RO121829B1

RO121829B1 - Metodă de diagnostic al unei encefalopatii spongiforme subacute transmisibile, determinate de un agent transmisibil neconvenţional, într-o mostrăbiologică

Info

Publication number: RO121829B1
Application number: ROA200200588A
Authority: RO
Inventors: Jean-Philippe Deslys; Emmanuel Comoy; Jacques Grassi
Original assignee: Commissariat A L'energie Atomique
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 2000-11-13
Publication date: 2008-05-30
Also published as: ZA200203342B; ES2280263T3; DE60032932T2; BG65933B1; FR2801106B1; CA2390891A1; US7097997B1; CN100383529C; EP1232395A1; US20060084130A1; PT1232395E; DZ3229A1; BG106686A; US7429463B2; EP1232395B1; DE60032932D1; JP4842478B2; CA2390891C; FR2801106A1; MA26043A1

Abstract

Invenţia se referă la o metodă de diagnostic al unei encefalopatii spongiforme, subacute, transmisibile, determinate de o tulpină de agent transmisibil, neconvenţional. Metoda constă în: (1) tratarea mostrei cu cel puţin o proteinază K, astfel încât să se degradeze complet PrP-sens încondiţiile în care toate sau parte dintre motivele octapeptidice repetate ale PrP-res sunt conservate, oricare ar fi tulpina; (2) contactarea mostrei tratate cu un ligand capabil să identifice, în mod specific, motivele octapeptidice repetate, ?i (3) detectarea prezenţei posibile a complexului ligand - motive octapeptidice repetate. Invenţia se referă, de asemenea, la o metodă de diagnostic diferenţial.

Description

Prezenta invenție se referă la o metodă de diagnostic al unei encefalopatii spongiforme subacute transmisibile, determinată de un agent transmisibil neconvențional, într-o mostră biologică.

Encefalopatiile spongiforme subacute transmisibile (ESST) sunt determinate de agenți transmisibili neconvenționali (ATNC) numiți, de asemenea, prioni, a căror natură precisă rămâne disputată până în prezent. în mod esențial, ESST cuprind boala Creutzfeldt-Jakob la oameni (CJD), scrapie la oi și capre și encefalopatia spongiformă bovină (BSE) la bovine. Alte encefalopatii au fost demonstrate la Felidae, la nurcă sau anumite animale sălbatice, cum ar fi cerbul sau elanul.

Aceste boli sunt întotdeauna fatale și, până în prezent, nu există nici un tratament eficient.

în ESST, există o acumulare a unei proteine de la gazdă, PrP (sau proteină prionică), într-o formă anormală (PrP-res), în principal în sistemul nervos central; PrP-res copurificată, cu infecțiozitate și acumularea sa precede apariția leziunilor histologice. In vitro, ea este toxică pentru culturile de neuroni.

Cele două izoforme de PrP au aceeași secvență de aminoacizi (vezi fig. 1) însă sunt diferite în structura lor secundară: PrP-res are un conținut în mod semnificativ mai mare de foi plisate β, în timp ce PrP normal (PrP-sens) are un număr mai mare de elice a.

în general, două proprietăți biochimice fac posibilă distingerea acestor două izoforme.

- PrP-res este parțial rezistentă la proteaze, în special la proteinaza K (PK), care determină clivarea capătului său N-terminal. După acțiunea PK, PrP-res este adesea numită PrP 27-30 din cauza greutății moleculare aparente a formei diglicozilate; este în general acceptat că situsul de clivaj al PrP-res este localizat între aminoacizii 89 și 90 (Prusiner și alții, Cell, 1984) pentru tulpinile convenționale.

- PrP-res este insolubilă în detergenți neionici, cum ar fi Triton X100 sau Triton X114.

Forma normală a proteinei prionice (PrP-sens) este, în principiu, complet degradată de proteaze și este total solubilă în prezența detergenților neionici.

Secvențele peptidice ale PrP-sens de hamster, om, bovine, și ovine sunt prezentate în fig. 1; ele cuprind în special un motiv octapeptidic (P (H/Q) GGG (-/T) WGQ), repetat de 4 sau 5 ori, depinzând de specie. Această repetare a motivului octapeptidic corespunde aminoacizilor 51-91 ai PrP (numerotarea secvenței PrP umane) (B. Oesch și alții, 1991).

Pentru detectarea prezenței agentului infecțios, cele mai recente metode sunt bazate pe detectarea selectivă a PrP anormale (PrP-res) legate la agentul infecțios, folosind avantajul rezistenței sale parțiale la proteaze.

Se pot distinge:

- metodele Western blot care sunt bazate pe detectarea imunologică a PrP-resîntr-un extract de țesut după tratarea extractului cu o protează astfel încât să se distrugă izoforma normală a PrP (PrP-sens), separarea proteinelor extractului prin electroforeză, transferul pe o membrană polimerică și detectarea cu un anticorp specific care recunoaște PrP (Schaller O. și alții, 1999),

- testele de tip ELISA, care, de asemenea, implică tratarea extractului de țesut cu o protează.

Printre aceste diferite teste, care implică tratarea extractelor de țesut cu o protează, pot fi menționate:

- cel descris de Serban și alții (Neurology, 1990, 40, 110), care a dezvoltat un test pentru detectarea PrP-res care include imobilizarea proteinelor pe o membrană de nitroceluloză, urmată de digestie cu protează, denaturare și imunodetectare cu anticorpi monoclonali;

RO 121829 Β1

- cel descris de Oesch și alții (Biochemistry, 1994, 33, 5926-5931), care a propus, 1 pentru determinarea cantității de PrP-res, un test de imunofiltrare pentru purificarea PrP-res (ELIFA sau test de imunofiltrare cu enzimă legată);3

- cel descris de Gratwohl și alții, 1997, care propun un test de tip ELISA. După tratarea mostrelor cu proteinază K și purificarea PrP-res prin centrifugare, acesta din urmă este5 adsorbită pe plăci de microtitrare și detectată utilizând anticorpi policlonali de iepuri de casă;

- cel descris de Safar și alții, 1998, care nu folosește proteinază Kînsă compară imu- 7 noreactivitatea PrP-res imobilizate pe un suport solid în funcție dacă ea a fost sau nu supusă la un tratament de denaturare.9 în general, aceste teste diverse au neajunsul lipsei de sensibilitate, determinând astfel rezultate fals negative.11

Alte metode propun tratarea mostrei cu produse care denaturează (Oesch și alții,

1994 și 1999; WOOO/22438, The Reagentsofthe University of California, Reactivi ai Univer- 13 sității din California), o tratare limitată cu proteinază K (WO 00/29850, Wallac Oy și alții) sau tratarea cu o metalopeptidază (WO 00/22438), care face situsurile antigenice ascunse 15 accesibile, detectabile cu anticorpul monoclonal 3F4 care recunoaște regiunea 109-112 a

PrP (WO 00/29850 sau WO 00/22438). 17

Metoda descrisă în WO 00/29850, Wallac Oy și alții, are neajunsul major al lipsei de specificitate, datorate, în special, eliminării incomplete a PrP-sen în condițiile tratării re- 19 comandate, în timp ce metoda descrisă în WO 00/22438, The Reagents of the University of California, Reactivi ai Universității din California prezintă o lipsă de sensibilitate datorată uti- 21 lizării anticorpului de detectare 3F4 (WO 00/22438), care se leagă la un singur motiv de pe proteină. 23

Solicitantul a propus recent un test pentru detectarea cantitativă a PrP-res, care cuprinde o etapă de purificare care conduce la o detectare, în mod semnificativ mai sensibilă 25 și care reprezintă un mare progres pentru monitorizarea medicală și evaluarea PrP-res în abatoare. Această metodă este, în special, descrisă în cererea de brevet internațională POT 27 WO 99/41280 și într-un raport preliminar al Directoratului General XXIV al Comisiei Europene (politica consumatorului și protecția sănătății consumatorului; 29 http;//europa.eu.int/comm/ dg24/health/).

Cu toate acestea, ținând cont de cerința pentru un test îndeosebi sigur de diagnostic 31 al ESST, solicitantul a continuat studiile.

S-a stabilit în special că, în scopul de a produce un test de detectare:33 (i) care este sensibil, cu alte cuvinte care are capacitatea de a identifica, în mod corect, animalele neinfectate,35 (ii) care este specific, cu alte cuvinte care are capacitatea de a identifica, în mod corect, animalele infectate care prezintă simptome clinice,37 (iii) care are o limită de detectare cât mai joasă posibil, cu alte cuvinte care poate per- mite detectarea cantităților mici de PrP-res (detectarea de PrP-resînainte de apariția simpto- 39 melor clinice), și (iv) care este reproductibil,41 mostra biologică de analizat trebuie să fie tratată în condiții care fac posibil să se conserve toate sau unele dintre motivele octapeptidice exclusiv în PrP-res.43

S-a descoperit în special că, în scopul de a satisface, în mod eficient, cele patru condiții (i)-(iv) enunțate mai sus, este necesar să se definească condițiile precise pentru tratarea 45 mostrei de analizat, care elimină complet PrP-sens din mostră, permițând în același timp capturarea specifică a PrP-res, în condițiile definite. 47

RO 121829 Β1

Un obiect al prezentei invenții este o metodă de diagnostic (metoda A) al ESST sau al bolii prionice determinate de o tulpină de ATNC, prin detectarea PrP-res într-o eșantion biologic care cuprinde:

(1) tratarea eșantionului cu cel puțin o proteinază (PK) fie la o concentrație cuprinsă între 30 pg/ml și 2000 pg/ml, timp de 10 min., la 37°C pentru un omogenat de 10%, fie pentru o perioadă și la o concentrație care este echivalentă cu concentrația cuprinsă între 30 pg/ml și 200 pg/ml în condițile menționate mai sus, și preferabil timp de 10 min la o concentrație cuprinsă între 30 pg/ml și 200 pg/ml pentru un omogenat de 10% sau timp de 30 min. la o concentrație cuprinsă între 10 pg/ml și 70 pg/ml pentru un omogenat de 10%, în care proteinaza K este dizolvată într-o soluție tampon aleasă din grupul constând din soluții tampon de omogenizare a eșantionului biologic și soluții tampon care cuprinde cel puțin unul dintre următorii agenți: cel puțin un agent tensioactiv și/sau cel puțin un agent caotropic și/sau cel puțin o sareîntr-un asemenea mod încât să se degradeze complet proteinele PrP-sens, conservându-se în același timp toate sau unele dintre repetițiile motivului octapeptidic ale PrPres, oricare ar fi tulpina ATNC:

(2) aducerea eșantionuluui tratat în contact cu un ligand pentru motivele octapeptidice, și (3) detectarea unei eventuale prezențe a complexului de repetiții ale motivului octapeptidic-ligand.

în conformitate cu o realizare avantajoasă a metodei, tratarea cu proteinaza K este între 30 s și 2 h, la o temperatură mai mică de 80°C, de preferință între 10 min și 30 min la 37°C, la concentrațiile sus-menționate și chiar preferabil timp de 10 min la o concentrație cuprinsă între 30 pg/ml și 200 (pg/ml pentru un omogenat de 10% (concentrație finală) sau timp de 30 min la o concentrație cuprinsă între 10 pg/ml și 70 pg/ml pentru un omogenat de 10% (concentrație finală) sau la o concentrație cuprinsă între 25 pg/ml și 175 pg/ml pentru un omogenat de 25% (concentrație finală).

Trebuie notat că un anumit număr de parametri sunt strâns legați unul de celălalt: concentrația de proteinază K depinde în mod direct de durata de tratare (timp de incubație) a mostrei; poate fi considerat că, la 37°C de exemplu, o incubație de 10 min. cu o PK la o concentrație cuprinsă între 30 pg/ml și 200 pg/ml a omogenatului de 10% este echivalentă cu o incubație de 30 de min. cu o PK la o concentrație cuprinsă între 10 pg/ml și 70 pg/ml a omogenatului de 10%. De exemplu, o incubație de 30 de min. cu o PK la 25 pg/ml este echivalentă cu o incubație de 10 min. cu o PK la o concentrație de 75 pg/ml.

Indiferent de concentrația de PK și de durata de incubație, mostra tratată nu trebuie să mai conțină PrP-sens nedegradat, în timp ce PrP-res, posibil prezent, are conservate toate sau unele dintre motivele octapeptidice.

Alți parametri pot fi implicați, într-o măsură mai mică, (cu alte cuvinte, în mod neesențial) în stabilirea concentrației active de PK: aceasta implică, în special, soluția tampon în care PK este dizolvată; când PK este dizolvată în soluția tampon de omogenizare a mostrei, depinzând de soluția tampon de omogenizare utilizată, concentrația minimă de PK poate varia în domeniul de concentrații specificate mai sus:

- într-o soluție tampon de glucoză sau în guanidină (sau o sare a acesteia), concentrația minimă de PK este de preferință 25 pg/ml (incubație timp de 30 min) sau 75 p/ml (incubație timp de 10 min);

- în soluție tampon PBS, concentrația minimă de PK este, de preferință, 50 pg/ml (incubație timp de 30 min) sau 150 pg/ml (incubație timp de 10 min).

în mod avantajos, PK poate fi utilizată într-o soluție tampon care este diferită de soluția tampon de omogenizare; o astfel de soluție tampon cuprinde, în mod avantajos, cel puțin un agent tensioactiv și/sau cel puțin un agent caotropic și/sau cel puțin o sare.

RO 121829 Β1

De asemenea, în mod avantajos, după tratarea (sau incubația) mostrei cu protei- 1 nază K, suspensia obținută este în mod avantajos tratată în condițiile definite în cererea de brevet internațională 99/41280, și anume: 3

- adăugarea la suspensie a unei soluții tampon B, așa cum a fost definită în această cerere de brevet internațională 99/41280, și în special alcooli C₃-C₆ și amestecuri de alcooli,5 a căror constantă dielectrică teoretică medie este între 10 și 25,

- centrifugarea suspensiei obținute și7

- solubilizarea peletului într-o soluție tampon care cuprinde cel puțin un agent tensioactiv și/sau cel puțin un agent caotropic în condițiile definite în cererea de brevet inter- 9 națională 99/41280,

Un astfel de test are avantajul de a fi în mod special adecvat pentru diagnosticul dife-11 rențial al ESST în aceeași gazdă, deterninate de tulpini diferite de ATNC și în special pentru diagnosticul diferențial al tulpinilor BSE comparativ cu tulpinile convenționale ale scrapiei la 13 oi.

De exemplu, a fost arătat că tulpina BSE a infectat oameni în Marea Britanie, prin 15 analizarea profilelor electroforetice ale PrP-res, care a prezentat diferențe în migrare depinzând de tulpinile de ATNC; un profil caracteristic (tip 4) a fost descoperit la pacienții care 17 dezvoltă o variantă nouă a bolii Creutzfeld-Jacob (vCJD), care pare să fie legată de trecerea vitelor infectate cu agentul BSE în hrana umană (Collinge și alții, Nature, 1996). Un profil si- 19 milar a fost observat la un macac infectat cu agentul BSE (Lasmezas și alții, 1996) și la o pisică probabil contaminată cu acest agent (Priola și alții, Nature Med., 1996). 21

Această metodă durează însă un timp îndelungat și este complicat să se implementeze dacă sunt dorite rezultate reproductibile, ceea ce probabil constituie un ele- 23 ment al controversei care există privind clasificarea diferitelor tipuri de PrP-res și utilizarea acestei metode (Parchi și alții, Nature, 1997). 25

Există, de asemenea, o suspiciune puternică a contaminării oilor cu agentul BSE (Butler, Nature, 1998). Aceste animale sunt de fapt sensibile la acest agent, cu toate că 27 printre ovine, există o boală endemică, scrapia, altă ESST, care are caracteristici clinice și histologice apropiate și nediferențiabile. Singura metodă de referință pentru diagnosticul dife- 29 rențial între agentul BSE și agentul de scrapie este inocularea la șoareci și studierea profilului lezional, ceea ce necesită o așteptare de aproximativ doi ani, și care a fost efec- 31 tuată în Marea Britanie numai pe 9 oi pentru o populație de mai multe zeci de milioane de capete de oi. 33

Primele tentative au fost făcute pentru a încerca să se distingă tulpinile diferite de ATNC într-o mostră; Kuczius T. și alții, 1999 au considerat că variațiile observate între tul- 35 pinile diferite de ESST (scrapie, BSE, CJD) folosind tehnica de glicotipare nu fac posibilă distingerea fiecărei tulpini; ei au selectat alți markeri biochimici și biologici pentru PrP-res care 37 fac posibilă distingerea tulpinilor prionice diferite una de cealaltă în mod mult mai clar.

Parametrii analitici pe care ei i-au utilizat sunt după cum urmează: rezistența pe ter- 39 men lung la proteinaza K, masa moleculară a PrP-res, topologia și cantitatea depozitelor de PrP-res. Rezultatele obținute au arătat că PrP-res ale tulpinilor diferite de BSE și de scrapie 41 prezintă diferențe semnificative în rezistența lor pe termen lung la proteinaza K. Rezistența la PK variază funcție de tulpina scrapiei: rezistență scăzută: tulpina Chandler; rezistență 43 intermediară: tulpină 22A; stabilitate relativă: tulpină 87V. în condiții similare, tulpinile de BSE prezintă rezistență intermediară. Cu toate că glicotiparea nu face posibilă distingerea între 45 tulpina 87V de scrapie și tulpinile de BSE, aceste două tipuri de tulpini pot fi în mod clar distinse după tratare pe termen lung cu PK. Acestea nu sunt însă protocoale care să fie su- 47 ficient de sigure și care să poată fi utilizate pe scară largă și pe teren.

RO 121829 Β1 în acest context, este important de a avea o metodă sigură, sensibilă pentru detectarea PrP-res care permitediagnosticdiferențial, relativ necostisitoare și ușor de efectuat, folosind o mostră biologică, cum arfi o mostră de țesut.

în consecință, un obiect al prezentei invenții este, de asemenea, o metodă de diagnostic diferențial (metoda B) al ESST determinate de tulpini de ATNC, într-un eșantion biologic, prin detectarea PrP-res asociate cu diferite tulpini de ATNC, care cuprinde:

(a) detectarea PrP-res într-o primă fracțiune din mostră, în conformitate cu etapele (1) la (3) ale metodei de diagnostic așa cum a fost definită mai sus (metoda A), și apoi:

(b) pentru fiecare eșantion pentru care în etapa (a) este detectată prezența unui complex de repetiții ale motivului octapeptidic-ligand:

- tratarea unei a doua fracțiuni din numitul eșantion cu cel puțin o proteinază K într-un asemenea mod încât majoritatea repetițiilor motivului octapeptidic sunt eliminate pentru PrPres asociată cu cel puțin o tulpină de interes, în special tulpina encefalopatiei spongiforme bovine (BSE), și astfel încât toate PrP-res asociate cu celelalte tulpini de ATNC conservă toate sau unele dintre repetițiile motivului octapeptidic,

- aducerea celei de-a doua fracțiuni a eșantionului tratat în contact cu un ligand pentru repetițiile motivului octapeptidic, și

- detectarea unei eventuale prezențe a complexului de repetiții ale motivului octopeptidic-ligand.

Un obiect al prezentei invenții este, de asemenea, o metodă de diagnostic diferențial (variantă a metodei B) al ESST determinate de tulpini de ATNC, într-o mostră biologică, considerată a conține PrP-res (teste de detectare efectuate prin oricare metodă), care cuprinde, pentru fiecare mostră pentru care prezența unei PrP-res a fost detectată:

-tratarea altei fracțiuni din numita mostră biologică conform cu etapa (b) așa cum s-a definit mai sus și aducerea acestei a doua fracțiuni din mostra tratată în contact cu un ligand capabil să recunoască în mod specific repetițiile motivului octapeptidic, și

- detectarea unei eventuale prezențe a complexului de repetiții ale motivului octapeptidic-ligand.

în contextul diagnosticului diferențial (metoda B) pe lângă concentrația de PK, alte condițiipot avea, posibil, un efect asupra degradării motivului octapeptidic, funcție de tulpină: în mod specific, când PK este utilizată într-o soluție tampon care este diferită de soluția tampon de omogenizare, cum arfi o soluție tampon care în mod avantajos, cuprinde, cel puțin un agent tensioactiv și/sau cel puțin un agent caotropic și/sau cel puțin o sare, numărul de motive octapeptidice degradate poate varia funcție de compoziția numitei soluții tampon și de concentrația diferiților agenți.

Termenul „tulpină de interes înseamnă tulpina sau tulpinile de ATNC, în special tulpina de BSE, pentru care intenția este de a elimina repetițiile motivului octapeptidic, de exemplu.

Una dintre caracteristicile principale ale metodelor A și B este de a exploata condițiile în care este efectuată tratarea cu protează, astfel încât să se controleze degradarea repetițiilor motivului octapeptidic. Funcție de utilizarea preconizată, metoda va fi efectuată astfel încât aceste motive să fie conservate (metoda A) sau distruse (metoda B):

- în contextul metodei A, scopul acestui control va fi de a conserva toate sau unele dintre repetițiile motivului octapeptidic în scopul promovării detectării foarte sensibile a PrP-res;

- în contextul metodei B, scopul supravegherii degradării cu protează va fi de a degrada majoritatea, și opțional toate, repetițiile motivului octapeptidic pentru PrP-res care corespund tulpinii (lor) de interes, oricare arfi specia în care ea (ele) este (sunt) exprimată(e),

RO 121829 Β1 în condițiile în care toate sau unele dintre repetițiile motivului octapeptidic sunt conservate 1 pentru PrP-res care corespund la toate celelalte tulpini de ESST. în acest caz avantajul invenției este de a permite diagnosticul diferențial al tulpinii de interes față de celelalte tulpini 3 de ATNC.

în mod specific: 5 în mod surprinzător, în condițiile conform etapei (1) sau etapei (a), PK nu conduce la clivarea tuturor sau a unora dintre repetițiile motivului octapeptidic din PrP-res asociate cu 7 toate tulpinile de ATNC sau prioni, în timp ce condițiile etapei (b) conduc la clivarea repetițiilor motivului octapeptidic din PrP-res asociate cu tulpina de interes, în timp ce toate 9 PrP-res asociate cu celelalte tulpini de ATNC conservă toate sau unele dintre repetițiile motivului octapeptidic. 11

De asemenea în mod surprinzător, un astfel de test, în special când ligandul este un anticorp, are avantajele care urmează: 13

- sensibilitate mare de detectare deoarece anticorpii direcționați către aceste repetiții ale motivului octapeptidic au o afinitate mult mai mare decât anticorpii direcționați către alte 15 regiuni ale PrP-res 27-30 și sunt mai rezistenți la soluțiile tampon utilizate; în mod specific, recunoașterea unui motiv repetat favorizează interacțiuni de afinitate ridicată și furnizează 17 posibilitatea de atașare a mai multor molecule de anticorpi la o singură moleculă PrP;

- posibilitatea de diagnostic diferențial al tulpinilor de ATNC sau prionilor deoarece 19 este posibil, funcție de condițiile utilizate, să se obțină sau să nu se obțină digestia acestor motive; este posibil, în special, să fie elimine acestea pentru toate bolile legate de tulpina de 21 interes, agentul pentru BSE de exemplu, în timp ce este posibil ca ele să fie conservate pentru celelalte boli „prionice. Ca rezultat al acestui fapt, metodele conform invenției propun 23 un test simplu de diagnostic diferențial al BSE și/sau al altei tulpini de interes, relativ la celelalte tulpini, prin utilizarea a două condiții diferite (etapa (1) sau (a) și etapa (b)), condițiile 25 etapei (1) sau (a) (conservarea repetițiilor motivului octapeptidic din PrP-res asociate cu toate tulpinile de ATNC) permițând detectarea tuturor tulpinilor, și condițiile etapei (b) (eli- 27 minarea acestor motive numai în PrP-res asociată cu o tulpină de interes) evidențiind numai celelalte tulpini. 29

Prin urmare, astfel de teste își găsesc o aplicare în special în investigarea contaminării oilor cu tulpina de BSE, care, în mod obișnuit, nu se poate distinge de tulpinile con- 31 venționale ale scrapiei.

în conformitate cu o realizare avantajoasă a numitelor metode, PK este dizolvată 33 într-o soluție tampon care cuprinde, de preferință:

a. cel puțin un agent tensioactiv, ales din grupul format din\ 35

- agenți tensioactivi anionici, cum ar fi SDS (sulfat de dodecilsodiu), sarcozil (laurilsarcozină), colat de sodiu, deoxicolat de sodiu sau taurocolat de sodiu; 37

- agenți tensioactivi amfoterici, cum ar fi SB 3-10 (decilsulfobetaina), SB

3-12 (dodecilsulfobetaina), SB 3-14SB 3-16 (hexadecilsulfobetaina), CHAPS 39 și dezoxi-CHAPS,

- agenți tensioactivi neionici, cum ar fi C12E8 (dodeciloctaetilenglicol),41

TRITON X100, TRITON X114, TWEEN 20, TWEEN 80, MEGA 9 (nonanoilmetilglucamină), octilglucozidă, LDAO (oxid de dodecildimetilamină)43 sau NP40, sau

- amestecuri de agenți tensioactivi, cum ar fi un amestec dintr-un agent45 tensioactiv ionic și un agent tensioactiv neionic, un amestec de odi agenți tensioactivi ionici și un agent tensioactiv amfoteric și/sau47

b. cel puțin un agent caotropic, ales din grupul format din uree și guanidină, sau un amestec al acestora, și/sau49

RO 121829 Β1

c. cel puțin o sare, aleasădintre carurile unor metale care pot fi alcaline sau nu.

în conformitate cu o realizare avantajoasă a invenției, soluția tampon cuprinde cel puțin 5% de agent tensioactiv anionic, de preferință sarcozil, în mod opțional combinat cu SDS.

în conformitate cu o altă realizare avantajoasă a acestor metode, ligandul este ales din grupul constând din aptameri și anticorpi capabili să se lege în mod specific la regiunea repetițiilor motivului octapeptidic.

Un obiect al prezentei invenții este, de asemenea, o trusă de diagnostic pentru aplicarea metodelor conform invenției, care cuprinde, în combinație, cel puțin un agent tensioactiv și/sau cel puțin un agent caotropic și/sau cel puțin o sare și o protează, așa cum au fost definite mai sus.

Complexul repetiții ale motivului octapeptidic-anticorp (când ligandul este un anticorp) este detectat prin metode imunologice standard.

Se dau, în continuare, șapte exemple de realizare a invenției, în legătură și cu fig.1...17, care reprezintă:

- fig. 1, secvențele PrP diferite: umană, de ovine, de bovine, de rozătoare și de Cricetidae-,

- fig. 2, detectarea PrP-res prin Wetern blot;

-fig. 3... 6 corespund condițiilor diferite conform, în primul rând, etapei (1)sau (a) și, în al doilea rând, etapei (b), la oameni (fig. 3 și 4) și la rumegătoare (fig. 5 și 6), când prezența repetițiilor motivului octapeptidic este detectată printr-un test imunometric care folosește două situsuri;

- fig. 7...12, ilustrează influența soluțiilor tampon în detectarea diferențială a BSE și a scrapiei;

-fig. 13 și 14, ilustrează influența compoziției soluțiilor tampon și a concentrației proteinazei K (PK) pentru detectarea tipurilor diferite de CJD;

- fig. 15, ilustrează rezultatele obținute cu digestia directă a omogenatelor de creier folosind proteinaza K;

- fig. 16, ilustrează diferențele în rezistența PrP-res la proteinaza K ca funcție de tipurile de CJD;

-fig. 17, ilustrează detectarea, prin Wetern blot, a PrP-res digerate cu PKși purificate în formă SAF.

Trebuie să fie în mod clar înțeles, cu toate acestea, că aceste exemple sunt date numai cu titlu ilustrativ al obiectului invenției, pentru care ele nu constituie în nici un fel o limitare.

Exemplul 1. Producția și caracterizarea anticorpilor monoclonali specifici pentru motivul octapeptidic repetitiv.

- Sinteza și marcarea peptidei

O peptidă reprezentativă a motivului octapeptidic repetat din PrP, de exemplu motivul G-G-W-G-Q-P-H-G-G-G-W-G-Q~G-(NH₂), care corespunde secvenței 79-92 a PrP umane, a fost sintetizată folosind un sintetizator automat (Milligen 9050, Waters, Milford, Ml).

Peptida a fost cuplată covalent la acetilcolinesterază (AchE) prin intermediul unui reactiv heterobifuncțional, 4-(N-malemidometil) ciclohexan-1-carboxilat de succinimidil (SMCC, Calbiochem, France) așa cum a fost descris anterior pentru alte peptide sau proteine (McLaughlin și alții, 1987, Grassi și alții, 1989).

Această metodă implică reacția unei grupări tiol introduse în peptidă cu funcționalitatea maleimidei care a fost atașată la AchE prin reacția cu SMCC.

RO 121829 Β1

Gruparea tiol a fost introdusă în peptidă prin reacția cu S-acetiltioacetat de 1 N-succinimidil (SATA) așa cum a fost descris anterior (McLaughlin și alții, 1987). Cuplarea a fost obținută prin reacția AchE-SMCC cu un exces de peptidă tiolată. 3

- Imunizarea și prepararea de anticorpi monoclonali

Un preparat de fibrile asociate scrapiei (SAF-uri, preparare de PrP-res) a fost obținut 5 din creiere de hamsteri infectați (tulpină 263K de scrapie) așa cum a fost descris anterior (Lasmezas și alții, 1997). 7

Aceast preparat a fost inactivat prin tratare cu acid formic, înaintea imunizării șoarecilor. Șoareci în care gena PrP a fost eliminată (șoareci PrP %) au fost imunizați cu aceste 9 preparate de SAF și celule hibridom au fost preparate așa cum a fost descris anterior (Grassi și alții, 1988,1989). Supernatantele de cultură au fost triate așa cum a fost descris mai sus. 11 A fost posibil să se identifice și să se stabilizeze 57 de hibridoame; ele au fost numite

SAF-1 până la SAF-90. Toți acești anticorpi s-au dovedit a recunoaște SAF-urile imobilizate 13 pe plăci de microtitrare, în timp ce o minoritate a lor a demonstrat o capacitate de a recunoaște conjugate peptidă-AchE. Printre cei din urmă, șapte recunosc în mod clar motivul 15 octapeptidic repetat (peptida 79-92); ei sunt anticorpii SAF-15, SAF-31, SAF-32, SAF-33, SAF-34, SAF-35 și SAF-37. 17

Lista anticorpilor obținuți precum și caracteristicile principale ale acestora sunt date în tabelul de mai jos.19

După donare și expansiune în formă de lichid ascitic, anticorpii monoclonali au fost purificați prin cromatografie de afinitate pe o coloană de proteină A - sepharose și depozitați 21 la -20’C până la utilizare.

Izotipul anticorpului a fost determinat prin imunodifuzie radială în conformitate cu teh-23 nica Ouchterlony.

- Trierea supernatantelor culturii de hibridom25

Prezența unui anticorp PrP-specifîc în supernatantele culturii de hibridom a fost demonstrată în două moduri, prin testarea capacității lor de a lega fie conjugate peptidă-AchE 27 fie SAF de hamster.

în primul caz, trierea a fost realizată pe plăci care conțin un anticorp IgG anti-șoarece 29 imobilizat așa cum a fost descris anterior (Creminon și alții, 1993, Frobert și alții, 1991).

în rezumat, 100 pl din supernatantele culturii și 100 μΙ de conjugat peptidă-AchE au 31 fost reacționați peste noapte la +4”C pe plăci care conțin anticorpi de capră IgG anti-șoarece imobilizați.33

După ce plăcile au fost spălate, 200 μΙ de reactiv Ellman (Ellman și alții, 1961) au fost adăugați în godeuri în scopul de a detecta prezența AchE atașate la faza solidă.35 în al doilea caz, plăcile care conțin un preparat de SAF imobilizat au fost pregătite prin punerea în reacție a 50 μΙ dintr-o soluție de 2 pg/ml într-o soluție tampon de fosfat 0,05 M, 37 pH 7,4, peste noapte la temperatura camerei.

După spălare, plăcile au fost saturate cu soluție tampon EIA (soluție tampon de fosfat39

100 mM, pH 7,4, care conține 150 mM NaCI, 0,1% albumină de ser bovin (BSA) și 0,01% azidă de sodiu) peste noapte la +4°C și au fost menținute la această temperatură până când 41 ele au fost utilizate.

Legarea anticorpilor monoclonali la SAF-urile imobilizate a fost evidențiată folosind 43 anticorpi de capră IgG anti-șoarece marcați cu AchE așa cum a fost descris anterior (Negroni și alții, 1998).45

RO 121829 Β1

Anticorpi monoclonali produși împotriva unui preparat de SAF de hamster

Anticorpi monoclonali	Izotip	Peptidă recunoscută	Anticorpi monoclonali	Izotip	Peptidă recunoscută
SAF 1	IgM	X	SAF 54*	lgG2b	142-160
SAF 2	?	A	SAF 56	IgM	A
SAF 3	lgG2a	X	SAF 58	IgM	A
SAF 4	lgG2a	A	SAF 59	IgM	A
SAF 5	IgGI	X	SAF 60*	lgG2b	142-160
SAF 7	lgG2a	X	SAF 61	lgG2a	142-160
SAF 8	IgGI	A	SAF 63	IgM	A
SAF 9	IgGI	A	SAF 65	igGK?)	A
SAF 10	IgGI	A	SAF 66	lgG2a	142-160
SAF 11	lgG2a	X	SAF 67	IgGI	X
SAF 12	IgM	A	SAF 68	lgG2a	X
SAF 13	IgM	A	SAF 69*	lgG2b	142-160
SAF 14	IgGI	A	SAF 70*	lgG2b	142-160
SAF 15*	igG3	79-92	SAF 72	lgG2b	A
SAF 21	IgGI	X	SAF 73	IgGI	X
SAF 22	?	A	SAF 75	lgG2a	142-160
SAF 23	IgGI	X	SAF 76	lgG2a	142-160
SAF 24	IgGI	A	SAF 77	IgGI	X
SAF 31*	lgG2b	79-92	SAF 80	IgGI	X
SAF 32*	lgG2b	79-92	SAF 81*	IgM	A
SAF 33*	lgG2b	79-92	SAF 82	IgGI	A
SAF 34*	lgG2a	79-92	SAF 83*	IgGI	A
SAF 35*	lgG2b	79-92	SAF 84*	lgG2b	A
SAF 37*	lgG2b	79-92	SAF 85	IgM	A
SAF 42	IgGI	A	SAF 91	IgM	A
SAF 44	IgM	A	SAF 94	IgM	A
SAF 50	IgM	A	SAF 95	IgGI	A
SAF 51	IgM	A	SAF 96	IgM	A
SAF 53*	lgG2a	X

79-92:anticorpi care recunosc peptidă 79-92;

142-160: anticorpi care recunosc peptidă 142-160;

Epitop X: anticorpi care nu recunosc decât SAF-uri imobilizate;

Epitop A: anticorpi care recunosc peptidă 12 6-164 dar nu se leagă la peptidă 142-160;

*: anticorpi monoclonali care demonstrează capacitatea lor de a recunoaște PrP-sens a cel puțin unei specii testate în timpul acestui studiu (umană, de bovine, de ovine, de șoarece sau de hamster) în contextul unui test imunometric.

RO 121829 Β1

Exemplul 2. Detectarea PrP-res prin Western blot1

/. Tratarea mostrei (i) Prepararea unui omogenat de țesut din diferite mostre biologice:3

- BSE la vacă, scrapie la oaie, vCJD (tip 4) umană, CJD sporadică (tip 1) umană și controale negative corespunzătoare:5

Se prelevează 350 mg de creier bovin: se macină și se omogenizează la 20% (g/v) într-o soluție 5% de glucoza.7

Pentru a realiza omogenizarea, mostra de creier (350 mg) și 1,4 ml de soluție de glucoza sunt introduse în tuburi care conțin mărgele ceramice și agitate viguros (Hybaid 9 Ribolyser).

Mostrele pozitive au fost diluate într-un omogenat care își are originea în creiere 11 sănătoase ale speciilor corespunzătoare, după cum urmează:

- pentru oi: la 1/10013

- pentru vaci: la 1/50

- pentru oameni: tip 1 sau 4: la 1/40; tip 3: la 1/80;15 tip 2: la 1/20 (ii) Condiții pentru etapa (1)17

O primă fracție (500 μΙ) de omogenat de 20% obținut în (i) este incubat cu 500 μΙ dintr-o soluție tampon care cuprinde 10% sarcozil (SK10), 10% Triton X100 (T10), uree 2M19 (U2) și proteinază K (PK) la 60 pg/ml de soluție tampon (PKI), timp de 10 min, la 37°C (care corespunde la o concentrație finală de 30 pg/ml pentru un omogenat de 10%).21 în fig. 3-6, PK3 corespunde la o concentrație de PK de 180 pg/ml de soluție tampon, și PK6 corespunde la o concentrație de PK de 360 pg/ml de soluție tampon.23 (iii) Sunt adăugați 500 pl dintr-o soluție tampon constând din 1-butanol (care co- respunde soluțiilor tampon B, așa cum a fost descris în cererea de brevet internațională 25 WO 99/41280); amestecul este centrifugat la 15000 rpm timp de 5 min. (aproximativ 17000g.)27 (iv) Peletul rezultat după centrifugare, care conține PrP-res, este preluat în 80-100 pl dintr-o soluție tampon C așa cum a fost descris în cererea de brevet internațională29

WO 99/41280, de preferință, o soluție tampon Laemmli care conține 4% de SDS și încălzit la 100°C timp de 5 min, în scopul de a efectua Western blot, sau este preluat în mod 31 succesiv într-o soluție tampon C1 care cuprinde uree 6M și sarcozil 0,5%, urmată de încălzire timp de 5 min la 100°C și apoi într-o soluție tampon C2 care cuprinde guanidină 2M, ur- 33 mată de încălzire timp de 5 min la 100°C, în scopul de a realiza un test imunometric.

(v) Condiții pentru etapa (b) 35

O a doua fracțiune (500 pl) de omogenat de 20% obținut în (i) este incubat cu 500 pl dintr-o soluție tampon care curinde 5% sarcozil (SK5), 5% SDS (SDS5), uree 1M (U1) și 37 proteinază K (PK) la 360 pg/ml (PK6), timp de 10 min. la 37’0, și apoi sunt efectuate etapele (iii) și (iv) de mai sus. 39

II. Western blot

Mostrele obținute sunt utilizate pentru a realiza electroforeza SDS-PAGE și trans- 41 ferate pe o membrană de nitroceluloză în condițiile fixate în exemplul 1 și în exemplul 3 din cererea de brevet internațională WO 99/41280 sus-menționată. 43

Imunodetectarea PrP-res este efectuată cu anticorpii monoclonali SAF 10 și SAF 31, așa cum a fost descris în exemplul 1, mai sus, și cu Ig de capră anti-iepure de casă con- 45 jugate cu peroxidază (1/2 500). Imunoreactivitatea este evidențiată prin chemiluminescență (ECL, Amlersham), determinată cantitativ și vizualizată pe filme autoradiografice, așa cum 47 este ilustrat în fig. 2.

RO 121829 Β1 în această figură:

* culoarele 1-5 corespund condițiilor conform etapei (1) sau (a) (SK10 + T1O + U2 + PK1):

culoarul 1: control negativ culoarul 2: BSE la vacă culoarul 3: scrapie la oaie culoarul 4: vCJD umană (tip 4) culoarul 5: CJD umană (tip 1) și * culoarele 6-10 corespund condițiilor conform etapei (b) (SK10 + SDS5 + U1 + PK6).

culoarul 1: control negativ culoarul 2: BSE la vacă.

culoarul 3: scrapie la oaie culoarul 4: vCJD umană (tip 4) culoarul 5: CJD umană (tip 1)

Rezultatele obținute arată că:

- în etapa (1) sau (a) (culoarele 1-5), PrP-sens este, în mod sistematic distrusă, în timp ce semnalul obținut cu PrP-res este, în mod sistematic mai mare, cu anticorpul direcționat către motivele octapeptidice repetate, față de semnalul obținut pe aceleași mostre cu un anticorp direcționat către regiunea 94-230 a PrP;

- în etapa (b) (culoarele 6-10), PrP-sens este, în mod sistematic distrusă, în timp ce semnalul obținut pe culoarele 8 și 10 (în prezența anticorpului direcționat către de motivele octapeptidice repetate) este similar cu, sau mai mare decât semnalul obținut pe aceleași mostre cu un anticorp direcționat către regiunea 94-230 a PrP, în timp ce este mai mic și chiar nedetectabil pe culoarele 7 și 9 (PrP-res a BSE).

Exemplul 3. Detectarea PrP-res cu un test imunometric care folosește două situsuri utilizând, drept anticorp de captură, un anticorp monoclonal care recunoaște motivele octapeptidice repetate

Pentru a efectua un test imunometric care folosește două situsuri, peletul obținut în (iv) din exemplul 2 este, de exemplu, dizolvat într-o soluție tampon care cuprinde sarcozil (0,25-1%) și uree (0,25-8 M) sau SDS (0,25-1%) și uree (0,25-1 M); mostra obținută va fi, de preferință diluată (la 1/4 sau la 1/2), după încălzire, cu o soluție tampon care cuprinde albumină, producând o concentrație finală de albumină cuprinsă între 0,1 și 1% (g/v), sau cu o soluție tampon care conține 1% dezoxicolat.

Testul imunometric care folosește două situsuri este realizat pe plăci de microtitrare care conțin un anticorp care a fost imobilizat în condițiile descrise deja pentru alte proteine (Grassi și alții, 1989). Principiul acestuia este după cum urmează: PrP analizată este recunoscută de un anticorp atașat la suportul solid (anticorp de captură) și de un al doilea anticorp, care recunoaște altă parte a moleculei și care este marcat cu o enzimă (în acest caz, acetilcolinesterază, anticorpi indicator), la 5 unități Ellman/ml (1 unitate Ellman = 7,35x10’²unități enzimatice).

în contextul acestei invenții, anticorpul de captură este direcționat către motivele octapeptidice repetate și anticorpul indicator recunoaște o secvență inclusă în regiunea 94-230 a PrP, de exemplu regiunea 142-160 a PrP. După spălarea fazei solide, activitatea enzimatică atașată la placă este proporțională cu cantitatea de PrP-res care are motivele octapeptidice repetate inițial în mostra analizată.

în practică, testul este realizat în următorul mod: 100 pl de soluție de PrP de analizat sunt puși în godeurile plăcii de microtitrare conținând anticorpul care recunoaște motivele octapeptidice repetate. După reacție timp de 3 h la temperatura camerei, placa este spălată

RO 121829 Β1 înaintea adăugării a 100 μΙ dintr-o soluție de anticorp indicator (5 unități Ellman/ml). După 1 reacția peste noapte la +4°C, plăcile sunt spălate din nou înaintea adăugării a 200 (0,1 dintr-o soluție de substrat (reactiv Ellman, Grassi și alții, 1989) care face posibil să se 3 măsoare activitatea acetilcolinesterazei atașate la faza solidă. După 30 de min. de reacție enzimatică, este măsurată absorbanța (O.D. la 414 nm) pentru fiecare godeu. 5

Exemplul 4. Studiu comparativ al diferitelor condiții: etapa (1) sau (a) și etapa (b)

Mostrele sunt preparate așa cum a fost descris în exemplul 2.7

Omogenatele sunt preparate ca în exemplul 2.

- la oameni9

Fig. 3 și 4 ilustrează rezultatele obținute cu diferite soluții tampon:

* condiții conform etapei (1) sau (a) a metodei conform invenției:11

I: omogenat de 20% + SK10 +. T1O + U2 + PK1

III': omogenat de 10% + SK5 + T5 + U1 + PK0,5 (figura 4)13 * condiții conform etapei (b) a metodei conform invenției:

II: omogenat de 20% + SK10 + T1O + U2 + PK315

III: omogenat de 20% + SK10 + T1O + U2 + PK6

III: omogenat de 10% + SK5 + T5 + U1 + PK6 (figura 4)17

IV: omogenat de 2 0% + SK20 + PK3

V: omogenat de 20% + SK20 + U1 + PK319

VI: omogenat de 20% + SK20 + U2 + PK3

VII: omogenat de 10% + SK20 + PK321

VIII: omogenat de 10% + SK20 + U1 + PK3

IX: omogenat de 10% + SK2 0 + U2 + PK323

X: omogenat de 10% + SK5 + SDS5 + U1 + PK6

X': omogenat de 10% + SK2,5 + SDS2.5 + U2 + PK6 (fig. 4)25

XI: omogenat de 20% + SK20 + PK6

XII: omogenat de 20% + SK20 + U1 + PK627

XIII: omogenat de 20% + SK20 + U2 + PK6

XIV: omogenat de 10% + SK20 + PK629

XV: omogenat de 10% + SK20 + U1 + PK6

XVI: omogenat de 10% + SK20 + U2 + PK631

Cantitatea de PrP care are conservat motivul octapeptidic repetat este măsurată folosind testul imunometric care folosește două situsuri (absorbanța sau O.D. la 414 nm, vezi 33 exemplul 3; este măsurată apariția unei colorații galbene, reactiv Ellman): control negativ (□),

CJD sporadic tip 1 (□), și vCJD tip 4 ().35

- la rumegătoare

Fig. 5 și 6 ilustrează rezultatele obținute cu soluții tampon diferite:37 * condiții conform etapei (1) a metodei conform invenției:

I: omogenat de 20% + SK10 + T1O + U2 + PK139

III': omogenat de 10% + SK5 + T5 + U1 + PK0,5 (fig. 6) ‘condiții conform etapei (b) a metodei conform invenției:41

II: omogenat de 20% + SK10 + T1O + U2 + PK3

III: omogenat de 20% + SK10 + T1O + U2 + PK643

III: omogenat de 10% + SK5 + T5 + U1 + PK3 (fig. 6)

IV: omogenat de 20% + SK20 + PK345

V: omogenat de 20% + SK20 + U1 + PK3

VI: omogenat de 20% + SK20 + U2 + PK347

VII: omogenat de 10% + SK20 + PK3

RO 121829 Β1

VIII: omogenat de 10% + SK20 + U1 + PK3

IX: omogenat de 10% + SK20 + U2 + PK3

X: omogenat de 10% + SK5 + SDS5 + U1 + PK6

X': omogenat de 10% + SK5 + SDS5 + U1 + PK3 (fig. 6)

XI: omogenat de 20% + SK20 + PK6

XII: omogenat de 20% + SK20 + U1 + PK6 XIII: omogenat de 20% + SK20 + U2 + PK6 XIV: omogenat de 10% + SK20 + PK6 XV: omogenat de 10% + SK20 + U1 + PK6 XVI: omogenat de 10% + SK20 + U2 + PK6

Cantitatea de PrP-res care are conservat motivul octapeptidic repetat este măsurată folosind testul imunometric care folosește două situsuri (absorbantă sau O.D. la 414 nm, vezi exemplul 3); control negativ (□), ATNC bovin ((0)), și ATNC ovin ().

Fig. 7 (Western blot) și 8 (test imunometric care folosește două situsuri):

• Comparația este făcută folosind omogenate de 20% de creiere de la o oaie sănătoasă, de la o oaie care suferă de scrapie și de la o bovină care suferă de BSE, obținute în condițiile fixate în exemplul 2.

• Tratarea mostrelor:

A: sarcozil 10% + Triton 10% + uree 2M + proteinază K 60 pg/ml, 10 min.

B: sarcozil 10% + uree 2M + proteinază K 240 pg/ml, 10 min.

C: sarcozil 10% + proteinază K 240 pg/ml, 10 min.

• Detectarea:

-prin Western blot (fig. 7): anticorpii SAF 37 și SAF 84 (vezi exemplul 1); -prin analiză imunometrică (figura 8): captură cu SAF 37 și evidențiere cu un anticorp direcționat către regiunea 94-230 a PrP.

Fig. 9 (Western blot) și 10 (test imunometric care folosește două situsuri):

• Tratarea mostrelor:

A: sarcozil 10% + Triton 10% + uree 2M + proteinază K 60 pg/ml, 10 minute B: SDS 10% + Triton 5% + uree 2M + proteinază K 180 pg/ml proteinază K, 10 min • Detectarea:

-în aceleași condiții ca mai sus.

Crescând numai doza de PK este posibil să se evidențieze o sensibilitate diferențială a regiunii motivului octapeptidic repetate între BSE și scrapie la ovine însă nu la oameni (între tipul 1 și tipul 4).

Pe de altă parte, de asemenea, prin modificarea compoziției agentului tensioactiv și a agentului caotropic, este posibil să se evidențieze o sensibilitate diferențială a regiunii motivului octapeptidic repetate în toate cazurile.

Exemplul 5: Influența compoziției soluțiilor tampon asupra detectării diferențiale a BSE și a scrapiei

Fig. 11 (Western blot) și 12 (test imunometric care folosește două situsuri):

• Comparația este făcută folosind omogenate de 10% de creiere de la șoareci sănătoși, sau de la șoareci experimental infectați cu tulpina C506M3 (scrapie) sau cu o tulpină 6PBI (BSE), obținute în condițiile fixate în exemplul 2.

RO 121829 Β1 • Tratarea mostrelor:1

A: sarcozil 10% + Triton 10% + uree 2M + proteinază K 30 pg/ml, 10 min.

B: sarcozil 10% + Triton 10% + uree 2M + proteinază K 60 pg/ml, 10 min.3

C: sarcozil 10% + Triton 10% + uree 2M + proteinază K 180 pg/ml, 10 min.

D: sarcozil 10% + Triton 10% + uree 2M + proteinază K 360 pg/ml, 10 min.5

E: sarcozil 10% + uree 2M + proteinază K 180 pg/ml, 10 min.

• Detectarea:7

- prin Western blot (fig. 11): anticorpii SAF 37 și SAF 70 (vezi exemplul 1);

- prin analiză imunometrică (fig. 12): captură cu SAF 37 și evidențiere cu un 9 anticorp direcționat către regiunea 94-230 a PrP.

Rezultatele obținute arată că, crescând numai doza de PK este posibil să se evi- 11 dențieze o sensibilitate diferențială a regiunii motivului octapeptidic repetate între BSE și scrapie, la șoareci.13

Exemplul 6. Influența concentrației soluțiilor tampon și a proteinazei K asupra detectării diferitelor CJD15

Fig. 13 (Western blot) și 14 (test imunometric care folosește două situsuri):

• Comparația este făcută folosind omogenate de 10% de creiere de la oameni 17 sănătoși și de la oameni care suferă de CJD (tipurile 1,2,3 și 4), obținute în condițiile fixate în exemplul 2.19 • Tratarea mostrelor:

A: sarcozil 10% + Triton 10% + uree 2M + proteinază K 30 pg/ml, 10 min.21

B: sarcozil 10% + Triton 10% + uree 2M + proteinază K 180 pg/ml, 10 min.

C: sarcozil 10% + proteinază K 30 pg/ml, 10 min.23

D: sarcozil 10% + proteinază K 60 pg/ml, 10 min.

E: sarcozil 10% + proteinază K 180 pg/ml, 10 min.25

F: sarcozil 10% + proteinază K 360 pg/ml, 10 min.

• Detectarea:27

- prin Western blot (fig. 13): anticorpii SAF 37 și SAF 7 0 (vezi exemplul 1);

- prin analiză imunometrică (figura 14): captură cu SAF 37 și evidențiere cu 29 un anticorp direcționat către regiunea 94-230 a PrP.

Fig. 15 (Western blot) și 16 (analiză imunometrică):31 • Comparația este făcută folosind omogenate de 10% de creiere de la oameni sănătoși și de la oameni care suferă de CJD (tipurile 1,2,3 și 4), obținute în condițiile 33 fixate în exemplul 2.

• Tratarea mostrelor:35

Fig. 15: digerare cu proteinază K (150 pg/ml), 10 min.

Fig. 16: sarcozil 10% + uree 2M + proteinază K (de la 30 pg/ml la 360 pg/ml),37 timp de 10 min.

• Detectarea:39

- prin Western blot (figura 15): anticorpul SAF 37 și un anticorp direcționat către regiunea 94-230 a PrP (vezi exemplul 1);41

- prin analiză imunometrică (figura 16): captură cu SAF 37 și evidențiere cu un anticorp direcționat către regiunea 94-230 a PrP.43

Rezultatele obținute arată că, crescând doza de PK este posibil să se evidențieze o sensibilitate diferențială a regiunii motivului octapeptidic repetate în diferitele tipuri de CJD. 45 în aceste condiții nu există nici o diferență semnificativă între tipul 1 și tipul 4; schimbarea compoziției agentului tensioactiv și a agentului caotropic, la aceeași doză de PK (E, fig. 13 47 și 14), face posibil să se distrugă octapeptidele în tipul 4 conservându-le în același timp în tipul 1. 49

RO 121829 Β1 în plus, fig. 16 face posibil să se arate diferența în sensibilitatea PrP-res derivate din tulpini diferite, pentru aceeași soluție tampon, ca funcție de doza de PK.

Mai mult decât atât, fig. 15 arată că tratarea directă a omogenatului cu PK evidențiază alt tip de sensibilitate a PrP-res la degradare.

Exemplul 7. Detectarea prin Western blot a PrP-res digerate purificate în formă SAF Omogenatele, obținute în condițiile conform exemplului 2, sunt tratate după cum urmează:

Omogenat 20% (500 pl) + NaCI 20% (500 (μΙ) + [sarcozil 20% + SB3-14 2%] (500 μΙ) + PK (concentrație finală 20 μg/ml) timp de 1 h.

Fig. 17 ilustrează rezultatele:

b și d:

culoarele 1-7: rezultate obținute cu diluții diferite de tulpină C506M3 de scrapie la șoareci (diluții 1/20, 1/50, 1/250,1/500,1/1 000 și 1/2 000) culoarul 8: greutăți moleculare culoarele 9-15: rezultate obținute cu diluții diferite de tulpină de BSE la șoareci (diluții 1/1 000 la 1/10).

Este posibil să se elimine complet semnalul BSE.

a și c: rezultate obținute confirmă că există o creștere semnificativă a semnalului în prezența anticorpilor direcționați către motivele octapeptidice repetate.

e: această figură arată că este posibil să se obțină o descreștere a semnalului cu BSE, atât la maimuțe, cât și la oameni (culoarele 4 și 7).

Claims

Revendicări

(1) tratarea eșantionului cu cel puțin o proteinază K într-un asemenea mod 3 încât să degradeze complet proteinele PrP-sens conservându-se în același timp toate sau unele dintre repetițiile motivului octapeptidic ale PrP-res, 5 oricare ar fi tulpina de ATNC, (2) aducerea eșantionului tratat în contact cu un ligand pentru motivele 7 octapeptidice, și (3) detectarea unei eventuale prezențe a complexului de repetiții ale motivului 9 octapeptidic-ligand.

(b) pentru fiecare eșantion pentru care în etapa(a) este detectată prezența unui 11 complex de repetiții ale motivului octapeptidic-ligand:

- tratarea unei a doua fracțiuni din numitul eșantion cu cel puțin o proteinază 13 K într-un asemenea mod încât majoriatatea repetițiilor motivului octapeptidic sunt eliminate pentru PrP-res asociată cu cel puțin o tulpină de interes, în 15 special tulpina encefalopatiei spongiforme bovine (BSE), și astfel încât toate PrP-res asociate cu celelalte tulpini de ATNC conservă toate sau unele dintre 17 repetițiile motivului octapeptidic,

- aducerea celei de-a doua fracții a eșantionului tratat în contact cu un ligand 19 pentru repetițiile motivului octopeptidic, și

- detectarea prezenței unui posibil complex de repetiții ale motivului 21 octapeptidic-ligand.

(1) tratarea eșantionului cu cel puțin o proteinază (PK) fie la o concentrație cuprinsă între 30 pg/ml și 200 pg/ml, timp de 10 min., la 37°C pentru un omogenat de 10%, fie pentru o perioadă și la o concentrație care este echivalentă cu concentrația cuprinsă între 30 pg/ml și 200 pg/ml în condițile menționate mai sus, și preferabil timp de 10 min la o concentrație cuprinsă între 30 pg/ml și 200 pg/ml pentru un omogenat de 10% sau timp de 30 min la o concentrație cuprinsă între 10 pg/ml și 70 pg/ml pentru un omogenat de 10%, în care proteinaza K este dizolvată într-o soluție tampon aleasă din grupul constând din soluții tampon de omogenizare a eșantionului biologic și soluții tampon care cuprinde cel puțin unul dintre următorii agenți: cel puțin un agent tensioactiv și/sau cel puțin un agent caotropic și/sau cel puțin o sare într-un asemenea mod încât să se degradeze complet proteinele PrP-sens, conservându-se în același timp toate sau unele dintre repetițiile motivului octapeptidic ale PrP-res, oricare ar fi tulpina ATNC:

1. Metodă de diagnostic al unei encefalopatii spongiforme subacute transmisibile, (ESST) sau al bolii prionice, determinată de un agent transmisibil neconvențional (ATNC), prin detectarea PrP-res într-un eșantion biologic, caracterizată prin aceea că, cuprinde:
2. Metodă de diagnostic diferențial al ESST determinate de tulpini de ATNC, într-un eșantion biologic, prin detectarea PrP-res asociat cu diferite tulpini de ATNC, caracterizată prin aceea că, cuprinde:

RO 121829 Β1 (a) detectarea PrP-res într-o primă fracțiune din eșantionul biologic, în conformitate 1 cu următoarele etape 1)... 3):

(2) aducerea eșantionuluui tratat în contact cu un ligand pentru motivele octapeptidice, și (3) detectarea unei eventuale prezențe a complexului de repetiții ale motivului octapeptidic-ligand.
3. Metodă de diagnostic diferențial al ESST determinate de tulpini de ATNC într-un 23 eșantion biologic despre care se consideră că conține PrP-res, caracterizată prin aceea că, pentru fiecare eșantion la care prezența unui PrP-res a fost detectată, se efectuează etapa 25 (b) conform revedicării 2, prin:

- aducerea celei de-a doua fracții a eșantionului tratat în contact cu un ligand 27 pentru repetițiile motivului octopeptidic, și

- detectarea unei eventuale prezențe a complexului de repetiții ale motivului 29 octapeptidic-ligand.
4. Metodă conform revendicării 2 sau 3, caracterizată prin aceea că tratarea cu pro- 31 teinaza K conform etapei (a) sau (b) se efectuează timp de 30 s până la 2 h, la o temperatură mai mică de 80°C, de preferință între 10 min și 30 min. 33
5. Metodă conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că tratarea eșantionului cu cel puțin o proteinază K, se realizează la o concentrație cuprinsă între 30 pg/ml și 35 200 pg/ml timp de 10 min, la 37°C pentru un omogenat de 10%, fie pentru o perioadă și la o concentrație care este echivalentă cu concentrația cuprinsă între 30 pg/ml și 200 pg/ml în 37 condițile menționate mai sus și, preferabil, timp de 10 min la o concentrație cuprinsă între

30 pg/ml și 200 pg/ml pentru un omogenat de 10%, sau timp de 30 min la o concentrație cu- 39 prinsă între 10 pg/ml și 70 pg/ml pentru un omogenat de 10%.
6. Metodă conform cu oricare din revendicările de la 2 la 5, caracterizată prin aceea 41 că proteinază K este dizolvată într-o soluție tampon aleasă din grupul constând din soluții tampon de omogenizare a eșantionului biologic și soluții tampon care cuprind cel puțin unul 43 dintre următorii agenți: cel puțin un agent tensioactiv și/sau cel puțin un agent caotropic și/sau cel puțin o sare. 45
7. Metodă conform revendicării 1 sau 6, caracterizată prin aceea că soluția tampon cuprinde de preferință: 47

RO 121829 Β1

a. cel puțin un agent tensioactiv, ales din grupul format din:

- agenți tensioactivi anionici, cum ar fi SDS (sulfat de dodecilsodiu), sarcozil (laurilsarcozină), colat de sodiu, deoxicolat de sodiu sau taurocolat de sodiu;

- agenți tensioactivi amfoterici, cum ar fi SB 3-10 (decilsulfobetaina), SB 3-12 (dodecilsulfobetaina), SB 3-14SB 3-16 (hexadecilsulfobetaina), CHAPS și dezoxi-CHAPS,

- agenți tensioactivi neionici, cum ar fi C12E8 (dodeciloctaetilenglicol), TRITON X100, TRITON X114, TWEEN 20, TWEEN 80, MEGA 9 (nonanoilmetilglucamină), octilglucozidă, LDAO (oxid de dodecildimetilamină) sau NP40, sau

- amestecuri de agenți tensioactivi, cum ar fi un amestec dintr-un agent tensioactiv ionic și un agent tensioactiv neionic, un amestec de odi agenți tensioactivi ionici și un agent tensioactiv amfoteric și/sau

b. cel puțin un agent caotropic, ales din grupul format din uree și guanidină, sau un amestec al acestora, și/sau

c. cel puțin o sare, aleasă dintre cărurile unor metale care pot fi alcaline sau nu.
8. Metodă conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că soluția tampon cuprinde cel puțin 5% agent tensioactiv anionic, de preferință sarcozil, în mod opțional combinat cu SDS.
9. Metodă conform cu oricare din revendicările de la 1 la 8, caracterizată prin aceea că ligandul este ales din grupul constând din aptameri și anticorpi capabili să se lege în mod specific la regiunea repetițiilor motivului octapeptidic.
10. Metodă conform revendicărilor 2 sau 4 sau 5, caracterizată prin aceea că, tratarea din etapa (b) se efectuează în aceleași condiții ca cele definite în etapa (a) însă la o concentrație de PK mai mare decât cea utilizată la etapa (a) (1).
11. Trusă de diagnostic pentru aplicarea metodei definite în oricare din revendicările de la 1 la 10, caracterizată prin aceea că, cuprinde în combinație, cel puțin un agent tensioactiv și/sau cel puțin un agent caotropic și/sau cel puțin o sare și o protează, așa cum au fost definite în oricare din revendicările de la 1 la 10.