JP6343560B2 - 乳癌の判定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、新規な乳癌マーカー、及びそれを検出し、その結果に基づいて乳癌を判定（診断・検査）する方法、及び該判定のために用いられるキットに関する。
現在、乳癌の診断方法として、体液，血液等の試料中の乳癌マーカーを検出することによる診断、又はマンモグラフィーによる診断が行われている。
乳癌マーカーを検出することにより乳癌を診断する方法では、癌胎児性抗原（Carcinoembryonic antigen、CEA）をマーカーとして、試料中の量を診断キット等を用いて測定し、その結果に基づいて乳癌を診断している。しかし、この方法は乳癌特異性を示す確度が乏しいため、実用的な乳癌確定診断とはなっていない。
また、特開２００２−１３１３２２号公報（特許文献１）には、被検者の乳管液を試料として用い、乳管液中の成分を検出することにより乳癌または乳房前癌を有する患者を同定する方法が開示されている。しかしながら、該文献は細胞外マトリックスタンパク質やアポリポタンパク質を含む多数のマーカー候補を記載しているものの、単にマーカー候補を羅列しているのみで、乳癌患者乳管液中の成分分析を行っていない。そのため、特許文献１の開示内容からは、列挙された多数のマーカーが乳癌マーカーとして本当に有用であるか否かは不明である。
また、特表２００８−５０２８９１号公報（特許文献２）には、乳癌患者の組織片をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析）で分析し、PDX1（ペルオキシレドキシン１）を乳癌マーカー候補として選択したこと、及び乳癌患者の血清中のPDX1を検出したことを記載している。また、PDX1と他のマーカーとの併用により乳癌を診断することを示唆する記載がある。しかしながら、これらのマーカーが乳癌に特異的であることを示す証拠、例えば非乳癌者由来試料中のこれらのマーカーの測定結果等を開示していない。そのため、PDX1が乳癌マーカーとして有用であるか否か、及び他のマーカーとの組み合わせが乳癌の診断に用いることができるか否かについては確認できていない。
また、マンモグラフィーを用いる乳癌の診断方法は、検査の受診者（被検者）の精神的及び肉体的苦痛が少なくない。また、乳腺密度が高い若年層の撮像は困難なため、やはり確度の高い乳癌診断技術とはなっていない。
そのほか、近年バイオマーカー（タンパク質・ペプチド、脂質、糖鎖等）の探索に関する研究が盛んに行われるようになり、特に疾患と関連して各種体液を用いたプロテオミクス等の網羅的解析研究が盛んに行われている。これらの解析は、生体から得られる微量試料の高感度かつ正確な分析を行うことができる。そこで、プロテオミクスを用いた乳癌マーカーの研究も行われていることが、F. Mannello et al. Expert Rev. Proteomics 6, 43−60 （2009）（非特許文献１）に紹介されている。しかし、未だ乳癌マーカーとして乳癌診断確度の高い乳癌マーカーは見出されていない。
F. Mannello et al. Expert Rev. Proteomics 6, 43−60 （2009）
従来の乳癌診断方法には以上のような問題があるため、乳癌検診率が向上せず、早期乳癌及び乳癌の診断が遅れ、その結果、乳癌罹患率及び乳癌死亡率の低減を阻む結果を生じており、大きな社会問題となっている。これらの問題を解消するため、より低侵襲で且つ確度の高い乳癌マーカータンパク質を乳癌診断の指標とする新しい乳癌診断技術の開発が待たれている。
本発明の課題は、乳癌の検出に有用な新規な乳癌マーカー、及び該乳癌マーカーを検出することによる、確度の高い、新規な乳癌の判定方法を提供することにある。
本発明は、上記したごとき課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
（１）カルボキシペプチダーゼＮサブユニット２、細胞外マトリックスタンパク質１、血清アミロイドＰ成分、ネブリン、補体成分C8α鎖、アポリポタンパク質Ｌ１、フラビンレダクターゼ、カタラーゼ、炭酸脱水酵素２（カルボニックアンヒドラーゼ２）、アポリポタンパク質C−I、核膜孔糖タンパク質２１０、スーパーオキシドジスムターゼ［Cu−Zn］（超酸化物不均化酵素［Cu−Zn］）、ビスホスホグリセリン酸ムターゼ、炭酸脱水酵素１（カルボニックアンヒドラーゼ１）、及びペルオキシレドキシン２からなる群から選択される乳癌マーカー。
（２）試料中のカルボキシペプチダーゼＮサブユニット２、細胞外マトリックスタンパク質１、血清アミロイドＰ成分、ネブリン、補体成分C8α鎖、アポリポタンパク質Ｌ１、フラビンレダクターゼ、カタラーゼ、炭酸脱水酵素２（カルボニックアンヒドラーゼ２）、アポリポタンパク質C−I、核膜孔糖タンパク質２１０、スーパーオキシドジスムターゼ［Cu−Zn］（超酸化物不均化酵素［Cu−Zn］）、ビスホスホグリセリン酸ムターゼ、炭酸脱水酵素１（カルボニックアンヒドラーゼ１）、及びペルオキシレドキシン２からなる群から任意に選択される1つ以上の乳癌マーカーを検出し、その結果に基づいて判定する、乳癌の判定方法。
（３）カルボキシペプチダーゼＮサブユニット２、細胞外マトリックスタンパク質１、血清アミロイドＰ成分、ネブリン、補体成分C8α鎖、アポリポタンパク質Ｌ１、フラビンレダクターゼ、カタラーゼ、炭酸脱水酵素２（カルボニックアンヒドラーゼ２）、アポリポタンパク質C−I、核膜孔糖タンパク質２１０、スーパーオキシドジスムターゼ［Cu−Zn］（超酸化物不均化酵素［Cu−Zn］）、ビスホスホグリセリン酸ムターゼ、炭酸脱水酵素１（カルボニックアンヒドラーゼ１）、及びペルオキシレドキシン２からなる群から選択される乳癌マーカーを検出する試薬を含む、乳癌を判定するために乳癌マーカーを検出するためのキット。
（１）カルボキシペプチダーゼＮサブユニット２、細胞外マトリックスタンパク質１、血清アミロイドＰ成分、ネブリン、補体成分C8α鎖、アポリポタンパク質Ｌ１、フラビンレダクターゼ、カタラーゼ、炭酸脱水酵素２（カルボニックアンヒドラーゼ２）、アポリポタンパク質C−I、核膜孔糖タンパク質２１０、スーパーオキシドジスムターゼ［Cu−Zn］（超酸化物不均化酵素［Cu−Zn］）、ビスホスホグリセリン酸ムターゼ、炭酸脱水酵素１（カルボニックアンヒドラーゼ１）、及びペルオキシレドキシン２からなる群から選択される乳癌マーカー。
（２）試料中のカルボキシペプチダーゼＮサブユニット２、細胞外マトリックスタンパク質１、血清アミロイドＰ成分、ネブリン、補体成分C8α鎖、アポリポタンパク質Ｌ１、フラビンレダクターゼ、カタラーゼ、炭酸脱水酵素２（カルボニックアンヒドラーゼ２）、アポリポタンパク質C−I、核膜孔糖タンパク質２１０、スーパーオキシドジスムターゼ［Cu−Zn］（超酸化物不均化酵素［Cu−Zn］）、ビスホスホグリセリン酸ムターゼ、炭酸脱水酵素１（カルボニックアンヒドラーゼ１）、及びペルオキシレドキシン２からなる群から任意に選択される1つ以上の乳癌マーカーを検出し、その結果に基づいて判定する、乳癌の判定方法。
（３）カルボキシペプチダーゼＮサブユニット２、細胞外マトリックスタンパク質１、血清アミロイドＰ成分、ネブリン、補体成分C8α鎖、アポリポタンパク質Ｌ１、フラビンレダクターゼ、カタラーゼ、炭酸脱水酵素２（カルボニックアンヒドラーゼ２）、アポリポタンパク質C−I、核膜孔糖タンパク質２１０、スーパーオキシドジスムターゼ［Cu−Zn］（超酸化物不均化酵素［Cu−Zn］）、ビスホスホグリセリン酸ムターゼ、炭酸脱水酵素１（カルボニックアンヒドラーゼ１）、及びペルオキシレドキシン２からなる群から選択される乳癌マーカーを検出する試薬を含む、乳癌を判定するために乳癌マーカーを検出するためのキット。
すなわち、本発明者らは、上記問題を解決した、乳癌診断の確度の高い乳癌マーカー及びそれを用いた乳癌の判定方法を確立すべく鋭意研究の途上、乳癌発症部位である乳管内の情報を直接得ることができる乳頭分泌液（Nipple discharge, ND）を試料とし、最新の二次元液体クロマトグラフィー（LC）／質量分析（MS）システムであるナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによるプロテオミクスを応用することにより、多数の成分を含む乳頭分泌液中の成分を分析した。そして、乳癌患者由来乳頭分泌液と非乳癌者由来乳頭分泌液を試料として用い、ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを行った結果を比較することにより、乳癌マーカーとして有望と推測される新たなマーカーを選別した。そして、これらのマーカーを指標として用いれば、乳癌を確度よく判定することができることを見出し、本発明を完成した。
本発明の乳癌マーカーを利用した判定方法はより確度の高い乳癌の判定（診断、検査）を可能とする。また、本発明の乳癌マーカーは、例えば乳頭分泌液中に見出されるため、非侵襲的且つ簡便に乳癌を判定（診断、検査）することが可能である。
本発明の乳癌マーカーとしては、カルボキシペプチダーゼＮサブユニット２、細胞外マトリックスタンパク質１、血清アミロイドＰ成分、ネブリン、補体成分C8α鎖、アポリポタンパク質Ｌ１、フラビンレダクターゼ、カタラーゼ、炭酸脱水酵素２（カルボニックアンヒドラーゼ２）、アポリポタンパク質C−I、核膜孔糖タンパク質２１０、スーパーオキシドジスムターゼ［Cu−Zn］（超酸化物不均化酵素［Cu−Zn］）、ビスホスホグリセリン酸ムターゼ、炭酸脱水酵素１（カルボニックアンヒドラーゼ１）、及びペルオキシレドキシン２からなる群から選択される乳癌マーカー（以下、これらをまとめて「本発明の乳癌マーカー」と記載する場合がある。）が挙げられる。これらの成分自体は既に公知のものであるが、これらが乳癌を判定する指標（乳癌マーカー）として有用であることは、本発明者らによって初めて明らかになった。
本発明の乳癌の判定方法は、「本発明の乳癌マーカーを検出し、その結果に基づいて判定する、乳癌の判定方法」である。
そのために行う本発明の乳癌マーカーを検出する方法としては、本発明の乳癌マーカーである各成分を検出・測定する常法が挙げられる。それに用いられる乳癌マーカーを検出・測定する試薬としては、当該乳癌マーカーの各成分を検出・測定する常法に用いられる試薬であればよい。
本発明の乳癌マーカーを検出する方法の例としては、例えば本発明の乳癌マーカーに対する親和性を有する物質（例えば、抗体、レクチン、多糖類、DNA、酵素基質、タンパク質、各種受容体、各種リガンド等）を用いた、いわゆる酵素免疫測定法（EIA）、放射免疫測定法（RIA）、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、蛍光免疫測定法（FIA）、簡易イムノクロマトグラフィーによる測定法、等の自体公知の免疫学的測定法に準じた方法の他、これらと高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、キャピラリーチップ電気泳動法等の組み合わせによる方法等が挙げられる。その測定原理としては、例えばサンドイッチ法、競合法、二抗体法等が挙げられるが、これに限定されない。
また、例えば、免疫比ろう法、免疫比濁法等の免疫凝集法に準じた測定法で、本発明の乳癌マーカーを検出してもよい。これらの検出方法も、自体公知の方法に準じて行えばよい。
本発明の乳癌マーカーを検出するために用いられる乳癌マーカーに対する抗体は、本発明の乳癌マーカーやその部分ペプチド、又はそれらの塩を認識し得る抗体であればよく、特に限定されない。例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよく、これらを単独であるいはこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。また、これら抗体は、要すればペプシン，パパイン等の酵素を用いて消化してF（ab'）2、Fab'、或はFabとして使用してもよい。更に、本発明の乳癌マーカーに対する、市販の抗体を用いることもできる。
上記した本発明の乳癌マーカーを検出するために用いられる、試薬及びその検出時の濃度、検出を実施するに際しての測定条件等（反応温度、反応時間、反応時のｐＨ，測定波長、測定装置等）は、すべて自体公知の上記した如き免疫学的測定法の測定操作法に準じて設定すれば良く、使用する自動分析装置、分光光度系等も通常この分野で使用されているものは何れも例外なく使用し得る。
上記した本発明の乳癌マーカーの検出に用いられるこれら試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害したりせず、本発明の乳癌マーカーと本発明の乳癌マーカーに対する抗体等との反応を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
検出対象の乳癌マーカーが酵素である場合の乳癌マーカーを検出する方法としては、これを発色試薬と反応させて発色反応に導き、その結果生成する色素量を分光光度計等により測定する方法等の自体公知の方法も挙げられる。このような目的で用いられる発色試薬等としては、通常この分野で用いられる発色試薬等が挙げられ、測定対象の酵素毎に適宜選択される。また、これらの使用濃度も、通常この分野で用いられる濃度範囲から適宜設定すればよい。
また、本発明の乳癌マーカーを２種以上、組み合わせて検出してもよい。その組み合わせは、本発明の乳癌マーカーから任意に２種以上組み合わせればよく、特に限定されない。
更に、本発明の乳癌マーカー１種以上と、本発明の乳癌マーカー以外の乳癌マーカー１種以上との任意の組み合わせであってもよい。
尚、本発明の乳癌マーカーの検出は、用手法に限らず、自動分析装置を用いた測定系で行ってもよい。用手法又は自動分析装置を用いて測定を行う場合の試薬類等の組み合わせ等については、特に制約はなく、適用する自動分析装置の環境、機種に合わせて、或いは、他の要因を考慮にいれて最も良いと思われる試薬類等の組み合わせを適宜選択して用いれば良い。
更に、本発明の乳癌マーカーは、いわゆるナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる蛋白質網羅解析を行って、検出してもよい。ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳは、分離手段としてナノ液体クロマトグラフを用い、数百nL／minという低流速で送液し、多数の成分からなる試料について液体クロマトグラフで試料中の成分を分離した後、オンラインでエレクトロスプレーイオン化法による質量分析を行い、それにより特定された質量成分について、更にもう一度衝突誘起解離を用いて質量分析を行う方法である。この分析方法は、一度質量分析を行った後、特定質量成分だけを再度質量分析に付し、更に得られたフラグメントパターンを解析するので、より詳細な解析が行える。
本発明の乳癌マーカーをナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで検出する場合、例えば上記ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳのＬＣ部分をｐＨの異なる二つの分離システムを用いて、二次元ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる蛋白質網羅解析を行って検出すればよい。
二次元ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより本発明の乳癌マーカーを検出する方法の具体的な例は、以下の通りである。
一次元目の液体クロマトグラフとして例えば逆相カラムを用い、移動相は例えば約２０ｍＭのギ酸アンモニウム水溶液や約７０ｍＭのトリエチルアミン水溶液等の塩基性溶液（ｐＨ９〜１０）と、アセトニトリルとし、数μL／min（好ましくは５〜５００μL／min）という低流速で送液し、試料中の成分を分離し、例えば１〜１０分間間隔程度の一定時間間隔で、数十画分を分取する。次いで、分取した各画分中の溶媒を蒸発させた後、各画分に０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を加え、分離した成分を溶解させる。
次に、得られた各画分溶液の各全量をそれぞれ二次元目の液体クロマトグラフに付し、以下の方法で分離する。すなわち、上記の各画分の溶液の各全量を、それぞれ逆相クロマトグラフカラムにアプライし、移動相は例えば０．１％ギ酸水溶液等の酸性溶液（ｐＨ２〜３）と、アセトニトリル／０．１％ギ酸とし、数十〜百nL／min（好ましくは５０〜５００nL／min）という低流速で送液し、各画分中の多数の成分を分離し、オンラインでＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを行う。
二次元ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いて行った解析は、単次元のナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳよりもより分離能が向上するため、更に網羅的な蛋白質解析が可能となる。内部標準物質等を用いて測定することによって、定量解析も可能である。
以上の方法により本発明の乳癌マーカーを検出し、その結果を基に、本発明の乳癌マーカーを指標として乳癌を判定するための、本発明の乳癌マーカーに関するデータ（例えば本発明の乳癌マーカーの存在の有無、濃度、量の増加の程度等の情報）を得る。得られたデータを用いて、例えば下記の方法で、乳癌の判定（診断・検査）を行う。
すなわち、例えば、被験者由来試料中の本発明の乳癌マーカーを検出し、当該乳癌マーカーが検出されたとの検査結果から、被験者に乳癌のおそれがある、又は乳癌のおそれが高い等の判定が可能である。又は当該乳癌マーカーが検出されなかった場合には、被験者に乳癌のおそれがない、又は乳癌のおそれが低い等の判定が可能である。
他の方法としては、まず上記の方法によって試料中に本発明の乳癌マーカーが含まれる量を決定する。次いでその結果を予め別試料として非乳癌者由来の試料を用いて同様に行った結果と比較し、被験者由来試料中に当該乳癌マーカーが含まれる量が、非乳癌者由来試料中に含まれるその量より多いとの検査結果から、被験者に乳癌のおそれがある、又は乳癌のおそれが高い等の判定が可能である。又は、被験者由来試料中に当該乳癌マーカーが含まれる量と、非乳癌者由来試料中に含まれるその量との間に顕著な差が認められないという検査結果から、被験者に乳癌のおそれはない、又は乳癌のおそれが低い等の判定が可能である。
また、予め基準値を設定しておき、本発明の乳癌マーカーの量がその乳癌マーカーの基準値より多いという検査結果から、被験者に乳癌のおそれがある又は被験者に乳癌のおそれが高い等の判定が可能である。また、当該乳癌マーカーの量又はその量的範囲に対応させて複数の判定区分を設定し［例えば（１）乳癌のおそれはない、（２）乳癌のおそれは低い、（３）乳癌の兆候がある、（４）乳癌のおそれが高い、等］、検査結果がどの判定区分にはいるかを判定することも可能である。
更にまた、同一被験者において、ある時点で測定された被験者由来試料中の本発明の乳癌マーカーの量と、異なる時点での当該乳癌マーカーの量とを比較し、当該乳癌マーカーの量の増減の有無及び／又は増減の程度を評価することによって、乳癌の進行度や悪性度の診断、あるいは術後の予後診断が可能である。すなわち、当該乳癌マーカーの量の増加が認められたという検査結果から、乳癌へ病態が進行した（あるいは乳癌の悪性度が増した）、又は乳癌への病態の進行の兆候が認められる（あるいは乳癌の悪性度が増す兆候が認められる）との判定が行える。また、被験者由来試料中の当該乳癌マーカーの量の減少が認められたという検査結果から、乳癌の病態が改善した、又は乳癌の病態の改善の兆候が認められるとの判定ができる。また、当該乳癌マーカーの量の変動が認められないという検査結果から、病態に変化はないとの判定が可能である。
更に、本発明の乳癌マーカーを２つ以上検出・測定し、その結果を基に乳癌の判定を行う方法も挙げられる。例えば、本発明の乳癌マーカーを単独或いは２種以上組み合わせて検出することで、乳癌患者に特徴的な本発明の乳癌マーカーの存在パターンが得られる。そこで、被験者の乳頭分泌液等の試料から本発明の乳癌マーカーを検出・同定し、これら複数の本発明の乳癌マーカーの存在パターン解析をすることにより、被験者が乳癌を発症しているか否かの推定が可能となる。
２つ以上の乳癌マーカーの組み合わせは、本発明の乳癌マーカーからなる群から任意に選択すればよい。
また、本発明の乳癌マーカー１種以上と本発明の乳癌マーカー以外の乳癌マーカー１種以上とを検出・測定し、上記と同様の方法で乳癌の判定を行ってもよい。本発明の乳癌マーカー以外の乳癌マーカーの検出は、それぞれの乳癌マーカーに応じた自体公知の方法で行えばよい。
本発明の乳癌マーカーを検出するために用いられる試料としては、被検者の乳頭分泌液、又は血液（全血），血清，血漿，尿，リンパ等の生体由来試料等が挙げられるがこれらに限定されない。
乳頭分泌液としては、被験者の片側あるいは両側の乳房から、自然に分泌される乳頭分泌液、乳房のマッサージによって滲出する分泌液、乳頭吸引液等が挙げられるが、これらに限定されない。
試料として乳頭分泌液を使用すれば、被験者に対して非侵襲的に試料を採取することができるので、患者の負担が遙かに少ない点で、優れている。
本発明の「乳癌の判定を行うために乳癌マーカーを検出するためのキット」は、本発明の乳癌マーカーを検出する試薬を構成要件として含むものである。
「本発明の乳癌マーカーを検出する試薬」及びその構成要件の好ましい態様と具体例は、上記の本発明の乳癌マーカーを検出する方法に関する説明において記載した通りである。また、これら試薬の濃度等の好ましい態様も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
例えば、本発明の乳癌マーカーを検出する試薬の例として、該乳癌マーカーに親和性を有する物質を含むものが挙げられる。また、その乳癌マーカーに親和性を有する物質の例としては、例えば抗体やレクチン等が挙げられる。
該キットは、一種類の乳癌マーカーを検出する試薬又はキットを構成要件とするものであっても、複数の乳癌マーカーを検出する、複数の試薬又はキットの組み合わせからなるものであってもよい。また、複数の乳癌マーカーを検出する、複数の試薬又はキットの組合せとしては、複数の本発明の乳癌マーカーを検出する、複数の試薬又はキットの組合せの他に、 一種類又は複数の本発明の乳癌マーカーを検出する、一種又は複数の試薬又はキットと、一種類又は複数の本発明の乳癌マーカー以外の乳癌マーカーを検出する、一種又は複数の試薬又はキットの組合せ、等が挙げられる。
また、これらキットに含まれる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害したりせず、本発明の乳癌マーカーと抗体（又はレクチン等）との反応を阻害しないものが含まれていてもよい。またその濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
さらに、当該乳癌マーカーを検出する際に用いられる、検量線作成用の乳癌マーカーの標準を組み合わせたキットとしてもよい。該標準は、市販の標準品を用いても、公知の方法に従って、製造されたものを用いても構わない。
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１ 乳癌のマーカーの選別
（１）試料の前処理
乳癌患者（１１名）から採取したそれぞれの乳頭分泌液（数μL）を、100μL のサンプル保存液（50 mM 炭酸水素アンモニウムと0.02% アジ化ナトリウムを含有する水溶液）に加え、４℃、５分間 18,000 x g で遠心した。上澄みを分取後、280 nm の波長の紫外線を用いた紫外吸収法によりタンパク質濃度を求め、50 mM 炭酸水素アンモニウム水溶液を用いてタンパク質濃度が 0.5 mg／mL となるように調製した。45 mM ジチオトレイトール水溶液を 1.41μL 加えて還元し、タンパク質を変性させるためトリフルオロエタノールを 50% になるよう加え、60 ℃、１時間加熱した。加熱後室温に戻し、100 mM のヨードアセトアミド水溶液を 1.41μL 加えて室温暗環境下において１時間アルキル化を行った。次いで、アルキル化産物から10μLを分取し、90μLの50 mM 炭酸水素アンモニウム水溶液を加えて、トリフルオロエタノールの割合が 5%になるように調整した。更に、100ng／μLのトリプシン（マススペクトロメトリーグレード、Promega Corporation, Madison, WI, USA）の溶液 1.2μL（タンパク質重量の 1／20量のトリプシン含有）を加え 37 ℃ で一晩インキュベートした。得られたトリプシン消化産物（タンパク質換算で約 350 fmol／μL）について、以下の方法で二次元ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ測定を行った。
（１）試料の前処理
乳癌患者（１１名）から採取したそれぞれの乳頭分泌液（数μL）を、100μL のサンプル保存液（50 mM 炭酸水素アンモニウムと0.02% アジ化ナトリウムを含有する水溶液）に加え、４℃、５分間 18,000 x g で遠心した。上澄みを分取後、280 nm の波長の紫外線を用いた紫外吸収法によりタンパク質濃度を求め、50 mM 炭酸水素アンモニウム水溶液を用いてタンパク質濃度が 0.5 mg／mL となるように調製した。45 mM ジチオトレイトール水溶液を 1.41μL 加えて還元し、タンパク質を変性させるためトリフルオロエタノールを 50% になるよう加え、60 ℃、１時間加熱した。加熱後室温に戻し、100 mM のヨードアセトアミド水溶液を 1.41μL 加えて室温暗環境下において１時間アルキル化を行った。次いで、アルキル化産物から10μLを分取し、90μLの50 mM 炭酸水素アンモニウム水溶液を加えて、トリフルオロエタノールの割合が 5%になるように調整した。更に、100ng／μLのトリプシン（マススペクトロメトリーグレード、Promega Corporation, Madison, WI, USA）の溶液 1.2μL（タンパク質重量の 1／20量のトリプシン含有）を加え 37 ℃ で一晩インキュベートした。得られたトリプシン消化産物（タンパク質換算で約 350 fmol／μL）について、以下の方法で二次元ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ測定を行った。
別に、乳頭から分泌液が分泌されることを不定愁訴として訴える受診者（被験者）であって乳癌ではないと診断された非乳癌者（１５名）から採取した乳頭分泌液を、上記と同様に処理した。
（２）二次元ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ測定
上記（１）で得られたトリプシン消化産物のうち40μLを、二次元 Nano HPLC system （UltiMate 3000； Thermo Fisher Scientific Inc. （Dionex）, Waltham, MA, USA） に装着した Acclaim PA2, 300μm i.d. x 15 cm 逆相カラム （Thermo Fisher Scientific Inc. （Dionex）, Waltham, MA, USA） を用いて A 溶媒 20 mM ギ酸アンモニウム水溶液, pH 10.0、B 溶媒 アセトニトリルを用い、７５分のグラジエント（12〜95% の B 溶媒）で分離し 26 個の画分を得た。それらの画分を 70 ℃ で４時間加熱して溶媒を蒸発させた。次いで各々の画分に 0.1% トリフルオロ酢酸水溶液を 30μL 加えて、分離した成分を溶解させた。次いで、得られた各画分溶液の各全量を、それぞれ L−column Micro L2−C18, 75μm i.d. x 15 cm 逆相カラム（（財）化学物質評価研究機構製）を用いて A 溶媒 0.1% ギ酸水溶液、B 溶媒 アセトニトリル／0.1% ギ酸を用い、４５分のグラジエント（2〜95% の B 溶媒）で分離し、連続的にナノＥＳＩイオン源を装着したＥＳＩ−イオントラップ型質量分析計 （HCTultra； Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany）でデータ依存的スキャンを用いてオンライン分析した。各試料について、２回のランを行った。
上記（１）で得られたトリプシン消化産物のうち40μLを、二次元 Nano HPLC system （UltiMate 3000； Thermo Fisher Scientific Inc. （Dionex）, Waltham, MA, USA） に装着した Acclaim PA2, 300μm i.d. x 15 cm 逆相カラム （Thermo Fisher Scientific Inc. （Dionex）, Waltham, MA, USA） を用いて A 溶媒 20 mM ギ酸アンモニウム水溶液, pH 10.0、B 溶媒 アセトニトリルを用い、７５分のグラジエント（12〜95% の B 溶媒）で分離し 26 個の画分を得た。それらの画分を 70 ℃ で４時間加熱して溶媒を蒸発させた。次いで各々の画分に 0.1% トリフルオロ酢酸水溶液を 30μL 加えて、分離した成分を溶解させた。次いで、得られた各画分溶液の各全量を、それぞれ L−column Micro L2−C18, 75μm i.d. x 15 cm 逆相カラム（（財）化学物質評価研究機構製）を用いて A 溶媒 0.1% ギ酸水溶液、B 溶媒 アセトニトリル／0.1% ギ酸を用い、４５分のグラジエント（2〜95% の B 溶媒）で分離し、連続的にナノＥＳＩイオン源を装着したＥＳＩ−イオントラップ型質量分析計 （HCTultra； Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany）でデータ依存的スキャンを用いてオンライン分析した。各試料について、２回のランを行った。
二次元ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析の各条件は以下の通りである。
i）LC 条件
（一次元目）
HPLCカラム：Acclaim PA2, 300μm i.d. x 15 cm 逆相カラム （Thermo Fisher Scientific Inc. （Dionex） 製）
流速：6.0μL／分
A 溶媒：20 mM ギ酸アンモニウム水溶液, pH 10.0
B 溶媒：アセトニトリル
溶出： 0分→19 分：12% から 20% B 溶媒までリニアグラジエント、
19 分→29 分：48% B 溶媒までリニアグラジエント、
29 分→34 分：95% B 溶媒で洗浄、
34 分→75 分：2% B 溶媒で平衡化。
（なお、溶出開始後すぐにB溶媒の濃度を上げたので、溶出開始後ほとんど0分で、溶出液のＢ溶媒の濃度は12%になっている。）
カラム温度：35 ℃
注入量：40μL
分画数：26
i）LC 条件
（一次元目）
HPLCカラム：Acclaim PA2, 300μm i.d. x 15 cm 逆相カラム （Thermo Fisher Scientific Inc. （Dionex） 製）
流速：6.0μL／分
A 溶媒：20 mM ギ酸アンモニウム水溶液, pH 10.0
B 溶媒：アセトニトリル
溶出： 0分→19 分：12% から 20% B 溶媒までリニアグラジエント、
19 分→29 分：48% B 溶媒までリニアグラジエント、
29 分→34 分：95% B 溶媒で洗浄、
34 分→75 分：2% B 溶媒で平衡化。
（なお、溶出開始後すぐにB溶媒の濃度を上げたので、溶出開始後ほとんど0分で、溶出液のＢ溶媒の濃度は12%になっている。）
カラム温度：35 ℃
注入量：40μL
分画数：26
（二次元目）
HPLCカラム：L−column Micro L2−C18, 75μm i.d. x 15 cm 逆相カラム（（財）化学物質評価研究機構製）
流速：300 nL／分
A 溶媒：0.1% ギ酸水溶液, pH 2.0
B 溶媒：アセトニトリル／0.1% ギ酸
溶出： 0分→1 分：8% B 溶媒までリニアグラジエント、
1 分→20 分：20% B 溶媒までリニアグラジエント、
20 分→25 分：35% B 溶媒までリニアグラジエント、
25 分→30 分：95% B 溶媒で洗浄、
30 分→45 分：2% B 溶媒で平衡化。
カラム温度：室温
注入量：30μL
HPLCカラム：L−column Micro L2−C18, 75μm i.d. x 15 cm 逆相カラム（（財）化学物質評価研究機構製）
流速：300 nL／分
A 溶媒：0.1% ギ酸水溶液, pH 2.0
B 溶媒：アセトニトリル／0.1% ギ酸
溶出： 0分→1 分：8% B 溶媒までリニアグラジエント、
1 分→20 分：20% B 溶媒までリニアグラジエント、
20 分→25 分：35% B 溶媒までリニアグラジエント、
25 分→30 分：95% B 溶媒で洗浄、
30 分→45 分：2% B 溶媒で平衡化。
カラム温度：室温
注入量：30μL
ii）ESI−MS／MS 条件
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法 (electrospray ionization 法、ESI 法)
測定イオン：正イオン
スプレー電圧：1200V
ドライガス：窒素（4 L／min）
イオン源温度：160 ℃
走査範囲：m／z 300 〜 1,500（MS／MS 測定時：m／z 50 〜 2,200）
プリカーサーイオン選択数：4 イオン／マススペクトル
最小限のプリカーサーイオン強度：50,000 カウント
プリカーサーイオン選択排除時間：30 s
プリカーサーイオン排除価数：1
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法 (electrospray ionization 法、ESI 法)
測定イオン：正イオン
スプレー電圧：1200V
ドライガス：窒素（4 L／min）
イオン源温度：160 ℃
走査範囲：m／z 300 〜 1,500（MS／MS 測定時：m／z 50 〜 2,200）
プリカーサーイオン選択数：4 イオン／マススペクトル
最小限のプリカーサーイオン強度：50,000 カウント
プリカーサーイオン選択排除時間：30 s
プリカーサーイオン排除価数：1
iii）タンパク質同定解析条件
タンパク質サーチエンジン：Mascot (Matrix Science Ltd., London,UK)
タンパク質サーチ手法：MS／MS Ion Search
タンパク質データベース：Swiss−Prot
タンパク質サーチ時動物種分類：Homo sapiens （human）
タンパク質サーチ時翻訳後修飾設定：Carbamidomethyl （システイン残基修飾）
トリプシン未切断部位許容回数：1
プリカーサーイオン質量許容値：±0.5 Da
プロダクトイオン質量許容値：±1 Da
同定タンパク質解析ソフトウェア：Scaffold（Proteome Software,Inc., Portland, OR, USA）
タンパク質サーチエンジン：Mascot (Matrix Science Ltd., London,UK)
タンパク質サーチ手法：MS／MS Ion Search
タンパク質データベース：Swiss−Prot
タンパク質サーチ時動物種分類：Homo sapiens （human）
タンパク質サーチ時翻訳後修飾設定：Carbamidomethyl （システイン残基修飾）
トリプシン未切断部位許容回数：1
プリカーサーイオン質量許容値：±0.5 Da
プロダクトイオン質量許容値：±1 Da
同定タンパク質解析ソフトウェア：Scaffold（Proteome Software,Inc., Portland, OR, USA）
（３）二次元ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ測定の結果
二次元ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ測定によって、乳癌患者由来試料から３５０種、非乳癌者由来試料から４７９種、総計５７５種のタンパク質成分が検出された。この分析では、特許文献２に記載されたペルオキシレドキシン１は乳癌患者試料及び非乳癌者試料の両方から検出され、更に乳癌患者に特異的な検出ではなかったことを、付記しておく。
二次元ナノＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ測定によって、乳癌患者由来試料から３５０種、非乳癌者由来試料から４７９種、総計５７５種のタンパク質成分が検出された。この分析では、特許文献２に記載されたペルオキシレドキシン１は乳癌患者試料及び非乳癌者試料の両方から検出され、更に乳癌患者に特異的な検出ではなかったことを、付記しておく。
次いで、以下の方法で、乳癌患者試料から特異的に検出されたタンパク質を乳癌マーカー候補として選別した。
（４）乳癌マーカー候補の選別
上記（３）の結果を基に、
（i）分析を行った乳癌患者１１名中の、各タンパク質成分が試料中に検出された乳癌患者数（ｎ１）の割合（比率Ａ）、
（ii）分析を行った非乳癌者１５名中の、各タンパク質成分が試料中に検出された非乳癌者数（ｎ２）の割合（比率Ｂ）、及び
（iii）比率Ａ／比率Ｂ（比率Ｃ）
を求めた。
上記（３）の結果を基に、
（i）分析を行った乳癌患者１１名中の、各タンパク質成分が試料中に検出された乳癌患者数（ｎ１）の割合（比率Ａ）、
（ii）分析を行った非乳癌者１５名中の、各タンパク質成分が試料中に検出された非乳癌者数（ｎ２）の割合（比率Ｂ）、及び
（iii）比率Ａ／比率Ｂ（比率Ｃ）
を求めた。
紙面の都合上、上記（３）で検出されたタンパク質成分５７５種のうち、比率Ｃが2.00以上であったタンパク質成分の一覧を、下記表１に示す。
そして、表１に挙げられたタンパク質成分の一覧中から血液由来成分と疑われるタンパク質成分等は除外し、比率Ｃが２．４以上であるタンパク質成分で、且つマススペクトル中に検出されたペプチドピークを基準に算出されたタンパク質成分の存在量を示すスペクトラムカウント値が乳癌患者及び非乳癌者間で統計的に有意な差が認められるタンパク質成分（マン・ホイットニーのＵ検定において p〈0.05 のタンパク質成分）を、乳癌マーカー候補として選択した。選択された乳癌マーカー候補及び各乳癌マーカー候補の比率Ａ，Ｂ，Ｃを表２に、統計結果を図１〜図５に示す。
尚、表２において、比率Ｂが０だった場合、非乳癌者からはその乳癌マーカーが検出されなかったということを意味し、比率Ｃの値は計算できなくなる。そこで、この場合の比率Ｃは、ｎ１の乳癌患者数と同じ値を記載している（＊）。
すなわち、表２に記載のカルボキシペプチダーゼＮサブユニット２（Carboxypeptidase N subunit 2）、細胞外マトリックスタンパク質１（Extracellular matrix protein 1）、血清アミロイドＰ成分（Serum amyloid P−component）、ネブリン（Nebulin）、補体成分C8α鎖（Complement component C8 alpha chain）、アポリポタンパク質Ｌ１（Apolipoprotein L1）、フラビンレダクターゼ（Flavin reductase）、カタラーゼ（Catalase）、炭酸脱水酵素２（カルボニックアンヒドラーゼ２）（Carbonic anhydrase 2）、アポリポタンパク質C−I（Apolipoprotein C−I）、核膜孔糖タンパク質２１０（Nuclear pore membrane glycoprotein 210）、スーパーオキシドジスムターゼ［Cu−Zn］（超酸化物不均化酵素［Cu−Zn］）（Superoxide dismutase ［Cu−Zn］）、ビスホスホグリセリン酸ムターゼ（Bisphosphoglycerate mutase）、炭酸脱水酵素１（カルボニックアンヒドラーゼ１）（Carbonic anhydrase 1）、及びペルオキシレドキシン２（Peroxiredoxin 2）を本発明の乳癌マーカーとして選別した。
表２及び図１〜５から明らかな通り、これらの乳癌マーカーは、非乳癌者の乳頭分泌液中濃度に比較して乳癌患者の乳頭分泌液中に高濃度に存在していた。また、これらの成分は乳癌マーカーとして使用されたという実績はないことから、新規な乳癌マーカーとして極めて有望である。
また、これらの乳癌マーカーを単独或いは２種以上組み合わせて検出することにより乳癌、及びその進行度の判定が行えることが期待される。例えば、これらの乳癌マーカーを単独或いは２種以上組み合わせて検出することで、乳癌患者に特徴的な本発明の乳癌マーカーの存在パターンが得られる。そこで、被験者の乳頭分泌液等の試料から本発明の乳癌マーカーを検出・同定し、これら複数の乳癌マーカーの存在パターン解析をすることにより、被験者が乳癌を発症しているか否かの推定が可能となることが期待される。
本発明の乳癌マーカーを利用した判定方法はより確度の高い乳癌の判定（診断、検査）を可能とする。
また、本発明の乳癌マーカーは、例えば乳頭分泌液中に見出されるため、非侵襲的且つ簡便に乳癌を判定（診断、検査）することが可能である。その結果、精神的及び肉体的苦痛が少ない本発明による乳癌診断は、若い世代や授乳中・後の若年経産婦人が自主的に乳癌検診を行うことを促進し、世界に比べて低い我が国の乳癌検診率の向上と、乳癌死亡率の低減による経済的効果が期待される。
Claims (7)
- 炭酸脱水酵素２（カルボニックアンヒドラーゼ２）である、乳癌の存否を判定するための乳癌マーカー。
- 乳癌の存否を判定するためのデータを得るために、試料中の請求項１に記載の乳癌マーカーを検出することを特徴とする方法。
- 試料が乳頭分泌液である、請求項２に記載の方法。
- 試料が血清、血漿、又は全血である、請求項２に記載の方法。
- 請求項１に記載の乳癌マーカーを検出する試薬を含む、乳癌の存否を判定するために該乳癌マーカーを検出するためのキット。
- 乳癌マーカーを検出する試薬が乳癌マーカーに親和性を有する物質を含むものである、請求項５に記載のキット。
- 乳癌マーカーに親和性を有する物質が抗体である、請求項６に記載のキット。
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