SE447422B - REAGENTS AND SETS FOR DETERMINING ALDOLAS OF THE TYPE THAT ARE IN THE HUMAN MUSCLES - Google Patents
REAGENTS AND SETS FOR DETERMINING ALDOLAS OF THE TYPE THAT ARE IN THE HUMAN MUSCLESInfo
- Publication number
- SE447422B SE447422B SE8006667A SE8006667A SE447422B SE 447422 B SE447422 B SE 447422B SE 8006667 A SE8006667 A SE 8006667A SE 8006667 A SE8006667 A SE 8006667A SE 447422 B SE447422 B SE 447422B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- type
- aldolas
- muscle
- antibody
- rabbit
- Prior art date
Links
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 title claims description 73
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims description 42
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 13
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 36
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 33
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 23
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 21
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 15
- 101710123627 Fructose-bisphosphate aldolase A Proteins 0.000 claims description 12
- 102100022277 Fructose-bisphosphate aldolase A Human genes 0.000 claims description 12
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 11
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 11
- 101000755879 Homo sapiens Fructose-bisphosphate aldolase A Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 9
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 claims description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 claims description 4
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- -1 compound anhydride Chemical class 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 3
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XYZZKVRWGOWVGO-UHFFFAOYSA-N Glycerol-phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(O)CO XYZZKVRWGOWVGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- WMDDNKROYKCDJC-UHFFFAOYSA-N [4-[3-oxo-1-(4-phosphonooxyphenyl)-2-benzofuran-1-yl]phenyl] dihydrogen phosphate Chemical compound C1=CC(OP(O)(=O)O)=CC=C1C1(C=2C=CC(OP(O)(O)=O)=CC=2)C2=CC=CC=C2C(=O)O1 WMDDNKROYKCDJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- RONNRWUMUHMWOH-UHFFFAOYSA-N bromo cyanate Chemical compound BrOC#N RONNRWUMUHMWOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N hydrochloric acid Substances Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N phenyl phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=CC=C1 CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 1
- 239000004945 silicone rubber Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
Description
447 422 _ n 2 Q Vid elektroforesmetoden består problemet i att de vandrande punkterna från de humana aldolas-isoenzymen är så tätt pla- cerade i förhållande till varandra att upplösningen är svår, och den exakta kvantitativa bestämningen kan inte erhållas. 447 422 _ n 2 Q In the electrophoresis method, the problem is that the migratory points of the human aldolase isoenzyme are so closely spaced relative to each other that dissolution is difficult, and the exact quantitative determination cannot be obtained.
Vid mätmetoden för aktivitetsförhållandet FDP/FIP skall det framhållas att förfarandet är speciellt svårt för mätning av FIP-ALD-aktiviteten, och dessutom sker ingen kvantitativ bestämning.In the measurement method for the FDP / FIP activity ratio, it should be emphasized that the procedure is particularly difficult for measuring the FIP-ALD activity, and in addition no quantitative determination takes place.
Nyligen har ett nytt förfarande med radio-immunoanalys rap- porterats. Jämfört med de ovan nämnda förfarandena är denna metod bättre när det gäller den kvantitativa bestämningen.Recently, a new method of radioimmunoassay has been reported. Compared with the above-mentioned procedures, this method is better in terms of quantification.
Denna metod har emellertid även nâgra nackdelar genom att reagenset inte kan lagras på grund av att den radioisotop, som skall användas för märkning, snabbt försvinner; speciel- la maskiner och speciella apparatur och i synnerhet ett- speciellt rum erfordras för radioisotopmötningen; hante- ringen av radioisotopen under mätningen och kvittblivningen av avfallsmaterial är svåra eftersom användningen av radio- isotopen är förknippad med hälsorisk.However, this method also has some disadvantages in that the reagent cannot be stored due to the rapid disappearance of the radioisotope to be used for labeling; special machines and equipment and in particular a special room are required for the radioisotope encounter; The handling of the radioisotope during the measurement and disposal of waste materials is difficult because the use of the radioisotope is associated with health risks.
Ett reagens har nu utvecklats för användning för enzym-im- munoanalys av aldolas av det slag, som finns i människomusk- ler, samt ett förfarande för bestämning av aldolas av det slag, som finns i människomuskler, med användning av detta reagens. Enligt detta förfarande kan många nackdelar, som är förknippade med förfarandena enligt tidigare teknik, undan- röjas eller minskas.A reagent has now been developed for use in enzyme immunoassay of aldolas of the human muscle type and a method of determining aldolas of the human muscle type using this reagent. According to this method, many disadvantages associated with the prior art procedures can be eliminated or reduced.
Förfarandet enligt föreliggande uppfinning baserar sig på enzym-immunoanalys, så kallad “sandwichmetoden". Vid detta ; förfarande utföres mätning med följande steg: (a) ett prov bringas i kontakt med en'olösliggjord anti- kropp mot aldolas av muskeltyp, varefter den fasta fa- sen separeras;. 447 422 (b) den fasta fasen bringas i kontakt med en med alkalifos- fatas märkt antikropp mot aldolas av muskeltyp, följt av separation av den fasta fasen; (c) den fasta fasen bringas i kontakt med alkalifosfatas-sub- strat och (d) absorbansen från substratets nedbrytningsprodukt bestäm- mes.The method of the present invention is based on the enzyme immunoassay, the so-called "sandwich method". In this method, measurement is performed with the following steps: (a) a sample is contacted with an insolubilized antibody against muscle-type aldolase, after which the solid 447 422 (b) the solid phase is contacted with an alkali phosphatase-labeled antibody to muscle-type aldolase, followed by separation of the solid phase; (c) the solid phase is contacted with the alkali phosphatase. substrate and (d) the absorbance of the degradation product of the substrate is determined.
Följande beskriver detta förfarande närmare.The following describes this procedure in more detail.
I steget (a) inkuberas en antikropp, som gjorts olöslig genom att den kombinerats med en bärare, med ett prov, såsom serum etc. så att antigenet (av det slag, som finns i människomusk- ler) i provet kan reagera med den olösliggjorda antikroppen.In step (a), an insoluble antibody by combining it with a carrier is incubated with a sample such as serum, etc. so that the antigen (of the kind found in human muscles) in the sample can react with the insolubilized the antibody.
Efter det att reaktionen är avslutad, avlägsnas reaktionslös- ningen, och den fasta fasen tvättas med buffertlösning, destil- lerat vatten eller liknande.After the reaction is complete, the reaction solution is removed, and the solid phase is washed with buffer solution, distilled water or the like.
I steg (b) inkuberas den fasta fas, som erhölls i steg (a) tillsammans med en alkalifosfatasmärkt antikropp, vilket resul- terar i att den alkalifosfatasmärkta antikroppen förenar sig med antigenet, som tidigare kombinerats med den olösliggjorda antikroppen. Efter det att reaktionen är avslutad, avlägsnas reaktionslösningen, och den fasta fasen tvättas med en buf- fertlösning, destillerat vatten eller liknande.In step (b), the solid phase obtained in step (a) is incubated with an alkali phosphatase-labeled antibody, resulting in the alkali phosphate-labeled antibody joining the antigen previously combined with the insolubilized antibody. After the reaction is complete, the reaction solution is removed, and the solid phase is washed with a buffer solution, distilled water or the like.
I steg (c) inkuberas den fasta fas, som erhölls i steg (b) tillsammans med ett alkalifosfatassubstrat för att utföra en- zymreaktionen. Efter en bestämd tid avslutas reaktionen genom att en stopplösning för enzymreaktionen tillsättes. _; I steg (d) bestämmes absorbansen från nedbrytningsprodukten från substratet i reaktionslösningen i steg (c). Mätningen av absorbansen utföres med en absorptíonsfotometer med användning av en lämplig våglängd för kvantitativ bestämning av substra- tets nedbrytningsprodukt- 447 422 Absorbansen från en känd mängd av standardprovet mätes för kontroll med mätsystemet för att utarbeta en arbetskurva för mängden antigen mot absorbansen. Mängden antigen i_provet kan bestämmas från arbetskurvan genom mätning av absorbansen från en okänd mängd prov med samma mätsystem.In step (c), the solid phase obtained in step (b) is incubated together with an alkali phosphatase substrate to carry out the enzyme reaction. After a certain time, the reaction is terminated by adding a stop solution for the enzyme reaction. _; In step (d), the absorbance of the degradation product from the substrate in the reaction solution in step (c) is determined. The measurement of the absorbance is performed with an absorption photometer using a suitable wavelength for quantitative determination of the substrate degradation product. The absorbance from a known amount of the standard sample is measured for control with the measuring system to prepare a working curve for the amount of antigen against the absorbance. The amount of antigen in the sample can be determined from the work curve by measuring the absorbance of an unknown amount of sample with the same measurement system.
Fig. l - 4 av de bifogade rítningarna visar arbetskurvor för aldolas av det slag, som finns i människomuskler, vilka kur- vor erhållits genom enzym-ímmunoanalys enligt nedanstående exempel 5.Figures 1-4 of the accompanying drawings show work curves for aldolas of the type found in human muscles, which curves were obtained by enzyme immunoassay according to Example 5 below.
Fig. 5 visar en arbetskurva för aldolas av det slag, som finns i människomuskler, vilken kurva erhållits med enzym- immunoanalys enligt nedanstående exempel 6.Fig. 5 shows a work curve for aldolas of the type found in human muscles, which curve was obtained by enzyme immunoassay according to Example 6 below.
Fig. 6 visar resultaten från bestämning av aldolas av det slag, som finns i människomuskler, i humana sera, vilka re- sultat erhållits med enzym-immunoanalysen enligt nedanståen- de exempel 7.Fig. 6 shows the results of the determination of aldolas of the type found in human muscles in human sera, which results were obtained by the enzyme immunoassay according to Example 7 below.
Nedan beskrives reagenset för bestämning enligt föreliggande förfarande.The reagent for determination according to the present method is described below.
A) Antikropp mot aldolas av det slag, som finns i muskler.A) Antibody to aldolas of the type found in muscle.
Antiserum erhålles genom att immunisera aldolas av muskeltyp från ett däggdjur såsom människa, kanin, hund, apa, nötbo- skap etc. till ett annat djur.Antiserum is obtained by immunizing muscle-type aldolas from a mammal such as a human, rabbit, dog, monkey, cattle, etc. to another animal.
Det imuniserade djuret väljs företrädesvis från olika arter av fâgla;,,ty aldolas av muskeltyp visar inte signifikant e immunologisk distinktion mellan däggdjuren. -- Exempel på föredragna fåglar inkluderar t.ex. hönsfâglar, kalkon, anka och liknande. 447 422 Företrädesvis sättes det inaktiverade_djurserumet, som är källan för aldolas av muskeltyp, till det erhållna anti- serumet, så att därvid andra förorenande antikroppar avlägs- nas genom absorption.The immunized animal is preferably selected from various species of birds; for aldolas of the muscle type do not show significant immunological distinction between the mammals. Examples of preferred birds include e.g. poultry, turkey, duck and the like. Preferably, the inactivated animal serum, which is the source of aldolas of the muscle type, is added to the resulting antiserum, so that other contaminating antibodies are removed by absorption.
Reníngen av dessa antisera kan utföras med affinitetskroma- tografi med användning av bärare, förenad med aldolas av det slag, som förekommer i däggdjursmuskler, varvid däggdju- ret t.ex. väljs bland människa, kanin, apa, nötboskap etc.The purification of these antisera can be performed by affinity chromatography using carriers, combined with aldolas of the type found in mammalian muscles, the mammal e.g. selected from humans, rabbits, monkeys, cattle, etc.
Bärarmaterial för användning för detta ändamål är agaros," tvärbunden dextran etc. Den förenade bäraren kan framställas genom aktivering av en bärare med bromocyan eller liknande, den aktiverade bäraren sättes till en lösning av aldolas av muskeltyp, och den blandade lösningen omröres vid låg tem- peratur. Den renade antíkroppen mot aldolas av muskeltyp å- stadkommes genom att sätta antiserumet till en kolonn, fylld med denna förenade bärare och utföra affinitetskromatografin.Carrier materials for use for this purpose are agarose, crosslinked dextran, etc. The combined carrier can be prepared by activating a carrier with bromocyanate or the like, the activated carrier is added to a solution of muscle-type aldolase, and the mixed solution is stirred at low temperature. The purified antibody to muscle-type aldolas is obtained by placing the antiserum in a column filled with this combined vehicle and performing the affinity chromatography.
Eluering av antikroppen mot aldolas av muskeltyp från kolon- nen kan ske med en svag alkalisk lösning.Elution of the antibody to muscle-type aldolas from the column can be done with a weak alkaline solution.
Vid denna affinitetskromatografi varierar känsligheten i mät- ningsförfarandet enligt föreliggande uppfinning beroende på kombinationen av det slag av aldolas av muskeltyp, som före- nats med bäraren, och det slag av aldolas av muskeltyp, som använts för framställningen av antiserumet.In this affinity chromatography, the sensitivity of the measurement method of the present invention varies depending on the combination of the type of muscle-type aldolase associated with the carrier and the type of muscle-type aldolase used for the preparation of the antiserum.
När det gäller antiserum mot aldolas av det slag, som finns i människomuskler, erhålles en föredragen arbetskurva såsom visas i fig. l genom användning av antikropp mot aldolas av människomuskeltyp, vilken antikropp framställes genom re- ning med en bärare, förenad med aldolas av det slag, som finns i människomuskler, När det gäller antiserum mot aldoyz las av det slag som finns i kaninmuskler, erhålles mer före- dragna arbetskurvor genom rening med användning av en bärare förenad med aldolas av människomuskeltyp och bärare förenad med aldolas av det slag som finns i muskler från nötkreatur 447 422 än en bärare förenad med aldolas av kaninmuskeltyp såsom fram- går av fig. 2, 3 och 4.In the case of antiserum to aldolas of the type found in human muscles, a preferred work curve is obtained as shown in Fig. 1 by using antibody to aldolas of the human muscle type, which antibody is prepared by purification with a carrier combined with aldolas of the In the case of antiserum to aldoyz las of the rabbit muscle type, more preferred work curves are obtained by purification using a carrier associated with aldolas of the human muscle type and carriers associated with aldolas of the type available. in muscle from cattle 447 422 than a carrier associated with aldolas of the rabbit muscle type as shown in Figures 2, 3 and 4.
B) Alkalifosfatasmärkt antikropp mot aldolas av muskeltyp.B) Alkali phosphate-labeled antibody to muscle-type aldolas.
Märkningen kan ske med vilka vanliga metoder som helst, så- som t.ex. Glutalaldehydmetoden, Nakanemetoden, Maleimide- metoden, metoden med sammansatta anhydrider, Carbodiimid- metoden etc. _ . " I Glutalaldehydmetoden âstadkommes märkningen genom att al- kalifosfatas sättes till antikroppen, glutalaldehyd tillsät- tes så att koncentrationen blir 0,2 - 0,8 % och slutligen utföres reaktionen i rumstemperatur.The marking can be done by any common methods, such as e.g. The glutalaldehyde method, the Nakane method, the Maleimide method, the compound anhydride method, the Carbodiimide method, etc. _. In the Glutalaldehyde method, the labeling is accomplished by adding alkali phosphatase to the antibody, glutalaldehyde is added so that the concentration is 0.2 - 0.8%, and finally the reaction is carried out at room temperature.
Reaktionsförhållandet mellan alkalifosfatas och antikroppen är företrädesvis 1:1, när det gäller koncentrationen även om den kan vara 1:2 till 2:1.The reaction ratio of alkali phosphatase to the antibody is preferably 1: 1, in terms of concentration, although it may be 1: 2 to 2: 1.
Den alkalifosfatasmärkta antikroppen användes allmänt som ett reagens genom att den spädes med en buffertlösning och lik- nande. Det är även önskvärt att sätta till inaktivt kaninse- rum i en mängd av över 20 % till den spädda lösningen. Såsom framgår av fig. 4 ger tillsatsen av det inaktiverade kaninse- rumet en mer föredragen arbetskurva än de, som erhålles med enbart en buffertlösning eller med buffertlösningen innehål- lande serumalbuminet från nötdjur.The alkali phosphate-labeled antibody is widely used as a reagent by diluting it with a buffer solution and the like. It is also desirable to add inactive rabbit serum in an amount of over 20% to the diluted solution. As shown in Fig. 4, the addition of the inactivated rabbit serum gives a more preferred work curve than those obtained with a buffer solution alone or with the buffer solution containing the serum albumin from cattle.
C) Olösliggjord antikropp mot aldolas av muskeltyp.C) Undissolved antibody to muscle-type aldolas.
Såsom bärare användes en olöslig fast substans, som kan kom; bineras med en antikropp. Exempel på sådan fast substans in- kluderar t.ex. polystyren, cellulosa, agaros, glas, tvärbun- den dextran, silikongummi, metall etc. Man kan nämna en form såsom rör, platta för mikrotiter, pulver, sfär, membran, plat- ta, folie etc. 447 422 När det gäller polystyrenplattan för mikrotiter kan anti- kroppen förenas med plattans väggyta, när antikroppen är rätt utspädd med en buffertlösning eller liknande. Den späd- da lösningen sättas då till plattan; och det hela får slut- ligen stå.The carrier used is an insoluble solid which can come; binarized with an antibody. Examples of such solids include e.g. polystyrene, cellulose, agarose, glass, cross-linked dextran, silicone rubber, metal, etc. One can mention a shape such as tube, plate for microtiter, powder, sphere, membrane, plate, foil, etc. 447 422 In the case of the polystyrene plate for microtiter, the antibody can be combined with the wall surface of the plate, when the antibody is properly diluted with a buffer solution or the like. The dilute solution is then added to the plate; and the whole thing must finally stand.
D) övriga.D) others.
Som substrat användes enzymsubstrat, som används för den en- zymmärkta antikroppen såsom p-nitrofenylfosfat,,É¥glyceroI- -fosfat, fenyl-fosfat,gßrnaftyl-fosfat, fenolftalein-fosfat eller liknande.As the substrate, enzyme substrates used for the enzyme-labeled antibody such as p-nitrophenyl phosphate, glycerol phosphate, phenyl phosphate, gernaphthyl phosphate, phenolphthalein phosphate or the like are used.
Som stopplösning för alkalifosfatasreaktionerna kan användas kända lösningar för de respektive enzymerna. När det gäller al- kalifosfatas är den lämpliga stopplösningen 1N natriumhydroxid- lösning.Known solutions for the respective enzymes can be used as the stop solution for the alkali phosphatase reactions. In the case of alkali phosphatase, the appropriate stop solution is 1N sodium hydroxide solution.
Ovanstående beskrivningar har utförts med sandwich-metoden, men aldolaset av typ människomuskel enligt föreliggande upp- finning kan även bestämmas med den immunoenzymometriska ana- lysen. Denna metod består i omsättning av den enzymmärkta an- tikroppen med ett prov (antigen), följt av separation av den enzymmärkta antikropp-antigen-reaktanten (B) från icke omsatt enzymmärkt antikropp (F), och bestämning av enzymaktiviteten hos både (B) och (F) med substratet. Som separationsmetod för (B) och (F) kan nämnas gelfiltreringsmetoden, absorptionsmeto- den med olösliggjort antigen etc. Även vid bestämning av aldo- las av humanmuskeltyp med den immunoenzymometriska analysen användes den enzymmärkta antikroppen mot aldolas av humanmus- keltyp, som beskrivits ovan, som reagens.The above descriptions have been performed with the sandwich method, but the human muscle type aldolase of the present invention can also be determined by the immunoenzymometric analysis. This method consists in reacting the enzyme-labeled antibody with a sample (antigen), followed by separating the enzyme-labeled antibody-antigen reactant (B) from unreacted enzyme-labeled antibody (F), and determining the enzyme activity of both (B) and (F) with the substrate. As the separation method for (B) and (F) can be mentioned the gel filtration method, the absorption method with insolubilized antigen, etc. Also in determining human muscle type aldolase with the immunoenzymometric assay, the enzyme-labeled antibody to human muscle type aldolase was used, as described above. as reagent.
Följande experiment och exempel beskriver ytterligare denna: uppfinning. 447 422 Exgeriment l Antiserum mot aldolas av humanmuskeltyp.The following experiments and examples further describe this: invention. 447 422 Exgeriment l Antiserum to aldolas of the human muscle type.
Q Aldolas av humanmuskeltyp (1 mg) upplöstes i 0,5 ml fysiolo- giskt koksalt, och lösningen försattes med samma volym av Freunds kompletta adjuvans. Produkten administrerades genom injektion i muskeln på en hönsfågel (White Leghorn). Aldola- sen av humanmuskeltyp administrerades med samma förfarande, som beskrivits ovan tvâ veckor respektive tre veckor däref: ter. En vecka efter den sista administreringen uppsamlades blodet från hönsfågeln för utvinning av antiserum mot aldo- las av humanmuskeltyp.Human muscle type Aldolas (1 mg) was dissolved in 0.5 ml of physiological saline, and the solution was added with the same volume of Freund's complete adjuvant. The product was administered by injection into the muscle of a hen (White Leghorn). The human muscle type aldolase was administered by the same procedure as described above two weeks and three weeks thereafter. One week after the last administration, the blood was collected from the chicken bird for the extraction of antiserum against aldolase of the human muscle type.
Normalt humanserum (NHS) inaktiverat vid 560 C under 2 tim- mar sattes till detta antiserum, så att det innehöll 10 %.Normal human serum (NHS) inactivated at 560 ° C for 2 hours was added to this antiserum so that it contained 10%.
Blandningen inkuberades vid 37° C under 1 timme och fick stå över natt vid 40 C. Produkten centrifugerades vid 3000 vpm under 20 minuter. Övervätskan uppsamlades för utvinning av antiserumet mot aldolas av humanmuskeltyp, innehållande ab- sorberat NHS. I Exgeriment 2 Antiserum mot aldolas av kaninmuskeltyp.The mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour and allowed to stand overnight at 40 ° C. The product was centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes. The supernatant was collected for the extraction of the antiserum against aldolas of the human muscle type, containing absorbed NHS. In Exgeriment 2 Antiserum against rabbit muscle aldolas.
Aldolas av kaninmuskeltyp (2 mg) upplöstes i 1 ml fysiolo- gisk koksaltlösning. Därefter upprepades samma förfarande som i experiment l för utvinning av antiserumet mot aldolas av kaninmuskeltyp.Aldolas of rabbit muscle type (2 mg) was dissolved in 1 ml of physiological saline solution. Thereafter, the same procedure was repeated as in Experiment 1 for recovering the antiserum against rabbit muscle-type aldolas.
Till detta antiserum sattes normalt kaninserum (NRS) inakti- verat via s's° c under 3 timmar så att det iñnehöll 10 z. när; efter upprepades samma förfarande som i experiment 1 för ut- vinning av antiserum mot aldolas av kaninmuskeltyp innehål- lande absorberat NRS. 447 422 Exgeriment 3 Antikropp mot aldolas an humanmuskeltyg, .I- Sepharose @Ö4BÉE (Pharmacia Fine Chemicals AB; Agarose) (10 g) och aldolasen av humanmuskeltyp (10 mg) fick stå vid 4° C över natt i 15 ml 0,lM natriumkarbonatbuffertlösning (pa 9,0).To this antiserum was added normal rabbit serum (NRS) inactivated via s' ° c for 3 hours so that it contained 10 z. When; after, the same procedure was repeated as in Experiment 1 for the extraction of antiserum against rabbit muscle-type aldolas containing absorbed NRS. 447 422 Exgeriment 3 Antibody to aldolase in human muscle tissue, .I- Sepharose® Ö4BÉE (Pharmacia Fine Chemicals AB; Agarose) (10 g) and the human muscle type aldolase (10 mg) were allowed to stand at 4 ° C overnight in 15 ml 0.1M sodium carbonate buffer solution (pa 9.0).
Den erhållna Sepharose 48 gelen förenad med aldolasen av hu- manmuskeltyp packades i en kolonn och tvättades med 0,05 É- tris-saltsyrabuffertlösníng (pH 8,0) innehållande 0,5 N natriumklorid. Till denna lösning sattes 3 ml av det NHS-ab- sorberade antiserumet mot aldolas av humanmuskeltyp, som er- hölls i experiment 1, och antiserumet drevs ut med 0,05 M tris-saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) innehållande 0,5 N natriumklorid. Därefter tillsattes 0,1 N vattenlösning av natriumkarbonat till kolonnen för eluering av antikroppen mot aldolas av humanmuskeltyp. Fraktionen med antikroppelua- tet utsattes för dialys med 0,05 M tris-saltsyrabuffertlös- ning (pH 8,0) varvid 3 mg av antikroppen mot aldolas av hu- manmuskeltyp erhölls.The resulting Sepharose 48 gel combined with the human muscle type aldolase was packed in a column and washed with 0.05 Etris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) containing 0.5 N sodium chloride. To this solution was added 3 ml of the NHS-absorbed antiserum to human muscle-type aldolas obtained in Experiment 1, and the antiserum was expelled with 0.05 M tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) containing 0.5 N sodium chloride. Then, 0.1 N aqueous sodium carbonate solution was added to the column to elute the antibody against human muscle aldolas. The fraction with the antibody eluate was dialyzed with 0.05 M tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) to give 3 mg of the antibody to human muscle aldolas.
Exgeriment 4 Antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp.Exgeriment 4 Antibody to rabbit muscle type aldolas.
Det förfarande, som beskrevs i experiment 3, upprepades, förutom att 3 ml av det NRS-absorberade antiserumet mot aldo- las av kaninmuskeltyp, som beskrevs i experiment 2, sattes till Sepharose 4B gelen förenad med aldolasen av kaninmue- keltyp. Antiserumet mot aldolasen av kaninmuskeltyp (3 mg) erhölls: ' Exgeriment 5 Antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp.The procedure described in Experiment 3 was repeated except that 3 ml of the NRS-absorbed anti-rabbit muscle type aldolase described in Experiment 2 was added to the Sepharose 4B gel combined with the rabbit muscle type aldolase. The rabbit muscle-type aldolase antiserum (3 mg) was obtained: Exgeriment 5 Rabbit muscle-type aldolase antibody.
Samma förfarande som beskrevs i experiment 3 upprepades för- 447 422 io utom att 3 ml av det NRS-absorberade antiserumet mot aldolas av kaninmuskeltyp, som beskrevs i experiment 2, sattes till Sepharose 4B gel förenad med aldolas av humanmuskeltyp. Anti- kropp mot aldolas av kaninmuskeltyp (3 mg) erhölls.The same procedure as described in Experiment 3 was repeated except that 3 ml of the NRS-absorbed rabbit muscle-type aldase antiserum added in Experiment 2 was added to Sepharose 4B gel combined with human muscle-type aldolas. Antibody against rabbit muscle type aldolas (3 mg) was obtained.
Experiment 6 Antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp.Experiment 6 Antibody to rabbit muscle type aldolas.
Samma förfarande som beskrevs i experiment 3 upprepades för- utom att 3 ml av det NRS-absorberade antiserumet mot aldolas av muskeltyp, som beskrevs i experiment 2, sattes till Sepharose 4B gelen förenad med aldolasen av typ nötkreatur.The same procedure as described in Experiment 3 was repeated except that 3 ml of the NRS-absorbed anti-muscular aldolas antiserum described in Experiment 2 was added to the Sepharose 4B gel combined with the bovine aldolase.
Man erhöll sålunda antikroppen mot aldolas av kaninmuskel- typ (3 m9) .Thus, the rabbit muscle-type aldola antibody (3 m9) was obtained.
Experiment 7 Olösliggjord antikropp mot aldolas av humanmuskeltyp.Experiment 7 Undissolved antibody to aldolas of the human muscle type.
I varje hål, utfört i en polystyren-mikrotiter-platta sattes 200 /ul av 0,05 M tris-saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) inne- hållande 25 /ng/hd. av den antikropp mot aldolas av muskeltyp, som beskrevs i experiment 3, och fick sedan stå över natt. vid 4° C. Lösningen avlägsnades från plattan. Plattan tvät- tades med destillerat vatten för framställning av en mikro- titer-platta förenad med antikroppen mot aldolas av humanmus- keltyp.In each well, made in a polystyrene microtiter plate, was added 200 .mu.l of 0.05 M tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) containing 25 .mu.g / hd. of the muscle-type aldolas antibody described in Experiment 3 and then allowed to stand overnight. at 4 ° C. The solution was removed from the plate. The plate was washed with distilled water to produce a microtiter plate combined with the antibody to human muscle aldolas.
Experiment 8 Olösliggjord antikropp mot aldolas av kanínmuskeltyp.Experiment 8 Insolubilized antibody to rabbit muscle type aldolas.
I varje nål, utfört i en polystyren-mikrotiter-platta satsae des 200 ßfl. av 0,05 M tris-saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) innehållande 25lpg/ml av den antikropp mot aldolas av ka- ninmuskeltyp, som beskrevs i experiment 4, och fick stå över natt vid 40 C. Lösningen avlägsnades från plattan. Plattan tvättades med destillerat vatten för framställning av en 447 422 ll ' mikrotiter-platta förenad med antikroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp.In each needle, made in a polystyrene-microtiter plate, the value is 200 ß fl. of 0.05 M tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) containing 25 μg / ml of the rabbit muscle-type aldolas antibody described in Experiment 4 and allowed to stand overnight at 40 ° C. The solution was removed from the plate. The plate was washed with distilled water to prepare a 447,422 μl microtiter plate combined with the rabbit muscle-type aldolas antibody.
Exgeriment 9 Olösliggjord antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp.Exgeriment 9 Immobilized antibody to rabbit muscle type aldolas.
I var och en av de hål, som utförts i en polystyren-mikro- titer-platta satsades 200 /ul 0,05 M tris-saltsyrabuffert- lösning (pH 8,0) innehållande 25 /pg/nd. av den antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp, som beskrevs i experiment 5,-oëh fick stå över natt vid 4° C. Lösningen avlägsnades från plat- tan. Plattan tvättades med destillerat vatten för framställ- ning av en mikrotiter-platta förenad med antikroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp.In each of the holes made in a polystyrene microtiter plate, 200 .mu.l of 0.05 M Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) containing 25 .mu.g / nd was charged. of the rabbit muscle type aldolas antibody described in Experiment 5, -oëh was allowed to stand overnight at 4 ° C. The solution was removed from the plate. The plate was washed with distilled water to prepare a microtiter plate combined with the rabbit muscle type aldolas antibody.
Exgeriment 10 Olösliggjord antíkropp mot aldolas av kaninmuskeltyn.Exgeriment 10 Insolubilized antibody to aldola by rabbit muscle tone.
Med användning av den antikropp mot aldolas av kaninmuskel, som erhölls i experiment 6, erhölls en mikrotiter-platta förenad med antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp på samma sätt som beskrevs i det föregående experimentet 9.Using the rabbit muscle aldolas antibody obtained in Experiment 6, a microtiter plate was obtained with rabbit muscle type aldolas antibody in the same manner as described in the previous experiment 9.
Exempel 1 Alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av humanmuskeltyp.Example 1 Alkali phosphatase-labeled antibody to human muscle type aldolas.
I 0,3 ml vatten innehållande 1 mg alkalifosfatas (relativ aktivitet 1000 enheter/mg) sattes 0,2 ml 0,05 M fosforsyra- buffertlösning (pH 7,0) innehållande l mg av den antikropp mot aldolas av humanmuskeltyp, som beskrevs i experiment 3 och 50 ;ül'2,5-procentig glutaraldehydlösning. Blandningenz fick stå 30 minuter i rumstemperatur, varefter den utsattes för dialys med 0,05 M tris-saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) över natt. Man erhöll en alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av humanmuskeltyp. 447 422 12 Exempel 2 Alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av kaninmüskeltyp.In 0.3 ml of water containing 1 mg of alkali phosphatase (relative activity 1000 units / mg) was added 0.2 ml of 0.05 M phosphoric acid buffer solution (pH 7.0) containing 1 mg of the human muscle-type aldolas antibody described in experiments 3 and 50; ul'2.5% glutaraldehyde solution. The mixture was allowed to stand for 30 minutes at room temperature, after which it was dialyzed with 0.05 M Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) overnight. An alkali phosphatase-labeled antibody to human muscle aldolas was obtained. 447 422 12 Example 2 Alkali phosphatase-labeled antibody to rabbit muscle-type aldolas.
Samma förfarande som beskrevs i exempel l upprepades förutom att 1 mg antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp, som be- skrevs i experiment 4, användes med l mg alkalifosfatas.The same procedure as described in Example 1 was repeated except that 1 mg of rabbit muscle type aldolas antibody described in Experiment 4 was used with 1 mg of alkali phosphatase.
Alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av kanínmuskeltyp erhölls.Alkali phosphatase-labeled antibody to rabbit muscle-type aldolas was obtained.
Exempel 3 Alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp.Example 3 Alkali phosphatase-labeled antibody to rabbit muscle-type aldolas.
' Samma förfarande, som beskrevs i exempel 1, upprepades för- utom att den antikropp mot aldolas av kanínmuskeltYP, som beskrevs i experiment 5, användes med 1 mg alkalifosfatas.The same procedure as described in Example 1 was repeated except that the rabbit muscle type anti-aldola antibody described in Experiment 5 was used with 1 mg of alkali phosphatase.
Alkalifosfataszmärkt antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp“ erhölls: S Exempel 4 Alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp.Alkali phosphatase-labeled antibody to rabbit muscle-type aldolas was obtained: S Example 4 Alkali-phosphatase-labeled antibody to rabbit muscle-type aldolas.
Samma förfaranden som beskrevs i exempel 1 upprepades för4 utom att den antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp, som beskrevs i experiment 6, användes med l mg alkalifosfatas.The same procedures as described in Example 1 were repeated for 4 except that the rabbit muscle-type aldolas antibody described in Experiment 6 was used with 1 mg of alkali phosphatase.
Man erhöll sålunda alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av kaninmuskeltyp.Thus, alkali phosphatase-labeled antibody to rabbit muscle aldolas was obtained.
Exempel 5 Enzym-immunoanalxs En standard antigenlösning av 500 ng/ml - 7,6 mg/ml fram- ' ställdes genom spädning av aldolas av humanmuskeltyp i serie två gånger med normalt kaninserum inaktiverat vid 56° C un- der 2 timmar. Denna standardlösning (0,1 ml) sattes till en mikrotiter-platta förenad med antikropp mot aldolas av mus- 447 422 13 keityp och fick stå so minuter vid 37° c. Reakcionslösningen . avlägsnades. Plattan tvättades fyra gånger med destillerat vatten. Å andra sidan späddes alkalifosfatas-märkt anti- kropp mot aldolas av muskeltyp 150 gånger med 0,05 M tris- saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) innehållande 30 % normalt ka- ninserum inaktiverat vid 560 C 2 timmar. Denna spädda lös- ning (0,1 ml) sattes till plattan och fick stå 60 minuter vid 370 C. Reaktionslösningen avlägsnades. Plattan tvättades fyra gånger med destillerat vatten. En lösning av 5 mg/ml p-nitrofenyl-fosfat i 0,1 M natriumkarbonatbuffertlösning" (pH 9,0) innehållande 0,001 M magnesiumklorid bereddes se- parat. Denna lösning (0,1 ml) sattes till plattan och fick reagera vid 37° C under 60 minuter följt av tillsats av I 0,1 ml l N natriumhydroxid för att avsluta reaktionen. Reak- tionslösningen späddes tio gånger med destillerat vatten. Ab- sorbansen vid 405 m/i mättes med en spektrofotometer för uppritning av arbetskurvan mellan absorbansen och koncentra-0 tionen av aldolaset av humanmuskeltyp.Example 5 Enzyme Immunoassay A standard antigen solution of 500 ng / ml - 7.6 mg / ml was prepared by diluting human muscle type aldolas in series twice with normal rabbit serum inactivated at 56 ° C for 2 hours. This standard solution (0.1 ml) was added to a microtiter plate combined with antibody to mouse-type aldolas and allowed to stand for 37 minutes at 37 ° C. The reaction solution. was removed. The plate was washed four times with distilled water. On the other hand, alkali phosphatase-labeled antibody to muscle-type aldolas was diluted 150-fold with 0.05 M trisalic acid buffer solution (pH 8.0) containing 30% normal rabbit serum inactivated at 560 ° C for 2 hours. This dilute solution (0.1 ml) was added to the plate and allowed to stand for 60 minutes at 370 ° C. The reaction solution was removed. The plate was washed four times with distilled water. A solution of 5 mg / ml p-nitrophenyl phosphate in 0.1 M sodium carbonate buffer solution "(pH 9.0) containing 0.001 M magnesium chloride was prepared separately. This solution (0.1 ml) was added to the plate and reacted at 37 ° C. ° C for 60 minutes followed by the addition of 0.1 ml of 1 N sodium hydroxide to complete the reaction, the reaction solution was diluted ten times with distilled water and the absorbance at 405 m / l was measured with a spectrophotometer to plot the work curve between the absorbances. and the concentration of the human muscle-type aldolase.
'Fig. l visar arbetskurvan för ovan nämnda analyssystem, där mikrotiter-plattan förenad med antikroppen mot aldolas av humanmuskeltyp i experiment 7 användes som en mikrotiter- platta förenad med antikropp mot aldolas av muskeltyp, res- pektive det alkalifosfatas-märkta aldolasantigenet av human- muskeltyp i exempel l användes som ett alkalifosfatas-märkt aldolasantigen av muskeltyp.FIG. 1 shows the work curve for the above-mentioned assay system, where the microtiter plate associated with the human muscle type aldolas antibody in Experiment 7 was used as a microtiter plate associated with the muscle type aldolas antibody, respectively the human muscle type alkaline phosphatase-labeled aldolase antigen in Example l was used as an alkali phosphatase-labeled muscle-type aldolase antigen.
Fig. 2 visar arbetskurvan när mikrotiter-plattan förenad med antikroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp i experiment 8 an- vändes som en mikrotiter förenad med antikropp mot aldolas av muskeltyp, respektive den alkalifosfatas-märkta antikroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp i exempel 2 användes som en .= alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av muskeltyp.Fig. 2 shows the work curve when the microtiter plate associated with the rabbit muscle type aldolas antibody in Experiment 8 was used as a muscle type aldrotocyte antibody antibody, and the rabbit muscle type aldules antibody-labeled antibody in Example 2 was used as one. = alkali phosphatase-labeled antibody to muscle-type aldolas.
Fig. 3 visar arbetskurvan när mikrotiter-plattan förenad med antikroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp i experiment 9 användes som en mikrotiter-platta kombinerad med antíkropp 447 422 14 mot aldolas av muskeltyp, respektive den alkalifosfatas- märkta antikroppen mot aldolas av kaninmnskeltyp i exempel 3 användes som en alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av muskeltyp.Fig. 3 shows the work curve when the microtiter plate associated with the rabbit muscle type aldolas antibody in Experiment 9 was used as a microtiter plate combined with muscle type aldolas antibody, and the alkali phosphatase-labeled rabbit muscle type aldolas antibody in Example 3 was used. as an alkali phosphatase-labeled antibody to muscle-type aldolas.
Fig. 4 visar arbetskurvan när mikrotiter-plattan, förenad med antikroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp i experiment 10 användes som en mikrotiter-platta kombinerad med anti- kropp mot aldolas av muskeltyp respektive den alkalifosfatas- märkta antikroppen mot aldolas av kaninmuskeltyp i exempel 4 användes som en alkalifosfatas-märkt antikropp mot aldolas av muskeltyp.Fig. 4 shows the work curve when the microtiter plate, combined with the rabbit muscle type aldolas antibody in Experiment 10 was used as a microtiter plate combined with the muscle type aldolas antibody and the rabbit muscle type aldolas antibody labeled antibody in Example 4, respectively. an alkali phosphatase-labeled antibody to muscle-type aldolas.
I fig. l - 4 anger de horisontella axlarna koncentrationen (ng/ml) av aldolas av humanmuskeltyp, och de vertikala axlar- na anger absorbansen vid 405 mji (OD405 mfl).In Figures 1 to 4, the horizontal axes indicate the concentration (ng / ml) of human muscle-type aldolase, and the vertical axes indicate the absorbance at 405 microns (OD405 and others).
Såsom framgår av fig. l - 4 erhålles den mest gynnsamma ar- betskurvan med den olösliggjorda antikroppen och den enzym- märkta antikroppen när antikroppen mot aldolas av humanmus- keltyp (fig. l) användes i ordning följd av den olösliggjor- da antikroppen och den enzymmärkta antikroppen när antikrop- pen mot aldolas av kaninmuskeltyp (fig. 4, 3 och 2) användes.As shown in Figs. 1-4, the most favorable work curve with the insolubilized antibody and the enzyme-labeled antibody is obtained when the human muscle-type anti-aldol antibody (Fig. 1) is used in order of the insolubilized antibody and the enzyme-labeled antibody when the rabbit muscle-type aldolas antibody (Figs. 4, 3 and 2) was used.
Det framgår vid jämförelse av de fall, när antikropp mot al- dolas av kaninmuskeltyp användes att mer fördelaktiga arbets- kurvor erhålles i respektive fall (fig. 4), när bäraren, fö- renad med aldolas från nötboskapsmuskel användes samt det fall (fig. 3) när bäraren användes förenad med aldolas av humanmuskeltyp för reningen av antikroppen med affinitets- kromatografi än den kurva, som erhålles i det andra fallet (fig. ZL när en bärare, förenad med aldolas av kaninmuskel- e. .u typ användes.It appears from comparison of the cases when antibody to rabbit muscle type aldeoli is used that more advantageous work curves are obtained in the respective case (Fig. 4), when the carrier, combined with aldola from bovine muscle is used and that case (Fig. 4). 3) when the carrier was used in association with human muscle type aldolas for the purification of the antibody by affinity chromatography than the curve obtained in the second case (Fig. ZL when a carrier combined with rabbit muscle aldolas aldolas was used.
Exempel 6 Enzym-immunoanalys Effekterna från slaget av utspädningsmedel på de enzym-mârk- 447 422 15 ta antikropparna undersöktes med immunoanalyssystemet enligt exempel 5.Example 6 Enzyme Immunoassay The effects of the kind of diluent on the enzyme-labeled antibodies were examined with the immunoassay system of Example 5.
Den alkalifosfatas-märkta antikroppen mot aldolas av human- muskeltyp, som beskrevs i exempel l, användes som en enzym- märkt antikropp, och mikrotiter-plattan, förenad med den aldolas av humanmuskeltyp, som beskrevs i experiment 7, så- som olösliggjort antigen.The alkali phosphatase-labeled antibody to human muscle-type aldolas described in Example 1 was used as an enzyme-labeled antibody, and the microtiter plate, combined with the human muscle-type aldola described in Experiment 7, as an insolubilized antigen.
Följande utspädningsmedel användes i detta exempel: (A) 0,05 M tris-saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) innehållande 30 % koncentration av det normala kaninserumet inaktive- rat vid 56° C under 2 timmar.The following diluents were used in this example: (A) 0.05 M tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) containing 30% concentration of the normal rabbit serum inactivated at 56 ° C for 2 hours.
(B) 0,05 M tris-saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) innehållande 1 % koncentration av albumin frân nötboskap inaktiverat vid se° c under ao minuter.(B) 0.05 M tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) containing 1% concentration of bovine albumin inactivated at se ° c for ao minutes.
(C) 0,05 M tris-saltsyrabuffertlösning (pH 8,0) som kontroll.(C) 0.05 M Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) as a control.
De enzymmärkta antikropparna användes utspädda 150 gånger med var och en av dessa utspädningsmedel. Arbetskurvan uppfördes på samma sätt som i exempel 5 med användning av standardanti- genlösningen. Varje erhâllen arbetskurva visas i fig. 4. Den horisontella axeln i fig. 4 anger koncentrationen av°aldolas av humanmuskeltyp (ng/ml), och den vertikala axeln anger ab- sorbansen vid 405 m/u (OD405 m ). Symbolerna A, B och C an- ger de respektive arbetskurvor a, erhållna i varje fall när utspädningsmedlen (A), (B) respektive (C) användes. Det fram- går på ritningen att den mest gynnsamma arbetskurvan är ar- betskurvan A, som erhålles när utspädningsmedlet innehåller* det inaktiverade kaninserumet. 447 422 Exemgel 7 Enzym-immunoanalvs Analys utfördes för koncentrationerna av aldolas av human- muskeltyp i serumen från olika cancerpatienter från godar- tat sjuka patienter och från friska människor med det immuno- analyssystem, som beskrevs i exempel S.The enzyme-labeled antibodies were used diluted 150-fold with each of these diluents. The work curve was constructed in the same manner as in Example 5 using the standard antigen solution. Each work curve obtained is shown in Fig. 4. The horizontal axis in Fig. 4 indicates the concentration of ° aldolas of the human muscle type (ng / ml), and the vertical axis indicates the absorbance at 405 m / h (OD405 m). The symbols A, B and C indicate the respective working curves a, obtained in each case when the diluents (A), (B) and (C) are used. The drawing shows that the most favorable work curve is work curve A, which is obtained when the diluent contains * the inactivated rabbit serum. 447 422 Example Gel 7 Enzyme Immunoassay Analysis was performed for the concentrations of human muscle type aldolas in the serum of various cancer patients from benign patients and from healthy people with the immunoassay system described in Example S.
Den enzym-märkta antikropp, som användes i detta exempel, var den alkalifosfatas-märkta antikroppen mot aldolas av' _- humanmuskeltyp, som beskrevs i exempel 1, och den använda olösliggjorda antikroppen var mikrotiter-plattan förenad med den aldolas av humanmuskeltyp, som beskrevs i experi- ment 7. Serumprovet användes direkt utan spädning.The enzyme-labeled antibody used in this example was the alkali phosphatase-labeled antibody to human muscle aldolas described in Example 1, and the insolubilized antibody used was the microtiter plate associated with the human muscle aldolas described. in experiment 7. The serum sample was used directly without dilution.
'Resultaten visas i fig. 6. Såsom framgår av kurvorna tende- rar aldolasen av humanmuskeltyp att föreligga i serumet från cancerpatienter i en högre koncentration än i serumen från de andra godartat sjuka patienterna och från de friska människorna.The results are shown in Fig. 6. As the curves show, the human muscle-type aldolase tends to be present in the serum of cancer patients at a higher concentration than in the serum of the other benign patients and of the healthy people.
Claims (8)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12204779A JPS5648894A (en) | 1979-09-25 | 1979-09-25 | Reagent for measuring human muscular aldolase and its determination |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE8006667L SE8006667L (en) | 1981-03-26 |
| SE447422B true SE447422B (en) | 1986-11-10 |
Family
ID=14826285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE8006667A SE447422B (en) | 1979-09-25 | 1980-09-24 | REAGENTS AND SETS FOR DETERMINING ALDOLAS OF THE TYPE THAT ARE IN THE HUMAN MUSCLES |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5648894A (en) |
| BE (1) | BE885376A (en) |
| CA (1) | CA1158549A (en) |
| CH (1) | CH648596A5 (en) |
| DE (1) | DE3036184A1 (en) |
| FR (1) | FR2466020A1 (en) |
| GB (1) | GB2062226B (en) |
| IT (1) | IT1141082B (en) |
| NL (1) | NL8005330A (en) |
| SE (1) | SE447422B (en) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56125667A (en) * | 1980-03-07 | 1981-10-02 | Eisai Co Ltd | Reagent for measurement and measuring method for human muscle type aldolase |
| JPS57208459A (en) * | 1981-06-19 | 1982-12-21 | Eisai Co Ltd | Measuring method using enzyme-labelled antibody and reagent |
| DE3145936A1 (en) * | 1981-11-20 | 1983-06-01 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Method for the enzyme immunological determination of lipase |
| JP6754116B2 (en) * | 2016-04-26 | 2020-09-09 | 学校法人近畿大学 | Colorectal cancer marker |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2128670B2 (en) * | 1971-06-09 | 1977-06-30 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | IMMUNOLOGICAL ISOENZYME DETERMINATION METHOD |
| JPS54147097A (en) * | 1978-05-11 | 1979-11-16 | Eisai Co Ltd | Reagent for detecting muscleetype aldolase |
-
1979
- 1979-09-25 JP JP12204779A patent/JPS5648894A/en active Pending
-
1980
- 1980-09-23 CH CH7209/80A patent/CH648596A5/en not_active IP Right Cessation
- 1980-09-24 SE SE8006667A patent/SE447422B/en not_active IP Right Cessation
- 1980-09-24 NL NL8005330A patent/NL8005330A/en not_active Application Discontinuation
- 1980-09-24 IT IT24877/80A patent/IT1141082B/en active
- 1980-09-24 GB GB8030730A patent/GB2062226B/en not_active Expired
- 1980-09-24 FR FR8020472A patent/FR2466020A1/en active Granted
- 1980-09-24 BE BE0/202218A patent/BE885376A/en not_active IP Right Cessation
- 1980-09-24 CA CA000360973A patent/CA1158549A/en not_active Expired
- 1980-09-25 DE DE19803036184 patent/DE3036184A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BE885376A (en) | 1981-03-24 |
| NL8005330A (en) | 1981-03-27 |
| GB2062226A (en) | 1981-05-20 |
| CH648596A5 (en) | 1985-03-29 |
| IT1141082B (en) | 1986-10-01 |
| IT8024877A0 (en) | 1980-09-24 |
| SE8006667L (en) | 1981-03-26 |
| CA1158549A (en) | 1983-12-13 |
| GB2062226B (en) | 1983-11-30 |
| JPS5648894A (en) | 1981-05-02 |
| FR2466020B1 (en) | 1983-07-08 |
| FR2466020A1 (en) | 1981-03-27 |
| DE3036184A1 (en) | 1981-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0527212B1 (en) | Analyte determination in biological fluids in the presence of interfering substances | |
| US4526871A (en) | Conjugate obtained by coupling a lectin and a specific ligand, containing such a conjugate and its applications in biology | |
| US5932480A (en) | Measurement method and kit for hemoglobin A1c | |
| US4366242A (en) | Method and agent for the immunological determination of enzymes | |
| EP0311492B1 (en) | Kit and immunoassay method applicable to whole cells | |
| CA1177750A (en) | Quantitative determination of adenosine | |
| Lindstedt et al. | Analytical and clinical evaluation of a radioimmunoassay for gastrin. | |
| US4729961A (en) | Process for the detection and assay by erythroadsorption | |
| JPWO1999050663A6 (en) | Testing methods for IgA nephropathy | |
| SE447422B (en) | REAGENTS AND SETS FOR DETERMINING ALDOLAS OF THE TYPE THAT ARE IN THE HUMAN MUSCLES | |
| EP0106615B1 (en) | Assay for the free portion of substances in biological fluids | |
| EP0226903B1 (en) | Immunoassay for antibodies to htlv-iii | |
| US6767709B1 (en) | Immunoassay of human medullasin and diagnosis of multiple sclerosis using the same | |
| EP0166224B1 (en) | Process for assaying atl virus antibody and reagent therefore | |
| US5856113A (en) | Antigen and method for measuring anti-erythrocyte antibody | |
| EP0398292B1 (en) | Diagnostic composition for rheumatoid arthritis | |
| EP0662611A2 (en) | Method for assaying glycoconjugates and reagent thereof | |
| AU619808B2 (en) | Agent, for immunochemical assays, containing amine oxides | |
| JP2508915B2 (en) | Anti-SSA / Ro and SSB / La antibody measuring antigen, method for producing the same, and anti-SSA / Ro and SSB / La antibody measuring method | |
| EP0100395B1 (en) | Reagent for determination of human urine kallikrein | |
| EP0085402B1 (en) | Method of determination of human urine kallikrein and kit for the same | |
| RU2021815C1 (en) | Method for diagnosing aleutian disease of minks | |
| EP0089367A1 (en) | Monoclonal antibody detection system | |
| JPH03134567A (en) | Carrier for bonding anti-phospholipid antibody, innumoassay using same and kit thereof | |
| JPH1123578A (en) | Measuring method for aldolase isozyme and standard solution for measuring alsolase isozyme |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 8006667-3 Effective date: 19880125 Format of ref document f/p: F |