CN101611315A - 用于对抗癌试剂敏感的癌症的生物标记物及其用途 - Google Patents

Abstract

本文公开了果糖－二磷酸醛缩酶A(ALDOA)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、过氧化物氧还蛋白1(PRDX1)、切丝蛋白1和组蛋白H4作为生物标记物，用于评价抗癌试剂功效和预测癌细胞敏感性。

Description

用于对抗癌试剂敏感的癌症的生物标记物及其用途

相关申请的交叉引用

本申请对2006年10月23日提交的美国序列号60/862,527要求优先权，通过引用将其整体并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明在政府支持下完成，得到国立卫生研究院(National Institute ofHealth)资金号P50 CA83591、P5089019和P20 CA101955的资助。政府具有本发明的某些权利。

背景技术

血清肿瘤相关蛋白的表达谱是在检测早期阶段的癌症以及监测病情发展，并确定治疗方法中是有效的生物标记物。药物敏感的标志蛋白是选择哪些病人作为药物有预期治疗效果的关键因子。目前，还没有可用于评价DR5介导肿瘤细胞凋亡过程中的癌细胞早期反应的血清生物标记物。

在许多抗癌治疗的病例中，生物标记物是针对个体病例治疗预期疗效的关键因子。生物标记物可以在治疗前预测预期治疗效果，或用于预测在开始治疗后的初级阶段对药物的治疗的反应。这些生物标记物有利于选择合适的对象进行治疗。同时也有利于挑选出对治疗方案没有预期临床效果的人不进行相关的治疗以减少药物的副作用并节约治疗成本。因此，发现可预测的标志物在抗癌药物研发中的必要性也变得尤为突出。然而，尽管已经发现了许多有效的癌症治疗方法，却只发现了少数一些生物标记物可以用于决定治疗方案。例如，雌激素受体和/或孕激素受体的表达在乳腺癌中可以预测他莫昔芬(tamoxifen)的治疗反应。过度表达HER2/neu(erbB2)原癌基因的乳腺癌患者对人为的抗HER2单克隆抗体曲妥单抗(赫赛汀)的治疗反应更可能有好的疗效。

肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)，也叫Apo2L，是肿瘤坏死因子亚家族的成员。他可以触发多种转化细胞株的凋亡。已经发现了TRAIL蛋白的五个受体。包括：两个转换凋亡信号的死亡受体DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2，即细胞凋亡信号的传感器；以及3个抑制TRAIL诱导细胞凋亡的诱饵受体DcR1(TRAIL-R3)，DcR2(TRAIL-R4)和骨保护素(osteoprotegrin)。DR4和DR5含有用于诱导细胞凋亡所必需的细胞质内的死亡结构域。在TRAIL与DR4和/或DR5结合以后，这些受体通过招募Fas蛋白相关的死亡结构域和胱冬酶-8蛋白形成诱导凋亡信号复合体(death-inducing signaling complex)起始细胞凋亡。然后激活胱冬酶效应蛋白酶级联效应并最终导致细胞死亡。

尽管TRAIL的mRNA在许多人的正常组织中都是连续正常表达的，但是它只能由到癌变细胞或者转化的细胞凋亡，却不能诱导正常细胞发生凋亡。这就暗示着可能存在某些机制保护正常的细胞逃离TRAIL所诱导的细胞凋亡。在小鼠和非人的灵长类动物中的预临床研究已经发现了重组的可溶性TRAIL在许多人类肿瘤的异种移植模型中具有抗肿瘤效应并且对于正常的组织没有明显的毒性。但是，另外的报道发现某些形式的重组可溶性TRAIL可以在体外诱导人正常肝细胞凋亡。尽管这可能是由于重组可溶性TRAIL的形式不同，但是它暗示着TRAIL可能对于人的肝脏有一定的毒性。抗人DR5单克隆抗体TRA-8和人造形式的TRA-8在体外和体内均能够在对肝细胞没有毒性的情况下诱导肿瘤细胞凋亡。然而，也发现了TRA-8诱导细胞凋亡在不同癌细胞中有不同程度的敏感性。

发明概述

如本文体现及广泛描述的：本公开内容涉及用于评价抗癌疗法或治疗的功效的生物标记物。此外，提供了用于评价DR5介导的细胞凋亡过程中的肿瘤细胞反应的生物标记物。提供了预测癌细胞对治疗剂的敏感性的方法；预测治疗剂的功效以及通过检测诸如磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、果糖二磷酸醛缩酶A(ALDOA)、过氧化物氧还蛋白1(PRDX1)、切丝蛋白素(cofilin)1(COF1)和组蛋白H4(H4)等生物标记物来确定治疗剂的有效剂量。

公开的方法和组合物的其它优点，将在下面的说明书中部分地描述，并可以从说明书中部分地理解，或可以通过实践公开的方法和组合物来学习。借助于在所附权利要求书中特别指出的要素和组合，可以实现和获得公开的方法和组合物的优点。应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述都仅仅是示例性的和解释性的，且不限制要求保护的发明。

附图简述

图1表示TRA-8对COLO 205细胞的影响。不处理COLO 205细胞(A)，或使用终浓度为10(B)、100(C)或1000ng/ml(D)的无血清培养基处理COLO205细胞。培养上清液通过双向凝胶电泳进行分析，然后使用

Ruby(Molecular Probes、Carlsbad、California)进行染色。分子量标记物的位置显示于每幅图的左侧。每幅图的顶部显示等电点范围。圆圈表示经分析的蛋白。

图2显示TRA-8对结肠癌细胞的培养上清液中候选生物标记物的影响。图2A表示不用TRA-8处理或者用终浓度为1、10、100或1000ng/ml的TRA-8在37℃处理24小时的COLO 205、WiDr和HT-29细胞。细胞的成活力通过测定细胞ATP水平进行评价，并确定为相对于用作对照的未处理细胞的荧光值的百分比。每个点或者条分别代表各个三次重复实验的平均值和标准误差。图2B显示不用TRA-8处理或者用终浓度为1、10、100或1000ng/ml的TRA-8在37℃处理24小时的COLO 205、WiDr和HT-29细胞。培养上清液使用SDS-PAGE凝胶电泳进行分析，然后使用抗-ALDOA、抗-COF1、抗-组蛋白H4、抗-PGK1或抗-PRDX1抗体进行免疫印迹。图的底部示出了细胞的成活力。

图3显示TRA-8对乳腺癌细胞培养上清液中候选生物标记物的影响。图3A显示不用TRA-8处理或者用终浓度为1、10、100或1000ng/ml的TRA-8在37℃处理24小时的2LMP和BT-474细胞。细胞成活力的检测如图2所述。图3B显示不用TRA-8处理或者用终浓度为1、10、100或1000ng/ml的TRA-8在37℃处理24小时的细胞。培养上清液使用图2B中所述的方法进行分析。图的底部示出了细胞的成活力。

图4显示TRA-8对肺癌细胞培养上清液中候选生物标记物的影响。图3A显示不用TRA-8处理或者用终浓度为1、10、100或1000ng/ml的TRA-8在37℃处理24小时的NCI-H2122和A-427细胞。细胞成活力的测定如图2所述。图2B显示不用TRA-8处理或者用终浓度为1、10、100或1000ng/ml的TRA-8在37℃处理24小时的细胞。培养上清液使用图2B中所述的方法进行分析。图的底部示出了细胞的成活力。

图5显示经TRA-8处理后细胞培养上清液中候选生物标记物变化的时间过程。图5A显不用TRA-8处理或者用终浓度为1μg/ml的TRA-8在37℃处理0、1、2、4、8和24小时的COLO 205(钻石形)、WiDr(正方形)、2LMP(三角形)和NCI-H2122细胞(交叉)。细胞成活力的测定如图2A所示。图5B显不用TRA-8处理或者用无血清培养基中终浓度为1μg/ml的TRA-8在37℃处理0小时(泳道(lanes)1、7、13和19)、1小时(泳道2、8、14和20)、2小时(泳道3、9、15和21)、4小时(泳道4、10、16和22)、8小时(泳道5、11、17和23)和24小时(泳道6、12、18和24)的COLO 205细胞(泳道1-6)、WiDr细胞(泳道7-12)、2LMP细胞(泳道13-18)和NCI-H2122细胞(泳道19-24)。培养上清液使用SDS-PAGE电泳进行分析，并进一步使用抗ALDOA、COF1、组蛋白H4、PGK1或PRDX1的抗体进行免疫印迹。

图6显示化疗剂对癌细胞的培养上清液中的候选生物标记物的影响。图6A显示使用单独培养基处理(条件1)、于含50μM CPT-11(条件2)、50μM奥沙利铂(条件3)或者1μM紫杉醇(条件4)的无血清培养基中37℃培养24小时(空心条)和48小时(实心条)的COLO 205、WiDr和hT-29细胞。细胞成活力的测定如图2A所述。细胞成活力分析使用ATPLite^TM分析试剂盒(PerkinElmer、Inc.、Waltham、MA)进行分析。每一柱和条分别代表各三次重复试验的平均值和标准误差。图6B显示使用单独培养基培养(泳道1、5、9、13、17和21)、含有50μM CPT-11(泳道2、6、10、14、18和22)、50μM奥沙利铂(泳道3、7、11、15、19和23)或者1μM紫杉醇(泳道4、8、12、16、20和24)的无血清培养基中37℃分别培养24小时(泳道1-12)和48小时(泳道13-24)的COLO205细胞(泳道1-4和13-16)、WiDr细胞(泳道5-8和17-20)以及HT-29细胞(泳道9-12和21-24)。培养上清液如图2B中描述，使用SDS-PAGE电泳进行分析，随后使用抗ALDOA、COF1、组蛋白H4、PGK1或PRDX1的抗体进行免疫印迹。

图7显示PRDX1和PGK1在人癌细胞系及组织中的表达。图7A显示PRDX1在癌细胞中表达的蛋白质印迹分析，图7B表示PGK1在癌细胞中表达的蛋白质印迹分析：将来自13种人癌细胞系的总细胞裂解物蛋白使用SDS-PAGE电泳进行分离，并用抗人PRDX1和PGK1的特异性单克隆抗体进行杂交印迹。图7A和7B中显示的泳道对应以下细胞系：泳道1，MDA231；泳道2，UL-3A；泳道3，UL-3C；泳道4，COLO205；泳道5，HT29；泳道6，SW480；泳道7，SW620；泳道8，SW116；泳道9，WiDR；泳道10，2-LMP；泳道11，BT474；泳道12，H2122；泳道13，A427。图7C显示PGK1在人卵巢癌组织中的免疫组化染色。人卵巢癌组织的石蜡切片使用抗PGK1的单克隆抗体进行染色。

图8显示在异种移植模型中，从TRA-8和CPT-11处理的COLO 205肿瘤释放候选生物标记物。图8A示出了TRA-8和CPT-11处理对带有COLO 205肿瘤的无胸腺裸鼠的效果。在第16天和20天给予裸鼠TRA-8(10mg/kg)。在第17天和21天给予裸鼠CPT-11(33mg/kg)。每个点和条分别代表未处理(钻石形)；用TRA-8处理(正方形)、CPT-11处理(三角形)或者TRA-8与CPT-11联合处理(环形)的各组肿瘤尺寸数据的平均值和标准误差。图8B显示从不用TRA-8处理(柱1)、使用TRA-8处理(柱2)、CPT-11处理(柱3)或者使用TRA-8和CPT-11联合处理(柱4)20天的带有肿瘤的裸鼠中获得的上清液检测候选生物标记物的分泌情况。血清中的PRDX1水平使用ELISA试剂盒检测A₄₅₀的吸收光获得。每个柱和条分别代表数据的平均值和标准误差。

发明详述

预测治疗反应的生物标记物是开发抗癌治疗必需的。如本文中所述，监测抗癌药物的效力导致预测治疗反应。双向凝胶电泳(2-DE)和质谱(MS)用于鉴定检测并预测癌症治疗效果的蛋白质。如本文所述，癌细胞应答治疗剂而释放出磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、果糖二磷酸醛缩酶A(ALDOA)、过氧化物氧还蛋白1(PRDX1)、切丝蛋白1(COF1)和组蛋白H4(H4)。这些候选生物标记物的释放与诸如CPT-11、奥沙利铂和紫杉醇等化疗剂的细胞毒性效应相关。此外，当向带有肿瘤的小鼠给予DR5激动剂和CPT-11两次后，通过单独使用DR5激动剂或者联合使用CPT-11明显提高血清中的PRDX1水平。本文鉴定和描述的蛋白组(protein set)包含用于检测和预测抗癌药物功效的生物标记物。

本文所公开的是生物标记物和用于识别和使用生物标记物的方法。生物标记物是指任何可分析的特点或组合物，其用于鉴定、预测或监测病症(例如：肿瘤或其他癌症，或缺乏)或治疗对象或样品中的所述病症。生物标记物是例如蛋白质或者蛋白质的组合，其存在、缺失或者相对量用于鉴定对象或样品的病症的状况或状态。在一个具体实例中，生物标记物是其在对象或样品中的相对浓度是癌细胞对于治疗剂敏感性的特征的蛋白质或者蛋白质组合。测定本文中所鉴定的生物标记物，以确定水平、表达、活性；或者检测变体(variants)。变体包括氨基酸或者核苷酸变体或者翻译后修饰变体。

本文公开了果糖二磷酸醛缩酶A的(ALDOA)作为预测癌细胞对于抗癌试剂的敏感性的生物标记物的用途。醛缩酶催化包括果糖代谢的中间体果糖-1-磷酸盐(F-1-P)等结构相关磷酸糖(structurally related sugar phosphates)的裂解。已经鉴定了该酶的三种异构体，即，醛缩酶A(从肌肉中分离)、醛缩酶B(从肝脏中分离)和醛缩酶C(从脑中分离)。醛缩酶A(果糖二磷酸醛缩酶(肌型醛缩酶))是普遍存在的一种糖酵解酶，它催化1，6-二磷酸果糖可逆裂解成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮。在胰腺癌细胞中，通过缺氧诱导因子-1(HIF-1)诱导醛缩酶的转录。醛缩酶A发现于发育中的胚胎中，它在成年肌肉中产生甚至更高的量。醛缩酶A在成年的肝脏，肾脏和肠道中的表达受到抑制，与醛缩酶C在脑和其它神经组织中的水平相似。对该基因的另路剪接产生多种编码相同蛋白质的不同转录物变体。无氧代谢相关基因Glut 1和醛缩酶A在组成型表达HIF-1α的肿瘤细胞中高度表达，使得这些细胞抵抗低氧和糖缺失诱导的凋亡。在应答缺氧时，癌细胞利用糖酵解酶生成ATP。通过显性失活的HIF-1α(dnHIF-1α)转染子取消Glut-1和醛缩酶AmRNA在缺氧时的增强表达，使得胰腺癌细胞易于发生缺氧或和糖饥饿诱导的细胞凋亡和生长抑制。相比于正常组织，ALDOA在肺癌和肝细胞肿瘤中过量表达，并在患者的血清中检测出。

本发明公开磷酸甘油酸激酶1(PGK1)作为预测癌细胞对抗肿瘤试剂敏感性的生物标记物的用途。磷酸甘油酸激酶1(PGK1)(也称作3-磷酸甘油酸1-磷酸转移酶)催化1，3-二磷酸甘油酸盐(1，3-diphosphoglycerate)向3-磷酸甘油酸盐(3-phosphoglycerate)的可逆性转化，生成一分子ATP。由于细胞外环境的氧化性质，通常认为分泌蛋白中的二硫键是惰性的。这一规则的例外是：肿瘤细胞分泌的还原酶还原在丝氨酸蛋白酶、纤溶酶中的二硫键。纤溶酶的还原引发kringle 5结构域的蛋白水解和肿瘤血管抑制剂血管抑制素的释放。新血管形成和血管生成对于肿瘤的扩散和转移是至关重要的。从纤维肉瘤细胞的条件培养基中分离的纤溶酶还原酶是糖酵解酶磷酸甘油酸激酶。重组磷酸甘油酸激酶具有与纤维肉瘤来源的蛋白相同的比活性。患有纤维肉瘤肿瘤的小鼠血浆含有的磷酸甘油酸激酶比没有肿瘤的小鼠多数倍。向患有的肿瘤小鼠给予磷酸甘油酸激酶导致血浆中血管抑制素水平的增加并且导致肿瘤血管分布和肿瘤生长速度的减少。磷酸甘油酸激酶不仅在糖酵解中发挥作用，而且通过肿瘤细胞分泌并作为二硫化物还原酶参与血管形成过程。然而，根据Daly等人，不认为血液中磷酸甘油酸激酶的水平与肿瘤的存在或程度有关(Daly EB等，Int.J.Biol.Markers 19(2)：170-22004)。HIF-1激活PGK 1的转录。发现与患者匹配的正常肾皮质相比，肾细胞癌中的PGK 1水平增加。从各种培养的癌细胞分泌PGK1，带有HT1080纤维肉瘤肿瘤的小鼠的血清中的PGK 1含量比没有肿瘤的小鼠高若干倍。

本发明公开过氧化物氧还蛋白1(PRDX1)作为预测癌细胞对抗肿瘤试剂敏感性的生物标记物的用途。过氧化物氧还蛋白1(PRDX1)是将细胞中的例如过氧化氢等氧化剂还原为无活性物质的过氧化物氧还蛋白家族的成员。由于PRDX1编码的蛋白的抗氧化性质及其在T-细胞抗病毒活性中的作用，因此认为该蛋白对细胞有保护作用。但是，PRDX1也可有助于癌细胞的增殖。该蛋白的表达水平与口腔鳞状细胞癌的肿瘤发展阶段相关；该蛋白在滤泡状甲状腺肿瘤但非乳头状甲状腺肿瘤中存在高表达。PRDX1由氧化应激诱导表达，并且在多数人细胞中组成型表达。在未转化和转化细胞中经血清刺激诱导该蛋白的表达。在甲状腺癌、乳腺癌、肺癌、恶性间皮瘤和非小细胞肺癌患者中观察到PRDX1的水平升高。

本发明公开切丝蛋白1(COF1)作为预测癌细胞对抗肿瘤试剂敏感性的生物标记物的用途。切丝蛋白是广泛分布的胞内肌动蛋白调节蛋白，其以pH依赖方式结合并解聚丝状肌动蛋白F(filamentous F-actin)并抑制单体肌动蛋白G的聚合。它涉及肌动蛋白-切丝蛋白复合体(actin-cofilin complex)从细胞质向细胞核的转位。COF1是肌动蛋白解聚因子/切丝蛋白的一种非肌肉同工型，其调节肌动蛋白聚合和解聚并切断肌动蛋白丝的小肌动蛋白结合蛋白。COF1广泛分布于多种组织。切丝蛋白活性通过多种机制(包括磷酸化)来调节。由于浸润T淋巴细胞表达切丝蛋白，观察到肾细胞癌中该蛋白的表达水平相比于与患者匹配的正常肾区段的水平增高。

本发明公开组蛋白H4作为预测癌细胞对抗肿瘤试剂敏感性的生物标记物的用途。组蛋白是负责真核细胞染色体纤维上的核小体的结构的基础核蛋白。核小体由大约146个DNA碱基对包绕组蛋白八聚体(包含四对核心组蛋白(H2A、H2B、H3和H4))组成。染色质纤维通过连接组蛋白H1与核小体之间的DNA相互作用进一步压缩形成更高级的染色质结构。当细胞发生死亡时，将核小体释放到血液循环中并检测到在血清或血浆中的量升高。与健康人相比，在多种实体瘤的血清或血浆中检测到循环核小体(circulating nucleosome)水平增高。此外，化疗或放疗之后观察到循环核小体的短时间增加。化疗期间，循环核小体在晚期非小细胞肺癌患者中的变化可以预测治疗反应。如Ono等人在J.Exp.Clin.Cancer Res.21(3)：377-82(2002)阐明，与非肿瘤黏膜相比，乙酰化组蛋白H4的表达水平在胃癌中降低。在非肿瘤上皮细胞和基质细胞的细胞核中都检测到乙酰化组蛋白H4，而乙酰化组蛋白H4的水平在胃癌和胃腺癌中降低。在临近癌的某些肠上皮化区域也发现了乙酰化组蛋白H4表达量的降低。乙酰化组蛋白H4的表达量降低与肿瘤的发展阶段、浸润深度以及淋巴结转移呈显著相关。因此，低水平的组蛋白乙酰化水平可能通过改变基因表达而与胃癌的发生和发展密切相关。

本文提供预测癌细胞对抗癌试剂的敏感性的方法，其包括使癌细胞与有效量的抗癌试剂接触，以及评价细胞对一种或多种本文公开的生物标记物的释放。体内或体外接触癌细胞。

相比于对照细胞，接触细胞对本文提供的生物标记物的释放增加显示癌细胞对该试剂敏感。“释放增加”是指与本底(native)或对照水平相比，细胞外可检测的生物标记物量的任何增加。因此，与本底或对照水平相比，所述增加是约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％增加或在其之间或更高的任何数量的增加。

例如，使从对象中活检出的癌细胞在体外培养基中接触抗癌试剂。测定培养基中存在或不存在本文所公开的生物标记物。这种测量与其他对照癌细胞或非癌细胞的结果以及使用其它的抗癌试剂的结果相比较。

任选评价异种移植模型中的生物标记物的释放。例如，将人组织移植到免疫缺陷的小鼠内。在用抗癌试剂处理前和/或处理后，测定体液中本文中公开的生物标记物的存在或不存在。

任选评价对象或者对象样品中的生物标记物的释放。测定组织(如或活检组织)或体液内本文公开的生物标记物的存在或不存在。用于评价本文公开的生物标记物的存在或不存在的体液包括但不限于血液、尿液、血清、眼泪、淋巴、胆汁、脑脊髓液、组织间液、水或玻璃体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液、精液、渗出液、分泌物和滑液(synovial fluid)。例如，测定对对象进行治疗之前和之后的血液或活检中生物标记物的水平。

活检是指取出用于诊断的组织样品。例如，活检来自癌或者肿瘤，包括来自从非正常区域或整个肿瘤中的组织样品。不同类型肿瘤的的非限制性清单包括：淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、何杰金氏病、髓细胞性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈部癌、肾癌、肺癌(如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、脑肿瘤(如神经母细胞瘤和神经胶母细胞瘤)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、宫颈癌、乳腺癌、肾癌、泌尿生殖道癌、食道癌、造血癌(hematopoietic cancers)、睾丸癌或结肠和直肠癌。

本文所用的“对象”是脊椎动物，更具体是哺乳动物(例如人、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人灵长类动物、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼、鸟类或爬行类或两栖类动物。该术语没有指出特定的年龄和性别。因此，成年和新生对象(以及胎儿)，不论雄性还是雌性都有意涵盖在内。如本文所用的，“患者”和“对象”互换使用，指只患有疾病或病症的对象。术语“患者”或“对象”包括人和兽类对象。

所公开的方法涉及所公开的生物标记物从癌细胞中的释放与相同的生物标记物在对照样品中的释放之间的比较。应理解，对照样品是同时运行的非肿瘤细胞，或者通过分析一个或多个非肿瘤细胞并收集生物标记物数据产生的标准物。因此，对照样品任选是创建的并且连续使用的标准物。该标准物例如包括非肿瘤细胞或任何其它对照组对生物标记物的平均释放水平。在检测生物标记物之前，任选使癌细胞与抗癌试剂接触。因此，对照样品是不与抗癌试剂接触的癌细胞或者与抗癌试剂接触之前的癌细胞。

还提供用于预测或监测抗癌试剂在对象中的功效的方法。该方法包括给予对象该试剂后，从该对象获取生物样品，如组织或身体液体。例如，给予对象该试剂后1至60分钟、数小时、数天或数周，从对象收集组织或体液。该方法还包括检测生物样品中选自ALDOA、PGK1、PRDX1、COF1和组蛋白H4的一种或者多种生物标记物的水平。一种或多种生物标记物的水平增加是治疗功效的证据。因此，所述的增加的降低或时间是功效降低的证据。因此，优选随着时间系统获得生物样品以监测生物标记物水平的变化。

还提供确定抗癌药试剂的有效剂量的方法。该方法包括使一种或多种癌细胞与多种抗癌试剂剂量接触。公开的方法优选允许细胞释放一种或多种本文中公开的生物标记物。该方法还包括检测在每一剂量下对一种或多种生物标记物的释放。如本文中所公开的，较高的生物标记物的释放率表示有效剂量。至少一个细胞与多于一种剂量接触，或者每个细胞只与一种剂量接触。

所公开的抗癌试剂包括例如，死亡受体激动剂。死亡受体指一旦与配体结合就诱导细胞凋亡的受体。死亡受体包括例如具有死亡结构域的肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员(例如，TNFRI、Fas、DR3、4、5、6)和没有死亡域的肿瘤坏死因子受体超家族成员LTβR、CD40、CD27、HVEM。因此，死亡受体激动剂选自DR5抗体、DR4抗体、Fas配体、TNF和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)。DR5抗体任选为TRA-8或与TRA-8具有相同的表位特异性抗体。DR5抗体任选为人源化TRA-8(humanized version of TRA-8)。

通过例如DR5的信号转导，是控制DR5-介导的细胞凋亡的关键机理。TNFR超家族的死亡受体的共同特征是，它们在其胞质尾巴中都具有保守的“死亡结构域”(Zhou，T.，等2002.Immunol Res 26：323-336)。非常确定的是，在死亡结构域处启动DR5-介导的细胞凋亡。TRAIL或激动性抗-DR5抗体与细胞表面上的DR5的交联，导致DR5的寡聚化，此后立即将FADD募集到DR5的死亡结构域(Bodmer，J.L.，等2000.Nat Cell Biol 2：241-243；Chaudhary，P.M.，等1997.Immunity 7：821-830；Kuang，A.A.，等2000.J Biol Chem 275：25065-25068；Schneider，P.，等1997.Immunity 7：831-836；Sprick，M.R.，等2000.Immunity 12：599-609)。死亡结构域连接的FADD进一步募集起始物胱冬酶原8和/或胱冬酶原10，以通过嗜同性DD相互作用形成DISC(Krammer，P.H.2000.Nature 407：789-795)。激活的胱冬酶8和10可以直接激活胱冬酶3，或切割含有BH3的蛋白Bid，以通过细胞色素C的释放和胱冬酶9激活，激活线粒体-依赖性的细胞凋亡途径(Desagher，S.，和J.C.Martinou.2000.TrendsCell Biol 10：369-377；Scaffidi，C.，等1998.Embo J 17：1675-1687)。在形成死亡结构域复合物后，激活几个信号转导途径，例如胱冬酶、NF-κB和JNK/p38。这些信号传导途径的激活，导致通过Bcl-2和IAP家族的蛋白，调节死亡受体-介导的细胞凋亡。

“激动剂”是指物质(分子、药物、蛋白等)，它能结合细胞上的受体(例如死亡受体)，并启动一般地通过结合内源配体产生的相同反应或活性(例如，细胞凋亡)。本方法的激动剂例如是死亡受体配体，例如TNF、Fas配体或TRAIL。激动剂包括这些配体的片段，其包含死亡受体结合结构域，从而使得该片段能结合和激活死亡受体。激动剂包括融合蛋白，其包含死亡受体结合结构域，从而使得该融合蛋白能结合和激活死亡受体。激动剂还可以是融合蛋白，其包含死亡受体结合结构域，从而使得该融合蛋白能结合和激活死亡受体。激动剂包括这样的多肽，它的氨基酸序列与TNF、Fas或TRAIL具有至少85-99％同源性(包括例如，90％、95％和99％的同源性)而使得同源物能结合和激活死亡受体。

激动剂包括结合死亡受体的细胞凋亡诱导性抗体。该“抗体”可以是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、全人抗体或其任何Fab或F(ab′)2片段。“细胞凋亡诱导性抗体”是指在使用本文提供的方法激活之前或之后，造成程序性细胞死亡的抗体。因此，本方法的激动剂包括对Fas、TNFR1或TRAIL死亡受体具有特异性的抗体，从而使得该抗体激活死亡受体。激动剂包括对DR4或DR5具有特异性的抗体。例如激动剂是与小鼠-小鼠杂交瘤具有相同表位特异性或由它分泌的DR5抗体，所述小鼠-小鼠杂交瘤具有ATCC登记号PTA-1428(例如，TRA-8抗体)、ATCC登记号PTA-1741(例如，TRA-1抗体)、ATCC登记号PTA-1742(例如，TRA-10抗体)。激动剂任选是与具有ATCC登记号PTA-3798的杂交瘤(例如，2E12抗体)具有相同表位特异性或由它分泌的抗体。

抗体任选来源于使用以下的转化体大肠杆菌菌株：E.coli JM109/pHA15(含载有编码人源化TRA-8的H1-型重链的cDNA的质粒)E.coli JM109/pHB14(含载有编码人源化TRA-8的H1-型重链的cDNA的质粒)、E.coli JM109/pHC10(含载有编码人源化TRA-8的H3-型重链的cDNA的质粒)、E.coli JM109/pHD21(含载有编码人源化TRA-8的H4-型重链的cDNA的质粒)、和E.coli JM109/pM11(含载有编码嵌合型TRA-8的重链的cDNA的质粒)、E.coli DH5α/pHSG/M1-2-2(含载有编码人源化LM1 TRA-8轻链可变区和人Ig链恒定区域的融合片段的cDNA的质粒)。根据布达佩斯微生物保藏条约，这些菌株已于2001年4月20日保藏在国际专利生物保藏组织(International Patent OrganismDepositary)国家先进工业科学和技术研究院(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)(1-1，Higashi 1 chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，日本)，并分别给予登记号FERM BP-7555、FERMBP-7556、FERM BP-7557、FERM BP-7558、FERM BP-7559、和FERMBP-7562。

本方法的抗体靶向的TRAIL受体可以是DR4或DR5。这样的受体记载在公开的专利申请WO99/03992、WO98/35986、WO98/41629、WO98/32856、WO00/66156、WO98/46642、WO98/5173、WO99/02653、WO99/09165、WO99/11791、WO99/12963和公开的美国专利号6,313,269中，它们都关于本文教导的受体，整体在本文中引作参考。使用本领域已知的方法，可以生成对这些受体特异性的单克隆抗体。参见，例如，Kohler和Milstein，Nature，256：495-497(1975)和Eur.J.Immunol.6：511-519(1976)，它们都关于这些方法，整体在本文中引作参考。也参见在公开的专利申请WO01/83560中教导的方法，它整体在本文中引作参考。

所公开方法中的抗癌试剂任选为如化疗药物等抗癌化合物。一般地，有效抑制或阻止抗癌化合物是对不正常生长的细胞的生长的化合物或组合物。抗癌化合物的示例性实例包括：博来霉素、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙碱、CPT-11、环磷酰胺、柔红霉素、更生霉素、乙烯雌酚阿霉素、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、美法仑、甲氨蝶呤、丝裂霉素、6-巯基嘌呤、奥沙利铂、紫杉醇、替尼泊苷、6-硫鸟嘌呤、长春新碱和长春碱。抗癌化合物和治疗剂的其它实例，参见The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，18th Ed.，Berkow等，编，2006，Rahway，N.J.和Sladek等Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs，1987，Powis等编，Taylor和Francis，New York，N.Y。

根据美国癌症协会，有5个主要类别的化疗药物。它们是烷化剂、硝基脲类、抗代谢药物、抗肿瘤抗生素和有丝分裂抑制剂。烷化剂直接作用于肿瘤细胞的DNA阻止其复制。白消安、环磷酰胺和美法仑是烷化剂的例子。硝基脲类抑制癌细胞用于修复DNA所需的酶。卡莫司汀和洛莫司汀是硝基脲的例子。抗代谢药干扰癌细胞的DNA和RNA两者。5-氟尿嘧啶，氨甲蝶呤和氟达拉滨是抗代谢药的例子。抗肿瘤抗生素也干扰癌细胞的DNA，此外改变癌细胞的细胞膜(保护包层的外层)。莱霉素、阿霉素和伊达比星是抗肿瘤抗生素的例子。有丝分裂抑制剂是抑制癌细胞中蛋白质合成所需酶的植物碱。多西他赛、依托泊苷和长春碱是有丝分裂抑制剂的例子。

本文所公开的某些方法涉及从对象收集生物样品。通过标准方法进行生物样品收集。通常，一旦收集样品，就检测和测量生物标记物。使用任何合适的技术检测所公开的生物标记物。此外，使用已知技术检测与所公开的生物标记物相互作用或者结合于生物标记物的分子，如结合于生物标记物的抗体。许多合适的技术(例如众所周知用于检测蛋白质、多肽和其他分析物和抗原的技术)。其中一些方法在下文描述。一般来说，这些技术涉及直接成像技术(如显微镜术)、免疫分析或功能测定。“功能测定”指通过检测所述功能来检测具有功能的给定生物标记物(蛋白质)。例如，通过评价其对底物的作用来检测酶。

免疫检测方法用于检测、结合、纯化、去除和量化包括所公开的生物标记物等多种分子。此外，检测针对所公开生物标记物的抗体和配体。例如，使用公开的生物标记物来检测与其有反应的抗体。标准免疫检测技术在以下文献中描述，如：Weir’s Handbook of Experimental Immunology(Hertzenberg等，1-4卷(1996))；Coligan，Current Protocols in Immunology(1991)；Methods inEnzymology，第70、73、74、84、92、93、108、116、121、132、150、162、和163卷；和Paul，Fundamental Immunology(第3版，1993))。所有这些文献中所描述的方法，尤其是与免疫检测技术相关的方法都在这里整体引作参考。

在科学文献中描述了多种有用的免疫检测方法的步骤，例如Maggio等，Enzyme-Immunoassay，(1987)；和Nakamura等，Enzyme Immunoassays：Heterogeneous and Homogeneous Systems，Handbook of ExperimentalImmunology，第1卷：Immunochemistry，27.1-27.20(1986)，所有这些方法尤其是用于免疫检测的方法都在这里整体引作参考。免疫分析，在其最简单的和直接的意义上说，是涉及抗体和抗原间结合的结合分析。已知许多类型和形式的免疫分析都适合于检测所公开的生物标记物。免疫分析的例子为：酶联免疫分析(ELISAs)、放射性免疫分析(RIA)、放射性免疫沉淀分析(RIPA)、免疫珠捕获分析(immunobead capture assays)、蛋白质印迹、点印迹(dotblotting)、凝胶移位分析、流式细胞术(Flow cytometry)、蛋白阵列分析(proteinarrays)、多重珠阵列分析(multiplexed bead arrays)、磁性捕获(magneticcapture)、体内成像、荧光共振能量转移(FRET)和光致褪色后的荧光恢复/定位(FRAP/FLAP)。

一般来说，免疫分析涉及使怀疑含有感兴趣分子(如本文所公开的生物标记物)的样品与感兴趣分子的抗体接触，或使感兴趣分子的抗体(如本文所公开的生物标记物的抗体)与被该抗体结合的分子接触，该情况可以在有效允许形成免疫复合体的条件下。在有效条件下，使样品与感兴趣分子的抗体接触或者与被感兴趣分子的抗体结合的分子接触，接触时间足以允许形成免疫复合物(初级免疫复合物)。所述接触一般是简单地使分子或抗体与样品接触，并将混合物孵育足够长的时间，使抗体与任何与抗体结合的分子(如抗原)形成免疫复合物。在许多免疫分析形式中，洗涤样品-抗体复合物(如组织切片、ELISA板、斑点印迹或蛋白质印迹)，以除去任何非特异性结合的抗体，从而只允许特异性结合在待测的初级免疫复合物内的抗体。

免疫分析包括用于检测或定量样品中感兴趣的分子(如本公开的生物标记物或它们的抗体)的量方法，所述方法一般涉及检测或定量在结合过程中形成的任何免疫复合体。一般来说，免疫复合体形成的检测可以通过应用许多方法来实现。这些方法通常基于对标记或标志(如任何放射性、荧光、生物或酶标记或其他任何已知的标记)的检测。例如参见美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。这些方法尤其是与免疫检测和标记相关的方法都在这里整体引作参考。

如本文所使用的，标记包括荧光染料、结合对成员(如生物素/链霉抗生物素蛋白)、金属(如金)或者特异性地与待测分子相互作用的表位标记(如生成有色底物或荧光)。适用于可检测地标记蛋白质的物质包括荧光染料(本文也称作荧色染料或荧光团)和与显色底物反应的酶(如辣根过氧化物酶)。由于荧光染料可在很低的水平下检测到，因此在本发明实践中通常使用它们。荧光团是发光的化合物或者分子。典型的荧光团在某一波长处吸收电磁能量，在另一波长处发射电磁能量。在多个抗原与单一阵列反应的情况下，每个抗原标记有不同的荧光化合物，用于同时检测。使用荧光计检测阵列上的标记点，一个信号的出现指示一个抗原结合于一个特异性抗体。

标记可以是直接标记或间接标记。直接标记时，检测抗体(感兴趣分子的抗体)或检测分子(被感兴趣分子的抗体结合的分子)包含标记。对标记的检测指示检测抗体或者检测分子的存在，其进而分别指示感兴趣分子或该感兴趣分子的抗体的存在。在间接标记时，使额外的分子或部分(moiety)与免疫复合物接触或在免疫复合物位点上生成。例如，诸如酶之类的信号发生分子或部分与检测抗体或检测分子结合或缔合。然后信号发生分子在免疫复合物的位点产生可以检测的信号。例如，当供给合适的底物时，酶在免疫复合物位点处生成可视的或者可以检测的产物。ELISA使用这种间接标记法。

作为间接标记的另一种例子，使能够与感兴趣分子或者感兴趣分子的抗体(第一抗体)结合的额外分子(也称作结合剂)，例如能结合第一抗体的第二抗体，与免疫复合物接触。该额外分子任选具有标记或信号发生分子或部分。该额外分子例如是称作第二抗体的抗体。第二抗体与第一抗体的结合与第一抗体及感兴趣分子形成所谓的三明治结构。免疫复合物与标记的第二抗体在有效条件下接触，持续时间足以允许形成二级免疫复合物。通常洗涤二级免疫复合物，以除去任何非特异性结合的带标记的二级抗体。然后检测在二级免疫复合体中残留的标记。额外分子包括能够互相结合的分子对或者部分对之一，如生物素/抗生物素蛋白对。在这种模式中，检测抗体或检测分子包括所述对的其它成员。

间接标记的其它模式包括通过两步实现对初级免疫复合物的检测。例如，使用对感兴趣分子或者相应的抗体具有结合亲和性的分子(也称为第一结合剂)，例如抗体形成上述的二级免疫复合物。洗涤后，二级免疫复合物与另一个对第一结合剂具有结合亲和性的分子(也称第二结合剂)在有效的条件下接触足以形成免疫复合物(这样形成三级免疫复合物)的时间。第二结合剂连接于可检测的标记或信号生成分子或部分，允许对如此形成的三级免疫复合体的检测。这一系统提供信号放大。

涉及对诸如蛋白或特定蛋白的抗体之类的物体检测的免疫分析包括无标记分析、蛋白分离方法(即电泳)、固体支持捕获分析或体内检测。无标记分析通常为确定样品中是否存在某个特定蛋白或特定蛋白的抗体的诊断方法。蛋白分离方法另外有用于评价蛋白物理特性(如大小和净电荷)。捕获分析一般更有用于定量评价样品中特定蛋白或特定蛋白的抗体的浓度。最后，体内检测有用于评价物质的空间表达模式(spatial expression patterns)，即，在对象、组织或细胞中何处发现该物质。

只要有足够的浓度，通过抗体-抗原相互作用生成的分子复合物([Ab-Ag]n)就可以用肉眼看到。但是较小量也可因其散射光束的能力而被检测并测量。复合物的形成显示两种反应物都存在，在免疫沉淀测定中，恒定浓度的反应抗体用于测定特异性抗原([Ab-Ag]n)，反应抗原用于检测特异性抗体([Ab-Ag]n)。如果试剂种类预先涂覆在细胞上(如在红细胞凝聚分析中)或很小的颗粒(如乳胶凝集分析)上，则涂覆颗粒的聚集可以在很低的浓度下观察到。基于这些基本原理的多种分析都已经普遍使用，包括Ouchterlony免疫扩散分析、火箭免疫电泳和免疫比浊(immunoturbidometric)和散射浊度(nephelometric)测定。与采用标记的分析相比，此类分析的主要局限是受限制的灵敏度(较低的检测限)，在某些情况下，非常高浓度的分析物实际会抑制复合物的形成，该事实迫使操作更加复杂以确保安全。这些组1分析中的一些追溯到抗体的发现并且所有的抗体都没有实际标记(如银酶(Ag-enz))。没有标记的其它种类免疫测定依赖于免疫传感器，并且目前可商购各种能直接测定抗体-抗原相互作用的仪器。大多数仪器依赖于具有固定配体的传感器表面上产生隐失波，以允许持续监测与配体的结合。免疫传感器使得动力学相互作用容易调查。在专门仪器的帮助下为免疫分析提供了更广泛的应用。

使用免疫分析来检测特定蛋白涉及例如通过电泳分离蛋白。电泳是带电荷分子对响应电场而在溶液中的迁移。它们的迁移速度依赖于电场的强度；分子的净电荷、大小和形状；还依赖于分子在其中迁移的介质的离子强度、粘度及温度。作为分析工具，电泳是简单、快速并高灵敏性的。它是用于分析，以研究单个带电荷物质的特性，并且用作分离技术。

通常，样品在支持基质(例如纸、乙酸纤维、淀粉凝胶、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶)上跑样(run)。基质抑制通过加热所引起的对流混合，并提供电泳跑样的记录：例如在跑样结束时，基质被染色并用于扫描，放射自显影或存储。此外，最常用的支持基质(琼脂糖和聚丙烯酰胺)提供通过大小分离分子的手段，这是因为它们是多孔凝胶。多孔凝胶通过延迟或某些情况下完全阻滞大分子的运动，同时允许小分子自由迁移而充当分子筛。相比于相同浓度的聚丙烯酰胺凝胶，由于稀释的琼脂糖凝胶通常更硬，因此更易于操作，琼脂糖凝胶用于分离诸如核酸、大蛋白和蛋白复合物之类的较大的大分子。聚丙烯酰胺凝胶在较高浓度下较易于操作和制备，用于分离大多数蛋白和需要用于延迟的小的凝胶孔径的小分子寡核苷酸。

蛋白是两性化合物；因此它们的净电荷决定于它们悬浮其中的介质的pH值。在pH值高于其等电点的溶液中，蛋白带有净负电荷，并在电场中向阳极迁移。当低于其等电点时，蛋白带有正电荷并向负极迁移。蛋白所带有的净电荷不依赖于其大小，即，分子的每单位质量(或长度，假定蛋白和核酸是线形大分子时)所携带的电荷在不同蛋白之间是不同的。因此，在给定的pH下并且在非变性条件下，蛋白的电泳分离是由分子的大小和电荷两者决定的。

十二烷基硫酸钠(SDS)是阴离子去垢剂，其通过缠绕多肽骨架使蛋白变性，SDS相当明确地以1.4∶1的质量比与蛋白结合。这样做时，SDS根据多肽的长度按比例使其带上负电荷。此外，在蛋白采用无规卷曲构型(对于按大小进行分离是必需的)之前，通常必需减少蛋白中的二硫桥键(变性)；使用2-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)进行变性。因此，在变性SDS-PAGE分离中，迁移并非由多肽固有的电荷来确定，而是取决于其分子量。

使用已知分子量的蛋白连同待表征蛋白，通过SDS-PAGE进行分子量的测定。经SDS-变性的多肽或天然核酸的分子量(MW)对数与它的Rf之间存在线性关系。Rf计算为该分子的迁移距离与染料标记物(marker dye-front)的迁移距离之比。通过电泳测定相对分子量(Mr)的一个简单方法是绘制迁移距离对已知样品的log10 MW的标准曲线，在测量相同凝胶上的迁移距离后读出样品的log Mr。

进行双向电泳时，首先基于其一种物理特性将蛋白分级(fractionated)，在第二步中，基于另一种特性进行分级。例如，等点聚焦用于第一维分离(方便地在管式凝胶中进行)，使用板凝胶中的SDS电泳用于第二维分离。该操作的一个例子是O’Farrell，P.H.，High Resolution Two-dimensionalElectrophoresis of Proteins，J.Biol.Chem.250：4007-4021(1975)中的方法(通过整体引用将其并入本文，用于参考有关双向电泳方法的教导)。其它例子包括但不限于：Anderson，L和Anderson，NG，High resolution two-dimensionalelectrophoresis of human plasma proteins，Proc.Natl.Acad.Sci.74：5421-5425(1977)和Ornstein，L.，Disc electrophoresis，L.Ann.N.Y.Acad.Sci.121：321349(1964)中记载的方法(通过引用将每一篇文献整体并入本文，用于参考有关电泳方法的教导)。

Laemmli，U.K.，Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4、Nature 227：680(1970)中公开了解析SDS变性蛋白的不连续系统(通过引用将该文献整体并入本文，用于参考有关电泳方法的教导)。Laemmli缓冲液系统中的前导离子是氯，而尾随离子是甘氨酸。因此，在Tris-盐酸缓冲液(不同浓度和pH值)中制备分离凝胶和积层凝胶，而槽缓冲液(tankbuffer)是Tris-甘氨酸。所有的缓冲液中都含有0.1％SDS。

使用现有方法中考虑的电泳的免疫分析的一个实例是蛋白印迹分析。蛋白印迹或免疫印迹允许测定蛋白的分子量以及测量不同样品中存在的蛋白的相对量。检测方法包括化学发光或显色检测。蛋白印迹分析的标准方法参见例如D.M.Bollag等，Protein Methods(2d edition 1996)和E.Harlow & D.Lane，Antibodies，a Laboratory Manual(1988)，美国专利4,452,901(通过引用将每一篇文献整体并入本文，用于参考有关蛋白印迹方法的教导)。一般来说，通过凝胶电泳(通常为SDS-PAGE)分离蛋白。将蛋白转移到一张特殊的印迹纸(如硝化纤维，但是也使用其它类型的纸或膜)上。所述蛋白保留与它们在凝胶上相同的分离图案。将印迹与一般蛋白(如乳蛋白)孵育，以结合硝酸纤维膜上任何剩余的粘性位置(remaining sticky places)。然后向溶液中加入能与其特异性蛋白结合的抗体。

针对特定固定抗原的特异性抗体的附着容易通过间接酶联免疫分析技术(通常使用化学显色底物(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)或化学发光底物)来观测。其它用于探查的可能方法包括使用荧光标记或放射性同位素标记(如荧光素、¹²⁵I)。用于抗体结合的检测的探针是例如与抗免疫球蛋白缀合的，结合IgG的缀合金黄色葡萄球菌蛋白A，或者是生物素化的(biotinylated)第一抗体(如缀合生物素/链霉抗生物素蛋白)的探针。

该技术的优势在于同时检测特定蛋白的抗原性及其分子量。首先根据SDS-PAGE中的分子量分离蛋白，然后在免疫测定步骤中进行特异性检测。因此，蛋白标准品(梯度)例如同时跑样，以便估计(approximate)不均匀样品中的感兴趣蛋白的分子量。

凝胶移位分析或电泳迁移率变动分析(EMSA)用于以定性和定量的方式检测DNA结合蛋白与其同源DNA识别序列之间的相互作用。示例性技术描述于Ornstein L.，Disc electrophoresis-I：Background and theory，Ann.NY Acad.Sci.121：321-349(1964)，和Matsudiara，PT和DR Burgess，SDS microslablinear gradient polyacrylamide gel electrophoresis，Anal.Biochem.87：386-396(1987)中(通过整体引用将每一篇文献并入本文，用于参考有关凝胶移位分析的教导)。

在通用的凝胶移位分析中，将纯化的蛋白或细胞粗提取物与标记(如³²P放射标记)的DNA或RNA探针孵育，然后通过非变性的聚丙烯酰胺凝胶将复合物与自由探针分离。与未结合的探针相比，复合物迁移通过凝胶慢得多。取决于结合蛋白的活性，标记的探针是双链或者单链的。对于检测诸如转录因子等的DNA结合蛋白，使用纯化蛋白或部分纯化蛋白、或细胞核提取物。对于检测RNA结合蛋白，使用纯化蛋白或部分纯化蛋白、或细胞核或细胞质提取物。使用含有感兴趣蛋白结合位点的DNA或RNA片段或寡核苷酸或其他无关序列通过竞争实验建立DNA或RNA结合蛋白对假设结合位点的特异性。在特异性或非特异性竞争者的存在下所形成的复合物的性质和强度差别能够分辨出特异性相互作用。参见Promega公司http://www.promega.com/faq/gelshfaq.html上的凝胶移位测定问答(通过整体引用将其并入本文，用于参考有关凝胶移位方法的教导)。

凝胶移位方法包括使用例如胶体形式(colloidal forms of)的考马斯蓝(Imperial Chemicals Industries，Ltd)染色来检测凝胶(如聚丙烯酰胺电泳凝胶)中的蛋白。此类方法描述于例如Neuhoff等，Electrophoresis 6：427-448(1985)和Neuhoff等，Electrophoresis 9：255-262(1988)中(通过整体引用将这些文献中每一篇并入本文，用于参考有关凝胶移位方法的教导)。除了上述常规的蛋白测定方法外，清洁和蛋白染色组合物描述于美国专利5,424,000中(通过整体引用将其并入本文，用于参考有关凝胶移位方法的教导)。该解决方案包括磷酸、硫酸和硝酸，以及酸性紫染料。

放射免疫沉淀测定(RIPA)是使用放射性标记的抗原来检测血清中的特异性抗体的灵敏测定方法。允许抗原与血清反应，然后使用特殊的试剂(如蛋白A琼脂糖凝胶珠)进行沉淀。然后通过凝胶电泳对结合的放射性标记的免疫沉淀物进行常规分析。放射免疫沉淀测定(RIPA)经常用作用于诊断HIV抗体存在的证实试验。RIPA在本领域中也称为的法尔测定(Farr Assay)；沉淀素测定(Precipitin Assay)；放射免疫沉淀素测定(Radioimmune Precipitin Assay)；放射免疫沉淀分析(Radioimmunoprecipitation Analysis)；Radioimmunoprecipitation Analysis和Radioimmunoprecipitation Analysis。

尽管以上使用电泳分离并检测感兴趣的特定蛋白的免疫测定允许评价蛋白大小，但是它们对评价蛋白浓度却不十分灵敏。但是，还考虑这样的免疫测定：其中蛋白或该蛋白的特异性抗体结合到固体支持物(如试管、孔、珠或者细胞)，以分别从样品中捕获抗体或感兴趣的蛋白，结合检测支持物上的蛋白或该蛋白的特异性抗体的方法。这类免疫测定的实例包括放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、蛋白阵列、多元珠分析(Multiplexed beadassays)和磁性捕获。

放射免疫测定(RIA)是使用放射性标记物质(放射性配体)直接或间接检测抗原-抗体反应，以测定未标记物质与特定抗体或其它受体系统的结合的经典定量分析法。放射免疫测定用于例如无需使用生物测定而测试血液中的激素含量。也可以测定非免疫原性物质(如半抗原)，如果使其偶联于能诱导抗体形成的较大的载体蛋白质(如牛γ-球蛋白或人血清白蛋白)。RIA涉及将放射性抗原(因为用它容易地将碘原子引入蛋白的酪氨酸残基，常使用放射性同位素¹²⁵I或¹³¹I)与针对该抗原的抗体混合。抗体通常连接于固体支持物(如柱或珠)。然后按已知量加入未标记的抗原或者冷抗原，测定置换标记抗原的量。起初，放射性抗原结合到抗体上。加入冷抗原时，两者竞争抗体结合位点。较高浓度的冷抗原，较多地结合至抗体，置换放射性变量(radioactive variant)。将结合的抗原与在溶液中未结合的抗原分离，并使用每种抗原的放射性绘制结合曲线。这种技术是极其敏感且具特异性。

酶联免疫测定(ELISA)或者更一般称为EIA(酶免疫测定)是能够检测对蛋白具有特异性的抗体的免疫测定。在此类测定中，结合于抗体结合或抗原结合试剂的可检测标记是酶。当接触其底物时，这种酶以诸如生成化学部分(chemical moiety)的方式发生反应，所述化学部分通过例如分光光度法、荧光法或目视方法检测。用来用于检测的可检测标记试剂的酶包括但不限于：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、天冬酰胺酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。关于ELISA程序的描述，参见Voller，A.等，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；Maggio，E.(ed.)，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，1980；Butler，J.E.，In：Structure of Antigens，第1卷(Van Regenmortel，M.，CRC Press，Boca Raton，1992，pp.209-259；Butler，J.E.，In：van Oss，C.J.等编，Immunochemistry，Marcel Dekker，Inc.，New York，1994，pp.759-803；Butler，J.E.编，Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，1991)；Crowther，“ELISA：Theory and Practice，”In：Methods in Molecule Biology，Vol.42，Humana Press；New Jersey，1995；U.S.Patent 4,376,110。将每篇文献并入本文，作为整体参考，尤其参考有关ELISA方法的教导。

ELISA技术的变型(variations)为本领域技术人员已知。在一种变型中，将与蛋白结合的抗体固定在显示蛋白亲和性的选择的表面上，例如聚苯乙烯微量滴定板中的一个孔。然后，将怀疑含有标记抗原的测试组合物加到孔中。在结合并洗去非特异性结合的免疫复合物之后，对结合抗原进行检测。例如通过加入对目标蛋白具有特异性的第二抗体(与可检测标记连接)来实现检测。这种ELISA是简单的夹心ELISA。也可通过加入第二抗体，然后加入与第二抗体有结合亲和性的第三抗体来实现检测，其中第三抗体与可检测标记连接。

另一种变型是竞争ELISA。在竞争ELISA中，测试样品与已知量的标记抗原或抗体竞争性结合。通过将样品与已知的已标记物质在与包被孔孵育之前或期间混合来测定样品中反应性物质的量。样品中反应性物质的存在起到减少可利用与孔结合的已标记物质的量，从而降低最终的信号的作用。

与采用的形式无关，ELISA具有某些共同的特点，例如包被、孵育或结合，洗去非特异性结合物质，以及检测结合的免疫复合物。将抗原或抗体连接到诸如平板、珠、测深杆(dipstick)、膜或柱基质之类形式的固体支持物上，并将待分析的样品施加到固定的抗原或抗体上。在用抗原或抗体包被平板时，通常将该板的孔与抗原或抗体溶液孵育过夜或者特定的若干小时。然后洗涤该板的孔，以除去没有完全吸附的材料。孔的任何其余可利用表面都被相对于测试抗血清呈抗原中性(antigenically neutral)的非特异性蛋白包被。这些蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和奶粉溶液。这种包被允许封闭固定表面上的非特异性吸附位点并因此降低由抗血清非特异性结合到表面上所导致的背景。

在ELISA中，任选使用二级或三级的检测方法，而非直接检测程序。因此，在使蛋白或抗体与孔结合之后，用非反应性物质物质包被，以减少背景，并洗去未结合的材料，使固定表面与临床对照或待测的生物样品在有效形成免疫复合物(抗原/抗体)的条件下接触。对免疫复合体的检测然后需要标记的二级结合试剂或者与标记的三级结合试剂联用的二级结合试剂。

“在有效形成免疫复合物(抗原/抗体)的条件下”是指包括用诸如BSA、牛丙种球蛋白(BGG)和磷酸缓冲盐水(PBS)/吐温之类的溶液稀释抗原和抗体，以便减少非特异性结合并促进合理的信噪比的条件。

合适的条件是指在一定的温度下孵育足以进行有效结合的一段时间。孵育步骤通常是在大约20℃到30℃的温度下进行约1分钟到12小时或在大约0℃到大约10℃温度下孵育过夜。

ELISA中，在所有的孵育步骤之后，洗涤接触表面，以便去除未复合的材料。洗涤程序包括用诸如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液之类的溶液洗涤。在测试样品与最初结合材料之间形成特定的免疫复合物以及然后的洗涤之后，检测出现的甚至微小(minute)量的免疫复合物。

为提供检测手段，第二抗体或第三抗体具有例如如上所描述的允许检测的相关标记。这任选是的与适当的显色底物孵育时而产生颜色的酶。因此，举例来说，在有利于形成进一步免疫复合物的条件下，与带有标记抗体的初级或二级免疫复合物接触并孵育一段时间的一种酶(如在诸如PBS-吐温之类含有PBS的溶液中于室温孵育两个小时)。

在与标记的抗体孵育之后，并在洗去未结合的材料之后，任选通过例如与发色底物(例如尿素和溴甲酚紫，或者在使用过氧化物酶作为酶标记的情况中，为2，2′-叠氮二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和过氧化氢)孵育来定量标记的量。通过例如使用可见光分光光度计测定生成颜色的程度来实现定量。

蛋白阵列是使用表面(包括玻璃、膜、微量滴定孔、质谱仪板和珠子或其他颗粒)上的固定蛋白的固相配体结合分析系统。该分析系统高度平行(多路复用的(multiplexed))并且常常是小型化的(微陈列、蛋白芯片)。它们的优点包括快速并自动化，能具有高灵敏度，节省试剂和对于单个实验提供大量数据。生物信息支持是重要的：数据的处理需要复杂的软件和数据比较分析。但是，该软件可从用于DNA阵列的软件改编，多数硬件和检测系统也可以这样。

蛋白阵列的主要形式之一是捕获阵列(capture array)，其中配体结合试剂(通常是抗体但也可以用蛋白支架、肽或核酸适体代替)用于检测混合物中的靶分子(例如血清或组织提取物)。在诊断中，捕获陈列用于进行多个平行免疫测定。例如同时测试个体血清中的数个分析物以及同时测试多个血清样品。在蛋白质组学中，捕获阵列用于定量和比较不同的健康和疾病样品中的蛋白水平，即蛋白表达谱。特异性配体结合物以外的蛋白用于体外功能性相互作用(如蛋白-蛋白，蛋白-DNA，蛋白-药物，受体-配体，酶-底物等)筛选的阵列形式。对捕获试剂本身进行选择并针对许多蛋白进行筛选，任选在多路阵列形式中对对多种蛋白靶。

对于阵列的构成，蛋白源包括用于重组蛋白的基于细胞的表达系统，从天然来源纯化，通过无细胞翻译系统体外制备，以及肽的合成方法。这些方法中许多可以高通量自动化生产。对于捕获阵列和蛋白功能分析，蛋白的正确折叠和功能是重要的。情况并非总是如此，例如，其中在变性条件下，从细菌中提取重组蛋白。但是，变性蛋白的阵列用于筛选具有交叉反应性的抗体，识别自身抗体和选择配体结合蛋白。

已将蛋白阵列设计为小型化的常见免疫测定方法(例如ELISA和点印迹)，通常使用荧光读数(readout)，并且通过机器人技术和高通量检测系统促进，以使多个测定能够平行进行。物理支持物包括载玻片、硅、微孔、硝化纤维素或PVDF膜，以及磁性微珠和其它微珠。虽然将蛋白微滴递送到平面(planar)表面上是最常见的形式，但是另选构造包括基于微流体技术发展的CD离心设备(Gyros，Monmouth Junction，NJ)和专门的芯片设计，例如平板中的工程微通道(例如The Living Chip^TM，Biotrove，Woburn，MA)和贴在硅表面上的微小3D(Zyomyx，Hayward CA)。悬浮液中的颗粒也用作阵列的基础，只要对它们编码用于识别；系统包括微珠用的色彩编码(Luminex，Austin，TX；Bio-RadLaboratories)、半导体纳米晶体(例如QDOTS^TM，Quantum Dot，Hayward，CA)、珠用条码(ULTRAPLEX^TM珠，SmartBead Technologies Ltd，Babraham，Cambridge，UK)和多金属微米粒(multimetal microrods)(例如NANOBARCODES^TM颗粒，Nanoplex Technologies，Mountain View，CA)。任选将珠组装进半导体芯片上的平面阵列(LEAPS^TM technology，BioArray Solutions，Warren，NJ)。

蛋白质固定涉及偶联试剂和被偶联表面的性质。良好的蛋白阵列支持表面在偶联操作步骤前后均化学稳定，产生良好的点形态，显示出最小的非特异性结合，不造成检测系统中的背景并且在不同的检测系统中兼容。所使用的固定方法可再现，适用于不同性能(大小、亲水性、疏水性)的蛋白，顺应于高通量和自动化，并且适用于保留完全的功能蛋白活性。表面结合蛋白的取向公认为将其以活性状态递呈到配体或底物上的重要因素；对于捕获阵列，用取向的捕获试剂获得最有效的结合结果，所述试剂通常需要对蛋白的位点特异性标记。

蛋白固定的共价和非共价方法都可以使用并且有不同的优缺点。被动吸附到表面在方法上是简单的，但是几乎不允许量化控制或取向控制。它可以改变或可以不改变蛋白的功能性质，再现性和效率是可变的。共价偶联方法提供稳定的连接(linkage)，适用于各种蛋白，具有良好的再现性，然而，其取向可变化。此外，化学衍生可能改变蛋白的功能并且需要稳定的相互作用(interactive)表面。在蛋白上使用标记的生物捕获方法提供稳定的连接，特异性地结合蛋白，处于可再现的取向，但是，生物试剂必须首先被充分固定，而且阵列可能需要特殊的操作并具有可变的稳定性。

一些固定化学和标记已被描述用于制作蛋白阵列。用于共价附着(attachment)的底物包括涂覆有含氨基或醛基的硅烷试剂的载玻片。在VERSALINX^TM系统(Prolinx，Bothell，WA)中，通过蛋白衍生物与固定在支持表面的亚苯基二硼酸(phenyldiboronic acid)和水杨羟肟酸(salicylhydroxamicacid)之间的相互作用实现可逆的共价偶联。这种方法还具有低的结合背景和低的固有荧光并且允许固定蛋白保留功能。未修饰蛋白的非共价结合发生在多孔结构(如HYDROGEL^TM(PerkinElmer，Wellesley，MA)，基于3维聚丙烯酰胺凝胶(3-dimensional polyacrylamide gel))内；据报道，该底物在玻璃微阵列上产生非常低的背景，具有高容量并保留蛋白功能。广泛使用的生物偶联方法通过生物素/链霉抗生物素蛋白或六组氨酸(hexahistidine)/镍的相互作用，恰当地修饰蛋白。可将生物素缀合到固定在诸如二氧化钛(Zyomyx，Inc.，Hayward，CA)或五氧化钽(Zeptosens、Witterswil、Switzerland)之类的表面上的聚赖氨酸骨架上。

阵列制备方法包括机器人接触印刷(robotic contact printing)、墨喷印刷(ink-jetting)、压电点样(piezoelectric spotting)和光刻(photolithography)。可以获得许多商品阵列[如Packard Biosciences，Affymetrix Inc.and Genetix]和手动设备[如V & P Scientific]。菌落任选进入PVDF膜上的机器栅格(robotically gridded onto PVDF membranes)以诱导原位表达蛋白。

点大小和密度的极限是纳米阵列，其具有纳米空间尺度的点，能在小于1平方毫米的单张芯片上进行数千个反应。例如BioForce Nanosciences Inc.和Nanolink Inc公司已经开发了商业可得的纳米阵列。

荧光标记和检测方法已经广泛使用。与用于阅读DNA微阵列相同的仪器适用于蛋白阵列。为了差异显示，捕获阵列(如抗体)用来自两种不同细胞状态的荧光标记蛋白探究(probed)，其中细胞裂解物直接与不同的荧光团(如Cy-3、Cy-5)缀合并混合，这样颜色充当靶标丰度变化的读数。荧光读出灵敏度通过酪胺信号放大(TSA)(PerkinElmer Lifesciences)放大10到100倍。平面波导技术(Zeptosens)能进行超灵敏的荧光检测，其另外的优势是没有介入(intervening)洗涤步骤。使用藻红蛋白(Luminex)或半导体性质的纳米晶体(量子点)标记的悬浮体珠子和颗粒实现高的灵敏度，已经开发一些新的替代读出技术，尤其是在商业生物技术领域。这些包括表面等离子共振调节(HTSBiosystems，Intrinsic Bioprobes，Tempe，AZ)、滚环DNA扩增(Molecular Staging，New Haven，CT)、质谱(Intrinsic Bioprobes；Ciphergen，Fremont，CA)、共振光散射(Genicon Sciences，San Diego，CA)和原子力显微镜术[BioForceLaboratories]。

捕获阵列形成诊断芯片和表达谱阵列的基础。它们使用高亲和性捕获试剂(如常规抗体、单结构域、工程支架(engineered scaffolds)、肽或核酸适体)以高通量的方式结合并检测具体的目标配体。

抗体阵列具有所需的特异性和可接受背景的特性。一些抗体阵列可以通过商业途径获得(BD Biosciences，San Jose，CA；Clontech，Mountain View，CA；BioRad；Sigma，St.Louis，MO)。用于捕获阵列的抗体在从噬菌体或核糖体展示库(Cambridge Antibody Technology，Cambridge，UK；BioInvent，Lund，Sweden；Affitech，Walnut Creek，CA；Biosite，San Diego，CA)中选择以后可以通过常规免疫(多克隆血清和杂交瘤)或作为通常在大肠杆菌中表达的重组片段来获得。除常规抗体以外，Fab和scFv片段，来自camelids的单V结构域或者设计的人等价物(engineered human equivalents)(Domantis，Waltham，MA)任选用于阵列。

术语“支架”指蛋白的配体结合结构域，其设计为多种变型，所述变型能以类似抗体的特异性和亲和性性质结合多种靶分子。这些变型以基因库形式(genetic library format)产生，并针对单独靶标，通过噬菌体、细菌或核糖体显示进行选择。此类配体结合支架或框架包括基于金黄色葡萄球菌蛋白A的Affibodies(Affibody，Bromma，Sweden)、基于纤连蛋白的Trinectins(Phylos，Lexington，MA)和基于脂笼蛋白结构的Anticalins(Pieris Proteolab，Freising-Weihenstephan，Germany)。这些以类似于抗体的方式用于捕获阵列，并且具有稳固和易生产的优点。

非蛋白捕获分子(尤其以高特异性和亲和性结合蛋白配体的单链核酸适体)也用于阵列(SomaLogic，Boulder，CO)。通过Selex^TM程序(SomaLogic，Boulder，CO)从寡核苷酸库中选则适体，并且它们与蛋白的相互作用通过共价结合(通过并入溴化脱氧尿苷和紫外活化的交联(光适体))而增强。由于空间排列的需要，与配体的光交联降低适体的交联活性。适体具有以下优点：容易通过自动化寡核苷酸合成来制备，DNA稳定且坚固；在光适体阵列上，通常使用荧光蛋白染色来检测结合。

结合到抗体阵列上的蛋白分析物例如通过第二抗体而直接或间接检测。直接标记用于比较具有不同颜色的不同样品。当针对相同蛋白配体的成对抗体可以获得时，夹心免疫测定提供高的特异性和灵敏度，因此选择这种方法用于低丰度蛋白(例如细胞因子)；这种方法还为检测蛋白修饰提供可能性。无标记检测方法包括质谱、表面等离子体共振和原子力显微镜术，其避免配体的改变。任何方法都需要最优化灵敏度和特异性，具有低背景以提供高的信噪比。由于分析物的浓度覆盖范围宽，因此必须适当调整灵敏度。对该问题的解决是连续稀释样品或者使用不同亲和性的抗体。感兴趣蛋白经常是那些在体液或提取物中浓度低的蛋白(例如细胞因子或细胞中的低表达产品)，这需要检测pg级或更低范围。

捕获分子的阵列的一种选择是通过分子印记技术实现的一种阵列，其中肽(如蛋白的C-末端区域)用作模板，以在可聚合基质上产生结构互补、序列特异性的空腔；然后所述空腔能特异性地捕获具有合适初级氨基酸序列的(变性的)蛋白(ProteinPrint^TM，Aspira Biosystems，Burlingame，CA)。

另一种在诊断和表达谱中有用的方法是

阵列(Ciphergen，Fremont，CA)，其中，固相层析表面结合来自混合物(例如血浆或肿瘤提取物)的蛋白(具有相似的电荷特征或疏水性)，SELDI-TOF质谱用来检测残留的蛋白。

大规模的功能芯片已经通过固定大量纯化蛋白构建，并用来检测各种各样的生物化学功能，如与其它蛋白的蛋白相互作用，药物-靶相互作用，酶-底物等。一般来说，它们需要表达文库，将表达文库克隆入大肠杆菌、酵母或类似物，然后纯化(例如经由His标记)并固定从其中表达的蛋白。无细胞蛋白转录/翻译是可行的选择，用于合成在细菌或其它体内系统不能充分表达的蛋白。

对于检测蛋白-蛋白相互作用，蛋白阵列是对基于细胞的酵母双杂系统的体外替代，在后者缺乏的情况有用，例如涉及分泌的蛋白或含有二硫桥键(disulphide bridges)蛋白的相互作用。阵列上生化活性的高通量分析已被描述用于酵母蛋白激酶，以及用于酵母蛋白质组的各种功能(蛋白-蛋白和蛋白-脂相互作用)，其中所有酵母开放阅读框中的大部分都表达并固定在微阵列上。大规模蛋白质组芯片还有用于识别功能性相互作用，药物筛选等(Proteometrix，Branford，CT)。

作为单独元素的二维显示，为了选择特异性结合伴侣(binding partners)(包括抗体、合成支架、肽和适体)，蛋白阵列用于筛选噬菌体或核糖体展示库。这样，进行库对库筛选(library against library screening)。针对从基因组计划鉴定的蛋白钯的阵列对组合化学库中的候选药物进行筛选是该方法的另一个应用。

多元珠分析使用一系列用于捕获和定量可溶性分析物的光谱离散粒子。然后通过检测基于荧光的发射和流式细胞分析测定分析物。多元珠分析产生与基于ELISA的测定相当的数据，但是其为多元的或同时发生的形式。以与任何夹心形式测定的相同方法(即，通过使用已知的标准物并通过描绘未知物相对于标准物的曲线)，计算用于细胞计数珠阵列(cytometric bead array)的未知物的浓度。此外，多元珠分析允许对样品中的可溶性分析物定量，之前由于样品体积的限制，从未考虑这样做。除了定量数据，还产生强大的可视图像，所述图像揭示了为用户提供额外的一目了然的信息的独特谱(profiles)或信号(signatures)。

在公开方法的一些例子中，评价生物标记物的表达水平时，将该水平与参照标准中的生物标记物的表达水平相比较。“参照标准”是指特定生物标记物的表达水平，所述生物标记物来自没有癌症；处于癌症的选定阶段；或没有特定变量(例如治疗剂)的样品或对象。或者，参考标准包括已知量的生物标记物。此类已知量与没有癌症；处于癌症的选定阶段；或没有特定变量(例如治疗剂)的对象的平均水平相关。参照标准还包括本文所描述的一种或多种来自一种或多种所选样品或对象的生物标记物的表达水平。例如，参照标准包括对样品中一种或多种生物标记物的表达水平的评价，所述样品来自没有癌症；处于癌症进程的选定阶段；或没有接受癌症治疗的对象。另一个参照标准的例子包括对样品中一种或多种生物标记物的表达水平的评价，所述样品取自没有癌症；处于癌症进程的选定阶段；或没有接受癌症治疗的多个对象。

当参照标准包括没有治疗剂的样品或对象中的异构或多个生物标记物的表达水平，对照样品或对象任选是与用治疗剂治疗之前或之后的待测试样品或对象相同的样品或对象，或是没有治疗剂的所选择样品或对象。或者，参照标准是从许多没有具体癌症的对象中计算的平均表达水平。参照标准还包括本领域中已知的对照水平或值。在本文所公开的方法的一个方面中，参照标准与诊断患有癌症的对象的年龄匹配是合意的。

在一种比较来自两种不同样品(如来自诊断患有癌症的对象的样品和参照标准)的蛋白表达水平的技术中，使每种样品分别进行双向凝胶电泳分离。或者，对每种样品进行不同的标记，将两种样品上样到同一个双向电泳凝胶。参见Unlu等，Electrophoresis，1997；18：2071-2077，将该文献并入本文用于至少参考其对评价和比较蛋白表达水平的方法的教导。可通过双向凝胶电泳分离的蛋白图中的相对位置来鉴定每种样品中的相同蛋白或蛋白组。然后将第一种样品中的一种或多种蛋白的表达水平与第二种样品中的相同蛋白的表达水平进行比较，从而允许鉴定在两种样品间表达不同的蛋白或蛋白组(如生物标记物)。在怀疑对象患癌之前和之后、对其开始治疗方案前之前和之后以及在该治疗方案的过程中对对象进行这种比较。

在另一种技术中，一种或多种蛋白的表达水平在单个样品中是表达的总蛋白的百分比。将这种评估的表达水平与现已存在的参照标准比较，从而允许鉴定样品中相对于参照标准表达差异的蛋白。

与生物标记物以及本文公开的任何其它蛋白有关的各种序列公开在Genbank中，那里含有这些序列和通过引用整体并入以及以单独序列并入本文的其它序列。因此，本文提供各种序列，且这些和其它序列在网址为http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi的Genebank中找到。本领域技术人员理解如何解析序列差异和不同以及如何调整涉及具体序列或其它相关序列的组合物和方法。设计用于本文公开信息的任何序列的引物和/或探针是本领域已知的。例如，人ALDOA的基因序列在GenBank登录号NM_000034找到。人PGK1的基因序列在GenBank登录号NM_000291找到。人PRDX1的基因序列在GenBank登录号NM_002574找到。人COF1的基因序列在GenBank登录号NM_005507找到。人组蛋白H4的基因序列在GenBank登录号NM_175054找到。

还提供检测试剂盒，其包含对ALDOA、PGK1、PRDX1、COF1和组蛋白H4中的两种或更多种具有特异性的抗体。该检测试剂盒任选包含对ALDOA、PGK1和RDX1具有特异性的抗体。任选地，该检测试剂盒在分析系统中包含对ALDOA、PGK1、PRDX1、COF1和组蛋白H4中的两种或更多种具有特异性的抗体。例如，试剂盒进一步包含用于实施本文所述方法的说明书。此类试剂盒任选包含标记手段和/或治疗剂。

还提供多元分析系统，该系统包含固体支持物和用于测定样品中ALDOA、PGK1、PRDX1、COF1和组蛋白H4中的两种或更多种的水平的检测手段。所述检测手段是任何已知的或新发现的测定ALDOA、PGK1和PRDX1水平的组合物或系统。例如，所述检测手段包括特异性结合生物标记物的抗体或其它配体。固体支持物包括任何有用形式，如薄膜或膜、珠、瓶、器皿、纤维、光学纤维、编织纤维、芯片(chip)、光盘(compact disks)、成形的聚合物、颗粒和微粒。芯片是矩形的或正方形的小片材料。固态基材的优选形式为薄膜、珠或芯片。

实施例

实施例1

材料和方法

抗体：按照Ichikawa等人描述的方法(Ichikawa等、Nat.Med.7：954-602001)制备激动性(agonistic)抗人DR5抗体(TRA-8)。抗-ALDOA、抗-COF1和抗-PGK1抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)。抗-组蛋白H4和抗-PRDX1抗体购自Upstate Group，Inc.(Charlottesville，VA)。喜树碱衍生物CPT-11(Pfizer lnc.，New York，NY)和铂化合物奥沙利铂(Sanofi-Aventis，Bridgewater，NJ)得自University of Alabama at BirminghamHospital Pharmacy(Birmingham，AL)。紫杉醇购自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO)。

细胞：将COLO 205人结肠癌细胞和NCI-H2122人肺癌细胞保持在RPMI-1640培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，该培养基补充有4.5g/l葡萄糖、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠和10％热灭活胎牛血清(FBS；HyCloneLaboratories，Logan，UT)。在补充有0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和10％FBS的极限必需培养基(Invitrogen)中培养WiDr人结肠癌细胞和A-427人肺癌细胞。使HT-29人结肠癌细胞在补充有10mM HEPES、1mM丙酮酸钠和10％FBS的RPMI-1640培养基中生长。将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的2LMP亚克隆保持在含有10％FBS的Dulbecco改进的Eagle培养基(Invitrogen)中。在补充有10mg/ml胰岛素、4.5g/l葡萄糖、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠和10％FBS的RPMI-1640培养基中培养BT-474人乳腺癌细胞。所有的细胞系于37℃、在5％CO₂的加湿气氛中生长。

培养上清液(culture supernatant)样品的制备：对于2-DE，COLO 205细胞(2×10⁶cells)用磷酸缓冲盐溶液制备的DPBS(Mediatech、Herndon、VA)洗涤，并在血清饥饿条件下于37℃孵育24小时。用无血清培养基洗涤后，细胞在含有或不含TRA-8的10ml无血清培养基中37℃处理24小时。通过在4℃下以10,000×g离心30分钟回收培养上清液，用Centriplus(Millipore，Billerica，MA)浓缩，并用丙酮沉淀。将沉淀物在READYPREP^TM再水化(rehydration)/样品缓冲液(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)中再溶解。对于免疫印迹分析，将细胞(1×10⁶细胞)铺板(plated)并在完全培养基中37℃培养24小时。细胞用无血清培养基洗涤，并在含有或不含有TRA-8或化疗剂的5ml无血清培养基37℃中处理24小时。通过离心回收培养上清液，经浓缩并用丙醇沉淀。沉淀重新溶解于十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液(62.5mM Tris-盐酸，pH6.8、5％2-巯基乙醇、2％SDS、10％甘油和0.002％溴酚蓝)中。

双向凝胶电泳：通过被动再水化过夜将培养上清液样品加样到READYSTRIP^TM IPG条带，pH3～10(Bio-Rad Laboratories)上。使用

IEF小室(cell)(Bio-Rad Laboratories)进行等电聚焦。根据以下范例应用IEF电压：250V保持20分钟，8000V保持2.5小时以及8000V至达到20kVh。IEF之后，条带在READYPREP^TM平衡缓冲液I(Bio-RadLaboratories)中室温下平衡10分钟。然后在室温下于READYPREP^TM平衡缓冲液II(Bio-Rad Laboratories，Inc.)中孵育10分钟。第二向电泳在

Tris-HCl凝胶，8-16％(Bio-Rad Laboratories)中进行。按照制造商的说明书用

(Molecular Probes，Carlsbad，California)Ruby蛋白凝胶染色液(Bio-Rad Laboratories)将凝胶染色。

蛋白斑点(spot)的分析和鉴定：使用

分析软件(Bio-RadLaboratories)检测斑点并对各凝胶进行匹配。将所选择的斑点从凝胶上切离。用含有50％CH₃CN的20mM NH₄HCO₃脱色，用CH₃CN脱水，干燥。凝胶片用10μl 20mM NH₄HCO₃(pH8.0，含有10ng/ml测序级改良的胰蛋白酶(PromegaCo.，Madison，WI))在37℃下再水化并消化12小时。所得的肽用0.05％甲酸提取一次，并用含0.05％甲酸的CH₃CN提取两次。将合并的样品蒸发至2-3μl、加入10μl 0.05％甲酸，用配备串联质谱的液相色谱(LC-MS/MS)进行分析。

使用自制的填充Develosil ODS-HG(3μm，Nomura Chemical Co.，Ltd.，Aichi，Japan)的ESI小柱，在配备有DiNa(KYA Technologies Co.，日本东京)的Q-Tof Ultima API质谱仪(Q-Tof Ultima API mass spectrometer(Waters Co.，Milford，MA))上进行LC-MS/MS实验。使用线性梯度的0-35％CH₃CN(历时35分钟)以200nl/min的流速进行肽洗脱。样品体积为5μl。MS/MS光谱使用Mascot(Matrix Science Inc.，Boston，MA)从GenBank的不丰富蛋白数据库中搜索。

免疫印迹分析：将培养上清液样品在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中解析，然后进行免疫印迹。用山羊抗-ALDOA、抗-COF1或抗-PGK1抗体和过氧化物酶缀合(peroxidase-conjugated)的兔抗-山羊IgG(SouthernBiotechnology Associates，Birmingham，AL)分别作为第一抗体和第二抗体来检测ALDOA、COF1或PGK1。用抗-组蛋白H4或抗-PRDX1抗体和过氧化物酶缀合的山羊抗-兔IgG、鼠/人ads-HRP(Southern Biotechnology Associates)分别作为第一抗体和第二抗体来检测组蛋白H4或PRDX1。按照制造商的说明书使用ECL蛋白印迹检测试剂(GE Healthcare，Chalfont St.Giles，UK)。

流式细胞术分析：为了检测细胞表面上DR5的表达，细胞(1×10⁶)用含有5％FBS的PBS洗涤，并与5μg/ml TRA-8或同种型特异性鼠IgG1(SouthernBiotechnology Associates，Inc.，Birmingham，Alabama)于4℃孵育30分钟。用含有5％FBS的PBS洗涤后，用5μg/ml藻红蛋白(PE)缀合的山羊抗鼠IgG1的(Southern Biotechnology Associates，Inc.)于4℃处理细胞30分钟。然后，洗涤细胞，用1％的多聚甲醛固定，在FACScan流式细胞仪上用CellQuest软件(BD，Franklin Lakes，NJ)进行分析。

细胞成活力分析：为了检查血清的影响，将细胞(2×10⁴)铺板到96孔微型板上，在完全培养基中于37℃培养24小时，用无血清培养基洗涤，在100μl的完全培养基或无血清培养基中于37℃进一步培养，持续指定的时间。通过使用ATPlite^TM-M发光分析系统(PerkinElmer，Inc.，Waltham，MA)，按照生产商的说明书测定细胞ATP水平来评价细胞成活力，并确定为相对于培养在完全培养基中的细胞(用作对照)的发光值的百分比。细胞成活力分析重复三次实验。通过学生t检验(Student t test)统计数据。在学生t检验情况下，如果均匀性方差(variance of homogeneity)被拒绝(rejected)(F检验P＜0.05)，则使用韦尔奇检验。概率值(P值)小于0.05则认为有统计学意义。所有的P-值近似到(rounded to)小数点后第四位(four decimal places)。

为了评价无血清培养基中TRA-8的影响，如上所述培养细胞，用无血清培养基培养洗涤，并用100μl含有或不含有TRA-8或化疗剂的无血清培养基于37℃下处理，持续指定的时间。细胞成活力使用ATPLite^TM assay(PerkinElmer，Inc.，Waltham，MA)评价，并确定为相对于未经处理的细胞(用作对照)的发光值的百分比。细胞成活力重复三次实验。

带瘤小鼠血清的制备：将COLO 205细胞(1×10⁷)在第0天皮下接种入无胸腺小鼠。将小鼠随机分组。每组由三只小鼠构成。分别在第16和20天将10mg/kg的TRA-8腹腔内给予小鼠。分别在第17和21天，将33mg/kg的CPT-11静脉内给予小鼠。实体瘤的长度和宽度每周测量两次。肿瘤体积(mm³)计算为a×b²/2，其中a和b分别为肿瘤的长度和宽度(mm)。肿瘤的大小确定为相对于第16天的肿瘤体积的百分比。在第23天从带瘤小鼠获取血清。

ELISA的建立：用重组PRDX1对雌性BALB/c小鼠进行免疫。将来自局部淋巴结的淋巴细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合。通过针对重组PRDX1的ELISA筛选阳性杂交瘤。在得到若干个抗体之后，ELISA平板用捕获的抗体包被并用含有3％BSA的PBS封闭。各蛋白先后用生物素缀合的抗体和过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白进行检测。使用读板仪测定450nm处的吸光度(A₄₅₀)。血清中各蛋白的水平测定为A₄₅₀值。

结果

抗DR-5单克隆抗体TRA-8在没有交联剂或表面粘附(adherence)的情况下具有固有的激动活性(agonistic activity)并体外诱导各种癌细胞的凋亡。另外，在各种人肿瘤异种移植模型中，TRA-8在单独使用以及与化疗和/或放疗联合使用时均具有抗肿瘤活性。然而，尽管癌细胞上表达DR5，在癌细胞中观察到不同程度的TRA-8敏感性。目前不存在用于预测TRA-8功效的生物标记物。

在细胞凋亡过程中可从癌细胞释放或分泌蛋白，所引起的这些蛋白的水平变化可反映癌细胞对治疗剂的反应。有可能将这些蛋白用作生物标记物来监测并预测诸如TRA-8等治疗剂的效果。为了发现此类蛋白，从一些蛋白质组学技术中选择双向凝胶电泳(2-DE)与质谱(MS)联用以致力于含量相对丰富的蛋白。由于已经确定，人结肠癌细胞系COLO 205在其表面表达DR5，并且该细胞系是对TRA-8最为敏感的细胞系之一，因此，使用该细胞来发现从TRA-8敏感细胞中释放的蛋白。释放或分泌的蛋白具有作为潜在生物标记物的价值，因为在患者的血清或血浆中检测这些蛋白，而患者的血清或血浆是容易获得的样品。在TRA-8处理的COLO 205细胞的培养上清液通过2-DE分离，随后用SYPRO Ruby染色之后，使用

2-D分析软件基于凝胶之间的比较获得培养上清液的蛋白质组学谱(图1)。我们在经TRA-8处理的培养上清液中发现出现6个蛋白斑点。通过质谱将这些蛋白鉴定为PGK1、ALDOA、1型蛋白体β亚基(proteasome subunit beta type 1(PSB1))、PRDX1、COF1和组蛋白H4(表2)。这些数据表明，这些经TRA-8处理从COLO 205细胞释放到培养上清液中的蛋白是监测该抗体的细胞素毒性影响的生物标记物。

就发现用于预测癌细胞对抗癌药物的敏感性的生物标记物而言，将抗-DR5的抗体(TRA-8)用作抗癌药物。对一组15种人结肠癌细胞系就对TRA-8介导的凋亡的体外敏感性进行筛选(表1)。由于COLO 205细胞非常容易受到TRA-8处理的影响，因此选则该细胞用于最初的筛选，以便测定在TRA-8介导的凋亡过程中释放的蛋白谱。在用或不用TRA-8处理COLO205人结肠癌细胞之后，培养上清液通过双向凝胶电泳分离，并使用PDQuest 2-D分析软件确定从对照和TRA-8处理的COLO205细胞释放的差异表达蛋白(图1)。与未处理细胞相比，释放的蛋白随着TRA-8处理剂量的增加而增加(图1，环)。质谱分析显示这些在TRA-8处理的COLO205细胞培养上清液中新释放出来的蛋白分别是果糖二磷酸醛缩酶A(ALDOA)、切丝蛋白1(COF1)、组蛋白H4、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)和过氧化物氧还蛋白1(PRDX1)(表2)。这些蛋白表达水平的增加通过使用特异性抗体的蛋白印迹分析进一步证明。

表1

顺序法：细胞铺板→37℃/24h，加抗体→37℃/24h，分析细胞成活力

同步法：细胞铺板，加抗体→37℃/24h，分析细胞成活力

表2

为了确定COLO205细胞培养物中鉴定的这些蛋白是否与癌细胞对TRA-8的敏感性相关，选择三种人结肠癌细胞系COLO205、WiDr和HT29，所述细胞系代表对TRA-8介导的凋亡的不同敏感性。由于在血清饥饿的条件下用TRA-8处理细胞，因此检查血清饥饿对细胞成活力的影响。血清饥饿对三种细胞系的成活力影响极小或无影响，三种细胞系之间的TRA-8敏感性图形没有变化(图2A)。三种细胞系之间释放蛋白质的基线水平存在明显的差异，这似乎与肿瘤细胞对TRA-8介导的凋亡的敏感性相关。高敏感性的COLO205细胞释放最高基线水平的ALDOA、COF1、PGK1和PRDX1。对TRA-8中等敏感的WiDr细胞释放基线水平的PGK1和PRDX1两种蛋白，而TRA-8抵抗细胞HT29不释放任何可检测基线水平的这些蛋白(图2B)。用不同剂量的TRA-8处理时，通过与很低剂量(10ng/ml)的TRA-8孵育，增加了所有五种蛋白从COLO205细胞进入培养上清液的释放。用更高剂量(＞100ng/ml)的TRA-8处理时，WiDr细胞中观察到这些蛋白明显增加。相反，抵抗TRA-8的HT29细胞在低剂量TRA-8处理下没有释放显著水平的这些蛋白(pGK1除外)，COF1和PRDX1的释放需要高剂量(1μg/ml)的TRA-8。这些结果显示，这些蛋白在基线水平和经TRA-8诱导的水平都与肿瘤细胞对TRA-8介导的凋亡的敏感性相关。

为了确定这些鉴定的蛋白对于其它的类型的人癌细胞是否具有普遍性，检查这些蛋白在人乳腺癌细胞系2LMP和BT-474中的变化。血清饥饿对2LMP的细胞成活力(96％)和BT-474细胞成活力(87％)的影响极小。在这种情况下，TRA-8对2LMP细胞有显著的细胞毒效应，但对BT-474细胞没有显著的细胞毒性(图3A)。用TRA-8处理2LMP时，释放进入培养上清液中的ALDOA、COF1、组蛋白H4、PGK1和PRDX1明显增加(图3B)。用TRA-8处理BT-474细胞时，检测到LDOA和PRDX1增加。只有用高浓度(1μg/ml)的TRA-8处理时，才显示培养上清液中的COF1和组蛋白H4增加。PGK1在培养上清液中的增加最小。这些数据表明，ALDOA、COF1、组蛋白H4、PGK1和PRDX1的释放与抗DR5抗体对人乳腺癌细胞的细胞毒性功效相关。

然后，使用人肺癌细胞系NCI-H2122和A-427。与人结肠癌细胞和乳腺癌细胞一样，血清饥饿对NCI-H2122细胞成活力(87％)和A-427细胞成活力(82％)的影响极小。如图4A所示，在这种情况下，TRA-8对NCI-H2122具有显著的细胞毒效应，但对A-427细胞却没有。用TRA-8处理时，从NCI-H2122细胞释放进入培养上清液中的ALDOA、COF1、组蛋白H4、PGK1和PRDX1增加(图4B)。用TRA-8处理A-427细胞时，检测到PRDX1的增加。只有用终浓度(1μg/ml)的TRA-8处理时，才显示培养上清液中ALDOA、COF1和组蛋白H4增加。PGK1在培养上清液中轻微增加。这些数据显示，ALDOA、COF1、组蛋白H4、PGK1和PRDX1的释放与抗DR5抗体对人肺癌细胞的细胞毒性功效相关。

当TRA-处理后分析培养上清液中候选生物标记物的时程(time courses)时，这些生物标记物足够敏感，以预测TRA-8的功效(图5)。ALDOA、COF1、组蛋白H4、PGK1和PRDX1鉴定为使用人癌细胞监测TRA-8效应的潜在生物标记物，在人癌细胞中观察到不同程度的TRA-8敏感性。为了检查经TRA-8处理，多早可以检测这些释放的分子，利用TRA-8-敏感细胞系COLO 205、WiDr、2LMP和NCI-H2122。如图5A中所示，TRA-8以时间依赖的方式对这些细胞系具有显著的细胞毒效应。由于NCI-H2122细胞比其它细胞的生长慢，因此显示了TRA-8对NCI-H2122细胞的影响似乎比其它TRA-8敏感细胞弱。在TRA-8介导凋亡期间，以时间依赖的方式从细胞释放所有的候选生物标记物，但是细胞间释放生物标记物的程度不同(图5B)。在TRA-8处理1或2小时观察到释放的ALDOA和PRDX1增加，但是TRA-8在这些时间点不显示对细胞成活力的显著影响。虽然其他分子经TRA-8处理同样会增加，但是COF1和H4在早期时间点的释放水平低，并且释放的PGK1的变化小。这些结果显示，在候选生物标记物中，ALDOA和PRDX1是预测TRA-8的细胞毒效应的较敏感和较易于检测的生物标记物。

接下来，评价化疗剂对候选生物标记物的影响。一些化疗剂需要长期孵育，以达到对细胞的细胞毒效应。血清饥饿24小时对COLO 205、WiDr和HT-29的细胞成活力影响最小。相反，血清饥饿48小时对细胞具有影响。在这种情况下，使用CPT-11、奥沙利铂和紫杉醇作为化疗剂。当用化疗剂处理细胞24小时，奥沙利铂对WiDr细胞产生明显的影响(图6A)，CPT-11杀死71％的COLO205细胞，奥沙利铂杀死了41％的COLO205细胞和99％的WiDr细胞，紫杉醇杀死62％的COLO 205细胞和72％的WiDr细胞。免疫印迹显示，用奥沙利铂处理时，释放进入培养上清液中的ALDOA、COF1、组蛋白H4、PGK1和PRDX1增加(图6B)。与化疗剂孵育48小时，奥沙利铂和紫杉醇影响COLO205和WiDr细胞的细胞成活力，CPT-11对COLO205细胞具有明显影响(图6C)。在这种情况下，培养上清液中所检测的ALDOA、COF1、组蛋白H4、PGK1和PRDX1水平依赖于化疗剂的细胞毒效应(图6D)。从细胞释放的生物标记物的增加与化疗剂的细胞毒效应相关。这些数据表明ALDOA、COF1、组蛋白H4、PGK1和PRDX1用作预测化疗剂对人癌细胞的细胞毒功效的生物标记物。

为了确定癌细胞和组织是否表达高水平的PRDX1和PGK1，开发一组针对这些蛋白的单克隆抗体。使用一组人癌细胞系进行的蛋白印迹分析显示，所有测试的人癌细胞都表达高水平的PRDX1(图7A)和PGK1(图7B)。对一组人卵巢癌组织的免疫组化染色显示，癌细胞选择性表达高水平的PGK1(图7C)。PGK1表达水平和其他凋亡蛋白与TRA-8介导的源自腹水的癌细胞的凋亡以及患者的化疗反应的相关性总结在表3中

表3

为了测定生物标记物是否有用于监测并预测试剂在体内的功效，使用带COLO205肿瘤的小鼠来检查候选生物标记物是否能够预测抗癌药物对COLO205肿瘤的体内功效。对带COLO205肿瘤的小鼠每周施用两次TRA-8和/或CPT-11，持续仅一周后，从该小鼠回收血清并使用ELISA进行分析。虽然TRA-8或TRA-8加上CPT-11具有轻微的抗肿瘤功效，但是单独的CPT-11不显示抗肿瘤功效(图8A)。伴随施用TRA-8或TRA-8加上CPT-11使血清中ALDOA、PGK1和PRDX1的量增加(图8B)。因此，ALDOA、COF1、组蛋白H4、PGK1、PRDX1或者它们的组合用作生物标记物来预测癌细胞对抗癌药物的敏感性。

公开的是用于、联合使用于、或用于制备所公开的方法和组合物的材料、组合物和成分，或者公开的是所公开的方法和组合物的产品。本文公开这些和其他的材料，应理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能没有明确公开这些化合物中的每一个不同的个体或这些化合物的组合或排列的具体提及，但是上述每一种都明确考虑和描述于本文中。例如，如果公开及讨论生物标记物，以及讨论可对许多分子作出的许多修饰(包括生物标记物)，那么明确考虑该生物标记物和修饰的每一种可能的组合和排列，除非明确指出相反的情况。因此，如果公开一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，并公开了结合分子(combination molecule)的实例(A-D)，那么即使没有单独叙述每一种，也将每一种单独考虑并且共同(collectively)考虑。因此，在该例子中，明确考虑组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E、和C-F中的每一种，并且应通过A、B和C；D、E和F以及组合A-D的实例的公开而视为公开。相似地，还明确考虑并公开这些结合的任何子集或组合。因此，例如明确考虑子组(sub-group)A-E、B-F和C-E，并应该通过对A、B和C；D、E和F以及组合A-D的实例的公开而视为公开。这一概念应用于本发明应用的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开组合物的方法中的步骤。因此，如果有可实施的各种额外步骤，则应理解，这些额外步骤中的每一个与所公开的方法的任何具体实施方式或实施方式的组合一起实施，而且每一种此类组合是明确考虑的，并应视为被公开。

必须指出，本文和所附权利要求书中使用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数形式，除非上下文另有清楚说明。因而，例如，“一种生物标记物”包括许多这样的生物标记物，“该生物标记物“指一种或多种生物标记物和本领域技术人员已知的等同物，等等。

“任选的”或“任选地”指，随后描述的事件、情况或材料可能或可能不发生或存在，且该描述包括所述事件、情况或材料发生或存在的情况，和它不发生或不存在的情况。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常理解的含义。本文引用的出版物和它们引用的材料特别地在本文中引作参考。没有承认任何参考文献构成背景技术。讨论参考文献说明了它们的作者的观点，且申请人保留质询引用的文献的准确度和相关性的权力。应当清楚地理解，尽管在本文中提及许多出版物，但这样的参考文献不构成承认，任意这样的文件构成本领域的公知一般知识的部分。

贯穿说明书和本说明书的权利要求书中，词语“包含”和该词语的变体，例如包括和含有，指“包括但不限于”，且无意排除例如其它添加成分、组分、整数或步骤。

本领域技术人员将认识到或能使用仅仅常规试验来确定，本文所述方法和组合物的特定实施方案的许多等同方案。这样的等同方案意欲包含在所附权利要求书内。

Claims (25)

1.用于预测癌细胞对第一抗癌试剂的敏感性的方法，包括：

(a)使癌细胞与有效量的抗癌试剂接触，和

(b)评价细胞对一种或多种选自以下的生物标记物的释放：果糖-二磷酸醛缩酶A(ALDOA)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、过氧化物氧还蛋白1(PRDX1)、切丝蛋白1(COF1)和组蛋白H4；相比于对照细胞，接触细胞对生物标记物的释放的增加表示癌细胞对该试剂敏感。

2.如权利要求1所述的方法，其中在体内接触癌细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其中在体外接触癌细胞。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述抗癌试剂含有死亡受体激动剂。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述激动剂选自DR5抗体、DR4抗体、Fas配体、TNF和TNF-相关凋亡诱导配体(TRAIL)。

6.如权利要求5所述的方法，其中DR5抗体是TRA-8或者与TRA-8具有相同表位特异性的抗体。

7.如权利要求5所述的方法，其中DR5抗体是人源化TRA-8。

8.用于预测或监测抗癌试剂功效的方法，包括：

(a)将所述试剂给予对象；

(b)从所述对象获得生物学样品；和

(c)检测一种或多种选自ALDOA、PGK1、PRDX1、COF1和组蛋白H4的生物标记物的水平，与基线水平相比，水平的增加指示有功效。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述抗癌试剂包括死亡受体激动剂。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述激动剂选自DR5抗体、DR4抗体、Fas配体、TNF和TNF-相关凋亡诱导配体(TRAIL)。

11.如权利要求10所述的方法，其中DR5抗体是TRA-8或者与TRA-8具有相同表位特异性的抗体。

12.如权利要求10所述的方法，其中DR5抗体是人源化TRA-8。

13.检测试剂盒，其包含对ALDOA、PGK1、PRDX1、COF1和组蛋白H4中的两种或多种具有特异性的配体。

14.如权利要求13所述的检测试剂盒，其包含对ALDOA、PGK1和PRDX1具有特异性的配体。

15.如权利要求13所述的检测试剂盒，其中所述配体是抗体。

16.如权利要求14所述的检测试剂盒，其中所述配体是抗体。

17.多路测定系统，其包含固体支持物和用于测定样品中的ALDOA、PGK1、PRDX1、COF1和组蛋白H4中的两种或多种的水平的检测装置。

18.如权利要求17所述的多路测定，其中所述检测装置测定ALDOA、PGK1和PRDX1的水平。

19.检测抗癌试剂的有效剂量的方法，包括：

(a)在允许细胞释放选自果糖-二磷酸醛缩酶A(ALDOA)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、过氧化物氧还蛋白1(PRDX1)、切丝蛋白1(COF1)和组蛋白H4的一种或多种生物标记物的条件下，使一个或多个癌细胞与多种剂量的抗癌试剂接触；

(b)检测每种剂量下的释放，较高释放率指示有效剂量。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述抗癌试剂包括死亡受体激动剂。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述激动剂选自DR5抗体、DR4抗体、Fas配体、TNF和TNF-相关凋亡诱导配体(TRAIL)。

22.如权利要求21所述的方法，其中DR5抗体是TRA-8或者与TRA-8具有相同表位特异性的抗体。

23.如权利要求21所述的方法，其中DR5抗体是人源化TRA-8。

24.如权利要求19-23中任一项所述的方法，其中，至少一个细胞与多于一种剂量接触。

25.如权利要求19-23中任一项所述的方法，其中，各细胞只与一种剂量接触。

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