DE2639623A1

DE2639623A1 - Mittel und verfahren zur neoplasmadiagnose

Info

Publication number: DE2639623A1
Application number: DE19762639623
Authority: DE
Inventors: Masaru Ishii
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1975-09-03
Filing date: 1976-09-02
Publication date: 1977-03-10
Also published as: FR2323147B1; GB1560788A; FR2323147A1; US4152410A; CH627187A5; CA1080124A

Description

HOFFMANN · EITLE & PARTNER 2 6 3 3 Q Z 0

PATENTANWÄLTE DR. ING. E. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN . DIPL.-ING. W. LEH N D-8000 MÖNCHEN 81 . ARABELLASTRASSE 4 (STERN HAUS) · TELEFON (089) 911087 . TELEX 05-29619 (PATHE)

EISAI CO., LTD.,
Tokyo/Japan

" Mittel und Verfahren zur Neoplasmadiagnose "

Untersuchungen an neoplasma-eigenen Antigenen des Menschen stellen einen wichtigen Faktor bei der Erforschung der genetischen Ursachen, der Verhütung, der Behandlung und der Diagnose von Neoplasmen dar. Diese Untersuchungen haben bereits zur Auffindung einiger neoplasma-eigener Antigene geführt, z.B. von a-FÖtoprotein aus primären Leberkrebszellen und von embryonalem Carcinoantigen (CEA) aus Adenocarcinoma. Diese Antigene sind jedoch auf die Neoplasmen von bestimmten Eingeweidebereichen, Organsystemen oder histopathologischen Formen beschränkt. Aus diesem Grund stellt es

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einen bedeutenden Fortschritt in der Diagnose, der Verhütung und der Behandlung von variablen, beim Menschen entwickelten Neoplasmen dar, wenn nach Neoplasma-eigenen Antigenen, die den Neoplasmen verschiedener Eingeweide und histopathologischer Morphologien gemeinsam sind, geforscht, die diesen Antigenen zugehörigen Antikörper hergestellt und ein Verfahren zum Nachweis von Antigenen unter Verwendung der monospezifischen Antikörper bereitgestellt wird.

Als Ergebnis von Untersuchungen über die Existenz von Antigenen, die variablen Neoplasmen eigen und zahlreichen verschiedenen Neoplasmen gemeinsam sind, wurde nun ein neuartiges embryonales Neoplasma-Antigen (im folgenden: NEA) gefunden.

NEA ist ein monospezifisches Antigen, das Embryonen und Neoplasmen gemeinsam ist. Das Antigen kann aus Krebsgeweben gewonnen werden, z.B. aus Brust-, Magen- und Lebertumoren.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass NEA bzw. ΝΕΑ-Antikörper zur Diagnose verschiedener Arten von malignen Neoplasmen verwendet werden können.

Gegenstand der Erfindung sind daher ein neues Diagnosemittel für Neoplasmen der verschiedensten Art, ein Diagnoseverfahren für Neoplasmen im menschlichen Organismus, ein Verfahren zur Herstellung von ΝΕΑ-Antikörpern für die Neoplasmadiagnose sowie ein Verfahren zum Reinigen von NEA und NEA-Antikörpern für das Neoplasma-Diagnosemittel.

Das erfindungsgemäß verwendete NEA besitzt folgende Eigenschaften:

1) Nach der Ouchterlony-Methode kann bei Verwendung eines Antikörpers für NEA nachgewiesen werden, daß NEA in Gewebe (hauptsächlich Dünndarm und Dickdarm), Serum, Ascites und Exkrementen von Embryonen, Gewebe von verschiedenen Neoplas-

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men (hauptsächlich malignen Neoplasmen) sowie in Serum und Ascites von Neoplasmapatienten existiert. Dagegen konnte die Existenz von NEA in nicht-neoplasmatischem Gewebe von Neoplasmapatienten, normalem menschlichem Serum sowie Serum und Ascites von Nicht-Neoplasmapatienten nicht nachgewiesen werden.

Darüberhinaus läßt sich keine Desaktivierung oder Verringerung der Aktivität der NEA-Antikörper beobachten, selbst wenn man das NEA-Antiserum einer Neutralisations- und Absorptionsbehandlung unter Verwendung eines Antigens unterzieht, das aus Gewebe von ITicht-Neoplasmapatienten, normalem menschlichem Serum oder Serum von Ficht-Neoplasmapatienten, extrahiert worden ist. Dagegen läßt sich nach der Ouchterlony-Methode eine Desaktivierung bzw. Verringerung der Aktivität der NEA-Antikörper nachweisen, wenn man das Antiserum einer Absorptions behandlung unter Verwendung eines Extrakts unterzieht, der aus embryonalem Gewebe, embryonalem Serum, Extrakten verschiedener maligner Neoplasmagewebe oder Serum von Neoplasmapatienten gewonnen wurde. Hieraus läßt sich schließen, daß NEA ein monospezifisches, Embryonen und Neoplasmen gemeinsames Antigen ist.

2) Die Ouchterlony-Methode und die Immuno elektrophorese führen zu dem Ergebnis, daß NEA bei der Elektrophorese in einer Barbitallösung mit einem pH von 8,6 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,1, die z.B. eine Celluloseacetatmembran, einen Vinylchlorid/Vinylacetatkomplex (Pebicon C-870), Agargel oder Stärke als Trägermedium enthält, der y-Globulinfraktion angehört und sich in den immunologischen Eigenschaften von anderen Immunoglobulinen (Immunoglobuline G, A, M, D und E) und anderen Serum-y-Globulinen unterscheidet.

3) NEA hat einen Absorptionskoeffizienten E^0> Jj 280 von 0,936. Die Proteinmenge wird nach der Lowry-Methode bestimmt, bei der Serumalbumin von Kühen als Standardbase dient.

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4) NEA ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 100 000 + 20 000 (ermittelt durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex G-200 der Pharmacia AB).

5) Bei der chromatographischen Entwicklung von NEA mit einer Pufferlösung, die eine Ionenstärke von 0,05 und einen pH von 7}0 aufweist, unter Verwendung eines basischen Anionenaustauschers wird NEA nicht am Austauscher absorbiert, sondern mit Immunoglobulin G eluiert.

6) Der isoelektrische Punkt von NEA liegt bei einem pH von S,Λ bis 9,4.

7) NEA fällt in einer 2,6m Ammoniumsulfatlösung bei einem pH von 7,0 aus.

Da NEA ein monospezifisches Antigen ist, können Neoplasmen dadurch diagnostiziert werden, daß man die Anwesenheit von NEA im Serum prüft.

Der für die erfindungsgemäße Neoplasmadiagnose verwendete NEA-Antikörper kann dadurch hergestellt werden, daß man das NEA eines NEA-NEA-Antikörperkomplexes in tierischen Organismen immunisiert und das Antiserum gewinnt.

NEA kann im Rahmen der Erfindung entweder in gereinigter oder in roher Form verwendet werden. Beispielsweise kann man Embryonenserum, Embryonenascites, Serum von Plasmapatienten, Ascites von Neoplasmapatienten, Extrakte von Neoplasmageweben, Extrakte von Embryonenexkrementen sowie gereinigte Produkte verwenden, die nach üblichen, im Bereich der Immunologie angewandten Verfahren zur Reinigung von Proteinfraktionen erhalten worden sind. Die Reinigung kann z.B. durch Aussalzen, Elektrophorese, Gelfiltration, Ionenaustausch, AffinitatsChromatographie, Zentrifugaltrennung, Ultrafiltration, Fraktionierung nach dem isoelektrischen Punkt, Fraktionierung mit organischen Lösungsmit-

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teln, Cohn-Fraktionierung (Verfahren, bei dem der ΝΕΑ-Antikörper zugesetzt, der NEA-NEA-Antikörperkomplex gesammelt und das NEA daraus isoliert wird) oder nach der modifizierten Spiro-Methode erfolgen (Verfahren, "bei dem ein Antikörper für Verunreinigungen außer NEA zugesetzt wird, um die Verunreinigungen abzutrennen). Diese Methoden können auch in beliebiger Kombination angewandt werden.

Der NEA-NEA-Antikörperkomplex läßt sich z.B. durch Vermischen von NEA mit dem NEA-Antikörper in einer Lösung erhalten.

Als Reinigungsverfahren eignen sich insbesondere die Affinitätschromatographie und die Behandlung mit einem basischen Anionenaustauscherharz. Diese Methoden werden im folgenden näher erläutert .

A) Reinigung unter Anwendung der Affinitätschromatographie

NEA oder der ΝΕΑ-Antikörper werden mit einem Trägermedium, wie Gepharose oder Sephadex (beide von Pharmacia AB) kombiniert, indem man z.B. das Trägermedium, das vorher mit Bromcyan oder dergleichen aktiviert worden ist, zu einer Lösung von NEA oder dem IiEA-Antikörper gibt und das Gemisch bei niedrigen Temperaturen rührt. Das erhaltene Kombinationsprodukt wird als Trennmittel verwendet. Dabei dienen Kombinationsprodukte aus dem NEA-Antikörper und einem Trägermedium zur Reinigung von NEA, während Kombinationsprodukte aus NEA und einem Trägermediüm zur Reinigung des NEA-Antikörpers verwendet werden. In der praktischen Durchführung werden das Kombinationsprodukt aus NEA bzw. dem NEA-Antikörper und dem Trägermedium in eine Säule gefüllt. Hierauf beschickt man die Säule mit einer Lösung, die das zu reinigende NEA bzw.· den ΝΕΑ-Antikörper enthält. Hierbei reagier ren nur das NEA bzw. der NEA-Antikörper mit dem mit dem Trägermedium kombinierten NEA-Antikörper bzw. NEA unter Komplexbildung, während die anderen Verunreinigungen abfließen. Der Kom-

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plex wird dann dissoziiert, wobei das gewünschte NEA bzw. der NEA-Antikörper erhalten werden. Die Komplexdissoziation erfolgt z.B. dadurch, daß man eine 3 m bis 5m Salzlösung oder eine wäßrige Lösung mit einem pH von 2 bis 3 durch die Säule leitet.

Nach dem Reinigungsverfahren der Erfindung können NEA bzw. der NEA-Antikörper in hoher Reinheit nicht nur aus hochkonzentrierten Ausgangsmaterialien gewonnen werden, sondern auch aus Ausgangsmaterialien, die wenig NEA bzw. NEA-Antikörper enthalten. Die erfindungsgemäß verwendete Säule hat darüberhinaus den Vorteil, daß sie durch Regeneration mehrmals verwendet werden kann.

B) Reinigung von NEA mit einem basischen Anionenaustauscherharz

Als basische Anionenaustauscherharze eignen sich z.B. QAE-Sephadex (Pharmacia AB), DEAE-Sephadex (Pharmacia AB), DEAE-Cellulose (Celula Co.) und TEAE-Cellulose (Celuba Co.).

Als NEA-haltige Gemische können z.B. embryonales Serum, Serum von Neoplasmapatienten, Ascites von Neoplasmapatienten, Extrakte von Keoplasmageweben, Extrakte von embryonalen Exkrementen sowie teilweise gereinigtes NEA verwendet werden, das aus den genannten Materialien in einem üblichen Verfahren zur Reinigung von Proteinfraktionen erhalten worden ist.

Das basische Anionenaustauscherharz wird in eine Säule gefüllt, worauf man das NEA-haltige Gemisch durchleitet. Die Reinigung erfolgt dadurch, daß das NEA ohne Absorption am Harz eluiert wird. Anstelle des Säulensystems kann zur Reinigung auch ein Chargensystem angewandt werden.

Der NEA-Antikörper läßt sich dadurch erhalten, daß man das erfindungsgemäß gereinigte NEA an Tieren immunisiert. Antiserum wird dadurch hergestellt, daß man Tiere mit NEA bzw. dem NEA-NEA-Antikörperkomplex immunisiert und nach einer bestimmten Zeit das Blut der Tiere sammelt. Als Versuchstiere eignen sich z.B. Kaninchen, Ziegen, Pferde und Kühe. Die Immunisierung er-

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folgt vorzugsweise mit NEA bzw. einem NEA-NEA-Antikörperkom- -plex, die vorher in einem Freund-Adjuvans emulgiert worden sind. Ferner wird die Immunisierung vorzugsweise mehrmals durchgeführt, um ein Antiserum mit hohem Antikörpergehalt zu erhalten.

Die Abtrennung der vom NEA-Antikörper verschiedenen Antikörper aus dem erhaltenen Antiserum kann auf verschiedene Weise erfolgen, z.B. durch

- Immunoabsorption, wobei das Antigen aus normalem menschlichem Serum, Ascite3und Serum von Nicht-Neoplasraapatienten oder Extrakten von Neuplasmagewebe eingesetzt wird;

- Affinitätschromatographie, wobei das Antigen fixiert wird;

- Affinitätschromatographie, wobei NEA fixiert wird;

- ein Verfahren, bei dem man das Antiserum mit NEA versetzt, den NEA-NEA-Antikörperkomplex isoliert nnd den NEA-Antikörper aus dem Komplex abtrennt.

Im Verfahren der Erfindung erfolgt die Neoplasmadiagnose gewöhnlich mit einem NEA-Antikörper unter Anwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Diagnostizierung beruht somit auf einer Reaktion zwischen dem NEA-Antikörper und dem NEA in den Proben. Die Neoplasmadiagnose kann aber auch mit NEA selbst durchgeführt werden, wobei eine Inhibierungsreaktion mit dem NEA-Antikörper angewandt wird.

Die Neoplasmadiagnose (Nachweis von NEA) unter Verwendung des IiSA-Antikörpers kann z.B. nach folgenden Methoden durchgeführt werden:

1) Ouchterlony-Methode und die entsprechend modifizierte Cohn-Methode;

2) Einfach radiale Immunodiffusionsmethode (S.R.I.D.);

3) Elektrophorese (Gegen-Elektrophorese, Immunoelektroosmophorese, Immunoelektrodiffusion).

Bei dieser Methode-neigen sowohl der NEA-Antikörper als auch

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das Subjekt dazu, zur y-Globulinfraktion zu wandern, so daß sie carbamyliert werden müssen, um sie auf die Albuminseite zu bewegen. Trotz dieser Carbamylierung werden weder der NEA-Antikörper noch das Subjekt in ihrer Immunoaktivität als Antikörper bzw. Antigen desaktiviert;

4) Radioimmunotest (RIA);

5) Enzymatischer Immunotest (ELISA);

6) Bakteriophagenmethode;

7) Komplementäre Fixationsmethode (CF);

8) Hämagglutinationsmethode (PHA, RPHA);

9) Immunohaftungs-Hämagglutination (IA).

Im folgenden wird die Herstellung eines Neoplasma-Diagnosemittels näher erläutert, das bei der Immunoelektrophorese eingesetzt werden kann. Die Immunoelektroosmophorese beruht auf dem Prinzip, daß man eine Agarplatte mit einem Paar von Vertiefungen versieht, das Antiserum in die Vertiefung auf die Anodenseite und das Antigen in die Vertiefung auf die Kathodenseite spritzt, eine bestimmte Zeit einen elektrischen Strom fließen läßt, das Antigen einer Phorese zur Anode unterwirft und den Antikörper durch elektrische Osmose zur Kathode bewegt, so daß es auf der Berührungslinie zwischen dem Antigen und dem Antikörper zu einer Ausfällungsreaktion kommt; vgl. Biochim. Biophys. Acta, Bd. 34, S. 258 (1959)· Diese Methode hat den Vorteil, daß sie relativ empfindlich ist und das Resultat in relativ kurzer Zeit liefert. Um das Antigen bzw. den Antikörper nachzuweisen, ist es jedoch erforderlich, daß beide umgekehrte Wanderungsrichtungen aufweisen. Da jedoch sowohl NEA als auch der NEA-Antikörper zur Kathode wandern, kann NEA nicht durch herkömmliche Verfahren nachgewiesen werden. Um das NEA-Antigen im Verfahren der Erfindung nachzuweisen, müssen daher entweder das NEA oder der ΝΕΑ-Antikörper so verändert werden, daß sie bei der Elektrophorese zur Anodenseite wandern, wobei jedoch die charakteristische Aktivität von NEA bzw. dem NEA-Antikörper beibehalten werden muß.

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Erf ihduhgs gemäß wird der ΝΕΑ-Antikörper carbamyliert, damit er zur Anodenseite wandert. Für den Äntigennachweis in dem zu prüfenden Serum ist es vorteilhafter, den carbamyiierten Antikörper einzusetzen als das Antigen in den jeweiligen Seren zu carbamylieren. Die Carbamylierung des ΝΕΑ-Antikörpers erfolgt z.B. dadurch, daß man den I¹IEA-Antikörper mit einer wäßrigen Kaliumcyanatlösung mischt, das Gemisch eine bestimmte Zeit inkubiert und dann abkühlt.

Der auf diese Weise carbamylierte NEA-Antikörper besitzt dieselbe Antikörperaktivität wie vor der Behandlung. Die Aktivität des carbamyiierten NEA-Antikörpers bleibt selbst nach 4 Monaten bei 4⁰C konstant.

Der NEA-Nachweis im Serum von Patienten (d.g. die Neoplasmadiagnose) kann z.B. durch Immunoelektroosmophorese erfolgen, wobei der erfindungsgemäß carbamylierte NEA-Antikörper eingesettt wird. γ

Im folgenden wird die Herstellung eines Neoplasma-Diagnosemittels näher erläutert, das sich für die Hämagglutinationsmethode (PHA- bzw. RPHA-Methode) eignet.

Nach dieser Methode werden NEA bzw. der NEA-Antikörper mit Feinteilchen kombiniert. Als Teilchen eignen sich z.B. die bei der PHA- bzw. RPHA-Methode üblicherweise eingesetzten Teilchen. Besonders bevorzugt sind Blutzellen von Säugetieren und Vögeln. Ferner können Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 1 bis 10 u eingesetzt werden, z.B. Polystyrollatex, Polyesterlatex, Vinylchlorid, Bentonit, Glasperlen und dergl.

Das NEA kann dadurch hergestellt werden, daß man das vorstehend genannte NEA-haltige Gemisch in einem üblichen Verfahren zur fraktionierten Reinigung von Proteinen reinigt. Der NEA-Antikörper laßt sich dadurch herstellen, daß man NEA bzw. den NEA-NEA-Antikörperkomplex bei Tieren immunisiert.

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Zum Kombinieren von NEA bzw. dem HEA-Antikörper mit Feinteilchen können übliche Reagentien verwendet werden. Hierzu eignen sich z.B. Glutaraldehyd, Formaldehyd, Tanninsäure, bis-diazotiertes Benzidin, Chromchlorid und Carbodiimid.

Im folgenden wird ein allgemeines Verfahren zur Herstellung des Reagens angegeben, wobei Erythrocyten von Schafen verwendet werden.

Erythrocyten von Schafen werden in einer Konzentration von etwa 5 % in einer phosphat-gepufferten physiologischen Kochsalzlösung suspendiert. Die Suspension wird dann mit 1/5 des Volumens Glutaraldehydlösung versetzt, die vorher unter Verwendung von phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von 1 bis 5 % hergestellt worden ist. Das Ganze wird dann 3 bis 7 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Waschen des erhaltenen Produkts mit physiologischer Kochsalzlösung wird eine frische phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung zugesetzt, um eine Konzentration von Glutaraldehyd/ Schaf erythrocyten von 5 % einzustellen. Hierauf werden die Erythrocyten mit der äquivalenten Menge einer 0,001 bis 0,02prozentigen Tanninsäurelösung versetzt. Das Gemisch wird 5 bis 20 Minuten gerührt und dann mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Das erhaltene Produkt wird mil:· einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung versetzt, um ein 5prozentiges Präparat aus Glutaraldehyd-und Tanninsäure-behandelten Schaferythrocyten herzustellen. Um die Erythrocyten mit dem NEA-Antikörper zu kombinieren, versetzt man die Erythrocyten mit 5 Jig bis1mg/ml des gereinigten NEA-Antikörpers (d.h. mit der den Erythrocyten äquivalenten Menge) und rührt das Ganze 10 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur.

Um die Erythrocyten mit NEA zu kombinieren, versetzt man die Erythrocyten mit 1 jig bis 1 mg/ml des gereinigten NEA (d.h. mit der den Erythrocyten äquivalenten Menge) und rührt das Ganze 10 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur.

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Im folgenden wird ein Verfahren zum Nachweis von NEA im Serum .näher erläutert, bei dem mit NEA bzw. NEA-Antikörpern kombinierte Feinteilchen eingesetzt werden. Vermischt man die NEA-Antikörper-Feinteilchen und das zu prüfende Serum in einem Teströhrchen, so reagiert der NEA-Antikörper mit dem NEA unter Glutination, falls NEA im Serum vorhanden ist. Am Boden des Röhrchens ist dabei der Niederschlag makroskopisch sichtbar, der aufgrund der unterschiedlichen Glutination durch gewöhnliche oder spontane Sedimentation entsteht. Falls das Serum kein NEA enthält, oder falls die ΝΕΑ-Konzentration geringer ist als die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Reagens, fallen die NEA-Antikörper-Feinteilchen spontan aus und es bildet sich ein ringähnlicher Niederschlag am Boden des Röhrchens. Im Falle von NEA-Feinteilchen kommt es aufgrund der Anwesenheit des NEA-Antikörpers ebenfalls zu einer Glutination. Dagegen wird im letzteren Pail die Glutination verhindert, wenn gleichzeitig freies NEA vorhanden ist. Freies NEA im Serum wird deshalb dadurch nachgewiesen, daß man das zu prüfende Serum vorher mit einer geeigneten Menge des NEA-Antikörpers versetzt, die NEA-Feinteilchen zugibt und beobachtet, ob eine Glutination auftritt.

Die Diagnostizierüng von Neoplasmapatienten nach der Ouchterlony-Methode unter Verwendung des NEA-Antikörpers zeigte, daß unter 84 Fällen 27 Fälle positiv sind, wobei Serum von Patienten verwendet wurde, die an Krebs des Magens, des Enddarms, des Rectums, des Pancreas, primärem Leberkrebs, des Uterus, der Ovarien, Brustkrebs, Leukämie bzw. Lymphosarcoma litten. Dagegen verliefen 111 Fälle, die das Serum von normalen Patienten und Nicht-Neoplasmapatienten betrafen, sämtlich negativ. Bei der Diagnose nach der einfach radialen Imminodiffussionsmethode (S.R.I.D.) waren unter 98 Fällen 38 Fälle positiv, die das Serum von Neoplasmapatienten betrafen, während von 141 Fällen, die das Serum von normalen Patienten und Nicht-Neoplasmapatenten betrafen, mit Ausnahme von einem Fall alle negativ waren. Der erfihdüngsgemäße NEA-Antikörper eignet sich

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daher zur monospezifischen Diagnose von Neoplasmen im allgemeinen, insbesondere von malignen Neoplasmen.

Da die Ouchterlony-Methode und die einfach radiale Immunodiffusionsmethode (S.R.I.D.) durch eine relativ geringe Empfindlichkeit gekennzeichnet sind, kann für eine zuverlässigere Diagnose eine empfindlichere Methode in Betracht gezogen werden.

Im Hinblick auf die einfach radiale Immunodiffusionsmethode (S.R.I.D.) (Ziffer 2) und die Elektrophorese (Ziffer 3) wird im folgenden ein Neoplasma-Diagnosemittel näher erläutert, das zum Nachweis von NEA nach der Elektroimminodiffusionsmethode (Rauler-Methode) eingesetzt wird.

Nach dieser Methode wird der NEA-Antikörper zusammen mit einem Trägermedium gelöst, worauf man die Lösung zu einem plattenähnlichen Material verfestigt. Als Trägermedium können die bei der einfach radialen Imminodiffusionsmethode üblichen Trägermedien eingesetzt werden, z.B. Agar-Agar, Agarose, Stärke und Polyacrylamidgel. Die Herstellung einer Gelplatte aus dem Trägermedium und dem NEA-Antikörper kann auf herkömmliche Weise erfolgen. Beispielsweise löst man das Trägermedium unter Erwärmen in einer Pufferlösung, setzt den NEA-Antikörper zu und mischt das Ganze. Die erhaltene Lösung wird auf eine Glasplatte oder in ein Kunststoffgefaß oder eine Pfanne gegossen, abgekühlt und zu der gewünschten Platte verfestigt.

Die Diagnose mit der so erhaltenen Gelplatte erfolgt derart, daß man die Gelplatte mit einer Vertiefung versieht und das Serum des Patienten in die Vertiefung spritzt. Nach der einfach radialen Immunodiffusionsmethode läßt man die Platte eine bestimmte Zeit stehen und untersucht dann, ob sich ein Sedimentationsring gebildet hat. Bei der Immunoelektrodiffusionsmethode wird ein elektrischer Strom durch die Gelplatte geleitet, in die vorher das Serum gespritzt worden ist, und es

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wird geprüft, ob sich ein Präzipitatband bildet. Falls ein Sedimentationsring bzw. ein Präzipitatband entsteht, ist dies ein Beweis dafür, daß im Serum des untersuchten Patienten NEA vorhanden ist.

Im folgenden wird ein Neoplasma-Diagnosemittel näher erläutert, bei dem der ΝΕΑ-Nachweis nach dem Radioimmunotest (RIA) erfolgt.

Das Reagens wird durch Markieren von NEA oder dem NEA-Antikörper mit einem radioaktiven Isotop hergestellt. Die Markierung erfolgt auf übliche Weise, z.B. nach der Chloramin-T-Methode oder der Peroxidase-Methode unter Verwendung von 125 τ oder

Die Bestimmung von NEA unter Verwendung dieses Diagnosemittels nach der RIA-Methode erfolgt ebenfalls auf übliche Weise, z.B. nach der Doppelantikörpermethode oder der Festphasenmethode.

Nach der Ouchterlony-Methode kann NEA in normalem menschlichem Serum und in Serum von Kicht-Neoplasmapatienten nicht nachgewiesen werden, während es nach der RIA-Methode auch in diesen Seren bestimmt werden kann. Die Konzentration ist relativ niedriger als die im Serum von Neoplasmapatienten. Die Neoplasmadiagnose kann daher unter Anwendung eines NEA-Konzentrationswerts im Serum als Standard-Bezugswert durchgeführt werden.

Die erfindungsgemäße Neoplasmadiagnose hat folgende Vorteile:

A. Das NEA bzw. NEA-Antikörper enthaltende Diagnosemittel kann zur Diagnostizierung zahlreicher verschiedener Neoplasmen angewandt werden.

B. Die Diagnose erfolgt mit einer geringen Serummenge.

C. Es ist möglich, einen Screeningtest für Neoplasmen durchzuführen und das Neoplasmawachstum zu beobachten.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1

Teilweise Reinigung von NEA aus Krebsgewebe

10Og eines gefrorenen Brustkrebsgewebes werden in kleine Würfel geschnitten. In einem Homogenisator wird das Gewebe dann mit der 10-fachen Volumenmenge physiologischer Kochsalzlösung versetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 4⁰C homogenisiert, dann mit einer äquivalenten Menge physiologischer Kochsalzlösung versetzt, die 0,05 % Natriumnitrit enthält, und hierauf 48 Stunden bei 4°C gerührt. Das enthaltene Protein wird extrahiert und durch 30minütiges Zentrifugieren mit 5000 G abgetrennt. Nach Entfernen der obersten Fettschicht wird die überstehende Flüssigkeit gesammelt. Der Überstand wird nochmals 30 Minuten bei 2000 G zentrifugiert. Die geringe Menge der obersten Fettschicht wird entfernt und der Überstand gesammelt. Man füllt den Überstand in ein Celluloserohr für die Dialyse und konzentriert auf etwa 1/20 des Volumens in einer Lösung von Polyäthylenglykol (mittleres Molekulargewicht: etwa 15 000). Der konzentrierte Überstand weist eine Proteinkonzentration von 73 mg/ml nach der Lowry Folim-Methode auf. 3 ml dieses Konzentrats werden der Gelfiltration in einer gepufferten Barbitallösung mit einem pH von 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 unterworfen, wobei eine Säule von 2,6 cm Durchmesser und 70 cm Länge (Bettkapazität: 460 ml) angewandt wird, die vorher mit Sephadex G-200 gefüllt worden ist. Das Eluat wird fraktioniert.

Bei der Eluierung zeigt ein Spektrophotometer 4 Peaks bei einer Wellenlänge von 280 mu. Der erste Peak entspricht einer Fraktion, die Proteine mit mehr als 19 S enthält, z.B. c^-Makroglobulin, Immunoglobulin M und ß-Lipoprotein. Der zweite Peak entspricht einer Fraktion von 7S-Globulin einschließlich Immunoglobulin. Der dritte Peak entspricht einer Fraktion von 4,5 S einschließlich Albumin, während der vierte Peak einer Fraktion entspricht, die Materialien mit geringerem Molekulargewicht enthält.

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Das NEA wird zwischen der zweiten und der dritten Fraktion eluiert. Hierbei werden etwa 90 % des NEA als Fraktion mit einem Molekulargewicht von 120 000 bis 80 000 eluiert. Das Eluat zwischen dem zweiten und dem dritten Peak wird unter Ausschluß des 2. und 3· Peaks gesammelt und ergibt eine rohe NEA-Fraktion. Das Verfahren wird mehrmals wiederholt, wobei eine rohe NEA-Fraktion erhalten wird, die man unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran (filterbares Molekulargewicht: weniger als 10 000) auf etwa 1/10 des Volumens, bezogen auf die ursprüngliche Gewebemenge, konzentriert. Ein Elektrophoresetank von 33 cm Länge, 8 cm Breite und 2 cm Dicke wird mit Pebicon C-870 als Trägermedium gefüllt. Unter Verwendung einer gepufferten Barbitallösung mit einem pH von 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 werden 5 ml der konzentrierten Lösung der rohen NEA-Fraktion in eine Probenmulde gespritzt, die 10 cm von der Kathodenseite des Elektrophoresetanks angeordnet ist, und 16 Stunden der Elektrophorese mit einer konstanten Stromstärke von 80 mA unterworfen. Da sich das NEA 3 bis 7 cm von der Probenmulde entfernt in Richtung auf die Kathodenseite befindet, schneidet man die Unterlage in diesem Bereich ab, versetzt mit 100 ml einer Pufferlösung, die 0,05 m Phosphat in physiologischer Kochsalzlösung bei einem pH von 7>5 enthält, und rührt das Ganze. Der Überstand wird dann durch 15minütiges Zentrifugieren mit 3000 U/min gesammelt. Nach Zugabe weiterer 100 ml der Pufferlösung unter Rühren zu dem Überstand wird dieser auf ähnliche Weise durch Zentrifugieren gesammelt. Um das als geringe Verunreinigung in der gesammelten Lösung enthaltene Pebicon C-870 abzutrennen, filtriert man durch ein Glasfilter. Etwa 200 ml des Filtrats werden mit Hilfe eines Proteinbeutels (Carl Schleicher GmbH; Ultrahülse Nr. 100; filtrierbares Molekulargewicht: 25 000) auf 5 ml eingeengt. Das Verfahren wird noch fünfmal wiederholt und die erhaltene konzentrierte Lösung wird bei 4°C gehalten. Die Elektromobilität des erhaltenen NEA entspricht praktisch der von Immunoglobulin G. Nach der Ouchterlony-Methode und durch Immunoelektrophorese werden in der Probe die Immunoglobuline G und A als Proteinverunreinigungen nachgewiesen.

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Nach dem "beschriebenen Verfahren werden etwa 50 % NEA gewonnen, bezogen auf die ΝΕΑ-Menge im ersten Extrakt der physiologischen Kochsalzlösung, und der Reinigungsgrad beträgt etwa das 100-fache.

Beispiel 2

Teilweise Reinigung von NEA aus der Ascitesflüssigkeit von krebskranken Patienten

Unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran (filtrierbares Molekulargewicht: 15 000) werden 2 Liter der Ascites von Magenkrebspatienten auf 500 ml eingeengt. Hierauf zentrifugiert man das Konzentrat 30 Minuten mit 20 000 G und sammelt den Überstand. Der Überstand wird mit einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung versetzt, die 0,05 m Phosphat enthält und einen pH von 7,5 aufweist, bis das Gesamtvolumen 1 Liter beträgt (Proteinmenge: etwa 3 %). Hierauf versetzt man das Gemisch mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 1,5 m. Die Lösung wird dann durch Zusatz von Natriumhydroxid auf einen pH von 7,0 eingestellt, hierauf 60 Minuten stehengelassen und schließlich 30 Minuten mit 10 000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird gesammelt und mit weiterem Ammoniumsulfat versetzt, so daß eine 2,6 m Ammoniumsulfatlösung erhalten wird. Nach 60 Minuten wird die Lösung 30 Minuten mit 10 000 U/min zentrifugiert. Im erhaltenen Niederschlag finden sich mehr als 60 % des NEA. Der Niederschlag wird in einer gepufferten Barbitallösung mit einem pH von 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 gelöst, so daß das Gesamtvolumen 200 ml beträgt. Die Lösung wird der Gelfiltration mit Sephadex G-50 unterworfen, wobei die vorstehende Pufferlösung verwendet wird. Die als erste eluierte Proteinfraktion wird aufgefangen, das Ammoniumsulfat entfernt und das Barbital gepuffert. Die fraktionierte Ammoniumsulfatlösung wird auf eine Proteinkonzentration von etwa 70 mg/ml eingestellt, worauf man 5 ml der Lösung der Elektrophorese unterwirft. Die Elektrophorese wird hierbei folgendermaßen durchgeführt:

?Ö981O/Q§11 . 17 _

In einen Elektrophoresetank von 33 cm Länge, 8 cm Breite und 2 cm Dicke wird Pepicon C-870 (TM) als Trägermedium einge^ füllt. Unter Verwendung einer gepufferten Barbitallösung mit einem pH von 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 spritzt man 5 ml der fraktionierten Ammoniumsulfatlösung in eine Probenmulde, die 10 cm von der Kathodenseite des Tanks entfernt angeordnet ist, und führt die Elektrophorese 16 Stunden mit einer konstanten Stromstärke von 80 mA durch. Hierauf schneidet man das Trägermedium in einem Bereich ab, der 3 bis 7 cm von der Mulde in Richtung auf die Kathodenseite entfernt ist. 100 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, die 0,05 m Phosphat enthält und einen pH von 7,5 aufweist, werden unter Rühren zugegeben und das Gemisch wird 15 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird mit 100 ml der genannten Pufferlösung versetzt, worauf man das Gemisch rührt und unter denselben Bedingungen zentrifugiert und den erhaltenen Überstand durch ein Glasfilter filtriert. Das Filtrat wird mit Hilfe eines Proteinbeutels auf 2,5 ml eingeöngt. 2,5 ml des Konzentrats werden der Gelfiltration an einer Säule von 2,6 cm Durchmesser und 90 cm Länge (Bettkapazität: 460 ml) unterworfen, die vorher mit Sephadex G-200 gefüllt worden ist. Unter Verwendung einer 0,05 m Phosphatpufferlösung mit einem pH von 7,5 wird das Eluat in Teströhrchen fraktioniert. Beim Eluieren werden mit Hilfe eines Spektrophotometers zwei Absorptionspeaks bei einer Wellenlänge von 280 mu beobachtet. Der erste Peak entspricht einer 19S-Fraktion, die Immunoglobulin M enthält, während der zweite Peak einer 7S-Fraktion entspricht, die Immunoglobulin G enthält. Das NEA wird kurz nach dem zweiten Peak eluiert. Etwa 90 % oder mehr NEA sind in der Fraktion enthalten, die einem Molekulargewicht von 120 000 bis 80 000 entspricht. Diese Fraktion wird gesammelt, mit einem Proteinbeutel konzentriert und bei 4°C aufbewahrt. Nach der Ouchterlony-Methode und durch Immunoelektrophorese werden in der erhaltenen ΝΕΑ-Probe die Immunoglobuline G und A als Verunreinigungen nachgewiesen. Der Reinigungsgrad des NEA beträgt das etwa 50-fache.

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Beispiel 5 Herstellung des NEA-Antikörpers

Teilweise gereinigtes NEA gemäß Beispiel 1 wird mit physiologischer Kochsalzlösung Ms zu einem Proteingehalt von 1 mg/ml behandelt. 0,5 ml dieser Lösung werden mit der äquivalenten Menge Freund-Adjuvans vermischt und emulgiert. Die Emulsion wird in Teildosen intracutan, subcutan und intramuskulär in den Hinterlauf bzw. die Bauchhöhle eines Kaninchens mit einem Körpergewicht von etwa 2 kg injiziert. Nach 2 Wochen wird eine weitere Immunisierung mit 1 ml der ΝΕΑ-Emulsion durchgeführt. Nach weiteren 2 Wochen erfolgt nochmals eine Immunisierung mit 1 ml der NEA-Emulsion. 10 Tage nach der letzten Immunisierung wird das Blut aufgefangen. Das vom Blut abgetrennte Serum wird 30 Minuten bei 56⁰C inkubiert und dadurch stabilisiert. Um das Serum antiseptisch zu machen, werden 0,05 % Natriumnitrit zugesetzt. Das erhaltene Antiserum wird mit 1/3 des Volumens normalem menschlichem Serum und 5 mg gereinigtem Kolostrum-y-Globulin pro ml Antiserum versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert und dann 48 Stunden bei 4°C gehalten. Anschließend zentrifugiert man 30 Minuten bei 4⁰C mit 3000 U/min und sammelt den Überstand. Bei der Identifizierung nach der Ouchterlony-Methode und durch Immunoelektrophorese unter Verwendung eines Gewebeextrakte des ursprünglichen Brustkrebses als Antigen zeigt sich, daß das erhaltene Antiserum aufgrund der monospezifischen Eigenschaften des NEA-Antikörpers keine Antikörper außer dem NEA-Antikörper enthält. Das gereinigte Kolostrum-y-Globulin wird zur Neutralisation des Antiserums verwendet, da zur Antigenextraktion Brustkrebsgewebe eingesetzt wird und die Möglichkeit besteht, daß das sekretionsartige Antigen von Immunoglobulin A in der Probe des teilweise gereinigten NEA enthalten ist. Da vermutlich der Antikörper für das Antigen in dem so hergestellten Antiserum gebildet wird, verwendet man das gereinigte Kolostrum-y-Globulin, das das Immunoglobulin A des Sekretionsantigens enthält, zum Absorbieren und Entfernen des Antikörpers.

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Beispiel 4
'Herstellung des NEA-Antikörpers

Das gemäß Beispiel 2 teilweise gereinigte NEA wird mit physiologischer Kochsalzlösung auf einen Proteingehalt von 1 mg/ml eingestellt, 0,5 ml dieser Lösung werden mit der äquivalenten Menge Freund-Adjuvans vermischt und emulgiert. Die erhaltene Emulsion wird in Teildosen intracutan, subcutan und intramuskulär in den Hinterlauf bzw. die Bauchhöhle eines Kaninchens mit einem Körpergewicht von 2 kg injiziert. Nach 2 Wochen wird eine weitere Immunisierung mit 1 ml einer genau^so hergestellten NEA-Emulsion durchgeführt. Nach weiteren 2 Wochen erfolgt nochmals eine Immunisierung mit 1 ml der NEA-Emulsion. 10 Tage nach der letzten Immunisierung wird das Blut aufgefangen. Das vom Blut abgetrennte Serum wird 30 Minuten bei 56°C inkubiert und dadurch stabilisiert. Um das Serum antiseptisch zu machen, wird es mit 0,05 % Natriumnitrit versetzt. Hierauf versetzt man das Antiserum mit 1/3 des Volumens normalem menschlichem Serum und 1/3 des Volumens konzentrierter Ascitesflüssigkeit eines Patienten, der an Leberzirrhose leidet (Proteinmenge: 80 mg/ml) pro 1 ml Antiserum, inkubiert das Gemisch 1 Stunde bei 37⁰C und hält es schließlich 48 Stunden bei 4⁰O* Hierauf zentrifugiert man 30 Minuten mit 3000 U/min und fängt den Überstand auf. Bei der Identifizierung nach der Ouchterlony-Methode unter Verwendung des konzentrierten ursprünglichen Ascites als Antigen und bei der Immunoelektrophorese zeigt sich, daß das vorstehend erhaltene Antiserum keine Antikörper außer dem NEA-Antikörper enthält.

Beispiel 5

Isolierung und Reinigung von MEA durch AffinitätsChromatographie NEA wird durch AffinitätsChromatographie aus dem monospezifischen ΝΕΑ-Antikörper isoliert und gereinigt. 50 ml eines gemäß Beispiel 3 hergestellten monospezifischen Kaninchen-NEA-Antiserums werden mit einer äquivalenten Menge einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung,.die 0,05 - m Phosphat enthält und einen

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pH von 7,5 aufweist, versetzt. Hierauf gibt man zu dem Gemisch eine äquivalente Menge einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung mit einem pH von 7,8. Nach 60 Minuten wird die Lösung mit 5000 U/min zentrifugiert und der entstandene Niederschlag in der vorstehenden Pufferlösung gelöst, so daß etwa dieselbe Lösungsmenge wie das ursprüngliche Antiserum entsteht. Die Lösung wird dann mit 1/4 des Volumens gesättigter Ammoniumsulfatlösung mit einem pH von 7,8 versetzt. Nach weiteren 60 Minuten zentrifugiert man die Lösung mit 5000 U/min und versetzt den erhaltenen Überstand nochmals mit 1/4 des Volumens gesättigter Ammoniumsulfatlösung, so daß eine 33prozentige Ammoniumsulfatlösung erhalten wird. Nach 60 Minuten wird die Lösung mit 5000 U/min zentrifugiert, wobei die y-Globulinfraktion als Niederschlag erhalten wird. Der Niederschlag \tfird in etwa 15 ml einer 0,01 m Phosphatpufferlösung mit einem pH von 8,0 gelöst. Das Entsalzen und Puffern der Lösung wird so durchgeführt, daß man 15 ml der Lösung durch Gelfiltration fraktioniert, wobei eine Säule von 2,6 cm Durchmesser und 40 cm Länge, die mit Sephadex G-50 gefüllt ist, und dieselbe Phosphatpufferlösung verwendet wird. Die zuerst eluierte Proteinfraktion wird aufgefangen und unter Verwendung eines Proteinbeutels auf eine Proteinkonzentration von 70 mg/ml eingeengt. Unter Verwendung der genannten Phosphatpufferlösung wird aktivierte DEAE-Cellulose in eine Säule von 2,6 cm Durchmesser und 40 cm Länge eingefüllt. Die vorstehend erhaltene konzentrierte Lösung wird auf die Säule aufgegeben, so daß sie durch die Säulenfüllung absorbiert wird. Hierauf läßt man die Phosphatpufferlösung kontinuierlich durch die Füllung strömen. Der größte Teil des Immunoglobulins G wird durch die DEAE-Cellulose nicht absorbiert, während alle anderen Proteine absorbiert werden. Das Eluat wird fraktioniert aufgefangen, wobei die optische Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm bestimmt wird. Durch Anffangen der Proteinfraktion wird das Immunoglobulin G isoliert. Hierauf konzentriert man die fraktionierte Lösung mit Hilfe eines Proteinbeutels auf eine Proteinkonzentration von 10 mg/ml. 50 ml bromcyan-aktiviertes Cephalose 4B-GeI wird

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dann mit dem die NEA-Antikörperaktivität aufweisenden Immunoglobulin G in einer Menge von 5 mg/1 ml Gel versetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden "bei Raumtemperatur (20 Ms 25⁰C) umgesetzt, um das Immunoglobulin zu fixieren. Nicht umgesetztes Immunoglobulin wird durch Auswaschen mit der phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung entfernt.

Das genannte Cephalose 4B-GeI wird unter Verwendung der phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung in eine Säule von 2,6 cm Durchmesser und 20 cm Länge eingefüllt. In 10 ml physiologischer Kochsalzlösung werden 20 mg (Proteinmenge) des gemäß Beispiel 1 teilweise gereinigten NEA aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird auf die Säule aufgegeben, um mit dem an dem Cephalose 4B-GeI fixierten NEA-Antikörper zu reagieren. Hierbei entsteht in dem Gel der NEA-Antigen-Antikörperkomplex.

Nach dem Auswaschen von nicht umgesetztem Protein mit der phosphat-gepufferten physiologischen Kochsalzlösung wird auf die Säule eine 0,2 m Natriumcarbonatlösung (pH 11,5) aufgegeben, um das NEA zu dissoziieren und auszulösen. Die aufgefangene ΝΕΑ-Lösung wird dialysiert, eingeengt und dann bei 4⁰C gehalten. Das erhaltene NEA zeigt nach der Ouchterlony-Methode und bei der Immunoelektrophorese unter Verwendung von normalem menschlichem Serum und dem Anti-NEA-Serum (Serum vor der Neutralisation mit dem gereinigten Kolostrum-y-Globulin) eine einzige Sedimentationslinie. Außerdem zeigt das isolierte NEA bei der Elektrophorese unter Verwendung von 10 % Natrium-dodecylsulfit und einer Polyacrylamid-Gelscheibe (gereinigte Proben mit hoher Reinheit) ein einziges Band.

Beispiel 6

Reinigung von NEA mit Hilfe eines basischen Anionenaustauseherharz es

500 ml Ascites von einem Patienten, der an primärem Leberkrebs leidet, werden auf etwa 150 ml (Proteinkonzentration: etwa 7 %)

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einer 30prozentigen Lösung, gelöst in einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0; Ionenstärke 0,05) von Polyäthylenglykol (Molekulargewicht: etwa 15 000) eingeengt. Das Konzentrat wird dann 30 Minuten mit 5000 G zentrifugiert. Der Überstand wird unter Verwendung eines Celluloserohrs für die Dialyse 3 Tage "bei 4⁰C in einer Phosphatpuff erlö sung mit einer Ionenstärke von 0,05 und einem pH von 7,0 dialysiert. Getrennt davon wird QAE-Sephadex A-50 befeuchtet und unter Verwendung einer Phosphatpufferlösung mit einer Ionenstärke von 0,05 und einem pH von 7,0 eingestellt. Das erhaltene QAE-Sephadex A-50 wird dann in eine Säule von 5 cm Durchmesser und 40 cm Länge gefüllt. Hierauf gibt man 500 ml der Dialyseprobe auf die Säule. Nachjiem die Probe durch die Säulenfüllung absorbiert ist, füllt man den oberen Teil des Betts mit der Phosphatpufferlösung und läßt diese kontinuierlich strömen. Der Ionenaustauscher absorbiert praktisch kein NEA und kein Immuno globulin G, so daß diese ausfließen, während die anderen Proteinbestandteile absorbiert werden. Die abfließende Lösung wird unter Messung der Absorption bei 280 mu fraktioniert, wobei eine fraktionierte Proteinlösung aufgefangen wird, die nach der Ouchterlony-Methode unter Verwendung von Antikörperserum/Kaninchenprotein-Antiserum eine einzige Sedimentationslinie ergibt. Auf dieselbe Weise wird nachgewiesen, daß es sich um Humanimmunoglobulin G handelt, wobei Antihuman-Immunoglobulin G-Antikörper verwendet werden. Ferner wird nach der Ouchterlony-Methode unter Verwendung von Kaninchen-Anti-NEA-Antiserum nachgewiesen, daß die erhaltene fraktionierte Proteinlösung NEA enthält.

Daneben wird die konzentrierte fraktionierte Proteinlösung durch Elektrophorese unter Verwendung einer Celluloseacetatmembran identifiziert. Hierbei zeigt sich, daß das Proteinband nur in der y-Globulinfraktion auftritt und nicht in den anderen Globulin- und Albuminbereichen. Nach dem beschriebenen Verfahren werden etwa 5 % NEA gewonnen, wobei der Reinigungsgrad das etwa 6-fache (Proteinverhältnis) beträgt.

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Beispiel 7

.Reinigung des monospezifischen NEA-Antikörpers Gemäß Beispiel 2 teilweise gereinigtes NEA wird in einer 0,05 m phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung gelöst, so daß die Proteinkonzentration 10 mg/ml beträgt. Diese Lösung wird zum doppelten Volumen eines Sephalose 4B-GeIs gegeben, das mit Bromcyan aktiviert worden ist. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 4⁰C umgesetzt, um das Protein des teilweise gereinigten NEA am Gel zu fixieren. Nicht umgesetztes Protein wird durch Auswaschen mit derselben Pufferlösung entfernt. Das Gel wird dann in eine Säule von 1,5 cm Durchmesser und 20 cm Länge eingefüllt. Hierauf gibt man auf die Säule eine Lösung von gereinigtem Kaninchen-Immunoglobulin B (Proteinkonzentration; 10 mg/ml) auf, die den ΝΕΑ-Antikörper enthält, der durch Reinigen durch Ionenaustiauscherchromatographie nach dem Aussalzen mit Ammoniumsulfat gemäß Beispiel 5 erhalten worden ist. Die Lösung wird mit dem an dem Cephalose 4B-GeI fixierten NEA umgesetzt, wobei der IiEA-Anti gen-Antikörperkomplex entsteht. Nach Entfernen von nicht umgesetztem Immunoglobulin G-Protein durch Auswaschen mit genügend phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung wird auf die Säule 0,2 m Natriumcarbonatlösung (pH 11,5) aufgegeben, um den NEA-Antikörper zu dissoziieren und zu eluieren. Die NEA-Antikörperfraktion wird aufgefangen und durch Zugabe von 1/5 des Volumens 1 m Glycin-hydrochlorid-Pufferlösung (pH 2,5) neutralisiert. Die erhaltene Lösung wird an Sephadex G-25 chromatographiert und mit einer 0,05 m phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung eluiert, um das Glycin zu entfernen.

Das erhaltene NEA zeigt nach der Ouchterlony-Methode und bei der Immunoelektrophorese unter Verwendung eines Antikaninchenserum-Proteinserums von Schafen eine einzige Präzipitatlinie. Auch mit Antikaninchen-y-Globulinserum von Schafen tritt eine einzige Präzipitatlinie auf, während bei der Ouchterlony-Methode und der Immunoelektrophorese unter Verwendung von Antihumanserumprotein-Antiserum und Antikolostrum-Protein-Antiserum keine Präzipitatlinie zu beobachten ist. Hieraus ergibt

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sich, daß der NEA-Antikörper das Kaninchen-Immunoglobulin G ist, das nur aus dem NEA-Antikörper in hoher Reinheit besteht. Der NEA-Antikörper besitzt gegenüber dem ursprünglichen Antiserum den etwa 100-fachen Antikörperwert (Proteinverhältnis).

Beispiel 8

Verfahren zur Herstellung von NEA aus dem gereinigten HEA 100 ug des gemäß Beispiel 5 gereinigten NEA werden in 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Hierauf vermischt man die Lösung mit einer äquivalenten Menge Freund-Adjuvans und emulgiert das Gemisch. 1 ml der Emulsion wird in Teildosen intracutan, subcutan bzw. intramuskulär in den Hinterlauf und die Bauchhöhle eines Kaninchens mit einem Körpergewicht von 2 kg injiziert. In Abständen von 2 Wochen wird diese Immunisierung noch zweimal auf dieselbe Weise unter Verwendung derselben Menge Antigen-Adjuvansemulsion wiederholt. 10 Tage nach der letzten Injektion wird das Blut aufgefangen und das Serum abgetrennt. Das Serum wird 30 Minuten bei 56⁰C gehalten, um es zu passivieren. Um das Serum antiseptisch zu machen, wird es mit 0,05 % Natriumnitrit versetzt. Bei der Ouchterlony-Methode und der Immunoelektrophorese unter Verwendung eines Brustkrebsgewebeextrakts als Antigen zeigt sich, daß das erhaltene Antiserum nur den NEA-Antikörper enthält.

Zur weiteren Reinigung werden 50 ml des Antiserums mit einer äquivalenten Menge einer physiologischen Kochsalzlösung versetzt, die 0,05 m Phosphat enthält und einen pH von 7,5 aufweist. Die Lösung wird dann mit derselben Menge einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung mit einem pH von 7,3 versetzt. Nach 60 Minuten zentrifugiert man die Lösung mit 5000 U/min und löst den erhaltenen Niederschlag in derselben phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung, so daß die Lösungsmenge dem ursprünglichen Antiserum entspricht. Die Lösung wird

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dann mit 1/4 des Volumens gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt, 60 Minuten stehengelassen und schließlich mit 500 U/min zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird mit 1/4 des Volumens gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt, so daß eine 33prozentige Ammoniumsulfatlösung erhalten wird. Nach öOminütigem Stehen zentrifugiert man die Lösung mit 5000 U/rnin und sammelt die ausgefällte y-Globulinfraktion. Der Niederschlag wird in etwa 15 ml einer 0,01 m Phosphatpufferlösung mit einem pH von 8,0 gelöst. Die Lösung wird dadurch entsalzt und gepuffert, daß man 15 ml der Lösung durch Gelfiltration fraktioniert, wobei eine Säule von 2,6 cm Durchmesser und 40 cm Länge, die mit Sephadex G-50 gefüllt ist, und dieselbe Phosphatpuxferlösung verwendet. Die zuerst eluierte Proteinfraktion wird mit Hilfe eines Proteinbeutels auf eine Proteinkonzentration von 70 mg/ml eingeengt.

Hierauf füllt man mit derselben Phosphatpufferlösung aktivierte DEAE-Cellulose in eine Säule von 2,6 cm Durchmesser und 40 cm Länge. Dann wird die konzentrierte Lösung auf die Säule aufgegeben, die von der Füllung aufgesaugt wird, worauf man die Phosphatpufferlösung aufgibt und kontinuierlich durch das Bett strömt. Der größte Teil des Immunoglobulins G wird von der DEAE-Cellulose nicht absorbiert, während alle anderen Proteine absorbiert werden. Das Eluat wird unter Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm fraktioniert aufgefangen, wobei die Proteinfraktion erhalten wird. Auf diese V/eise läßt sich das den NEA-Antikörper enthaltende Immunoglobulin G isolieren. Die Fraktion wird mit einem Proteinbeutel auf eine Proteinkonzentration von 10 mg/ml eingeengt.

Beispiel -9

Verfahren zur Herstellung des NEA-Antikörpers unter Verwendung: des NEA/NEA-Antikörperkomplexes 1 Liter NEA-enthaltende Ascitesflüssigkeit von einem Patienten, der an primärem Leberkrebs leidet, wird unter Verwendung einer

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Ultrafiltrationsmembran (filtrierbares Molekulargewicht: 10 000) auf etwa 300 ml eingeengt und dann 30 Minuten bei 4° C mit 40 000 G zentrifugiert. Der Überstand wird gesammelt und als NEA-Antigenlösung verwendet.

Daneben werden 50 ml eines gemäß Beispiel 1 hergestellten monospezifischen NEA-Kaninchenantiserums 30 Minuten bei 4°C mit 40 000 G zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird als NEA-Antikörperlösung verwendet. Man mischt die gesamte NEA-Antigenlösung und die NEA-Antikörperlösung zusammen, inkubiert das Gemisch 1 Stunde bei 37⁰C und hält es dann 24 Stunden bei 4°C. Hierauf wird die gemischte Lösung 20 Minuten bei 4°C mit 10 000 G zentrifugiert. Der Überstand wird abgetrennt und der NEA-Anti gen-Antikörp erkomplex als Niederschlag gesammelt. Hierauf suspendiert man den Niederschlag in 50 ml eisgekühlter physiologischer Kochsalzlösung, zentrifugiert die Suspension 20 Minuten bei 4°C mit 10 000 G und trennt den Überstand ab. Der erhaltene Niederschlag wird nochmals mit derselben Menge eisgekühlter physiologischer Kochsalzlösung versetzt, worauf man das Verfahren noch zweimal wiederholt, um schließlich einen Niederschlag zu erhalten. Der NEA-Antigen-Antikörperkomplex wird dann mit 20 ml einer 0,1 m Glycinhydrochlorid-Pufferlösung mit einem pH von 1,8 versetzt, um den Komplex 30 Minuten bei 4°C zu dissoziieren. Hierauf zentrifugiert man die Lösung 20 Minuten bei 4⁰C mit 30 000 G, sammelt den Überstand und versetzt ihn mit einer 0,5 m Dinatriumhydrogenphosphatlösung, um ihn zu neutralisieren und den pH-Wert auf 7,0 einzustellen. Bei dieser Neutralisation entsteht wieder der NEA-Anti gen-Antikörp erkomplex. Die Verfahrens schritte vom Vermischen der NEA-Antigenlösung mit der NEA-Antikörperlösung bis zur Neutralisationsstufe werden noch zweimal wiederholt. Die erhaltene neutralisierte Lösung wird 1 Stunde bei 37°C inkubiert, dann 24 Stunden bei 4°C gehalten und schließlich 20 Minuten bei 4⁰C mit 10 000 G zentrifugiert. Durch Entfernen des Überstands wird der NEA-Antigen-Antikörperkomplex erhalten. Der Komplex wird in physiologischer

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Kochsalzlösung suspendiert, worauf man den Proteingehalt durch Konzentrieren auf 2 mg/ml einstellt. Durch Vermischen von 0,5 ml der Lösung mit 0,5 ml Freund-Adjuvans wird eine Emulsion hergestellt. Die Emulsion wird intracutan, subcutan und intramuskulär in den Hinterlauf bzw. die Bauchhöhle eines Kaninchens mit einem Körpergewicht von 2 kg injiziert. Nach 2 Wochen erfolgt eine weitere Immunisierung mit 1 ml des NEA-Antigen-Antikörperkomplexes, der auf dieselbe Weise hergestellt worden ist. Nach weiteren 2 Wochen wiederholt man die Immunisierung nochmals mit 1 ml derselben Emulsion. 10 Tage nach der letzten Immunisierung wird das Blut aufgefangen und das Serum abgetrennt. Das Serum wird 30 Minuten bei 56⁰C inkubiert, um es zu passivieren, und dann mit Natriumnitrit in einer Konzentration von 0,05 % versetzt, um es antiseptisch zu machen. Die Identifizierung nach der Ouchterlony-Methode und durch Immunoelektrophorese unter Verwendung der konzentrierten Lösung der ursprünglichen Ascitesflüssigkeit, die zur Herstellung des NEA-Antigen-Antikörperkomplexes eingesetst wurde, als Antikörper ergibt, daß das Antiserum keine Antikörper außer dem NEA-Antikörper enthält.

Beispiel 10

Nachweis von NEA im Serum von Patienten nach der Ouchterlony-Methode

Das Serum von Patienten, die an verschiedenen Krankheiten leiden, wird nach der Ouchterlony-Methode auf NEA geprüft. Hierzu wird eine Platte von 1,2 mm Dicke aus 1,2 % Agarose und einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung hergestellt, die 0,05 m Phosphat und 0,05 % Natriumnitrit enthält und · einen pH von 7,5 aufweist. Die Antigenvertiefung und die Antikörpervertiefung haben einen Durchmesser von 4 mm und sind 7 mm voneinander entfernt. Der Nachweis von NEA erfolgt dadurch, daß man 10 ill eines gemäß Beispiel 3 hergestellten Anti-NEA-Kaninchenantiserums in die Antikörpervertiefung spritzt, während in die Antigenvertiefung 40 ul des zu prüfenden Serums gespritzt werden. Die Identifizierung von NEA er-

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folgt unter Verwendung von hochreinem NEA, das gemäß Beispiel 3 erhalten -worden ist, als Kontrollsubstanz. Zur Identifizierung wird untersucht, ob die beiden Präzipitatlinien, die von der Reaktion zwischen dem Kontroll-NEA und dem Anti-NEA-Kaninchen-Antiserum bzw. dem zu prüfenden Serum und dem Anti-NEA-Kaninchenantiserum stammen, vollständig übereinstimmen. Die
Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben.

Tabelle 1

untersuchtes Serum	Magenkrebs Kolon- und Rektumkrebs \| Pankreaskrebs j primärer Leberkrebs Uterus- und Ovarialkrebs i Brustkrebs j Leukämie ! Lymphosarcom	Proben anzahl	positiv	negativ
Serum von Neo- plasma- Patien- ten	gesunder Mensch Gastritis, Magen- und Duodenalgeschwüre Colitis Hepatitis und Leber zirrhose Mastitis chronische Pankreatitis Pankreatitis rheumatisches Fieber chronischer Gelenk rheumatismus andere gutartige Krankheiten	25 12 8 12 10 9 6 2	8 2 2 4 3 5 2 1	17 10 6 8 7 4 4 1
Serum von Nicht- Neo- plasma- Patienten	31 32 β 18 3 3 3 3 5 7	O OOOOO OO OO	31 32 6 18 3 3 3 3 5 7

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Die Ergebnisse zeigen, daß NEA bei insgesamt 84 Beispielen für Seren von Neoplasman-Patienten 27 mal nachgewiesen wird. Der Nachweisprozentsatz beträgt somit 32,1 %. Andererseits konnte bei insgesamt 133 Beispielen für Seren von Nicht-Neoplasma-Patienten (einschließlich gesunden Patienten) kein NEA nachgewiesen werden. Hieraus ergibt sich, daß NEA stark monospezifisch für Neoplasmen ist und der Nachweis von Serum-NEA unter Verwendung des NEA-Antikörpers zur Neoplasmadiagnose eingesetzt werden kann.

Beispiel 11

Nachweis von NEA im Serum von Patienten nach der ainfachradialen Immunodiffusionsmethode

Seren von Patienten, die an verschiedenen Krankheiten leiden, werden nach der einfach radialen Immunodiffusionsmethode auf NEA untersucht. Da die ΝΕΑ-Menge im Serum von Patienten mit malignen Neoplasmen vermutlich innerhalb weiter Grenzen variiert, wurde der ΝΕΑ-Nachweis dadurch verbessert, daß man zwei Platten mit unterschiedlichen Antikörperkonzentrationen verwendet und das eingesetzte Serum gleichzeitig auf-beiden Platten beobachtet. Hierdurch wird vermieden, daß der Nachweis durch Überschuß oder Mangel an Antikörpern fehlschlägt. Im Falle der Platte mit niedriger Antikörperkonzentration ist es schwierig, den durch den Antigen-AntikÖrperkomplex gebildeten Präzipitatring makroskopisch zu beobachten, da die Ausfällung nur sehr schwach ist. Der Nachweis wird daher auf die folgende Weise durchgeführt:

Nachdem das Antigen genügend mit dem Antikörper reagiert hat, taucht man die Platte in die Pufferlösung, um nicht umgesetzten Antikörper aus dem Agar auszulösen.

Daneben wird Antiserum unter Verwendung von Serumimmunoglobulin derselben Tierart hergestellt, die zur Herstellung des Antikörpers eingesetzt worden ist. Die Immunisierung erfolgt

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bei der anderen Tierart mit dem Globulin. Das Antiserum wird in die Antigenvertiefungen gespritzt und bestimmte Zeit inkubiert. Falls ein NEA-Antigen-Antikörper vorhanden ist, läßt sich der Präzipitatring makroskopisch beobachten, der das Reaktionsprodukt zwischen dem NEA-Antigen-Antikörper und dem anschließend zugesetzten Antikörper darstellt. Bei der einfach radialen Immunodiffusionsmethode werden somit zwei Antikörperprozesse angewandt.

1) Herstellung der Platte für die einfach radiale Immunodiffusion

Agarose wird unter Erwärmen in einer Konzentration von 1,2 ^L,a in einer mit 0,1 m tris-salzsäuregepufferten physiologischen Kochsalzlösung mit einem pH von 8,0 gelöst, die zur Desinfizierung 0,1 % Natriumnitrit enthält, wobei es zu einer Gelierung kommt. Die Temperatur des Agarosegels wird dann auf etwa 50⁰C gebracht. ΝΕΑ-Kaninchen-Antiserum, das gemäß Beispiel 3 hergestellt worden ist, wird auf etwa 50°C erwärmt und dann mit dem Gel vermischt, wobei das Gemisch für die hochkonzentrierte Platte 2 % Antiserum und das Gemisch für die niederkonzentrierte Platte 0,4 % Antiserum enthält. Die Gemische werden auf eine Glasplatte, in ein Kunststoffgefaß oder eine Pfanne gegossen, um 1,2 mm dicke, das NEA-Antiserum enthaltende Agarosegel-Platten herzustellen. Antigenvertiefungen von 4 mm Durchmesser werden in gleichmäßigem Abstand in die Platte gebohrt.

2) Nachweis des ΝΕΑ-Antigens im untersuchten Serum nach der einfach radialen Immunodiffusionsmethode

Jeweils 10 ul des zu prüfenden Serums werden gleichzeitig in die Antigenvertiefungen der beiden Platten mit hoher bzw. niedriger Antikörper-Konzentration gespritzt. Nachdem das gesamte Serum durch das Gel absorbiert ist, läßt man die Platten 48 Stunden bei Raumtemperatur in einer Befeuchtungsbox stehen. Hierauf untersucht man, ob sich auf der hochkonzentrierten Platte ein Präzipitatring gebildet hat.

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Die niederkonzentrierte Platte wird 3 Tage in dieselbe Pufferlösung getaucht, die zur Herstellung der Gelplatte verwendet worden ist, um den nicht umgesetzten NEA-Antikörper aus dem Gel zu entfernen. Die Pufferlösungen werden zweimal täglich (am Morgen und am Abend) erneuert. Dann nimmt man die Gelplatte aus den Pufferlösungen und entfernt auch die Pufferlösungen aus den Antigenvertiefungen. Jeweils 10 μΐ von Anti-Kaninchen-Immuno globulin-Zi egenanti serum werden in die Antigenvertiefungen gespritzt. Nachdem alle Antiseren durch das Gel absorbiert sind, läßt man die Platte 24 Stunden bei Raumtemperatur in einer Befeuchtungsbox stehen. Der ΝΕΑ-Nachweis erfolgt dadurch, daß man auf die eventuelle Bildung eines Präzipitatrings prüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle II wiedergegeben.

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Tabelle 2

untersuchtes Serum	Serum von Neo- plasma- Patien- ten	Magenkrebs Kolon- und Rektumkrebs Pankreaskrebs primärer Leberkrebs Uterus- und Ovarialkrebs Brustkrebs Leukämie Lympho sarcom	Proben anzahl	positiv	negativ
Serum von Nicht- Neo- plasma- Patien- ten	gesunder Mensch Gastritus, Magen- und Duodenalgeschwüre Colitis Hepatitis und Leber zirrhose Mastitis chronische Pankreatitis Pankreatitis rheumatisches Fieber chronischer Gelenk rheumatismus andere gutartige Krankheiten	27 14 8 19 10 12 6 2	10 3 2 9 3 8 2 1	17 11 6 \ 10 7 4 4 1
31 32 6 45 3 3 4 5 5 7	OO Ov- OOOOOO	31 32 6 44 3 3 4 5 5 7

Die Ergebnisse zeigen, daß NEA bei insgesamt 98 Beispielen
für Seren von Neoplasma-Patienten 38 mal nachgewiesen wurde,
was einem Nachweisprozentsatz von 38,8 % entspricht. Andererseits wurde bei insgesamt 141 Beispielen für Seren von normalen oder Nicht-Neoplasmapatienten mit einer Ausnahme kein NEA nachgewiesen. In dem Ausnahmefall wurde bei dem Patienten
eine Leberzirrhose diagnostiziert und beim Serum dieses Patienten besteht der Verdacht auf eine primäre Leberkrebskomplikation. Die Ergebnisse machen deutlich, daß der erfindungs-

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geraäße Nachweis von NEA im Serum eine vorteilhafte Diagnose für maligne Neoplasmen darstellt.

3eispiel 12

Neoplasma-Diagnosemittel für den immunologischen Nachweis auf Grund einer Agglutinationsreaktion (PHA-- und RPHA-Methode)

a) NEA-Antikörper-sensibilisierte Erythrocyten von Schafen In einer Alserver-Lösung konserviertes Schafsblut wird 10 Minuten bei 4⁰C mit 2000 U/min zentrifugiert, um das Plasma abzutrennen, dann fünfmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und schließlich nochmals 10 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert. Durch Zusatz einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung werden die Schaferythrocyten zu einer 5prozentigen Lösung verarbeitet. Die Emulsion wird dann langsam über einen Tropftrichter mit 1/5 des Volumens 2,5prozentigem Glutaraldehyd versetzt, der mit einer eisgekühlten, phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung verdünnt ist. Die Emulsion wird 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, fünfmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und schließlich 5 Minuten mit 2000 U/min zentrifugiert. Der Niederschlag wird mit einer eisgekühlten, phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung versetzt, die Thimerosal enthält, wobei eine 5prozentige Lösung von glutaraldehyd-behandelten Schaferythrocyten erhalten wird. Diese Lösung wird mit einer äquivalenten Menge von 0,0025 prozentiger Tanninsäurelösung versetzt, worauf man das Gemisch 15 Minuten zentrifugiert, den Überstand abtrennt, den Niederschlag fünfmal mit physiologischer Kochsalzlösung wäscht und schließlich nochmals zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird mit einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung versetzt, so daß eine 5prozentige Lösung von Glutarsäure-Tanninsäurebehandel ten Schaferythrocyten erhalten wird.

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Zu den Erythrocyten wird dann eine äquivalente Menge(10 ug/inl) des gemäß Beispiel 7 hergestellten NEA-Antikörpers gegeben. Das ganze wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann mit phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Auf diese Weise entsteht eine lOprozentige Lösung von Glutaraldehyd/ Tanninsäure-behandelten, HEA-Antikörper-sensiMlisierten Schaferythrocyten.

Die Nachweisempfindlichkeit für NEA beträgt nach der RPHA-Methode bei Verwendung der NEA-Antikörper-sensibilisierten Schaferythrocyten 150 ng/ml. Es können daher äußerst geringe ΝΕΑ-Mengen im untersuchten Serum nachgewiesen werden.

b) NEA-sensibilisierte Schaferythrocyten Eine 5prozentige Lösung von Glutaraldehyd-Tanninsäure-behandelten Schaferythrocyten gemäß (a) wird mit einer äquivalenten Menge (10 ug/ml) NEA versetzt, das gemäß Beispiel 5 erhalten wurde. Das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann 10 Minuten mit 2000 U/min zentrifugiert. Der Niederschlag wird zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann mit der phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung verdünnt, so daß eine lOprozentige Lösung von Glutaraldehyd-Tanninsäure-behandelten, NEA-sensibilisierten Schaferythrocyten erhalten wird.

Die Nachweisempfindlichkeit für NEA nach der PHA-Methode beträgt bei Verwendung der NEA-sensibilisierten Schaferythrocyten 200 ng/ml.

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Beispiel 13

Nachweis von NEA im Serum von Patienten durch Immunoelektro-

osmophorese unter Verwendung eines carbamylierten NEA-Anti körpers

a) Carbamylierung des NEA-Antikörpers Ein Anti-NEA-Kaninchenimmunoglobulin-Antikörper, der gemäß Beispiel 8 hergestellt worden ist, wird auf eine Proteinkonzentration von 7 mg/ml eingestellt. 10 ml dieser Lösung werden mit 70 ml eines Borsäurepuffers mit einem pH von 8,0 (die Pufferlösung wird vorher dadurch hergestellt, daß man 9»03 g Η,ΒΟ,, 2,13 g NaCl und 5,18 g Na₂B^Oy . 10 H₂O in Wasser löst und bis zu einem Volumen von 1 Liter auffüllt) sowie 20 ml einer 1-,Om Kaliumcyanatlösung versetzt, worauf man 120 Minuten bei 45⁰G inkubiert. Zur Unterbrechung der Reaktion wird die Lösung dann auf 4⁰C abgekühlt. Hierauf konzentriert man die Lösung auf etwa 10 ml, indem man sie in ein Celluloserohr für die Dialyse einfüllt und in ein Gemisch aus 30 % PoIyäthylenglykol (Molekulargewicht: etwa 15 000) und einem 0,05 m Phosphatpuffer mit einem pH von 7,5 einbringt. Etwa 10 ml der konzentrierten Lösung werden durch Säulenchromatographie entsalzt und gepuffert, wobei eine Säule mit 2,6 cm Durchmesser und 40 cm Länge verwendet wird, die mit vorher gequollenem und mit 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7,5) eingestelltem Sephadex G-25 gefüllt ist. Der erhaltene Antikörper wird mit Hilfe eines Proteinbeutels auf eine Proteinkonzentration von etwa 70 mg/ml eingestellt.

Die Lösung des erhaltenen carbamylierten ΝΕΑ-Antikörpers wird der Elektrophorese in Agargel unterworfen und das NEA wird in eine gewöhnliche Antikörpervertiefung gespritzt. Bei der Ot₂ bulinfraktion tritt eine Präzipitatlinie auf. Im Falle einer nicht-carbamylierten NEA-Antikörperlösnng als Kontrolle tritt die Präzipitatlinie bei der y-Globulinfraktion auf. Hieraus ergibt sich, daß der carbamylierte NEA-Antikörper seine

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Elektromobilität verändert hat, so daß die Präzipitatlinie zur Anodenseite verschoben ist, während der Antikörper gleichzeitig seine Aktivität beibehalten hat.

b) Nachweis von NEA im untersuchten Serum Der ΝΕΑ-Nachweis im Serum wird in folgenden Schritten durchgeführt:

Eine 1,2prozentige Agarplatte mit einer Dicke von 1,2 mm wird aus einer Veronal-Pufferlösung mit einem pH von 8,6 und einer Ionenstärke von 0,025 hergestellt- Die Platte wird mit paarweisen Vertiefungen von 4mm Durchmesser in einem Abstand von 7 mm versehen. 10 pl des zu untersuchenden Serums werden in die Vertiefung auf der Anodenseite gespritzt, während 10 ul der Lösung des gemäß Beispiel 1 carbamylierten NEA-Antikörpers in die andere Vertiefung auf der Kathodenseite gespritzt v/erden. Die Elektrophorese erfolgt 40 Minuten mit einer Stromstärke von 2,5 mA/cm Breite der Platte. Dabei wird geprüft, ob eine Präzipitatlinie auftritt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III wiedergegeben.

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Tabelle 3

untersuchtes Serum	Serum von Neo- plasma- Patien- ten	Magenkrebs Kolon- und Rektumkrebs Pankreaskrebs primärer Leberkrebs Uterus- und Ovarialkrebs Brustkrebs Leukämie Lymphosarcom	Proben anzahl	positiv	negativ
Serum von Nicht- Neo- plasma- Patien- ten	gesunder Mensch Gastritis, Magen- und Duodenalgeschwüre Colitis Hepatitis und Leber zirrhose Mastitis chronische Pankreatitis Pankreatitis rheumatisches Fieber chronischer Gelenk rheumatismus andere gutartige Krank heiten	25 12 8 19 10 12 6 2	8 2 2 8 3 7 2 1	17 10 6 11 7 5 4 1
31 32 6 41 3 3 3 5 5 7	OO Ov- OOOOO O	3t 32 6 40 3 3 3 5 5 7

Die Ergebnisse zeigen, daß NEA bei insgesamt 94 Beispielen für Seren von Neoplasma-Patienten in 33 Fällen nachgewiesen wird, was einem Prozentsatz von 35,1 % entspricht. Andererseits wird NEA bei insgesamt 136 Beispielen für Seren von normalen bzw. Nicht-Neoplasmapatienten mit Ausnahme von einem Fall nicht nachgewiesen. In dem Ausnahmefall wurde bei dem Patienten Leberzirrhose diagnostiziert und beim Serum dieses Patienten besteht Verdacht auf eine primäre Leberkrebskomplikation.

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Daraus ergibt sich, daß der erfindungsgemäße Nachweis von NEA im Serum im vorteilhafte Diagnosemethode für maligne Neoplasmen darstellt.

Beispiel 14

Nachweis von NEA im Serum von Patienten durch den Radioimmunotest (RIA)

a) Markierung von NEA nach dem GhI ο ramin-· T-Verfahr en IiEA, das gemäß Beispiel 5 hergestellt worden ist, wird durch Vermischen der folgenden Lösungen markiert:

NEA-Lösung (1,25 mg/ml) 20 yO.

¹²⁵J-Na (0,1 Millicurie/μΐ) 10 ul 0,4 m Phosphatpufferlösung

(pH 7,4) 50 ul.

Das Gemisch wird mit 50^1 Chloramin T (1,2 mg/ml) versetzt und 30 Sekunden gerührt. Hierauf gibt man 50 μΐ einer NatriummetaMsulfit-Lösung (3₅O mg/ml) zu und rührt das Gemisch 2 Minuten. Dann versetzt man mit 100 ^il einer nicht radioaktiven Kaliumjodidlösung (10 mg/ml) und unterwirft die Reaktionslösung der Säulenchromatographie an Sephadex G-75 unter Verwendung einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Phosphatgehalt von 0,05 m und einem pH von 7,4. Das Eluat wird fraktioniert in Teströhrchen aufgefangen, die vorher mit 1 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gefüllt worden sind,die 0,05 m Phosphat als Puffer und 1 % Kuhserumalbumin enthält.

125 Durch Abtrennen der markierten ΝΕΑ-Fraktion wird J-NEA mit einer spezifischen Radioaktivität von 10Millicurie/mg erhalten. Das ^⁵J-NEA kann als Neoplasma-Diagnosemittel verwondet werden.

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"b) Nachweis von NEA durch zwei Antikörperprozesse unter Ver-

125
Wendung von ^J-NEA

Zunächst wird eine Standardkurve aufgezeichnet, die unter Verwendung eines Standard-NEA-Materials mit bekanntem NEA-Gehalt

125 und dem gemäß Beispiel 1 hergestellten J-NEA erhalten worden ist. Das Reaktionsgemisch wird dadurch hergestellt, daß man 0,1 ml des Standard-NEA-Materials, 0,1 ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten ³J-NEA (10 000 cpm) und 0,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung miteinander vermischt, die 0,05 m Phosphat als Puffer und 1 % Kuhserumalbumin enthält. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 0,1 ml einer Lösung versetzt,die vorher durch Verdünnen des gemäß Beispiel 3 hergestellten Anti-NEA-Kaninchen-Antiserums auf das 20 000- bis 40 000-fache erhalten worden ist. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 4⁰C umgesetzt. Hierauf versetzt man mit 0,1 ml der normalen Kaninchen-Serumlösung, die auf das 100-fache verdünnt wurde, und 0,1 ml einer Anti-Kaninchen-y-Globulin-Ziegenantiserumlösung als zweite Antikörperlösung, die auf das 10-fache verdünnt wurde, und läßt das Ganze 24 Stunden bei 4⁰C reagieren, Die Lösung wird dann in ein Teströhrchen eingebracht und 30 Minuten mit 3000 U/min zentrifugiert, worauf man den Überstand entfernt. Die Radioaktivität des Niederschlags in dem Teströhrchen wird gemessen. Als Ergebnis der erfindungsgemäßen RIA-Methode wird eine äußerst genaue Standardkurve im NEA-Konzentrationsbereich von 5 bis 320 ng/ml erhalten.

Die beschriebene RIA-Methode wird auf insgesamt 381 Beispiele von Seren angewandt, darunter 55 Beispielen von normalen Menschen, 129 Beispielen von Nicht-Neoplasmapatienten und 197 Beispielen von Neoplasma-Patienten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben.

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- 40 Tabelle 4

	Fall	Gesamt	NEA-PIonzentration von	Prozent
		zahl der.	mehr als 200 ng/ml	satz ("/o)
		Fälle	Anzahl der	30,9
	Magenkrebs		Fälle	34,5
Serum	Dickdarmkrebs	UU	21	60,0
von Neo-	Pankreaskrebs	29	10 I	42,9
plasma-	Leberkrebs	10		30,0
Patien- ten	Gallenblasen- und	21	9
	Gallengangkrebs	10	—* \ D ;	53,3
	Lungenkrebs			41,2
	Brustkrebs	3	1 ^:	27,3
	Uterus- und	17	7 i
	Ovarialkrebs	11		50,0
	Leukämie			50,0
	andere maligne	24	12
	Tumoren	4	2	37,0*
	insgesamt			C
	gesunder Mensch	I 197	74	15,7
Serum	akute Hepatitis	I 55	0	17,4
von mor- malen	chronische Hepa	6	1'
und	titis	23	4	4,8
Nicht-	Leberzirrhose			^ .τ
Ne ο- Olasma-	andere benigne	21	1
Patien	Krankheiten	79	3	4,9**
ten	insgesamt
	184	9

. ja.

* Mittelwert : -^- χ 100 = 37,6

197

** Mittelwert : —^¹- χ 100 = 4,9

184

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— H* I —

Die Ergebnisse zeigen, daß der Nachweis von NEA im Serum nach der RIA-Methode für die Neoplasmadiagnose geeignet ist.

c) Markierung des NEA-Antikörpers nach dem Chloramin-T-Ver fahren

Der gemäß Beispiel 7 hergestellte NEA-Antikörper wird unter Vermischen der folgenden Lösungen markiert:

NEA-Antikörperlösung (1,0 mg/ml) 20^uI

¹²⁵J-Na (0,1 Millicurie/ul) 10 μΐ

0,4 m Phosphatpuffer (pH 7,4) 50 ul

Das Gemisch wird mit 100^uI Chloramin-T (1,0 mg/ml) versetzt und 1 Minute gerührt. Hierauf gibt man 100 ul Natrium-metabisulfit (2,4 mg/ml) zu und rührt weitere 2 Minuten. Schließlich wird das Gemisch mit 100 ,ul nicht radioaktivem Kaliumiodid (10 mg/ml) versetzt. Die Reaktionslösung wird der Säulenchromatographie an Sephadex G-75 unterworfen und mit einer 0,05 ω phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (pH 7,4) eluiert. Das Eluat wird fraktioniert in Teströhrchen aufgefangen, die vorher mit 1 ml eines Gemisches aus einer 0,05 m phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung und einer 1proζentigen Kuhserumalbuminlösung gefüllt worden sind.

Durch Abtrennen der Fraktion mit dem markierten NEA-Antikörper 125

wird ein J-NEA-Antikörper mit einer spezifischen Radioaktivität von 10 Millicurie/mg erhalten. Der ²⁵J-NEA-Antikörper eignet sich als Neoplasma-Diagnosemittel.

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Claims

Patentansprüche

Neoplasma-Diagnosemittel, dadurch g e k e η η - ζ e i ch η e t, daß es NEA und/oder NEA-Antikörper enthält.

2, Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das NEA und/oder der NEA-Antikörper mit einem radioaktiven Isotop markiert sind.

3· Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Kombinationsprodukt von IiEA und/oder NEA-Antikörper mit Feinteilchen enthält.

4. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es Blutzellen von Säugetieren oder Vögeln, Polystyrollatex, Polyesterlatex, Polyvinylchlorid, Bentonit und/oder Glasperlen als Feinteilchen enthält.

5. Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es Erythrocyten von Schafen als Feinteilchen enthält.

6. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Gel enthält, das durch gemeinsames Auflösen von NEA-Antikörper und einem Trägermedium und anschließende Verfestigung der erhaltenen Lösung auf einer Platte hergestellt worden ist.

7· Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermedium Agar-Agar, Agarose, Stärke. und/oder Polyacrylamidgel verwendet worden sind.

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-8. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermedium Agarose verwendet worden ist.

9. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen carbamylierten NEA-Antikörper enthält.

10. Verfahren zur Nieoplasmadiagnose beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß man NEA unter Verwendung von NEA oder NEA-Antikörper, die mit einem radioaktiven Isotop markiert worden sind, nach der Radioimmunomethode oder im Falle der Neoplasmadiagnose unter Verwendung von NEA oder ΝΕΑ-Antikörper unter Anwendung einer immunologischen Diagnose auf Basis der Hämagglutination nachweist.

11. Verfahren zur Neoplasmadiagnose beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß man NEA unter Verwendung eines Kombinationsprodukts von NEA oder NEA-Antikörper mit Feinteilchen nachweist, im Falle der Neoplasmadiagnose unter Verwendung von NEA oder NEA-Antikörper unter Anwendung einer immunologischen Diagnose auf Basis der Hämagglutination.

12. Verfahren zur Neoplasmadiagnose beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß man NEA unter Verwendung eines Gels nachweist, das durch gemeinsames Auflösen von NEA-Antikörper und einem Trägermedium sowie anschließendes Verfestigen der erhaltenen Lösung auf einer Platte hergestellt worden ist, im Falle der Neoplasmadiagnose unter Verwendung von NEA-Antikörper unter Anwendung der einfach radialen Immunodiffusionsmethode oder der Immunoelektrodiffusion.

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· Verfahren zur Neoplasmadiagnose beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß man KEA unter Vervendung eines carbamylierten NEA-Antikörpers nachweist, im Falle der lieoplasmadiagnose unter Verwendung von IJILA-Antikörper unter Anwendung der Immunoelektroosmophorese.

14. Verfahren zur Herstellung von ΝΞΑ-Antikörper für die Neoplasrna diagnose j dadurch gekennz eichnet, daß man HEA an Tieren immunisiert und das Antiserum gewinnt .

15· Verfahren zur Herstellung von NEA-Antikörper zur Neoplasmadiagnose, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Komplex aus NEA und ΙΪΞΑ-Antikörper an Tieren immunisiert und das Antiserum geviinnt.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Immunisierung Kaninchen verwendet.

17- Verfahren zur Reinigung von HEA und NEA-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung durch Affinitätschromatograpliie erfolgt.

18. Verfahren zur Reinigung von NEA, dadurch gekennzeichnet, daß man das NEA-haltige Gemisch mit einem basischen Anionenaustauscherharz behandelt.

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