SE447422B

SE447422B - Reagens och sett for bestemning av aldolas av det slag, som finns i menniskomuskler

Info

Publication number: SE447422B
Application number: SE8006667A
Authority: SE
Inventors: T Kitamura; T Morimoto; T Naraki; T Sawada; M Tohda
Original assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1979-09-25
Filing date: 1980-09-24
Publication date: 1986-11-10
Also published as: FR2466020B1; IT1141082B; JPS5648894A; IT8024877A0; DE3036184A1; SE8006667L; FR2466020A1; GB2062226A; CH648596A5; GB2062226B; BE885376A; NL8005330A; CA1158549A

Description

447 422 _ n 2 Q Vid elektroforesmetoden består problemet i att de vandrande punkterna från de humana aldolas-isoenzymen är så tätt pla- cerade i förhållande till varandra att upplösningen är svår, och den exakta kvantitativa bestämningen kan inte erhållas.

Vid mätmetoden för aktivitetsförhållandet FDP/FIP skall det framhållas att förfarandet är speciellt svårt för mätning av FIP-ALD-aktiviteten, och dessutom sker ingen kvantitativ bestämning.

Nyligen har ett nytt förfarande med radio-immunoanalys rap- porterats. Jämfört med de ovan nämnda förfarandena är denna metod bättre när det gäller den kvantitativa bestämningen.

Denna metod har emellertid även nâgra nackdelar genom att reagenset inte kan lagras på grund av att den radioisotop, som skall användas för märkning, snabbt försvinner; speciel- la maskiner och speciella apparatur och i synnerhet ett- speciellt rum erfordras för radioisotopmötningen; hante- ringen av radioisotopen under mätningen och kvittblivningen av avfallsmaterial är svåra eftersom användningen av radio- isotopen är förknippad med hälsorisk.

Ett reagens har nu utvecklats för användning för enzym-im- munoanalys av aldolas av det slag, som finns i människomusk- ler, samt ett förfarande för bestämning av aldolas av det slag, som finns i människomuskler, med användning av detta reagens. Enligt detta förfarande kan många nackdelar, som är förknippade med förfarandena enligt tidigare teknik, undan- röjas eller minskas.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning baserar sig på enzym-immunoanalys, så kallad “sandwichmetoden". Vid detta ; förfarande utföres mätning med följande steg: (a) ett prov bringas i kontakt med en'olösliggjord anti- kropp mot aldolas av muskeltyp, varefter den fasta fa- sen separeras;. 447 422 (b) den fasta fasen bringas i kontakt med en med alkalifos- fatas märkt antikropp mot aldolas av muskeltyp, följt av separation av den fasta fasen; (c) den fasta fasen bringas i kontakt med alkalifosfatas-sub- strat och (d) absorbansen från substratets nedbrytningsprodukt bestäm- mes.

Följande beskriver detta förfarande närmare.

I steget (a) inkuberas en antikropp, som gjorts olöslig genom att den kombinerats med en bärare, med ett prov, såsom serum etc. så att antigenet (av det slag, som finns i människomusk- ler) i provet kan reagera med den olösliggjorda antikroppen.

Efter det att reaktionen är avslutad, avlägsnas reaktionslös- ningen, och den fasta fasen tvättas med buffertlösning, destil- lerat vatten eller liknande.

I steg (b) inkuberas den fasta fas, som erhölls i steg (a) tillsammans med en alkalifosfatasmärkt antikropp, vilket resul- terar i att den alkalifosfatasmärkta antikroppen förenar sig med antigenet, som tidigare kombinerats med den olösliggjorda antikroppen. Efter det att reaktionen är avslutad, avlägsnas reaktionslösningen, och den fasta fasen tvättas med en buf- fertlösning, destillerat vatten eller liknande.

I steg (c) inkuberas den fasta fas, som erhölls i steg (b) tillsammans med ett alkalifosfatassubstrat för att utföra en- zymreaktionen. Efter en bestämd tid avslutas reaktionen genom att en stopplösning för enzymreaktionen tillsättes. _; I steg (d) bestämmes absorbansen från nedbrytningsprodukten från substratet i reaktionslösningen i steg (c). Mätningen av absorbansen utföres med en absorptíonsfotometer med användning av en lämplig våglängd för kvantitativ bestämning av substra- tets nedbrytningsprodukt- 447 422 Absorbansen från en känd mängd av standardprovet mätes för kontroll med mätsystemet för att utarbeta en arbetskurva för mängden antigen mot absorbansen. Mängden antigen i_provet kan bestämmas från arbetskurvan genom mätning av absorbansen från en okänd mängd prov med samma mätsystem.

Fig. l - 4 av de bifogade rítningarna visar arbetskurvor för aldolas av det slag, som finns i människomuskler, vilka kur- vor erhållits genom enzym-ímmunoanalys enligt nedanstående exempel 5.

Fig. 5 visar en arbetskurva för aldolas av det slag, som finns i människomuskler, vilken kurva erhållits med enzym- immunoanalys enligt nedanstående exempel 6.

Fig. 6 visar resultaten från bestämning av aldolas av det slag, som finns i människomuskler, i humana sera, vilka re- sultat erhållits med enzym-immunoanalysen enligt nedanståen- de exempel 7.

Nedan beskrives reagenset för bestämning enligt föreliggande förfarande.

A) Antikropp mot aldolas av det slag, som finns i muskler.

Antiserum erhålles genom att immunisera aldolas av muskeltyp från ett däggdjur såsom människa, kanin, hund, apa, nötbo- skap etc. till ett annat djur.

Det imuniserade djuret väljs företrädesvis från olika arter av fâgla;,,ty aldolas av muskeltyp visar inte signifikant e immunologisk distinktion mellan däggdjuren. -- Exempel på föredragna fåglar inkluderar t.ex. hönsfâglar, kalkon, anka och liknande. 447 422 Företrädesvis sättes det inaktiverade_djurserumet, som är källan för aldolas av muskeltyp, till det erhållna anti- serumet, så att därvid andra förorenande antikroppar avlägs- nas genom absorption.

Reníngen av dessa antisera kan utföras med affinitetskroma- tografi med användning av bärare, förenad med aldolas av det slag, som förekommer i däggdjursmuskler, varvid däggdju- ret t.ex. väljs bland människa, kanin, apa, nötboskap etc.

Bärarmaterial för användning för detta ändamål är agaros," tvärbunden dextran etc. Den förenade bäraren kan framställas genom aktivering av en bärare med bromocyan eller liknande, den aktiverade bäraren sättes till en lösning av aldolas av muskeltyp, och den blandade lösningen omröres vid låg tem- peratur. Den renade antíkroppen mot aldolas av muskeltyp å- stadkommes genom att sätta antiserumet till en kolonn, fylld med denna förenade bärare och utföra affinitetskromatografin.

Eluering av antikroppen mot aldolas av muskeltyp från kolon- nen kan ske med en svag alkalisk lösning.

Vid denna affinitetskromatografi varierar känsligheten i mät- ningsförfarandet enligt föreliggande uppfinning beroende på kombinationen av det slag av aldolas av muskeltyp, som före- nats med bäraren, och det slag av aldolas av muskeltyp, som använts för framställningen av antiserumet.

När det gäller antiserum mot aldolas av det slag, som finns i människomuskler, erhålles en föredragen arbetskurva såsom visas i fig. l genom användning av antikropp mot aldolas av människomuskeltyp, vilken antikropp framställes genom re- ning med en bärare, förenad med aldolas av det slag, som finns i människomuskler, När det gäller antiserum mot aldoyz las av det slag som finns i kaninmuskler, erhålles mer före- dragna arbetskurvor genom rening med användning av en bärare förenad med aldolas av människomuskeltyp och bärare förenad med aldolas av det slag som finns i muskler från nötkreatur 447 422 än en bärare förenad med aldolas av kaninmuskeltyp såsom fram- går av fig. 2, 3 och 4.

B) Alkalifosfatasmärkt antikropp mot aldolas av muskeltyp.

Märkningen kan ske med vilka vanliga metoder som helst, så- som t.ex. Glutalaldehydmetoden, Nakanemetoden, Maleimide- metoden, metoden med sammansatta anhydrider, Carbodiimid- metoden etc. _ . " I Glutalaldehydmetoden âstadkommes märkningen genom att al- kalifosfatas sättes till antikroppen, glutalaldehyd tillsät- tes så att koncentrationen blir 0,2 - 0,8 % och slutligen utföres reaktionen i rumstemperatur.

Reaktionsförhållandet mellan alkalifosfatas och antikroppen är företrädesvis 1:1, när det gäller koncentrationen även om den kan vara 1:2 till 2:1.

Den alkalifosfatasmärkta antikroppen användes allmänt som ett reagens genom att den spädes med en buffertlösning och lik- nande. Det är även önskvärt att sätta till inaktivt kaninse- rum i en mängd av över 20 % till den spädda lösningen. Såsom framgår av fig. 4 ger tillsatsen av det inaktiverade kaninse- rumet en mer föredragen arbetskurva än de, som erhålles med enbart en buffertlösning eller med buffertlösningen innehål- lande serumalbuminet från nötdjur.

C) Olösliggjord antikropp mot aldolas av muskeltyp.

Såsom bärare användes en olöslig fast substans, som kan kom; bineras med en antikropp. Exempel på sådan fast substans in- kluderar t.ex. polystyren, cellulosa, agaros, glas, tvärbun- den dextran, silikongummi, metall etc. Man kan nämna en form såsom rör, platta för mikrotiter, pulver, sfär, membran, plat- ta, folie etc. 447 422 När det gäller polystyrenplattan för mikrotiter kan anti- kroppen förenas med plattans väggyta, när antikroppen är rätt utspädd med en buffertlösning eller liknande. Den späd- da lösningen sättas då till plattan; och det hela får slut- ligen stå.

D) övriga.

Som substrat användes enzymsubstrat, som används för den en- zymmärkta antikroppen såsom p-nitrofenylfosfat,,É¥glyceroI- -fosfat, fenyl-fosfat,gßrnaftyl-fosfat, fenolftalein-fosfat eller liknande.

Som stopplösning för alkalifosfatasreaktionerna kan användas kända lösningar för de respektive enzymerna. När det gäller al- kalifosfatas är den lämpliga stopplösningen 1N natriumhydroxid- lösning.

Ovanstående beskrivningar har utförts med sandwich-metoden, men aldolaset av typ människomuskel enligt föreliggande upp- finning kan även bestämmas med den immunoenzymometriska ana- lysen. Denna metod består i omsättning av den enzymmärkta an- tikroppen med ett prov (antigen), följt av separation av den enzymmärkta antikropp-antigen-reaktanten (B) från icke omsatt enzymmärkt antikropp (F), och bestämning av enzymaktiviteten hos både (B) och (F) med substratet. Som separationsmetod för (B) och (F) kan nämnas gelfiltreringsmetoden, absorptionsmeto- den med olösliggjort antigen etc. Även vid bestämning av aldo- las av humanmuskeltyp med den immunoenzymometriska analysen användes den enzymmärkta antikroppen mot aldolas av humanmus- keltyp, som beskrivits ovan, som reagens.

Följande experiment och exempel beskriver ytterligare denna: uppfinning. 447 422 Exgeriment l Antiserum mot aldolas av humanmuskeltyp.

Q Aldolas av humanmuskeltyp (1 mg) upplöstes i 0,5 ml fysiolo- giskt koksalt, och lösningen försattes med samma volym av Freunds kompletta adjuvans. Produkten administrerades genom injektion i muskeln på en hönsfågel (White Leghorn). Aldola- sen av humanmuskeltyp administrerades med samma förfarande, som beskrivits ovan tvâ veckor respektive tre veckor däref: ter. En vecka efter den sista administreringen uppsamlades blodet från hönsfågeln för utvinning av antiserum mot aldo- las av humanmuskeltyp.

Normalt humanserum (NHS) inaktiverat vid 560 C under 2 tim- mar sattes till detta antiserum, så att det innehöll 10 %.

Blandningen inkuberades vid 37° C under 1 timme och fick stå över natt vid 40 C. Produkten centrifugerades vid 3000 vpm under 20 minuter. Övervätskan uppsamlades för utvinning av antiserumet mot aldolas av humanmuskeltyp, innehållande ab- sorberat NHS. I Exgeriment 2 Antiserum mot aldolas av kaninmuskeltyp.

Aldolas av kaninmuskeltyp (2 mg) upplöstes i 1 ml fysiolo- gisk koksaltlösning. Därefter upprepades samma förfarande som i experiment l för utvinning av antiserumet mot aldolas av kaninmuskeltyp.

Till detta antiserum sattes normalt kaninserum (NRS) inakti- verat via s's° c under 3 timmar så att det iñnehöll 10 z. när; efter upprepades samma förfarande som i experiment 1 för ut- vinning av antiserum mot aldolas av kaninmuskeltyp innehål- lande absorberat NRS. 447 422 Exgeriment 3 Antikropp mot aldolas an humanmuskeltyg, .I- Sepharose @Ö4BÉE (Pharmacia Fine Chemicals AB; Agarose) (10 g) och aldolasen av humanmuskeltyp (10 mg) fick stå vid 4° C över natt i 15 ml 0,lM natriumkarbonatbuffertlösning (pa 9,0).

Den erhållna Sepharose 48 gelen förenad med aldolasen av hu- manmuskeltyp packades i en kolonn och tvättades med 0,05 É- tris-saltsyrabuffertlösníng (pH 8,0) innehållande 0,5 N natriumklorid. Till denna lösning sattes 3 ml av det NHS-ab- sorberade antiserumet mot aldolas av humanmuskeltyp, som er- hölls i experiment 1, och antiserumet drevs ut med 0,05 M tris-saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) innehållande 0,5 N natriumklorid. Därefter tillsattes 0,1 N vattenlösning av natriumkarbonat till kolonnen för eluering av antikroppen mot aldolas av humanmuskeltyp. Fraktionen med antikroppelua- tet utsattes för dialys med 0,05 M tris-saltsyrabuffertlös- ning (pH 8,0) varvid 3 mg av antikroppen mot aldolas av hu- manmuskeltyp erhölls.

Exgeriment 4 Antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp.

Det förfarande, som beskrevs i experiment 3, upprepades, förutom att 3 ml av det NRS-absorberade antiserumet mot aldo- las av kaninmuskeltyp, som beskrevs i experiment 2, sattes till Sepharose 4B gelen förenad med aldolasen av kaninmue- keltyp. Antiserumet mot aldolasen av kaninmuskeltyp (3 mg) erhölls: ' Exgeriment 5 Antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp.

Samma förfarande som beskrevs i experiment 3 upprepades för- 447 422 io utom att 3 ml av det NRS-absorberade antiserumet mot aldolas av kaninmuskeltyp, som beskrevs i experiment 2, sattes till Sepharose 4B gel förenad med aldolas av humanmuskeltyp. Anti- kropp mot aldolas av kaninmuskeltyp (3 mg) erhölls.

Experiment 6 Antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp.

Samma förfarande som beskrevs i experiment 3 upprepades för- utom att 3 ml av det NRS-absorberade antiserumet mot aldolas av muskeltyp, som beskrevs i experiment 2, sattes till Sepharose 4B gelen förenad med aldolasen av typ nötkreatur.

Man erhöll sålunda antikroppen mot aldolas av kaninmuskel- typ (3 m9) .

Experiment 7 Olösliggjord antikropp mot aldolas av humanmuskeltyp.

I varje hål, utfört i en polystyren-mikrotiter-platta sattes 200 /ul av 0,05 M tris-saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) inne- hållande 25 /ng/hd. av den antikropp mot aldolas av muskeltyp, som beskrevs i experiment 3, och fick sedan stå över natt. vid 4° C. Lösningen avlägsnades från plattan. Plattan tvät- tades med destillerat vatten för framställning av en mikro- titer-platta förenad med antikroppen mot aldolas av humanmus- keltyp.

Experiment 8 Olösliggjord antikropp mot aldolas av kanínmuskeltyp.

I varje nål, utfört i en polystyren-mikrotiter-platta satsae des 200 ßﬂ. av 0,05 M tris-saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) innehållande 25lpg/ml av den antikropp mot aldolas av ka- ninmuskeltyp, som beskrevs i experiment 4, och fick stå över natt vid 40 C. Lösningen avlägsnades från plattan. Plattan tvättades med destillerat vatten för framställning av en 447 422 ll ' mikrotiter-platta förenad med antikroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp.

Exgeriment 9 Olösliggjord antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp.

I var och en av de hål, som utförts i en polystyren-mikro- titer-platta satsades 200 /ul 0,05 M tris-saltsyrabuffert- lösning (pH 8,0) innehållande 25 /pg/nd. av den antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp, som beskrevs i experiment 5,-oëh fick stå över natt vid 4° C. Lösningen avlägsnades från plat- tan. Plattan tvättades med destillerat vatten för framställ- ning av en mikrotiter-platta förenad med antikroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp.

Exgeriment 10 Olösliggjord antíkropp mot aldolas av kaninmuskeltyn.

Med användning av den antikropp mot aldolas av kaninmuskel, som erhölls i experiment 6, erhölls en mikrotiter-platta förenad med antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp på samma sätt som beskrevs i det föregående experimentet 9.

Exempel 1 Alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av humanmuskeltyp.

I 0,3 ml vatten innehållande 1 mg alkalifosfatas (relativ aktivitet 1000 enheter/mg) sattes 0,2 ml 0,05 M fosforsyra- buffertlösning (pH 7,0) innehållande l mg av den antikropp mot aldolas av humanmuskeltyp, som beskrevs i experiment 3 och 50 ;ül'2,5-procentig glutaraldehydlösning. Blandningenz fick stå 30 minuter i rumstemperatur, varefter den utsattes för dialys med 0,05 M tris-saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) över natt. Man erhöll en alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av humanmuskeltyp. 447 422 12 Exempel 2 Alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av kaninmüskeltyp.

Samma förfarande som beskrevs i exempel l upprepades förutom att 1 mg antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp, som be- skrevs i experiment 4, användes med l mg alkalifosfatas.

Alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av kanínmuskeltyp erhölls.

Exempel 3 Alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp.

' Samma förfarande, som beskrevs i exempel 1, upprepades för- utom att den antikropp mot aldolas av kanínmuskeltYP, som beskrevs i experiment 5, användes med 1 mg alkalifosfatas.

Alkalifosfataszmärkt antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp“ erhölls: S Exempel 4 Alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp.

Samma förfaranden som beskrevs i exempel 1 upprepades för4 utom att den antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp, som beskrevs i experiment 6, användes med l mg alkalifosfatas.

Man erhöll sålunda alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp.

Exempel 5 Enzym-immunoanalxs En standard antigenlösning av 500 ng/ml - 7,6 mg/ml fram- ' ställdes genom spädning av aldolas av humanmuskeltyp i serie två gånger med normalt kaninserum inaktiverat vid 56° C un- der 2 timmar. Denna standardlösning (0,1 ml) sattes till en mikrotiter-platta förenad med antikropp mot aldolas av mus- 447 422 13 keityp och fick stå so minuter vid 37° c. Reakcionslösningen . avlägsnades. Plattan tvättades fyra gånger med destillerat vatten. Å andra sidan späddes alkalifosfatas-märkt anti- kropp mot aldolas av muskeltyp 150 gånger med 0,05 M tris- saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) innehållande 30 % normalt ka- ninserum inaktiverat vid 560 C 2 timmar. Denna spädda lös- ning (0,1 ml) sattes till plattan och fick stå 60 minuter vid 370 C. Reaktionslösningen avlägsnades. Plattan tvättades fyra gånger med destillerat vatten. En lösning av 5 mg/ml p-nitrofenyl-fosfat i 0,1 M natriumkarbonatbuffertlösning" (pH 9,0) innehållande 0,001 M magnesiumklorid bereddes se- parat. Denna lösning (0,1 ml) sattes till plattan och fick reagera vid 37° C under 60 minuter följt av tillsats av I 0,1 ml l N natriumhydroxid för att avsluta reaktionen. Reak- tionslösningen späddes tio gånger med destillerat vatten. Ab- sorbansen vid 405 m/i mättes med en spektrofotometer för uppritning av arbetskurvan mellan absorbansen och koncentra-0 tionen av aldolaset av humanmuskeltyp.

'Fig. l visar arbetskurvan för ovan nämnda analyssystem, där mikrotiter-plattan förenad med antikroppen mot aldolas av humanmuskeltyp i experiment 7 användes som en mikrotiter- platta förenad med antikropp mot aldolas av muskeltyp, res- pektive det alkalifosfatas-märkta aldolasantigenet av human- muskeltyp i exempel l användes som ett alkalifosfatas-märkt aldolasantigen av muskeltyp.

Fig. 2 visar arbetskurvan när mikrotiter-plattan förenad med antikroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp i experiment 8 an- vändes som en mikrotiter förenad med antikropp mot aldolas av muskeltyp, respektive den alkalifosfatas-märkta antikroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp i exempel 2 användes som en .= alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av muskeltyp.

Fig. 3 visar arbetskurvan när mikrotiter-plattan förenad med antikroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp i experiment 9 användes som en mikrotiter-platta kombinerad med antíkropp 447 422 14 mot aldolas av muskeltyp, respektive den alkalifosfatas- märkta antikroppen mot aldolas av kaninmnskeltyp i exempel 3 användes som en alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av muskeltyp.

Fig. 4 visar arbetskurvan när mikrotiter-plattan, förenad med antikroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp i experiment 10 användes som en mikrotiter-platta kombinerad med anti- kropp mot aldolas av muskeltyp respektive den alkalifosfatas- märkta antikroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp i exempel 4 användes som en alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av muskeltyp.

I fig. l - 4 anger de horisontella axlarna koncentrationen (ng/ml) av aldolas av humanmuskeltyp, och de vertikala axlar- na anger absorbansen vid 405 mji (OD405 mfl).

Såsom framgår av fig. l - 4 erhålles den mest gynnsamma ar- betskurvan med den olösliggjorda antikroppen och den enzym- märkta antikroppen när antikroppen mot aldolas av humanmus- keltyp (fig. l) användes i ordning följd av den olösliggjor- da antikroppen och den enzymmärkta antikroppen när antikrop- pen mot aldolas av kaninmuskeltyp (fig. 4, 3 och 2) användes.

Det framgår vid jämförelse av de fall, när antikropp mot al- dolas av kaninmuskeltyp användes att mer fördelaktiga arbets- kurvor erhålles i respektive fall (fig. 4), när bäraren, fö- renad med aldolas från nötboskapsmuskel användes samt det fall (fig. 3) när bäraren användes förenad med aldolas av humanmuskeltyp för reningen av antikroppen med affinitets- kromatografi än den kurva, som erhålles i det andra fallet (fig. ZL när en bärare, förenad med aldolas av kaninmuskel- e. .u typ användes.

Exempel 6 Enzym-immunoanalys Effekterna från slaget av utspädningsmedel på de enzym-mârk- 447 422 15 ta antikropparna undersöktes med immunoanalyssystemet enligt exempel 5.

Den alkalifosfatas-märkta antikroppen mot aldolas av human- muskeltyp, som beskrevs i exempel l, användes som en enzym- märkt antikropp, och mikrotiter-plattan, förenad med den aldolas av humanmuskeltyp, som beskrevs i experiment 7, så- som olösliggjort antigen.

Följande utspädningsmedel användes i detta exempel: (A) 0,05 M tris-saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) innehållande 30 % koncentration av det normala kaninserumet inaktive- rat vid 56° C under 2 timmar.

(B) 0,05 M tris-saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) innehållande 1 % koncentration av albumin frân nötboskap inaktiverat vid se° c under ao minuter.

(C) 0,05 M tris-saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) som kontroll.

De enzymmärkta antikropparna användes utspädda 150 gånger med var och en av dessa utspädningsmedel. Arbetskurvan uppfördes på samma sätt som i exempel 5 med användning av standardanti- genlösningen. Varje erhâllen arbetskurva visas i fig. 4. Den horisontella axeln i fig. 4 anger koncentrationen av°aldolas av humanmuskeltyp (ng/ml), och den vertikala axeln anger ab- sorbansen vid 405 m/u (OD405 m ). Symbolerna A, B och C an- ger de respektive arbetskurvor a, erhållna i varje fall när utspädningsmedlen (A), (B) respektive (C) användes. Det fram- går på ritningen att den mest gynnsamma arbetskurvan är ar- betskurvan A, som erhålles när utspädningsmedlet innehåller* det inaktiverade kaninserumet. 447 422 Exemgel 7 Enzym-immunoanalvs Analys utfördes för koncentrationerna av aldolas av human- muskeltyp i serumen från olika cancerpatienter från godar- tat sjuka patienter och från friska människor med det immuno- analyssystem, som beskrevs i exempel S.

Den enzym-märkta antikropp, som användes i detta exempel, var den alkalifosfatas-märkta antikroppen mot aldolas av' _- humanmuskeltyp, som beskrevs i exempel 1, och den använda olösliggjorda antikroppen var mikrotiter-plattan förenad med den aldolas av humanmuskeltyp, som beskrevs i experi- ment 7. Serumprovet användes direkt utan spädning.

'Resultaten visas i fig. 6. Såsom framgår av kurvorna tende- rar aldolasen av humanmuskeltyp att föreligga i serumet från cancerpatienter i en högre koncentration än i serumen från de andra godartat sjuka patienterna och från de friska människorna.

Claims

447 422 17 . Patentkrav

1. Reagens för bestämning av aldólas av humanmuskeltyp. k ä n n e t e c k n a t av att det innehåller alkalífosfatas- märkt antíkropp mot aldolas av muskeltyp.

2. Reagens enligt krav 1, k ä n n e t e c K n a t av att antikroppen mot aldolas, av muskeltyp är antikropp mot aldolas av humanmuskeltyp. h

3. Reagens enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att antíkroppen mot aldolas av muskeltyp är antíkropp mot aldolas av kanínmuskeltyp.

4. Reagens enligt krav 3. k ä n n e t e c k n a t ~av att antíkroppen mot aldolas av kanínmuskeltyp är en. som renats med affínítetskromatografí med användning av en bärare förenad med aldolas av humanmuskeltyp.

5. Reagens enligt krav 3. k ä n n e t e c k n a t av att antíkroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp är en. som :enats genom affinítetskromatografí med användning av en bärare. förenad med aldolas av det slag. som finns i nötkreatursmuskel.

6. Reagens enligt krav 1. x ä n n e t e c n n a t av att den enzym-märkta antíkroppen mot aldolas av muskeltyp spätts med en buffertlösníng innehållande inaktiverat kaninserum.

7. Sätt att bestämma aldolas av humanmuskeltYP- k ä n n e - t e c k n a t av att (a) ett prov bringas i kontakt med en olösliggjord antikropp mot aldolas av muskeltyp. varefter den fasta fasen separeras; (b) den fasta fasen bringas i kontakt med alkalifosfatasnärkt antikropp mot aldolas av muskeltyp. varefter den fasta fasen separeras: 447 422 18 . (c) den fasta fasen bríngas i kontakt med alkalífosfatas- substrat och - '* (d) absorbansen från substratets nedbrytningsprodukte: bestäm- meS .

8. Sätt enligt krav 7. K ä n n e t e c k n a t av att man använder en antíkropp mot aldolas av kaninmuskeltyp. som :enats med affínítetskromatografí med användning av en Panare. förenad med alâolas av det slag, som finns i nötkzeatürs- muskel. såsom antíkropp mot aldolas av muskeltyp í en olöslig- gjord antikropp mot aldolas av muskeltyp och en alkalífosfa- tasmärkt antíkropp mot aldolas av muskeltyp.