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Verfahren zur enzymimmunologischen Bestimmung von
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Llpase Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymimmunologischen
Bestimmung von Lipase.
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In der Diagnostik von Erkrankungen spielt die Bestimmung der Lipase
im Blutserum der Patienten eine wichtige Rolle.
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Aus Ann. Acad. Sci Finn. Fer., V/Med. 166, 36 (1974) sind Verfahren
zur immunchemischen Bestimmung von Lipase bekannt. Aufgrund der geringen Empfindlichkeit
der verwendeten Methoden (radiale Immundiffusion, Elektroimmunoassay) können nur
sehr hohe Lipasekonzentrationen bestimmt werden, wie sie beispielsweise im Duodenal
saft vorkommen.
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Ein Festphasen-Enzymimmunoassay zur Bestimmung von Lipase ist in J.
Cl in. Chem. Biochem. 19, 683 (1981) beschrieben, der genügend empfindlich ist,
um auch Lipase-Bestimmungen im Serum gesunder Personen und bei Patienten mit erniedrigter
Lipasekonzentration, wie beispielsweise bei chronischer Pankreatitis, zu erlauben.
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Bei diesem Test wird das Patientenserum mit Antikörpern gegen Lipase
zusammengebracht, mit denen die Innenseite von Röhrchen beschichtet ist. Anschließend
werden die Röhrchen leergesaugt und zweimal gewaschen. Dann wird die Lösung von
Antikörpern gegen Lipase, die mit dem Enzym Peroxidase markiert sind, in die Röhrchen
eingefüllt. Nach Leersaugen und Auswaschen der Röhrchen wird eine Substratlösung
zugegeben, mit deren Hilfe die an die Röhrchenwand gebundene Peroxidase-Aktivität
bestimmt wird. Obwohl das Testverfahren die erforderliche Empfindlichkeit besitzt,
ist der Aufwand für eine Routineanwen-
dung nachteilig.
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Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches und empfindliches Verfahren
zur enzymimmunologischen Bestimmung von Lipase zur Verfügung zu stellen. Enzymimmunologische
Bestimmungen sind an sich bereits bekannt.
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Ein als Sandwich-Verfahren bekanntes Verfahren ist beispielsweise
für die Bestimmung des alpha-Fetoproteins in J. Immunol. Meth., 42, 11 (1981) beschrieben,
bei dem die zu untersuchende Probe und ein monoklonaler Enzym-markierter Antikörper
gleichzeitig zusammen mit einem zweiten monoklonalen Antikörper, der an der Festphase
gebunden ist, inkubiert werden. Monoklonale Antikörper werden von identischen Zellen
produziert, besitzen eine identische Struktur und vermögen nur mit einer antigenen
Determinante eines Antigens, das mehrere unterschiedliche antigene Determinanten
besitzt, zu reagieren. In dieser Veröffentlichung wird jedoch darauf hingewiesen,
daß ein solcher Testaufbau nur bei Verwendung von zwei verschiedenen monoklonalen
Antikörpern möglich ist. Der Antikörper der Festphase muß andere Antigendeterminanten
auf dem alpha-Fetoprotein erkennen, als der markierte Antikörper. AuBerdem geht
aus der Arbeit hervor, daß von 10 nach der Hybridoma-Technik (G.Köhler, C.Milstein,
Nature 256, 495 (1979)) hergestellten monoklonalen Antikörpern nur 2 gute Testergebnisse
lieferten. Die Herstellung einer so großen Anzahl monoklonaler Antikörper ist mit
einem großen Aufwand verbunden.
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Die Verwendung po-lyklonaler Antikörper in einem solchen Testsystem
löst die erfindungsgemäß gestellte Aufgabe.
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Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, daß der Aufbau eines
sehr empfindlichen und einfach durchzuführenden Enzymimmunoassays zur Bestimmung
von Lipase nach dem
Sandwich-Prinzip mit nur einem Inkubationsschritt
möglich ist.
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Polyklonale Antikörper stammen aus unterschiedlichen Zellen und erkennen
mehrere unterschiedliche antigene Determinanten eines Antigens. Sie sind ein natürliches
Gemisch von Antikörpern verschiedener Struktur.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur enzymimmunologischen
Bestimmung von Lipase, dadurch gekennzeichnet, daß eine Festphase, an deren Oberfläche
polyklonale Antikörper gegen Lipase gebunden sind, mit der zu untersuchenden Probe
und mit polyklonalen Antikörpern gegen Lipase, die an ein Enzym (Marierungsenzym)
gekoppelt sind, zusammengebracht (inkubiert), die Phase getrennt und die Menge des
Enzyms in der festen oder flüssigen Phase bestimmt wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfacher als die üblichen Sandwich-Verfahren,
da ein Inkubationsschritt und ein Waschschritt entfallen.
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Die Erzeugung von polyklonalen Antikörpern durch konventionelle Immunisierung,
das heißt durch Injektion des Antigens in Tiere wie Kaninchen, Schafe, Ziegen oder
Meerschweinchen, die darauf mit der Bildung von Antikörpern reagieren, ist bekannt.
Durch geeignete Zusätze (Adjuvantien) kann die Reaktion des Tieres auf die Gabe
des Antigens gesteigert werden. Nach ausreichender Dauer der Immunisierung und mehrfacher
Verabreichung des Antigens wird das Serum aus dem Blut der Tiere abgetrennt.
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Die antikörperhaltige Fraktion kann nach einer Vielzahl von Methoden,
beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat, gewonnen werden. Für die hochempfindl
ichen Immunoassays ist es erforderlich, die spezifischen Antikörper von der übrigen
Gamma-Globulln-Fraktlon durch Affinitäts-
chromatog r a phie zu
trennen.
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Als Festphasen können einteilige Formkörper verwendet werden, wobei
die Röhrchenform bevorzugt wird. Andere Formkörper, wie die Vertiefungen in Mikrotitrationsplatten
oder auch größere Kunststoffkugeln, sind ebenfalls geeignet.
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Als Markierungsenzyme können alle Enzyme verwendet werden, die sich
kovalent unter möglichst geringem Verlust an Antikörper binden lassen. Als besonders
geeignet hat sich Peroxidase aus Meerrettich erwiesen.
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Die Bestimmung des Markierungsenzyms kann mit jedem geeigneten Substrat
durchgeführt werden.
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Durch die Erfindung wird ein einfaches und schnell durchzuführendes
Verfahren zur enzymimmunologischen Bestimmung von Lipase zur Verfügung gestellt,
das eine sehr hohe Nachweisempfindlichkeit besitzt, so daß auch sehr niedrige Lipase-Konzentrationen
problemlos bestimmt werden können.
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Das folgende Beispiel soll d-ie Erfindung erläutern: Beispiel A) Beschichtung
von Röhrchen mit Anti-Lipase vom Kaninchen Antiserum gegen Pankreas-Lipase wird
durch Immunisierung von Kaninchen mit aus menschlichem Duodenalsaft gereinigter
Lipase erzeugt. In 2 ml fassenden Polystyrol-Röhrchen wird eine verdünnte Lösung
der Anti-
Pankreas-Lipase über Nacht inkublert. Die Röhrchen werden
anschließend mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen und getrocknet.
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B) Herstellung von Anti-LipaseZPeroxidase-Konjugaten Anti-Lipase-Antiserum
vom Kaninchen wird mit trägergebundener Lipase inkubiert. Nach Auswaschen der nichtgebundenen
Anteile werden die spezifischen Antikörper durch Einwirkung von 0.2 M Glycin-Salzsäure-Puffer
pH 2.5 abgespalten. Nach Dialyse gegen physiologische Kochsalz-Lösung und Einengen
durch Ultrafiltration auf eine Proteinkonzentration von 5 mg/ml werden die gereinigten
Anti-Lipase-Antikörper an mit Perjodataktivierte Peroxidase (Reinheitszahl 3) nach
der Methode von P.K.Nakane und A.Kawaoi (J. Histochem.
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Cytochem. 22, 1084 (1974)) gekoppelt. Nach Reinigung des Konjugates
durch Gelfiltration wird zur-Stabilisierung Humanserum-Albumin hinzugegeben.
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C) Herstellung von Lipase-Standards Hochgereinigte Lipase wird in
einer Lösung von Humanserum-Albumin (30 mg/ml) in Tris(hydroxymethyl)-aminomethan/Salzsäure-Puffer
pH 7.4 gelöst. Lösungen mit folgenden Konzentrationen werden hergestellt: 3, 10,
30, 100, 300, 1000, 3000, 10000, 20000 Lipase.
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D) Bestimmung der Lipase In die mit Antikörpern gegen Lipase beschichteten
Röhrchen werden 0.02 ml der Lipase-Standards (0, 3, 30, 100, 300, 1000, 3000, 10000,
20000/ug/l) eingefüllt. Unmittelbar danach gibt man 0.2 ml des entsprechend verdünnten
Anti-Lipase/Peroxidase-Konjugates zu und Inkublert 2 Stunden bei 20 - 250C. Danach
saugt man den Inhalt der Röhrchen aus und füllt etwa 2 ml physiologische Kochsalzlösung
ein. Man saugt nochmals
aus und wiederholt den Waschschritt. Man
pipettiert 0.2 ml einer Lösung von Ortho-Phenylendiamin-Dihydrochlorid und Wasserstoff-Peroxid
in Citrat-Phosphatpuffer ein und inkubiert 30 Minunten bei Rumtemperatur. Durch
Zugabe von 1 ml verdünnter Schwefelsäure wird die enzymatische Reaktion gestoppt.
Man bestimmt die Extinktion in einem Photometer bei 492 nm. Trägt man das Meßsignal
gegen die eingesetzte Lipase-Konzentrat ion auf, so erhält man eine Referenzkurve.
Der gut auswertbare Meßbereich liegt zwischen 3 und 300/ug/l.
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Selbst bei sehr hohen Konzentrationen von 20000/ug liegt die Extinktion
noch über dem Wert der als Obergrenze des Meßbereichs festgelegten Konzentration
von 300/ug/l. Solche hohen Konzentrationen wurden selbst im Serum von Patienten
mit akuter Pankreatitis nicht gefunden. Die höchste gemessene Konzentration liegt
bei 5000/ug/l. Der Normal bereich der Pankreas-Lipase beträgt 7 - 37/ug/l (2.5 -
97.5 Percentile, ermittelt an 220 gesunden Personen).
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Werden die-mit Anti-Lipase beschichteten Röhrchen und die Anti-Lipase/Peroxidase-Konjugate
mit einem Antiserum vom Schaf nach dem oben erläuterten Verfahren hergestellt und
der Test entsprechend durchgeführt, erhält man eine vergleichbare Eichkurve.
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Werden anstelle des zur Herstellung von mit Antikörpern gegen Lipase
beschichteten Röhrchen verwendeten Antiserums vom Kaninchen ein durch konventionelle
Immunisierung von Schafen mit gereinigter Pankreas-Lipase erzeugtes Antiserum und
zur Herstellung des Anti-Lipase/Peroxidase-Konjugates Anti-Lipase vom Kaninchen
verwendet, so ergibt sich ebenfalls eine vergleichbare Eichkurve.
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Vergleichbare Ergebnisse werden ferner erhalten, wenn man die Röhrchen
mit Antiserum vom Kaninchen beschichtet und das Antikörper-Peroxidase-Konjugat aus
Antiserum vom Schaf herstellt.