CH648596A5

CH648596A5 - Reagens und verfahren fuer die bestimmung von aldolase vom menschenmuskel-typ.

Info

Publication number: CH648596A5
Application number: CH7209/80A
Authority: CH
Inventors: Toyohiro Kitamura; Tomiaki Morimoto; Tohru Naraki; Takashi Sawada; Minoru Tohda
Original assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1979-09-25
Filing date: 1980-09-23
Publication date: 1985-03-29
Also published as: SE8006667L; CA1158549A; IT1141082B; DE3036184A1; IT8024877A0; BE885376A; FR2466020B1; FR2466020A1; SE447422B; GB2062226A; GB2062226B; NL8005330A; JPS5648894A

Description

Diese Erfindung betrifft Reagentien und ein Verfahren zur Bestimmung von Aldolase des Menschenmuskel-Typs.

Mit Aldolase bezeichnet man normalerweise Enzyme, die die Aldol-Kondensation zwischen Dihydroxyacetonphosphat und einer Reihe von Aldehyden katalysieren.

Die Bezeichnung «Aldolase» umfasst in der Beschreibung dieser Erfindung die Fructosediphosphataldolase (E. C. 4.1.2.13 Fructose-1, 6-Phosphat-D-glyceraldehyd-3-phosphat-lyase). Das Enzym spaltet reversibel das Fructose- 1,6-di-phosphat in Dihydraxyacetonphosphat und D-Glyceralde-hyd-3-phosphat. Das Enzym hält also eine wichtige Stellung inne, im Glycolyse-System; es ist speziell tätig in Muskelgeweben. Es ist daher im Energiemetabolismus ein sehr wichtiges Enzym.

Die Aldolase von Säugetieren wird normalerweise in drei Typen aufgeteilt: Der Muskel-Typ oder auch Typ A, der Leber-Typ, oder auch Typ B und der Gehirn-Typ oder auch Typ C. Es ist bekannt, dass die Konzentrations Verhältnisse dieser Isoenzyme variieren, je nach Metamorphose des lebenden Körpers wie die Differenzierung der foetalen Leber in Ratten oder je nach Befall des Organismus mit Krebs bei Menschen oder Ratten und ähnlichen Vorgängen.

Bekannt sind bis anhin zwei Methoden für die Bestimmung von Aldolase vom Menschenmuskel-Typ. Eine ist die Elektrophorese-Methode. Die andere ist eine Methode, die die Zersetzungsaktivitäten von zwei Substraten bestimmt. Die beiden Substrate sind: Fructose-1,6-diphosphat (FDP) und Fructose-l-phosphat (FIP) für Aldolase. Dadurch wird das Aktivitätsverhältnis FDP/FIP bestimmt.

Die Methoden sind jedoch problematisch.

Bei der Elektrophorese ist das Problem dasjenige, dass die migrierten Flecken der menschlichen Aldolase so nahe beieinander liegen, dass ihre Unterscheidung sehr schwierig und demzufolge eine präzise quantitative Bestimmung nicht möglich ist.

Bei Bestimmung der Methode der Aktivitätsverhältnisse FDP/FIP ist die Bestimmung der FIP-Aldolase-Aktivität sehr schwierig. Auch diese Methode führt daher nicht immer zu qantitativen Bestimmungen.

In neuester Zeit wurde eine entsprechende Methode mittels Radio-Immunoassay vorgeschlagen. Verglichen mit den beiden zuvor genannten Methoden weist die neue Methode erhöhte Sensivität auf und führt auch zu verbesserten quantitativen Resultaten. Aber auch diese neue Methode zeigt einige Nachteile, indem das darin verwendete Reagens nicht gelagert werden kann. Die für die Markierung eingesetzten Radioisotope zersetzen sich nämlich zu schnell. Auch benötigt die Ausführung der neuen Methode spezielle Maschinen und Apparate und vor allem einen geeigneten Raum für die Messung der Aktivitäten der Radioisotope. Ebenso stellen das Handling und die Beseitigung der Abfälle grosse Probleme dar.

Wir haben nun ein Reagens entwickelt, um in einer En-zymimmunoassay-Untersuchüng die Anwesenheit von Aldolase des Menschenmuskel-Typs zu bestimmen. Auch ein Verfahren zur Bestimmung der genannten Aldolase mit dem genannten Reagens wurde entwickelt. Mit dem neuen Reagens und der entsprechenden Methode werden verschiedene Nachteile der obigen Verfahren beseitigt oder zumindest verkleinert.

Das erfindungsgemässe Reagens für die Bestimmung von Aldolase vom Menschenmuskel-Typ ist im Patentanspruch 1 gekennzeichnet; das entsprechende Verfahren zur Bestimmung der genannten Aldolase im Patentanspruch 8.

Im folgenden werden die einzelnen Verfahrensschritte des Patentanspruches 8 näher illustriert.

Im Schritt a) wird der Antikörper, der an einem Träger immobilisiert ist, zusammen mit der Probe inkubiert. Die Probe kann ein Serum oder eine ähnliche Flüssigkeit sein. Das Antigen in der Probe, d.h. die Aldolase vom Menschenmuskel-Typ, kann nun mit dem genannten immobilisierten Antikörper reagieren. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird die Reaktionslösung entfernt. Die feste Phase wird mit einer Pufferlösung, mit destilliertem Wasser oder mit ähnlichen Flüssigkeiten gewaschen.

Im Schritt b) wird die feste Phase aus Schritt a) zusammen mit einem Enzym-markierten Aldolase-Antikörper vom Muskel-Typ inkubiert. Erhalten wird dabei die Kombination des genannten Enzym-markierten Antikörpers mit dem vorgängig am immobililsierten Antikörper gebundenen Antigen. Nachdem diese Reaktion abgeschlossen ist, wird wiederum die Reaktionslösung entfernt und die feste Phase mit einer Pufferlösung, mit destilliertem Wasser oder ähnlichen Flüssigkeiten gewaschen.

Im Schritt c) wird die feste Phase aus b) zusammen mit einem Enzymsubstrat inkubiert, um die entsprechende Enzymreaktion zu ermöglichen. Nach einer bestimmten Zeit wird die Reaktion durch Zugabe einer Lösung beendigt, welche die oben genannte Enzymreaktion unterbricht.

Im Schritt d) schliesslich wird die Absorption von Zersetzungsprodukten aus dem Substrat in der obigen Enzymreaktion gemessen. Die Messung der Absorption wird mittels eines Absorptionsphotometers ausgeführt, welcher auf eine geeignete Wellenlänge für die quantitative Bestimmung von Zersetzungsprodukten des Substrats eingestellt werden kann.

Zur Bestimmung der genannten Absorbtion muss vor5

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her eine Eichkurve aus Proben mit bekannten Gehalten aufgestellt werden.

Die Figuren 1 bis 4 zeigen solche Eichkurven für den Gehalt an Aldolase vom Menschenmuskel-Typ, welcher mittels der Enzym-Immunoassay-Methode gemäss dem folgenden Beispiel 5 erhalten worden ist.

Die Fig. 5 zeigt eine entsprechende Eichkurve für das folgende Beispiel 6.

Fig. 6 zeigt Resultate von Bestimmungen von Aldolase vom Menschenmuskel-Typ im menschlichen Serum, die mittels der Enzymimmunoassay-Methode gemäss dem folgenden Beispiel 7 erhalten worden sind.

Die folgende Beschreibung illustriert nun das erfindungs-gemäss Reagens und dessen Anwendung.

A) Aldolase-Antikörper vom Muskel-Typ

Antiserum wird wie folgt erhalten: Aldolase vom Muskel-Typ eines Säugers, wie beispielsweise Mensch, Kaninchen, Hund, Affe oder Rind, wird einem anderen Tier injiziert. Das zu immunisierende Tier wird vorzugsweise aus den verschiedenen Species der Vögel ausgewählt. Die Aldolasen vom Muskel-Typ der verschiedenen Säugetiere zeigen nämlich immunologisch keine signifikanten Unterschiede.

Bevorzugte Vögel umfassen beispielsweise das Haushuhn, den Truthahn, Enten und ähnliche.

Es ist von Vorteil, das inaktivierte Serum des Tieres, von welchem die Muskel-Aldolase stammt, zum resultierenden Antiserum zu geben, wobei durch Absorption die anderen, unreinen Antikörper entfernt werden.

Die Reinigung dieser Antisera können mittels Affinitätschromatographie an Trägern ausgeführt werden, welche mit Aldolase von Säugermuskeln kombiniert sind.

Solche Aldolasen stammen bevorzugterweise von Menschenmuskeln, Kaninchenmuskeln, Affenmuskeln, Rindermuskeln oder ähnlichen. Das Trägermaterial ist normalerweise Agarose, vernetztes Dextran usw. Der beladene Träger kann hergestellt werden, indem er vorerst mit Bromcyan oder ähnlichen Substanzen aktiviert wird und dann zur Lösung der Aldolase vom Muskel-Typ gegeben wird. Die Lösung wird dann bei tiefer Temperatur gerührt. Der gereinigte Aldolase-Antikörper vom Muskel-Typ wird dadurch erhalten, indem man das Antiserum über eine Kolonne gibt, die mit dem obengenannten Träger gefüllt ist. Die Eluierung des Aldolase-Antikörpers vom Muskel-Typ aus der Kolonne kann mittels einer schwach alkalischen Lösung ausgeführt werden.

In der beschriebenen Affinitätschromatographie variiert die Sensitivität der Messmethode gemäss der Kombination zwischen dem Träger und der eingesetzten Aldolase. Auch die Art der Aldolase, die für die Herstellung des Antiserums verwendet wird, hat einen Einfluss auf die Genauigkeit der Messmethode.

Im Falle eines Aldolase-Antiserums vom Menschen-muskel-Typ wird eine Eichkurve erhalten, wie sie in Fig. 1 dargestellt ist. Dabei wird Aldolase-Antikörper vom Menschenmuskel-Typ eingesetzt, der auf einem Träger gereinigt ist, welcher mit Aldolase vom Menschenmuskel-Typ beladen ist. In den Fällen vom Aldolase-Antiserum vom Kanin-chenmuskel-Typ werden entsprechende Eichkurven erhalten, wenn zur Reinigung Träger mit Aldolase vom Menschen-muskel-Typ, vom Rindermuskel-Typ und vom Kaninchenmuskel-Typ beladen werden. Die entsprechenden Eichkurven sind in den Fig. 2, 3 und 4 dargestellt.

B) Enzym-markierter Aldolase-Antikörper vom Muskel-Typ

Zur Markierung des Antikörpers können diejenigen Enzyme verwendet werden, welche allgemein in der Enzym-,

immunoassay-Methode eingesetzt werden. Beispiele solcher Enzyme sind: Alkaliphosphatase, Peroxidase, ß-D-Galactosi-dase, Glucoamylase, Glucoseoxydase, und ähnliche.

Die Markierung kann mit konventionellen Methoden ausgeführt werden. Bekannt sind beispielsweise die Glutar-aldehyd-Methode, die Nakane-Methode, die Maleimid-Methode, die gemischte Methode unter Einsatz von Säuren und Anhydriden, die Carbodiimid-Methode usw. In der Glutaraldehyd-Methode wird die Markierung durch Zugabe des Enzyms zum Antikörper und gleichzeitiger Beigabe von Glutaraldehyd ausgeführt. Die Konzentration der letztgenannten Verbindung kann 0,2 bis 0,8% betragen. Die Reaktion wird dann bei Raumtemperatur zu Ende geführt. Die Reaktionsverhältnisse des Enzyms zum Antikörper liegen vorzugsweise bei 1:1, sie können jedoch in den Verhältnissen 1:2 bis 2:1 variieren.

Der Enzym-markierte Antikörper wird vor seiner Verwendung als Reagens normalerweise noch mit einer Pufferlösung verdünnt. Anstelle der Pufferlösung können auch andere Flüssigkeiten eingesetzt werden. Es ist auch von Vorteil, zur genannten, verdünnten Lösung ungefähr 20% inaktiviertes Kaninchenserum zuzugeben. Wie in Fig. 4 gezeigt wird, führt die Zugabe von inaktiviertem Kaninchenserum zu einer bevorzugten Eichkurve, verglichen mit einer reinen Pufferlösung des Antikörpers oder mit einer Pufferlösung des Antikörpers die zusätzlich Rinderserumalbumin enthält.

C) Immobilisierter Aldolase-Antikörper vom Muskel-Typ

Als Träger wird ein unlöslicher Feststoff verwendet,

welcher mit Antikörper beladen ist. Illustrative Beispiele solcher Feststoffe umfassen: Polystyrol, Cellulose, Agarose, Glas, vernetztes Dextran, Silikongummi, Metalle, usw. Die Materialien können in den folgenden Formen vorliegen: Schlauch, Mikrotiterplatten, Pulver, Kügelchen, Platten, Folien, usw.

Im Falle von Polystyrol-Mikrotiterplatten kann der Antikörper mit der Oberfläche der Platte kombiniert werden. Der Antikörper wird dazu in eine geeignete Pufferlösung verdünnt und die verdünnte Lösung auf der Platte stehengelassen.

D) Andere Substanzen

Als Substrate werden Substrate derjenigen Enzyme eingesetzt, welche für die Markierung der Antikörper eingesetzt wurden. Wenn das Enzym Alkaliphosphatase ist, werden als Substrate p-Nitrophenylphosphat, ß-Glycerolphos-phat, Phenylphosphat, ß-Naphthylphosphat, Phenolphthalein-phosphat oder ähnliche eingesetzt.

Als Lösung zur Unterbrechung der Enzymreaktion können die bekannten Mittel eingesetzt werden. Im Falle von Alkaliphosphate ist eine IN Natriumhydroxidlösung eine geeignete Lösung zur Unterbrechung der Enzymreaktion.

Die obigen Beschreibungen wurden hinsichtlich der Sandwich-Methode gemacht. Das erfindungsgemässe Reagens zur Bestimmung der Aldolase vom Menschenmuskel-Typ kann jedoch auch mittels immunoenzymetrischer Methoden bestimmt werden. Diese Methode umfasst die Reaktion von Enzym-markiertem Antikörper mit einer das Antigen darstellenden Probe mit anschliessender Abtrennung des Anti-körper-Antigenreaktanden B vom nicht reagierten Enzymmarkierten Antikörper (F). Anschliessend wird die Enzymaktivität von beiden (B oder F) am Substrat bestimmt. Zur Trennung (B) und (F) kann die Gelfiltrationsmethode verwendet werden, aber auch die Absorptionsmethode mittels immobilisiertem Antigen liefert annehmbare Resultate. Auch bei der Bestimmung der Aldolase vom Menschenmuskel-Typ mittels Immunoenzymetrie wird der Enzym-markierte

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Aldolase-Antikörper vom Menschenmuskel-Typ, wie oben beschrieben, als Reagens eingesetzt.

Im folgenden werden Experimente und Beispiele die Erfindung weiter illustrieren.

Experiment 1 Aldolase-Antiserum vom Menschenmuskel-Typ

Ein mg Aldolase vom Menschenmuskel-Typ werden in 0,5 ml einer wässrigen, physiologischen Salzölsung aufgelöst. Zur Lösung wurde das gleiche Volumen an Freund-Zusatz-lösung gegeben. Das Produkt wurde mittels Injektion in die Muskel eines Haushuhnes (White Leghorn) verabreicht. Die gleiche Injizierung erfolgte zwei, bzw. drei Wochen später. Eine Woche nach der letzten Injektion wurde das Blut des Tieres gesammelt und daraus das Aldolase-Antiserum vom Menschenmuskel-Typ gewonnen. Zum gewonnenen Antiserum wurde normales Humanserum (NHS) gegeben, welches vorgängig zwei Stunden lang bei 56 °C inaktiviert worden war. Die Lösung enthielt am Schluss 10% des genannten Humanserums. Die Mischung wurde dann bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert und bei 4°C über Nacht stehen gelassen. Das Produkt wurde 20 Minuten lang bei 3000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert. Die überliegende, klare Flüssigkeit wurde abgetrennt und daraus das Alkoholase-Antiserum vom Menschenmuskel-Typ gewonnen, das das Normalhumanserum absorbiert enthielt.

Experiment 2 Aldolase-Antiserum vom Kaninchenmuskel-Typ

2 mg Aldolase vom Kaninchenmuskel-Typ wurden in 1 ml wässriger, physiologischer Salzlösung aufgelöst. Anschliessend wurde gleich weiter verfahren wie im Experiment 1. Erhalten wurde so das Aldolase-Antiserum vom Kaninchenmuskel-Typ. Zu diesem Antiserum wurden soviel normales Kaninchenserum (NRS) gegeben, dass die Lösung schliesslich 10% davon enthielt. Das genannte Normal-Kaninchenserum war vorgängig 3 Stunden lang bei 56°C inaktiviert worden. Dann wurde wiederum gleich verfahren wie im Experiment 1 und man erhielt schliesslich das Aldolase-Antiserum vom Kaninchenmuskel-Typ, das das NRS absorbiert enthielt.

Experiment 3 Aldolase-Antikörper vom Menschenmuskel-Typ

10 g Sepharose 4B^ der Pharmacia Fine Chemicals AB, bestehend aus Agarose und 10 mg Aldolase vom Menschenmuskel-Typ wurden über Nacht bei 4°C in 15 ml einer 0,1 M Natriumkarbonat-Pufferlösung bei pH 9 stehen gelassen.

Das so erhaltene Sepharose 4B-Gel, welches nun mit Aldolase vom Menschenmuskel-Typ beladen war, wurde in eine Kolonne gepackt. Die Packung wurde mit einer 0,05 M Trishydrochlorid-Pufferlösung mit 0,5 N Natriumchlorid bei einem pH von 8,0 gewaschen. Auf die Kolonne wurden anschliessend 3 ml des Aldolase-Antiserums mit absorbiertem NHS vom Menschenmuskel-Typ aus dem Experiment 1 gegeben. Das Antiserum wurde mit einer 0,05 M Trihydro-chlorid-Pufferlösung mit 0,5 N Natriumchlorid bei einem pH von 8,0 ausgewaschen. Dann wurde eine 0,1 N wäss-rige Natriumkarbinatlösung auf die Kolonne gegeben, wodurch der Aldolase-Antikörper vom Menschenmuskel-Typ eluiert wurde. Die Fraktion mit dem Antikörper wurde einer Dialyse unterworfen. Die Gegenlösung war die obige 0,05 M Tris-Hydrochlorid-Pufferlösung bei pH 8,0. Erhalten wurden schliesslich so 3 mg Aldolase-Antikörper vom Men-schenmuskel-Typ.

Experiment 4 Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ

Das Vorgehen vom Experiment 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass 3 ml des Aldolase-Antiserums mit absorbiertem NRS vom Kaninchenmuskel-Typ aus dem Experiment 2 auf die Kolonne gegeben wurde. Die Sepharose war vorgängig mit Aldolase vom Kaninchenmuskel-Typ beladen worden. Erhalten wurden 3 mg Aldolase-Antikör-per vom Kaninchenmuskel-Typ.

Experiment 5 Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ

Das gleiche Vorgehen wie in Experiment 3 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass 3 ml Aldolase-Antiserum mit absorbiertem NRS vom Kaninchenmuskel-Typ aus dem Experiment 2 auf die mit Sepharose 4B-Gel beschichtete Kolonne gegeben wurde. Die Sepharose war vorgängig mit Aldolase vom Menschenmuskel-Typ beladen worden. Erhalten wurden 3 mg Aldolase-Antikörper vom Kaninchen-muskel-Typ.

Experiment 6 Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ

Das Vorgehen vom Experiment 3 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass 3 ml Aldolase-Antiserum mit absorbiertem NRS vom Kaninchenmuskel-Typ aus dem Experiment 2 auf die mit Sepharose 4B-Gel beschichtete Kolonne gegeben wurde. Die Sepharose 4B war vorgängig mit Aldolase vom Rindermuskel-Typ beladen worden. Erhalten wurden schliesslich 3 mg Aldolase-Antikörper vom Kaninchen-muskel-Typ.

Experiment 7

Immobilisierter Aldolase-Antikörper vom Humanmuskel-Typ

In jede Vertiefung auf einer Polystyrolmikrotiterplatte wurden je 200 jxl einer 0,05 M Tris-Hydrochlorid-Puffer-lösung von pH 8,0 gegeben. Jede Portion enthielt 25 (ig/ml Aldolase-Antikörper vom Humanmuskel-Typ aus dem Experiment 3. Die Lösungen wurden über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Anschliessend wurden die Lösungen von der Platte entfernt. Die Platte wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und man erhielt so eine Mikrotiterplatte, die mit Aldolase-Antkörper vom Humanmuskel-Typ beladen war.

Experiment 8

Immobilisierter Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-

Typ

In jede Vertiefung einer Polystyrolmikrotiterplatte wurden je 200 [il einer 0,05 M Tris-Hydrochlorid-Pufferlösung bei pH 8,0 gegeben. Jede Position enthielt 25 |ig pro ml des Aldolase-Antikörpers vom Kaninchenmuskel-Typ aus dem Experiment 4. Die Platte mit den Lösungen wurde bei 4°C über Nacht stehen gelassen. Dann wurden die Lösungen von der Platte entfernt. Die Platte wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und man erhielt so eine Mikrotiterplatte, die mit Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ beladen war.

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Experiment 9

Immobilisierter Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-

Typ

In jede Vertiefung einer Polystyrolmikrotiterplatte wurden je 200 |il einer 0,05 M Tris-Hydrochlorid-Pufferlösung bei pH 8,0 gegeben. Jede Position enthielt 25 (il/ml des Aldolase-Antikörpers vom Kaninchenmuskel-Typ aus dem Experiment 5. Die Platte mit den Lösungen wurde über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Dann wurden die Lösungen entfernt. Die Platte wurde nun mit destilliertem Wasser gewaschen und man erhielt so eine Mikrotiterplatte, die mit Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ beladen war.

Experiment 10

Immobilisierter Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-

Typ

Unter Verwendung des Aldolase-Antikörpers vom Kaninchenmuskel-Typ aus dem Experiment 6 wurde eine Mikrotiterplatte erhalten, die mit Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ beladen war, indem man gleich vorging, wie im vorher beschriebenen Experiment 9.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Mit Alkaliphosphatase markierter Aldolase-Antikörper vom Humanmuskel-Typ

Zu 0,3 ml Wasser, das 1 mg Alkaliphosphatase mit einer relativen Aktivität von 1000 Einheiten/mg enthielt, wurden 0,2 ml einer 0,05 M Phosphorsäure-Pufferlösung von pH 7,0 gegeben. Die Pufferlösung enthielt zusätzlich 1 mg Aldolase-Antikörper vom Humanmuskel-Typ aus dem Experiment 3 und 50 jxl einer 2,5 %igen Glutaraldehydlösung. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde sie über Nacht hydrolysiert gegenüber einer 0,05 M Tris-Hydrochlorid-Säurepufferlösung von pH 8,0. Es wurde so der mit Alkaliphosphatase markierte Aldolase-Antikörper vom Humanmuskel-Typ erhalten.

Beispiel 2

Mit Alkaliphosphatase markierter Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ

Das gleiche Vorgehen wie im Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass 1 mg Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ aus dem Experiment 4 zusammen mit 1 mg Alkaliphosphatase eingesetzt wurde. Erhalten wurde der mit Alkaliphosphatase markierte Aldolase-Antikör-per vom Kaninchenmuskel-Typ.

Beispiel 3

Mit Alkaliphosphatase markierter Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ

Das gleiche Vorgehen wie im Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass 1 mg Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ aus dem Experiment 5 zusammen mit 1 mg Alkaliphosphatase eingesetzt wurde. Erhalten wurde der mit Alkaliphosphatase markierte Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ.

Beispiel 4

Mit Alkaliphosphatase markierter Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ

Das gleiche Vorgehen wie im Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass 1 mg Aldolase-Antikörper vom

Kaninchenmuskel-Typ aus dem Experiment 6 zusammen mit 1 mg Alkaliphosphatase eingesetzt wurde. Erhalten wurde der mit Alkaliphosphatase markierte Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ.

Beispiel 5 Enzym-Immunoassay

Eine Standard-Antigenlösung von 500 ng/ml - 7,6 mg/ ml wurde durch serielle Verdünnung von Aldolase vom Humanmuskel-Typ mit normalem Kaninchenserum, welches 2 Stunden lang bei 56 °C inaktiviert worden war, hergestellt. 0,1 ml dieser Standardlösung wurde zu der Mikrotiterplatte gegeben, welche mit Aldolase-Antikörper vom Muskel-Typ beladen war. Die Lösung verblieb 60 Minuten lang bei 37°C auf der Platte. Dann wurde die Reaktionslösung entfernt. Die Platte wurde viermal mit destilliertem Wasser gewaschen. Daneben wurde der mit Alkaliphosphatase markierte Aldolase-Antikörper vom Muskel-Typ auf das 150fache verdünnt. Als Verdünnungslösung wurde eine 0,05 M Tris-Hydrochloridsäure-Pufferlösung von pH 8,0 mit 30% normalem Kaninchenserum, welches 2 Stunden lang bei 56°C inaktiviert worden war, verwendet. 0,1 ml dieser Lösung wurde zur obigen Platte gegeben und verblieb dort 60 Minuten lang bei 37°C. Dann wurde auch diese Reaktionslösung entfernt. Die Platte wurde wiederum viermal mit destilliertem Wasser gewaschen. Eine Lösung von 5 mg/ ml an p-Nitrophenylphosphat in 0,1 M Natriumkarbonat-Pufferlösung bei pH 9,0, die zusätzlich 0,001 M Magnesiumchlorid enthielt, wurde getrennt davon bereitgestellt. 0,1 ml dieser Lösung wurden dann auf die Platte gegeben und verblieben dort 60 Minuten lang bei 37°C. Dann wurden 0,1 ml einer 0,1 N Natriumhydroxidlösung gegeben, um die Enzymreaktion abzubrechen. Die Reaktionslösung wurde mit destilliertem Wasser auf das Zehnfache verdünnt. Die Absorption dieser Lösung bei 405 um wurde mit einem Spektrophotometer gemessen. Damit konnte die Eichkurve, d.h. die Beziehung zwischen der Absorption dieser Lösung und den verschiedenen Konzentrationen der Aldolase vom Humanmuskel-Typ aufgesetzt werden.

Die Fig. 1 zeigt die oben erhaltene Eichkurve. Dafür wurde die Mikrotiterplatte mit dem Aldolase-Antikörper vom Humanmuskel-Typ aus dem Experiment 7 verwendet. Als Enzym-markierter Aldolase-Antikörper wurde der mit Alkaliphosphatase markierte Aldolase-Antikörper vom Huma-muskel-Typ aus dem Beispiel 1 verwendet.

Die Fig. 2 zeigt die entsprechende Kurve im Falle der Mikrotiterplatte, die mit dem Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ aus dem Experiment 8 beladen war. Als Enzym-markierter Aldolase-Antikörper vom Muskel-Typ war dazu der mit Alkaliphosphatase markierte Aldo-lase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ aus dem Beispiel 2 verwendet worden.

Die Fig. 3 zeigt die entsprechende Kurve für den Fall, in dem die Mikrotiterplatte mit dem Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ aus dem Experiment 9 beladen worden war. Als Enzym-markierter Aldolase-Antikörper vom Muskel-Typ war hier der mit Alkaliphosphate markierte Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ aus dem Beispiel 3 eingesetzt worden.

Die Fig. 4 zeigt die Eichkurve für den Fall, in dem die Mikrotiterplatte mit Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ aus dem Experiment 10 kombiniert worden war. Als Enzym-markierter Aldolase-Antikörper vom Muskel-Typ war hier der mit Alkaliphosphatase markierte Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ aus dem Beispiel 4 eingesetzt worden.

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In den Fig. 1 bis 4 zeigt die horizontale Achse die Konzentration in ng/ml der Aldolase vom Humanmuskel-Typ und die vertikale Achse gibt die Absorption bei 405 mji.

Wie aus den Figuren 1 bis 4 ersichtlich ist, werden bevorzugte Eichkurven dadurch erhalten, dass Aldolase-Antikörper vom Humanmuskel-Typ verwendet werden. Von den Fällen mit Aldolase-Antikörpern vom Kaninchenmuskel-Typ (Fig. 2, 3 und 4), zeigt die Fig. 4 die eindeutigste Eichkurve. Dies ist der Fall, in dem der Träger mit Aldolase vom Rindermuskel-Typ beladen wird. Auch die Fig. 3, d.h. der Fall, in dem der Träger mit Aldolase vom Humanmuskel-Typ beladen ist, führt zu annehmbaren Resultaten. Im Falle von Fig. 2, d.h. bei der Beladung des Trägers mit Aldolase vom Kaninchenmuskel-Typ ist der Zusammenhang zwischen Konzentration und Absorbierung nicht sehr eindeutig.

Beispiel 6 Enzym-Immunoassay

Die Effekte der Art der Verdünnungsmittel auf die Enzym-markierten Antikörper wurden durch das Immunoas-say-System gemäss Beispiel 5 untersucht.

Verwendet wurden als Enzym-markierter Antikörper der mit Alkaliphosphate markierte Aldolase-Antikörper vom Humanmuskel-Typ aus dem Beispiel 1. Als immobilisiertes Antigen wurde die Aldolase vom Humanmuskel-Typ aus dem Experiment 7 auf der Mikrotiterplatte gebunden.

Die folgenden Verdünnungsmittel wurden in diesem Beispiel verwendet:

A) 0,05 M Tris-Hydrochloridsäure-Pufferlösung (pH 8,0) mit 30% an normalem Kaninchenserum, das 2 Stunden lang bei 56°C inaktiviert worden war;

B) 0,05 M Tris-Hydrochloridsäure-Pufferlösung bei pH 8,0 mit einem % Rinderserumalbumin, das 30 Minuten lang bei 56°C inaktiviert worden war;

C) 0,05 M Tris-Hydrochloridsäure-Pufferlösung bei pH 8,0

als Vergleich.

Der Enzym-markierte Antikörper wurde mit jeder der obengenannten Verdünnungsmitteln 150fach verdünnt. Dann 5 wurden die entsprechenden Eichkurven gemäss den Angaben aus Beispiel 5 aufgesetzt. Alle erhaltenen Eichkurven sind in der Fig. 5 dargestellt. Die horizontale Achse zeigt die Konzentration an Aldolase vom Humanmuskel-Typ in ng/ml und die vertikale Achse die Absorbierung bei 405 io mn nach. Die Symbole A, B und C zeigen die verschiedenen Verdünnungsmittel auf. Wie die A-Stellung zeigt, werden die bevorzugten Eichkurven mit dem Verdünnungsmittel (A) erhalten, d.h. im Falle des Verdünnungsmittels, das inaktiviertes Kaninchenserum enthält.

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Beispiel 7 Enzym-Immunoassay:

Im Serum verschiedener Krebs-Patienten wurde die Kon-20 zentration von Aldolase vom Humanmuskel-Typ bestimmt. Als Vergleich wurde die gleiche Bestimmung an Patienten ohne Krebs und an gesunden Menschen ausgeführt. Die Bestimmungsmethode war das Immunoassay-System aus dem Beispiel 5.

25 Der verwendete Enzym-markierte Antikörper war dabei der mit Alkaliphosphatase markierte Aldolase-Antikörper vom Humanmuskel-Typ aus dem Beispiel 1. Der immobilisierte Antikörper war dabei die Aldolase vom Humanmuskel-Typ aus dem Experiment 7 auf der Mikrotiterplatte. 30 Die zu untersuchenden Seren wurden direkt verwendet, d.h. ohne Verdünnung.

Die Resultate sind in der Fig. 6 zusammengestellt. Wie die Figur zeigt, ist die Konzentration von Aldolase vom Humanmuskel-Typ bei Krebspatienten im grossen und gan-35 zen höher oder zumindest weiter verstreut als bei nicht an Krebs erkrankten und bei gesunden Menschen.

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3 Blätter Zeichnungen

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PATENTANSPRÜCHE

1. Reagens zur Bestimmung von Aldolase vom Menschenmuskel-Typ, gek ennzeichnet durch einen Gehalt an Enzym-markiertem Aldolase-Antikörper vom Muskel-Typ.
2. Reagens gemäss Patentanspruch 1, in dem das genannte Enzym Alkaliphosphatase ist.
3. Reagens gemäss Patentanspruch 1, in dem der genannte Aldolase-Antikörper ein solcher vom Menschenmuskel-Typ ist.
4. Reagens gemäss Patentanspruch 1, in dem der genannte Aldolase-Antikörper ein solcher vom Kaninchenmuskel-Typ ist.
5. Reagens gemäss Patentanspruch 1, in dem der genannte Aldolase-Antikörper vom Muskel-Typ in einer Pufferlösung vorliegt, die inaktiviertes Kaninchenserum enthält.
6. Verfahren zur Bestimmung von Aldolase vom Men-schen-muskel-Typ unter Verwendung eines Reagens gemäss dem Patentanspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) In Kontakt bringen der zu untersuchenden Probe mit einem immobilisierten Aldolase-Antikörper vom Muskel-Typ und anschliessender Abtrennung der festen Phase,

b) In Kontakt bringen der festen Phase aus a) mit einem Reagens gemäss dem Patentanspruch 1 mit anschliessender Abtrennung der festen Phase,

c) In Kontakt bringen der festen Phase aus b) mit einem Enzymsubstrat und c) Bestimmung der Absorption von Zersetzungsprodukten aus dem obigen Substrat.
7. Verfahren gemäss Patentanspruch 6, umfassend den Gebrauch von Aldolase-Antikörper vom Kaninchenmuskel-Typ, welcher mittels Affinitätschromatographie an einem Träger, der mit Aldolase des Rindermuskel-Typs beladen ist, gereinigt worden ist, als Aldolase-Antikörper vom Muskel-Typ in immobilisierter Form.