CN104583777A - 乳癌的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及乳癌标志物,该乳癌标志物选自由羧肽酶N2、细胞外基质蛋白1、血清淀粉样蛋白P成分、伴肌动蛋白、补体成分C8α链、载脂蛋白L1、黄素还原酶、过氧化氢酶、碳酸酐酶2、载脂蛋白C-I、核孔糖蛋白210、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、二磷酸甘油酸变位酶、碳酸酐酶1、及过氧化物还原酶2构成的群组。本发明还涉及检测试样中的该乳癌标志物,根据其结果进行鉴定的乳癌的鉴定方法,以及在该鉴定方法中使用的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及新型的乳癌标志物,及检测该标志物并根据其结果来鉴定(诊断、筛查)乳癌的方法,及用于该鉴定的试剂盒。
背景技术
目前,作为乳癌的诊断方法,有借助检测体液、血液等试样中的乳癌标志物的诊断,或借助乳房造影术的诊断。
就通过检测乳癌标志物诊断乳癌的方法而言,是将癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)作为标志物,用诊断试剂盒等测定试样中的量后,根据其结果来诊断乳癌。然而,该方法在显示乳癌特异性的精确度方面有欠缺,还没有成为实用性的乳癌确定诊断。
并且,在日本特开2002-131322号公报(专利文献1)中公开了将受试者的乳腺导管液用作为试样,通过检测乳腺导管液中的成分来鉴定具有乳癌或乳腺癌前病变的患者的方法。然而,该文献中虽然记载了包括细胞外基质蛋白或载脂蛋白在内的多个候选标志物,但只是罗列了候选标志物,并未进行乳癌患者乳腺导管液中的成分分析。因此,根据专利文献1的公开内容,并不能确定所列举的多个标志物作为乳癌标志物是否真正有用的问题。
并且,在日本特表2008-502891号公报(专利文献2)中记载了以下技术方案,即,用LC-ESI-MS/MS(液相色谱-电喷射离子化-串联质谱分析)分析乳癌患者的组织片,选择PDX1(Peroxiredoxin-1,过氧化物还原酶1)作为乳癌的候选标志物,及对乳癌患者的血清中的PXD1进行了检测。并且,对于通过并用PDX1和其他标志物来诊断乳癌的问题也做了提示。然而,对于显示这些标志物是乳癌特异性的证据,例如,对于来自非乳癌受试者的试样中的这些标志物的测定结果等没有做公开。因此,对于PDX1作为乳癌标志物是否有用,及其与其他标志物的组合对于乳癌的诊断是否有用的问题并没有得到确认。
并且,就使用乳房造影术的乳癌的诊断方法而言,会给检查的被检查者(受试者)带来不少精神及肉体上的痛苦。并且,由于乳腺密度高的青年人群的造影困难,因此还没有成为精确度高的乳癌诊断技术。
此外,近年来,有关生物标志物(蛋白质/多肽、脂质、糖链等)的探索的研究变得活跃,尤其是与疾病相关的利用各种体液的蛋白质组学等系统性分析研究得以普遍展开。通过这些分析,能够对取自生物体的微量试样进行高灵敏度且精确的分析。在F.Mannello et al.Expert Rev.Proteomics 6,43-60(2009)(非专利文献1)中,对于利用蛋白质组分析方法进行乳癌标志物的研究的情况进行了介绍。然而,就作为乳癌标志物而言,目前还没有确定乳癌诊断精确度高的乳癌标志物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2002-131322号公报
专利文献2:日本特表2008-502891号公报
非专利文献
非专利文献1:F.Mannello et al.Expert Rev.Proteomics 6,43-60(2009)
发明内容
发明要解决的问题
由于现有的乳癌诊断方法存在如上所述的问题,乳癌检查、受诊率得不到提高,延迟了早期乳癌及乳癌的诊断,其结果,乳癌罹患率及乳癌死亡率的降低变得困难,并成为了大的社会问题。为了解决这些问题,目前对于用更为低侵袭且精确度高的乳癌标志性蛋白质作为乳癌诊断的指标的、新型的乳癌诊断技术的开发提出了要求。
本发明的目的在于提供对于乳癌的检测有用的新型的乳癌标志物,及通过检测该乳癌标志物得以实现的精确度高的、新型的乳癌鉴定方法。
解决问题的方法
出于解决上述问题的目的,本发明采用了以下的技术方案。
1)一种乳癌标志物,该乳癌标志物选自由羧肽酶N2(Carboxypeptidase Nsubunit 2)、细胞外基质蛋白1、血清淀粉样蛋白P成分、伴肌动蛋白、补体成分C8α链、载脂蛋白L1、黄素还原酶、过氧化氢酶、碳酸酐酶2(Carbonicanhydrase 2)、载脂蛋白C-I、核孔糖蛋白210、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](Superoxide dismutase[Cu-Zn])、二磷酸甘油酸变位酶(Bisphosphoglyceratemutase)、碳酸酐酶1(Carbonic anhydrase 1)、及过氧化物还原酶2(Peroxiredoxin-2)构成的群组。
2)一种乳癌的鉴定方法,该方法检测在由试样中的羧肽酶N2、细胞外基质蛋白1、血清淀粉样蛋白P成分、伴肌动蛋白、补体成分C8α链、载脂蛋白L1、黄素还原酶、过氧化氢酶、碳酸酐酶2(Carbonic anhydrase 2)、载脂蛋白C-I、核孔糖蛋白210、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](Superoxide dismutase[Cu-Zn])、二磷酸甘油酸变位酶、碳酸酐酶1(Carbonic anhydrase 1)、及过氧化物还原酶2构成的群组中任意选择的一种以上的乳癌标志物,根据其结果进行鉴定。
3)一种试剂盒,该试剂盒是为了鉴定乳癌而对乳癌标志物进行检测的试剂盒,包含对选自由羧肽酶N2、细胞外基质蛋白1、血清淀粉样蛋白P成分、伴肌动蛋白、补体成分C8α链、载脂蛋白L1、黄素还原酶、过氧化氢酶、碳酸酐酶2(Carbonic anhydrase 2)、载脂蛋白C-I、核孔糖蛋白210、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](Superoxide dismutase[Cu-Zn])、二磷酸甘油酸变位酶、碳酸酐酶1(Carbonic anhydrase 1)、及过氧化物还原酶2构成的群组中的乳癌标志物进行检测的试剂。
即,为了确立解决上述问题的、乳癌诊断的精确度高的乳癌标志物及使用该标志物的乳癌的鉴定方法,本发明人进行了潜心研究,从而将可以直接获得乳癌发病部位、即乳管内的信息的乳头分泌液(Nipple discharge,ND)作为试样,通过应用借助了最新的二维液相色谱(LC)/质量分析(MS)系统、即纳米LC-ESI-MS/MS的蛋白质组学,对含有多种成分的乳头分泌液中的成分进行了分析。随后,将来自乳癌患者的乳头分泌液和来自非乳癌受试者的乳头分泌液用作为试样,通过比较纳米LC-ESI-MS/MS的结果,筛选出了有望作为乳癌标志物的新的标志物。进而发现,将这些标志物用作为指标时,能够高精确度地鉴定乳癌,从而完成了本发明。
发明的效果
利用了本发明的乳癌标志物的鉴定方法使精确度更高的乳癌鉴定(诊断、筛查)成为了可能。并且,作为本发明的乳癌标志物,例如,在乳头分泌液中即可发现,因此,能够非侵袭性地且简便地鉴定(诊断、筛查)乳癌。
附图说明
图1示出了对实施例1中得到的、来自乳癌患者及非乳癌受试者的试样中的各种蛋白质成分进行检测的结果、及据此得出的统计结果,其中,1)表示羧肽酶N2的测定结果,2)表示细胞外基质蛋白1的测定结果,3)表示对血清淀粉样蛋白P成分的测定结果。
图2示出了对实施例1中得到的、来自乳癌患者及非乳癌受试者的试样中的各种蛋白质成分进行检测的结果、及据此得出的统计结果,其中,1)表示伴肌动蛋白的测定结果,2)表示补体成分C8α链的测定结果,3)表示载脂蛋白L1的测定结果。
图3示出了对实施例1中得到的、来自乳癌患者及非乳癌受试者的试样中的各种蛋白质成分进行检测的结果、及据此得出的统计结果,其中,1)表示黄素还原酶的测定结果,2)表示过氧化氢酶的测定结果,3)表示碳酸酐酶2(Carbonic anhydrase 2)的测定结果。
图4示出了对实施例1中得到的、来自乳癌患者及非乳癌受试者的试样中的各种蛋白质成分进行检测的结果、及据此得出的统计结果,其中,1)表示载脂蛋白C-I的测定结果,2)表示核孔糖蛋白210的测定结果,3)表示超氧化物歧化酶[Cu-Zn]的测定结果。
图5表示对实施例1中得到的、来自乳癌患者及非乳癌受试者的试样中的各种蛋白质成分进行检测的结果、及据此得出的统计结果,其中,1)表示二磷酸甘油酸变位酶的测定结果,2)表示碳酸酐酶1(Carbonic anhydrase 1)的测定结果,3)表示过氧化物还原酶2的测定结果。
具体实施方式
作为本发明的乳癌标志物,可以列举选自由羧肽酶N2、细胞外基质蛋白1、血清淀粉样蛋白P成分、伴肌动蛋白、补体成分C8α链、载脂蛋白L1、黄素还原酶、过氧化氢酶、碳酸酐酶2(Carbonic anhydrase 2)、载脂蛋白C-I、核孔糖蛋白210、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](Superoxide dismutase[Cu-Zn])、二磷酸甘油酸变位酶、碳酸酐酶1(Carbonic anhydrase 1)、及过氧化物还原酶2构成的群组中的乳癌标志物(以下,也有将这些概括性地称为“本发明的乳癌标志物”的情况)。这些成分本身虽然是已知的,但将这些成分用作为鉴定乳癌的指标(乳癌标志物)则是本发明人的发现和首创。
本发明的乳癌的鉴定方法是“检测本发明的乳癌标志物,根据其结果进行鉴定的乳癌的鉴定方法”。
作为为此进行的检测本发明的乳癌标志物的方法,可以列举对本发明的乳癌标志物的各成分进行检测、测定的常规方法。作为在其中使用的检测、测定乳癌标志物的试剂,只要是在检测、测定该乳癌标志物的各成分的常规方法中使用的试剂即可。
作为检测本发明的乳癌标志物的方法的例子,例如,除了可以列举使用了对本发明的乳癌标志物具有亲和性的物质(例如,抗体、凝集素、多糖类、DNA、酶底物、蛋白质、各种受体、各种配体等)的、所谓的酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、利用简易免疫色谱法的测定法等本身已知的基于免疫学测定法的方法之外,还可以列举这些方法与高速液相色谱法(HPLC)、电泳法、毛细管电泳法、毛细管芯片电泳法等组合而成的方法等。作为其测定原理,例如,可以列举夹心法、竞争法、双抗体法等,但并限定于此。
并且,例如,也可以采用免疫乳胶比浊法、免疫散射比浊法等基于免疫凝集法的测定法来检测本发明的乳癌标志物。作为这些检测方法,也可以根据本身已知的方法进行。
作为用于检测本发明的乳癌标志物的针对乳癌标志物的抗体,只要是能够识别本发明的乳癌标志物或其部分肽、或它们的盐的抗体即可,对此没有特别的限定。例如,可以是多克隆抗体、单克隆抗体中的任意一种,这些抗体可以单独或适当组合使用等,可以采取任意的方式加以使用。并且,大体上来说,也可以用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等酶消化这些抗体后,以F(ab')2、Fab'或Fab的形式加以使用。此外,还可以使用针对本发明的乳癌标志物的市售的抗体。
对于检测上述的本发明的乳癌标志物时使用的试剂及该试剂在检测时的浓度、实施检测时的测定条件等(反应温度、反应时间、反应时的pH,测定波长、测定装置等),全部按照本身已知的如上所述的免疫学测定法的测定操作法进行设定即可,作为所使用的自动分析装置、分光光度系统等,也可以使用通常在该领域中使用的设备。
作为在上述的本发明的乳癌标志物的检测中使用的这些试剂,可以包括通常在该领域中所使用的试剂类,例如,缓冲剂、反应促进剂、糖类、蛋白质、盐类、表面活性剂等稳定剂、防腐剂等不损害共存的试剂等的稳定性,且不阻碍本发明的乳癌标志物与针对本发明的乳癌标志物的抗体等之间的反应的试剂。并且,作为其浓度,通常也可以在该领域通常使用的浓度范围中适当地进行选择。
当检测对象的乳癌标志物为酶时,作为检测乳癌标志物的方法,也可以列举使该标志物与显色试剂反应后生成显色反应,用分光光度计等测定所生成的色素量的方法等本身已知的方法。作为以这种目的使用的显色试剂等,可以列举通常在该领域中所使用的显色试剂等,可以根据测定对象的酶来适当选择。并且,作为这些显色试剂的使用浓度,也可以根据通常在该领域使用的浓度范围来适当设定。
并且,也可以将两种以上的本发明的乳癌标志物组合起来进行检测。作为该组合,将本发明的乳癌标志物中的任意两种以上进行组合即可,对此没有特别的限定。
进而,也可以是一种以上的本发明的乳癌标志物、与本发明的乳癌标志物以外的一种以上的乳癌标志物的任意组合。
此外,检测本发明的乳癌标志物时,并不局限在手动检测法,也可以采用使用了自动分析装置的测定系统来进行。当采用手动检测法或自动分析装置进行测定时,对于试剂类等的组合等没有特别的限制,可以根据所采用的自动分析装置的环境、机种,或考虑其他因素来适当地选择被认为是最好的试剂类等的组合。
进而,可以借助所谓的纳米LC-ESI-MS/MS来进行蛋白质系统分析,从而对本发明的乳癌标志物进行检测。纳米LC-ESI-MS/MS是如下的一种方法,即,作为分离手段使用纳米液相色谱仪,以几百nL/min的低流速输送液体,对于由多个成分构成的试样,用液相色谱仪分离试样中的成分后,在线通过电喷射离子化法进行质量分析,对于通过该质量分析确定的质量成分,再次用碰撞诱导解离进行质量分析。该分析方法在进行一次质量分析后,只针对特定质量成分再次实施质量分析,从而进一步对得到的片断模式进行分析,因此能够进行更为详细的分析。
当用纳米LC-ESI-MS/MS检测本发明的乳癌标志物时,例如,针对上述纳米LC-ESI-MS/MS的LC部分,可以用pH不同的两个分离系统通过二维纳米LC-ESI-MS/MS来进行蛋白质系统分析,从而进行检测。
作为通过二维纳米LC-ESI-MS/MS来检测本发明的乳癌标志物的方法,具体的例子如下所述。
作为第一维的液相色谱仪,例如,使用反相柱,作为流动相,例如,采用约20mM的甲酸铵水溶液或约70mM的三乙胺水溶液等碱性溶液(pH9~10)、和乙腈,以数μL/min(优选5~500μL/min)的低流速输送液体,分离试样中的成分后,例如,以1~10分钟间隔程度的一定时间间隔来分取数十个组分。随后,使分取的各组分中的溶剂蒸发后,在各组分中加入0.1%三氟乙酸水溶液,从而使分离了的成分溶解。
随后,将得到的各组分溶液的各自全部量分别加入到第二维的液相色谱仪,用以下的方法进行分离。即,将上述的各组分溶液的各自全部量分别上样至反相色谱柱,作为流动相,例如,采用0.1%甲酸水溶液等酸性溶液(pH2~3)、和乙腈/0.1%甲酸,以数十~数百nL/min(优选50~500nL/min)的低流速输送液体,分离各组分中的多个成分后,在线进行ESI-MS/MS。
作为利用二维纳米LC-ESI-MS/MS进行的分析,分离性能更好于单一维度的纳米LC-ESI-MS/MS,因此,能够进行更为系统的蛋白质分析。使用内部标准物质等进行测定时,也能够进行定量分析。
通过以上的方法检测本发明的乳癌标志物以后,基于该结果,获得将本发明的乳癌标志物作为指标来对乳癌进行鉴定的、本发明的乳癌标志物的相关数据(例如,本发明的乳癌标志物的存在有无、浓度、量增加的程度等信息)。利用得到的数据,例如,通过下述的方法进行乳癌的鉴定(诊断、筛查)。
即,例如,检测来自受试者的试样中的本发明的乳癌标志物以后,基于该乳癌标志物被检测到的检查结果,能够进行受试者有患乳癌的可能、或患乳癌的可能性高等的鉴定。或者,没有检查到该乳癌标志物时,能够进行受试者无患乳癌的可能、或患乳癌的可能性低等的鉴定。
作为其他方法,首先,根据上述的方法确定试样中含有的本发明的乳癌标志物的量。其次,将该结果与预先用来自非乳癌受试者的试样作为别的试样进行同样测定的结果进行比较,基于来自受试者的试样中含有的该乳癌标志物的量多于来自非乳癌受试者的试样中含有的该乳癌标志物的量的检测结果,能够进行受试者有患乳癌的可能、或患乳癌的可能性高等的鉴定。或者,基于在来自受试者的试样中含有的该乳癌标志物的量、与来自非乳癌受试者的试样中含有的该乳癌标志物的量之间无法确认到显著差异的检查结果,能够进行受试者无患乳癌的可能、或患乳癌的可能性低等的鉴定。
并且,预先设定好基准值以后,基于本发明的乳癌标志物的量高于该乳癌标志物的基准值的检查结果,能够进行受试者有患乳癌的可能、或受试者患乳癌的可能性高等的鉴定。并且,也可以对应于该乳癌标志物的量或该乳癌标志物量的范围来设定多个鉴定级别(例如,1)无患乳癌的可能、2)患乳癌的可能性低、3)有患乳癌的征兆、4)患乳癌的可能性高等),从而判断检查结果处于哪个鉴定级别。
再者,针对同一受试者,将在某一时间点测定的来自受试者的试样中的本发明的乳癌标志物的量与不同时间点的该乳癌标志物的量进行比较以后,通过评价该乳癌标志物的量有无增减和/或增减的程度,还能够进行乳癌的进展度或恶性度的诊断、或者手术后的预后诊断。即,基于该乳癌标志物的量增加被确认的检查结果,能够进行病情发展到乳癌(或者乳癌的恶性度增大)、病情向乳癌发展的征兆被确认(或者乳癌的恶性度增大的征兆被确认)的鉴定。并且,基于来自受试者的试样中的该乳癌标志物的量减少被确认的检查结果,能够进行乳癌的病情改善、或乳癌病情改善的征兆被确认的鉴定。并且,基于没有确认到该乳癌标志物的量变动的检查结果,能够进行病情没有变化的鉴定。
此外,还可以列举检测、测定两个以上的本发明的乳癌标志物,从而根据其结果来进行乳癌鉴定的方法。例如,通过单独或组合两种以上的本发明的乳癌标志物来进行检测,能够得到乳癌患者特征性的本发明的乳癌标志物的存在模式。从而,从受试者的乳头分泌液等试样中检测、鉴定本发明的乳癌标志物以后,通过分析这些多个本发明的乳癌标志物的存在模式,能够进行受试者是否有乳癌病症的推定。
作为两个以上的乳癌标志物的组合,可以从本发明的乳癌标志物构成的群组中任意地进行选择。
并且,也可以对一种以上的本发明的乳癌标志物和本发明的乳癌标志物以外的一种以上的乳癌标志物进行检测、测定,从而用与上述相同的方法进行乳癌的鉴定。检测本发明的乳癌标志物以外的乳癌标志物时,可以用各个乳癌标志物相应的本身已知的方法进行。
作为检测本发明的乳癌标志物时使用的试样,可以列举受试者的乳头分泌液、或血液(全血)、血清、血浆、尿、淋巴等来自生物体的试样等,但并不限于此。
作为乳头分泌液,可以列举从受试者的一侧或两侧的乳房自然分泌的乳头分泌液、通过乳房的按摩渗出的分泌液、乳头吸引液等,但并不限于此。
作为试样,如果使用乳头分泌液,则可以对受试者用非侵袭性的方式采取试样,因此从患者的负担极少的观点来看是优异的。
作为本发明的“为了乳癌的鉴定而对乳癌标志物进行检测的试剂盒”,含有检测本发明的乳癌标志物的试剂作为构成要素。
作为“检测本发明的乳癌标志物的试剂”及其构成要素的优选的实施方式和具体例子,如同在上述的有关检测本发明的乳癌标志物的方法的说明中所述。并且,就这些试剂的浓度等的优选的实施方式而言,通常也可以在该领域通常使用的浓度范围做适当选择。
例如,作为检测本发明的乳癌标志物的试剂的例子,可以列举含有对该乳癌标志物具有亲和性的物质的试剂。并且,作为对该乳癌标志物具有亲和性的物质的例子,例如,可以列举抗体或凝集素等。
该试剂盒可以是以检测一种乳癌标志物的试剂或试剂盒作为构成要素的试剂盒,也可以是由检测多个乳癌标志物的、多个试剂或试剂盒的组合构成的试剂盒。并且,作为检测多个乳癌标志物的、多个试剂或试剂盒的组合,除了检测多个本发明的乳癌标志物的、多个试剂或试剂盒的组合以外,可以列举检测一种或多个本发明的乳癌标志物的一种或多个试剂或试剂盒、和检测本发明的乳癌标志物以外的一种或多个乳癌标志物的、一种或多个试剂或试剂盒的组合等。
并且,在这些试剂盒中含有的试剂中,可以含有通常在该领域使用的试剂类,例如,缓冲剂、反应促进剂、糖类、蛋白质、盐类、表面活性剂等稳定剂、防腐剂等不损害共存的试剂等的稳定性,且不阻碍本发明的乳癌标志物与抗体(或凝集素等)的反应的物质。并且,作为其浓度,通常也可以在该领域通常使用的浓度范围做适当选择。
再者,也可以是组合了检测该乳癌标志物时所用的、校正曲线绘制用的乳癌标志物的标准的试剂盒。作为该标准,可以使用市售的标准品,也可以使用根据公知的方法制造的标准品。
以下,基于实施例具体说明本发明,但本发明并不受这些实施例的任何限定。
实施例
实施例1乳癌的标志物的筛选
1)试样的前处理
将从乳癌患者(11名)采样的各乳头分泌液(数μL)加入到100μL样品保存液(含有50mM碳酸氢铵和0.02%叠氮化钠的水溶液)中,在4℃、18000×g离心5分钟。分取上清液后,通过采用了280nm波长的紫外线的紫外吸收法求出蛋白质浓度,随后用50mM碳酸氢铵水溶液配制蛋白质浓度为0.5mg/mL的溶液。加入45mM二硫苏糖醇水溶液1.41μL进行还原后,为了使蛋白质变性,加入三氟乙醇至50%,随后在60℃加热1小时。加热后恢复到室温,加入100mM的碘乙酰胺水溶液1.41μL,在室温暗环境下进行了1小时烷基化。随后,从烷基化产物中分取10μL,加入90μL的50mM碳酸氢铵水溶液,将三氟乙醇的比例调节至5%。进而,加入100ng/μL的胰蛋白酶(质谱级,PromegaCorporation,Madison,WI,USA)的溶液1.2μL(含蛋白质重量的1/20量的胰蛋白酶),在37℃蕴育一晩。对于得到的胰蛋白酶消化产物(换算成蛋白质时,为约350fmol/μL),用以下的方法进行了二维纳米LC-ESI-MS/MS测定。
另外,对于由于乳头分泌的分泌液而感到不适的受诊人(受试者)、但被诊断为非乳癌的非乳癌受试者(15名),对其乳头分泌液进行采样后,与上述相同地进行了处理。
2)二维纳米LC-ESI-MS/MS测定
对于由上述1)得到的胰蛋白酶消化产物中的40μL,用在二维纳米HPLC系统(UltiMate 3000,Thermo Fisher Scientific Inc.(Dionex),Waltham,MA,USA)中安装的Acclaim PA2,300μm i.d.×15cm反相柱(Thermo Fisher ScientificInc.(Dionex),Waltham,MA,USA),并用20mM甲酸铵水溶液、pH10.0作为A溶剂、乙腈作为B溶剂,用75分钟的梯度洗脱(12~95%的B溶剂)进行分离,从而得到了26个组分。将这些组分在70℃加热4小时,从而使溶剂蒸发。随后,在各组分中加入0.1%三氟乙酸水溶液30μL,使分离的成分溶解。随后,对于所得到的各组分溶液的各自的全部量,分别用L-column MicroL2-C18,75μm i.d.×15cm反相柱((财)化学物质评价研究机构制),并用0.1%甲酸水溶液作为A溶剂、乙腈/0.1%甲酸作为B溶剂,以45分钟的梯度洗脱(2~95%的B溶剂)进行分离后,在安装了纳米ESI离子源的ESI-离子阱型质量分析仪(HCTultra,Bruker Daltonik GmbH,Bremen,Germany)上利用数据依赖性扫描连续地进行了在线分析。对于各试样,进行了两回合的上样测定。
二维纳米LC-ESI-MS/MS分析的各条件如下所述。
i)LC条件
[第一维]
HPLC柱:Acclaim PA2,300μm i.d.×15cm反相柱(Thermo Fisher ScientificInc.(Dionex)制)
流速:6.0μL/分钟
A溶剂:20mM甲酸铵水溶液、pH10.0
B溶剂:乙腈
洗脱:0分钟→19分钟:从12%到20%的B溶剂为止的线性梯度、
19分钟→29分钟:到48%的B溶剂为止的线性梯度、
29分钟→34分钟:用95%的B溶剂洗涤、
34分钟→75分钟:用2%的B溶剂平衡化。
(此外,洗脱开始后立刻提高了B溶剂的浓度,因此,洗脱开始后几乎在0分钟,洗脱液的B溶剂的浓度变为了12%)
柱温度:35℃
注入量:40μL
组分数:26
[第二维]
HPLC柱:L-column Micro L2-C18,75μm i.d.×15cm反相柱((财)化学物质评价研究机构制)
流速:300nL/分钟
A溶剂:0.1%甲酸水溶液、pH2.0
B溶剂:乙腈/0.1%甲酸
洗脱:0分钟→1分钟:到8%的B溶剂为止的线性梯度、
1分钟→20分钟:到20%的B溶剂为止的线性梯度、
20分钟→25分钟:到35%的B溶剂为止的线性梯度、
25分钟→30分钟:用95%的B溶剂洗涤、
30分钟→45分钟:用2%的B溶剂平衡化。
柱温度:室温
注入量:30μL
ii)ESI-MS/MS条件
离子化法:电喷射离子化法(Electrospray ionization法、ESI法)
测定离子:正离子
喷雾电压:1200V
干燥气:氮(4L/min)
离子源温度:160℃
扫描范围:m/z 300~1500(MS/MS测定时:m/z 50~2200)
前体离子选择数:4离子/质谱
最小前体离子强度:50000计数
前体离子选择排除时间:30秒
前体离子排除价数:1
iii)蛋白质鉴定分析条件
蛋白质检索引擎:Mascot(Matrix Science Ltd.,London,UK)
蛋白质检索方法:MS/MS Ion Search
蛋白质数据库:Swiss-Prot
蛋白质检索时动物物种分类:Homo sapiens(人)
蛋白质检索时翻译后修饰设定:Carbamidomethyl(半胱氨酸残基修饰)
胰蛋白酶未切断部位允许次数:1
前体离子质量允许值:±0.5Da
产物离子质量允许值:±1Da
鉴定蛋白质分析软件:Scaffold(Proteome Software,Inc.,Portland,OR,USA)
3)二维纳米LC-ESI-MS/MS测定的结果
通过二维纳米LC-ESI-MS/MS测定,在来自乳癌患者的试样中测定出350种、及在来自非乳癌受试者的试样中测定出479种总计575种的蛋白质成分。在此需要特别说明的是,在这一分析中,从乳癌患者试样及非乳癌受试者试样的两方中检测到了专利文献2记载的过氧化物还原酶1,因此,该物质的测出并不是乳癌患者特异性的。
随后,作为乳癌的候选标志物,通过以下的方法筛选出了从乳癌患者试样中特异性地检测到的蛋白质。
4)乳癌的候选标志物的筛选
基于上述3)的结果,求出了
i)进行分析的11名乳癌患者中的、在试样中检测到各蛋白质成分的乳癌患者数(n1)的比例(比率A),
ii)进行分析的15名非乳癌受试者中的、在试样中检测到各蛋白质成分的非乳癌受试者数(n2)的比例(比率B),及
iii)比率A/比率B(比率C)。
限于篇幅,在上述3)检测出的575种蛋白质成分中,将比率C为2.00以上的蛋白质成分一览列在下述表1中。
表1
进而,在表1列举的蛋白质成分的一览中排除疑似为来自血液成分的蛋白质成分等后,将比率C为2.4以上的蛋白质成分中、且以质谱中检测到的肽峰值为基准算出的表示蛋白质成分的存在量的图谱计数值在乳癌患者及非乳癌受试者之间具有统计学上的显著差异的蛋白质成分(在曼-惠特尼U检验(Mann-Wthitney U test)中,p<0.05的蛋白质成分)选定为了乳癌的候选标志物。将选定的乳癌标志物及各乳癌标志物的比率A、B、C示于表2,将统计结果示于图1~图5。
此外,在表2中,比率B为0时,则意味着从非乳癌受试者中没有检测到该乳癌标志物,从而比率C的值变得无法求出。因此,将此时的比率C记为与n1的乳癌患者数相同的数值(*)。
表2
即,将表2记载的羧肽酶N2(Carboxypeptidase N subunit 2)、细胞外基质蛋白1(Extracellular matrix protein 1)、血清淀粉样蛋白P成分(Serum amyloidP-component)、伴肌动蛋白(Nebulin)、补体成分C8α链(Complement componentC8alpha chain)、载脂蛋白L1(Apolipoprotein L1)、黄素还原酶(Flavinreductase)、过氧化氢酶(Catalase)、碳酸酐酶2(Carbonic anhydrase 2)、载脂蛋白C-I(Apolipoprotein C-I)、核孔糖蛋白210(Nuclear pore membraneglycoprotein 210)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](Superoxide dismutase[Cu-Zn])、二磷酸甘油酸变位酶(Bisphosphoglycerate mutase)、碳酸酐酶1(Carbonicanhydrase 1)、及过氧化物还原酶2(Peroxiredoxin 2)筛选为了本发明的乳癌标志物。
由表2及图1~5明确可知,与非乳癌受试者的乳头分泌液中的浓度相比,这些乳癌标志物在乳癌患者的乳头分泌液中高浓度地存在。并且,这些成分由于目前还没有作为乳癌标志物使用过,因此作为新型的乳癌标志物是极有希望的。
并且,通过将这些乳癌标志物单独或组合两种以上来进行检测,有望可以进行乳癌、及其进展度的鉴定。例如,通过将这些乳癌标志物单独或组合两种以上来进行检测,能够得到乳癌患者特征性的本发明的乳癌标志物的存在模式。从而,通过从受试者的乳头分泌液等试样中检测、鉴定本发明的乳癌标志物,并对这些多个乳癌标志物的存在模式进行分析,有望实现受试者是否患有乳癌的推定。
工业实用性
通过利用本发明的乳癌标志物的鉴定方法,能够实现精确度更高的乳癌的鉴定(诊断、筛查)。并且,作为本发明的乳癌标志物,例如,可以从乳头分泌液中检测到,因此,能够非侵袭性且简便地对乳癌进行鉴定(诊断、筛查)。其结果,通过精神上及肉体上痛苦少的本发明的乳癌诊断,能够促进年轻世代或哺乳中、哺乳期过后的年轻产妇自发地进行乳癌检查,并有望促使目前仍低于世界水平的我国的乳癌检查率的提高,及实现由乳癌死亡率降低带来的经济效益。
Claims (7)
1.一种乳癌标志物,该乳癌标志物选自由羧肽酶N2、细胞外基质蛋白1、血清淀粉样蛋白P成分、伴肌动蛋白、补体成分C8α链、载脂蛋白L1、黄素还原酶、过氧化氢酶、碳酸酐酶2、载脂蛋白C-I、核孔糖蛋白210、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、二磷酸甘油酸变位酶、碳酸酐酶1、及过氧化物还原酶2构成的群组。
2.一种乳癌的鉴定方法,该方法检测在由试样中的羧肽酶N2、细胞外基质蛋白1、血清淀粉样蛋白P成分、伴肌动蛋白、补体成分C8α链、载脂蛋白L1、黄素还原酶、过氧化氢酶、碳酸酐酶2、载脂蛋白C-I、核孔糖蛋白210、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、二磷酸甘油酸变位酶、碳酸酐酶1、及过氧化物还原酶2构成的群组中任意选择的一种以上的乳癌标志物,根据其结果进行鉴定。
3.如权利要求2所述的方法,其中,试样为乳头分泌液。
4.如权利要求2所述的方法,其中,试样为血清、血浆或全血。
5.一种试剂盒,该试剂盒是为了鉴定乳癌而对乳癌标志物进行检测的试剂盒,包含对选自由羧肽酶N2、细胞外基质蛋白1、血清淀粉样蛋白P成分、伴肌动蛋白、补体成分C8α链、载脂蛋白L1、黄素还原酶、过氧化氢酶、碳酸酐酶2、载脂蛋白C-I、核孔糖蛋白210、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、二磷酸甘油酸变位酶、碳酸酐酶1、及过氧化物还原酶2构成的群组中的乳癌标志物进行检测的试剂。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其中,检测乳癌标志物的试剂含有对乳癌标志物具有亲和性的物质。
7.如权利要求6所述的试剂盒,其中,对乳癌标志物具有亲和性的物质是抗体。
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