DE3036184A1

DE3036184A1 - Reagenz und verfahren zur bestimmung von human-muskeltyp-aldolase

Info

Publication number: DE3036184A1
Application number: DE19803036184
Authority: DE
Inventors: Toyohiro Matsudo Chiba Kitamura; Tomiaki Hino Tokyo Morimoto; Tohru Naraki; Takashi Gifu Sawada; Minoru Kagamigahra Gifu Tohda
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1979-09-25
Filing date: 1980-09-25
Publication date: 1981-04-16
Also published as: SE8006667L; CH648596A5; SE447422B; CA1158549A; FR2466020A1; FR2466020B1; GB2062226B; BE885376A; IT1141082B; GB2062226A; IT8024877A0; NL8005330A; JPS5648894A

Description

HOFFMANN · EITLE & PAKTNlSR 3036184

PATENTANWÄLTE

DR. ING. E. HOFFMANN (1730-1976) . D I PL-I NG. W. EITLE - D R. RER. N AT. K.H O FFMAN N - DfPL.-ING.W. LEHN

DIPL.-ING. K.FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 . D-8C00 MDNCHEN 8! · TELEFON (089) 911087 . TELEX 05-29419 (PATH E)

34. 013. o/wa

EISAI CO. LTD -, TOKYO / JAPAN

Reagenz und Verfahren zur Bestimmung von Human-Muskeltyp-Aldolase

Die Erfindung betrifft ein Reagenz und ein Verfahren zur Bestimmung von Humanmuskel-Aldolase.

Aldolase ist ein allgemeiner Begriff für Enzyme, welche die Aldolkondensation und die Spaltung zwischen Dihydroxyacetonphosphat mit einer Reihe von Aldehyden katalysieren.

Die erfindungsgemäss gemeinte Aldolase ist eine Fructosediphosphataldolase (z.B. 4,1,2,13-Fructose-1,6-phosphat- D~glycelaldehyd-3-phosphatlyase), die reversibel

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Fructose-1,6-diphosphat in Dihydroxyacetonphosphat und D-Glycelaldehyd-3-phosphat spaltet. Dieses Enzym hat eine grosse Bedeutung im Glycolysesystem und ist hauptsächlich im Muskel verteilt und spielt deshalb eine wichtige Rolle im Energiemetabolismus.

Säugetier-Aldolase besteht aus drei Isoenzymarten, nämlich dem Muskeltyp (A-Typ), dem Lebertyp (B-Typ) und dem Gehirntyp (C-Typ). Es ist bekannt, dass sich das Aufbauverhältnis dieser Isoenzyme in Übereinstimmung mit der Metamorphose im lebenden Körper verändert, wie der Veränderung der Fetalleber in Ratten, oder der Krebsbildung von Organismen bei Menschen, Ratten und anderen Säugetieren.

Es sind derzeit zwei Methoden zur Bestimmung von Aldolase vom Human-Muskeltyp bekannt, nämlich eine Elektrophoresemethode und eine andere Methode, bei der man die Zersetzungsaktivitäten zweier Substrate, nämlich von Fructose-1,6-diphosphat (FDP) und Fructose-1-phosphat (FIP) in Aldolase (FDP-ALD-Aktivität und FIP-ALD-Aktivität misst und dann das Aktivitätsverhältnis (FDP/FIP) bestimmt.

Beide Methoden sind jedoch mit verschiedenen Problemen behaftet.

Bei der Elektrophorese besteht das Problem darin, dass die wandernden Punkte der Human-Aldolaseisoenzyme so dicht beieinanderliegen, dass eine Unterscheidung nur sehr schwer ist und eine genaue quantitative Bestimmung nicht möglich ist.

Bei der Methode der Messung des Aktivitätsverhältnisses

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FDP/FIP ist insbesondere das Verfahren zur Bestimmung der FIP-ALD-Aktivität sehr schwierig und man kann eine quantitative Bestimmung nicht vornehmen.

Kürzlich sind Radio-Immun oas say -Methoden bekannt geworden. Im Vergleich zu den vorerwähnten Methoden ist diese Methode äusserst empfindlich und zwar auch in quantitativer Hinsicht. Aber auch diese Methode hat Nachteile, weil man das Reagenz wegen des schnellen Zerfalls der zur Markierung verwendeten Radioisotope nicht lagern kann; weil spezielle Vorrichtungen und Apparaturen und ein besonderer Raum für die Messung der Radioisotope erforderlich sind, und weil die Handhabung der Radioisotope und die Messung sowie die Abfallbeseitigung schwierig sind und schliesslich auch, weil die Verwendung von Radioisotopen eine Gefahr für die Gesundheit darstellt.

Es wurde nun ein Reagenz für die Enzymimmunoassay von Aldolase vum Human-Muskeltyp, sowie ein Verfahren zur Bestimmung von Human-Muskeltyp-Aldolase unter Verwendung des Reagenzes gefunden. Dieses Verfahren ermöglicht es, dass die Nachteile des Standes der Technik vermindert oder vermieden werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist ein Enzym-Immunoassay und zwar ein sogenanntes "Sandwich-Verfahren". Bei diesem Verfahren wird die Messung in folgender Weise durchgeführt:

(a) Inberührungbringen einer Probe mit einem unlöslich gemachten Muskeltyp-Aldolase-Antikörper und anschliessende Abtrennung'der festen Phase,

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(b) Inberührungbringen der festen Phase mit einem enzymmarkierten Muskeltyp-Aldolase-Antikörper und an-, schliessende Abtrennung der festen Phase,

(c) Inberührungbringen der festen Phase mit dem Substrat des Enzyms, und

(d) Messung der Absorption des Zersetzungsproduktes auf dem Substrat.

Nachfolgend wird diese Methode näher beschrieben.

In der Stufe (a) wird ein Antikörper, der durch Kombination mit einem Träger unlöslich gemacht worden ist, zusammen mit einer Probe, wie Serum und dergleichen, inkubiert, so dass das Antigen (Human-Muskeltyp-Aldolase) in der Probe mit dem unlöslich gemachten Antikörper reagieren kann. Nach Beendigung der Umsetzung wird die Reaktionslösung entfernt und die feste Phase wird mit Pufferlösung, destilliertem Wasser und dergleichen gewaschen.

In der Stufe (b) wird die in Stufe (a) erhaltene feste Phase zusammen mit einem enzymmarkierten Antikörper inkubiert mit dem Ergebnis, dass sich der enzymmarkierte Antikörper mit dem zuvor mit dem unlöslichen Antikörper kombinierten Antigen kombiniert. Nach Beendigung der Umsetzung wird die Reaktionslösung entfernt und die feste Phase wird mit Pufferlösung, destilliertem Wasser und dergleichen gewaschen.

In der Stufe (c) wird die in Stufe (b) erhaltene feste

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Phase .zusammen mit einem Substrat des Enzyms inkubiert, um eine Enzymreaktion zu bewirken. Nach einer bestimmten Zeit wird die Reaktion durch Zugabe einer Abbrechlösung zu der Enzymmreaktion abgebrochen.

In der Stufe (d) wird der Absorptionsgrad des Zersetzungsproduktes des Substrates in der Reaktionslösung von Stufe (c) gemessen. Die Messung des Absorptionsgrades wird mit einem Absorptionsfotometer durchgeführt bei einer geeigneten Wellenlänge für die quantitative Bestimmung des Zersetzungsproduktes auf dem Substrat.

Der Absorptionsgrad einer bekannten Menge einer Standardprobe, der zur Kontrolle zuvor mit dem Messystem gemessen wurde, dient zum Aufstellen einer Arbeitskurve, welche die Menge des Antigens bei dem jeweiligen Absorptionsgrad zeigt. Die Menge des Antigens in der Probe kann aus dieser Arbeitskurve bestimmt werden, indem man die Absorption einer unbekannten Menge in der Probe in dem gleichen Masssystem bestimmt.

Fig. 1 bis 4 zeigen Arbeitskurven von Human-Muskeltyp-Aldolase, wie sie durch Enzym-Immunoassay gemäss Beispiel 5 erhalten wurden.

Fig. 5 zeigt eine Arbeitskurve von Human-Muskeltyp-Aldolase, wie sie durch Enzym-Immunoassay gemäss Beispiel 6 erhalten wurde.

Fig. 6 zeigt das Ergebnis der Bestimmung von

Human-Muskeltyp-Äldolase in Humanseren, nach dem Enzym-Immunoassay des Beispiels 7.

130016/0762 . ,

Nachfolgend wird das Reagenz, wie es für die Bestimmung erfindungsgemäss verv/endet wird, näher beschrieben.

(A) Muskeltyp-Aldolase-Antikörper

Antiserum erhält man, indem man Muskeltyp-Aldolase von Säugern, wie Menschen, Kaninchen, Hunden, Affen, Rindern und dergleichen, einem anderen Geschöpf verabreicht. Das immune Geschöpf wird vorzugsweise aus einer unterschiedlichen Art von Vögeln ausgewählt, weil Muskeltyp-Aldolase bei den verschiedenen Säugern keinen wesentlichen immunologischen -Unterschied aufweist.

Typische und bevorzugte Vögel sind beispielsweise Hühner, Puten, Enten und dergleichen.

Vorzugsweise wird das inaktivierte Serum des Tieres, aus dem die Muskeltyp-Aldolase stammt, dem gebildeten Antiserum zugegeben und dadurch durch Absorption andere unreine Antikörper entfernt.

Die Reinigung dieser Antiseren kann durch Affinitätschromatografie erfolgen unter Verwendung eines Trägers in Kombination mit der Säugetier-Muskeltyp-Aldolase, wobei der Säuger ausgewählt ist aus Menschen, Kaninchen, Affen, Rindern und dergleichen. Für diesen Zweck geeignete Materialien sind Agarose, überbrücktes Dextran und dergleichen. Der kombinierte Träger kann hergestellt werden, indem man einen Träger mit Bromcyan und dergleichen acyliert, den aktivierten Träger dann zu einer Lösung von Muskeltyp-Aldolase

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gibt und das Lösungsgemisch bei niedriger Temperatur rührt. Man erhält den gereinigten Muskeltyp-Aldolase-Antikörper durch Zugabe des Antiserums zu einer mit dem kombinierten Träger gefüllten Säule und Durchführung einer Affinitätschromatografxe. Die Eluierung des Muskeltyp-Aldolase-Antikörpers aus der Säule kann mit einer schwach alkalischen Lösung erfolgen.

Bei der Affinitätschromatografxe variiert die Empfindlichkeit der Messmethode gemäss der vorliegenden Erfindung in Abhängigkeit von der Art der Muskeltyp-Aldolase in Kombination mit dem Träger und der Art der Muskeltyp-Aldolase, wie sie zur Herstellung des Antiserums verwendet wird.

Im Falle von Human-Muskeltyp-Aldolase-Antiserum wird eine bevorzugte Arbeitskurve, wie sie in Fig. 1 gezeigt wird, erhalten, unter Verwendung von Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper, das hergestellt wurde durch Reinigung mit dem Träger in Kombination mit der Human-Muskeltyp-Aldolase. Im Falle von Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antiserum wird eine bevorzugtere Arbeitskurve erhalten, indem man unter Verwendung eines Trägers, kombiniert mit Human-Muske!typ-Aldolase reinigt und den Träger mit Rinder-Muskeltyp-Aldolase,kombiniert und dann den Träger mit Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase kombiniert, wie dies in Fig. 2, 3 und 4 gezeigt wird.

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(B) Der enzyinmarkierte Muskeltyp-Aldolase-Antikörper

Als für die Markierung geeignete Enzyme sind solche Enzyme geeignet, wie sie allgemein für die Enzym-Immunoassay angewendet werden, z.B. Alkaliphosphatase, Peroxidase, ß-D-Galactosidase, Glucoamylase oder Glucoseoxidase.

ήϊε Markierung kann in üblicher Weise erfolgen, z.B. nach der Glutaraldehyd-Methode, Nakan-Methode, Maleimid-Methode, Mischsäureanhydrid-Methode, Carbodiimid-Methode und dergleichen. Bei der Glutaraldehyd-Methode erfolgt die Markierung, indem man das Enzym zu dem Antikörper gibt und dann Glutaraldehyd in einer solchen Menge zugibt, dass die Konzentration 0,2 bis 0,8 %-ig ist, und dann die Umsetzung bei Raumtemperatur vornimmt. Das Konzentrationsverhältnis von Enzym zu Antikörper beträgt vorzugsweise 1:1 kann jedoch auch 1:2 bis 2:1 betragen. Der enzymmarkierte Antikörper wird im allgemeinen als Reagenz verwendet, indem man ihn mit Pufferlösung und dergleichen verdünnt. Es ist auch wünschenswert, inaktiviertes Kaninchenserum in einer Menge von etwa 20 % zu der verdünnten Lösung zuzugeben. Wie in Fig. 4 gezeigt wird, ergibt die Zugabe von inaktiviertem Kaninchenserum eine vorteilhaftere Arbeitskurve, als wenn man alleine eine Pufferlösung oder eine Pufferlösung enthaltend Rinderserumalbumin, verwendet.

(C) Der unlöslich gemachte Muskeltyp-Aldolase-Antikörper

Als Träger kann man einen unlöslichen Feststoff, der sich mit dem Antikörper kombiniert, verwenden.

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Geeignet hierfür sind beispielsweise Polystyrol, Zellulose, Agarose, Glas, überbrücktes Dextran, Silikonkautschuk oder Metall. Der Träger kann beispielsweise eine Rohrforin, eine Mikrotiterplatte, Pulverform, kugelförmig, scheibenförmig, eine Platte oder eine Folie sein.

In Falle einer Polystyrol-Mikrotiterplatte kann sich der Antikörper mit der Wandoberflache der Platte kombinieren, wenn der Antikörper in geeigneter Weise mit einer Pufferlösung oder dergleichen verdünnt ist und dann gibt man die verdünnte Lösung auf die Platte und das Ganze lässt man schliesslich stehen.

(D) Die weiteren Reagentien

Als Substrat kann man Enzymsubstrate verwenden, wie man sie bereits für enzymmarkierte Antikörper verwendet hat. Ist das verwendete Enzym Alkaliphosphatase, so können als Substrate p-Nitrophenylphosphat, ß-Glyzerinphosphat, Phenyl phosphat, ß-Naphthylphosphat, Phenolphthaleinphosphat und dergleichen verwendet werden.

Als Abbruchlösung für die Enzymreaktion kann man solche verwenden, wie sie für die jeweiligen Enzyme bekannt sind. Im Falle von Alkaliphosphatase besteht eine geeignete Abbruchlösung aus 1 η. Natriumhydroxidlösung.

Die bisherige Beschreibung erfolgte hinsichtlich der Sandwich-Methode aber die Human-Muskeltyp-Aldolase gemäss der Erfindung kann man auch durch Immunoenzymometrie bestimmen. Bei dieser Methode wird der enzymmarkierte

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Antikörper mit einer Probe (Antigen) umgesetzt und anschliessend erfolgt die Abtrennung des enzymmarkierten Antikörper-Antigen-Reaktanten (B) von dem nichtumgesetzten enzymmarkierten Antikörper (F) und die Bestimmung der Enzymaktivität von entweder (B) oder (F) auf dem Substrat. Als Methode für die Trennung von (B) und (F) können die Gelfiltrationsmethode, die Absorptionsmethode mittels unlöslich gemachten Antigens und dergleichen erwähnt werden. Bei der Bestimmung von Human-Muskeltyp-Aldolase mittels Immunoenzymometrie wird enzymmarkierter Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper als Reagenz verwendet.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Versuchen und Beispielen beschrieben.

Versuch 1

Human-MuskeltYg-Aldolase-Antiserum

Human-Muskeltyp-Aidolase (1 mg) wurde in 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und zu der Lösung wurde ein gleiches Volumen von Freund-Complete-Adjuvant hinzugegeben. Das Produkt wurde in den Muskel einer Henne (weisses Leghorn) injiziert. Die Human-Muskeltyp-Aldolase wurde in gleicher Weise wie vorher beschrieben nach 2 Wochen und nach 3 Wochen verabreicht. Eine Woche nach der letzten Verabreichung wurde das Blut der Henne zur Gewinnung von Human-Muskeltyp-Aldolase-Antiserum gesammelt.

Zu diesem Antiserum wurde normales Humanserum (NHS), das 2 Stunden bei 56 C inaktiviert worden war, bis zu einem

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Gehalt von 10 % gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert und dann über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Dann wurde ^;.das Produkt 20 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gesammelt zur Gewinnung von Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper, enthaltend absorbiertes NHS.

Versuch 2

Kaninchen-MuskeltYg-Aldolase-Antiserum

Kaninchen-Muskeltyp-Aldoläse (2 mg) wurde in 1 mg physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Anschliessend wurde das in Versuch 1 beschriebene Verfahren wiederholt, wobei man Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antiserum erhielt.

Zu diesem Antiserum wurde normales Kanxnchenserum (NRS), das 3 Stunden bei 56 C inaktiviert worden war, gegeben und zwar bis zu einem Gehalt von 10 %. Anschliessend wurde das in Versuch 1 beschriebene Verfahren wiederholt, wobei man Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antiserum, enthaltend adsorbiertes NRS, erhielt.

Versuch 3

TM
Sepharose 4B— (Pharmacia Fine Chemicals AB) Agarose (TO g) und die Human-Muskeltyp-Aldolase (10 mg) wurden bei 4°C

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über Nacht in einer 15 ml 0,1 m Natriumkarbonat-Pufferlösung (pH 9,0) stehen gelassen.

Der entstandene Sepharose 4B-GeI, in Kombination mit der Human-Muskeltyp-Aldolase, wurde in eine Säule gepackt und mit 0,05 m tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 0,5 η Natriumchlorid, gewaschen. Auf die Säule wurden dann 3 ml NHS-adsorbiertes Human-Muskeltyp-Aldolase-Antiserum, erhalten gemäss Versuch 1, gegeben, wobei das Antiserum mit der 0,05 m tris-Chlorwasserstoff säure-Puf ferlösung (pH 8,0), enthaltend 0,5 η Natriumchlorid, ausfloss. Anschliessend wurden auf die Säule 0,1 η einer wässrigen Natriumkarbonatlösung gegeben, um den Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper zu eluieren. Die Fraktion des Antikörpereluats wurde mit 0,05 m tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0) dialysiert, wobei man 3 mg des Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörpers erhielt.

Versuch 4

Das in Versuch 3 beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass 3 ml des NRS-absorbierten Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörpers gemäss Versuch 2 zu Sepbarose 4B-GeI, kombiniert mit Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase, gegeben wurde. Man erhielt 3 mg des Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antiserums.

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Versuch 5

Kaninchen-Muskelt^g^Aldolase-Antikörger

Das in Versuch 3 beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass 3 ml von NRS-adsorbiertem Kaninchen-Muskeltyp—Aldolase-Antiserum gemäss Versuch 2 zu dem mit Human-Muskeltyp-Aldolase-kombinierten Sepharose 4B-GeI

gegeben wurde. Es wurden 3 mg Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper erhalten.

Versuch 6

Das in Versuch 3 beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass 3 ml von gemäss Versuch 2 erhaltenem NRS-adsorbiertem Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper zu dem mit Rinder-Muskeltyp-Aldolase-kombinierten Sepharose 4B-GeI gegeben wurde. Man erhielt 3 mg Kaninchen-Muskel typ-Aldolase-Antikörper .

Versuch 7

Unlöslich_2emachter_Human-MuskeltYg-Aldolase-Antikörger

In die Löcher einer Polystyrol-Mikrotiterplatte wurden jeweils 200 Aal 0,05 m tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 25.ug/ml des im Versuch 3 beschriebenen

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Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörpers gegeben und dann
über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Die Lösung wurde
von der Platte entfernt. Die Platte wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, wobeiman eine Mikrotiterplatte
erhielt, die kombiniert war mit Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper.

Versuch 8

In die Löcher einer Polystyrol-Mikrotiterplatte wurden
jeweils 20OuI einer 0,05 m tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 25AIgZmI des im Versuch 4 beschriebenen Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörpers, gegeben und das Ganze wurde über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Die Lösung wurde von der Platte entfernt und die
Platte wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, unter Er halt einer Mikrotiterplatte in Kombination mit dem Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper.

Versuch 9

Unlöslich_2emachter_Kaninchen-Muskelt^g-

In die Löcher einer Polystyrol-Mikrotiterplatte wurden
jeweils 200 nl einer 0,05 m tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 25ng/ml des im Versuch

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5 beschriebenen Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörpers gegeben und das Ganze wurde bei 4 C über Nacht stehen gelassen. Die Lösung wurde von der Platte entfernt und die Platte wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, wobei man eine Mikrotiterplatte in Kombination mit dem Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper erhielt.

Versuch 10

ünlöslich_2emachter_Kaninchen-MuskeltY£-Aldolase-Antikörper

Unter Verwendung des gemäss Versuch 6 erhaltenen Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörpers wurden wie im vorhergehenden Versuch 9 Mikrotiterplatten hergestellt, die in Kombination mit dem Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper vorlagen.

Beispiel 1

Zu 0,3 ml Wasser, enthaltend 1 mg Alkaliphosphatase (relative Aktivität 1000 Einheiten/mg) wurden 0,2 ml einer 0,05 m Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 7,0), enthaltend 1 mg des gemäss Versuch 3 erhaltenen Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörpers, und 50 All einer 2,5 %-igen Glutaraldehydlösung gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschliessend mit 0,05 m

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tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0) über Nacht dialysiert. Man erhielt alkaliphosphatasemarkierten Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper.

Beispiel 2

Antikörper

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass 1 mg des Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörpers gemäss Versuch 4 mit 1 mg Alkaliphosphatase verwendet wurde. Man erhielt alkaliphosphatasemarkierten Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper.

Beispiel 3

Kaninchen-Muskel tyjo-Aldolase^

Antikörper

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass der in Versuch 5 verwendete Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper zusammen mit 1 mg Alkaliphos-phatase verwendet wurde. Man erhielt alkaliphosphatasemarkierten Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper.

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Beispiel 4

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass der in Versuch 6 beschriebene Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper zusammen mit 1 mg Alkaliphosphatase verwendet wurde. Man erhielt alkaliphosphatasemarkierten Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper.

Beispiel 5

Eine Standard-Antigenlösung aus 500 ng/ml - 7,6 mg/ml wurde hergestellt durch zweifache Serienverdünnung von Human-Muskeltyp-Aldolase mit 2 Stunden bei 56 C inaktiviertem normalen Kaninchenserum. Diese Standardlösung (0,1 ml) wurde zu der Mikrotiterplatte in Kombination mit dem Muskeltyp-Aldolase-Antikörper gegeben und dann 60 Minuten bei 37 C stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde entfernt. Die Platte wurde 4 mal mit destilliertem Wasser gewaschen.

Der alkaliphosphatasemarkierte Muskeltyp-Aldolase-Antikörper wurde 150-fach mit 0,05 m tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend' 30 % normales Kaninchenserum, das 2 Stunden bei 56°C inaktiviert worden war, verdünnt. Diese verdünnte Lösung (0,1 ml) wurde zu der erwähnten Platte gegeben und dann 60 Minuten bei 37°C stehen gelassen.

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Die Reaktionslösung' wurde entfernt. Die Platte wurde 4 mal mit destilliertem Wasser gewaschen. Eine Lösung aus 5 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0,1 η Natriumcarbonat-Pufferlösung (pH 9,0), enthaltend 0,001 m Magnesiumchlorid, wurde getrennt hergestellt. Diese Lösung (0,1 ml) wurde zu der Platte gegeben und dort 6O Minuten bei 37 C reagieren gelassen und anschliessend wurden zum Abbrechen der Reaktion 0,1 ml einer 1 η Natriumhydroxidlösung hinzugegeben-Die Reaktionslösung wurde auf das 10-fache mit destilliertem Wasser verdünnt. Der Absorptionsgrad bei 405 mn wurde mit einem Spektrofotometer zum Einstellen der Arbeitskurve zwischen der Absorption und der Konzentration der Human-Muskeltyp-Aldolase gemessen.

Fig. 1 zeigt die Arbeitskurve, die man bei der hier erwähnten Untersuchungsmethode erhielt, wobei die Mikrotiterplatte in Kombination mit Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper von Versuch . 7 als Mikrotiterplatte, die in Kombination mit Muskeltyp-Aldolase-Antikörper vorlag, verwendet wurde, und alkaliphosphatasemarkiertes Human-Muskeltyp-Aldolase-Antigen von Beispiel 1 als alkaliphosphatasemarkiertes Muskeltyp-Aldolase-Antigen verwendet wurde.

Fig. 2 zeigt die Arbeitskurve für den Fall, dass die Mikrotiterplatte in Kombination mit dem Kaninchen-Muskeltyp--Aldolase-Antikörper von Versuch 8 als Mikrotiter in Kombination nri t dem Muskeltyp-Aldolase-Antikörper verwendet wurde und der alkaliphosphatasemarkierte Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper von Beispiel 2 wurde als alkaliphosphatasemarkierter Muskeltyp-Aldolase-Antikörper verwendet.

Fig. 3 zeigt die Arbeitskurve für den Fall, dass die

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Mikrotiterplatte in Kombination mit dem Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper von Versuch 9 als Mikrotiterplatte in Kombination mit dem Muskeltyp-Aldolase-Antikörper verwendet wurde und der alkaliphosphatasemarkierte Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper von Beispiel 3 als alkaliphosphatasemarkierter Muskeltyp-Aldolase-Antikörper verwendet wurde.

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Ϊ
Fig. 4 zeigt die Arbeitskurve für den Fall, dass als Mikrotiterplatte in Kombination mit dem Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper derjenige von Versuch 10 verwendet wurde und als alkaliphosphatasemarkierter Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper der gemäss Beispiel 4 eingesetzt wurde.

In den Fig. 1 bis 4 bedeutet die horizontale Achse die Konzentration (ng/ml) an Human-Muskeltyp-Aldolase und die senkrechte Achse die Adsorption bei 405 m Ai (OD *_n!- _n )

Wie aus Fig. 1 bis 4 hervorgeht, erhält man die am meisten bevorzugte Arbeitskurve bei einem unlöslich gemachten Antikörper und dem enzymmarkierten Antikörper, wenn man einen Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper (Fig. 1) verwendet und dann in der nachfolgenden Reihenfolge der unlöslich gemachten Antikörper und enzymmarkierten Antikörper, bei dem Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper (Fig. 4, 3 und 2) verwendet wurden. Dabei ist festzuhalten, dass bei einem Vergleich der Fälle, bei denen Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper verwendet wurde, die jeweils bevorzugteren Arbeitskurven in dem Falle (Fig. 4) erzielt wurde, bei dem der Träger in Kombination mit Rinder-Muskeltyp-Aldolase verwendet wurde sowie auch in

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dem Fall (Fig. 3), bei dem der Träger in Kombination mit Human-Muskeltyp-Aldolase verwendet wurde und in dem Fall, dass die Reinigung des Antikörpers mittels Affinitätschromatografie erfolgte, wurde die Kurve, die in einem anderen Fall (Fig. 2) erhalten wurde, verwendet, bei welcher der Träger mit der Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase verwendet wird.

Beispiel 6

Enζym-Immunοassay

Die Auswirkungen der Art des Verdünnungsmittels auf enzymmarkierte Antikörper wurde mittels des Immunoassaysystems gemäss Beispiel 5 untersucht.

Als enzymmarkierter Antikörper wurde der in Beispiel 1 beschriebene alkaliphosphatasemarkierte Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper verwendet und als Mikrotiterplatte in Kombination mit Human-Muskeltyp-Aldolase wurde als unlöslich gemachtes Antigen das von Versuch 7 verwendet.

In diesem Beispiel werden folgende Verdünnungsmittel verwendet :

(A) 0,05 m tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend eine 30 %-ige Konzentration des 2 Stunden bei 56°C inaktivierten Normal-Kanin chen se rums .

(B) 0,05 m tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung

■■-■■■:: \ - 24 -

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(pH-8,0), enthaltend in 1 %-iger Konzentration das 30 M.
serumalbumin.

tion das 30 Minuten bei 56°C inaktivierte Rinder-

(C) 0,05 m tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0) als Kontrolle.

Die enzymitiarkierten Antikörper, die mit jeweils den Verdünnungsmitteln auf das 150-fache verdünnt worden waren, wurden verwendet. Die Arbeitskurve wurde wie in Beispiel 5 unter Verwendung der Standardantigenlösung aufgestellt. Jede der gefundenen Arbeitskurven wird in Fig. 4 gezeigt. Die Horizontalachse in Fig. 4 zeigt die Konzentration an Human-Muskeltyp-Aldolase (ng/ml) und die senkrechte Achse zeigt die Absorption bei 450 m Ai (^oda5q ) · Die Symbole (A), (B) und (C) zeigen die jeweiligen Arbeitskurven, die man in jedem der Fälle mit den Verdünnungsmitteln (A), (B) bzw. (C) erhalten hat. Wie aus der Zeichnung hervorgeht, ist die bevorzugteste Arbeitskurve die Arbeitskurve (A), die man erhält, wenn man das inaktiviertes Kaninchenserum enthaltende Verdünnungsmittel verwendet.

Beispiel 7

Enzvin-ImmunoassaY

Die Bestimmung wurde hinsichtlich der Konzentrationen an Human-Muskeltyp-Aldolase im Serum von verschiedenen Krebspatienten, von nichtkrebsigen kranken Patienten und von.

1 3 p Q1 6 / 0 7 δ 2

gesunden Menschen mit Hilfe des in Beispiel 5 beschriebenen Immunoassaysystems durchgeführt.

Der in diesem Beispiel verwendete enzymmarkierte Antikörper war der in Beispiel 1 beschriebene alkaliphosphatasemarkierte Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper und als unlöslich gemachter Antikörper wurde die Mikrotiterplatte in Kombination mit der Human-Muskeltyp-Aldolase, wie sie im Versuch 7 beschrieben wird, verwendet. Die Serumproben wurden direkt ohne Verdünnung verwendet.

Die Ergebnisse werden in Fig. 6 gezeigt. Wie aus der Zeichnung hervorgeht, neigt Human-Muskeltyp-Aldolase dazu, im Serum von Krebspatienten in einer höheren Konzentration vorhanden zu sein als bei solchen mit anderen, nicht krebsartigen Krankheiten und bei gesunden Menschen.

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Claims

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Reagenz und Verfahren zur Bestimmung von Human-Muskeltyp-Äldolase

PATENTANSPRÜCHE

Reagenz zur Bestimmung von Human-Muskeltyp-Aldolase. dadurch gekennzeichnet , dass es enzymmarkierte Muskeltyp-Aldolase-Antikörper ent- · hält.

Reagenz gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Enzym Alkaliphosphatase ist.

Reagenz gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e η η z.eichnet, dass der Muskeltyp-Aldolase-Antikörper Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper ist.

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4. Reagenz gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet , dass der .Muckeltyp-Aldolase-Antikörper Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper ist.

5. Reagenz gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , dass der Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper ein solcher ist, der mittels Affinitätschromatografie unter Verwendung eines Trägers in Kombination mit Human-Muskeltyp-Aldolase gereinigt worden ist.

6. Reagenz gemäss Anspruch .4, dadurch gekennzeichnet , dass der Kaninchen-Muskeltyp— Aldolase-Antikörper ein solcher ist, der mittels Affinitätschromatografie unter Verwendung eines Trägers in Kombination mit Rinder-Muskeltyp-Aldolase gereinigt worden ist.

7. Reagenz gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der enzymmarkierte Muskeltyp-Aldolase-Antikörper mit einer Pufferlösung, enthaltend inaktiviertes Kaninchenserum, verdünnt worden ist.

8. Verfahren zur Bestimmung von Human-Muskeltyp-Aldolase, dadurch gekennzeichnet , dass folgende Stufen durchgeführt werden:

(a) Inberührungbringen einer Probe mit einem unlöslich gemachten Muskeltyp-Aldolase-Antikörper und anschliessende Abtrennung der festen Phase,

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(b) Inberührungbringen der festen Phase mit enzymmarkiertem Muskeltyp-Aldolase-Antikörper und anschliessende Abtrennung der festen Phase,

(c) Inberührungbringen der festen Phase mit dem Enzymsubstrat, und

(d) Bestimmung der Absorption oder der Zersetzungsprodukte aus dem Substrat.

9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , dass man Kaninchen-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper, die durch Affinitätschromatografie unter Verwendung eines Trägers in Kombination mit Rinder-Muskeltyp-Aldolase gereinigt worden sind, als Muskeltyp-Aldolase-Antikörper in einem unlöslich gemachten Muskeltyp-Aldolase-Antikörper und einem enzymmarkierten Muskeltyp-Aldolase-Antikörper verwendet.

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