DE3318761C2

DE3318761C2 -

Info

Publication number: DE3318761C2
Application number: DE19833318761
Authority: DE
Inventors: Masatoshi Chiryu Aichi Jp Nakano
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1982-05-24
Filing date: 1983-05-24
Publication date: 1988-04-14
Also published as: DE3318761A1; FR2527223B1; FR2527223A1

Description

Trehalase ist ein Enzym, daß das Disaccharid Trehalose in zwei Glucoseeinheiten hydrolysiert. Dieses Enzym wird in Bakterien, Pilzen, Hefen, Insekten, Fischen, höheren Pflanzen und höheren Tieren gefunden. In diesen Bioorganismen kommt die Trehalase in höheren Tieren insbesondere in zwei Geweben des Darmes und der Niere vor, und wird auch in Blut, Urin und im Kot gefunden.

Aufgrund zahlreicher Untersuchungen (Kagaku to Seibutsu, vol. 18, Nr. 12, S. 809) wird angenommen, daß die Trehalase in höheren Tieren im Glucose transportmechanismus eine physiologische Bedeutung besitzt.

Aufgrund der obigen Untersuchungen wurde gefunden, daß die Bestimmung von Trehalase im menschlichen Urin für die klinische Diagnose, insbesondere die Diagnose von Diabetes mellitus wertvoll ist.

Zur Bestimmung der Trehalase im menschlichen Urin und der Serumtrehalase war nur ein Verfahren zu ihrer Bestimmung bekannt, bei welchem unter Ver wendung eines Trehalosesubstrats die freigesetzte Glucose bestimmt wurde.

Im Urin kommen aber nur geringe Mengen an Trehalase vor, und die Bestimmung der Trehalaseaktivität im Urin und Serum wird durch verschiedene Substanzen gestört. Es ist deshalb notwendig, den Urin zu konzentrieren und zur Entfernung niedermolekularer Substanzen zu dialysieren, um die Trehalase in einer Körperflüssigkeit mit der vorstehenden genannten Methode zu bestimmen.

Zur Durchführung dieser Methode wird der Urin einen oder mehr Tage gegen ein geeignetes Medium (deionisiertes Wasser oder gepufferte Salzlösung usw.) dialysiert, um die bei der Aktivitätsbestimmung störenden Sub stanzen zu entfernen. Dann wird der Urin Probe für Probe mit einem Eindampfapparat konzentriert. Das bisherige Verfahren ist deshalb sehr kompliziert. Es ist deshalb für klinische Diagnosen, bei denen viele Proben in einer kurzen Zeit bearbeitet werden sollen, nicht geeignet. Zur Messung kleiner Mengen einer Komponente in einer Körperflüssigkeit werden gewöhnlich das Immuno diffusionsverfahren und die Methode der Komplement bindung, die das Antigen immunologisch bestimmt, verwendet.

Diese Methoden sind aber aufgrund ihrer Empfindlich keit nicht optimal. Gegenwärtig wird deshalb zur Be stimmung von Komponenten in Körperflüssigkeiten das radioimmunologische Bestimmungsverfahren angewendet. Das radioimmunologische Verfahren verunreinigt aber die Umwelt, und erfordert für die Bestimmung die Verwendung teurer Apparaturen und Instrumente.

Es ist deshalb für die Verwendung zur klinischen Diagnose nicht befriedigend.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfach durchzuführendes Verfahren zur Herstellung von Trehalase anzugeben, die sich aufgrund der dabei erzielbaren Reinheit zur Bildung von Anti-Trehalase-Antikörpern eignet. Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen ge kennzeichnet.

Mit Hilfe der erfindungsgemäß gereinigten Trehalase hergestellte Anti-Trehalase Antikörper eignen sich als Reagenz zur genauen und einfachen Bestimmung der Trehalase im menschlichen Urin und Serum mittels einer enzymiommonulogischen Bestimmungsmethode.

Diese Anti-Trehalase Antikörper zeigen eine Antigen-Antikörperreaktion mit intestinaler, renaler Trehalase und mit Trehalase aus Urin und Serum der gleichen Art, aber nicht mit Trehalase verschiedener Arten.

Sie bilden infolgedessen geeignete Faktoren bei der Trehalase-Bestimmung in Körperflüssigkeiten und Gewebeextrakten durch Immunodiffusion, Immuno elektrophorese, Radioimmunbestimmung und Enzym immunbestimmung usw. sowie zur Bestimmung von Trehalase in Geweben durch immunhistochemische Methoden.

Diese Anti-Trehalase Antikörper erhält man durch Immuni sierung geeigneter Tiere mit der erfindungsgemäß gereinigten Trehalase als Antigen. Die üblichen Reinigungs methoden für die Trehalase basieren auf einer Gel filtration, einer Ionenaustauschchromatographie, einer Adsorptionschromatographie, einer Affinitäts chromatographie und präparativer Gelelektrophorese. Die mit diesen Verfahren erhaltene Trehalase ist elektrophoretisch nicht homogen, nicht hochrein, und die Reinigungsverfahren sind sehr kompliziert. Erst durch die erfindungsgemäße Kombination von Reinigungsmaßnahmen in der angegebenen Reihenfolge erhält man eine zu dem angegebenen Endgebrauchszweck geeignete elektro phoretisch homogene und hochreine Trehalase.

Zur Gelfiltration kann man Harze verwenden wie Sephacryl S-300, Sephacryl S-200, Sephadex G-200, Sephadex G-150, Sephadex G-100, Ultrogel ACA-34, Sepharose 6B, Sepharose 4B, Bio-Gel P-300, Bio-Gel P-200 usw., und für die Adsorptionschromatographie Harze wie Hydroxyapatit, Alumogel, und Calciumphosphat gel usw., und für die Ionenaustauschchromatographie Harze wie z. B. DEAE-Zellulose, CM-Zellulose, ECTEORA- Zellulose, DEAE-Sephacel, DEAE-Sephadex, CM-Sephadex, QAE-Sephadex usw., und für die Affinitätschromato graphie Harze wie Phenyl-Sepharose, Octyl-Sepharose, Con A-Sepharose, Tris-Sepharose, Trehalose-Sepharose, Lectin-Sepharose, Epoxy-Sepharose usw., und für die Chromatofokussierung Harze wie PBE-94, PBE-118 usw.

Als Puffer für die oben genannte Chromatographie ist ein gewöhnlicher Puffer geeignet wie z. B. Phosphat puffer, Tris-HCl-Puffer, Histidin-HCl-Puffer usw.

Es verursacht weiterhin kein Problem, wenn dieser Puffer weitere Zusätze, z. B. nichtionische Detergentien, Natrium chlorid, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid und Ammoniumsulfat usw. enthält. Als Elutierpuffer kann man den oben genannten Puffer verwenden, sowie Lösungen von α-Methylglucopyranosiden, von Trehalase und Polypuffer.

Ein Anti-Trehalase Antikörper wird durch Immuni sierung mit einer emulgierten Mischung von Adjuvans (Freund'sches vollständiges Adjuvans oder Freund'sches unvollständiges Adjuvans, usw.) und hochgereinigter Trehalase, die nach den oben genannten Verfahren aus menschlichem Urin, menschlichem Serum, Kaninchen niere, Rattendarm, Schweineniere, usw. erhalten wird, hergestellt, wobei ein geeignetes Tier einer von den Antigenquellen verschiedenen Art, wie Kaninchen, Meerschweinchen, Ziege, Hund, Kuh, Pferd usw. ausge wählt und immunisiert wird durch subkutane Injektion zwischen den Klauen und Pfoten, die einige Male in Intervallen von 1 bis 2 Wochen durchgeführt wird. 10 bis 14 Tage nach der letzten Injektion werden die Tiere ausge blutet und die Serumfraktion erhalten.

Nach Inaktivierung des Komplementes im Serum kann man den Anti-Trehalase Antikörper (Anit-Trehalase IgG) durch Sulfatfällung und Ionenaustauschchromato graphie (DEAE-Zellulose, DEAE-Sephacel usw.) oder Gelfiltration (Sephadex G-200, Sephacryl S-300 usw.) erhalten.

Die Fig. 1 zeigt eine Präzipitationslinie des doppelten Immundiffusionstests (Ouchterlony-Ver fahren) von Anti-Trehalase Antikörper (aus Kaninchenniere) gegen verschiedene gereinigte Antigene.

Beispiel 1

Es wurde eine Reihe von Versuchen zur Reinigung von aus Kaninchennieren gewonnener Trehalase durchgeführt, bei denen verschiedene Reinigungsmethoden in mehreren Schrit ten miteinander kombiniert wurden.

Im einzelnen wurde die Reinigung wie folgt durchgeführt:

Die Rinde der Kaninchennieren wurde homogenisiert und anschließend nacheinander unter Kühlung zentrifugiert und ultrazentrifugiert. Die Trehalase enthaltende Membran fraktion wurde abgetrennt und mit einem Detergenz (Mischung aus 0,5 Gew.-% Triton X-100 und 0,5 Gew.-% Natriumdesoxy cholat) behandelt. Hierdurch wurde die Trehalase in Lösung gebracht.

Die Membranfraktion wurde dann zur Reinigung der Trehalase einer Säulenchromatographie unterworfen. Es wurden im einzelnen folgende Versuche durchgeführt:

Versuch 1

Stufe 1: Gelfiltration und Ionenaustauscherchromatographie
Stufe 2: Affinitätschromatographie
Stufe 3: Chromatofokussierung

Versuch 2

Stufe 1: wie Versuch 1
Stufe 2: wie Versuch 1
Stufe 3: Gelfiltration

Versuch 3

Stufe 1: wie Versuch 1
Stufe 2: wie Versuch 1
Stufe 3: Ionenaustauscherchromatographie und Adsorption

Versuch 4

Stufe 1: Gelfiltration
Stufe 2: Affinitätschromatographie
Stufe 3: Chromatofokussierung

Versuch 5

Stufe 1: Ionenaustauscherchromatographie und Adsorption
Stufe 2: Chromatofokussierung
Stufe 3: Chromatofokussierung

Durchführung:

Die Membranfraktion wurde mit einem proteolytischen Enzym, Papain, behandelt und die Trehalase dann mit dem oben be schriebenen Detergenz solubilisiert. Der solubilisierte Überstand wurde auf eine Säule (2,6 × 90 cm) mit Sepacryl S-300 und eine Säule mit DEAE-Sephacel (2,6 × 30 cm) gegeben. Diese Säulen wurden mit 10 mM Trish-HCl-Puffer, pH 7,2, mit 0,2% Triton X-100 equilibriert.

Die aktive Fraktion der DEAE-Sephacel-Säule wurde auf einer Säule (2,6 × 15 cm) mit Phenylsepharose einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographie (interaction chromatography) unterworfen. Es konnten hierdurch zwei Peaks A und B mit Trehalase-Aktivität abgetrennt werden.

Form B, nicht Form A, wurde auf einer Säule (2,6 × 20 cm) mit Hydroxylapatit chromatographiert.

A und B wurden an Con-A-Sepharose weiter aufgetrennt.

Die Formen A ₂ und B ₂ zeigten Wechselwirkung mit Con-A- Sepharose und wurden mit Methyl-α -D-glucopyranosid (α-Methylglukosid) eluiert. A ₁ und B ₁ ergaben keine Wechselwirkung.

Jede der vier gewonnenen Formen wurde auf einer Säule der Chromatofokussierung unterworfen.

Ergebnis

Die Reinheit der Trehalase wurde anhand eines mittels Elektrophorese erzeugten Proteinbands bestimmt.

Dabei ergab sich folgendes Bild:

Versuch 1: kaum erkennbares Band
Versuch 2: deutlich erkennbares Band
Versuch 3: mehrere starke Bänder
Versuch 4: kaum erkennbares Band
Versuch 5: kein Band sichtbar

Hieraus ergibt sich, daß es auf die Chromatofokussierung in der letzten Stufe entscheidend ankommt und daß nur die Versuche 1, 4 und 5 hochgereinigte Trehalase ergeben. Die Trehalase aus den Versuchen 2 und 3 ist noch so stark ver unreinigt, daß sie erfindungsgemäß nicht verwendbar ist.

Beispiel 2

Gereinigte Trehalaselösung (0,5 mg/ml) aus Kaninchen niere wurde mit dem gleichen Volumen von Freund's vollständigem Adjuvans gemischt und eine Emulsion er halten. 2 ml der Emulsion wurden (0,2 ml bei jeder Injektion) subkutan einzelnen Meerschweinchen injiziert.

Die oben genannte Emulsion wurde 10 Tage nach der ersten Injektion nochmals injiziert.

10 Tage nach der letzten Injektion wurden die Meerschwein chen aus der Ventralaorta ausgeblutet.

Das so erhaltene Blut wurde 120 min lang bei 37°C be lassen, und 10 min lang bei 3000 upm zentrifugiert, wobei ein klarer Überstand (Antiserum) erhalten wurde.

Zum Antiserum, in dem das Komplement durch Hitzebehand lung bei 56°C während 30 min inaktiviert worden war, wurde ein gleiches Volumen 0,9%iger Natriumchlorid lösung zugegeben. Dann wurde nach dem Aussalzen mit Ammoniumsulfat (0∼33%ige Sättigung) das Serum 30 min lang bei 11 000 upm zentrifugiert. Der erhaltene Nieder schlag wurde in 20 mM Phosphat-Puffer (pH 8,0) gelöst und über Nacht gegen den gleichen Puffer dialysiert.

Die so erhaltene Ammoniumsulfatfraktion wurde auf den Kopf einer Säule (2,6 × 90 cm) zur Gelfiltration (Sephacryl S-300, Warenzeichen der Phamacia Inc.,) aufgebracht, die mit 10 mM Phosphat puffer (pH 7,2), der 0,9% Natriumchlorid enthält, äquilibriert ist, und mit dem gleichen Puffer eluiert wobei Anti-Trehalase Antikörper (Anti-Trehalase IgG) erhalten wurde.

Der so erhaltene Anti-Trehalase Antikörper erwies sich im Doppelimmunodiffusionstest (Ouchterlony-Methode) als homogen.

Charakterisierung der Anti-Trehalase Antikörper:

Es wurde die Ouchterlony-Methode angewendet auf Anti- Trehalase Antikörper (aus Kaninchenniere), der nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten wurde, gereinigte Trehalase aus menschlichem Harn, die als Ausgangsmaterial für einen Antikörper diente, gereinigte Trehalase aus Rattenharn und gereinigte Trehalase aus Rattenniere, um jeweilige Präzipitationslinien zu erhalten, wobei die erhaltenen Ergebnisse in Fig. 1 gezeigt werden.

Nach der Ouchterlony-Methode werden in eine 1,0%ige Agargel-Schicht wie in der Figur dargestellt Löcher ange bracht, und dann Antigen und Antikörper in die Löcher pipettiert und 48 h lang in einer Feuchtigkeitskammer bei 4° belassen. Während dieser Inkubation diffundieren sowohl Antigen als auch Antikörper, die Proteine sind, in die Agar-Schicht, und treffen an einem bestimmten Punkt aufeinander. Wenn Antigen und Antikörper aufeinander einwirken (wenn Antigen und Antikörper die gleiche Antigeni tät besitzen, sollten sie miteinander reagieren) zeigt sich ein Antigen-Antikörper-Komplex (Immunkomplex) als weiße Präzipitationslinie auf der Agarplatte. Das Auftreten der Präzipitation zeigt deshalb die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes an.

Wie in Fig. 1 gezeigt verursacht nämlich Anti-Trehalase- Antikörper aus Kaninchenniere eine Präzipitations linie gegen gereinigte Trehalase aus Kaninchenharn und gereinigte Trehalase aus Kaninchenniere, nicht aber gegen gereinigte Trehalase aus menschlichem Harn.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung hochgereinigter Trehalase, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Trehalase enthaltende Körperflüssigkeiten oder Gewebeextrakte (außer von menschlichem Blut und Gewebe) höherer Tiere einer Gelfiltration, Adsorptions- und/oder Ionenaustauschchromato graphie unterwirft,
b) die erhaltene Trehalase enthaltende Fraktion einer Affinitätschromatographie oder Chromato fokussierung unterwirft, und
c) die Trehalase enthaltende Fraktion einer Chromato fokussierung unterwirft.

2. Verwendung der nach Anspruch 1 erhaltenen Trehalase zur Bildung von Anti-Trehalase-Antikörpern für die Bestimmung von Trehalase.