JP6754116B2

JP6754116B2 - 大腸癌マーカー

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Publication number: JP6754116B2
Application number: JP2016088419A
Authority: JP
Inventors: 淳多賀; 哲志山本; 善哉内藤; 工藤　光洋; 光洋工藤
Original assignee: Nippon Medical School Foundation; Kinki University
Current assignee: Nippon Medical School Foundation; Kinki University
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2020-09-09
Anticipated expiration: 2036-04-26
Also published as: JP2017198509A

Description

本発明は大腸癌を精度よく検出できる可能性を有する大腸癌マーカーと大腸癌細胞の存在を判定する指針となるデータの収集方法に関する。

大腸癌（Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ、ＣＲＣ）は、世界で最も罹患者数の多い癌の一種である。腫瘍が粘膜層に限局している場合は、外科的治療や内視鏡手術により完治させることが可能であるが、患者の多くは、既に進行している状態で発見されている。そのため、早期発見法が必要とされている。現在、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）が大腸癌細胞検出のための血液検査マーカーとして広く用いられているが、早期ステージにおける感受性は、５−１０％ほどと非常に低い。

したがって、感受性の高いマーカーが強く求められている。例えば、大腸癌細胞により分泌される新たな候補物質の同定は、早期診断の改善に繋がると考えられる。

ホルマリン固定パラフィン包埋（以下「ＦＦＰＥ」と呼ぶ。）組織は、患者の病歴、治療成績、薬物応答性などの詳細な臨床情報と共に、病院で保存されている。また、ＦＦＰＥ組織は、免疫組織学（ＩＨＣ）やｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いた、癌を初めとした様々な疾患の診断や研究に日常的に使用されている。

以前は、ＦＦＰＥ組織はプロテオーム解析を行うための素材としては不適切だと考えられていた。しかし、近年、プロテオーム解析を行うためのＦＦＰＥ組織からのタンパク質抽出法が開発されたことにより、様々なＦＦＰＥ組織を用いたプロテオーム研究が報告されるようになった。そのため、保管されているＦＦＰＥ組織は、新たなバイオマーカーを探索するための有用な素材になったといえる。

ＷＯ２００８／０３２８６８号特表２００７−５２７００１号公報

「看護師のための検査値・数式辞典」奈良信夫１０４頁ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃ．ａｕｏｎｅ−ｎｅｔ．ｊｐ／〜ｔａｉｊｉｒｏｕ／ａｒｕｄｏｒａ−ｚｅ．ｈｔｍｌ "ＡｌｄｏｌａｓｅＡｉｓｏｅｎｚｙｍｅｌｅｖｅｌｓｉｎｓｅｒｕｍａｎｄｔｉｓｓｕｅｓｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅｓ"ＡｓａｋａＭ，ＮａｇａｓｅＫ，ＭｉｙａｚａｋｉＴ，ＡｌｐｅｒｔＥ．；Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９８３Ｊａｎ；８４（１）：１５５−６０．

上記のように、大腸癌細胞を精度よく検出するためのマーカーは、まだ提案されていない。そこで本発明が解決しようとする課題は、精度よく大腸癌細胞を検出できるマーカーの提供である。

本発明では、上記課題を解決するために、ＦＦＰＥ大腸癌組織を用いたショットガンプロテオミクスによって、大腸癌細胞を精度よく検出できるバイオマーカーを探した。その結果、アルドラーゼＡの実量の変化が好適に利用できることを見出し本発明を完成するに至った。なお、アルドラーゼＡは、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で調べた場合、健常人の血清中には１７１±３９ｎｇ／ｍｌ含まれているとされている（非特許文献３）。

アルドラーゼが、上昇する疾患としては、Ｋｕｇｅｌｂｅｒｇ−Ｗｅｌａｎｄｅｒ症候群、多発性筋炎、進行性筋ジストロフィー症、白血病、心筋梗塞、ウイルス性肝炎、悪性腫瘍、甲状腺機能異常が知られている。また、減少する疾患としては、果糖不耐症、Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ病が知られている。

また、アルドラーゼＡは、腎臓癌細胞のマーカーとして提案されていた（特許文献１）。また、癌細胞の増殖によってアルドラーゼＡがアップレギュレーションすることも報告されている（特許文献２）。また、血液検査においてアルドラーゼの高値によって疑われる場合に大腸癌が挙げられているという記載も見られる（非特許文献１、２）。

しかし、これらの文献にもアルドラーゼＡが大腸癌細胞の検出のためのバイオマーカーになり得るという開示はない。また、これらの文献では、癌細胞の増殖によってアルドラーゼのアップレギュレーションがマーカーとしての表示となっている。一方、本発明に係るマーカーでは、大腸癌細胞の増殖は、アルドラーゼＡの実量の減少がマーカーとしての表示となり、上記の開示内容とは異なる。

アルドラーゼはＡ型、Ｂ型、Ｃ型の３つのアイソザイムを持つことが知られている。血液検査のアルドラーゼはこの３つの型の総量で評価されている。しかも通常血液検査におけるアルドラーゼの検出は、酵素活性による評価が行われている。

したがって、実量の変化はなくても癌細胞によってアルドラーゼの酵素活性が高くなっている場合は、高値として検出される。つまり、従来は、アルドラーゼの上昇はどの型の上昇によるものであったのか、また実量の変化はどうだったのかといった点については、不明であった。

今回発明者らは、大腸癌細胞が増殖すると、大腸癌細胞が存在していた溶媒（試料）中のアルドラーゼＡの実量が減少することを見出し、本発明を完成するに至った。

よって、本発明に係る大腸癌マーカーとは、アルドラーゼＡからなる大腸癌マーカーである。

アルドラーゼＡは、大腸癌細胞の増殖によって、（酵素活性ではなく）実量が減少する。このような知見に基づく大腸癌マーカーはかつて存在しなかったので、大腸癌細胞を検出するための精度の高いマーカーとなり得る可能性がある。

ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織の写真である。大腸癌ＦＦＰＥ組織を用いたショットガンプロテオミクスを実施した結果同定されたタンパク質を癌部、非癌部の区別で分類したベン図である。スペクトラルカウントに基づいた非標識半定量法の結果を示すグラフである。ＤＡＶＩＤを使用して、癌部で発現が変動していたタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析の結果である。アルドラーゼＡ、シクロフィリンＡ、アネキシンＡ２の大腸癌組織における定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。アルドラーゼＡの免疫組織染色の写真である。シクロフィリンＡの免疫組織染色の写真である。アネキシンＡ２の免疫組織染色の写真である。アルドラーゼＡ、シクロフィリンＡ、アネキシンＡ２のｍＲＮＡ量を示すグラフである。

以下に本発明に係る大腸癌マーカーについて図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。

本発明に係る大腸癌マーカーはアルドラーゼＡから構成される。大腸癌マーカーの検出は、適切に採取された細胞が存在していた溶媒（試料）中のアルドラーゼＡの量を測定することで行われる。「測定する」とは「分析する」といってもよい。この試料はヒトから採取されたものを用いることができる。つまり、試料としては、血液等の体液が好適に利用できる。しかし、尿、糞便、唾液などでも利用できる。

発明者らの検討によれば、同条件で測定した時、正常細胞は、アルドラーゼＡを細胞外に分泌するが、大腸癌細胞は、細胞内ではアルドラーゼＡを発現しているものの、細胞外には分泌しない（検出限界以下）。つまり、大腸癌細胞でのアルドラーゼＡの分泌低下（または分泌抑制）は、大腸癌細胞の存在を示す実質的な特異的マーカーとなる。

したがって、本発明に係る大腸癌マーカーは、被験者体液（試料）において、アルドラーゼＡが、通常体液に存在する量より低値を示した場合には、その被験者は大腸癌に羅患している可能性を示唆するものと判断する。また、その試料中には、大腸癌細胞が存在していた可能性を示唆するものと判断するといってもよい。

また、試料中のアルドラーゼＡの実量を測定し、通常体液に存在する量と比較することは、試料提供した被験者が大腸癌に羅患している、若しくは被験者の体内に大腸癌細胞が存在すると判断するための指標となるデータを収集する方法といえる。また、このような手順は大腸癌マーカーを分析する方法を構成しているといえる。

なお、アルドラーゼＡは、健常人の血清中には１７１±３９ｎｇ／ｍｌあるとされている。今後、より測定しやすい方法による新たな調査によって、この値は多少変化するかもしれない。ここでは、将来の測定方法の変化によって変更されるかもしれない値を含め、通常体液中に存在するアルドラーゼＡの存在量を「基準量」と呼ぶ。

また、アルドラーゼＡの実量とは、酵素活性から見た値（Ｕ／Ｌ）ではなく、試料中のアルドラーゼＡの実量（ｎｇ／ｍｌ）をいう。アルドラーゼＡの実量は、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）だけでなく、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ）による検出若しくは液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）などで計測することができる。

以下に、本発明に係る大腸癌マーカーをＦＦＰＥ大腸癌組織を用いたショットガンプロテオミクスによって見出した大腸癌マーカーについて説明する。

以下の実験において、グアニジン塩酸塩、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＡ）は和光純薬社製のものを用いた。その他の試薬についてはシグマ社製を用いた。

＜大腸癌組織及び患者＞
本実施例で使用した大腸癌組織は、２０１１年に日本医科大学付属病院で外科手術を受けた１０名の大腸癌患者のものを使用した。全ての患者は、術前に化学療法や放射線治療を受けておらず、大腸炎や感染症などの炎症性疾患歴もない。病理診断及び進行度分類はＷＨＯの基準に従い実施した。本実施例はヘルシンキ宣言（２００８）に基づき実施されており、それぞれの患者から、大腸組織を以下の検討に使用することに対しての同意と理解を得ている。

＜ＦＦＰＥ組織からのタンパク質抽出＞
１０名の患者から得られた大腸癌ＦＦＰＥ組織を用いてプロテオーム解析を行うこととした。病理及び臨床情報は表１に示す。

なお、表１中「ＴｉｓＮ０Ｍ０」の「Ｔｉｓ」は、Ｔｕｍｏｒｉｎｓｉｔｕのことで、癌細胞が粘膜内に留まっており、粘膜下層にまで及んでいない状態を表す。

ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色による組織学的評価の後、癌部と正常構造を保っている非癌部とに分離した。薄切した組織（１０μｍ）は、キシレン中で脱パラフィンした後、アルコール中（１００％→９０％→８０％→７０％）で再水和した。Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで染色後、癌部と非癌部を顕微鏡観察下、マニュアルで切除した（図１：後に説明する。）。

過去の報告に基づき、ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（６Ｍｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ，４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．２，６５ｍＭＤＴＴ）を用いて、これらの部位よりタンパク質を抽出した。なお、タンパク質の抽出のより具体的な手順は、以下の文献に基づいた。得られたタンパク質の濃度はブラッドフォード法にて測定した。

Ｘ．Ｊｉａｎｇ，Ｓ．Ｆｅｎｇ，Ｒ．Ｔｉａｎ，Ｍ．Ｙｅ，Ｈ．Ｚｏｕ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｓｈｏｔｇｕｎｐｒｏｔｅｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄｔｉｓｓｕｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｐｒｏｔｅｏｍｅｒｅｓｅａｒｃｈ，６（２００７）１０３８−１０４７．

＜液中トリプシン消化＞
Ｂｌｕｅｍｌｅｉｎらの方法に基づき、液中消化を実施した。それぞれの試料より得られた１０μｇのタンパク質を４５ｍＭＤＴＴ及び２０ｍＭＴＣＥＰにより還元した後、１００ｍＭＩＡＡでアルキル化を行った。アルキル化後、プロテオミクスグレードのトリプシン（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、３７℃、２４時間インキュベートすることで試料の酵素消化を行った。得られた消化産物をＰｅｐＣｌｅａｎＣ−１８ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して脱塩を行った。

なお、Ｂｌｕｅｍｌｅｉｎらの方法は、以下の文献を参照した。
Ｋ．Ｂｌｕｅｍｌｅｉｎ，Ｍ．Ｒａｌｓｅｒ，Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌｅｘｔｒａｃｔｓｂｙｔａｒｇｅｔｅｄｌａｂｅｌ− ａｎｄｓｔａｎｄａｒｄ−ｆｒｅｅＬＣ−ＭＳ／ＭＳ，Ｎａｔｕｒｅｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，６（２０１１）８５９−８６９．

＜ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析＞
約２μｇの精製したペプチドをＨＴＳＰＡＬオートサンプラー（ＣＴＣＡｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｚｗｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、Ｌ−ｔｒａｐカラム（ＣｈｅｍｉｃａｌｓＥｖａｌｕａｔｉｏｎａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に注入した後、逆相Ｃ１８−ｃｏｌｕｍｎ（Ｚａｐｌｏｕｓｃｏｌｕｍｎ α，３−μｍｄｉａｍｅｔｅｒｇｅｌｐａｒｔｉｃｌｅｓａｎｄ１００Å ｐｏｒｅｓｉｚｅ，０．１ × １５０ｍｍ；ＡＭＲ）を使用したＡｄｖａｎｃｅ−ｎａｎｏＵＨＰＬＣシステム（ＡＭＲＩｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で分離を行った。

移動相にはｓｏｌｕｔｉｏｎＡ（０．１％ギ酸ｉｎ水）及びｓｏｌｕｔｉｏｎＢ（アセトニトリル）を用い、流速５００ｎＬ／ｍｉｎで、溶離液組成を５％Ｂから３５％Ｂまで、１２０分間で連続的に変化させた。溶出してきたペプチドは、ａｍａＺｏｎＥＴＤイオントラップ型質量分析計（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて測定した。

得られた質量分析のデータは、Ｍａｓｃｏｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ＿２．３．０１；ＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を用いてＳｗｉｓｓＰｒｏｔのＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓのデータベースに対して検索を行った。検索の条件は次の通りに行った。

酵素：トリプシン；質量誤差：±０．５Ｄａ及びＭＳ／ＭＳ誤差：±０．５Ｄａ；修飾：システインのカルバミドメチル化；メチオニンの酸化、アミノ基のフォルミル化（リジン、アルギニン、Ｎ末）

＜スペクトラルカウント＞
Ｌｏｇ_２スケールに基づいたタンパク質発現量の変動値をスペクトラルカウントに基づいたＲｓｃ値として計算した。

なお、Ｒｓｃ値については、以下の文献を参照した。
Ｗ．Ｍ．Ｏｌｄ，Ｋ．Ｍｅｙｅｒ−Ａｒｅｎｄｔ，Ｌ．Ａｖｅｌｉｎｅ−Ｗｏｌｆ，Ｋ．Ｇ．Ｐｉｅｒｃｅ，Ａ．Ｍｅｎｄｏｚａ，Ｊ．Ｒ．Ｓｅｖｉｎｓｋｙ，Ｋ．Ａ．Ｒｅｓｉｎｇ，Ｎ．Ｇ．Ａｈｎ，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇｈｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｓｈｏｔｇｕｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＭＣＰ，４（２００５）１４８７−１５０２．

また、相対発現量値（ＮＳＡＦ）も計算した。癌部で発現量が２倍以上変動しているものを候補タンパク質とすることとした。即ち、Ｒｓｃ値が＞１または＜−１を示したものである。

なお相対発現量値（ＮＳＡＦ）については、以下の文献を参照した。
Ｂ．Ｚｙｂａｉｌｏｖ，Ｍ．Ｋ．Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｌ．Ｆｌｏｒｅｎｓ，Ｍ．Ｐ．Ｗａｓｈｂｕｒｎ，Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｒｅｌａｔｉｖｅａｂｕｎｄａｎｃｅｒａｔｉｏｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｐｅｐｔｉｄｅｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓａｎｄｓｐｅｃｔｒｕｍｃｏｕｎｔｉｎｇｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｉｎｇ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７７（２００５）６２１８−６２２４．

＜バイオインフォマティクス＞
同定された候補タンパク質の機能分類についてＤａｔａｂａｓｅｆｏｒＡｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ）ｖｅｒｓｉｏｎ６．７（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／ｈｏｍｅ．ｊｓｐ）を用いて実施した。

なお、この実施に際しては以下の文献を参照した。
Ｇ．Ｄｅｎｎｉｓ，Ｊｒ．，Ｂ．Ｔ．Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ａ．Ｈｏｓａｃｋ，Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｇａｏ，Ｈ．Ｃ．Ｌａｎｅ，Ｒ．Ａ．Ｌｅｍｐｉｃｋｉ，ＤＡＶＩＤ：ＤａｔａｂａｓｅｆｏｒＡｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇｅｎｏｍｅｂｉｏｌｏｇｙ，４（２００３）Ｐ３．

＜定量ＲＴ−ＰＣＲ＞
大腸癌ＦＦＰＥ組織からＲＮｅａｓｙＦＦＰＥＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡ抽出を行った。また、培養大腸癌細胞からはＧｅｎＥｌｕｔｅＭａｍｍａｌｉａｎＴｏｔａｌＲＮＡＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて抽出した。

ＦＦＰＥ組織から得られたＲＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＶＩＬＯｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔを用いて、培養大腸癌細胞から得られたＲＮＡはＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙｃＤＮＡＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｋｉｔを用いて、製品のプロトコール通りにｃＤＮＡ合成を行った。

アルドラーゼＡ（ＡｌｄｏｌａｓｅＡ）、シクロフィリンＡ（ＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＡ）及びアネキシンＡ２（ＡｎｎｅｘｉｎＡ２）の発現量を調べるため、定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を７５００ｓｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて実施した。

プライマーとＴａｑＭａｎプローブはＴａｑＭａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙのａｌｄｏｌａｓｅＡ（Ｈｓ００７６５６２０＿ｍ１）、ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＡ（Ｈｓ０４１９４５２１＿ｓ１）、ａｎｎｅｘｉｎＡ２（Ｈｓ００７４３０６３＿ｓ１）及び１８ＳｒＲＮＡ（Ｈｓ０３９２８９９０＿ｇ１）を用いた。定量結果は、内因性コントロールとの相対値である、標的／１８ＳｒＲＮＡとして表記している。

＜免疫組織染色＞
パラフィン包埋薄切組織（３μｍ）を用いて免疫組織染色を行った。アルドラーゼＡ及びシクロフィリンＡの染色には、ＨｉｓｔｏｆｉｎｅＳｉｍｐｌｅＳｔａｉｎＭＡＸ−ＰＯ（Ｒ）ｋｉｔ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用い、アネキシンＡ２には、ＨｉｓｔｏｆｉｎｅＳｉｍｐｌｅＳｔａｉｎＭＡＸ−ＰＯ（Ｍ）ｋｉｔ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）を用いた。

シクロフィリンＡとアネキシンＡ２については、脱パラフィン後、切片をクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１２１℃、１５分間オートクレーブ処理を行った。また、内因性のペルオキシダーゼ活性を阻害するために、０．３％過酸化水素含有メタノール中で３０分間インキュベートした。

次に、組織切片を抗−ＡＬＤＯＡ抗体（１：１５０ｄｉｌｕｔｉｏｎ；ＡｔｌａｓＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）、抗−ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＡ抗体（１：１５０ｄｉｌｕｔｉｏｎ；ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）、または抗−ａｎｎｅｘｉｎＡ２抗体（１：３００ｄｉｌｕｔｉｏｎ；ＬｉｆｅＳｐａｎＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）と４℃で１６時間反応させた。

結合した抗体をｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを基質としてＳｉｍｐｌｅＳｔａｉｎＭＡＸ−ＰＯ（Ｒ）またはＳｉｍｐｌｅＳｔａｉｎＭＡＸ−ＰＯ（Ｍ）試薬と反応させ検出した。その後、切片をＭａｙｅｒ’ｓｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで染色した後、２名の研究者が盲検下個別に全ての組織切片の評価を行った。

切片は、強度（０，未染色；１，弱；２，中；３，強）及び陽性上皮細胞の割合（０，０−５％；１，６−２５％；２，２６−５０％；３，５１−７５％；４，７６−１００％）の両方をスコア化し、それぞれの合算値を組織のスコアとした。

＜培養大腸癌細胞＞
培養大腸癌細胞であるＤＬＤ−１，ＳＷ４８０及びＳＷ６２０と正常大腸上皮細胞であるＣＣＤ８４１ＣｏＮは、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入した。全ての細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０で５％ＣＯ_２条件下で培養した。

＜タンパク質抽出＞
大腸癌細胞を１００−ｍｍディッシュに５×１０^５個／ディッシュで播種した後、培養液中で培養した。７２時間後、ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（７Ｍｕｒｅａ，２Ｍｔｈｉｏｕｒｅａ，５％ＣＨＡＰＳ，ａｎｄ１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で溶解し、タンパク質溶液を得た。また、細胞外に分泌されたタンパク質を解析するため、７２時間後の培養液を回収した。

＜ウェスタンブロット＞
タンパク質溶液または培養液を還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写を行った。膜は、抗−ａｎｎｅｘｉｎＡ２抗体，抗−ａｌｄｏｌａｓｅＡ抗体または抗−ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＡ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）と４℃で一晩反応させた。

その後、膜を洗浄し、ＨＲＰ−結合抗−ウサギＩｇＧ抗体（ＡｍｅｒｉｃａｎＱｕａｌｅｘ，ＳａｎＣｌｅｍｅｎｔｅ，ＣＡ）と反応させた。洗浄後、化学発光試薬と反応させ、ｍｙＥＣＬＩｍａｇｅｒｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で検出を行った。次に、等量のタンパク質を反応させていたかを確認するために、同じ膜中に存在するβ−ａｃｔｉｎの検出を行った。全てのウェスタンブロットは３回実施した。

＜統計解析＞
全てのデータは平均±標準誤差で示している。２グループ間のデータは、対応のないｔ検定で比較を行った。＊Ｐ＜０．０５または、＊＊Ｐ＜０．００１を有意であると考えた。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍｖｅｒｓｉｏｎ５（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。

＜結果＞
１．大腸癌組織の癌部と非癌部に発現するタンパク質の同定
癌の進行に伴い発現するタンパク質を調べるため、大腸癌ＦＦＰＥ組織を用いたショットガンプロテオミクスを実施した。ＦＦＰＥ組織から癌部と非癌部を分離するために、マニュアルでの切除を行った。また、タンパク質発現は、細胞だけでなく周囲の間質に発現しているタンパク質も解析を行った。

図１にその組織の写真を示す。図１（ａ）は、切除を行う前の非癌部の写真であり、図１（ｂ）は、切除を行う前の癌部の写真である。また、図１（ｃ）は、切除後の非癌部の写真であり、図１（ｄ）は切除後の癌部の写真である。なお、切片はヘマトキリン染色を行った。

図２には同定されたタンパク質のベン図を示している。癌部だけに発現しているタンパク質は、１０６種類であり、非癌部だけに発現しているタンパク質は４４種類であった。癌部および非癌部の両方に発現しているタンパク質は９８種類あった。

２．＜大腸癌組織の癌部と非癌部に発現しているタンパク質の半定量解析＞
次に、癌部で発現量が変動しているタンパク質を同定するために、スペクトラルカウントに基づいた非標識半定量法を実施した。結果を図３に示す。図３（ａ）は、Ｒｓｃ値の結果であり、図３（ｂ）は、ＮＳＡＦ値の結果である。左か右に行くほど癌部で発現が上昇しているようになるように、Ｒｓｃ値を対応するタンパク質名に対してプロットした（横軸）。なお、横軸のタンパク質名は一部を除き省略している。

図３（ａ）において、縦軸はＲｓｃ値である。正と負のＲｓｃ値は、それぞれ癌部において発現量が増加または減少していることを表している。

図３（ｂ）は、ＮＳＡＦ値（棒グラフ）を対応するタンパク質名に対してプロットしており（Ｘ軸）、それぞれ癌部におけるＮＳＡＦ値（正値）と非癌部におけるＮＳＡＦ値（負値）とした。高い正または負のＲｓｃ値を示したタンパク質は、ＣＲＣの早期発見マーカーとしてのポテンシャルがあると考えられる。

全部で８４種類の癌部で発現量が変動しているタンパク質が同定された。結果を表２および表３に示す。発現量が上昇している代表的なタンパク質の中には、腫瘍マーカーとして知られているヒートショックプロテイン（ＨＳＰ６０：８１番）やＣＥＡ（７６番）が含まれていた。一方、ハウスキーピングのタンパク質として知られているヒストンＨ４やβ−アクチンなどの発現は変動していなかった。

なお、アルドラーゼＡ、シクロフィリンＡ、アネキシンＡ２は、いずれも表３の６４番、５９番、６２番である。シクロフィリンＡは、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼＡ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌｃｉｓ−ｔｒａｎｓｉｓｏｍｅｒａｓｅＡ）と記載されている。

３．＜癌部で発現が変動しているタンパク質の機能分類＞
表３、表４で大腸癌マーカーとして可能性のあるタンパク質が挙げられたが、血液中で検出できなければ、マーカーとなりえない。そこで、ＤＡＶＩＤを使用して、癌部で発現が変動していたタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析を行った。結果を図４に示す。

図４は、同定されたタンパク質の細胞成分分類に対するＧＯ解析により割り当てられた細胞成分分類のカテゴリーを表示している。縦軸は相対存在率（％）であり、横軸はタンパク質の分類名である。細胞成分での分類の結果（図４）より、大腸癌患者の血液中で検出できる可能性がある、「細胞外基質」に分類された２１種類のタンパク質に注目することとした。これらのタンパク質を表４に示す。

なお、ＤＡＶＩＤは、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ（ＮＩＡＩＤ）によって提供されるデータベースである。

４．＜大腸癌組織の癌部と非癌部におけるアルドラーゼＡ、シクロフィリンＡ及びアネキシンＡ２のｍＲＮＡ発現の解析＞
Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅａｌｄｏｌａｓｅＡ（ａｌｄｏｌａｓｅＡ：アルドラーゼＡ）、ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌｃｉｓ−ｔｒａｎｓｉｓｏｍｅｒａｓｅＡ（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＡ：シクロフィリンＡ）及びａｎｎｅｘｉｎＡ２（アネキシンＡ２）は、癌部で発現が上昇しているため（図３）、診断マーカー候補として分泌されている可能性がある。大腸癌部で発現が上昇していることを確認するため、大腸癌組織を用いて定量ＰＣＲを行った。結果を図５に示す。その結果、これらのタンパク質のｍＲＮＡ発現量は、非癌部に比べて癌部で有意に上昇していた。

図５を参照して、図５（ａ）はＡｌｄｏｌａｓｅＡ（アルドラーゼＡ）、図５（ｂ）はＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＡ（シクロフィリンＡ）、図５（ｃ）はＡｎｎｅｘｉｎＡ２（アネキシンＡ２）の結果である。いずれのグラフも横軸は非癌部（ｎｏｎ−ｃａｎｃｅｒ）と癌部（ｃａｎｃｅｒ）を表し、縦軸は、ｍＲＮＡの発現量（単位なし）である。なお、ｍＲＮＡの発現量は１８ＳｒＲＮＡ量で正規化してある。いずれのタンパク質も癌部において発現量が上昇していた。なお、「＊」はＰ値＜０．０５であり、「＊＊」はＰ値＜０．００１を表す。

５．＜大腸癌組織の癌部と非癌部におけるアルドラーゼＡ、シクロフィリンＡおよびアネキシンＡ２の免疫組織染色＞
次に３つの候補タンパク質の発現について免疫染色を実施した。結果を図６、図７、図８に示す。

図６はアルドラーゼＡの免疫組織染色の写真（図６（ａ）および図６（ｂ））と免疫組織染色のスコア（図６（ｃ））である。図６（ａ）および（ｂ）はそれぞれ（ａ−１）、（ａ−２）と（ｂ−１）、（ｂ−２）がある。（ａ−２）および（ｂ−２）は、（ａ−１）および（ｂ−１）の一部拡大写真である。

また、図６（ｃ）は横軸に非癌部（ｎｏｎ−ｃａｎｃｅｒ）と癌部（ｃａｎｃｅｒ）であり、縦軸が免疫染色のスコアである。図６（ｃ）で示すように、癌部においてａｌｄｏｌａｓｅＡが強く発現していた。なお、「＊」はＰ値＜０．０５を表す。

図７はシクロフィリンＡの免疫組織染色の写真（図７（ａ）および図７（ｂ））と免疫組織染色のスコア（図７（ｃ））である。図７（ａ）および（ｂ）はそれぞれ（ａ−１）、（ａ−２）と（ｂ−１）、（ｂ−２）がある。（ａ−２）および（ｂ−２）は、（ａ−１）および（ｂ−１）の一部拡大写真である。

また、図７（ｃ）は横軸に非癌部（ｎｏｎ−ｃａｎｃｅｒ）と癌部（ｃａｎｃｅｒ）であり、縦軸が免疫染色のスコアである。図７（ｃ）で示すように、癌部においてｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＡが強く発現していた。なお、「＊＊」はＰ値＜０．００１を表す。

図８はアネキシンＡ２の免疫組織染色の写真（図８（ａ）および図８（ｂ））と免疫組織染色のスコア（図８（ｃ））である。図８（ａ）および（ｂ）はそれぞれ（ａ−１）、（ａ−２）と（ｂ−１）、（ｂ−２）がある。（ａ−２）および（ｂ−２）は、（ａ−１）および（ｂ−１）の一部拡大写真である。

また、図８（ｃ）は横軸に非癌部（ｎｏｎ−ｃａｎｃｅｒ）と癌部（ｃａｎｃｅｒ）であり、縦軸が免疫染色のスコアである。図８（ｃ）で示すように、癌部においてアネキシンＡ２が強く発現していた。なお、「＊＊」はＰ値＜０．００１を表す。

以上のように、免疫染色の結果、３つの候補タンパク質はいずれも、非癌部に比べて癌部で有意に高く発現していた。なお、正常粘膜の表層の一部においてこれらの候補タンパク質が強く発現していたため、非癌部の免疫染色スコアは、平均が３または４であった。

６．＜培養大腸癌細胞におけるアルドラーゼＡ、シクロフィリンＡ及びアネキシンＡ２の発現＞
候補タンパク質が、バイオマーカーとして適しているかを調べるため、培養大腸癌細胞における候補タンパク質のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を定量ＰＣＲとウェスタンブロットで確認した。

図９において、図９（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、アルドラーゼＡ、シクロフィリンＡ、及びアネキシンＡ２のｍＲＮＡ量を表す。各図において、縦軸はそれぞれのタンパク質のｍＲＮＡ量（単位なし）であり、横軸は、細胞種類である。なお、縦軸は１８ＳｒＲＮＡ量で正規化してある。すでに説明したように、ＣＣＤ８４１は正常大腸上皮細胞であり、ＤＬＤ−１、ＳＷ４８０及びＳＷ６２０は、培養大腸癌細胞である。

図９（ａ）〜（ｃ）でわかるように、今回検討した培養細胞全てで候補タンパク質は発現しており、またその発現量は正常細胞に比べて大腸癌細胞で全体的に上昇している傾向が見られた。なお、「＊」はＰ値＜０．０５であり、「＊＊」はＰ値＜０．００１を表す。

図９（ｄ）および図９（ｅ）は、ウェスタンブロットの写真である。図９（ｄ）は細胞抽出液から得た結果であり、図９（ｅ）は培養液から得た結果である。図９（ｄ）は上からアルドラーゼＡ、シクロフィリンＡ及びアネキシンＡ２であり、一番下がβ−ａｃｔｉｎである。β−ａｃｔｉｎはコントロールとして示した。

各写真の横方向には、細胞種類を示した。ＣＣＤ８４１は正常細胞であり、その他は癌細胞である。アルドラーゼＡは、いずれの細胞においても、黒い線状の影（免疫反応産物）が確認できる。シクロフィリンＡ及びアネキシンＡ２も、いずれの細胞においても、黒い線状の影が確認できる。β−ａｃｔｉｎは内因性コントロールとして用い、全ての試料で同一量のタンパク質が泳動された事を確認した。したがって、いずれのタンパク質も細胞のｍＲＮＡの発現量と類似しているといえる。

図９（ｅ）は、培養液から得たウェスタンブロットの結果である。アルドラーゼＡは、３つの大腸癌細胞の培養液では、黒い影は認められなかった。しかし、正常大腸上皮細胞では、黒い影が認められた。つまり、アルドラーゼＡは、正常細胞では、細胞外に分泌されるが、大腸癌細胞では、細胞外に分泌されていないといえる。

シクロフィリンＡは、全ての細胞において、黒い影は認められなかった。つまり、シクロフィリンＡは、細胞外には分泌されないタンパク質である。

アネキシンＡ２は正常細胞とＳＷ４８０（大腸癌細胞）において黒い影が認められた。つまり、アネキシンＡ２は、細胞外に分泌される場合とされない場合がある。

以上のように検討した大腸癌細胞全てでａｌｄｏｌａｓｅＡ（アルドラーゼＡ）のｍＲＮＡ及びタンパク質は正常細胞における発現量より有意に多く発現していた。一方、正常細胞では培養液中でもａｌｄｏｌａｓｅＡの存在が認められたのに対して、３つの大腸癌細胞の培養液中では存在が認められなかった（図９（ｅ））。

これらのことは、大腸癌の進行に伴う遺伝子異常の蓄積などによりａｌｄｏｌａｓｅＡの細胞外への分泌が抑制されたことを示唆している。それゆえ、血中におけるａｌｄｏｌａｓｅＡの実量の低下は、大腸癌の早期発見のためのバイオマーカーとして有用であるといえる。

本発明に係る大腸癌マーカーは、大腸癌細胞の検出に好適に利用することができる。

Claims

大腸癌マーカーとしてのアルドラーゼＡの生体試料中における実量を測定する工程と、
アルドラーゼＡの基準量と、前記実量を比較する工程を含む大腸癌マーカーの分析方法。
アルドラーゼＡからなる大腸癌マーカー。