KR20230091199A - 탈당화 시약 및 방법 - Google Patents

탈당화 시약 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20230091199A
KR20230091199A KR1020237019819A KR20237019819A KR20230091199A KR 20230091199 A KR20230091199 A KR 20230091199A KR 1020237019819 A KR1020237019819 A KR 1020237019819A KR 20237019819 A KR20237019819 A KR 20237019819A KR 20230091199 A KR20230091199 A KR 20230091199A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
pngase
deglycosylation
deglycosylated
antibodies
Prior art date
Application number
KR1020237019819A
Other languages
English (en)
Inventor
파울라 매그넬리
엘렌 거스리
크리스토퍼 에이치. 태론
밍-쿤 쑤
존 부스웰
Original Assignee
뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인크 filed Critical 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인크
Publication of KR20230091199A publication Critical patent/KR20230091199A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6427—Chymotrypsins (3.4.21.1; 3.4.21.2); Trypsin (3.4.21.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • C12Y201/01063—Methylated-DNA-[protein]-cysteine S-methyltransferase (2.1.1.63), i.e. O6-methylguanine-DNA methyltransferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21004—Trypsin (3.4.21.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01052—Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase (3.5.1.52), i.e. glycopeptidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/38—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of carbohydrates, e.g. glycosylation, glycation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)

Abstract

본 명세서는 완전히 탈당화된 항체를 효율적으로 준비하기 위한 조성물 및 방법, 그리고 반응의 시간 및 온도를 제공하고, 상기 효율은 가용성 또는 동결건조된 형태에 상대적인 양의 시약으로 결정된다. 당화된 항체로부터 N-연결 글리칸을 실질적으로 전부 분리하기 위한, 그리고 항체의 기능성을 보존하기 위한 조성물 및 방법 또한 제공된다. 상기 방법들은 사전 정제 단계의 필요가 없이 글리칸 라벨링 및 단백 분해효소 소화(digestion)와 양립할 수 있다.

Description

탈당화 시약 및 방법{DEGLYCOSYLATION REAGENTS AND METHODS}
인간 단백질의 50% 이상이 당화된(glycosylated) 것이라 추정된다. 많은 건강과 질병 바이오 마커는 당화된 단백질이며 특정 글리코형(glycoforms)이 건강과 질병의 상태와 관련되었을 수 있다. 이는 암, 당뇨병, 염증 및 그 외 질병, 그리고 또한 발병과 관련된 당화된 단백질을 포함한다. 나아가, 당화된 단백질은 인간 또는 포유류에 제한되어있지 않고, 모든 진핵생물계, 원핵생물, 고세균 및 식물에서 발견된다.
항체는 당단백질이다. 항체에 있는 글리칸은 구조적으로 불균일(heterogenous)할 수 있으며 건강과 질병에서 상당한 차이가 있을 수 있다. 시험관 내에서의 항체 생산중, 항체에 부착된 글리칸은 그의 생산을 위해 사용된 세포 유형뿐만이 아니라, 세포 배양 조건에 영향을 받는다. 양분유효도, pH, 세포밀도 및 CO2 레벨의 변화는 세포가 생산한 항체 글리코형을 현저하게 변형시킬 수 있다. 치료적(therapeutic) 항체에 있어서, 이는 조직분포, 혈청 반감기, 단백질분해에 대한 저항력, 보체활성화, 항체-의존성 세포독성(ADCC), 및 염증에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 치료적 항체를 특정 규제-승인을 받은 글리코 형의 변형(variation)에 대한 범위 내에서 제조하는 것이 바람직하다.
항체와 같은 당단백질의 글리칸 프로파일링(profiling)은 항체 샘플에서 글리코형을 테스트하고 식별하는 방법을 필요로 한다. 글리칸 구조 분석은 표준적이지 않고, 시간 소모가 크며, 처리량이 낮은 과정에, 부분적인 당화뿐만이 아니라 단백질에 대한 손상 위험을 야기하는 조건 아래 당화 배양시간이 16시간 정도까지 된다(Jenkins, et al., Mol Biotechnol. 39(2):113-8 (2008); Liu, et al., J Pharm Sci. 97(7):2426-47 (2008)). 배양기간을 단축하려는 시도는 그 결과 단백질의 완전성(integrity)에 영향을 미치는, 즉 기능성에 영향을 미치고 질량 분석법에 지장을 주는, 세제를 사용하게 되었다. 글리칸이 분자의 구조적 폴드(fold) 안에 파묻혀있을 수 있기 때문에, 항체를 당화하는 것이 어려울 수 있다. 표준적 방법은 글리칸을 드러내기 위하여 극열 및 도데실황산나트륨(SDS)과 같은 강력한 변성제와 같은 방법을 사용하여 항체 구조를 변성시킨다. 그러나, 이러한 방법에는 몇몇 결점이 있다: 예를 들어 SDS는 글리칸을 제거하는데 사용되는 효소를 변성할 수 있고, SDS는 제거하기 어려우며, 극소량의 SDS조차도 질량 분석법과 같은 샘플 분석 방법에 지장을 줄 수 있다. 또한 이러한 방법은 시간 소모가 크다. 대안 방법은 고농도의 펩티드-N-글리코시다아제 F(Peptide-N-Glycosidase F(PNGase F))를 사용해 당화 속도를 증가시키는 시도이다. 그러나, 이 접근은 부분적인 당화와 관련된 추정 및 바람직하지 않은 편견을 극복하지 않는다. 부분적인 당화는 어떠한 글리코형이 다른 것보다 우선적으로 단백질로부터 방출되는 것을 야기할 수 있다. 이 접근은 또한 비용이 많이 들고, 상당한 양의 PNGase F가 필요하기 때문에 손쉽게 확장(scalable)할 수 없다.
항체 특성화(characterization)를 위한 탈당화를 향상시키기 위한 현재 접근법은 계속하여 더 복잡한 방법, 처리하는데 추가 시간이 필요한, 비효율적인, 그리고 글리칸을 덜 제거하는 결과를 낳는다. 나아가, 탈당화된 항체 생산은 현재 부위-돌연변이 유발(site-mutagenesis) 또는 세균 발현계(bacterial expression system)에 제한되어 있다. 유감스럽게도, 이러한 시스템은 유의미한 양의 제대로 집합되고(assembled) 접힌(folded) 항체를 생산하는데 어려움을 가진다.
전반적으로, 조성물 및 사용 방법을 포함하는 제제는 탈당화 반응에 사용되는 글리코시다아제 또는 글리코시다아제 혼합물의 기질인 글리칸의 균등한 제거를 야기하는 항체와 같은 완전히 당화하는 단백질에 대하여 기술되었다. 선택적으로 라벨링(labeled)할 수 있는 글리칸의 추가 분석을 위한 단백질로부터 글리칸을 분리시키기 위한 방법 및 시약 또한 기술되어있다. 이는 단백질 분해효소를 사용한 펩티드 절단를 수반하고, 놀랍게도 펩티드 절단 및 탈당화가 하나의 단계에서 이루어질 수 있다는 것이 밝혀졌다. 사용 용이성을 위하여, 글리코시다아제 및/또는 완충 조성물은 탈당화에 영향을 주기 위하여 동결 건조 후 당화된 단백질에 더해질 수 있다.
한 측면에서는 전반적으로, 자연적으로 발생할 수 없는 인공 체내 제제 또는 조성물은 (i) 담즙산염 또는 도데실황산나트륨(SDS)을 제외한 세제; (ii) 하나 이상의 글리코시다아제; (iii) 전기영동 또는 질량 분석법으로 측정된(determined) 완전히 탈당화된 항체; 및 (iv) 글리칸 절단 생성물(products)을 포함하여 제공된다. 한 측면에서는, 세제는 투석 가능한(dialyzable) 절단할 수 없는(non-cleavable) 카르복시산염 음이온의 계면활성제이다. 전반적으로, 다른 측면에서는, 인공 체내 제제 또는 조성물은 (a) 담즙산염 또는 투석 가능한 절단할 수 없는 카르복시산염 음이온의 계면활성제; (b) 하나 이상의 글리코시다아제; (c) 전기영동 또는 질량 분석법으로 측정된 생물학적 활성을 갖는 단백질; 및 (d) 글리칸 절단 생성물을 포함하여 제공된다.
다른 측면에서는, 완전히 탈당화된 항체는 항원 결합 활동을 가지고, 면역분석법에 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서는, 글리칸 절단 생성물 및/또는 항체는 형광라벨, 방사성 동위원소, 메틸 아세틸(methyl acetyl), 항체 또는 그에 따른 조합으로 라벨링된다. 이는 글리칸 유형의 분석과 단백질의 글리칸 결합부위 확인 또한 가능하게 한다. 탈당화된 단백질의 예는 항체를 포함한다. 대표적인 항체의 예는 탈당화된 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4, 인간 IgM, 인간 IgA1, 인간 IgA2, 인간 IgE, 뮤린 IgG1, 뮤린 IgG2a, 및 뮤린 IgA을 포함한다.
다른 측면에서는, 조성물에는 단백질 분해효소가 포함될 수 있고, 상기 단백질 분해효소는, 예를 들어, 트립신일 수 있다. 단백질 분해효소의 다른 예는 GluC, AspN, 단백질 분해효소 K, Xa인자, 엔테로키나아제, LysC, Arg-C, LysN, IdeS, V-8 단백 분해효소, 파파인, 알파-리틱 단백질 분해효소, 피로글루타메이트 아미노펩티다스(Pyroglutamate Aminopeptidas), 류신 아미노펩티다아제, 메티오닌 아미노펩티다아제, 아미노펩티다아제 I, 아미노펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제(A, B, G, Y), 펩신, 카텝신(B, C, D), α-키모트립신, TEV, 트롬빈, IdeZ 및 IdeE를 포함할 수 있다.
다른 측면에서는, 글리코시다아제(하나 이상의 글리코시다아제)는 글리코시다아제의 복수형일 수 있고, 예를 들어, 하나 이상의 엑소글리코시다아제(exoglycosidases) 및/또는 하나 이상의 엔도글리코시다아제(endoglycosidases)를 포함할 수 있다. 하나 이상의 글리코시다아제는 융합 단백질일 수 있고, 예를 들어, 상기 융합 단백질은 매트릭스(matrix)에 고정될 수 있다. 융합 단백질의 예는 AGT의 친화성 결합(affinity binding)을 통해 선택적으로 매트릭스에 고정될 수 있는 돌연변이(mutant) O6-알킬구아닌-DNA-알킬트랜스퍼라제(AGT)를 포함한다. 글리코시다아제 또는 하나 이상의 글리코시다아제는 하나 이상의 N-글리칸 글리코시다아제, 하나 이상의 O-글리코시다아제 및/또는 하나 이상의 엔도글리코시다아제를 포함할 수 있다.
다른 측면에서는, 조성물은 수용성 완충제를 포함할 수 있다.
*한 측면에서는 전반적으로, (a) 도데실황산나트륨(SDS)을 제외한 투석 가능한 절단할 수 없는 카르복시산염 계면활성제, 및/또는 담즙산염; 및 당화된 항체를 가진 하나 이상의 글리코시다아제를 포함하는 조성물을 60분 이하 배양; 그리고 (b) 탈당화된 항체 및 글리칸 절단 생성물을 형성하기 위하여 당화된 항체로부터 글리칸을 완전히 절단하는 것을 포함하는 방법이 제공되었다.
방법의 한 측면에서는, 탈당화된 항체 및/또는 절단된 글리칸 생성물은 분리되고 선택적으로 정제된다. 탈당화된 항체의 항원 결합 활동은 특성화될 수 있다. 항체의 항원 결합 성질은 테스트하였을 때 보존된 것으로 밝혀졌다. 탈당화된 항체의 항원과의 결합은, 예를 들어, 방사면역측정법, ELISA, 친화성 결합 분석, 또는 면역침전 분석법으로부터 선택되는 항체-항원 결합 분석법을 사용해 수량화(quantified)할 수 있다. 탈당화된 항체는 치료적 그리고/또는 진단적 사용에 적합하다.
방법의 한 측면에서는, 트립신과 같은 단백분해효소가 단백질을 탈당화된 펩티드 단편 및 글리칸 절단 생성물로 절단하기 위한 하나 이상의 글리코시다아제를 함유하는 조성물 내에 함유되어있다.
한 측면에서는, 조성물은 당화된 항체와 배양되기 전에 동결 건조되고, 상기 당화된 항체는 수용성 완충제이다. 다른 측면에서는, 글리코시다아제는 매트릭스에 고정된다. 한 측면에서는, 배양은 약 20°C 내지 60°C의 온도에서 실행된다. 다른 측면에서는, 배양은 5분 이하의 시간 동안 실행된다.
한 측면에서는 전반적으로, 키트는 하나 이상의 동결 건조된 글리코시다아제, 및/또는 하나 이상의 고정된(immobilized) 글리코시다아제, 또는 용액 및 동결 건조된 완충제 또는 동결 건조되지 않은 완충체, 또는 그에 따른 조합에 있는 하나 이상의 글리코시다아제로, 상기 동결 건조된 또는 동결 건조되지 않은 완충제는: 담즙산; 또는 SDS를 제외한, 투석가능한 절단할 수 없는 카르복시산염 음이온의 계면활성제; 또는 그에 따른 조합인 것을 포함하는 것으로 기술된다.
도면 및 그림은 본 명세서에 기술된 조성물 및/또는 방법의 하나 이상의 형태(version)를 도시하기 위한 것이다. 그 외 달리 기재되지 않았다면, 이는 어느 청구항의 범위를 해석하는 데에 제한을 두고자 한 것이 아니다.
도 1a 내지 1d는 질량 분석법으로 측정된 당화된 항체 및 당화된 그리고 탈당화된 항체 중쇄의 질량 분포를 나타내는 만화(cartoons)이다. 부분적인 탈당화는 PNGase F 첨가 이전에 표준 열 전처리(heat pre-treatment)의 결과로 도시한다(New England Biolabs, Ipswich, MA)(실시예 1 또한 참조). 계면활성제가 없을 때이다.
도 1a는 두 개의 중쇄(H, 흰색); 두 개의 경쇄(L, 회색) 및 중쇄에 부착된 글리칸 분자(G)로 구성된 항체의 도해를 도시한다. 바람직하게는, 완전히 탈당화된 항체 분자에는 글리칸이 없다.
도 1b는 단일클론성 IgG 항체 출발 시료에 있는 글리코형의 프로파일(profile)을 보이는 대조구("전처리 없는" 그리고 "PNGase F 없는" 처리)이다. 이 만화는 관측된 주요 피크(major peak) 각각의 글리코형을 도시한다.
도 1c는 열로 전처리되고 1시간 동안 PNGase F와 함께 배양된 항체의 프로파일을 도시한다. 네 개의 주요 피크(질량 50191, 50353, 50516, 및 50823)는 완전히 당화된 당단백질을 나타낸다. 이러한 조건 아래에서는, 항체 중쇄의 약 10% 이하가 탈당화된다(질량 48747 근처의, 제일 왼쪽의 피크에 부착된 글리칸이 없는 항체 중쇄의 만화 참조).
도 1d는 열과 연장된 16시간 PNGase F 배양이 실질적으로 탈당화된 항체를 야기하지 않는다는 것을 나타낸다. PNGase F 배양시간을 16시간으로 증가시키자 탈당화된 중쇄의 일부의 양이 소량 증가했지만, 항체의 상당한 부분이 50191, 50353, 50516, 및 50823의 피크가 증명하듯이 계속 당화된 상태이다.
도 2a 내지 2c는 질량 분석법에서 항체 중쇄의 질량 분포를 나타내고, PNGase F 처리 이전에 가열변성 및 환원제의 조합의 더 강력한 전처리가 실질적으로 탈당화된 항체를 생산하는데 불충분하다는 것을 입증한다(실시예 2 또한 참조).
도 2a는 단일클론성 IgG 항체 출발 시료(전처리 없는 그리고 PNGase F 없는 처리)에 있는 당단백질의 프로파일(profile)을 보이는 대조구이다.
도 2b는 디티오트레이톨(DTT) 환원제와 함께 가열 변성으로 전처리 되고 PNGase F와 함께 1시간 동안 배양된 항체의 프로파일이다. 상기 조합된 전처리는 가열 변성 단독과 비교하였을 때 탈당화를 향상시키지 않았다(도 1b 및 도 2b 비교). 항체 중쇄의 상당 부분이 당화된 상태로, 약 10% 이하가 탈당화된다(질량 크기 48750 근처 피크 참조).
도 2c는 연장된 16시간 PNGase F 배양하는 동일한 전처리 역시 항체 중쇄를 실질적으로 탈당화하는데 실패한 것을 나타낸다. 제시된 글리코형의 남은 세 개의 피크가 증명하듯이 부분적인 탈당화만이 이루어졌다. 어떠한 글리코형의 탈당화 속도(rate)에 있는 바이어스(bias)는 네 번째 글리코형(화살표로 표시)의 부재로 입증된다. 이는 이러한 반응 조건 아래에서 다른 글리코형이 다른 속도로 탈당화된다는 것을 도시한다.
도 3a 및 3b는 시중에서 판매되는 시약, RapiGest™(Waters, Milford, MA)를 PNGase F 소화(digestion)전에 사용하는 항체의 전처리 후에 항체가 실질적으로 탈당화하지 않았다는 것을 나타낸다. 실시예 3에 기술된 바와 같이, 당화된 항체는 생산자가 제안한 양의 RapiGest로 전처리 되었다. 전처리된 항체는 ESI-TOF MS 분석 전에 PNGase F와 함께 1시간 동안 배양되었다.
도 3a는 오리지널 샘플(질량 50192, 50354, 및 50823)에 존재하는 항체 중쇄 글리코형을 보이는 대조구(PNGase F 없음)이다.
도 3b는 실질적으로 모든 중쇄 글리코형(화살표로 표시)이 RapiGest 사용 후에도 존재했다는 것을 나타낸다. 항체 중쇄의 적은 일부만이 탈당화되었다(질량 48748).
도 4a 내지 4c는 카르복실화된 계면활성제 라우로일사르코신(lauroylsarcosine(LS)), DTT 및 PNGase F가 50°C에서 5분 안에 실질적으로 탈당화된 항체를 생산할 수 있는 광범위한 조건을 도시한다(실시예 4 또한 참조). 제시된 것은 여러 양(varying amount)의 DTT와 결합한 여러 양의 LS가 있을 때 PNGase F로 탈당화하고 나서의 쥐의 단일클론성 IgG 항체(New England Biolabs, Ipswich, MA)(실시예 1에 기술)의 SDS-PAGE 이동성 변화(mobility shift)이다. 화살표는 기질의 완전한 탈당화가 분자량의 감소에 일치하는 겔 위치의 이동에 의하여 검출된 줄(lane)을 가리킨다.
도 4a는 0.2mM, 1mM, 4mM 및 20mM DTT를 0%, 0.05%, 0.1%, 0.5% LS와 결합하여 사용하는 반응 조건(reaction condition)을 비교한다.
도 4b는 20mM, 40mM 및 80mM DTT를 0%, 0.2%, 0.4%, 0.5% LS와 결합하여 사용하는 반응 조건을 비교한다.
도 4c는 4mM 및 20mM DTT를 0%, 0.5%, 2%, 4% 및 5% LS와 결합하여 사용하는 반응 조건을 비교한다.
도 5는 50°C에서 5분의 배양기간에 0.5% LS 및 PNGase F가 있을 때 낮은 농도의 DTT가 항체의 탈당화를 향상시키는 것을 도시한다(실시예 5 또한 참조). 0.02mM, 0.05mM 또는 O.1mM DTT와 결합하여 사용하는 0.5% LS에서 PNGase F으로 처리된 쥐의 단일클론성 IgG 항체(실시예 1에 기술됨)는 SDS-PAGE 이동성 변화로 보여진다. 기질의 탈당화는 글리칸 손실로 인한 분자량 감소에 일치하는 SDS-PAGE에서의 샘플 이동성(sample mobility)의 증가로 관측되었다("X" 참조).
도 6은 DTT를 도 5에 기술된 것과 유사한 조건 아래에서 항체의 탈당화를 향상시키기 위하여 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)로 치환할 수 있다는 것을 도시한다.
도 7a 및 7b는 담즙산염 또는 카르복실화된 계면활성제를 환원제(0.5% LS 및 20mM DTT 또는 2% 디옥시콜레이트(SDC) 4mM DTT)와 함께 함유하는 완충제를 사용하여, SDS-PAGE 이동성 변화로 검출된(화살표 참조), PNGase F로 쥐의 단일클론성 IgG 항체의 완전한 탈당화를 위해 사용할 수 있는 온도의 범위를 나타낸다. 한 단계 및 두 단계 반응에 대한 추가 상세 정보는 실시예 7에서 제공된다.
도 7a: PNGase F와 함께 다른 온도들에서 실행된 5분간 배양의 한 단계 반응. 두 개의 다른 완충제와의 결과를 도시한다.
도 7b: 50°C에서 5분간 배양하는 전처리 후 PNGase F와 함께 다른 온도들에서 실행된 5분간 배양의 두 단계 반응. 두 개의 다른 완충제와의 결과를 도시한다.
도 8은 22°C에서 5분, 10분 그리고 15분 배양한 고정된 PNGase(벤질-구아닌-변종 AGT (BG-HS) PNGase F) 및 가용성 (프리(Free)) PNGase F를 비교하는 뮤린 안티-말토스 결합 단백질(anti-MBP)의 탈당화를 도시한다. 도 8의 결과는 실온에서 5분간 고정된 PNGase F와 가용성 PNGase F와 배양 후, 두 단계 반응에서의 완전한 항체 탈당화를 도시한다(실시예 8 또한 참조).
도 9는 한 단계 반응(실시예 9에서도 기술)을 사용한 항체의 완전한 탈당화가 3분 이내에 이루어질 수 있다는 것을 도시한다. 쥐의 단일클론성 IgG 항체가 카르복실화된 계면활성제 및 환원제를 함유한 완충제가 있을 때에는 50°C에서 1 내지 5분간 PNGase F으로 처리되었다. 화살표는 완전한 이동성 변화가 관측된 곳을 가리키고, 이는 완전한 탈당화를 나타낸다.
도 10a 및 10b는 항체로부터 방출된 N-글리칸의 구성 및 특성을 도표로 나타낸다(실시예 10 또한 참조).
도 10a는 담즙산염, SDC(빗금이 들어간 막대); 또는 PNGase F 및 DTT만(흰 막대)있을 때에는 PNGase F 및 환원제(DTT)와 배양되었을 때 당화된 항체로부터 방출된 글리칸(A 내지 I)을 도시한다. 피크 분획(peak fractions)에서 DTT만 사용했을 때와 비교하여 DTT와 SDC를 사용하였을 때 최소 10배의 글리칸 산출량이 관측되었다. 10배 증가는 이 방법에 의한 효율적이며 항체로부터 실질적으로 모든 글리칸의 완전한 제거를 나타낸다.
도 10b는, 다음을 사용한 탈당화 후 IgG N-글리칸의 백분 조성(percentage composition)을 파이 도표로 제공한다:
(i) DTT 및 SDC; 단일클론성 IgG 샘플에 존재하는 N-글리칸의 정밀한 구성은 실질적으로 글리칸의 아홉 개의 유형 전부의 비편향 표성(unbiased representation)을 보이는 것으로 제공된다.
(ii) DTT만: (i)와는 대조적으로, 모든 글리칸이 제거되지 않았으며, DTT 및 SDC가 있을 때의 탈당화와 비교하였을 때, 주류(major) N-글리칸(D 및 B)은 덜 나타났고 비주류(minor) 글리칸 종(種)(A, H, E, 및 I)는 과하게 나타났는데, 이는 즉 환원제만이 있을 때의 PNGase F에 의한 N-글리칸 제거에 바이어스가 있음을 도시한다.
도 11a 및 11b는 항체로부터 방출되고, 도 11a의 원 포트(one pot) 방법으로, 또는 도 11b의 투 포트(two pot) 방법으로, 형광으로 라벨링된 N-글리칸의 색층 분석의 프로파일(chromatographic profile)을 도시한다(실시예 11 또한 참조). 글리칸은 DTT 및 SDC가 있을 때 PNGase F를 사용하여 단일클론성 IgG 항체로부터 절단되었다. 항체로부터 절단된 글리칸은 원 포트 방법으로 탈당화 혼합물에서 직접 라벨링 되었거나, 또는 투 포트 방법으로 라벨링 되기 전에 탈당화 혼합물로부터 분리되었다. 도 11a 및 11b의 프로파일이 전체적으로 유사한 반면, 글라이칸의 절대량은 원 포트 방법에서 상당히 증가하여(도 11a 및 11b의 y축의 형광 계수 비교) 원 포트 방법의 효율성을 나타낸다.
도 11a는 라벨링되기 이전에 글리칸이 분리되지 않은 원 포트 방법을 사용하여 라벨된 글리칸의 전체적인 프로파일을 도시한다.
도 11b는 라벨링되기 이전에 먼저 글리칸이 분리된 투 포트 방법을 사용하여 라벨링된 글리칸의 전체적인 프로파일을 도시한다.
도 12a 내지 12c는 5분 내에 세 가지 다른 항체로부터 방출되고 원 포트 방법으로 라벨링된 형광으로 라벨된 N-글리칸의 색층 분석의 프로파일을 도시한다. N-글리칸은 라벨링되기 전에 LS 및 DTT가 있을 때 PNGase F를 사용하여 각각의 항체로부터 절단되었다(실시예 14 또한 참조).
도 12a는 리툭시맵(rituximab)의 N-글리칸 프로파일이다.
도 12b는 세툭시맵(cetuximab)의 N-글리칸 프로파일이다.
도 12c는 에타네르셉트(etanercept)의 N-글리칸 프로파일이다.
도 13a 내지 13c는 DTT, 담즙산염 및 온열(mild heat)의 조합을 사용하고 PNGase F에 의해 탈당화된 항체는 기능적이고(functional) 그의 동족항원을 특이적으로 인식하고 결합하는 능력을 유지함을 나타낸다.
도 13a는 처리된 샘플 각각의 SDS-PAGE다. IgG의 탈당화된 중쇄는 당화된 중쇄보다 조금 더 빨리(낮게) 이동한다(당화된 그리고 탈당화된 중쇄의 만화와 함께 화살표로 표시됨). (+)는 SDC 및 환원제가 있을 때 PNGase F로 처리된 안티-MBP 항체이고; (-)는 PNGase F 처리가 없는 병렬 샘플이다.
도 13b는 계면활성제 및 환원제가 있을 때 PNGase F로 처리된 샘플의 ESI-TOF MS로 항체의 상당한 탈당화를 보인다. 음성대조구(negative control)는 PNGase F로 처리되지 않았을 때 오리지널 샘플에 항체 글리코형이 존재한다는 것을 도시한다.
도 13c는 양성 샘플(positive sample)의 탈당화된 항체가 기능성이고 당화된 항체와 유사한 그의 항원을 인식하고 결합하는 능력을 유지함을 분명히 한다. MBP-융합 단백질에 웨스턴 블롯검사를 실행하였다. 겔 위에 흰 삼각형은 블롯된 겔에 로딩한(loaded) 4.2ng에서 0.5ng으로의 동족항원의 감소량을 표시한다.
도 14a 및 14b는 동결 건조된 PNGase F(lyo PNGase) 및 담즙산염 또는 계면활성제 및 DTT를 함유한 완충제를 사용한 급속(rapid) 탈당화가 효과적이라는 것을 나타낸다. PNGase F 및 완충제는 활성에 어떠한 악영향 없이 함께(lyo 마스터 혼합물(master mix)) 또는 따로(lyo 완충제) 동결건조될 수 있다(실시예 14 또한 참조).
도 14a는 동결건조된 PNGase F 및 완충제(함께 또는 따로 건조)로 완전히 탈당화된 단일클론성 IgG의 SDS-PAGE를 도시한다. 화살표는 동결건조되지 않은 PNGase F 및 완충제를 사용한 양성대조구(positive control)("신선 PNGase F")만큼의 이동의 변화가 IgG의 완전한 탈당화와 일치함을 가리킨다(우측에 보여짐). 음성대조구("C")에는 PNGase F가 없었다.
도 14b는 도 14a에 기술된 샘플의 ESI-TOF MS 분석이다((i) 동결건조된 마스터 혼합물(PNGase F-완충제)을 사용한 완전한 탈당화; (ii) 동결건조된 PNGase F 동결건조된 완충제를 사용한 완전한 탈당화; (iii) 음성대조구(PNGase F 없음)). 상기 분석은 동결건조된 그리고 재수화된(rehydrated) 완충제 및 효소가 50°C에서 5분 이내에 항체를 현저히 탈당화시킨다는 것을 확인시켜준다.
도 15a 및 15b는 담즙산염 또는 카르복실화된 음이온의 계면활성제 및 DTT를 함유한 완충제가 여러 가지의 항체 아이소타입(isotypes)을 효율적으로 탈당화하는데 사용될 수 있다는 것을 도시한다(실시예 15 또한 참조). SDS-PAGE 겔은 완충제 및 아이소타입(isotypes) 항체를 함유하지만 PNGase F는 함유하지 않은 대조구(효소 없음(-))를 도시한다. (+)는 0.5% LS 및 20mM DTT가 있을 때 PNGase F를 사용한 탈당화 반응을 나타낸다. 항체의 아이소타입(isotypes) 및 근원(인간, "h"; 쥐 "m")이 표시되어 있다. 각각의 겔의 한 면에는 PNGase F 밴드 및 아이소타입(isotypes)의 경쇄(LC) 역시 표시되어있다. 각각의 실험의 반응은 음성대조구와 비교하였을 때 성공적인 탈당화를 가리키는 중쇄(옆의 "HC"로 위치가 표기됨)의 이동성 변화를 보여주었다.
도 15a 항체 아이소타입(isotypes): hlgG1, hlgG2, 및 hlgG4.
도 15b 항체 아이소타입(isotypes): hlgM, hlgA1, hlgE, mlgG1, mlgG2A.
도 16a 및 16b는 LS 및 환원제가 있을 때 완전한 탈당화에 필요한 PNGase F의 양이 환원제만이 있는 것을 제외한 동일한 한 단계 반응 조건과 비교하였을 때 현저히 감소된 SDS-PAGE 겔을 도시한다(실험 조건은 실시예 17을 참조). PNGase F:IgG의 양의 비율(㎍/㎕)은 LS가 없을 때 20배 이상, 50배 이상, 75배 이상, 90배 이상의 PNGase F였고, 따라서 이는 LS가 없을 때보다 LS가 있을 때 현저히 적은 양의 PNGase F로 완전한 탈당화를 달성할 수 있다는 것을 도시한다.
도 16a는 반응 완충제(reaction buffer)가 0.5% LS를 함유하고 62.5유닛의 PNGase F를 사용한 단일클론성 IgG의 완전한 탈당화를 도시한다(검은색 화살표).
도 16b는 LS가 없을 땐, 있는 것 중에 가장 농축된 스톡(stock)(4000유닛)조차도 완전한 탈당화를 이루기에 충분하지 못하다는 것을 도시한다(X로 표시됨).
도 17a 및 17b는 LS 및 환원제가 있을 때 완전한 탈당화에 필요한 PNGase F의 양이 환원제만이 있는 것을 제외한 동일한 두 단계 반응 조건과 비교하였을 때 현저히 감소된 SDS-PAGE 겔을 도시한다(실험 조건은 실시예 18을 참조). PNGase F:IgG의 비율은 LS가 없을 때 20배 이상, 50배 이상, 75배 이상, 90배 이상의 PNGase F였다.
도 17a는 반응 완충제가 0.5%를 함유하고 62.5 유닛의 PNGase F를 사용한 단일클론성 IgG의 완전한 탈당화를 도시한다(검은색 화살표).
도 17b는 LS가 없을 땐, 있는 것 중에 가장 농축된 스톡(stock)(4000 유닛)조차도 완전한 탈당화를 이루기에 충분하지 못하다는 것을 도시한다(X로 표시됨).
도 18a 내지 18c 비환원 조건 아래에서의 PNGase F 탈당화 조건(카르복시 세제(carboxylic detergent), 열)은 항체 분자의 기능적 완전성(functional integrity)을 보존한다는 것을 도시한다. 쥐여 단일클론성 IgG, 리툭시맵, 및 에타네르셉트는 효과적인 탈당화를 촉진시키는데에 필요한 LS의 양 및 온도 및 배양 시간을 구하기 위하여 DTT가 없는 여러 조건 아래에서 전처리 되었다. 탈당화된, 온전한(intact), 단일클론성 항체는 그의 항원 결합 특성을 유지한다(실시예 19 또한 참조).
도 18a는 항체의 급속 탈당화가 환원제가 없을 때 80°C에서 55°C까지 이르는 범위의 온도에서 2 내지 15분 동안 전처리를 하였을 때 효과적인 것을 도시한다. SDS-PAGE는 크기의 변화(화살표로 표시)가 환전한 탈당화와 일치함을 도시한다.
도 18b는 급속 탈당화가 환원제가 없을 때 항체의 구조를 보존할 것이라는걸 도시한다. 다중체 단백질(예: IgG 이종-4합체(hetero-tetramers))의 존재를 검출하기 위하여 샘플들은 DTT가 없는 샘플 완충제에서 SDS PAGE를 실행하였다. 80KD 마커 아래로 이동한 단량체의 구조가 없는 걸 보았을 때, 다합체의 구조가 보존된 것이 분명하다.
도 18c는 전-배양된(pre-incubated) 항체, 또는 신선한 항체(둘 다 아직 당화된)와 비교하였을 때 동등한 역가를 가지는, 해당하는 항원(MBP-태그된 단백질)을 인식하는 탈당화된, 온전한, 단일클론성의 안티-MBP의 기능성 활동을 도시한다.
도 19는 LS 또는 로레이트 나트륨(LAU)와 같은 카르복시 계면활성제를 사용한 급속 탈당화가 효과적이라는 것을 나타낸다(실시예 20 참조). SDS-PAGE의 이동 변화는 완전한 탈당화(화살표)가 대조구("C")와 견줄 수 있는 것을 가리킨다. 카르복시산은 환원제의 존재 또는 부재에서 효과적이다. 상기 도면은 카르복시산이 한 단계 또는 두 단계 반응에서 50°C에서 5분 이내의 급속 탈당화에 효과적이라는 것을 도시한다.
도 20a 및 20b는 동시의 Rapid PNGase F(New England Biolabs, Ipswich, MA) 및 트립신 반응의 결과를 도시한다. 급속 탈당화는 트립신과 같은 단백질분해 효소가 있을 때 일어난다(실시예 21 참조). 쥐의 단일클론성 IgG는 질량 분석을 위해 PNGase F로 동시에 탈당화되고 탈당화된 트립신 분해 펩티드를 구하기 위하여 트립신으로 절단된다.
도 20a는 PNGase F/트립신 소화로부터 관측된 총 이온을 도시한다. Tris HCL 완충제(트립신 활성에 최적)에서 실행된 반응은 예상대로 LS가 있을 때와 LS가 없을 때 동일한 펩티드 커버리지(coverage)를 보인다.
도 20b는 분리된 EDYnSTIR 펩티드의 분열 패턴을 보여주고, 이는 쥐의 IgG의 특유의 당화 부위와 일치한다. 상기 펩티드는 아스파르트산 형태로만 발견되고, 이는 탈당화가 완료되었다는 것을 나타낸다.
본 발명의 구체예는 탈당화된 단백질 및 방출된 글리칸의 바이어스가 없는 별개의 분석을 할 수 있는 완전한 그리고 선택적인 글리칸 급속 제거 및/또는 기능적인 탈당화된 항체의 제제, 항체와 같은 당단백질을 분석하는 향상된 방법 및 조성물을 제공한다
본 발명의 구체예의 장점은 다음 중 최소 하나를 포함한다: (i) 단백질 또는 글리칸의 산화, 탈아미드화, 및 그외 원치않는 화학적 변형을 최소화하는 탈당화 조건; (ii) 질량 분석을 사용하는 다운스트림 분석에 지장을 주지않는 탈당화 조건; (iii) 결과적으로 글리칸의 어떠한 종에 대한 바이어스를 제거하는 완전한 탈당화; (iv) 편리하고 비용 효율이 높은 급속 반응 조건; (v) 탈당화된 단백질의 기능의 보존; (vi) 한 단계에서 단백분해효소에 의한 단백질의 펩티드로의 분해; (vii) 반응에 감소된 양의 글리코시다아제 사용 및 (viii) 당화된 항체에 더하는데 적합한 탈당화를 위한 동결 건조된 시약의 가용성(availability). 이러한 이점은 본 발명의 구체예의 어떠한 특성의 결과로 인해 생긴다. 이는 다음에서 하나 이상을 포함한다: 완충제에 있는 투석 가능한(dialyzable) 절단할 수 없는(non-cleavable) 카르복실화된(carboxylated) 음이온의 계면활성제 및/또는 담즙산염에 있는 글리코시다아제를 동결건조한 또는 가용성으로 만든(solubilized) 제제. 상기 제제는 추가로 환원제를 함유할 수 있다. 상기 제제는 추가로 트립신과 같은 단백분해효소를 함유할 수 있다. 상기 제제는 가용성으로 만든 또는 동결건조된 제제일 수 있다. 당화된 항체와 결합되었을 때, 상기 제제는 70°C 이하의 온도에서 60분 이내에, 그리고 선택적으로 한 단계 반응 또는 전처리를 수반하는 두 단계 또는 필요한 만큼의 두 단계 이상에서, 당화된 항체의 완전한 탈당화를 달성할 수 있다.
본 발명의 방법의 구체예의 고민감도는 샘플에 존재하는 항체 글리코형을 전부 또는 실질적으로 전부 간단하고, 효과적이고, 포괄적이고 빠른 방식으로 알아내는데 사용할 수 있다. 실질적으로 모든 글리칸이 당단백질로부터 제거될 수 있기 때문에, 다른 방법에서 발견되는 고유 바이어스(inherent bias)가 방지된다. 민감도는 더 적은 샘플이 사용될 수 있다는 뜻이기도 하다. 상기 방법은 다른 절차에서 일반적으로 발견되는 복수의 처리 단계(예: 가열변성, 알킬화, SDS가 손쉽게 제거될 수 없는 SDS 처리, 또는 이열성 또는 산-불안정성(acid-labile) 시약의 불활성화)로 인한 샘플 손실을 방지할 수 있다. 따라서 상기 방법은 적은 용량 또는 낮은 농도의 샘플에 적합하다. 또한, 상기 방법의 구체예가 상대적으로 소량의 글리코시다아제를 사용하기 때문에, 대형 샘플 부피의 샘플 및/또는 복수의 샘플(동시에 또는 순차적으로)이 손쉽게 탈당화될 수 있다.
상기 방법은 크로마토그래피(예: HPLC, 펄스 암페로메트릭 검출법을 가진 HP 음이온-교환 크로마토그래피(HPAE-PAD)), 겔 전기영동법, 질량 분석법(예: MALDI-TOF MS, ESI-TOF MS), 및 모세관 전기영동과 같은 다운스트림 분석과 손쉽게 결합된다. 상기 방법은, 예를 들어, 탈당화된 단백질(예: 항체)의 분자량, 전하 상태, 산화, 클리핑(clipping), 및 탈아미드화를 측정, 단백질 탈당화(항체 탈당화) 확인, 단백질 기능(예: 항체 기능) 확인, 글리칸 구성 확인, 글리칸 구조 확인, 및 글리코프로파일(glycoprofile) 정보를 찾는데 사용될 수 있다. 이는 업계에 현실적인 영향을 미치는 빠른 작업의 흐름을 가능하게 한다. 본 명세서에 기술된 방법 및 시약은 진단, 품질 관리, 항체 생산(예를 들어 치료적 항체)의 관리 및 과정 최적화, 글리코믹스(glycomics) 프로파일링, 및 고 처리량(high throughput) 분석에 사용될 수 있다.
하나의 구체예에서는, 당단백질 기질은 항체이다. 하나의 구체예에서는, 글리칸은 PNGase 글리코시다아제로 제거할 수 있는 N-글리칸이다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 전문적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 업계의 통상적인 기술자가 일반적으로 이해하는 뜻과 동일한 뜻을 가졌다. 특정 용어의 범위는 하기에 제공되었다. 본 명세서에 기술된 구체예는 하나 이상의 값의 범위(예: 크기, 농도, 시간, 온도)를 포함할 수 있다. 값의 범위는, 내용이 명확하게 달리 명시하지 않는 한, 나열된 범위의 값의 부분 집합(subset(s))을 포함한, 범위 내의 모든 값을 하한의 단위의 10분의 1까지 포함하는 것으로 이해될 것이다.
"항체"는 면역글로불린과 교대해서 쓰이고, 기능적일 때 항원 결합이 가능한 전체의 항체 및 단편을 포함한다. 항체는 자연의 또는 재조합의, 다클론성, 단일클론성, 인간화된(humanized), 포유류의(인간, 영장류, 낙타, 돼지, 말, 설치류, 솟과 포함), 새의, 파충류의, 어류(예: 먹장어, 칠성장어, 경골어 및 판새아강을 포함한 연골어류)의 항체일 수 있다. 항체는 혈청, 혈장 r 혈액 샘플 또는 분비된, 배설된, 또는 그 외에 숙주로부터 채취된 그 외 체액과 같은 체내 샘플로부터 유도될 수 있다. 그렇지 않으면, 항체는 시험관 내 세포 배양으로부터 나온 것일 수 있다. 항체(예: 치료적 항체)는 생물반응기, 또는 다세포 숙주 생물(예: 배양된 집단)에서 생산될 수 있다. 항체는, 예를 들어, 단쇄 항체일 수 있다.
"항체"는 항체의 모든 종류 및 아이소타입(isotypes)을 포함하고, 중쇄 Ig, IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgNAR, IgW, 및 IgY를 포함하며, 키메라(chimeric), 다중특이성(예: 이중특이성, 삼중특이성, 사중특이성), 유도된 그리고 그에 따른 융합 단백질을 더 포함할 수 있다. 미니체(minibody), 이중체, 삼중체, 사중체, scFv, 이중특이성 scFv, 삼중특이성 Fab3, 단일도메인 항체(sdAb), 및 이중가변(dual-variable) 도메인 항체와 같은 항체 또한 정의에 포함된다. Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, Fd, 단일도메인(예: VhH, VL, VH, VNAR), 그리고 그에 따른 부분을 포함하는 항체 단편은 "항체"에 포함된다.
항체는 가용성일 수 있다. 항체는 수성(aqueous) 상태 또는 침전물, 건조된 또는 비즈 컬럼(bead a column) 또는 매트릭스와 같은 고체 표면에 샘플을 위해 고정된것일 수 있다.
세포에 의해 생산된 단편을 포함한 항체는 전형적으로 당화되어 있다. 일반적으로, 항체는 N-연결(N-linked) 글리칸으로 당화되지만, O-글리칸 또한 함유할 수 있다. 당화는 항체의 어느 영역에서도 일어날 수 있다. 항체의 특정한 글리코형은 건강, 질병 상태 또는 배양 조건과 같은 여러 가지 조건에 따라 다를 수 있다. 이러한 차이는 항체의 활동 및 반감기에 영향을 미칠 수 있다. 당화된 항체는 항체 활동 또는 반감기의 감소된 변화나 변화를 가지지 않을 수 있다.
어떠한 구체예에서는, 시료 포획제(capture agent)/분석물 복합체에서 특이적으로 결합하였을 때, 항체 및 항원 사이의 친화성은 10-6M 이하, 10-7M 이하, 10-8M 이하, 10-9M 이하, 10-9M 이하, 10-11M 이하, 또는 10-12M 이하의 KD(해리상수)로 특징지어진다.
"글리칸"은 자유 형태의 또는 다른 분자에 부착된 어느 설탕을 말하며 O-글리칸 및 N-글리칸을 포함한다. N-연결 글리칸은 공통 서열(consensus sequence) -Asn-X-Ser/Thr에 폴리펩티드 사슬의 아스파라긴 잔기에 공유결합된 글리칸이며, 상기 X는 프롤린을 제외한 어느 아미노산이다. O-연결 글리칸은 글리코시드 결합을 통해 세린 또는 트레오닌의 수산기에 연결된 글리칸이다. 상기 글리칸은 단당류, 올리고당 또는 다당류, 선상, 분지된(branched) 또는 선상 및 측쇄의 혼합일 수 있고, 그리고 한 종의 당 또는 여러 종류의 당으로 구성될 수 있다. "글리코형(glycoforms)"은 다른 글리칸 구조 및/또는 글리칸 부착자리 점유(occupancy)로 인한, 당단백질의 다른 분자 형태를 말한다. "글리코프로파일(glycoprofile)"은 하나 이상의 글리코몰레큘(glycomolecules)에 있는 속성 또는 특징을 말한다. 프로파일은 하나 이상의 글리칸, 글리코몰레큘의 당화 부위 또는 위치, 및/또는 글리코몰레큘의 글리칸 사용의 정체, 구조, 구성 및/또는 양을 포함할 수 있다. "글리코프로파일"은 "당화 프로파일"과 교대해서 쓸 수 있다.
"당화"는 폴리펩티드, 지질, 폴리뉴클레오티드 또는 다른 탄수화물에 대한 탄수화물의 공유 부착(covalent attachment)을 말한다. "당화된 펩티드", "당화된 폴리펩티드" 또는 "당화된 단백질"은 "당펩티드", "글리코폴리펩티드" 또는 "당단백질"와 교대해서 쓸 수 있다.
"탈당화"는 글리칸-함유 분자로부터 글리칸 제거를 말한다. 탈당화는 효소로 또는 화학적으로 행할 수 있다. 단일 글리코시다아제 또는 글리코시다아제의 혼합물은 단백질을 탈당화하는데 사용될 수 있다. "실질적으로 모든" 글리칸을 절단하는 것은 결과적으로 완전히 탈당화된 단백질을 야기하고, 상기의 "완전히 탈당화된"은 SDS-PAGE 또는 질량 분석으로 측정된 글시코시다아제에 의한 >70%, >80%, >90%, >92%, >94%, >96%, >98% 또는 >99% 탈당화를 말한다. 예를 들어, N-글리칸 또는 O-글리칸 글리코시다아제에 의한 완전한 탈당화는 >70%, >80%, >90%, >92%, >94%, >96%, >98% 또는 >99% N- 또는 O-글리칸 탈당화를 말한다. 완전한 탈당화가 N-글리칸 및 O-글리칸 글리코시다아제의 혼합물에 의해 되었다면 이는 >70%, >80%, >90%, >92%, >94%, > 96%, >98% 또는 >99% N-글리칸 및 O-글리칸 탈당화를 말한다. 완전한 탈당화의 예는 90%-100% 탈당화이다.
"글리코시다아제"는 글리칸을 절단할 수 있는 효소를 말하고, 엔도글리코시다아제(endoglycosidase), 엑소글리코시다아제(exoglycosidase), 및 아미다아제를 포함한다. 하나의 구체예에서는, 상기 글리코시다아제는 엔도글리코시다아제 및/또는 엑소글리코시다아제이다. 하나의 구체예에서는, 상기 글리코시다아제는 아미다아제이다. 몇몇의 구체예에서는, 상기 글리코시다아제는 N-연결 글리칸을 절단한다. 몇몇의 구체예에서는, 상기 글리코시다아제는 O-연결 글리칸을 절단한다. 몇몇의 구체예에서는, 상기 글리코시다아제는 아몬드의(PNGase A)(하기 참조) 또는 쌀의(PNGase Ar)(하기 참조) 탈당화된 펩티드-N-글리코시다아제, 펩티드-N-글리코시다아제 F (PNGase F), PNGase Y(Swiss Prot: Q6CAX5.1 YALI0C23562g YALI0C23562p [Yarrowia lipolytica CLIB122] Gene ID: 2909617 NCBI Reference Sequence: NC_006069.1. O-글리코시다아제(New England Biolabs, Ipswich MA), 엔도글리코시다아제 D(Endo D)(New England Biolabs, Ipswich MA), 엔도글리코시다아제 F(Endo F)(QAbio, Palm Desert, CA), 엔도글리코시다아제 F1(Endo F1)(QAbio, Palm Desert, CA), 엔도글리코시다아제 F2 (Endo F2)(QAbio, Palm Desert, CA), 엔도글리코시다아제 F3(Endo F3)(QAbio, Palm Desert, CA), 엔도글리코시다아제 H (Endo H)(New England Biolabs, Ipswich MA), 엔도글리코시다아제 M (Endo M)(TCI America), 엔도글리코시다아제 S(Endo S)(New England Biolabs, Ipswich MA), 베타1-3 갈락토시다아제(New England Biolabs, Ipswich MA), 알파1-3,6 갈락토시다아제(New England Biolabs, Ipswich MA), 베타-N-아세틸글루코사미니다아제(New England Biolabs, Ipswich MA), 알파-N-아세틸글루코사미니다아제(New England Biolabs, Ipswich MA), 베타-N-아세틸헥소사미니다아제(New England Biolabs, Ipswich MA), 알파1-2,3 만노시다아제(New England Biolabs, Ipswich MA), 알파1-6 만노시다아제(New England Biolabs, Ipswich MA), 뉴라미니다아제(New England Biolabs, Ipswich MA), 알파2-3 뉴라미니다아제(New England Biolabs, Ipswich MA), 알파1-2 후코시다아제(fucosidase)(New England Biolabs, Ipswich MA), 또는 그에 따른 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇의 구체예에서는, 상기 글리코시다아제는 융합 단백질이다. 몇몇의 구체예에서는, 상기 글리코시다아제는 PNGase F이다. PNGase F는 시중에서 판매되는 효소이다(예: New England Biolabs, Ipswich MA, Cat. #P0704 또는 #P0710). 몇몇의 구체예에서는, 상기 PNGase F는 융합 단백질이다. 예를 들어, 상기 PNGase F는 키틴 결합 도메인(CBD) 또는 PNGase F-SNAP 융합 단백질으로 태그된 PNGase F일 수 있다(실시예 16 참조). 몇몇의 구체예에서는, 상기 글리코시다아제는 동결건조되었다. 몇몇의 구체예에서는, 상기 글리코시다아제는 동결건조된 PNGase F이다. 몇몇의 구체예에서는, 상기 글리코시다아제는 동물-유래 시약이 실질적으로 없다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 상기 글리코시다아제(단일 글리코시다아제 또는 글리코시다아제의 혼합물을 포함)는 고체, 반고체 또는 다공성의 표면에 고정될 수 있다. 글리코시다아제(예를 들어 PNGase F)의 고정에 적합한 표면은 비즈, 수지, 컬럼, 홈(wells), 판(plates), 마이크로칩, 미세유체역학 장치(microfluidic devices), 필터 및 이와 같은 것을 포함한다. 하나의 구체예에서는, 상기 글리코시다아제는, 예를 들어 PNGase F는, 아가로스 또는 자성 비즈에 고정된다. 고정은 융합 단백질(예: PNGase F 융합 단백질)에 의하여 달성할 수 있고, 상기 융합 단백질은 CBD가 키틴에 대해 또는 말토스 결합 도메인이 말토스에 대한 것과 같은 특정한 분자에 대한 친화성을 가진다. 하나의 구체예에서는, 상기 융합 단백질은 변종 AGT를 포함한다.
하나의 구체예에서는, 글리코시다아제의 한 유닛은 10㎕의 반응부피(reaction volume)에 50°C에서 5분간 5㎍의 쥐 단일클론성 IgG로부터 >95%의 글리칸을 제거하는데 필요한 효소의 양이다.
다른 구체예에서는, PNGase F의 한 유닛은 10㎕의 반응부피에 37°C에서 1시간 동안 10㎍의 변성된 RNase B로부터 완전한 탈당화에 필요한 효소의 양이다.
"담즙산"은 네 개의 고리를 가진 스테로이드 구조, 카르복시산에서 (다섯 내지 여덟 원자)탄소 곁사슬로 끝나고, 그리고 하나 이상의 수산기로 구성된 분자군을 말한다. 상기 네 개의 고리는 왼쪽에서 오른쪽으로(흔히 그려지듯) A, B, C, D로 라벨링되었고, D-고리는 다른 세 개보다 탄소 하나분 작다. 상기 수산기는 베타로 불리는(β; 흔히 관례로 실선으로 그려짐) 위(또는 밖으로(out)), 또는 알파로 불리는(α; 점선으로 보여짐) 아래 둘 중 어느 하나의 위치일 수 있다. 모든 담즙산은 부모 분자(콜레스트롤)로부터 유도된 3-수산기를 가졌다. 담즙산은 Hofmann, et al., J. Lipid Res. 51: 226-46(2010) 및 Russell, Annu. Rev. Biochem. 72: 137-74(2003)에서 검토되었고 그리고 콜산(cholic acid), 글리코콜린산, 타우로콜린산, 디옥시콜산, 케노데옥시콜산, 글리코케노데옥시콜산, 타우로케노데옥시콜산 및 리토콜산을 포함하지만, 자연적으로 발생하는 담즙산의 인공적으로 만들어진 변종을 포함한, 많은 이외의 것들이 알려져 있다. 담즙산은, 예를 들어 담즙산염과 같은, 염으로 사용될 수 있다.
"음이온의 계면활성제"는 황산염, 술폰산염, 인산염 또는 카르복시산염과 같은, 음전하를 띠는 헤드(head)를 가진 계면활성제를 말한다.
"세제"로 불릴 수 있는 "절단할 수 없는 카르복시산염 음이온의 계면활성제"는 카르복실화된 헤드를 가진 음이온의 계면활성제를 말하고, 이는 스테아르산 나트륨과 같은 알킬 카르복실산염(alkyl carboxylate)(비누), 및 LS, 그리고 퍼플루오로노나노에이트(perfluorononanoate), 퍼플루오로옥탄산(PFOA 또는 PFO)과 같은 불소계면활성제(fluorosurfactants)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 그 외의 카르복실화된 음이온의 계면활성제도 알려져 있으며 더 많은 예는 하기에 기술되어있다. 상기 계면활성제/세제는 다른 화학 결합(예: 펩티드 결합, 글리코시드 결합 등)이 영향받지 않는 약간의 산성 조건 아래에서의 절단로 비활성 상태가 될 수 있다.
"투석 가능한(dialyzable)"은 25KD, 50KD, 또는 바람직하게는 70KD-100KD 범위 내의 분획 분자량(MWCO)을 가지고, 따라서 최소 10kDa의 분자량을 가진 단백질의 >90%를 유지하지만 계면활성제는 유지하지 않는, 투석막(예: 반-반-투과성(semi-semi-permeable) 막)을 투과할 수 있는 분자를 말한다.
"비-자연적으로 발생하는"은 자연에 존재하지 않는 조성물을 말한다. 단백질에 있어서는, 상기 "비-자연적으로 발생하는"은 자연적인 상태의 단백질과 다른 아미노산 서열 및/또는 번역 후 변형 패턴을 가진 단백질을 말한다. 예를 들어, 상기 비-자연적으로 발생하는 단백질은 단백질의 N-말단, C-말단 및/또는 N- 및 C-말단의 사이에 하나 이상의 아미노산 치환, 제거 및 삽입을 갖고 있을 수 있다. 상기 "비-자연적으로 발생하는" 단백질은 자연적으로 발생하는 아미노산 서열과는 다르지만 자연적으로 발생하는 아미노산 서열과 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 최소 97%, 최소 98% 또는 최소 99% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 어떠한 경우에는, 상기 비-자연적으로 발생하는 단백질은 N-말단 메티오닌을 함유하거나 또는 다른(예: 박테리아의) 세포에서 생산되었다면 하나 이상의 번역 후 변형(예: 당화, 인산화, 등.)이 없을 수 있다.
제제에 있어서는, 상기 "비-자연적으로 발생하는"은 다음을 말한다: a) 자연에서 결합되지 않은 구성요소의 조합, 예를 들어, 다른 위치, 다른 세포 또는 다른 세포 구획에 있기 때문; b) 자연에서 찾을 수 없는 않는 상대 농도를 가진 구성요소의 조합; c) 보통 자연에 있는 하나의 구성요소와 관련된 것이 결핍된 조합; e) 자연에서 찾을 수 없는 형태의 조합, 예를 들어, 건조된, 동결건조된, 결정체의, 수성의 형태; 및/또는 d) 자연에서 찾을 수 없는 구성요소를 함유한 조합. 예를 들어, 상기 제제는 자연에서 찾을 수 없는 완충화제(예: 트리스, HEPES, TAPS, MOPS, 트리신 또는 MES), 세제, 염료, 반응 촉진제(enhancer) 또는 억제제, 산화제, 환원제, 용제 또는 방부제를 함유할 수 있다. 본 발명의 구체예에서는, (a) 그의 항원에 대한 항체의 결합 특성을 보존; (b) 더 많은 분석을 위한 단백질 또는 글리칸의 특징을 보존; 및/또는 (c) 만약 있다면, 단백질의 다합체 구조를 보존하는 조건 아래의 탈당화를 위한 두 단계 반응 및 한 단계 반응을 기술한다. 몇몇의 상황에서는, 원 포트, 두 단계 반응이면 충분하다. 그러나, 한 단계 반응은 당단백질의 고 처리량 분석을 가능하게 하고 취급 오류를 최소화할 수 있다. 본 발명의 방법의 현재 측면은 당화된 단백질의 나노그램 내지 마이크로그램의 양에 효과적이다. 상대적으로 많은 양의 기질 단백질에 본 발명의 방법의 측면의 성공적인 적용은 글리칸의 희귀종을 검출하는 용도를 가진다.
"두 단계" 절차는, 이론에 제한되지 않기를 바라며, 기질 단백질이 당단백질의 응집 및/또는 응고를 피하는 조건 아래에서 이완되는 것을 야기하는 것으로 생각되는 첫 단계(전처리 단계)를 포함한다. 상기 두 단계(탈당화 반응 단계/반응 단계)는 편리 및 글리코시다아제의 최대 활동을 위하여 첫 단계에서의 동일한 또는 유사한 완충제를 사용한다. 여기에서는 글리칸의 절단를 위하여 글리코시다아제가 더해진다. 그에 반해서, "한 단계" 절차는 처음에 마스터 혼합물(master mix)에 글리코시다아제를 도입한다. 상기 한 단계 절차는 바람직하게는 선택적이며 두 단계 절차에서는 생략될 수 있는 DTT와 같은 환원제를 사용한다. 예를 들어, 환원제에, 즉 SDS 또는 LS, 및 PNGase F로 구성된 완충제에 항체가 배양되는, 단백질을 탈당화하는 하나의 단계를 사용하는 원 포트 방법을 기술하는 실시예 7 참조. 50°C에서 5분간 혼합물의 배양은 실질적으로 탈당화된 항체를 생산하였다(도 7a 참조). 탈당화는 3분 이내에 관측되었다(실시예 9, 및 도 9 참조).
두 단계 및 한 단계 방법에 대한 pH 조건은 유사하며 최적의 글리코시다아제 활동을 위해서는 4 내지 10의 범위 내에 있다. 예를 들어, 상기 pH는 약 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 그에 따른 어느 범위일 수 있다.
세제, SDS는 당단백질을 변성시켜 그렇지 않으면 가질 어느 구조 또는 기능을 잃기 때문에 본 구체예에는 부적합한 것으로 나타났다. 게다가, SDS는 반응 혼합물로부터 손쉽게 제거될 수 없으며 단백질과 밀접하게 연관되며, 그리고 그 후에 글리칸 및 단백질의 질량 분석에 지장을 준다. 실시예에서는, SDS가 PNGase F와 같은 글리코시다아제의 활동에 악영향을 미치는 것으로 나타났다. 그러므로 SDS는 본 구체예에서 제외되었다.
여기에서는 투석가능한 절단할 수 없는 카르복실화된 음이온의 계면활성제 및/또는 담즙산 또는 그에 따른 염과 같은 계면활성제가 본 발명의 방법에 적합한 것으로 나타났다. 이론에 제한되지 않게, 절단할 수 없는, 투석가능한 카르복실화된 음이온의 계면활성제 또는 담즙산은 단백질 구조를 이완하는데 쓰이며 효소 매개 탈당화를 가능하게 하는 것으로 생각된다. 덧붙여, 이러한 시약은 제거될 수 있어 질량 분석을 지나치게 저해하지 않고 단백질(예를 들면 항체)이 여기에서 보여진대로 기능을 유지 또한 가능하게 한다.
본 구체예에 사용할 수 있는 투석가능한, 절단할 수 없는 카르복실화된 음이온의 계면활성제의 예는 LS, 라우르산, 스테아르산, 팔미트산, 그에 따른 조합물, 및 그에 따른 염을 포함한다. 몇몇의 구체예에서는, 상기 카르복실화된 음이온의 계면활성제의 염(surfactant salt)은 LS다. 상기 카르복실화된 음이온의 계면활성제는 동결건조되었거나/또는 동물-유래 시약을 실질적으로 가지고 있지 않다.
다양한 농도의 나트륨 LS 또는 SDC와 같은 투석가능한, 절단할 수 없는 카르복실화된 음이온의 계면활성제를 사용할 수 있는 반면, 최소 0.5%의 농도를, 예를 들어 0.5% 내지 8%의 범위 내의 농도 또는 1% 내지 5%의 범위 내의 농도를, 사용하는 것이 바람직하다.
본 구체예에 사용할 수 있는 담즙산의 예는 콜산, 케노데옥시콜산, 리토콜산, 디옥시콜산, 우르소데옥시콜산 또는 그에 따른 염 또는 앞서 말한 것의 조합물을 포함한다. 몇몇의 구체예에서는, 상기 담즙산은 디옥시콜산이다. 하나의 구체예에서는, 상기 담즙산염은 SDC다. 상기 담즙산은 동결건조될 수 있다. 상기 담즙산은 동물-유래 시약을 실질적으로 가지고 있지 않다. 다양한 농도의 SDC와 같은 담즙산염을 사용할 수 있는 반면, 최소 2%의, 예를 들어 3% 또는 5%의 농도를, 사용하는 것이 바람직하다. 하나의 구체예에서는, SDC는 약 2%의 농도에서 사용되었다.
본 명세서에 기술된 사용에 적합한 세제의 더 많은 예는 Sigma Life Sciences(Biofiles (2008) Vol. 3 No. 3 "Detergents and Solubilization reagents" 참조), G-Biosciences "Detergents: A handbook and Selection Guide to Detergents and Detergent Removal"에서 구할 수 있다.
음이온의 카르복실화된 계면활성제 및/또는 담즙산염에 더하여, 탈당화 전처리 또는 반응 혼합물에 환원제를 포함시키는 것이 이롭지만 필수적인 것은 아닌 것으로 나타났다.
몇몇의 구체예에서는, 상기 환원제는 DTT, β-메르캅토에탄올, 또는 TCEP이다. 환원제의 최종 농도는 본 발명의 속한 분야의 기술자라면 구할 수 있다. 몇몇의 구체예에서는, 상기 환원제는 DTT다. 예를 들어, DTT의 최종 농도는 약 0.2mM 내지 약 100mM 사이일 수 있다. 예를 들어, 상기 최종 농도는 약 0.2mM, 0.4mM, 0.6mM, 0.8mM, 1mM, 2mM, 5mM, 1OmM, 15mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM, 80mM, 85mM, 90mM, 95mM, 1OOmM, DTT, 또는 그에 따른 어느 범위일 수 있다(실시예 4 및 5 참조). 몇몇의 구체예에서는, 상기 환원제는 TCEP다. 몇몇의 구체예에서는, TCEP의 최종 농도는 약 0.2mM 내지 약 10mM 사이이다. 예를 들어, 약 0.2mM, 0.4mM, 0.6mM, 0.8mM, 1mM, 2mM, 5mM, 1OmM TCEP, 또는 그에 따른 어느 범위일 수 있다(실시예 6 참조).
하나의 구체예에서는, 당단백질은 탈당화 전에 선택적으로 전처리 될 수 있으며 여기서 전체의 탈당화 반응은 60분 이내에, 예를 들어 30분 이내에, 완료될 수 있다. 몇몇의 구체예에서는, 상기 탈당화 반응 혼합물(열 전처리와 함께 또는 없이)은 약 25°C 내지 70°C까지의 온도(예: 약 25°C, 30°C, 37°C, 40°C, 43°C, 45°C, 48°C, 50°C, 53°C, 55°C, 58°C, 60°C, 63°C, 65°C, 70°C 또는 그에 따른 범위)에서 약 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 5시간, 10시간, 또는 그에 따른 어느 범위의 시간 동안 배양된다. 예를 들어, 실시예 7을 참조. 하나의 구체예에서는, 상기 혼합물은 37°C, 45°C, 또는 50°C에서 약 30분, 15분, 10분, 5분 또는 약 3분 또는 그 이하 동안 배양된다. 몇몇의 구체에에서는, 상기 반응은 30°C 내지 50°C의 범위의 온도에서 2분 내지 60분 이내에 최소 90%가 완료될 수 있다. 반응 조건은, 예를 들어 온도는, 사용된 효소에 따라 다를 수 있다.
반응에 속한 항체의 농도는 10ng/㎕ 내지 10㎍/㎕의 범위 내에, 예를 들어 100ng/㎕ 내지 5㎍/㎕에, 있을 수 있지만 이 범위 밖의 농도도 고려되고 있다.
어떠한 구체예에서는, 글리코시다아제를 더하기 전에 글리코시다아제가 없는 계면활성제로 약 45°C 내지 약 95°C에서 1분 내지 60분, 예를 들어 약 1분, 2분, 3분, 또는 약 5분, 10분, 15분, 또는 30분 이하 동안 전처리가 된 항체를 함유한 혼합물은 글리코시다아제 추가 이후에 실질적으로 완전한 탈당화를 야기한다. 이는, 예를 들어, 실시예 7, 및 17에 제시된다. 하나의 구체예에서는, 전처리 배양은 약 55°C에서 약 15분 동안이다. 다른 구체예에서는, 상기 전처리 배양은 약 80°C에서 약 2분 동안이다(예를 들어, 주위 온도(상온) 내지 약 63°C까지, 탈당화에 적합한 온도의 다양한 범위를 보여주는 도 7a-7b, 도 8, 실시예 7 및 실시예 8 참조). 다른 예에서는, 당화된 항체는 글리코시다아제와 배양하기 전에 선택적으로 DTT와 같은 환원제 및 LS와 같은 투석가능한, 절단할 수 없는 카르복실화된 음이온의 세제 또는 SDC와 같은 담즙산을 포함한 완충제로 전처리 될 수 있다.
실시예는 60분, 30분, 15분, 5분, 4분 및 3분 이내의 항체의 탈당화를 도시한다. 완전한 탈당화는 실온 내지 약 55°C까지의 범위의 온도에서 5분 동안 이루어질 수 있다. 예로, 55°C의 온도를 10분 동안 사용하거나 37°C의 온도를 15분 동안 사용할 수 있으며, 이를 투석가능한, 비-가용성 카르복실화된 음이온의 세제 또는 담즙산과 조합하면 절단를 위한 글리칸의 접근을 허용하는데 충분한 기질 당단백질의 열림(opening)을 야기한다.
몇몇의 구체예에서는, 항체를 주위 온도(약 22°C)에서 탈당화하는 것이 바람직하다. 혼합물의 항체 역시 빠르다는 것은 예상치 못한 발견이었다. 하나의 구체예에서는, 혼합물은 주위 온도에서 약 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 5시간, 10시간, 또는 그에 따른 범위 동안 배양된다. 실시예 8 및 도8은 주위 온도에서 고정된 PNGase F 또는 유리 PNGase F(전처리와 함께 또는 없이)를 사용한 15분, 10분, 5분 또는 그 이내의 급속 탈당화를 보인다. 하나의 구체예에서는, 상기 실온 온도는 약 18°C 내지 약 25°C이다(예: 약 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 또는 그에 따른 범위). 고정된 PNGase F는 바람직하게는 효소 활동 이외의 이유에는 주위 온도에서 사용될 수 있다. 하지만 상기 고정된 PNGase F는 본 명세서에 기술된 어느 더 높은 온도에서도 사용될 수 있다.
항체 샘플 내에 어떤 글리코형이 존재하는지 알아내는 것은 항체가 존재하는 특정 글리코형에 따른 예상대로의 활동 및/또는 반감기를 가질지 알아내는데에 유용하다. 본 발명의 방법은 글리코형의 탈당화에 효과적이다.
주위 온도에서의 탈당화(여기에 나타낸 바와 같이(실시예 16)는 인라인의(in-line) 생산 또는 분석 과정에 특히 바람직하다. 주위 온도 탈당화는 본 명세서에 기술된 방법에서 고정된 PNGase F를 사용하는 하나의 특정한 적용이다.
하나의 구체예에서는, 탈당화된 항체는 절단된 글리칸으로부터 분리(격리, 정제)된다. 예를 들어, 분리 방법은 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 단백질 G 친화성 크로마토그래피, 단백질 L 친화성 크로마토그래피, 등을 포함할 수 있다. 부가적인 분리 방법은, 가르침이 전체로 참조로서 본 발명에 기술된, 2014년 7월 2일에 출원된 미국 가출원번호 62/020,335에 기술된 것과 같은 일반적인(universal) N-글리칸 결합 시약을 포함한다.
글리코형은 크로마토그래피, 전기영동법, 분광분석법 또는 질량 분석법과 같은 어느 표준 기술을 사용하여 알아낼 수 있다. 실시예 14에서는, 상기 글리코형은 질량 분석법으로 확인되었다.
하나의 구체예에서는, 탈당화된 항체 또는 그에 따른 탈당화된 단편, 및/또는 절단된 글리칸은 라벨링되었다. 라벨은 업계-표준이며 대략적인 목록(non-exhaustive list)은 형광 라벨, 방사성 동위원소, 메틸 아세틸, 항체, 또는 그에 따른 조합을 포함한다. 하나의 구체예에서는, 절단된 글리칸은 2-아미노벤즈아미드(2-AB)로 라벨링되었다. 대안으로, 또는 2-AB와 결합하여, 절단된 글리칸은 2-아미노벤조산(안트라닐산; 2-AA)로 라벨링될 수 있다. 유리하게, 앞서 기술된 방법은 혼합물로부터의 생산물의 사전 정제의 필요가 없이 생산물의 직접적인 라벨링(direct labeling)과 양립할 수 있다. 이 구체예의 실례는 실시예 11 및 12에 기술되어 있다. 나아가, 글리칸의 라벨링은 고수성 조건 아래에서 이뤄질 수 있다. 고수성조건이란 최소 또는 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85%(vol/vol) 물인 용액을 말한다. 하나의 구체예에서는, 글리칸은 최소 80%의 물이 있는 데서 라벨링된다.
하나의 구체예에서는, 방법은 약 55°C 내지 약 75°C에서 약 30분 내지 약 3시간의 혼합물 배양을 더 포함한다. 하나의 구체예에서는, 상기 혼합물은 라벨링 시약과 함께 약 30분, 45분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 또는 3시간 동안 배양된다. 하나의 구체예에서는, 상기 혼합물은 라벨링 시약과 함께 약 55°C, 65°C, 65°C, 70°C, 또는 75°C에서 배양된다. 하나의 구체예에서는, 상기 혼합물은 라벨링 시약과 함께 약 65°C에서 약 2시간 동안 배양된다. 라벨링 시약의 예는 플루오레세인 이소티오안산염, 테트라메틸로다민 이소티오안산염, 리사민 로다민 B, 나프탈렌-5-술폰산, Alexa Fluor® 염료(488, 546, 555, 568, 594, 647, 350, 532), Qdot® 형광단(fluorophores), Pacific Blue™, Pacific Orange™, 및 Oregon Green®(전부 Life Technologies, Carlsbad, CA로부터 상업적으로 구매 가능)과 같은 형광 염료(fluorimetric dyes)를 포함한다.
실질적으로 모든 글리칸을 당단백질로부터 비편향적인 방법으로 제거될 수 있다. 예로, N-연결 글리칸은 항체로부터 절단될 수 있고, 분석을 위하여 분리되고 라벨링될 수 있다. 실시예 16에서는, 샘플은 LC/ESI-MS로 분석되었다. 방출된(released) 글리칸은 방출된 클리칸의 사전 분리와, 또는 없이, 라벨링될 수 있다(예: 실시예 16에 기술). 실시예 11에서 더 상세히 기술된 대로, 실질적으로 모든 N-연결 글리칸은 절단될 수 있고, 투 포트 방법에서 라벨링하기 전에 분리되거나(도 11b에 도시), 또는 원 포트 방법에서 분리 없이 직접적으로 라벨링될 수 있다(도 11a에 도시). 라벨링된 글리칸의 전체적인 프로파일은 글리칸이 먼저 분리되었든 아니든 동일했다. 그러나, 글리칸의 절대량은 원 포트 방법에서 상당히 증가했다. 이러한 구체예에서는, 글리칸은 DTT 및 SDC가 있을 때 글리코시다아제(예를 들어 PNGase F)를 사용하여 당화된 항체(예를 들어 단일클론성 IgG 항체)로부터 절단될 수 있다. 또한 원 포트 탈당화 및 라벨링 방법에서 대표적인 예는 LS인, 투석가능한, 절단할 수 없는 카르복실화된 음이온의 계면활성제를 사용하여 유사한 탈당화 결과가 나타났다(실시예 12 및 도 12a-12c 참조). 이는 담즙산염 또는 카르복실화된 계면활성제를 포함하는 글리코시다아제 반응과 글리칸 라벨링 중에 항체 침전을 최소화하는 글라이칸의 직접적일 라벨링과의 예상하지 못한 양립성을 나타낸다.
하나의 구체예에서는, 탈당화된 항체는 동일한 반응 조건 아래에서 테스트된 일치하는 당화된 항체의 항원결정기 결합 결합성 및/또는 친화성과 비교하였을 때, 최소 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 항원결정기 결합 결합성 및/또는 친화성을 유지한다. 항원결정기 결합 결합성 및/또는 친화성은 웨스턴 블롯검사, ELISA, 바이아코어(Biacore), 등과 같은 본 발명이 속하는 업계의 표준 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 항체가 완전히 탈당화되었고 그의 활동은 항원결정기 결합을 유지하였는지 웨스턴 블롯검사로 확인되었다(실시예 13 및 19, 도 13c 및 18c 참조). 본 방법의 구체예는 어느 당화된 항체 종류(class) 또는 아이소타입(isotypes)에도 적용될 수 있다. 실시예 13 및 15에 기술되었듯이, 모든 항체는 실질적으로 탈당화된 형태로 성공적으로 탈당화될 수 있다(도 13a-13c, 및 도 15a-15b 또한 참조).
하나의 구체예에서는, 트립신과 같은 단백질 분해효소는 글리코시다아제의 활동에 상당한 손실이 없이 PNGase F와 같은 글리코시다아제를 함유한 반응 혼합물에 더해질 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 글리코시다아제가 글리칸을 단일 반응에서 제거할 때 항체를 펩티드 단편으로 절단할 수 있다. 적합한 단백질 분해효소의 예는 다음을 포함한다: 트립신, GluC, AspN, 단백질 분해효소 K, Xa인자, 엔테로키나아제(New England Biolabs, Ipswich, MA), LysC, Arg-C, (Promega, Madison, Wl), LysN(Life Technologies, Carlsbad, CA), IdeS(Genovis, Cam bridge, MA), V-8 단백 분해효소, 파파인, 알파-리틱 단백질 분해효소, 피로글루타메이트 아미노펩티다스(Pyroglutamate Aminopeptidas), 류신 아미노펩티다아제, 메티오닌 아미노펩티다아제, 아미노펩티다아제 I, 아미노펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제(A, B, G, Y), 펩신, 카텝신(B, C, D), α-키모트립신(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), TEV, 트롬빈, IdeZ 및 IdeE(New England Biolabs, Ipswich, MA).
하나의 구체예에서는, 반응물질은 탈당화에 악영향을 미치는 것 없이 사용 전에 동결건조될 수 있다.
또한 제공된 것은 키트(kit)이다. 하나의 구체예에서는, 상기 키트는 하나 이상의 동결건조된 시약을 포함한다. 하나의 구체예에서는, 상기 동결건조된 시약은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 동결건조된 PNGase F와 같은 동결건조된 글리코시다아제; 동결건조된 완충제로, 상기 완충제가 담즙산, 또는 그에 따른 염을 포함하는 것, 카르복실화된 음이온의 계면활성제, 또는 그에 따른 염, 또는 그에 따른 조합물; 동결건조된 환원제; 및 그에 따른 조합물. 담즙산염, 투석가능한, 절단할 수 없는 카르복실산염 음이온의 계면활성제, 및 그에 따른 염은 앞서 기술되었다. 부가적으로 또는 대안으로, 상기 키트는 고정된, PNGase F와 같은 글리코시다아제를 포함한다. 실례가 되는 동결건조된 시약, 고정된 PNGase F, 및 그를 사용하는 방법은 실시예에 기술되어 있다(실시예 8 및 14 참조). 하나의 구체예에서는, 상기 키트는 글리칸 라벨링 시약, 제어 표준, 및 사용설명서로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 구성요소를 더 포함한다. 하나의 구체예에서는, 하나 이상의 시약은 동물-유래 생산물을 실질적으로 가지고 있지 않다. 다른 구체예에서는, 예를 들어 트립신과 같은, 단백질 분해효소가 키트에 포함될 수 있고, 상기 단백질 분해효소는 글리코시다아제 및/또는 반응 완충제와 함께 또는 별개로 동결건조될 수 있다.
본 명세서에 항체 또는 그에 따른 탈당화된 단편으로 제시된 탈당화된 단백질 준비를 위한 시약 및 방법의 예는, 제한하려는 의도가 아니라 본 발명의 구체예를 제시하기 위함이다. 구체예는 항체 단편을 포함하는 항체에 제한되지 않는, 어느 당화된 단백질에 적용가능하다. 당단백질로부터 실질적으로 전부 연결된 글리칸을 얻기 위한 시약 및 방법의 예는 시험관 내 분석의 결과이며, 체내에서 발생할 수 있는 것과 같은, 자연적으로 발생하는 혼합물 또는 일을 구성하거나, 그로 해석되거나 그를 의도한 것이 아니다. 탈당화 방법의 구체예는 항체 또는 그에 따른 단편 및 글리칸을 포함하는 혼합물의 글리칸의 사전 정제가 없는, 항체의 단편을 포함하는 항체와 같은 단백질으로부터 절단된 글리칸의 직접적인 라벨링과 양립할 수 있다. 대안으로, 항체의 탈당화된 단편을 포함하는 항체와 같은 탈당화된 단백질은 단백체 분석(proteomic analysis) 전에 투석, 드롭 투석(drop dialysis), 분자체에 의한 여과, 또는 고체 상태 추출을 포함하는 어느 적합한 방법으로 더 처리될 수 있다. 글리칸 또한, 바람직하다면, 예를 들어, 정상 또는 역상(C18, 흑연 탄소, HILIC)의 고체 상태 추출로 더 처리될 수 있다. 주위 온도에서의 샘플 처리를 가능하게 하는 방법 및 시약 또한 제공된다. 그러한 방법 및 시약은 공업 생산에 적용에서 인라인 샘플 분석에 특히 유용하다.
아래는 식물, 곤충, 연체동물 및 유충류에서 재조합으로 만들어진 단백질로부터 N-글리칸을 제거하는데 적합한 알파1,3 푸코스를 절단하는 아몬드로부터 유도된 새로운 PNGase의 서술이다. 이러한 글리코-항원결정기(glyco-epitope)는 인간과 그 외 척추동물에도 없으며, 그렇기 때문에 인간에서 알레르기성의(allergenic) 또는 면역성의 반응과 연루되어 왔고, 식물 또는 곤충으로부터 유도된 재조합 치료적 단백질의 빠른 제거율의 요인일 수 있다(Bardor, et al., Current Opinion Structural Bio. 16:576-583(2006)). 아몬드 유래 글리코시다아제는 N-탈당화된 이질이합체로서 자연에서 발견된다. 본 발명의 구체예에서는, 이는 단쇄 탈당화된 폴리펩티드로서 사용된다. 이는 PNGase F의 예에서 기술된 제제에 있는 다른 글리코시다아제와 유사한 정도로 효과적인 것으로 나타났다.
Figure pat00001
식물 유래 글리코시다아제(PNGases)의 예
본 발명의 구체예에서는, PNGase는 앞서 기술된 대로 사용되었고 다음 서열의 최소 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 상동성을 가졌다:
*AAVPHRHRLPSHHLASLKLNASAPPTTYFEVDRPIRPPRGSVGPCSTLLLSNSFGATYGRPPVTAAYAPPSCLAGGGGGGGGASSIALAVLEWSADCRGRQFDRIFGVWLSGAELLRSCTAEPRATGIVWSVSRDVTRYAALLAEPGEIAVYLGNLVDSTYTGVYHANLTLHLYFHPAPPPPPPPQQADLIVPISRSLPLNDGQWFAIQNSTDVQGKRLAIPSNTYRAILEVFVSFHSNDEFWYTNPPNEYIEANNLSNVPGNGAFREVVVKVNDDIVGAIWPFTVIYTGGVNPLLWRPITGIGSFNLPTYDIDITPFLGKLLDGKEHDFGFGVTNALDVWYIDANLHWLDHKSEETTGSLISYEAQGLVLNVDSGFSGLDGQFVTSASRHISATGLVKSSYGEVTTNFYQRFSYVNSNVYSKNGSVQVVNQTIDAKSGVFAKDALAVLLSEELHQIFPLYVYTGTSDEEADEYTLISHVKLGVNEKETSGGKMGFSYNSLRNAQSAHGSMKVKKNLVVGGLGETHQAYKYVGADGCYFRDVRSKNYTVLSDHSGDSCTKRNPYNGAKFSLRNDQSARRKLMVNNL(SEQ ID N0: 1).
비-자연 숙주 세포에서 클론된 선택된 PNGase의 발현 레벨 및 활동과 같은 특성을 더 향상시키기 위하여, 변이는 단백질의 이염기성의 부위를 표적할 수 있고, 예를 들면, 기본 아미노산은 어느 다른 아미노산, 특히 동일한 생물체에서의 다른 아이소형(isoforms)에 동일한 위치에서 관측되는 것으로 전환될 수 있다. 이염기성의 부위에 치환에 선택된 아미노산은 나선 또는 β 시트(sheet)와 같은 어느 2차 구조에 지장을 주지 않도록 만들어질 수 있다. 이러한 잠재적인 구조는 Jpred3와 같은 컴퓨터 프로그램으로 식별된다(Cole, et al., Nucleic Acids Research, 36(suppl 2):W197-W201(2008)).
선택된 PNGase는 비-동족(non-cognate) 숙주 세포에서 단일 폴리펩티드로 발현했고, 동물 세포 또는 이스트, 배큘로바이러스/곤충 세포에서 발현했을 때는 재조합 PNGase 자체가 N-연결 글리칸으로 변형이 되었다.
정제의 편이를 위하여, PNGase가 숙주 세포의 용해물로부터 정제될 수도 있지만 이스트와 같이 PNGase를 분비할 수 있는 숙주 세포가 선택되었다. 식물 PNGase를 발현시키는데 적합한 숙주 세포의 예는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis(K. lactis)) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris(P. pastoris))와 같은 이스트를 포함할 수 있다. PNGase가 비천연-숙주 세포에서 고 만노스 N-연결 글리칸과 융합되는데에, 이는 바람직하게 엔도 H와 같은 적합한 고 만노스 N-연결 글리칸 절단 효소를 사용하여 탈당화된다.
α1,3 푸코스를 함유한 N-연결 글리칸을 위한 식물 PNGase의 활동은 상기 N-연결 글리칸이 먼저 단백질을 펩티드로 절단할 필요가 없이 자세히 설명된 어느 기질을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, HRP 및 파인애플 브로멜라인은 완전히 특성화된(fully characterized) α1,3 푸코스를 함유한 N-연결 글리칸을 가졌다. 이러한 단백질에 있는 글리칸은 실질적으로 모두 α1,3 글리코시드 결합을 통해 푸코스 및 두 만노스(브로멜라인) 또는 제1 만노스가 자일로스에도 연결된 세 만노스(HRP)에 연결된 제2 GlcNAc에도 연결된 GlcNAc를 가졌다. 반면, 달팽이 헤모시아닌 및 인간 IgG는 α1,6 글리코시드 결합을 통해 푸코스에 연결된 GlcNAc를 가진다. HRP 및 파인애플 브로멜라인 모두 유용한 글리코시다아제에 의한 α1,3 푸코스를 함유한 N-연결 글리칸의 절단 분석을 위한 당단백질 기질이다. 이러한 당단백질은 색이 있는 또는 형광의(fluorimetric) 신호를 생산하는 라벨에 손쉽게 접합할 수 있다. 형광 염료의 예로는 다음이 있다: 플루오레세인 이소티오시안산염, 테트라메틸로다민 이소티오안산염, 리사민 로다민 B, 나프탈렌-5-술폰산, Alexa Fluor® 염료(488, 546, 555, 568, 594, 647, 350, 532) Qdot® 형광단(fluorophores), Pacific Blue™, Pacific Orange™, 및 Oregon Green®.
아몬드로부터 정제된 PNGase 디펩티드 및 쌀로부터 클론된 재조합 모노펩티드 PNGase Ar의 특정 활동 및 K. lactis 또는 P. pastoris에 발현은 500,000 내지 600,000유닛/단백질 mg(units/mg of protein)만큼일 수 있다. 한 유닛은 10㎕의 총 반응부피에 37°C에서 1시간 동안 10㎍의 변성된 Nase B로부터 >95%의 탄수화물을 제거하는데 필요한 효소의 양이다.
α1,3 푸코스를 함유한 N-글리칸을 탈당화하고 이러한 N-글리칸을 특성화하는 능력은 많은 용도를 가진다. 이는 치료적 단백질의 특성화를 위한 연방 법규 요구조건을 충족시키는 것을 포함한다. 덧붙여, N-글리칸 제거는 이러한 치료적 단백질 투여의 원치 않는 부작용을 줄일 수 있다. 응용의 예는 아래에 제공되었다.
HRP는 특정 기질과 배양했을 때 라벨된 분자의 색이 있는, 형광의, 또는 발광성의 유도체를 생산하고, 이는 검출 및 수량화될 수 있게 한다. HRP는 표적 분자의 존재를 검출하기 위하여 흔히 접합체(유전적으로 또는 화학적으로 연결된 분자)로 사용된다. 예를 들어, HRP에 접합된 항체는 웨스턴 블롯검사에서 소량의 특정 단백질을 검출하는데 사용될 수 있다. 교차반응성을 방지하기 위하여, 본 명세서에 기술된 방법의 구체예를 사용하여 PNGase로 탈당화된 HRP에 대비하여 준비(prepared against)될 수 있다.
개별화된 백신은 림프종 치료를 위하여 단백질을 사용하여 개발되었다. 이러한 단백질의 탈당화는 바람직하다. 비호지킨림프종을 위한 백신은 담배(tobacco plant)에서 생산되었고, 여기서의 N-글리칸의 제거는 α1,3 푸코스를 수반한다(McCormick, et al., PNAS, 105:10131-10136(2008)). PNGase Ar은 온전한(intact) 탈당화된 단백질의 활동이, 탈당화에서 생기는 이점을 가지고, 당화된 단백질과 동일한지 분석을 하는데에 사용될 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 참조자료는 2014년 5월 30일에 출원된 미국특허 가출원 제62/005,559호, 2014년 6월 27일에 출원된 미국특허 가출원 제62/018,074호, 2014년 7월 8일에 출원된 미국특허 가출원 제62/021,936호, 2014년 8월 22일에 출원된 미국특허 가출원 제62/040,745호, 및 2014년 11월 17일에 출원된 미국특허 가출원 제62/080,480호를 포함한다.
[실시예]
실시예 1: PNGase F 처리 전에 항체의 온열만에 의한 전처리는 완전히 탈당화된 항체를 생산하지 않는다
IgG의 농축된 샘플의 준비: 안티-MBP 단일클론성 항체의 부분표본(Aliquots)(New England Biolabs, Ipswich, MA)은 동결건조되었고 250㎕의 물(200mM NaCI, 4mM EDTA, 40mM Tris pH 7에 최종 농도 4㎍항체/㎕를 생산)에 재현가되었다. 농축된 IgG(36㎍)는 27㎕의 총 용량까지 물로 희석되었다. 샘플은 10분간 55°C까지 열을 가하고, 그리고 4°C로 유지되었다. 모든 샘플에 3㎕의 무-세제 완충제가 더해졌다. 대조 반응은 어느 탈당효소(deglycosylating enzyme)도 함유하지 않았으나, 각각의 탈당화 실험 샘플에는 1㎕의 Rapid PNGase F가 더해졌다. 반응들은 37°C에서 1시간 또는 16시간 동안 배양된 후 더 분석되기 전까지 4°C로 유지되었다. ESI-TOF로 IgG의 온전한 질량(mass)을 측정하기 위하여, 탈당화된 IgG 샘플은 실온에서 30분간 10mM DTT으로 처리되었고, 0.1%로 포름산이 더해졌다. 샘플은 PLRP-S(5㎛ 입자, 1000 A 공극 크기)을 사용한 역상 액체 크로마토크래피(LC) 및 본 발명이 속한 업계에 알려진 방법을 사용한 전자분무 이온화 비행시간 질량분석법(ESI-TOF MS)으로 분석되었다. 결과는 도 1a-1c에 제시되어 있다.
실시예 2: PNGase F 처리 전에 가열변성과 환원제를 결합한 항체의 전처리는 완전히 탈당화된 항체를 생산하지 않는다
농축된 IgG 샘플은 실시예 1에 기술된 대로 준비되었다. 단일클론성 IgG(36㎍)는 27㎕의 용량까지 40mM DTT에 희석되었다. 샘플은 55°C에서 10분간 배양되고, 그 이후 3㎕의 반응완충제(500mM 인산 나트륨 pH 7.5)가 더해졌다. 음성대조구는 어느 탈당효소를 함유하지 않았으나, 각각의 탈당화 실험 샘플은 500U의 PNGase F 글리세롤 프리(Free)가 더해졌다. 반응들은 37°C에서 1시간 또는 16시간 동안 배양된 후 더 분석되기 전까지 4°C로 유지되었다. 무-세제 IgG 샘플의 온전한 질량은 실시예 1에 기술된 대로 ESI-TOF로 분석되었다. 결과는 도 2a-2c에 제시되어 있다.
실시예 3: PNGase F 탈당화 전에 상업 시약 RapiGest™으로 처리하는 것은 완전히 탈당화된 항체를 생산하지 않는다
농축된 IgG 샘플은 실시예 1에 기술된 대로 준비되었다. 단일클론성 IgG의 부분표본(64㎍)은 20㎕의 총 용량까지 0.1% RapiGest™으로 재수화(rehydrated)되었다. 샘플은 10분간 55°C에서 배양되었고, 그 이후, 10㎕의 반응완충제. 대조 반응은 어느 탈당효소도 함유하지 않았으나, 각각의 탈당화 실험 샘플에는 1㎕의 Rapid PNGase F가 더해졌다. 반응들은 37°C에서 1시간 동안 배양되었다. 무-세제 IgG 샘플의 온전한 질량은 실시예 1에 기술된 대로 ESI-TOF로 분석되었다. 결과는 도 3a-3b에 제시되어 있다.
실시예 4: 다양한 농도에서 카르복실화된 계면활성제를 사용하는 항체의 완전한 탈당화
안티-MBP 쥐의 단일클론성 IgG 36 ㎍(New England Biolabs, Ipswich, MA)은 20㎕의 총 용량까지 여러 양의 DTT(0.2 내지 80mM의 범위의 최종농도) 및 여러 양의 LS(0.05 내지 5% w/v 범위의 최종농도)와 혼합되었다. 대조 반응은 어느 탈당효소도 함유하지 않았다. 1㎕의 Rapid PNGase F가 다른 모든 샘플에 더해졌고, 50°C에서 5분간 배양되었다. 각각의 샘플의 부분표본은 SDS-PAGE을 통해 분리되었고 SimplyBlue™ SafeStain(Life Technologies, Carlsbad, CA)으로 시각화되었다.
SDC의 다양한 농도(예: 약 0.05% 내지 약 5% w/v 사이의 범위)를 사용하여 유사한 실험이 반복되었다(데이터는 제시되지 않음). 탈당화는 약 50°C에서 5분 또 그 이내에, 당화 샘플의 열 전처리와 함께 또는 없이, 이뤄졌다. 완전한 탈당화는 약 2% 내지 5% SDC 범위에서 나타났다. 결과는 도 4a-4c에 제시되어 있다.
실시예 5: 다양한 농도의 환원제 DTT를 사용하는 항체의 완전한 탈당화
안티-MBP 쥐의 단일클론성 IgG(36㎍, New England Biolabs)는 20㎕의 총 용량까지 여러 양의 DTT(0 내지 0.1mM의 범위의 최종농도) 및 LS(0.5% w/v의 최종농도)와 혼합되었다. 대조 반응은 어느 탈당효소도 함유하지 않았다. 1㎕의 Rapid PNGase F가 다른 모든 샘플에 더해졌고, 50°C에서 5분간 배양되었다. 각각의 샘플의 부분표본은 SDS-PAGE을 통해 분리되었고 SimplyBlue SafeStain으로 시각화되었다. 결과는 도 5a-5d에 제시되어 있다.
실시예 6: 다양한 농도의 환원제, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)을 사용하는 항체의 완전한 탈당화
안티-MBP 쥐의 단일클론성 IgG(36㎍)는 20㎕의 총 용량까지 여러 양의 TCEP(0 내지 20mM의 범위의 최종농도) 및 LS(0.5% w/v의 최종농도)와 혼합되었다. 대조 반응은 어느 탈당효소도 함유하지 않았다. 1㎕의 Rapid PNGase F가 다른 모든 샘플에 더해졌고, 50°C에서 5분간 배양되었다. 각각의 샘플의 부분표본은 SDS-PAGE을 통해 분리되었고 SimplyBlue SafeStain으로 시각화되었다. 결과는 도 6에 제시되어 있다.
실시예 7: 다양한 온도를 사용하는 항체의 완전한 탈당화
*안티-MBP 쥐의 단일클론성 IgG(36㎍)의 열여섯 개의 샘플은 20㎕의 총 용량까지 DTT(20mM의 범위의 최종농도) 및 LS(0.5% w/v의 최종농도)와 혼합되었다. 덧붙여, 안티-MBP 쥐의 단일클론성 IgG(36㎍)의 제2 세트의 16개의 샘플은 완충제에서 20㎕의 총 용량이 되도록 DTT(4mM의 범위의 최종농도) 및 SDC(2% w/v의 최종농도)와 혼합되었다. 여덟 LS-함유 샘플 및 8 SDC-함유 샘플은 1㎕의 Rapid PNGase F을 더하기 전에 샘플을 50°C에서 5분간 전-배양하는 것(pre-incubating)으로 두 단계 반응에서 처리되었다. 1㎕의 Rapid PNGase F는 한 단계 반응에서 전-배양 없이 남은 8 LS-함유 샘플 및 8 SDC-함유 샘플에 더해졌다. 대조구(해당 LS 또는 SDC 완충제에 별도의 IgG 샘플)는 어느 PNGase F도 함유하지 않았다. 모든 샘플은(50°C에서 전처리된; 또는 전처리되지 않은) 8단계 온도 구배(8-point temperature gradient)(38°C에서 63°C까지)가 프로그램된 서모사이클러(thermocycler)에서 5분간 배양되었다. 각각의 샘플의 부분표본은 SDS-PAGE을 통해 분리되었고 SimplyBlue SafeStain으로 시각화되었다. 결과는 도 7a-7b에 제시되어 있다.
실시예 8: 주위 온도에서의 항체의 완전한 탈당화
항체는 프리(Free) Rapid PNGase F 또는 고정된 형태의 재조합 PNGase F를 사용하여 약 5, 10, 및 15분 내에 주위 온도에서 완전히 탈당화될 수 있다. 고정(immobilization)은 PNGase F의 융합 단백질을 사용하였고, 상기 PNGase F는 SNAP-Tag®(New England Biolabs, Ipswich, MA)을 통하여 융합되었고, 결과적으로 이는 벤질구아닌 아가로스 비즈(benzylguanine agarose beads)에 공유결합되었다. 본 명세서에서는 아가로스 비즈가 사용되었으나 본 발명이 속한 업게에 알려진 어느 적합한 매트릭스라도 사용될 수 있다.
안티-MBP 쥐의 모노클론성 IgG(100㎍)의 샘플은 0.5% LS 및 20mM DTT와 혼합되었고, 37°C에서 15분간 배양되었다. 샘플은 PNGase F HS-BG 아가로스 비즈를 함유한 컬럼에 로딩되었다. 반응은 약 22°C에서 5, 10, 또는 15분간 배양되었다. 가용성 (프리) PNGase F를 사용한 대조 반응은 동일한 조건 아래에서 실행되었다. 음성대조구("안티-MBP -")는 효소로 처리되지 않았다.
고정된 PNGase F 또는 가용성 Rapid PNGase F 처리는 IgG의 중쇄의 완전한 탈당화와 일치하는 SDS-PAGE에서의 이동성 변화를 야기했다. 대조구 및 탈당화된 항체 샘플의 온전한 질량은 실시예 1에서 기술된 대로 ESI-TOF로 분석되었다. 결과는 도 8에 제시되어 있다.
실시예 9: 실질적으로 탈당화된 항체를 생산하기 위한 3분 또는 그 이하 내의 항체의 탈당화
안티-MBP 쥐의 단일클론성 IgG(36㎍)는 완충제를 포함하여 20㎕의 총 용량까지 DTT(20mM의 최종농도) 및 LS(0.5% w/v의 최종농도)와 혼합되었다. 대조 반응은 어느 PNGase F도 함유하지 않았다. 다른 모든 샘플에는, 1㎕의 Rapid PNGase F가 더해졌다. 샘플은 50°C에서 1 내지 5분간 배양되었다. 각각의 샘플의 부분표본은 SDS-PAGE을 통해 분리되었고 SimplyBlue SafeStain(Life Technologies)으로 시각화되었다. 결과는 도 9에 제시되어 있다. 완전한 탈당화는 3분 이내의 배양 시간에서 관측되었다.
실시예 10: 비편향된(unbiased) N-글리칸 조성물을 생산하기 위하여 항체로부터 실질적으로 모든 N-연결 글리칸을 절단
농축된 IgG 샘플은 실시예 1에 기술된 대로 준비되었다. 단일클론성 IgG는, 2% SDC가 있을 때, 20㎕의 총 용량까지 4mM DTT와 혼합되었다. 1㎕의 Rapid PNGase F 및 37°C도에서 4시간의 제2 배양이 뒤를 잇는 전처리에서 10분간 55°C까지 열이 가해졌다. 방출된 당은 건조된, 그리고 2-아미노벤즈아미드(2AB)로 라벨링된 흑연 카트리지로 고체 상태 추출(SPE)에 의하여 분리되었다. 샘플은 LC/ESI-MS에 의해 분석되었고, 글리칸 과다(abundance)는 형광 채널(fluorescent channel)에 피크 적분(peak integration)으로 추산되었다. 글리칸 구조는 그의 정체시간(형광 흔적(trace)) 및 그의 해당하는 m/z 값에 따라 수동으로 부여되었다. 결과는 도 10a-10b에 제시되어 있다.
실시예 11: 담즙산염이 있을 때 사전(prior) 글리칸 정제 없이 항체로부터 방출된 글리칸의 직접적인 형광 라벨링
*안티-MBP 단일클론성 항체의 부분표본(14㎍)은 총 용량 20㎕에서 2% SDC, 및 4mM DTT에 현탁되었다. 1㎕의 Rapid PNGase F가 각각의 탈당화 샘플에 더해졌다. 반응들은 50°C에서 15분간 배양되었고 그 이후 유리된(liberated) 글리칸은 동일한 반응 용기(원 포트)에서 2-아미노벤즈아미드(2AB)으로 직접으로 라벨링되거나, 또는 SPE에 의하여 정제되고 실시예 12에 기술된 대로 건조되었다(투 포트). 신선한(fresh) 라벨링 용액(20㎕, 2AB, 사이아노보로하이드라이드 나트륨(sodium cyanoborohydride) 및 아세트산을 함유)이 건조된 글리칸에, 또는 탈당화 반응(고수성 라벨링 조건)에 직접적으로 더해졌다. 고수성조건이란 최소 또는 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85%(vol/vol) 물을 가진 반응을 말한다. 라벨링 반응은 65°C에서 2시간 동안 배양되었고, 그 이후, N-글리칸은 HILIC SPE에 의하여 결합이 풀린(unbound) 라벨을 제거하는 처리가 되었고, LC-MS에 의하여 분석되었고, 결과는 도 11a-11b에 제시되어 있다. 담즙산염 대신에 투석가능한, 절단할 수 없는 카르복실화된 음이온의 계면활성제를 사용하여 유사한 결과를 얻었다(실시예 12 참조).
실시예 12: 카르복실화된 음이온의 계면활성제가 있을 때 사전 글리칸 정제 없이 항체로부터 방출된 글리칸의 직접적인 형광 라벨링
치료적 단일클론성 IgGs 및 IgG 융합 단백질(리툭시맵, 세툭시맵, 에타네르셉트)은 실시예 9에 기술된 대로, 완전한 탈당화를 위하여, 약 5분간 20mM DTT, 0.5% LS 및 Rapid PNGase F로 탈당화되었다. 그 직후, 라벨링 혼합물(환원적인 아미노화(reductive amination)를 위한 시약 함유)이 더해졌고 65°C에서 2시간 더 배양되었다. 라벨링 반응은 고수성조건 아래에서 실행될 수 있다(앞서 기술됨). 고수성조건은 >60%, 바람직하게는 최소 또는 약 80%의 물을 포함한다. 형광으로 라벨된 글리칸은 HILIC SPE 정제가 행하여졌고, HPLC-MS에 의하여 분석되었다. 결과는 도 12a-12c에 제시되었다.
실시예 13: 단일클론성 항체 활동은 환원 조건 아래 있는 라우로일사르코신(lauroylsarcosine)이 있을 때의 탈당화 이후 유지된다
실시예 1에 기술된 대로의 농축된 IgG 샘플이 사용되었다. 단일클론성 IgG(36㎍)는 총 용량 20㎕에서 4mM DTT 및 0.5% LS와 혼합되었다. 대조 반응은 어느 탈당효소도 함유하지 않았다. 각각의 탈당화 실험 샘플에는 1㎕의 Rapid PNGase F가 더해졌고 50°C에서 5분간 배양되었다. IgG 샘플의 온전한 실량은 ESI-TOF로 분석되었다.
온전한, 탈당화된 단일클론성 IgG의 기능성 활동을 측정하기 위하여, 안티-MBP-단일클론성 항체가 MBP-엔도 H 융합 단백질(Endo Hf, New England Biolabs, Ipswich, MA)을 사용해 웨스턴 블롯검사에서 그에 일치하는 항원(말토스 결합 단백질, MBP)을 상대로 분석되었다. Endo Hf의 순차적 희석(serial dilutions)의 웨스턴 블롯검사는 PVDF 막(Immobilon-P Millipore, Billerica, MA)에 준비되었고 그리고 탈당화된 안티-MBP 쥐의 단일클론성 항체(앞서 기술된 비-항원 조건 아래에서 PNGase F로 처리된)나 당화된 안티-MBP 쥐의 탄일클론성 항체(Rapid PNGase F로 처리되지 않은)로 면역 블롯(immunoblotted)되었다. 결과는 도 13a-13b에 제시되었다.
실시예 14: 완충제 및 PNGase F는 탈당화된 항체를 생산하기 위하여 개별적으로 또는 결합하여 동결건조될 수 있다
0.5% LS 및 20mM DTT를 함유한 Rapid PNGase F 및 반응 완충제는 함께("마스터 혼합물") 또는 개별적으로 동결건조되었다. 동결건조된 마스터 혼합물의, 또는 개별적으로 동결건조된 완충제 및 Rapid PNGase F의 활동을 테스트하기 전, 각각의 구성요소는 재수화되었다. 각각의 효소-완충제 혼합물은 IgG 샘플에 더해졌다. 음성대조 반응은 50㎕의 신선한 0.5% LS 및 20mM DTT에 36㎍의 항체를 함유했다. 양성대조 반응은 2㎕의 Rapid PNGase F를 제외하고는 음성대조 반응과 동일했다. 모든 반응은 50°C에서 5분간 배양되었다. 각각의 샘플의 부분표본은 SDS-PAGE을 통해 분리되었고 SimplyBlue SafeStain으로 시각화되었다. 실시예 4 및 5에 기술된 대로 건조된 마스터 혼합물 또는 담즙산염을 함유한 건조된 반응 완충제에 LS를 SDC와 같은 담즙산염(예: 2% SDC 및 8mM DTT)으로 치환하는 것으로 유사한 결과를 얻을 수 있다. 결과는 도 14a-14b에 제시되었다.
실시예 15: 한 단계 또는 두 단계의 완전한 탈당화는 항체 아이소타입(isotypes)에 비-특이적이다(non-specific)
완전한 탈당화의 전반적인 효과는 항체의 11가지의 다른 아이소타입(isotypes)을 사용하여 보여졌다. 치료적 항체 리툭시맵의 가변부위를 특징으로 하는 안티-hCD20 아이소타입(isotypes) 콜렉션(isotype collection)은 Invitrogen(San Diego, CA)으로부터 구했다. 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4, 인간 IgM, 인간 IgA1, 인간 IgA2, 인간 IgE, 뮤린 IgG1, 뮤린 IgG2a 및 뮤린 IgA로 구성된 정제된 아이소타입(isotypes)은 최종 농도 1mg/ml에서 준비하는데 사용되었다. 각각의 아이소타입(isotypes)을 위하여 두 개의 탈당화 반응이 준비되었다. 음성대조 반응은 완충제와 혼합된 16㎍의 항체를 포함했고, 이는 총 20㎕에 0.5% LS, 및 20mM DTT의 최종 농도를 낸다. 반응들은 1㎕의 Rapid PNGase F 추가를 제외하고는, 음성대조구와 동일했다. 모든 반응들은 50°C에서 10분간 배양되었다. 각각의 샘플의 부분표본은 SDS-PAGE을 통해 분리되었고 SimplyBlue SafeStain으로 시각화되었다(도 15a-15b 참조). LS 대신에 2% SDC를 포함한 완충제 사용하여 유사한 결과를 얻었다.
아이소타입(isotypes)에 비-특징적인 두 단계의 완전한 탈당화 반응이 일어난다. 두 단계 반응은 글리칸을 효소적으로 절단하기 전 짧은 열 전처리를 포함한다. 상기 열 전처리의 온도 및 시간은 달라질 수 있으며, 일반적으로 더 짧은 시간은 더 높은 온도와 병행될 수 있다. 여기에서, 상기 전처리 시간은 1 또는 2분만큼 짧을 수 있고, 상기 온도는 약 95°C까지일 수 있다. 본 실시예에서는, 담즙산염 또는 카르복실화된 음이온의 계면활성제를 함유한 완충제에 있는 안티-hCD20 아이소타입(isotypes) 콜렉션 항체는 Rapid PNGase F를 더하고 혼합물을 50°C에서 10분간 배양하기 전에 80°C에서 약 2분간 전처리되었다. 완전한 탈당화는 SDS-PAGE 또는 본 발명이 속한 업계-표준 기술에 의하여 확인되었다.
실시예 16: 항체 생산중에 주위 온도 인라인 분석
항체의 대규모 생산은, 예를 들어 상업적 또는 치료적 항체 생산을 위해 사용되는 것은, 인라인 분석에 적합한 분석 과정이 필요하다. 생산중에, 항체는 당화된 항체의 글리칸 프로파일을 모니터하기 위하여 세포 배양중에 복수의 시점(time points)에서 분석돼야할 수도 있다. 본 실시예에서는, 항체 배양의 샘플은 하나 이상의 시점에서 생물반응기로부터 무균적으로(aseptically) 빼내어 고정된 PNGase F를 포함하는 장치에 로딩(loaded)되었다. 상기 장치는 고정된 PNGase F를 가진 비즈로 채워진 컬럼이었다. 대안으로, 미세유체역학 장치가 샘플과 접촉하는 표면에 고정된 PNGase F와 함께 사용될 수 있다. 상기 장치는 사전-로딩되거나 또는 나중에 본 명세서에 기술된 완충제로 로딩될 수 있다. 0.5% LS, 20mM DTT, 또는 2% SDC, 20mM DTT가 완충제로 사용되었다. 상기 장치 안의 샘플은 용리하고 그리고 용리액을 항체 및/또는 글리칸 조성물의 무당화(aglycosylation) 분석을 하기 전에 15분 또는 그 이하(예: 10분, 5분, 또는 그 이하) 동안 반응하도록 했다. 도 8은 고정된 PNGase F가 동일한 완충제에 있는 가용성 PNGase F만큼 효과적인 것을 나타냈다.
실시예 17: 50°C에서 5분 이내의, 환원제가 있을 때 완전한 탈당화를 위한 PNGase F/IgG 비율(도 16a-16b 참조)
50°C에서 5분간의 한 단계 반응을 사용하여 PNGase F 대 항체의 효과적인 비율을 측정하기 위하여, 안티-MBP 쥐의 단일클론성 IgG(36㎍)의 샘플은 10㎕의 완충제에, LS(최종 농도 0,5% w/v)와 함께 또는 없이, DTT(20mM)와 혼합되었다. 대조구는 어느 탈당효소도 함유하지 않았다. 재조합 PNGase F 스톡(8000 유닛/㎕)의 두 배 희석(two-fold dilutions)은 50°C에서 5분간 배양된(한 단계, 동시의 온열 및 탈당화) 샘플에 더해졌다. 각각의 튜브로부터의 부분표본은 샘플 완충제와 혼합되고, 열이 가해지고, 그리고 Novex® 10-20% 트리스 글리신 겔(Life Technologies, Carlsbad, CA)에 로딩되었다. 전기영동 이후, 상기 겔은 밴드를 시각화하기 위하여 SimplyBlue SafeStain으로 염색되었다(도 16a-16b 참조).
완전한 탈당화를 위한 비율은 50°C에서 5분 동안 10㎕의 반응부피에서 1㎍의 IgG를 완전히 탈당화하는데 필요한 PNGase F의 유닛의 최소량으로 정의된다.
실시예 18: 두 단계 반응에서, 환원제 없이 완전한 탈당화를 위한 PNGase F/IgG 비율
두 단계 반응은 환원제의 부제에서 PNGase F 대 항체의 효과적인 비율을 측정하기 위하여 사용되었다. 안티-MBP 쥐의 단일클론성 IgG의 샘플은 10㎕의 완충제에, LS(최종 농도 0,5% w/v)와 결합하거나 하지 않았다. 샘플은 75°C에서 5분간 배양되었다. 대조구는 어느 탈당효소도 함유하지 않았다. 재조합 PNGase F 스톡(8000 유닛/㎕)의 두 배 희석(two-fold dilutions)은 50°C에서 5분간 배양된 샘플에 더해졌다. 각각의 튜브로부터의 부분표본은 샘플 완충제와 혼합되고, 열이 가해지고, 그리고 Novex® 10-20% 트리스 글리신 겔에 로딩되었다. 전기영동 이후, 상기 겔은 밴드를 시각화하기 위하여 SimplyBlue SafeStain으로 염색되었다(도 17a-17b 참조).
비-환원 조건 아래에서의 완전한 탈당화를 위한 비율은 50°C에서 5분 동안 10㎕의 반응부피에서 1㎍의 IgG를 완전히 탈당화하는데 필요한 PNGase F의 유닛의 최소량으로 정의된다. 도 16a-16b 및 도 17a-17b의 결과는 투석가능한, 절단할 수 없는 카르복실화 음이온의 계면활성제의 존재가 두 단계 반응에서 완전한 탈당화에 필요한 PNGase F의 양을 >20배, >50배, >75배 또는 >90배 PNGase F로 상당히 감소된것을 도시한다.
실시예 19: 비-환원 조건 아래에서의 완전한 탈당화는 항체 결합 기능을 보존한다
탈당화 이후 4합체 항체의 기능을 유지하는 것은 다음에 의하여 확립되었다. 안티-MBP 쥐의 단일클론성 IgG(36㎍), 리툭시맵(40㎍, Genentech, San Francisco, CA), 및 에타네르셉트(25㎍, Amgen, Thousand Oaks, CA)는 20㎕의(최종 부피) 완충제에서 LS(최종 농도 0.5 % w/v)와 혼합되었다. 반응들은 여러 조건 아래에서 전-배양(pre-incubated)되었다: 80°C에서 2분, 75°C에서 5분, 70°C에서 10분, 65°C에서 10분, 60°C에서 10분, 또는 55°C에서 15분. 대조구는 어느 탈당효소도 함유하지 않았고, 그 외 모든 샘플에는 1㎕의 Rapid PNGase F가 더해졌다. 반응들은 그 직후 50°C에서 10분 동안 배양되었다. 부분표본은 샘플 완충제와 혼합되고, 열이 가해지고, 그리고 Novex® 10-20% 트리스 글리신 겔에 로딩되었다. 비-환원 겔 또한 이합체 및 4합체의 구조적 완전성(integrity)을 나타내기 위하여 진행(run)하였다: 부분표본은 DTT가 없을 때, 앞서 기술된 대로 샘플 완충제와 혼합되고, 열이 가해지고, 그리고 겔을 진행하였다. 전기영동 이후, 상기 겔은 밴드를 시각화하기 위하여 SimplyBlue SafeStain으로 염색되었다.
온전한, 탈당화된 단일 클론성 IgG의 기능성 활동을 측정하기 위하여, 안티-MBP-단일클론성 항체가 MBP-엔도 H 융합 단백질, Endo Hf를 사용해 웨스턴 블롯검사에서 그에 일치하는 항원(말토스 결합 단백질, MBP)을 상대로 분석되었다. Endo Hf의 순차적 희석의 웨스턴 블롯검사는 PVDF 막(Immobilon-P Millipore)에 준비되었고 그리고 탈당화된 안티-MBP 쥐의 단일 클론성 항체(앞서 기술된 비-항원 조건 아래에서 PNGase F로 처리된)나 당화된 안티-MBP 쥐의 단일 클론성 항체(Rapid PNGase F로 처리되지 않은)로 면역 블롯(immunoblotted)되었다. 신선한 안티-MBP를 가진 대조구 또한 포함되었다. 결과는 도 18a-18c에 제시되었다.
실시예 20: 두 개의 다른 투석 가능한, 절단할 수 없는 카르복실화된 계면활성제가 있을 때의 PNGase F 처리가 있는 한 단계 또는 두 단계 반응에서의 항체의 완전한 탈당화
안티-MBP 단일클론성 항체의 부분표본(36 ㎍)은 20 ㎕의 용량의 완충제에서, 20mM DTT와 함께 또는 없이, 2.5% LS 또는 라우린산염(LAU)에 현탁되었다. 대조 반응은 PNGase F도 함유하지 않았다. 한 단계 반응을 위해서는, 1㎕의 Rapid PNGase F가 더해졌고 그리고 샘플은 50°C에서 5분간 배양되었다. 두 단계 반응을 위해서는, 샘플은 72°C에서 5분간 예열(pre-heated) 되었고, 그를 식힌 후 1㎕의 Rapid PNGase F가 더해졌고 샘플은 50°C에서 5분간 배양되었다. 각각의 샘플의 부분표본(5.4㎍ IgG)은 SDS-PAGE을 통해 분리되었고 SimplyBlue SafeStain으로 시각화되었다(도 19 참조).
실시예 21: PNGase F 및 트립신을 가진 단백질의 동시 소화(digestion)
동시 PNGase F/트립신 소화는 단일클론성 항체의 펩티드 지도화(mapping)(및 펩티드 커버리지)를 가능하게 하기위하여 실시되었다. 이 한 단계 방법은 글리칸 점유(occupancy) 측정과 같은 구조적 분석에 유용하고, 완료될 때까지 몇 시간이 필요한 재조합 PNGase F 소화와 그를 뒤잇는 트립신 소화에 비해서 낫다.
단백 분해효소 소화에 이로운 탈당화 조건을 알아내기 위하여, 25㎍의 안티-MBP 쥐의 단일클론성 IgG가 총 50㎕의 완충제에 재현탁되었다. 항체는 95°C에서 5분간 배양되었고, 그리고 6㎕의 Rapid PNGase F 및 250ng의 Trypsin-ultra™, Mass Spectrometry Grade(New England Biolabs, Ipswich, MA)를 1:00 효소:기질의 비율. 샘플은 37°C에서 30분 동안, 또는 50°C에서 30분 동안 배양되었다.
소화된 샘플(동시 PNGase F/트립신 소화)의 1 마이크로리터가 C18 분석 컬럼에 주입되었고 그리고 60분 선형 구배(linear gradient)를 사용하여 분리되었다. 복수-대전된(multiple-charged) 펩티드 이온은 CID 및 ETD에 의하여 자동으로 선택되었고 분열되었다(fragmented). MS 및 MS/MS 분열 데이터는 최대 두 개의 놓친 절단를 가진 이론의 펩티드를 고려하여 분석되었다. 상기 분석은 PNGase F에 의한 글리칸 제거 후에 발생하는 아스파르트산으로의 전환을 설명하도록 아스파라긴의 변수 변경(variable modification)을 허용했다. 도 20a-20b의 데이터는 LS가 없을 때의 PNGase F/트립신의 결과를 보여주는 반면, 본 실시예는 카르복실화된 음이온의 계면활성제가 있을 때 상기 반응을 하는 방법을 제공한다.
실시예 22: 글리코시다아제의 혼합물로 처리하기 전의 열과 담즙산염 또는 절단할 수 없는, 투석가능한 카르복실화된 계면활성제의 조합의 전-처리를 수반하는, 두 단계에서의 N- 및 O-글리칸 모두 함유하는 항체의 완전한 탈당화
O-글리칸을 함유한 항체에 있어서, O-글리칸뿐만아니라 N-글리칸 또한 선택적으로 모두 제거하는 것이 바람직할 수 있다. O-글리칸을 절단하기 위한 O-글리코시다아제(엔도-알파-N-아세틸갈락토사미니다아제(acetylgalactosaminidase)) 및 3 엑소글리코시다아제(뉴라미니다아제, 베타 1-4 갈락토시다아제 및 베타 N-아세틸 글루코사미나다아제(glucosaminadase)(New England Biolabs, Ipswich, MA))를 함유하는 효소 조합은 N-글리칸을 절단하기 위한 N-글리코시다아제(PNGase F)는 O- 및 N-글리칸을 가진 단백질을 완전히 탈당화하기 위하여 함께 사용되었다.
치료적 단일클론성 융합 단백질(에타네르셉트)은 0.5% LS 및 20 mM DTT와 혼합되었다. 샘플은 80°C에서 2분간 전-배양되었다. 상기에 기술된 글리코시다아제를 모두 함유하는 단백질 탈당화 믹스(Protein Deglycosylation Mix)(New England Biolabs, Ipswich, MA) 5㎕가 샘플에 더해졌다. 대조 반응은 효소; 또는 LS 대신에 SDS를 포함하지 않았고, 반응은 37°C에서 30분간 배양되었다. 각각의 샘플의 부분표본은 SDS-PAGE을 통해 분리되었고 SimplyBlue SafeStain으로 시각화되었다.
O-글리칸 및 N-글리칸 모두의 완전한 제거에 일치하는 대조구와 비교했을 때 단백질 탈당화 믹스로 처리된 샘플은 이동에 증가를 보였다. 이 실시예는 효소 믹스에 의한 완전한 탈당화에 유해한 SDS의 사용의 문제를 강조한다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허출원, 또는 비-특허 문헌 및 참조 서열 정보(예를 들어 데이터베이스 또는 자료 수납 번호)는 다목적을 위하여 전체적으로, 그리고 인용된 명제 또한, 본 발명의 참고문헌으로 관련된다. 참고로 포함된 문서 및 본 발명 사이의 존재하는 어느 상충하는 점은, 본 출원이 제어할 것이다.
본 명세서를 따르는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의하여 앞서 기술된 측면은 어느 조합 또는 치환으로도 출원자에 의하여 청구될 수 있다는 것은 분명할 것이다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 하나 이상의 참고 자료로부터 기술될 하나 이상의 요소 및/또는 특성이 나중에 발견되었을 경우, 이는, 그 중에서도, 하나 이상의 요소 및/또는 특성의 네거티브 단서(negative proviso) 또는 포기서에 의하여 청구항으로부터 제외될 수 있다. 본 명세서에 사용된 제목들은 단지 편리를 위함이었을 뿐이고 본 명세서 또는 청구항의 해석에 영향을 미치지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> New England Biolabs, Inc. <120> DEGLYCOSYLATION REAGENTS AND METHODS <130> NEB-367 <150> 62/005,559 <151> 2014-05-30 <150> 62/018,074 <151> 2014-06-27 <150> 62/021,936 <151> 2014-07-08 <150> 62/040,745 <151> 2014-08-22 <150> 62/080,480 <151> 2014-11-17 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 586 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Ala Ala Val Pro His Arg His Arg Leu Pro Ser His His Leu Ala Ser 1 5 10 15 Leu Lys Leu Asn Ala Ser Ala Pro Pro Thr Thr Tyr Phe Glu Val Asp 20 25 30 Arg Pro Ile Arg Pro Pro Arg Gly Ser Val Gly Pro Cys Ser Thr Leu 35 40 45 Leu Leu Ser Asn Ser Phe Gly Ala Thr Tyr Gly Arg Pro Pro Val Thr 50 55 60 Ala Ala Tyr Ala Pro Pro Ser Cys Leu Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ala Ser Ser Ile Ala Leu Ala Val Leu Glu Trp Ser Ala Asp 85 90 95 Cys Arg Gly Arg Gln Phe Asp Arg Ile Phe Gly Val Trp Leu Ser Gly 100 105 110 Ala Glu Leu Leu Arg Ser Cys Thr Ala Glu Pro Arg Ala Thr Gly Ile 115 120 125 Val Trp Ser Val Ser Arg Asp Val Thr Arg Tyr Ala Ala Leu Leu Ala 130 135 140 Glu Pro Gly Glu Ile Ala Val Tyr Leu Gly Asn Leu Val Asp Ser Thr 145 150 155 160 Tyr Thr Gly Val Tyr His Ala Asn Leu Thr Leu His Leu Tyr Phe His 165 170 175 Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Gln Ala Asp Leu Ile Val 180 185 190 Pro Ile Ser Arg Ser Leu Pro Leu Asn Asp Gly Gln Trp Phe Ala Ile 195 200 205 Gln Asn Ser Thr Asp Val Gln Gly Lys Arg Leu Ala Ile Pro Ser Asn 210 215 220 Thr Tyr Arg Ala Ile Leu Glu Val Phe Val Ser Phe His Ser Asn Asp 225 230 235 240 Glu Phe Trp Tyr Thr Asn Pro Pro Asn Glu Tyr Ile Glu Ala Asn Asn 245 250 255 Leu Ser Asn Val Pro Gly Asn Gly Ala Phe Arg Glu Val Val Val Lys 260 265 270 Val Asn Asp Asp Ile Val Gly Ala Ile Trp Pro Phe Thr Val Ile Tyr 275 280 285 Thr Gly Gly Val Asn Pro Leu Leu Trp Arg Pro Ile Thr Gly Ile Gly 290 295 300 Ser Phe Asn Leu Pro Thr Tyr Asp Ile Asp Ile Thr Pro Phe Leu Gly 305 310 315 320 Lys Leu Leu Asp Gly Lys Glu His Asp Phe Gly Phe Gly Val Thr Asn 325 330 335 Ala Leu Asp Val Trp Tyr Ile Asp Ala Asn Leu His Trp Leu Asp His 340 345 350 Lys Ser Glu Glu Thr Thr Gly Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Ala Gln Gly 355 360 365 Leu Val Leu Asn Val Asp Ser Gly Phe Ser Gly Leu Asp Gly Gln Phe 370 375 380 Val Thr Ser Ala Ser Arg His Ile Ser Ala Thr Gly Leu Val Lys Ser 385 390 395 400 Ser Tyr Gly Glu Val Thr Thr Asn Phe Tyr Gln Arg Phe Ser Tyr Val 405 410 415 Asn Ser Asn Val Tyr Ser Lys Asn Gly Ser Val Gln Val Val Asn Gln 420 425 430 Thr Ile Asp Ala Lys Ser Gly Val Phe Ala Lys Asp Ala Leu Ala Val 435 440 445 Leu Leu Ser Glu Glu Leu His Gln Ile Phe Pro Leu Tyr Val Tyr Thr 450 455 460 Gly Thr Ser Asp Glu Glu Ala Asp Glu Tyr Thr Leu Ile Ser His Val 465 470 475 480 Lys Leu Gly Val Asn Glu Lys Glu Thr Ser Gly Gly Lys Met Gly Phe 485 490 495 Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Asn Ala Gln Ser Ala His Gly Ser Met Lys 500 505 510 Val Lys Lys Asn Leu Val Val Gly Gly Leu Gly Glu Thr His Gln Ala 515 520 525 Tyr Lys Tyr Val Gly Ala Asp Gly Cys Tyr Phe Arg Asp Val Arg Ser 530 535 540 Lys Asn Tyr Thr Val Leu Ser Asp His Ser Gly Asp Ser Cys Thr Lys 545 550 555 560 Arg Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Lys Phe Ser Leu Arg Asn Asp Gln Ser 565 570 575 Ala Arg Arg Lys Leu Met Val Asn Asn Leu 580 585

Claims (30)

  1. (i) 담즙산염, 또는 LS, 라우르산, 스테아르산, 팔미트산, 이들의 조합, 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 투석가능한, 절단할 수 없는 카르복실화된 음이온성 계면활성제;
    (ii) 하나 이상의 글리코시다아제;
    (iii) 전기영동 또는 질량 분석법으로 측정된(determined) 완전히 탈당화된(deglycosylated) 항체 또는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, Fd, VhH, VL, VH, 및 VNAR로부터 선택되는 완전히 탈당화된 항체 단편; 및
    (iv) 글리칸 절단 생성물(products);
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 완전히 탈당화된 항체가 항원 결합 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 완전히 탈당화된 항체가 탈당화된 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4, 인간 IgM, 인간 IgA1, 인간 IgA2, 인간 IgE, 뮤린 IgG1, 뮤린 IgG2a, 및 뮤린 IgA로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 글리칸 절단 생성물 및/또는 상기 항체가 형광 라벨, 방사성 동위원소, 메틸 아세틸(methyl acetyl), 항체, 또는 이들의 조합으로 라벨링되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 단백질 분해효소(protease)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질 분해효소가 트립신인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 단백질 분해효소가 트립신, GluC, AspN, 단백질 분해효소 K, Xa인자, 엔테로키나아제, LysC, Arg-C, LysN, IdeS, V-8 단백 분해효소, 파파인, 알파-리틱 단백 분해효소, 피로글루타메이트 아미노펩티다스(Pyroglutamate Aminopeptidas), 류신 아미노펩티다아제, 메티오닌 아미노펩티다아제, 아미노펩티다아제 I, 아미노펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제(A, B, G, Y), 펩신, 카텝신(B, C, D), α-키모트립신, TEV, 트롬빈, IdeZ 및 IdeE로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 글리코시다아제 중 적어도 하나가 융합 단백질이고, 상기 융합 단백질은 적어도 하나의 글리코시다아제 및 하나의 다른 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 융합 단백질이 매트릭스에 고정(immobilized)되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 하나의 다른 단백질이 돌연변이(mutant) O6-알킬구아닌-DNA-알킬트랜스퍼라제(AGT)를 포함하고, AGT의 친화성 결합(affinity binding)을 통해 매트릭스에 고정되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 하나의 다른 단백질은 말토스 결합 단백질, 키틴 결합 단백질, SNAP 태그, 또는 O6-알킬구아닌-DNA-알킬트랜스퍼라제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 수용성 완충제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. (a) 담즙산염, 또는 LS, 라우르산, 스테아르산, 팔미트산, 이들의 조합, 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 투석 가능한 절단할 수 없는 카르복실화된 음이온성 계면활성제;
    (b) 하나 이상의 글리코시다아제;
    (c) 전기영동 또는 질량 분석법으로 측정된 완전히 탈당화된 생물학적 활성 단백질; 및
    (d) 글리칸 절단 생성물;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 글리코시다아제가 복수개의 글리코시다아제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 복수개의 글시코시다아제가 엑소글리코시다아제(exoglycosidases) 및/또는 엔도글리코시다아제(endoglycosidases)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 단백질 분해효소(protease)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 단백질 분해효소가 트립신인 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. (a) 담즙산염, 또는 LS, 라우르산, 스테아르산, 팔미트산, 이들의 조합, 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 투석가능한 절단할 수 없는 카르복실화된 음이온성 계면활성제; 및 당화된 항체를 가진 하나 이상의 글리코시다아제를 포함하는 조성물을 60분 이내로 배양하고; 그리고
    (b) 탈당화된 항체 및 글리칸 절단 생성물을 형성하기 위하여 당화된 항체로부터 글리칸을 완전히 절단하는;
    단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 탈당화된 항체 또는 상기 글리칸 절단 생성물을 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 탈당화된 항체 및/또는 상기 글리칸 절단 생성물을 특성화(characterization)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 탈당화된 항체의 항원 결합 활성도를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 방사면역측정법, ELISA, 친화성 결합 분석, 또는 면역침전 분석법으로부터 선택되는 항체-항원 결합 분석법으로 상기 탈당화된 항체의 활동을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제18항에 있어서, (c) 치료적 사용을 위해 탈당화된 항체를 얻는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제18항에 있어서, (c) 진단적 사용을 위해 탈당화된 항체를 얻는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 조성물이 단백질 분해효소(protease)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제18항에 있어서, 상기 조성물이 당화된 항체와 배양되기 전에 동결건조되고, 상기 당화된 항체가 수용성 완충제 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제18항에 있어서, 상기 하나 이상의 글리코시다아제가 매트릭스에 고정된 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제18항에 있어서, 상기 배양이 20℃-60℃의 온도에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 하나 이상의 동결건조된 글리코시다아제, 하나의 고정된 글리코시다아제, 하나의 동결건조된 완충제, 또는 이들의 조합물을 포함하는 키트로서, 상기 동결건조된 완충제가 담즙산염, 또는 LS, 라우르산, 스테아르산, 팔미트산, 이들의 조합, 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 투석가능한 절단할 수 없는 카르복실화된 음이온성 계면활성제, 또는 이들의 조합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트(kit).
  30. 제29항에 있어서, 단백질 분해효소(protease)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
KR1020237019819A 2014-05-30 2015-05-29 탈당화 시약 및 방법 KR20230091199A (ko)

Applications Claiming Priority (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462005559P 2014-05-30 2014-05-30
US62/005,559 2014-05-30
US201462018074P 2014-06-27 2014-06-27
US62/018,074 2014-06-27
US201462021936P 2014-07-08 2014-07-08
US62/021,936 2014-07-08
US201462040745P 2014-08-22 2014-08-22
US62/040,745 2014-08-22
US201462080480P 2014-11-17 2014-11-17
US62/080,480 2014-11-17
PCT/US2015/033283 WO2015184325A2 (en) 2014-05-30 2015-05-29 Deglycosylation reagents and methods
KR1020167033877A KR20170012286A (ko) 2014-05-30 2015-05-29 탈당화 시약 및 방법

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167033877A Division KR20170012286A (ko) 2014-05-30 2015-05-29 탈당화 시약 및 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230091199A true KR20230091199A (ko) 2023-06-22

Family

ID=53887174

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237019819A KR20230091199A (ko) 2014-05-30 2015-05-29 탈당화 시약 및 방법
KR1020167033877A KR20170012286A (ko) 2014-05-30 2015-05-29 탈당화 시약 및 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167033877A KR20170012286A (ko) 2014-05-30 2015-05-29 탈당화 시약 및 방법

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20150346194A1 (ko)
EP (2) EP3149034B1 (ko)
KR (2) KR20230091199A (ko)
CN (1) CN106604930B (ko)
WO (1) WO2015184325A2 (ko)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10436790B2 (en) 2011-09-28 2019-10-08 Waters Technologies Corporation Rapid fluorescence tagging of glycans and other biomolecules with enhanced MS signals
EP3974412A1 (en) 2011-09-28 2022-03-30 Waters Technologies Corporation Rapid fluorescence tagging of glycans and other biomolecules with enhanced ms signals
US11352325B2 (en) 2011-09-28 2022-06-07 Waters Technologies Corporation Rapid fluorescence tagging of glycans and other biomolecules with enhanced MS signals
KR101520614B1 (ko) * 2013-07-25 2015-05-19 서울대학교산학협력단 당단백질의 탈당화 검출을 통한 암 진단 방법
EP3748340B1 (en) 2014-10-30 2022-04-06 Waters Technologies Corporation Methods for the rapid preparation of labeled glycosylamines and for the analysis of glycosylated biomolecules producing the same
CN111796039B (zh) 2014-11-13 2023-03-17 沃特世科技公司 快速标记的n-聚糖的液相色谱校准方法
WO2017222954A1 (en) 2016-06-21 2017-12-28 Waters Technologies Corporation Fluorescence tagging of glycans and other biomolecules through reductive amination for enhanced ms signals
WO2017222955A1 (en) 2016-06-21 2017-12-28 Waters Technologies Corporation Methods of electrospray ionization of glycans modified with amphipathic, strongly basic moieties
CN114839302A (zh) 2016-07-01 2022-08-02 沃特世科技公司 使用分子量截留过滤和过滤器上去糖基化从复杂基质快速制备标记的葡基胺的方法
US20180094293A1 (en) * 2016-10-03 2018-04-05 Waters Technologies Corporation Labeled glycan amino acid complexes useful in lc-ms analysis and methods of making the same
EP3541835A4 (en) * 2016-11-18 2020-08-05 Biocon Limited FAST AND EFFICIENT ENTGLYCOSYLATION OF GLYCOPROTEINS
US10260056B2 (en) 2017-03-17 2019-04-16 New England Biolabs, Inc. Cleavage of fucose in N-glycans
CN107014935B (zh) * 2017-05-05 2018-03-23 北京毅新博创生物科技有限公司 一种血浆或血清的IgG糖型检测批量前处理方法
CN109628531A (zh) * 2018-12-25 2019-04-16 上海药明生物技术有限公司 抗体人源化改造方法
CN109725094A (zh) * 2019-01-17 2019-05-07 中国食品药品检定研究院 糖蛋白的双酶处理法
CA3165060C (en) 2020-01-21 2023-06-20 Yiming Zhao Deglycosylation methods for electrophoresis of glycosylated proteins
GB202007431D0 (en) * 2020-05-19 2020-07-01 Hansa Biopharma AB Cysteine protease
GB202015772D0 (en) 2020-10-05 2020-11-18 Univ Newcastle Pngase enzymes
CN112345756A (zh) * 2020-10-09 2021-02-09 无锡市人民医院 肺癌组织中pd-l1蛋白的检测方法
US12091694B2 (en) 2022-11-18 2024-09-17 Seismic Therapeutic, Inc. Fc fusion molecules and uses thereof
WO2024201064A1 (en) * 2023-03-30 2024-10-03 Micromass Uk Limited Cancer risk assessment

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU749719B2 (en) * 1989-10-16 2002-07-04 Biovitrum Ab (Publ) Stem cell factor
FR2801106B1 (fr) * 1999-11-12 2007-10-05 Commissariat Energie Atomique Procede de diagnostic d'une esst provoquee par une souche d'atnc dans un echantillon biologique et son utilisation dans le diagnostic differentiel des differentes souches d'atnc
US20030077616A1 (en) * 2001-04-19 2003-04-24 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomolecule characterization using mass spectrometry and affinity tags
DE10237317B4 (de) * 2002-08-15 2010-04-08 3M Espe Ag Enzymhaltige Zusammensetzung, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
JP2010536355A (ja) * 2007-08-31 2010-12-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー グリコシル化プロファイル分析
US8741287B2 (en) * 2008-06-18 2014-06-03 Abbott Laboratories PlGF-1 assay and kits and components thereof
HUE038596T2 (hu) * 2009-06-02 2018-10-29 Regeneron Pharma Fukoziláció-hiányos sejtek
EP2788017B1 (en) * 2011-12-05 2017-05-31 Ben-Gurion University of The Negev Research and Development Authority INHIBITORS OF IgG-A2BG2 FOR USE IN TREATING AND DIAGNOSING AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS
WO2013112438A1 (en) * 2012-01-23 2013-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stabilized formulations containing anti-ang2 antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
US9964548B2 (en) 2018-05-08
US20150346194A1 (en) 2015-12-03
CN106604930B (zh) 2021-10-29
WO2015184325A2 (en) 2015-12-03
EP4083066A3 (en) 2023-02-08
WO2015184325A3 (en) 2016-02-04
EP4083066A2 (en) 2022-11-02
US20170138959A1 (en) 2017-05-18
CN106604930A (zh) 2017-04-26
KR20170012286A (ko) 2017-02-02
EP3149034A2 (en) 2017-04-05
EP3149034B1 (en) 2022-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9964548B2 (en) Deglycosylation reagents and methods
JP5461586B2 (ja) 免疫グロブリングリコシル化パターン分析
Sjögren et al. On enzymatic remodeling of IgG glycosylation; unique tools with broad applications
Bongers et al. Characterization of glycosylation sites for a recombinant IgG1 monoclonal antibody and a CTLA4-Ig fusion protein by liquid chromatography–mass spectrometry peptide mapping
US10507233B2 (en) Universal N-glycan binding reagent
CN110225925B (zh) 快速高效的糖蛋白去糖基化
US20190025323A1 (en) Methods of Mapping Protein Variants
CA3179460A1 (en) A high-throughput and mass-spectrometry-based method for quantitating antibodies
CA3165060A1 (en) Deglycosylation methods for electrophoresis of glycosylated proteins
Rappo Specific enzymatic digestion and fragment isolation for the critical quality attribute assessment of IgG1
CN118326524A (zh) 改进的糖链文库制备方法
CN118475839A (zh) 基于ms的蛋白质组学中用于防止二硫键混乱的方法
ZHENG et al. 1 CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL ANTIBODY HETEROGENEITY BY HPLC ANALYSIS
US20160252521A1 (en) Method for determining high-mannose glycans

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
E902 Notification of reason for refusal