄ（内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、粒子径５μｍ）等が使用できる。
液体クロマトグラフィーの検出は、例えば、紫外／可視光検出器（ＵＶ／Ｖｉｓ検出器）、質量スペクトルを利用する質量分析計（ＭＳ）などが挙げられる。紫外／可視光検出器の場合、検出波長は、例えば、２６０ｎｍが挙げられる。
紫外／可視光検出器は主として定量分析、質量分析計は主として定性分析に使用することができ、これらは組み合わせて使用することもできる。
本発明の一実施態様で使用する充てん剤は、アルカリ性条件下で安定であるという性質を有する。そのため、液体クロマトグラフィーによる分離分析を実施した後、アルカリ性溶液を通液することによりカラムを洗浄することができる。これにより、カラムに混入し充てん剤に吸着したタンパク質やオリゴヌクレオチド、副反応物等を分解除去したり、カラム内部を殺菌することができるので、オリゴヌクレオチドの分取目的で液体クロマトグラフィーを実施する場合に好都合である。
アルカリ性溶液の通液は、必要に応じて、液体クロマトグラフィーの実施前あるいは実施後のいずれも行うことができる。
シリカゲルを基材として用いた充てん剤は、シリカゲルが溶解してしまうために、通常ｐＨ８以上の条件では使用できない。このことからアルカリ性溶液は使用できない。本発明の一実施態様で使用する充てん剤は、基材が架橋有機高分子からなるため、使用する架橋有機高分子の性質に応じたｐＨのアルカリ性溶液を使用できる。特に、架橋ポリビニルアルコールを基材とする充てん剤は、通常使用するアルカリ性溶液で劣化しないため、アルカリ性溶液をカラム洗浄等に使用することができる。
洗浄に使用するアルカリ性溶液は、ｐＨ１０．０から１３．０のアルカリ性を示すものであれば特に限定されない。洗浄の効果や経済性を考慮すると、０．０１Ｍから０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液が好適である。
架橋有機高分子からなる多孔質粒子の表面にジオール構造が固定された充てん剤を用いた場合に、シリカゲルを用いた充てん剤を用いるよりも高度な分離が得られる理由は不明であるが、シリカゲルを用いたカラムでは、シラノールに由来する弱いイオン相互作用が同時に働くなどの影響が考えられ、これが親水性の差を利用する親水性相互作用クロマトグラフィーにおいて、分離の悪化を起こしている可能性が考えられる。
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明を具体的に説明する。
カラムの作製
実施例で使用したカラムは以下の通り作製した。
（１）基材の製造
酢酸ビニル１００ｇ、トリアリルイソシアヌレート１５０ｇ、酢酸ブチル１００ｇ、ｎ－デカン２５ｇ及び２，２－アゾビスイソブチロニトリル５ｇよりなる均一混合液と、ポリビニルアルコール（株式会社クラレ製ＰＶＡ２２４）１２ｇ及びリン酸水素二ナトリウム１８ｇを水１２００ｍＬに溶解した水溶液を還流冷却器を備えた５Ｌの三口フラスコに入れ１０分撹拌した。次いで、窒素ガス気流下で撹拌しつつ、６０℃で１６時間重合を行い、粒状共重合体を得た。この共重合体をろ過、５０℃の温水で洗浄し、アセトンにて洗浄した後乾燥した。次いでこの共重合体を１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３Ｌとともに還流冷却器、窒素ガス導入管及び撹拌器を備えた５Ｌの三口フラスコに入れ、窒素気流下で１５℃、２０時間撹拌してこの共重合体のけん化を行い、ろ過、水洗、乾燥及び風力分級処理をし、架橋ポリビニルアルコール共重合体からなる多孔質粒子を得た。けん化によって得られたポリビニルアルコール共重合体の水酸基の密度は２．１ｍｍｏｌ／ｇであった。画像解析式粒度分布測定装置（シスメックス株式会社製ＦＰＩＡ３０００）により粒径測定を行った結果、体積平均粒径は４．８μｍであった。またガス吸着式比表面積測定装置（日本ベル株式会社製ＢＥＬＳＯＲＰ（登録商標）－ｍｉｎｉ）により測定した平均細孔径は１３ｎｍであった。
なお、水酸基密度の測定は以下の手順で行った。
約２ｇの試料（ポリビニルアルコール共重合体）を６０℃で６時間真空乾燥し、その後、精密天秤にて正確に質量を測定する。５０ｍＬ三角フラスコに秤量した試料全量と、無水酢酸１７ｍＬとピリジン３３ｍＬの混合液を手早く投入し、次いで三角フラスコの上部に玉入冷却管を設置し、さらに冷却管上部から窒素ガスを静かに通気しフラスコ内の空気を追い出す。そのままマグネティックスターラーで撹拌しながら、オイルバスで９０℃１６時間加熱する。加熱終了後、メタノールを少量ずつ計１５ｍＬ加え、グラスフィルターで試料をろ過する。さらにメタノール９０ｍＬで洗浄した後、６０℃で６時間真空乾燥する。乾燥後の試料を精密天秤にて正確に質量測定し、無水酢酸を反応させる前との質量差を計算する。基材の水酸基にエステル付加した酢酸フラグメント（ＣＨ3ＣＯ－：分子量４３）が質量増に相当するので、これにより試料質量当たりの水酸基密度（単位：ｍｍｏｌ／ｇ）が算出される。
（２）ジオールの導入
上記（１）で得られた多孔質粒子１０ｇ、グリシドール１０ｇ、カリウム－ｔｅｒｔ－ブトキシド１ｇ及びジエチレングリコールジメチルエーテル１００ｍＬをセパラブルフラスコに入れ、６０℃で２０時間撹拌し、多孔質粒子にグリシドールを付加した。得られた粒子を、水、メタノールで洗浄後、乾燥し、充てん剤１とした。グリシドール付加量を質量測定により算出したところ、多孔質粒子の質量当たり２ｍｍｏｌ／ｇであった。
（３）カラムハウジングへの充填
得られた充てん剤１を水に分散させてスラリーとし、送液ポンプを用いて内径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍのＰＥＥＫ製のカラムハウジング（株式会社巴製作所製）に１５ＭＰａの一定圧力にて１０分間送液加圧充填し、カラムを得た。
実施例１
（１）カラムの平衡化工程
装置の液体クロマトグラフ／質量分析計は株式会社島津製作所製で、システムコントローラーＣＢＭ－２０Ａ、脱気装置ＤＧＵ－２０Ａ５Ｒ、送液ユニットＬＣ－３０ＡＤ（高圧グラジエント対応のため２台）、オートサンプラーＳＩＬ－３０ＡＣ、カラムオーブンＣＴＯ－２０ＡＣ、フォトダイオードアレイ検出器ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ、三連四重極型質量分析計ＬＣＭＳ－８０３０から構成されたものを用いた。カラム温度は４０℃とし、溶離液として５０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液／アセトニトリル＝３８／６２（混合前の体積比）を、０．２ｍＬ／分で２ｍＬ以上通液して、カラムを平衡化した。
（２）分析用サンプルの準備工程
ユーロフィンジェノミクス株式会社より購入した合成オリゴヌクレオチド２０量体（商品名：スタンダードオリゴ５０ｎｍｏｌスケール品ｓａｌｔ－ｆｒｅｅグレード；配列番号１（５’－ＡＴＡＣＣＧＡＴＴＡＡＧＣＧＡＡＧＴＴＴ－３’）で表される塩基配列）を前記溶離液で溶解し、合成オリゴヌクレオチドの濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように分析用サンプルを調製した。
（３）合成オリゴヌクレオチドの注入工程
調製した分析用サンプル１μＬを（１）の工程で平衡化したカラムに注入した。
（４）合成オリゴヌクレオチドと不完全長不純物の分離溶出工程
溶離液はリニアグラジエントで、初めの１０分でアセトニトリル比率を５６％（混合前の体積％。以下同様）まで減少させる勾配とし、次の２０分までアセトニトリル比率を５６％に維持することにより、合成オリゴヌクレオチドや不純物を分離して溶出させた。２０．０１分から２５分は６２％に戻し、カラムの平衡化を行い、次の分析に備えるようにした。
検出は、まずフォトダイオードアレイ検出器で１９０ｎｍから３５０ｎｍをモニターした。クロマトグラムは２６０ｎｍで表示した。さらにフォトダイオードアレイ検出器の直後に配置された質量分析計で合成オリゴヌクレオチドや不完全長不純物をＳＩＭ（選択イオンモニタリング）法でモニターした。
結果は図１に示すように、ＵＶクロマトグラム、マスクロマトグラムとも保持時間１８．５分に合成オリゴヌクレオチドの２０量体のピークが観測され、その前の２分から１７分には２量体から１９量体の不完全長不純物のピークが分子量順に観測された。
分析後のカラムに、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を０．２ｍＬ／分で２ｍＬ通液して、カラムを洗浄した。この後、カラムの平衡化を行い、再度、合成オリゴヌクレオチドの分析を行ったところ、カラム圧、分析結果に変化はなかった。
比較例１
カラムとして株式会社ワイエムシー製ＹＭＣｐａｋ Ｄｉｏｌ－１２０－ＮＰ（内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、粒子径５μｍ）を用いた他は、実施例１と同様にして合成ヌクレオチドの分離を行った。このカラムの充てん剤は、基材としてのシリカゲルにジオールを結合させたものである。
結果は図２に示すように、ＵＶクロマトグラム、マスクロマトグラムとも保持時間１４分に合成オリゴヌクレオチドのピークが観測された。ＵＶクロマトグラムでは、その前の２分から１３．５分には２量体から１９量体の不完全長不純物のピークが分子量順に観測された。実施例１に比べると、５量体から９量体のピーク形状が悪く、１１量体から１３量体の分離が悪かった。マスクロマトグラムでは、実施例１に比べるとすべてのピークでシグナル／ノイズ比が悪く、１５量体から１９量体は検出できなかった。
このカラムはシリカゲルを基材とするカラムであるため、アルカリ水溶液による洗浄は行わなかった。

Claims (7)

  1. 架橋有機高分子からなる多孔質粒子の表面にジオールが固定されてなる充てん剤を充てんしたカラムを用いた液体クロマトグラフィーによりオリゴヌクレオチドの混合物を分離分析する方法であって、
    前記ジオールの構造が、式（Ｉ）
    Ｒ－Ｏ－ＣＨ 2 －ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ 2 （ＯＨ） （Ｉ）
    （式中、Ｒは多孔質粒子の部分構造を表す。）
    で示される構造を含む方法。
  2. 架橋有機高分子が架橋ポリビニルアルコールである請求項１に記載の方法。
  3. 液体クロマトグラフィーの移動相が揮発性塩水溶液と水溶性有機溶媒の混合液である請求項１または２に記載の方法。
  4. カラムで分離されて溶出した成分を紫外可視光検出器及び／または質量分析計により検出する請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 液体クロマトグラフィーを移動相のグラジエント溶出にて行う請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 液体クロマトグラフィーの実施前または実施後に、カラムにｐＨ１０．０からｐＨ１３．０のアルカリ性溶液を通液してカラムを洗浄する工程を有する請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. オリゴヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドである請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
JP2019525688A 2017-06-22 2018-06-21 オリゴヌクレオチドの混合物の分離分析方法 Active JP7045373B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017122345 2017-06-22
JP2017122345 2017-06-22
PCT/JP2018/023650 WO2018235904A1 (ja) 2017-06-22 2018-06-21 オリゴヌクレオチドの混合物の分離分析方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2018235904A1 JPWO2018235904A1 (ja) 2020-04-23
JP7045373B2 true JP7045373B2 (ja) 2022-03-31

Family

ID=64736017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019525688A Active JP7045373B2 (ja) 2017-06-22 2018-06-21 オリゴヌクレオチドの混合物の分離分析方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11123656B2 (ja)
EP (1) EP3644055B1 (ja)
JP (1) JP7045373B2 (ja)
CN (1) CN110709696B (ja)
WO (1) WO2018235904A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3142017C (en) 2019-06-14 2023-09-19 Laboratory Corporation Of America Holdings Ion-pairing free lc-ms bioanalysis of oligonucleotides
CN111569849A (zh) * 2020-05-18 2020-08-25 北京石油化工学院 一种固定化金属螯合层析介质及其制备方法与应用
CN112858452B (zh) * 2021-01-19 2023-10-03 岛津企业管理（中国）有限公司 一种探针电喷雾离子化与质谱联用的活体分析系统
US20240092822A1 (en) * 2021-03-02 2024-03-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Purification methods for oligomeric compounds

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007522476A (ja) 2004-02-12 2007-08-09 バリアン・インコーポレイテッド クロマトグラフ分離のための極性修飾結合相材料
JP2010529431A (ja) 2007-05-25 2010-08-26 ダイオネックス コーポレイション クロマトグラフィー固定相として有用な組成物
WO2016009077A1 (en) 2014-07-18 2016-01-21 Hexal Ag Improved method of mapping glycans of glycoproteins in serum samples
JP2016524166A (ja) 2013-07-11 2016-08-12 サイノファーム タイワン，リミティド 硫酸化オリゴ糖を検出する分析法
WO2016190043A1 (ja) 2015-05-28 2016-12-01 昭和電工株式会社 糖類の分析方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5820235A (ja) * 1981-07-30 1983-02-05 Yokogawa Hokushin Electric Corp イオン交換クロマトグラフ用イオン交換体及びその作製方法
US5503933A (en) * 1994-02-25 1996-04-02 Purdue Research Foundation Covalently bonded coatings
SE9600590D0 (sv) * 1996-02-19 1996-02-19 Pharmacia Biotech Ab Sätt för kromatografisk separation av peptider och nukleinsyra samt ny högaffin jonbytesmatris
WO2000034343A1 (en) * 1998-12-04 2000-06-15 Mosaic Technologies, Inc. Method for the immobilization of oligonucleotides
US20050153926A1 (en) * 1998-12-04 2005-07-14 Adams Christopher P. Method for the immobilization of oligonucleotides
SE0202067D0 (sv) * 2002-06-28 2002-06-28 Amersham Biosciences Ab Surface-modified base matrices
CN101274272B (zh) 2007-03-30 2011-03-23 中国科学院大连化学物理研究所 一种寡聚乙二醇键合硅胶固定相及其制备方法
CN102811805B (zh) * 2009-12-17 2015-07-29 尹思琪爱克什有限公司 结合蛋白质和肽的特异性吸附剂及使用所述吸附剂的分离方法
US20130236986A1 (en) * 2012-02-20 2013-09-12 Cerulean Pharma Inc. Methods of separating nucleic acid polymer conjugates
US20150136700A1 (en) 2012-05-15 2015-05-21 Waters Technologies Corporation Chromatographic materials
US9486799B2 (en) * 2012-09-11 2016-11-08 Dionex Corporation Glycidol functionalized anion exchange stationary phases
CN105940298B (zh) * 2014-02-28 2018-05-04 昭和电工株式会社 液相色谱用填充剂及液相色谱用柱
ES2920381T3 (es) * 2014-08-15 2022-08-03 Merck Patent Gmbh Purificación de inmunoglobulinas a partir de plasma
GB201417341D0 (en) * 2014-10-01 2014-11-12 Isis Innovation Chromatography
CN104826618B (zh) * 2015-04-20 2017-05-24 华东理工大学 氨基二醇亲水色谱固定相及其制备方法
EP3505929B1 (en) * 2016-08-26 2021-04-07 Showa Denko K.K. Packing material for hilic columns, hilic column filled with same, and method for analyzing oligosaccharides with said column

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007522476A (ja) 2004-02-12 2007-08-09 バリアン・インコーポレイテッド クロマトグラフ分離のための極性修飾結合相材料
JP2010529431A (ja) 2007-05-25 2010-08-26 ダイオネックス コーポレイション クロマトグラフィー固定相として有用な組成物
JP2016524166A (ja) 2013-07-11 2016-08-12 サイノファーム タイワン，リミティド 硫酸化オリゴ糖を検出する分析法
WO2016009077A1 (en) 2014-07-18 2016-01-21 Hexal Ag Improved method of mapping glycans of glycoproteins in serum samples
WO2016190043A1 (ja) 2015-05-28 2016-12-01 昭和電工株式会社 糖類の分析方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALPERT J. ANDREW，HYDROPHILIC-INTERACTION CHROMATOGRAPHY FOR THE SEPARATION OF PEPTIDES, NUCLEIC ACIDS AND OTHER POLAR，Journal of Chromatography，1990年，499，P177-196

Also Published As

Publication number Publication date
CN110709696A (zh) 2020-01-17
WO2018235904A1 (ja) 2018-12-27
EP3644055A1 (en) 2020-04-29
EP3644055B1 (en) 2022-04-13
CN110709696B (zh) 2022-01-04
EP3644055A4 (en) 2021-05-26
US20200054966A1 (en) 2020-02-20
JPWO2018235904A1 (ja) 2020-04-23
US11123656B2 (en) 2021-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7045373B2 (ja) オリゴヌクレオチドの混合物の分離分析方法
Song et al. Quercetin molecularly imprinted polymers: Preparation, recognition characteristics and properties as sorbent for solid-phase extraction
Weiss et al. Improving methods of analysis for mycotoxins: molecularly imprinted polymers for deoxynivalenol and zearalenone
EP2562178B1 (en) Filler for affinity chromatography
Uzhel et al. Covalently-bonded hyperbranched poly (styrene-divinylbenzene)-based anion exchangers for ion chromatography
Yang et al. Surface radical chain-transfer reaction in deep eutectic solvents for preparation of silica-grafted stationary phases in hydrophilic interaction chromatography
Hu et al. Two copolymer-grafted silica stationary phases prepared by surface thiol-ene click reaction in deep eutectic solvents for hydrophilic interaction chromatography
Zhou et al. Determination of triazine herbicides from honey samples based on hydrophilic molecularly imprinted resins followed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
Fan et al. Cyromazine imprinted polymers for selective stir bar sorptive extraction of melamine in animal feed and milk samples
Lu et al. Preparation and evaluation of ionic liquid-gold nanoparticles functionalized silica monolithic column for capillary electrochromatography
CA2397743A1 (en) Method and apparatus for separating polynucleotides using monolithic capillary columns
CN110290867A (zh) 分离剂、该分离剂的应用及使用该分离剂的甜菊糖苷的分离方法以及使用该分离方法的甜菊糖苷的制造方法
Lei et al. Preparation of a biomimetic ionic liquids hybrid polyphosphorylcholine monolithic column for the high efficient capillary microextraction of glycopeptide antibiotics
US8435410B2 (en) Surfactant-based monolithic columns, methods for making the same, and method for using the same
Hsieh et al. Single‐step approach to β‐cyclodextrin‐bonded silica as monolithic stationary phases for CEC
US20200054967A1 (en) Packing material for size exclusion chromatography and method for producing the same
JP6885958B2 (ja) Ｈｉｌｉｃカラム用充填剤、それが充填されたｈｉｌｉｃカラム、及びそれを用いたオリゴ糖の分析方法
EP3783009A1 (en) Separating agent for human insulin purification and human insulin purification method
CN108927113B (zh) 一种纳米羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱
Zhang et al. Facile one-pot preparation of chiral monoliths with a well-defined framework based on the thiol–ene click reaction for capillary liquid chromatography
Yu et al. RECENT DEVELOPMENT AND APPLICATION OF MONOLITHIC COLUMNS.
WO2017115655A1 (ja) 分離分析方法
Stine Application of porous materials to carbohydrate chemistry and glycoscience
JP2007017445A (ja) クロマトグラフィー用充填剤
Retnaningtyas et al. A novel molecular imprinting polymer for the selective adsorptionof D-arabinitol from spiked urine

Legal Events

Date Code Title Description
RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422

Effective date: 20191218

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210317

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20211005

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211029

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20220308

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220318

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7045373

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350