JP2023512069A - 液体クロマトグラフィー－質量分析による高信頼度の化合物同定 - Google Patents
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Abstract
化合物の検出および特徴付けを改善するための方法が開示される。試料を特徴付ける方法が開示される。本方法は、試料を、試料成分を生成するための試料分離が可能な液体クロマトグラフィーシステムに提供することと、多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって試料成分を分析して包含リストを生成することと、包含リストから反復質量スペクトルデータ依存取得（ＤＤＡ）を実行して、個々の試料成分を同定し、それによって試料を特徴付けることと、を含み得る。一例では、多重化標的ＳＩＭおよび反復ＭＳ２ ＤＤＡ取得が、細胞培養培地分析のためのロバストな化合物同定を増加させるために使用される。【選択図】図６
Description
本発明は、化合物同定に関し、特に、抗体プロセス開発などのための液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）による高信頼度の化合物同定のための方法に関する。
細胞培養培地は、抗体産生において重要な役割を果たしている。細胞培養培地内の個々の成分およびそれらの代謝産物がどのように産生性能に影響を与えるかについて、より深い理解を発展させることは、非常に望ましく、困難である。化学的に定義された培地を使用するようになったにもかかわらず、大豆ベースの培地が広く使用されている。大豆加水分解物の主成分および不純物は、抗体の生産性および質に影響を及ぼすことが分かっている。質量分析は、非常に複雑なマトリックスにおける化合物の定量化および同定において重要な役割を果たしている。液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）ベースの分析は、データの質の向上から多大な恩恵を受けることができ、その結果、より高信頼度で曖昧さの少ない特徴付けを改善することができる。
一態様では、本発明は、試料を特徴付ける方法を提供し、方法は、試料を、試料成分を生成するための試料分離が可能な液体クロマトグラフィーシステムに提供することと、多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって試料成分を分析して包含リストを生成することと、包含リストから反復質量スペクトルデータ依存取得（ＤＤＡ）を実行して、個々の試料成分を同定し、それによって試料を特徴付けることと、を含む。
一部の実施形態では、液体クロマトグラフィーシステムは、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）システムである。
一部の実施形態では、多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によってイオン化試料を分析して包含リストを生成することは、イオントラップまたはオービトラップ質量分析器を利用することを含む。
一部の実施形態では、反復質量スペクトルデータ依存取得（ＤＤＡ）を実行することは、セグメント化四重極質量フィルタを装備したイオントラップまたはオービトラップ質量分析器を利用することを含む。
一部の実施形態では、多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって試料成分を分析して包含リストを生成することは、複数のセグメントが含まれ、各セグメントが複数のウィンドウを有する質量比ウィンドウ設定をセグメント化することを含む。
一部の実施形態では、複数のセグメントは３個のセグメントである。
一部の実施形態では、複数のセグメントは４個のセグメントである。
一部の実施形態では、複数のウィンドウは１０個のウィンドウである。
一部の実施形態では、セグメント内の各ウィンドウは、同じウィンドウ幅を有する。
一部の実施形態では、試料は細胞培養培地である。
一部の実施形態では、細胞培養培地は、大豆ベースの細胞培養培地である。
一部の実施形態では、細胞培養培地は、組換え細胞ベースの産生系のためのものである。
一部の実施形態では、本方法は、組換え細胞ベースの産生系とのインキュベーション後の細胞培養培地内の成分およびそれらの代謝産物を特徴付けるためのものである。
一部の実施形態では、組換え細胞ベースの産生系は、哺乳動物系である。
一部の実施形態では、組換え細胞ベースの産生系は、タンパク質産生のためのものである。
一部の実施形態では、タンパク質は、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせである。
一部の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプのものである。
細胞培養培地分析のための化合物同定の方法も提供され、方法は、細胞培養培地の試料を、試料成分を生成するための試料分離が可能な液体クロマトグラフィーシステムに提供することと、多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって試料成分を分析して包含リストを生成することと、包含リストから反復質量スペクトルデータ依存取得（ＤＤＡ）を実行して、細胞培養培地を用いて個々の化合物を同定することと、を含む。
一部の実施形態では、液体クロマトグラフィーシステムは、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）システムである。
一部の実施形態では、多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって断片化試料を分析して包含リストを生成することは、イオントラップまたはオービトラップ質量分析器を利用することを含む。
一部の実施形態では、反復質量スペクトルデータ依存取得（ＤＤＡ）を実行することは、セグメント化四重極質量フィルタを装備したイオントラップまたはオービトラップ質量分析器を利用することを含む。
一部の実施形態では、多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって試料成分を分析して包含リストを生成することは、複数のセグメントが含まれ、各セグメントが複数のウィンドウを有する質量比ウィンドウ設定をセグメント化することを含む。
一部の実施形態では、複数のセグメントは３個のセグメントである。
一部の実施形態では、複数のセグメントは４個のセグメントである。
一部の実施形態では、複数のウィンドウは１０個のウィンドウである。
一部の実施形態では、セグメント内の各ウィンドウは、同じウィンドウ幅を有する。
一部の実施形態では、細胞培養培地は、大豆ベースの細胞培養培地である。
一部の実施形態では、細胞培養培地は、組換え細胞ベースの産生系のためのものである。
一部の実施形態では、細胞培養培地試料は、組換え細胞ベースの産生系とのインキュベーション後に得られる細胞培養培地試料である。
一部の実施形態では、組換え細胞ベースの産生系は、哺乳動物系である。
一部の実施形態では、組換え細胞ベースの産生系は、タンパク質産生のためのものである。
一部の実施形態では、タンパク質は、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせである。
一部の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプのものである。
様々な実施形態では、上記または本明細書で考察される実施形態の特徴または構成要素のうちのいずれかは組み合わせられ得、そのような組み合わせは本開示の範囲内に包含される。上記または本明細書で考察されるいずれの特定の値も、上記または本明細書で考察される別の関連値と組み合わされて、それらの値が範囲の上限および下限を表す範囲を列挙することができ、かかる範囲およびかかる範囲内にあるすべての値は本開示の範囲内に包含される。上記または本明細書で考察される値のうちの各々は、１％、５％、１０％または２０％の変動で表され得る。他の実施形態は、後述の発明を実施するための形態の精査から明らかとなるであろう。
本発明が記載される前に、記載される特定の方法および実験条件が異なり得るため、本発明がかかる方法および条件に限定されないことを、理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを企図するものではないことも理解されるべきである。任意の実施形態または実施形態の特徴は、互いに組み合わせることができ、そのような組み合わせは、本発明の範囲内に明示的に含まれる。
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現は、９９および１０１ならびにそれらの間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、非限定的であることを意味し、それぞれ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。
本明細書に記載されるものと同様または同等のいずれの方法および材料も本発明の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書において言及されるすべての特許、出願および非特許刊行物は、それらの全体の参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される略語
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣
ＣＱＡ：重要な品属性
ＣＶ：変動係数
ＤＤＡ：データ依存取得
ＥＩＣ：抽出イオンクロマトグラフ
ＥＳＩ－ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化質量分析
ＦＡ：ギ酸
ＨＣ：重鎖
ＨＩＬＩＣ：親水性相互作用液体クロマトグラフィー
ＨＭＷ：高分子量
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＩＰＡ：イソプロパノール
ＬＣ：軽鎖
ＬＣ－ＭＳ：液体クロマトグラフィー－質量分析
ＬＭＷ：低分子量
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ＭＳ：質量分析
ＭＷ：分子量
Ｍ／Ｚ：質量電荷比
ＮＣＥ：正規化衝突エネルギー
ＰＫ：薬物動態
ＰＱＡ：産物の品属性
ＰＴＭ：翻訳後修飾
ＲＰ－ＬＣ：逆相液体クロマトグラフィー
ＳＩＭ：選択イオンモニタリング
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣
ＣＱＡ：重要な品属性
ＣＶ：変動係数
ＤＤＡ：データ依存取得
ＥＩＣ：抽出イオンクロマトグラフ
ＥＳＩ－ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化質量分析
ＦＡ：ギ酸
ＨＣ：重鎖
ＨＩＬＩＣ：親水性相互作用液体クロマトグラフィー
ＨＭＷ：高分子量
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＩＰＡ：イソプロパノール
ＬＣ：軽鎖
ＬＣ－ＭＳ：液体クロマトグラフィー－質量分析
ＬＭＷ：低分子量
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ＭＳ：質量分析
ＭＷ：分子量
Ｍ／Ｚ：質量電荷比
ＮＣＥ：正規化衝突エネルギー
ＰＫ：薬物動態
ＰＱＡ：産物の品属性
ＰＴＭ：翻訳後修飾
ＲＰ－ＬＣ：逆相液体クロマトグラフィー
ＳＩＭ：選択イオンモニタリング
定義
本明細書中で使用される場合、「タンパク質」という用語は、共有結合したアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含む。タンパク質は、当技術分野で「ポリペプチド」として概して知られている１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造変異体、およびペプチド結合を介して連結されたその合成非天然類似体、関連する天然に存在する構造変異体、およびその合成非天然類似体から構成されるポリマーを指す。「合成ペプチドまたは合成ポリペプチド」は、天然に存在しないペプチドまたはポリペプチドを指す。合成ペプチドまたは合成ポリペプチドは例えば、自動ポリペプチド合成機を使用して合成される。様々な固相ペプチド合成法は当業者に公知である。タンパク質は、単一の機能性生体分子を形成するために、１つ以上のポリペプチドを含有し得る。タンパク質は、任意の生物学的治療用タンパク質、研究または治療において使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質および他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに二重特異性抗体を含み得る。別の例示的な態様において、タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含み得る。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．））、哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの組換え細胞ベースの産生系を使用して産生され得る。生物療法用タンパク質およびそれらの産生を考察する最近の総説については、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ”（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．（２０１２）１４７－７５）を参照されたい。一部の実施形態では、タンパク質は、修飾、付加物、および他の共有結合部分を含む。これらの修飾、付加物および部分には、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、および他の単糖）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧｔａｇ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識および他の色素などが含まれる。タンパク質は、組成および溶解性に基づいて分類することができ、したがって、球状タンパク質および繊維状タンパク質などの単純タンパク質と、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、およびリポタンパク質などの複合タンパク質と、一次誘導タンパク質および二次誘導タンパク質などの誘導タンパク質とを含み得る。
本明細書中で使用される場合、「タンパク質」という用語は、共有結合したアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含む。タンパク質は、当技術分野で「ポリペプチド」として概して知られている１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造変異体、およびペプチド結合を介して連結されたその合成非天然類似体、関連する天然に存在する構造変異体、およびその合成非天然類似体から構成されるポリマーを指す。「合成ペプチドまたは合成ポリペプチド」は、天然に存在しないペプチドまたはポリペプチドを指す。合成ペプチドまたは合成ポリペプチドは例えば、自動ポリペプチド合成機を使用して合成される。様々な固相ペプチド合成法は当業者に公知である。タンパク質は、単一の機能性生体分子を形成するために、１つ以上のポリペプチドを含有し得る。タンパク質は、任意の生物学的治療用タンパク質、研究または治療において使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質および他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに二重特異性抗体を含み得る。別の例示的な態様において、タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含み得る。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．））、哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの組換え細胞ベースの産生系を使用して産生され得る。生物療法用タンパク質およびそれらの産生を考察する最近の総説については、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ”（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．（２０１２）１４７－７５）を参照されたい。一部の実施形態では、タンパク質は、修飾、付加物、および他の共有結合部分を含む。これらの修飾、付加物および部分には、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、および他の単糖）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧｔａｇ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識および他の色素などが含まれる。タンパク質は、組成および溶解性に基づいて分類することができ、したがって、球状タンパク質および繊維状タンパク質などの単純タンパク質と、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、およびリポタンパク質などの複合タンパク質と、一次誘導タンパク質および二次誘導タンパク質などの誘導タンパク質とを含み得る。
本明細書で使用される「変異体タンパク質」または「タンパク質変異体」または「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって標的タンパク質と異なるタンパク質を含み得る。タンパク質変異体は、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指す場合がある。好ましくは、タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して約１～約１０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１～約５個のアミノ酸修飾を有する。本明細書中のタンパク質変異体配列は、好ましくは、親タンパク質配列と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。一部の例示的な実施形態では、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、またはそれらの組み合わせであり得る。
本明細書で使用する「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合断片を指すよう企図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなる）からなる。様々な実施形態では、重鎖は、ＩｇＧアイソタイプであり得る。一部の場合において、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される。一部の実施形態、重鎖は、アイソタイプＩｇＧ１／ＩｇＧ２またはＩｇＧ４／ＩｇＧ２のキメラヒンジ領域を任意で含む、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４の重鎖である。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された抗体分子、例えば、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体を含む。抗体構造に関する総説については、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，２７（１）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５－７７（２００３）、およびＭ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１）Ｓｕｒｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２７－４２（１９８３）を参照されたい。
抗体という用語はまた、２つ以上の異なるエピトープに結合し得るヘテロ四量体免疫グロブリンを含む「二重特異性抗体」を包含する。単一の重鎖および単一の軽鎖ならびに６つのＣＤＲを含む二重特異性抗体の半分は、１つの抗原またはエピトープに結合し、抗体のもう半分は、異なる抗原またはエピトープに結合する。一部の場合において、二重特異性抗体は、同じ抗原に結合することができるが、異なるエピトープまたは非重複エピトープにおいて結合することができる。一部の場合において、二重特異性抗体の両半分は、二重特異性を保持しながら同一の軽鎖を有する。二重特異性抗体は、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号（２０１０年１２月３０日）に概して記載されている。
抗体の「抗原結合部分」（または「抗体断片」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片と、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片と、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片と、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片と、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ２４１：５４４－５４６）と、（ｖｉ）単離されたＣＤＲと、（ｖｉｉ）ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖を形成するように合成リンカーによって連結されたＦｖ断片の２つのドメインである、ＶＬおよびＶＨからなるｓｃＦｖと、が挙げられる。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も、用語「抗体」に包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）９０ ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．６４４４－６４４８、およびＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）２ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１２１－１１２３を参照されたい）。
さらに、抗体およびその抗原結合断片は、当該分野で概して公知の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法もまた、当該分野で公知である。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５９６，５４１号、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照されたい）またはモノクローナル抗体を生成するための任意の他の公知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する所望の抗原に対する高親和性キメラ抗体が最初に単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に対する応答においてヒト可変領域と、マウス定常領域と、を含む、抗体を生成するように、ヒト重鎖可変領域と、ヒト軽鎖可変領域と、を含む、ゲノムが内在性マウス定常領域座に動作可能に連結されたトランスジェニックマウスの生成を包含する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに動作可能に連結する。次に、完全ヒト抗体を発現することができる細胞においてＤＮＡを発現させる。
「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列へと移植されたｍＡｂを含むことは企図されない。この用語は、非ヒト哺乳類において、または非ヒト哺乳類の細胞において組換え産生された抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象において生成された抗体を含むよう意図されるものではない。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、例えば疾患または障害の改善、予防および／または治療を必要とする動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。
本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、バイオ医薬品産物中に存在する任意の望ましくないタンパク質を含み得る。不純物は、プロセス関連不純物および産物関連不純物を含み得る。不純物は、さらに、構造が既知であるか、部分的に特徴付けられているか、または同定されていないものであり得る。プロセス関連不純物は、製造プロセスに由来する可能性があり、３つの主要なカテゴリとして、細胞基質由来、細胞培養由来、および下流由来の不純物を含み得る。細胞基質由来不純物としては、宿主生物に由来するタンパク質および核酸（宿主細胞ゲノム、ベクター、または全ＤＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞培養由来不純物としては、誘導物質、抗生物質、血清、および他の培地成分が挙げられるが、これらに限定されない。下流由来不純物としては、酵素、化学および生化学処理試薬（例えば、臭化シアン、グアニジン、酸化および還元剤）、無機塩（例えば、重金属、ヒ素、非金属イオン）、溶媒、担体、リガンド（例えば、モノクローナル抗体）、および他の浸出物が挙げられるが、これらに限定されない。産物関連不純物（例えば、前駆体、特定の分解産物）は、活性、有効性、および安全性に関して所望の産物の特性に匹敵する特性を有さない、製造および／または貯蔵中に生じる分子変異体であり得る。かかる変異体は、修飾の型を同定するために、単離および特徴付けにおいて多大な努力を必要とし得る。産物関連不純物には、切断型、修飾型、および凝集体が含まれ得る。切断型は、ペプチド結合の切断を触媒する加水分解酵素または化学物質によって形成される。修飾型には、脱アミド化、異性化、ミスマッチＳ－Ｓ結合、酸化、または修飾共役形態（例えば、グリコシル化、リン酸化）が含まれるが、これらに限定されない。修飾型はまた、任意の翻訳後修飾型を含み得る。凝集体は、所望の産物の二量体およびより高い倍数を含む（Ｑ６Ｂ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｔｅｓｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＩＣＨ Ａｕｇｕｓｔ １９９９，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。
「低分子量（ＬＭＷ）タンパク質薬物不純物」という用語は、前駆体、分解産物、切断種、Ｆａｂ断片を含むタンパク質分解断片、Ｆｃまたは重鎖断片、リガンドまたは受容体断片、Ｈ２Ｌ（２重鎖および１軽鎖）、Ｈ２（２重鎖）、ＨＬ（１重鎖および１軽鎖）、ＨＣ（１重鎖）、およびＬＣ（１軽鎖）種を含むが、これらに限定されない。ＬＭＷタンパク質薬物不純物は、タンパク質産物の不完全バージョンである任意の変異体（例えば、多量体タンパク質の１つ以上の成分）であり得る。タンパク質薬物不純物、薬物不純物または産物不純物は、本明細書を通して互換的に使用され得る用語である。ＬＭＷ薬物または産物不純物は、概して、所望の薬物産物のものとは異なり得る活性、有効性、および安全性などの特性を有する分子変異体と考えられる。
タンパク質産物の分解は、細胞培養系におけるタンパク質薬物産物の産生の間に問題となる。例えば、タンパク質産物のタンパク質分解は、細胞培養培地中のプロテアーゼの放出に起因して起こり得る。メタロプロテアーゼを阻害するために添加される可溶性鉄源、またはセリンおよびシステインプロテアーゼ阻害剤などの培地添加剤が、分解を防止するために細胞培養において実施されている（Ｃｌｉｎｃｋｅ，Ｍ．－Ｆ．，ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｐｒｏｃ．２０１１，５，Ｐ１１５）。Ｃ末端断片は、細胞培養におけるカルボキシルペプチダーゼに起因して、産生中に切断され得る（Ｄｉｃｋ，ＬＷ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００８；１００：１１３２－４３）。
「高分子量（ＨＭＷ）タンパク質薬物不純物」という用語は、ｍＡｂ三量体およびｍＡｂ二量体を含むが、これらに限定されない。ＨＭＷ種は、２つの群、すなわち１）余分な軽鎖を有する単量体（Ｈ２Ｌ３およびＨ２Ｌ４種）と、２）単量体＋Ｆａｂ断片複合体とに分けることができる。加えて、ＩｄｅＳ酵素消化による処理後、異なる二量体化断片（Ｆａｂ２－Ｆａｂ２、Ｆｃ－ＦｃおよびＦａｂ２－Ｆｃ）が形成される。
「翻訳後修飾」（ＰＴＭ）は、タンパク質生合成後のタンパク質の共有結合修飾を指す。翻訳後修飾は、アミノ酸側鎖またはタンパク質のＣ末端もしくはＮ末端で起こり得る。ＰＴＭは概して、特定の酵素または酵素経路によって導入される。多くは、タンパク質骨格内の特定の特徴的なタンパク質配列（例えば、シグネチャー配列）の部位で生じる。数百のＰＴＭが記録されており、これらの修飾は、タンパク質の構造または機能の一部の側面に常に影響を及ぼす（Ｗａｌｓｈ，Ｇ．「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（２０１４）第２版、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．出版、ＩＳＢＮ：９７８０４７０６６９８５３）。様々な翻訳後修飾としては、切断、Ｎ末端伸長、タンパク質分解、Ｎ末端のアシル化、ビオチン化（リジン残基とビオチンのアシル化）、Ｃ末端のアミド化、グリコシル化、ヨウ素化、補欠分子族の共有結合、アセチル化（通常はタンパク質のＮ末端でのアセチル基の付加）、アルキル化（通常はリジンまたはアルギニン残基でのアルキル基（メチル、エチル、プロピルなど）の付加）、メチル化、アデニル化、ＡＤＰリボシル化、ポリペプチド鎖内またはポリペプチド鎖間の共有結合架橋、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性修飾（プロリンおよびリジンのヒドロキシル化とカルボキシ末端のアミド化）、ビタミンＫがグルタミン酸残基のカルボキシル化の補因子であり、γ－カルボキシグルタメート（ｇｌｕ残基）の形成をもたらす、ビタミンＫ依存性修飾、グルタミル化（グルタミン酸残基の共有結合）、グリシル化（共有結合グリシン残基）、グリコシル化（アスパラギン、ヒドロキシリシン、セリン、またはスレオニンのいずれかにグリコシル基を付加して糖タンパク質を生成する）、イソプレニル化（ファルネソールおよびゲラニルゲラニオールなどのイソプレノイド基の付加）、リポ酸化（リポ酸機能の付着）、ホスホパンテテイニル化（脂肪酸、ポリケチド、非リボソームペプチドおよびロイシン生合成の場合のように、補酵素Ａからの４’－ホスホパンテテイニル部分の付加）、リン酸化（通常、セリン、チロシン、スレオニン、またはヒスチジンへのリン酸基の付加）、ならびに硫酸化（通常はチロシン残基への硫酸基の付加）が含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸の化学的性質を変化させる翻訳後修飾としては、シトルリン化（例えば、脱イミノ化によるアルギニンのシトルリンへの変換）、および脱アミド化（例えば、グルタミンのグルタミン酸への変換またはアスパラギンのアスパラギン酸への変換）が挙げられるが、これらに限定されない。構造変化を伴う翻訳後修飾としては、ジスルフィド架橋（２つのシステインアミノ酸の共有結合）の形成およびタンパク質分解性切断（ペプチド結合におけるタンパク質の切断）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の翻訳後修飾には、ＩＳＧ化（ＩＳＧ１５タンパク質（インターフェロン刺激遺伝子）への共有結合）、ＳＵＭＯ化（ＳＵＭＯタンパク質（低分子ユビキチン関連修飾因子）への共有結合）およびユビキチン化（タンパク質ユビキチンへの共有結合）などの他のタンパク質またはペプチドの付加が含まれる。ＵｎｉＰｒｏｔによってキュレートされたＰＴＭのより詳細な統制語彙については、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ｐｔｍｌｉｓｔを参照されたい。
本明細書で使用される用語「糖ペプチド／糖タンパク質」は、共有結合した炭水化物またはグリカンを有する、それらの合成中または合成後の修飾ペプチド／タンパク質である。ある特定の実施形態では、糖ペプチドは、モノクローナル抗体から、例えば、モノクローナル抗体のプロテアーゼ消化物から得られる。
本明細書で使用される場合、「グリカン」という用語は、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびＮ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）を概して含む糖ユニットの１つ以上を含む化合物である（Ｆｒａｎｋ Ｋｊｅｌｄｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，７５，２３５５－２３６１）。モノクローナル抗体などの糖タンパク質中のグリカン部分は、その機能または細胞位置を同定するための重要な特徴である。例えば特定のモノクローナル抗体は、特定のグリカン部分で修飾される。
本明細書で使用される「試料」という用語は、例えば、分離、分析、またはプロファイリングを含む、本発明の方法による操作に供される細胞培養培地内の成分などの分子の混合物を指す。試料は、例えば、分離、分析、抽出、濃縮またはプロファイリングを含む本発明の方法に従う操作に供される、モノクローナル抗体から得られるような少なくとも１つの分析物分子（例えば、糖ペプチド）を含み得る。
「分析」または「分析する」という用語は、本明細書で使用される場合、互換的に使用され、目的の分子を分離、検出、単離、精製、可溶化、検出および／または特徴付ける様々な方法のいずれかを指す。例としては、これらに限定されないが、固相抽出、固相マイクロ抽出、電気泳動、質量分析（例えば、多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）－ＭＳおよびそれに続く反復ＭＳ２ ＤＤＡ、ＥＳＩ－ＭＳ、ＳＰＥ ＨＩＬＩＣ、またはＭＡＬＤＩ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー（例えば、高速、例えば、逆相、順相、またはサイズ排除）、イオン対液体クロマトグラフィー、液－液抽出（例えば、加速流体抽出、超臨界流体抽出、マイクロ波支援抽出、膜抽出、ソックスレー抽出）、沈殿、清澄化、電気化学検出、染色、元素分析、エドモンド分解、核磁気共鳴、赤外線分析、フローインジェクション分析、キャピラリー電気クロマトグラフィー、紫外線検出、およびそれらの組み合わせなどが挙げられる。
本明細書で使用される「プロファイリング」という用語は、タンパク質などの化合物の含量、組成、または特徴的な比を提供するために組み合わせて使用される様々な分析方法のいずれかを指す。
本明細書で使用される場合、「接触させること」は、少なくとも２つの物質を溶液または固相で一緒にすることを含む。
本明細書で使用される「ペプチドマッピング分析」は、タンパク質が消化を受け、続いて得られたペプチドが分離され、好ましくはＬＣ－ＭＳを使用して分析される実験を含む。一部の例示的な実施形態では、ペプチドマッピング分析を適用して、タンパク質バイオ医薬品の一次配列を確認することができ、この場合、タンパク質分子をまず加水分解剤を使用して小さなペプチド断片に加水分解することができ、次いで各ペプチド断片のアミノ酸配列を、ｃＤＮＡ予測配列および使用したプロテアーゼの特異性を考慮してＬＣ－ＭＳ分析によって決定する。ペプチドマッピング分析からのデータはまた、翻訳後修飾を同定および定量化し、ジスルフィド結合連結を確認し、非常に低いレベル（＜０．１％）で存在するアミノ酸置換事象を検出するためにも利用され得る（Ｚｅｃｋ ｅｔ ａｌ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ２０１２，７，ｅ４０３２８）。タンパク質バイオ医薬品のペプチドマッピング分析の間、ＬＣ－ＭＳは、しばしば、いわゆるＵＶフィンガープリントを生成するために紫外線（ＵＶ）検出と組み合わせて実施され得、これは、質管理（ＱＣ）および薬物放出の間の同定アッセイとして単独で使用され得る。
本明細書で使用される場合、「消化」という用語は、タンパク質の１つ以上のペプチド結合の加水分解を指す。適切な加水分解剤を使用して試料中のタンパク質の消化、例えば、酵素消化または非酵素消化を行うための複数のアプローチが存在する。本明細書で使用される場合、「加水分解剤」という用語は、タンパク質の消化を行うことができる多数の異なる薬剤のいずれか１つまたは組み合わせを指す。酵素消化を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、トリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、外膜プロテアーゼＴ（ＯｍｐＴ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ由来のプロテアーゼが挙げられる。非酵素的消化を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、高温、マイクロ波、超音波、高圧、赤外線、溶媒（非限定的な例はエタノールおよびアセトニトリルである）、固定化酵素消化（ＩＭＥＲ）、磁性粒子固定化酵素、およびオンチップ固定化酵素の使用が挙げられる。タンパク消化のための利用可能な技術を考察する最近の総説については、Ｓｗｉｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”（Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３，１２，１０６７－１０７７）を参照されたい。加水分解剤の１つまたは組み合わせは、配列特異的な様式で、タンパク質またはポリペプチド中のペプチド結合を切断し得、より短いペプチドの予測可能なコレクションを生成する。
タンパク質を消化するために使用され得る複数のアプローチが利用可能である。広くは試料中のタンパク質を消化するための容認された方法は、プロテアーゼの使用を含む。多くのプロテアーゼが利用可能であり、それらの各々は、特異性、効率、および最適消化条件に関してそれら自身の特徴を有する。プロテアーゼは、ペプチド内の非末端または末端アミノ酸で切断するプロテアーゼの能力に基づいて分類されるエンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼの両方を指す。代替的に、プロテアーゼはまた、６つの別個のクラス－アスパラギン酸、グルタミン酸、およびメタロプロテアーゼ、システイン、セリン、およびトレオニンプロテアーゼ（触媒の機構に基づいて分類される）を指す。「プロテアーゼ」および「ペプチダーゼ」という用語は、ペプチド結合を加水分解する酵素を指すために互換的に使用される。プロテアーゼはまた、特異的プロテアーゼおよび非特異的プロテアーゼに分類される。本明細書で使用される場合、「特異的プロテアーゼ」という用語は、ペプチドの特定のアミノ酸側鎖でペプチド基質を切断する能力を有するプロテアーゼを指す。本明細書で使用される場合、「非特異的プロテアーゼ」という用語は、ペプチドの特定のアミノ酸側鎖でペプチド基質を切断する能力が低下したプロテアーゼを指す。切断優先性は、タンパク質配列中の切断されたアミノ酸の総数に対する切断部位としての特定のアミノ酸の数の比に基づいて決定され得る。
タンパク質は、場合により、特徴付けの前に調製することができる。一部の例示的な一部の実施形態では、タンパク質調製は、タンパク質消化のステップを含む。一部の特定の例示的な実施形態では、タンパク質調製は、タンパク質消化のステップを含み、タンパク質消化は、トリプシンを用いて行うことができる。
一部の例示的な実施形態では、タンパク質調製は、タンパク質消化のステップの前に、タンパク質を変性させるステップ、タンパク質を還元するステップ、タンパク質を緩衝するステップ、および／または試料を脱塩するステップを含み得る。これらのステップは、必要に応じて任意の好適な方法で達成することができる。
ペプチドマッピング分析またはインタクトな質量分析のいずれかを使用して、異なるタンパク質属性の特徴付けを提供するために、広範な様々なＬＣ－ＭＳベースのアッセイが行われ得る。
本明細書中で使用される場合、「液体クロマトグラフィー」という用語は、液体によって運ばれる化学混合物が、固定された液相または固相の周りまたは上を流れる際の化学物質の示差的分布の結果として、成分に分離され得るプロセスをいう。液体クロマトグラフィーの非限定的な例としては、逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィーが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「質量分析計」という用語は、特定の分子種を検出し、それらの質量を正確に測定することができるデバイスを指す。この用語は、ポリペプチドまたはペプチドが検出および／または特徴付けのために溶出され得る任意の分子検出器を含むことを意味し得る。質量分析計は、３つの主要部分、すなわちイオン源、質量分析器、および検出器からなる。イオン源の役割は、気相イオンを生成することである。検体原子、分子、またはクラスタは、気相に移動され、同時に（エレクトロスプレーイオン化におけるように）イオン化され得る。イオン源の選択は用途に依存する。
本明細書で使用される場合、「質量分析器」は、種、すなわち、原子、分子、またはクラスタを、それらの質量に従って分離することができるデバイスを指す。使用され得る質量分析器の非限定的な例は、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁気／電気セクタ、四重極質量フィルタ（Ｑ）、四重極イオントラップ（ＱＩＴ）、オービトラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、および加速器質量分析（ＡＭＳ）の技術である。
本明細書で使用される場合、「質量電荷比」または「ｍ／ｚ」は、統一原子質量単位でのイオンの質量をその電荷数（符号にかかわらず）で除算することによって形成される無次元量を示すために使用される。概して、荷電状態は、イオン化の方法（エレクトロスプレーイオン化として、ＥＳＩは、ＭＡＬＤＩほど頻繁ではない多重イオン化を促進する傾向がある）、ペプチド長（より長いペプチドは、さらなるプロトンが結合され得るより多くの基（塩基性残基）を有するため）、ペプチド配列（一部のアミノ酸（例えば、ＡｒｇまたはＬｙｓ）は、他のアミノ酸よりもイオン化に対してより感受性であるため）、機器設定、溶媒ｐＨ、および溶媒組成に依存する。
本明細書中で使用される場合、「タンデム質量分析」という用語は、試料分子についての構造情報が、複数段階の質量選択および質量分離を使用することによって得られ得る技術をいう。前提条件は、試料分子を気相に移動させ、無傷でイオン化することができ、第１の質量選択ステップ後に、ある予測可能かつ制御可能な方法で分解するように誘導することができることである。多段階ＭＳ／ＭＳまたはＭＳｎは、意味のある情報を得ることができるか、または断片イオン信号が検出可能である限り、最初に前駆体イオン（ＭＳ２）を選択および単離し、それを断片化し、一次断片イオン（ＭＳ３）を単離し、それを断片化し、二次断片（ＭＳ４）を単離することなどによって行うことができる。タンデムＭＳは、多種多様な分析器の組み合わせを用いて正常に実施されている。特定の用途のためにどの分析器を組み合わせるかは、感度、選択性、および速度だけでなく、サイズ、コスト、および可用性などの多くの異なる要因によって決定することができる。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリは、タンデムインスペースとタンデムインタイムであるが、タンデムインタイム分析器が空間内またはタンデムインスペース分析器と結合されているハイブリッドも存在する。
タンデムインスペース質量分析計は、イオン源と、前駆イオン活性化デバイスと、少なくとも２つの非トラップ質量分析器とを備える。特定のｍ／ｚ分離機能は、機器の１つのセクションにおいて、イオンが選択され、中間領域において解離され、次いで、生成イオンが、ｍ／ｚ分離およびデータ取得のために別の分析器に伝送されるように設計されることができる。
時間タンデム質量分析計では、イオン源内で生成されたイオンは、同じ物理的デバイス内で捕捉、単離、断片化、およびｍ／ｚ分離されることができる。
本明細書で使用される「標的質量分析」は、特定の時間に特定の質量（ｍ／ｚ）のイオンに対して多段階のタンデム質量分析（ＭＳｎ、ｎ＝２または３）を使用する質量分析技術である。ｍ／ｚおよび時間の値は、過去の分析から導出される包含リストにおいて定義される。
本明細書で使用される場合、「四重極－オービトラップハイブリッド質量分析計」という用語は、四重極質量分析計をオービトラップ質量分析器に結合することによって作製されるハイブリッドシステムを指す。四重極－オービトラップハイブリッド質量分析計を使用するタンデムインタイム実験は、四重極質量分析計からの選択された狭いｍ／ｚ範囲内のイオンを除くすべてのイオンの放出から開始する。選択されたイオンは、オービトラップに挿入され、低エネルギーＣＩＤによって最も頻繁に断片化され得る。トラップのｍ／ｚ許容範囲内の断片はトラップ内に残るはずであり、ＭＳ－ＭＳスペクトルを得ることができる。ＱＩＴ－ＦＴＩＣＲおよびＱｑ－ＦＴＩＣＲなどであるがこれらに限定されない類似のハイブリッド系を高速タンパク質配列決定に使用することができる。
本明細書中で使用される場合、「タンパク質デノボ配列決定」という用語は、他の供給源から得られる情報に依存することなく、ペプチドのアミノ酸配列を決定するための手順をいう。質量分析の高いレベルの感度に起因して、この技術は、しばしば従来の配列決定方法の能力を超える重要な情報を提供し得る。
本明細書で使用される場合、「タンパク質配列カバレッジ」という用語は、同定されたペプチドによってカバーされるタンパク質配列のパーセンテージを指す。カバレッジ率は、すべての見出されたペプチド中のアミノ酸の数を、全タンパク質配列中のアミノ酸の総数で除算することによって計算することができる。
本明細書中で使用される場合、「データベース」という用語は、データベース中のすべての可能な配列に対して、解釈されていないＭＳ－ＭＳスペクトルを検索する可能性を提供するバイオインフォマティクスツールをいう。かかるツールの非限定的な例は、Ｍａｓｃｏｔ（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｗｗｗ．ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）またはＳｅｑｕｅｓｔ（ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）である。
一般的な説明
上記から、化合物の検出および特徴付けを改善するための改善された方法およびシステムに対する必要性が存在することが理解される。開示された発明は、この必要性を満たす。抗体プロセス開発のためなど、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＣ）による高信頼度の化合物同定のための方法が本明細書に開示される。本明細書に開示される実施形態は、多重化標的ＳＩＭと反復ＭＳ２ ＤＤＡ取得とを組み合わせることによって、ロバストで高感度の試料特徴付けのための方法を提供する。
上記から、化合物の検出および特徴付けを改善するための改善された方法およびシステムに対する必要性が存在することが理解される。開示された発明は、この必要性を満たす。抗体プロセス開発のためなど、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＣ）による高信頼度の化合物同定のための方法が本明細書に開示される。本明細書に開示される実施形態は、多重化標的ＳＩＭと反復ＭＳ２ ＤＤＡ取得とを組み合わせることによって、ロバストで高感度の試料特徴付けのための方法を提供する。
一部の例示的な実施形態は、本方法は、試料を、試料成分を生成するための試料分離が可能な液体クロマトグラフィーシステムに提供することと、多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって試料成分を分析して包含リストを生成することと、包含リストから反復質量スペクトルデータ依存取得（ＤＤＡ）を実行して、個々の試料成分を同定し、それによって試料を特徴付けることと、を含む。
一部の実施形態では、試料を、試料成分を生成するための試料分離が可能な液体クロマトグラフィーシステムに提供することは、試料を、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）システム、イオン交換クロマトグラフィーシステム、サイズ排除クロマトグラフィーシステム、アフィニティークロマトグラフィーシステム、親水性相互作用クロマトグラフィーシステム、または疎水性クロマトグラフィーシステムに提供することを含む。
一部の実施形態では、液体クロマトグラフィーシステムは、ＲＰＬＣシステムである。一部の特定の実施形態では、ＲＰＬＣ分析は、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＳ Ｆ５－３カラムを使用して行われる。カラム温度は、例えば、市販のカラムヒーターを使用して、クロマトグラフィーの実行を通して一定温度に維持することができる。一部の実施形態では、カラムは、約１８℃～約７０℃、例えば、約３０℃～約６０℃、約４０℃～約５０℃、例えば、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、または約７０℃の温度で維持される。一部の実施形態では、カラム温度は約４０℃である。一部の実施形態では、実行時間は、約１５～約２４０分、例えば、約２０～約７０分、約３０～約６０分、約４０～約９０分、約５０分～約１００分、約６０～約１２０分、約５０～約８０分であり得る。
一部の実施形態では、移動相は水性移動相である。代表的な水性移動相は、１４０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１０ｍＭ重炭酸アンモニウムを含有する。ＵＶトレースは、典型的には２１５および２８０ｎｍで記録される。
一部の例示的な実施形態では、タンパク質を溶出するために使用される移動相は、質量分析計と適合し得る移動相であり得る。
一部の例示的な実施形態では、液体クロマトグラフィーデバイスで使用される移動相は、水、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸、ギ酸、またはそれらの組み合わせを含み得る。
一部の例示的な実施形態では、移動相は、液体クロマトグラフィーデバイス内で約０．１ｍｌ／分～約０．４ｍｌ／分の流量を有し得る。一態様では、液体クロマトグラフィーデバイス内の移動相の流量は、約０．１ｍｌ／分、約０．１５ｍｌ／分、約０．２０ｍｌ／分、約０．２５ｍｌ／分、約０．３０ｍｌ／分、約０．３５ｍｌ／分、または約０．４ｍｌ／分であり得る。
一部の実施形態では、多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって試料成分を分析して包含リストを生成することは、イオントラップまたはオービトラップ質量分析器を利用することを含む。一部の実施形態では、イオントラップまたはオービトラップ質量分析器は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計である。
一部の実施形態では、多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって試料成分を分析して包含リストを生成することは、複数のセグメントが含まれ、各セグメントが複数のウィンドウを有する質量比ウィンドウ設定をセグメント化することを含む。一部の実施形態では、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個以上のセグメントが使用される。一部の実施形態では、３個のセグメントが使用される。一部の実施形態では、４個のセグメントが使用される。
一部の実施形態では、各セグメントは、同じ幅の複数のウィンドウを含む。一部の実施形態では、少なくとも２個以上のウィンドウが使用され、例えば、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のウィンドウが使用される。一部の実施形態では、各セグメントは１０個のウィンドウを含む。
一部の実施形態では、ウィンドウ幅は複数のセグメントの間で変化する。例えば、最も関心のあるｍ／ｚの範囲におけるウィンドウ幅は、あまり関心のないｍ／ｚの範囲よりも狭い。一部の実施形態では、セグメント１および２は、セグメント３および４よりも狭い幅のウィンドウ幅を有する。例えば、図２に示されるように、例示的なレジメンは、６０～７６０．５ｍ／ｚの範囲の４個のセグメント、すなわち、セグメント１（６０ｍ／ｚ～１５５．５ｍ／ｚ、ウィンドウ幅１０Ｄａ）と、セグメント２（１５５ｍ／ｚ～２５０．５ｍ／ｚ、ウィンドウ幅１０Ｄａ）と、セグメント３（２５０ｍ／ｚ～５０５．５ｍ／ｚ、ウィンドウ幅２５ＤＡ）と、セグメント４（５０５．５ｍ／ｚ～７６０．５ｍ／ｚ、ウィンドウ幅２５Ｄａ）と、を含むことができ、各セグメントは、１０個のウィンドウおよび隣接するウィンドウ間の０．５Ｄａの重複を含む。
実施形態では、包含リストの生成に続いて、本方法は、包含リストから反復ＭＳ２ ＤＤＡを実行して、個々の試料成分を同定し、それによって試料を特徴付けることを含む。
一部の例示的な実施形態では、反復ＭＳ ＤＤＡは、セグメント化四重極質量フィルタを備えたイオントラップまたはオービトラップ質量分析器を利用する。
一部の例示的な実施形態では、反復ＭＳ ＤＤＡは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計などの、セグメント化四重極質量フィルタを備えた市販のイオントラップまたはオービトラップ質量分析器を利用する。
一部の例示的な実施形態では、データは、反復ＭＳ ＤＤＡに続いて処理される。
一部の実施形態では、試料は、流加細胞培養、連続細胞培養または灌流細胞培養において使用される細胞培養培地などの細胞培養培地である。
一部の実施形態では、試料細胞培養培地は、大豆ベースの細胞培養培地である。
一部の例示的な実施形態では、細胞培養培地は、哺乳動物系などの組換え細胞ベースの産生系のためのものである。一部の実施形態では
一部の実施形態では、本方法は、組換え細胞ベースの産生系とのインキュベーションの前または後に、細胞培養培地内の成分およびそれらの代謝産物を特徴付けるためのものである。一部の実施形態では、組換え細胞ベースの産生系は、タンパク質産生のためのものである。例示的なタンパク質としては、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体、抗体断片または多重特異性抗体である。
一部の例示的な実施形態は、抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプのモノクローナル抗体などであるが、これらに限定されないモノクローナル抗体である。
一部の例示的な実施形態では、タンパク質は治療用タンパク質である。
一部の例示的な実施形態では、タンパク質は免疫グロブリンタンパク質であり得る。
例示的な一実施形態では、タンパク質はタンパク質変異体であり得る。
例示的な一実施形態では、タンパク質は翻訳後修飾タンパク質であり得る。
例示的な一実施形態では、翻訳後修飾タンパク質は、切断、Ｎ末端伸長、タンパク質分解、Ｎ末端のアシル化、ビオチン化、Ｃ末端のアミド化、酸化、糖鎖形成、ヨード化、補欠分子族の共有結合、アセチル化、アルキル化、メチル化、アデニル化、ＡＤＰリボシル化、ポリペプチド鎖内またはポリペプチド鎖間の共有架橋、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性修飾、ビタミンＫ依存性修飾、グルタミル化、グリシル化、糖鎖形成、脱糖鎖形成、イソプレニル化、リポイル化、ホスホパンテテイニル化、リン酸化、硫酸化、シトルリン化、脱アミド化、ジスルフィド架橋の形成、タンパク質分解切断、ＩＳＧ化、ＳＵ ＭＯ化またはユビキチン化（タンパク質ユビキチンへの共有結合）によって形成され得る。
例示的な一実施形態では、翻訳後修飾タンパク質は、タンパク質の酸化時に形成され得る。
別の例示的な実施形態では、細胞培養培地は、治療用タンパク質の翻訳後修飾などの分解産物を含むことができる。
一部の例示的な実施形態では、タンパク質は、約４．５～約９．０の範囲のｐＩを有するタンパク質であり得る。一態様では、タンパク質は、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０のｐＩを有するタンパク質であり得る。
一部の実施形態では、同定された成分は、少なくとも２桁、例えば少なくとも３桁、少なくとも４桁以上の存在量ダイナミックレンジを有するアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、同定された成分は、図７に提供される化合物のうちの１つ以上を含む。
一部の例示的な実施形態では、検出される１つ以上の化合物／成分は、１つ以上の産物関連不純物を含み得る。例示的な産物関連不純物は、分子変異体、前駆体、分解産物、断片化タンパク質、消化産物、凝集体、翻訳後修飾形態またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。
一部の特定の例示的な実施形態では、検出される１つ以上の化合物／成分は、プロセス関連不純物であり得る。プロセス関連不純物は、製造プロセスに由来する不純物、例えば、核酸および宿主細胞タンパク質、抗生物質、血清、他の培地成分、酵素、化学的および生化学的処理試薬、無機塩、溶媒、担体、リガンド、ならびに細胞培養培地中に存在または放出され得る製造プロセスで使用される他の浸出物を含み得る。
一部の実施形態では、開示される方法は、細胞培養培地分析のための化合物同定の方法であり、方法は、細胞培養培地の試料を、試料成分を生成するための試料分離が可能な液体クロマトグラフィーシステムに提供することと、多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって試料成分を分析して包含リストを生成することと、包含リストから反復質量スペクトルデータ依存取得（ＤＤＡ）を実行して、細胞培養培地内の個々の化合物を同定することと、を含む。一部の例では、方法は、抗体などの組換えタンパク質を産生する細胞を、例えば細胞培養培地中で培養することと、細胞培養培地成分を特徴付ける前に所望の時点で細胞培養物から試料を得ることとをさらに含む。
一部の実施形態では、方法は、開示された方法を使用することによって細胞培養培地成分を同定し、続いて、細胞培養の１つ以上の培養条件を変更して、タンパク質の細胞培養中に産生される特徴付けられた化合物の量を減少させることを含む。変化させることができる細胞培養の例示的な条件としては、温度、ｐＨ、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子濃度、撹拌、ガス分圧、界面活性剤、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、抗体などのタンパク質を産生する細胞は、ＣＨＯ細胞である。他の実施形態では、細胞はハイブリドーマ細胞である。
以下の実施例は、本発明の方法をどのように作製および使用するかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段に示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約２５℃であり、圧力は大気圧またはそれに近い。
実施例１：材料および方法
プールした大豆加水分解物を、マトリックスとしてのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶解した。安定同位体標識化合物標準を、数ナノモルから数百ミリモル濃度の範囲の最終濃度で添加した。逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）分離のために、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＳ Ｆ５－３カラムを使用した。多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）はＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計で実施して、包含リストを生成した。包含リストからの反復ＭＳ２データ依存取得（ＤＤＡ）を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計で行った。比較として、ＭＳ１フルスキャンとそれに続く従来のＭＳ２ ＤＤＡを行った。データ処理にはＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ３．１を使用した。
プールした大豆加水分解物を、マトリックスとしてのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶解した。安定同位体標識化合物標準を、数ナノモルから数百ミリモル濃度の範囲の最終濃度で添加した。逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）分離のために、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＳ Ｆ５－３カラムを使用した。多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）はＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計で実施して、包含リストを生成した。包含リストからの反復ＭＳ２データ依存取得（ＤＤＡ）を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計で行った。比較として、ＭＳ１フルスキャンとそれに続く従来のＭＳ２ ＤＤＡを行った。データ処理にはＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ３．１を使用した。
実施例２：多重化標的ＳＩＭおよび反復ＭＳ２ ＤＤＡ取得による、細胞培養培地分析のためのロバストな化合物同定の増加。
実施例１に記載の材料および方法を使用して、多重化標的ＳＩＭおよび反復ＭＳ２ ＤＤＡ取得を行った。図１は、２つのタイプのＭＳ１データ取得、すなわち、（１）従来のフルスキャンＭＳ１取得、および（２）本明細書に開示される実施形態による、標的ＳＩＭ ＭＳ１取得を図示する概略図を提供する。標的ＳＩＭ ＭＳ１取得は、サイズに基づく分子の選別に依存する。比較すると、フルスキャンＭＳ１は、サイズにかかわらず特定の数の分子を検出する。図示のように、標的ＳＩＭ ＭＳ１取得は、特定の数の各サイズの分子のみが検出されるので、より低い存在量の種の検出を可能にし、それによって検出の信頼性が改善される。標的ＳＩＭ ＭＳ１は、最適化注入時間および単離ウィンドウを含んでいた。
実施例１に記載の材料および方法を使用して、多重化標的ＳＩＭおよび反復ＭＳ２ ＤＤＡ取得を行った。図１は、２つのタイプのＭＳ１データ取得、すなわち、（１）従来のフルスキャンＭＳ１取得、および（２）本明細書に開示される実施形態による、標的ＳＩＭ ＭＳ１取得を図示する概略図を提供する。標的ＳＩＭ ＭＳ１取得は、サイズに基づく分子の選別に依存する。比較すると、フルスキャンＭＳ１は、サイズにかかわらず特定の数の分子を検出する。図示のように、標的ＳＩＭ ＭＳ１取得は、特定の数の各サイズの分子のみが検出されるので、より低い存在量の種の検出を可能にし、それによって検出の信頼性が改善される。標的ＳＩＭ ＭＳ１は、最適化注入時間および単離ウィンドウを含んでいた。
特に、図２は、６０～７６０．５ｍ／ｚの範囲の４個のセグメント、すなわち、セグメント１（６０ｍ／ｚ～１５５．５ｍ／ｚ、ウィンドウ幅１０Ｄａ）と、セグメント２（１５５ｍ／ｚ～２５０．５ｍ／ｚ、ウィンドウ幅１０Ｄａ）と、セグメント３（２５０ｍ／ｚ～５０５．５ｍ／ｚ、ウィンドウ幅２５ＤＡ）と、セグメント４（５０５．５ｍ／ｚ～７６０．５ｍ／ｚ、ウィンドウ幅２５Ｄａ）と、を含む例示的な調整可能ウィンドウ選択レジメンを示す概略図を提供する。各セグメントは、１０個のウィンドウおよび隣接するウィンドウ間の０．５Ｄａの重複を含んでいた。ウィンドウの幅はセグメント間で変化したが、特定のセグメント内では異なっていなかった。特に関心のある領域は、より小さいウィンドウ幅を有していた。図３は、従来のフルスキャンＭＳ１取得（上のトレース）または本明細書に開示される実施形態による調整可能ウィンドウＳＩＭ ＭＳ１取得（下のトレース）のいずれかに続いて取得されたＭＳ１スペクトルを示している。ＭＳ１フルスキャンと比較して、多重化標的ＳＩＭは、一部のスパイクインされた安定同位体標識化合物について、よりクリーンなバックグラウンドおよびより高い強度を提供した。例えば、１０ｎＭの安定同位体標識ヒスチジンは、多重化標的ＳＩＭ法によってのみ観察された。
ＭＳ１フルスキャンまたは多重化標的ＳＩＭの後、ＭＳ２ ＤＤＡを行った。図４は、２つのタイプのＭＳ２ ＤＤＡ、すなわち（１）従来のＤＤＡ ＭＳ２取得および（２）本明細書に開示される実施形態による反復ＤＤＡ ＭＳ２プラットフォームを図示する概略図を示している。
図５は、非常に豊富な種のみが選択され断片化された従来のＤＤＡ ＭＳ２取得と比較して、より多くの種が選択され断片化された反復ＭＳ２データ取得結果を示している。図６は、試料を特徴付ける従来の方法と、本明細書に開示される実施形態による、調整可能ウィンドウＳＩＭ取得と反復ＭＳ２取得との組み合わせを使用する方法とを比較する概略図を示している。図７に示されるように、調整可能ウィンドウＳＩＭ取得と反復ＭＳ２取得との組み合わせは、少なくとも４桁の大きさの存在量ダイナミックレンジを有するアミノ酸、ジペプチド、トリペプチドなどを含む、大豆加水分解物試料中の非常に複雑な様々な成分を同定した。図８は、反復ＭＳ２取得の強度を示すグラフを示している。上の線は、質量フィルタ除外リスト上のエントリの数を表し、下の線は、質量フィルタ包含リスト上のエントリの数であり、それぞれ反復注入に関連する。図示されるように、反復注入が増加するにつれて、種の除外リストは増加し、一方、包含リストは減少している。これにより、次に、より低い存在量の種の検出が可能となる。反復ＭＳ２ ＤＤＡにおいて、ブランク実行におけるバックグラウンドイオンは、試料の実行中に正常に排除された。複数回の反復実行を用いて、ＭＳ２スキャンを、はるかに低い存在量のイオンでトリガした。他のオンラインデータベースに加えて、正確な質量、保持時間および断片化スペクトルを含むインハウスライブラリに対して検索することによって、高速かつ高信頼度の成分同定を達成した。開示される方法は、細胞代謝産物を分析するために、例えば、細胞培養開発中のＣＨＯ細胞代謝産物分析のために適用され得ることが企図される。
全体として、開示される方法は、抗体プロセス開発を改善するために使用することができる、細胞培養培地ならびにその中の個々の成分および代謝産物などの試料を特徴付けるためのよりロバストで感度の高い方法を提供する。
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
Claims (36)
- 試料を特徴付ける方法であって、
前記試料を、試料成分を生成するための試料分離が可能な液体クロマトグラフィーシステムに提供することと、
多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって試料成分を分析して包含リストを生成することと、
前記包含リストから反復質量スペクトルデータ依存取得（ＤＤＡ）を実行して、個々の試料成分を同定することと、を含む、方法。 - 前記液体クロマトグラフィーシステムは、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）システムである、請求項１に記載の方法。
- 多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって断片化試料を分析して包含リストを生成することは、イオントラップまたはオービトラップ質量分析器を利用することを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
- 反復質量スペクトルＤＤＡを実行することは、セグメント化四重極質量フィルタが取り付けられたイオントラップまたはオービトラップ質量分析器を利用することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって試料成分を分析して包含リストを生成することは、複数のセグメントが含まれ、各セグメントが複数のウィンドウを有する質量比ウィンドウ設定をセグメント化することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 複数のセグメントは、３個のセグメントである、請求項５に記載の方法。
- 複数のセグメントは、４個のセグメントである、請求項５に記載の方法。
- 複数のウィンドウは、１０個のウィンドウである、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
- セグメント内の各ウィンドウは、同じウィンドウ幅を有する、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料は、細胞培養培地である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は、前記細胞培養培地内の成分およびそれらの代謝産物を特徴付けるためのものである、請求項９に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、大豆ベースの細胞培養培地である、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、組換え細胞ベースの産生系のためのものである、請求項１０または１１に記載の方法。
- 前記方法は、組換え細胞ベースの産生系とのインキュベーション後の前記細胞培養培地内の成分およびそれらの代謝産物を特徴付けるためのものである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換え細胞ベースの産生系は、哺乳動物系である、請求項１４に記載の方法。
- 前記組換え細胞ベースの産生系は、タンパク質産生のためのものである、請求項１４に記載の方法。
- 前記タンパク質は、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせである、請求項１６に記載の方法。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプのものである、請求項１８に記載の方法。
- 細胞培養培地分析のための化合物同定の方法であって、
細胞培養培地の試料を、試料成分を生成するための試料分離が可能な液体クロマトグラフィーシステムに提供することと、
多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって試料成分を分析して包含リストを生成することと、
前記包含リストから反復質量スペクトルデータ依存取得（ＤＤＡ）を実行して、前記細胞培養培地を用いて個々の化合物を同定することと、を含む、方法。 - 前記液体クロマトグラフィーシステムは、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）システムである、請求項２０に記載の方法。
- 多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって断片化試料を分析して包含リストを生成することは、イオントラップまたはオービトラップ質量分析器を利用することを含む、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
- 反復質量スペクトルＤＤＡを実行することは、セグメント化四重極質量フィルタが取り付けられたイオントラップまたはオービトラップ質量分析器を利用することを含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 多重化標的選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって試料成分を分析して包含リストを生成することは、複数のセグメントが含まれ、各セグメントが複数のウィンドウを有する質量比ウィンドウ設定をセグメント化することを含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 複数のセグメントは、３個のセグメントである、請求項２４に記載の方法。
- 複数のセグメントは、４個のセグメントである、請求項２４に記載の方法。
- 複数のウィンドウは、１０個のウィンドウである、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
- セグメント内の各ウィンドウは、同じウィンドウ幅を有する、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、大豆ベースの細胞培養培地である、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、組換え細胞ベースの産生系のためのものである、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培養培地試料は、組換え細胞ベースの産生系とのインキュベーション後に得られる細胞培養培地試料である、請求項２０～３０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組換え細胞ベースの産生系は、哺乳動物系である、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
- 前記組換え細胞ベースの産生系がタンパク質産生のためのものである、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
- 前記タンパク質は、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせである、請求項３３に記載の方法。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項３４に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプのものである、請求項３５に記載の方法。
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