DE69025414T2

DE69025414T2 - Vakzin-Zusammensetzung

Info

Publication number: DE69025414T2
Application number: DE69025414T
Authority: DE
Inventors: Vernon Morrison Bowles; Malcolm Roy Brandon; Mark Douglas Gorrell; Elsa Nicole Theresia Meeusen; John Walker
Original assignee: University of Melbourne; Meat Research Corp
Current assignee: University of Melbourne; Meat Research Corp
Priority date: 1989-02-01
Filing date: 1990-01-30
Publication date: 1996-07-11
Anticipated expiration: 2010-01-31
Also published as: CA2008808A1; AP9000165A0; AU640364B2; EP0381427A2; NO178893C; AU4903590A; NO900442L; EP0381427A3; ATE134386T1; CN1046188A; ES2085888T3; IL93234A; AP144A; DK0381427T3; BR9000451A; DE69025414D1; NO900442D0; NO178893B; GR3019065T3; NZ232279A

Description

Die vorliegende Erfindung betifft Antikörpersonden und die Verwendung derartiger Sonden bei einem Verfahren zum Nachweis und zur Reinigung einer Anzahl von schützenden und diagnostischen Antigenen, die Herstellung davon sowie ihre Verwendung zur Bildung von Impfstoffen.
Es sind in der Vergangenheit beträchtliche Anstrengungen unternommen worden, um Impfstoffe zur Kontrolle von parasitischen, bakteriellen und anderen Infektionen von Tieren einschließlich Herdentieren zu entwickeln. Es wurden jedoch in den letzten 5 Jahren nur geringe Fortschritte gemacht, obwohl die damit verbundene Technologie zur Erzeugung von fremden Produkten in großen Mengen in eukaryontischen und prokaryontischen Organismen enorme Fortschritte gemacht hat. Die Identifizierung von Schutzantigenen bei wichtigen pathogenen Infektionen von Tieren ist jedoch beispielsweise der Haupthemmstein für die Entwicklung von Impfstoffen geblieben.
Ein Hauptgrund dafür ist die enorme Komplexität von beispielsweise parasitischen Organismen, die bis zu 10 % der genetischen Information eines Säugetiers besitzen können, und die als Folge davon in der Lage sind, eine ungeheuere Menge an Produkten zu verschiedenen Stadien ihres Lebenszyklus zu bilden, von denen nur wenige von Bedeutung sein können zur Entwicklung eines wirksamen Impfstoffs. In den meisten Fällen ist der Forscher mit hunderten von potentiellen Antigenen konfrontiert. Das zentrale verbleibende Problem besteht darin, welches die Parasiten-Antigene sind, die eine den Wirt schützende Immunanwort hervorrufen. Das Klonen eines Parasiten-Antigens, das auf der Grundlage von Hoffnung oder Inspiration ausgewählt worden ist, mit beträchtlichen Schwierigkeiten und Aufwand an Geld und Zeit kann theoretisch zur Entwicklung eines wirksamen Impfstoffs führen. In den meisten Fällen ist dieser Versuch jedoch fehlgeschlagen.
Nach dem Stand der Technik auf dem Gebiet von Parasiteninfektionen wurde die Betonung gelegt auf das Absuchen (screening) von rohen Parasiten-Antigengemischen, Parasiten cDNA oder Gen-Banken bzw. -Bibliotheken mit ganzen Serum- Antikörpern, die als "Sonden" verwendet wurden. Serum enthält eine große Anzahl von Antikörpern gegen andere Pathogene und Antigene. Außerdem sind die meisten Antikörper gegen den Parasiten gegen nicht-schützende Antigene gerichtet.
Es wurden sehr geringe Anstrengungen unternommen, um die Antikörpersonden zu verbessern, die zum Absuchen von rohen Parasiten-Antigengemischen oder Parasiten-cDNA-Bibliotheken unternommen wurden, obwohl dies entscheidend ist für den Nachweis von Schutz-Antigenen und die Überwachung von Schutz- Epitopen dieser Antigene während ihres anschließenden molekularen Klonens.
Z.B. ist Haemonchus contortus ein Darmparasit von Schafen, der im Labmagen (vierter Magen) lokalisiert ist. Die späten Larven- und Erwachsenenstadien des Parasiten leben von Vollblut. Der Parasit ist verantwortlich für einen beträchtlichen wirtschaftlichen Verlust der Schafindustrie in Australien und beträchtliche Verluste in Übersee, da es sich um eine potentiell tödliche Krankheit handelt. Trotz dieser Verluste ist bisher kein erfolgreicher Impfstoff gegen diesen Parasiten entwickelt worden.
Lymphknotenverkäsung (abgekürzt CLA, auch als Cheesy Gland bezeichnet) ist eine chronische Infektion von Schafen und Ziegen, die hervorgerufen wird durch das Bakterium Corynebacterium pseudotuberculosis (Syn. C. ovis). Es ist ein komplexer, zellfreier Impfstoff für CLA bekannt (GLANVAC, Commonwealth Serum Laboratories) und er wird zur Zeit entweder allein oder als Teil eines 6-Komponenten antibakteriellen Impfstoffs (6 in 1) verabreicht. Der durch diesen Impfstoff hervorgerufene Schutz wird der inaktivierten Toxin (d.h. Toxoid)-Komponente zugeschrieben. Das Toxin besitzt ein relatives Molekulargewicht von etwa 31 k Dalton, wenn es unter reduzierenden Bedingungen auf 12,5 % SDS/PAGE läuft. Während dieser bekannte Impfstoff eine gewisse Schutzwirkung hervorruft, ist der Impfstoff komplex und teuer und es kann noch eine nennenswerte Anzahl von Infektionen auftreten.
Fasciola hepatica (Leberegel) ist eine Parasiteninfektion, die sich in der Leber und in Gallengängen bei Schafen und Rindern entwickelt. Leberegel können zu chronischen und akuten Verlusten in der Schaf- und Rinderindustrie führen. Es sind zahlreiche prophylaktische und therapeutische Behandlungen bekannt, aber ihre Wirkung hat sich als begrenzt erwiesen, und Leberegel bleiben eine chronische Veterinärerkrankung.
Taenia hydatigena ist eine Parasiteninfektion, die sich in der Leber von Schafen entwickelt. Sie wird von Tier zu Tier durch infizierte Hunde übertragen und kann zu Verlusten in der Schafindustrie führen. Gegen diesen Parasiten ist kein wirksamer Impfstoff entwickelt worden.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine oder mehrere der mit dem Stand der Technik verbundenen Schwierigkeiten zu überwinden oder zumindest zu verringern.
Folglich liefert die vorliegende Erfindung nach einem Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von mindestens einem Antikörper gegen einen Krankheitserreger, wobei dieses Verfahren darin besteht, die folgenden Verfahrensschritte zu kombinieren:
(a) Bereitstellen einer biologischen Probe, welche antikörperproduzierende Zellen eines immunen Tieres enthält, welches mit einem Erreger oder Erregerextrakt infiziert oder angegriffen ist, wobei die biologische Probe innerhalb einer geeigneten Periode aus einem Infektionsherd oder einem Bereich einer Läsion, oder einem Bereich nahe an dem Infektionsherd oder der Läsion oder einem diesen dränierenden Bereich entnommen wurde;
(b) Isolieren der antikörperproduzierenden Zellen aus der biologischen Probe;
(c) Kultivieren der antikörperproduzierenden Zellen aus der biologischen Probe in vitro in einem geeigneten Kulturmedium; und
(d) Ernten des durch die antikörperproduzierenden Zellen produzierten Antikörpers.
Die Erfindung betrifft auch einen Antikörper, der nach einem solchen Verfahren hergestellt worden ist, und eine Antikörpersonde, umfassend mindestens einen solchen Antikörper gegen ein Krankheitspathogen.
Das Tier, von dem die biologische Probe entnommen ist, kann von irgendeiner geeigneten Art sein und die biologische Probe wird vorteilhafterweise innerhalb einer Periode entnommen, in welcher der Erreger empfindlich ist gegen eine Immunattacke nachdem das Tier durch den Erreger oder Erregerextrakt infiziert worden ist. Das Tier kann ein Säugetier einschließlich Menschen sein. Das Tier kann ein Haustier wie ein Schaf oder ein Rind sein.
In der folgenden Beschreibung wird Bezug genommen auf ein Verfahren zum Identifizieren von parasitischen und bakteriellen Immunogenen, die bei Krankheiten von Schafen und Rindern von Bedeutung sind, insbesondere den Parasiteninfektionen Taenia hydatigena (Zestode), Haemonchus contortus (Nematode) Fasciola hepatica (Trematode) und das bakterielle Pathogen Corynebacterium pseudotuberculosis. Es ist jedoch zu verstehen, daß solche Immunogene und Pathogene nur erläuternd sind und das Verfahren allgemein anwendbar ist auf Tiere einschließlich Menschen. Insbesondere kann das hier angegebene Verfahren angewandt werden, um das Immunogen bei Autoimmunerkrankungen nachzuweisen.
Die biologische Tierprobe kann von beliebiger Art sein. Die biologische Probe kann von tierischem Gewebe, Organen, Blut, Lymphen oder Lymphknoten stammen. Die biologische Probe kann von irgendeinem Bereich des infizierten Tieres entnommen werden. Es ist jedoch bevorzugt, daß die Proben aus einem Infektionsherd oder einem Bereich einer Läsion entnommen werden, die bei bestimmten Krankheiten gebildet werden oder einem Bereich nahe dem Infektionsherd oder der Läsion, wie in Lymphknoten.
Serum/Plasma-Proben sind jedoch nicht bevorzugt als biologische Proben nach diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung. Es hat sich gezeigt, daß der Hauptteil der in einer Serum/Plasma-Probe gefundenen Antikörper irrelevant ist für den Schutz oder eine spezielle Diagnose eines Pathogens oder daß sie mit dem Pathogen nicht verwandt sind. Außerdem können andere Serum/Plasma-Bestandteile die spezifischen Reaktionen zwischen Pathogen-Komponenten und Antikörpern dazu stören.
Im Gegensatz dazu sind die erfindungsgemäßen Sonden hoch angereichert an pathogenspezifischen Antikörpern und können so ausgewählt werden, daß sie beschränkt sind auf den pathogenen Zustand von besonderer Bedeutung für eine Schutzimmunität.
Es ist bevorzugt, daß die biologischen Proben von den Tieren zu einem vorbestimmten Zeitpunkt bei der Entwicklung einer Krankheit entnommen werden. Allgemein hat es sich bei parasitischen Infektionen gezeigt, daß die biologischen Proben kurze Zeit nach der Infektion mit einem Pathogen oder nach der Injektion von aus einem Pathogen erhaltenen Produkten entnommen werden sollten. Es wird postuliert, daß ein Parasit nur kurze Zeit nach dem Eintritt in den Wirt empfindlich ist und anschließend seine Struktur verändert, und nicht mehr empfindlich ist gegen eine Immunattacke und nicht mehr Schutzantikörper hervorrufen kann.
Die aus der biologischen Probe isolierten Zellen können B- Zellen umfassen. Die Zellen können ähnlich zu einem Zeitpunkt isoliert werden, an dem bekannt ist, daß er eine Sekretions- und/oder antikörperproduzierende Periode umfaßt. Wahlweise können die Zellen Gedächtniszellen umfassen, die zu einem späteren Zeitpunkt bei bestimmten Krankheiten gebildet werden.
So werden die Zellen vorzugsweise kurze Zeit nach der in vivo Stimulation, vorzugsweise innerhalb von etwa 2 bis 13 Tagen mit beispielsweise dem relevanten Parasitenstadium entnommen, was zu einer in vivo Induktion der antikörpererzeugenden Zellen führt, die spezifische Antikörper in das Kulturmedium abgeben nach der in vitro Inkubation. Keine oder nur wenige Antikörper können in das Kulturmedium abgeschieden werden, ohne vorherige in vivo Stimulierung von ruhenden Lymphozyten.
Die in vitro Sekretion von Antikörpern in das Kulturmedium durch vor kurzem aktivierte B-Zellen kann verstärkt werden durch den Zusatz von Hilfsfaktoren zu den Kulturen. Die Hilfsfaktoren können Cytokine sein, die allein oder in Kombination verwendet werden, umfassend Interleukin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8, koloniestimulierende Faktoren, Interferone und andere Faktoren, von denen gezeigt werden konnte, daß sie eine verstärkende Wirkung auf die spezifische B-Zellensekretion besitzen.
Das Verfahren zur Erzeugung eines Antikörpers nach diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann eine weitere Stufe der Aktivierung der isolierten Zellen umfassen, um Antikörper zu vermehren und auszuscheiden und/oder freizusetzen.
Die Zell-Aktivierungsstufe kann die Zugabe eines zellaktivierenden Mittels zu dem Kulturmedium umfassen. Das zellaktivierende Mittel kann von Parasiten abgeleitet sein oder kann ausgewählt sein aus Mitogenen und Hilfsfaktoren, die gebildet worden sind von Leukozyten oder synthetischen Äquivalenten oder Kombinationen davon.
Die Mitogene können ausgewählt sein aus Produkten die abgeleitet sind von Kermesbeere (Phytolacca americana) auch bekannt als Kermesbeerenmitogen (PWM), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyadenyl/Polyruidylsäure (Poly(A-U)), gereinigtem Protein-Derivat (PPD), Polyinosin/Polycytidilinsäure (Poly(I-C)), Lipopolysaccharid (LPS), Stphylococcen- Organismen oder Produkten davon, Bacto-streptolysin-O-Reagens (SLO), Staphylococcenphagenlysat (SPL), Epstein-Barr-Virus (EBV), wasserlöslichem Nocardiamitogen (NWEM), Phyothämagglutinin (PHA), Concanavalin A (Con A) und Dextran-sulfat und Gemischen davon. Das Zellproliferationsmittel kann irgend ein Mittel sein, das direkt oder indirekt zu einer B-Zellenproliferation und/oder Antikörpersekretion führt, wie Festphasen-Anti-Immunoglobulin. Die Hilfsfaktoren können Cytokine sein, einschließlich Interleukin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8, koloniestimulierende Faktoren, Interferone und sonstige Hilfsfaktoren, von denen gezeigt werden kann, daß sie, wenn sie allein oder in Kombination mit anderen Faktoren und Mitteln zugesetzt werden, eine verstärkende Wirkung auf die spezifische B-Zellenproliferation und/oder Antikörpersekretion ausüben. Das ist in keinem Falle als eine erschöpfende Liste von Mitogenen und zellantreibenden Mitteln einschließlich Hilfsfaktoren zu versehen.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung in einem zweiten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines einem Krankheitserreger zugeordneten Antigens, wobei dieses Verfahren umfaßt:
(a) Bereitstellen einer Probe eines von einem kranken Tier, in einem Entwicklungsstadium entnommenen Erregers, in welchem man annimmt, daß er am empfindlichsten auf einen Angriff ist;
(b) Bereitstellen einer Antikörpersonde gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung;
(c) Untersuchen der Antigenprobe mit der Antikörpersonde, um wenigstens ein vom Antikörper erkanntes Antigen festzustellen; und
(d) Isolieren des festgestellten Antigens.
Gemäß einem dritten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines schützenden Antigens, welches einem Tier einen Schutz gegen einen Krankheitserreger verleiht, wobei dieses Verfahren die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:
(a) Bereitstellen einer Probe des Pathogens bzw. Erregers;
(b) Bereitstellen einer Antikörpersonde gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung, welche wenigstens einen Antikörper gegen ein diesem Erreger zugeordnetes Antigen enthält;
(c) Untersuchen der Erregerprobe mit der Antikörpersonde, um wenigstens ein schützendes Antigen festzustellen; und
(d) Isolieren des Antigens, welches einem Tier Schutz gegen den Erreger bietet.
Das Krankheitspathogen kann von irgendeiner geeigneten Art sein. Das Krankheitspathogen kann abgeleitet sein, von Viren, Chalmydien (Manteltieren), Ricketesien, Mycoplasmen, Bakterien, Spirocheten, Pilzen, Protozon, Helminthen bzw. Würmern (Trematoden, Nematoden, Zestoden) und ecotoparasitischen Arthorpoden (z.B. Zecken, Milben, Schmeißfliegen) oder kann ein Autoantigen oder Tumorantigen sein.
Das Krankheitspathogen ist vorzugsweise ein Parasit, Parasitenextrakt oder Parasitenteil davon. Das Krankheitspathogen kann ausgewählt sein aus Haemonchus contortus und Darmparasiten von Schafen, Fasciola hepatica (Leberegeln), einer Leberinfektion, die sich in der Leber und den Gallengängen von Schafen und Rindern entwickelt, oder Taenia hydatigena, einer Parasiteninfektion, die sich ebenfalls in der Leber von Schafen entwickelt. Andere Parasiten umfassen Lucilia cuprina, Trichostrongylus spp, Boophilus spp, Ostertagia spp, Schistosome spp, Taenia spp und Echinococcus spp. Die Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt und die folgende Beschreibung wird nur erläutert durch Bezug auf diese Parasiten.
Gemäß einem alternativen Aspekt, kann die Patogenprobe von einem Bakterium entnommen sein. Z.B. kann das Bakterium Corynebacterium pseudotuberculosis verwendet werden.
Die Krankheitspathogenprobe wird zu einem Entwicklungsstadium des Pathogens entnommen, während dem angenommen wird, daß es am empfindlichsten ist gegen eine Immunattacke. Z.B. kann es bei einer parasitischen Zestodeninfektion günstig sein, die Probe von dem onkosphären Stadium zu entnehmen. Es hat sich gezeigt, daß in dem onkosphären Stadium der Parasiteninfektion vorhandene Antigene, z.B. in dem Metazestodenstadium nicht vorhanden sind. Bei einer parasitischen Wurminfektion kann es günstig sein, die Probe von der Larve, vorzugsweise im späten Larvenstadium, zu entnehmen. Bei einer parasitischen Egelinfektion kann es günstig sein, die Probe von dem juvenilen Egelstadium zu entnehmen.
Die Probe des Krankheitspathogens kann mit einer Standardpufferlösung vermischt und auf einen Standardträger, wie ein SDS/Polyacrylamid-Gel aufgebracht werden, um die darin enthaltenen Proteine zu trennen. Die abgetrennten Proteine können dann auf Nitrocellulose, Nylon oder andere Bahnmaterialien überführt werden.
Die Sondenuntersuchung mit einem geeigneten Antikörper kann ferner umfassen, daß das gebildete Produkt dabei einem Nachweisassay unterworfen wird. Das Nachweisassay kann Wester-Blotting-Verfahren umfassen, das Nachweisassay kann ein Immunopräzipitationsassay, ein Radioimmunoassay, enzymgebundenes Immunoassay oder ein Immunofluoreszenzassay sein.
Mindestens ein wie oben beschrieben erzeugter Antikörper kann einfach in Form des Uberstands der von dem Kulturmedium geerntet wird, verwendet werden. Wahlweise können die Antikörper abgetrennt und gereinigt werden.
Das wie oben beschrieben lokalisierte Antigen kann nachgewiesen werden unter Anwendung irgendeiner geeigneten Assaytechnik.
Nach einem weiteren bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der in dem Kulturmedium enthaltene Antikörper verwendet werden zur Affinitätsreinigung vorzugsweise zur Immunoaffinitätsreinigung von Antigen.
Folglich liefert die Erfindung nach einem bevorzugten Aspekt ein Verfahren zum Reinigen bzw. Läutern eines Antigens, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Bereitstellen einer rohen Antigen-Mischung,
(b) Bereitstellen eines Antikörpers gegen einen Krankheitserreger, wobei der Antikörper auf einem geeigneten Träger immobilisiert ist und gebildet worden ist, nach einem Verfahren nach dem ersten Aspekt der Erfindung,
(c) Aussetzen des rohen Antigengemisches einer Affinitäts-Chromatographie unter Anwendung des immobilisierten Antikörpers und
(d) Isolieren des gereinigten Antigens des Erregers, das von dem immobilisierten Antikörper erkannt worden ist.
Antikörper können nach üblichen Verfahren aus der Überstandssonde der Kultur gewonnen werden. Z.B. können Verfahren, die üblicherweise zur Reinigung von Immunoglobulinen aus Serum oder Plasma angewandt werden z.B. Ausfällung mit Ammoniumsulfat, Fraktionierung mit Caprylsäure, Ionenaustausch-Chromatographie oder Bindung und Elution von immobilisierten Protein G oder Protein A, angewandt werden. So erhaltene Antikörper können mit geeigneten Trägern gekuppelt werden z.B. CNBr-aktivierter Sepharose 48 (Pharmacia), Affi-gel (Bio-RAD) oder anderen Trägern zur Affinitäts-Chromatographie, die in der Lage sind, Proteine zu binden ("Sepharose" ist ein Warenzeichen).
Immobilisierte Antikörper können dann angewandt werden zur Fraktionierung und Reinigung von spezifischen Antigenen aus einem komplexen Parasitenextrakt durch Affinitäts-Chromatographie. Nachdem das Antigen an den immobilisierten Antikörper gebunden ist, können nicht gebundene makromolekulare Arten von dem festen Träger ausgewaschen werden mit beispielsweise Puffern, enthaltend 1,5 M NaCl. Anschließend kann das Antigen von der Affinitätssäule eluiert werden, z.B. durch Puffer mit niedrigem oder hohem pH-Wert oder Puffer, enthaltend chaotrope Ionen, z.B. 0,5 bis 3,0 M Natriumthiocyanat.
Die Anwendung der Antikörpersonde auf die Affinitäts- Chromatographie ermöglicht es, ausreichende Mengen an spezifischen Antigenen schnell von einem komplexen rohen Extraktionsgemisch zur biochemischen Charakterisierung, Aminosäuresequenzbestimmung und Impfung von Tieren, mit begrenzten Schutzuntersuchungen zu isolieren. Die Anwendung der Affinitäts-Chromatographie, um Antigene zu erhalten, vermeidet die Schwierigkeiten, die häufig auftreten, wenn übliche biochemische Verfahren angewandt werden zur Reinigung eines Antigens, von dem wenig oder keine Daten bekannt sind. Es vermeidet auch die Notwendigkeit, polyklonale oder monoklonale Antikörper zu bilden zum Zweck einer "analytischen" Affinitäts-Chromatographie. Herstellungen im großen Maßstab können jedoch die Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern erfordern.
Die isolierten oder lokalisierten Antigene können zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern verwendet werden. Die monoklonalen Antikörper können die Basis für eine passive Behandlung der oben erwähnten Krankheit bilden. Nachdem die Antigene identifiziert worden sind, können molekularbiologische oder chemische Verfahren, z.B. Klonungsverfahren angewandt werden, um unbegrenzte Mengen dieses Antigens zu erhalten, oder wahlweise können synthetische Polypeptide, entsprechend unterschiedlichen Fragmenten der identifizierten Antigene, als Mittel zur Bildung eines Impfstoffs verwendet werden.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung in einem bevorzugten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines synthetischen antigenen Polypeptids, das einem Tier Schutz gibt gegen ein Krankheitspathogen, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Herstellen einer cDNA-Bibliothek, oder einer genomen Bibliothek, welche von einer Probe eines Krankheitsrerregers abgeleitet worden ist;
(b) Bereitstellen einer Antikörpersonde nach dem ersten Aspekt der Erfindung;
(c) Erzeugen synthetischer Polypeptide von der cDNA- Bibliothek oder genomen Bibliothek;
(d) Untersuchen der synthetischen Polypeptide mit der Antikörpersonde; und
(e) Isolieren des synthetischen antigenen Polypeptids, welches dadurch festgestellt wird.
Es können entweder cDNA- oder genome Bibliotheken verwendet werden. Die cDNA- oder genomen Bibliotheken können zu geeigneten Expressions-Vektoren angeordnet werden, die die Transkription und anschließende Expression der geklonten DNA entweder in prokaryontischen Wirten (z.B. Bakterien) oder eukaryontischen Wirten (z.B. Säugetierzellen) ermöglichen. Die Sonden können vorzugsweise ausgewählt werden aus
(i) synthetischen Oligonucleotid-Sonden auf der Basis der Aminosäure-Sequenz des wie oben beschrieben identifizierten und gereinigten Antigens,
(ii) Antikörpern, die erhalten worden sind, aus dem wie oben beschrieben gebildeten Kulturmedium,
(iii) monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, die gegen die wie oben beschrieben identifizierten und gereinigten Antigene gebildet worden sind,
(iv) rekombinierten oder synthetischen monoklonalen Antikörpern oder Polypeptiden mit Spezifität gegen das Antigen z.B. wie beschrieben von Ward et al. 1989, Nature 241, S. 544 - 546.
Die Schutzantigene können wie unten diskutiert als diagnostische Antigene wirken.
Folglich liefert die Erfindung nach einem bevorzugten Aspekt ein Schutzantigen gegen Taenia hydatigena-Infektionen ausgewählt aus Antigenen, mit ungefähren Molekulargewichten von 25 und 34 Kilodalton, wie später beschrieben. Ein Kreuzschutz zwischen verschiedenen Zestoden ist dokumentiert, wobei ähnliche Antigene auch in anderen Zestodenspezies nachgewiesen werden können, z.B. T. saginata, T. ovis, T. solium, Echinococcus granulosus.
Nach einem weiteren bevorzugten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Schutzantigen gegen Haemonchus contortus-Infektionen mit einem ungefähren Molekulargewicht von 67 bis 75 Kilodalton, wie später erläutert.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt liefert die Erfindung ein Schutzantigen gegen Fasciola hepatica-Infektionen mit einem ungefähren Molekulargewicht von 120 bis 125 Kilodalton wie unten beschrieben.
Gemäß noch einem weiteren bevorzugten Aspekt liefert die Erfindung ein Schutzantigen gegen Corynebacetium pseudotuberculosis-Infektionen mit einem ungefähren Molekulargewicht von 38 bis 40 Kilodalton, wie unten beschrieben. Dieses Antigen ist ein Proteinantigen.
Folglich ist gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren vorgesehen zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers gegen ein Antigen eines Krankheitspathogens, wobei das Verfahren umfaßt
(a) Bereitstellen einer B-Zelle, welche Antikörper gegen das Antigen produzieren kann, und erhalten von einem Tier, das mit einem schützenden Antigen gegen den Krankheitserreger, hergestellt nach dem Verfahren des dritten Aspekts der Erfindung, immunisiert ist, und einer Myelomzelle;
(b) Verschmelzen der B-Zelle mit der Myelomzelle;
(c) Vermehren des dadurch gebildeten Hybridoms und
(d) Ernten der durch dieses Hybridom erzeugten Antikörpers.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner einen Impfstoff oder eine veterinäre Zubereitung, umfassend eine prophylaktisch wirksame Menge mindestens eines Schutzantigens, hergestellt nach dem dritten Aspekt der Erfindung, gegen Krankheitspathogene, ausgewählt aus Taenia hydatigena, Haemonchus contortus, Fasciola hepatica und Corynebacterium pseudotuberculosis, wie später beschrieben.
Die vorliegende Erfindung liefert auch einen Impfstoff oder eine veterinäre Zubereitung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge mindestens eines monoklonalen Antikörpers, der wie oben angegeben hergestellt worden ist.
Der Impfstoff oder die veterinäre Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung kann oral verabreicht werden oder parenteral (z.B. durch intramuskuläre, subkutane oder intravenöse Injektion). Die erforderliche Menge variiert mit der Antigenität des wirksamen Bestandteils und erforderlich ist nur eine Menge, die ausreicht, eine Immunantwort typisch für die vorliegenden Impfstoffe, hervorzurufen.
Durch Untersuchung der Reaktionsfähigkeit wird die erforderliche Menge leicht festgestellt. Typische Anfangsdosen für Impfstoffe oder veterinäre Zubereitungen können etwa 0,001 bis 1 mg Wirkstoff/kg Körpergewicht betragen. Die Dosis kann erhöht oder es können mehrere Dosen angewandt werden, je nach Bedarf um den erwünschten Schutz zu erzielen.
Der Impfstoffe oder das veterinäre Mittel nach der vorliegenden Erfindung kann ferner einen für die Tiermedizin annehmbaren Träger, ein Verdünnungsmittel und ein Exzipiens enthalten. Vorzugsweise kann der Wirkstoff in einem Träger suspendiert oder gelöst sein. Der Träger kann irgendein Feststoff oder Lösungsmittel sein der/das für Tiere nicht toxisch ist und mit dem Wirkstoff verträglich ist. Geeignete Träger umfassen flüssige Träger wie übliche Salzlösung und andere nicht-toxische Salze in oder nahezu in physiologischen Konzentrationen sowie feste Träger wie Talkum oder Saccharose. Adjuvantien wie Freund's Adjuvans, vollständig oder unvollständig, oder Immunomodulatoren wie Cytokine können zugesetzt werden, um die Antigenität des Antiges zu erhöhen, wenn es erwünscht ist. Wenn er zur Verabreichung über die Bronchialäste verabreicht werden soll, liegt der Impfstoffe vorzugsweise in Form eines Aerosols vor.
Die vorliegende Erfindung wird nun vollständiger in Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben. Es ist jedoch zu verstehen, daß die folgende Beschreibung nur illustrativ ist und in keiner Weise als Beschränkung für die allgemeine oben beschriebene Erfindung dienen soll.
In den Figuren:

Figur 1A - H. contortus

Western-Blot eines 12,5%igen SDS-Polyacrylamid-Gels, das Antigene in der L&sub3;- und L&sub4;-Zubereitung (durch Pfeil gekennzeichnet) zeigt, identifiziert durch den Kulturüberstand von Immun-exoponierten (immune-challenged) Schafen. Es sind vorgefärbte Molekulargewichtsstandards (Bio-Rad) angegeben.

Figur 1B - H. contortus

Western-Blot eines 7,5 bis 15%igen Gradienten SDS- Polyacrylamid-Gels, das Antigene in der L&sub4;-Zubereitung (durch Pfeil gekennzeichnet), identifiziert durch den Kulturüberstand von Immun-exponierten Schafen, zeigt. Es sind vorgefärbte Molekulargewichte (Bio-Rad) angegeben.

Figur 2 - H. contortus

Mit Silber angefärbtes Gel von durch Affinität gereinigten Proteinen auf einem 12,5 % SDS-Polyacrylamid-Gel unter nichtreduzierenden Bedingungen. Die durch Affinität gereinigten Proteine sind in der Bahn 1 angegeben und Molekulargewichtsstandards (Pharmacia) (MG x 10³). Der Bereich der Antikörper- Reaktivität ist in Klammern angegeben (bracketed).

Figur 3 - H. contortus

Western-Blot von durch Affinität isolierten Antigenen nach der Sondenbildung mit Kulturüberstand von einem Immunexponierten Tier (Bahn A). Vorgefärbte Molekulargewichtsmarkierung (Bio-Rad) wie in Figur 1.

Figur 4 - H. contortus

Western-Blot von durch Affinität isolierten Antigen nach Inkubieren mit Proteinase K (Bahnen A), Tyrpsin (Bahnen B), Glycopeptidase F (Bahnen C) und Vergleich (kein Enzym) (Bahnen D). Molekulargewichte (Pharmacia) (MG x 10³) sind angegeben.

Figur 5 - H. contortus

IEF-Kapillar-Transfer auf Nitrocellulose von einem Agarose- IEF-Gel Ampholyt-Bereich 3 bis 5 und durch Sonde untersucht mit Kulturüberstand von einem immunen Tier. pH-Bereich unter Anwendung von IEF-Standards (Bio-Rad) ist angegeben.

Figur 6 - F. hepatica

Western-Blot von einem 7,5 bis 15 % SDS-PAGE-Gel.
MG = vorgefärbte Molekulargewichtsmarker (Bio-Rad) wie in Figur 1.
Bahnen 1 und 4 - NEJ Antigenzubereitung.
Bahnen 2 und 5 - Antigenzubereitung von erwachsenen Egeln.
Bahnen 3 und 6 - Antigenzubereitung von 12 Tage alten Egeln.
Bahnen 1, 2 und 3 wurden sondiert mit Kulturüberstand von HLN-Zellen von infizierten Rindern.
Bahnen 4, 5 und 6 wurden sondiert mit einem Gemisch von Kulturüberständen von HLN von 5 Tage exponierten Schafen mit einer abgekürzten oder chronischen Primärinfektion.
Klammern = beanspruchtes Antigen.

Figur 7 - F. hepatica

(A) 715 bis 15 % SDS-PAGE-Gel, angefärbt mit Silbernitrat.

Bahn 1 - hochmolekulare Marker (Bio-Rad) in reduzierendem Probenpuffer.
Bahn 2 - vorgefärbte Molekulargewichtsmarker (Bio-Rad).
Bahn 3 - Zubereitung von neu aus einer Zyste ausgetretenem (NEJ) Antigen in nicht-reduzierendem Probenpuffer.
Klammern = Stellung des des beanspruchten Antigens.

(B) 10 % SED-PAG-Gel, mit Silbernitrag angefärbt.

Bahn 1 - normales Mäuseserum in nicht-reduzierendem Puffer.
Bahnen 2 und 3 - mit n-Butanol extrahierte Antigenzubereitung in nicht-reduzierendem Probenpuffer. Perle (2) und Überstand (3) nach 50 min Rotation bei 100 000 g.
Bahn 4 und 5 - Uberstand von NEJ Sonikat. Perle (4) und Uberstand (5) nach 50 min Rotation bei 100 000 g.
Klammern = beanspruchtes Antigen.

Figur 8 - F. hepatica

10 % SDS-Gel, angefärbt mit Silbernitrat.
Gebundene (Bahn 2) und nicht-gebundene (Bahn 3) Fraktion nach Affinitätsreinigung von beschallter NEJ- Antigenzubereitung.
Klammern = Stellung des beanspruchten Antigens.
Bahn 1 = vorgefärbte Molekulargewichtsmarker (Bio-Rad) wie in Figur 1.

Figur 9 - T. hydatigena

Western-Blot von einem 10% SDS-PAGE-Gel von Onkosphären- Antigen in nicht-reduzierendem Probenpuffer, sondiert mit Kulturüberstand von Leber-Lymphozyten, isoliert von Immunexponierten ( ) oder nicht-exponierten ( ) Schafen.

Figur 10 - T. hydatigena

Sondierung von Western-Blots von Onkosphären-Antigen (O) in Verdünnungen von 1/2 und 1/4 und Sondieren von Western-Blots von Blasenwand-Metacestoden-Antigen (B) Zubereitungen und Scolex-Metacestoden-Antigen (5) Zubereitungen mit dem positiven Kulturüberstand wie in Figur 9. 10 % SDS-PAGE-Gel, Pfeil = beanspruchtee Antigene.
Sigma-Molekulargewichtsmarker in reduzierendem Puffer laufend.

Figur 11 - T. hydatigena

Sondierung von Western-Blots von Onkosphären-Antigen mit negativem Serum (-) oder positivem Serum (+), entnommen von dem gleichen Schaf zum gleichen Zeitpunkt nach der Infektion, wie der positive Kulturüberstand ( ). 12 % SDS-PAG-Gel. Serumverdünnung 1 : 20.

Figur 12 - T. hydratigena

Western-Blot von Onkosphären-Antigenen, kombiniert mit negativem (1) oder positivem (2) Serum oder Kulturüberstand von Leukzyten, isoliert von Leber (3), Leberlymphknoten (4) oder präskalpulären Lymphknoten (5) von vor kurzem infizierten Tieren. 10 % SDS-PAGE-Gel.

Figuren 13A und 13B

Western-Blot auf Nitrocellulose von 12,5 % SDS-PAGE-Proben löslich gemacht in reduzierendem Puffer.

13A: Angefärbt mit Amidoschwarz

Bahn 1 - Molekulargewichtsstandards. Bahn 2 - WA 1030 Isolat-Zellextrakt.
13B: WA 1030 Isolat-Zellextrakt, kombiniert mit Sera in 1:100 Verdünnung, erhalten von einem mit C. pseudotuberculosis infiziertem Schaf.
Bahn 1 - Serum unmittelbar vor der Infektion entnommen.
Bahn 2 - 2 Tage nach der Infektion.
Bahn 3 - 4 Tage nach der Infektion.
Bahn 4 - 7 Tage nach der Infektion.
Bahn 5 - 11 Tage nach der Infektion.
Bahn 6 - 14 Tage nach der Infektion.
Pfeile = beanspruchtes Proteinantigen.

Figur 13 - C. pseudotuberculosis

Isoelektrische Fokusierung von C. pseudotuberculosis- Antigen. Das Antigen hat einen pH zwischen 6,8 und 6,9.

Beispiel 1

Haemonchus contortus

Haemonchus contortus ist ein Darmparasit von Schafen, der sich im Labmagen (vierten Magen) befindet. Das späte Larven- und adulte Stadium des Parasiten ernährt sich von ganzem Blut. Der Parasit ist verantwortlich für einen beträchtlichen wirtschaftlichen Verlust der Schafindustrie in Australien und beträchtliche Verluste in Übersee und ist eine potentiell tödliche Erkrankung. Trotz dieser Verluste ist kein Impfstoff gegen diesen Parasiten entwickelt worden.

Parasit und Versuchstiere

H. contortus im dritten Larvenstadium (L&sub3;) wurde aus Fäkalkulturen von Schafen gewonnen, die experimentell mit dem Parasiten infiziert worden waren. Immune Tiere wurden erhalten durch die wiederholte Infektion der Schafe mit H. contortus-Larven und anschließendes Überwachen des fäkalen Eiausstoßes. Wenn eine Belastungsdosis nicht zu Eiern in den Faeces führte, wurde das Tier als immun angesehen. Nachdem es einmal immun war, wurde das Schaf einen Zeitraum von mindestens 4 Wochen stehen gelassen, bevor es mit 50 000 bis 200 000 L&sub3;-Larven belastet und dann fünf Tage nach der Belastung getötet wurde.

Herstellung von Kulturüberständen

Lymphknoten des Labmagens, die den Infektionsbereich (Labmagen) ableiten, wurden entfernt und Zellsuspensionen hergestellt wie unten für T. hydratigena beschrieben. Kulturen des Darminhalts von 10 bis 50 ml wurden in Kulturkolben (Miles) in Konzentrationen von 2 bis 4 x 10&sup6; Zellen/ml Kulturmedium angesetzt. Vorversuche hatten sichergestellt, daß der größte Teil der Antikörper in dem Kulturüberstand gebildet wurde durch die antikörpersekretierenden Zellen, die in den in vivo stimulierten Lymphknoten vorhanden waren, und daß diese nicht weiter erhöht wurden, durch Stimulation mit Kermesbeerenmitogen (PWM). PWM wurde daher von den Kulturen weggelassen und die Kulturüberstände wurden nach einer 5 Tage langen Inkubation der Zellen bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5 % CO&sub2; geerntet und bei -20ºC aufbewahrt bis sie verwendet wurden.

Stadiumspezifische Erkennung von Antigenen durch Kulturüberstand

Larven im dritten Entwicklungszustand von H. contortus wurden von der Hülle befreit, in 0,05%igem Natriumhydrochlorid währen 10 min bei 37ºC, um die Hülle der zweiten Stufe zu entfernen. Die Larven wurden dann wiederholt gewaschen und mit 3 000 g 10 min in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4, zentrifugiert. Nach dem sechsten Waschen wurden sie in 500 ml DME-Medium, pH 6,8, in Gegenwart von 200 U/ml Penicillin und 0,2 µg/ml Streptomycin überführt und mit 20 % CO&sub2; an Luft 5 Tage bei 39ºC gezüchtet. Die Kulturmedien wurden dann mit 3 000 g 15 min bei 20ºC zentrifugiert. L&sub3; in vitro geschaltete (switched) L&sub4; und erwachsene Parasiten wurden entfernt und mechanisch homogenisiert unter Anwendung eines Teflonpistills und eines Glasreibrohrs während 20 min bei 4ºC in Gegenwart von 0,1 % Empigen zwitterionischem Detergens (Calbiochem) in PBS und 5 mmol Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Die homogenisierten Larven wurden sofort in einzelne Anteile aufgeteilt und bei -70ºC gefroren. Gefrorene Anteile wurden aufgetaut und 1:1 mit SDS nicht-reduzierendem Probenpuffer vermischt und 5 min zum Sieden erhitzt, bevor sie 2 min bei 5 000 g zentrifugiert wurden, und liefen auf 12,5 % SDS- Polyacrylamid-Minigel (Bio-Rad) nach dem Verfahren von Laemmli (1970). Das Gel wurde dann elektrophoretisch in Nitrocellulose (Kerlero de Rosbo et al., 1984) überführt und mit Serum oder Kulturüberständen aus Lymphknotenzellen des Labmagens von immun-belasteten oder nicht belasteten immunen Schafen sondiert (untersucht). Western-Blots wurde mit 0,5 % Tween 20 in PBS blockiert und alle Waschvorgänge in 0,05 % Tween 20 in PBS durchgeführt. Der zweite Antikörper war ein Kaninchen-Antischaf-Immunoglobulin, gekuppelt an Meerrettichperoxidase (Dako) und anschließend entwickelt mit 3'3- Diaminobenzidin (Sigma) und Wasserstoffperoxid.
Larven-Antigene wurden nachgewiesen zwischen etwa 67 bis 75 Kilodalton (kD), in den in vitro gezüchteten Larven des vierten Stadiums (L&sub4;) und dritten Stadiums (L&sub3;) von Hülle befreiten Larven von H. contortus, wenn sie mit Kulturüberstand von immun-belasteten Schafen untersucht wurden (Figur 1). Es wurden bei den oben angegebenen Molekulargewichten keine Antigene nachgewiesen für erwachsene Haemonchus-Zubereitungen (Daten nicht angegeben). Es trat keine Reaktion auf, wenn der Überstand von nicht-exponierten immunen Schafen angewandt wurde, um die Blots (nicht gezeigt) zu untersuchen, was zeigt, daß alle Antikörper, die gebildet worden sind, in dem Kulturüberstand der immun-belasteten bzw. immun-exponierten Schafe durch die 5 Tage in vivo Exposition induziert worden waren. Bei einer ähnlichen Untersuchung der Western-Blots mit Serum der gleichen Tiere, das zum gleichen Zeitpunkt entnommen und mit verschiedenen Banden in allen drei Entwicklungsstufen des Parasiten umgesetzt worden war, stach das 67 - 75 kD Antigen (nicht gezeigt) jedoch nicht hervor. Auch konnte im Gegensatz zu dem Kulturüberstand kein Unterschied nachgewiesen werden, zwischen dem Serum von immun-belasteten und nicht immun-belasteten Schafen.

Herstellung von L&sub4; Antigen zur Affinitätsreinigung

Rohres Antigen zur Affinitätsreinigung wurde hergestellt durch Scheren in vitro geschalteter L&sub4;-Larven mit einem Polytron-Gewebehomogenisator währen 30 s auf Eis in Gegenwart von 0,05 % Empigen in 0,1 M Tris, pH 8,0, und 5 mM PMSF. Nach der Polytron-Behandlung wurde SDS auf eine Endkonzentration von 2 % zugegeben und die Probe 3 min im Wasserbad zum Sieden erhitzt, anschließend wurde 30 min bei 4ºC mit 35 000 Upm zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde das SDS aus dem Überstand entfernt durch Ausfällen des Proteins nach der "Methode A", beschrieben von Henderson, Oroszlan und Konigsberg (1979). Nach der Entfernung von SDS wurde 7M Guanidin-hydrochlorid (IBI) zu dem Protein-Präzipitat zugegeben und 5 h auf Eis stehen gelassen. Ein gleiches Volumen von 25 % Glycerin in destilliertem Wasser wurde zugegeben und die gesamte Probe gegen PBS und 0,05 Empigen pH 7,4 dialysiert. Die Probe wurde dann auf eine Affinitätssäule aufgebracht.

Affinitätsreinigung von Antigen

Eine Affinitätssäule wurde so konstruiert, daß sie das spezifische Antigen isolierte, indem zunächst Antikörper von dem Kulturüberstand von immun-belasteten Schafen entfernt wurden unter Verwendung von sowohl Protein G Sepharose (Pharmacia/LKB) als auch Esel-Anti-Schaf-Antikörpern (Dako), gekuppelt an Affi-prep (Bio-Rad) nach den Angaben der Hersteller. Die gereinigten Antikörper wurden dann an Affi-prep (Bio-Rad) gekuppelt, nach den Anweisungen der Hersteller und die Säule in PBS und 0,05 % Empigen-Detergens äquilibriert.
L&sub4; Antigene wurden auf die Affinitätssäule aufgebracht und nicht gebundene Proteine entfernt unter Verwendung von 0,5 M NaCl, pH 7,4, und 0,05 % Empigen. Gebundene Proteine wurden eluiert unter Verwendung von 1M NH&sub4;SCN (Ajax) in PBS. Das Eluat wurde durch OD&sub2;&sub8;&sub0; überwacht. Nach der Elution wurde die Probe extensiv dialysiert gegen 0,005 M Tris, pH 8,3, lyophilisiert und bei -70ºC aufbewahrt. Proben wurden erneut in destilliertem Wasser suspendiert und zur weiteren Analyse verwendet.

Anfärben mit Silber und Anfärben mit Coomassie von durch Affinität isolierten Antigenen

Auf üblichen SDS-Page-Gelen können verschiedene Banden erkannt werden bei Anfärben der Gele mit Silber nach der Methode von Morrissey (1981) Figur 2. Immonoblotting und Sondieren mit Kulturüberständen von immun-belasteten Schafen führte zu einer sehr intensiven Antikörper-Antwort im 67 bis 75 kD-Bereich in der durch Affinität isolierten Zubereitung (Figur 3). Es konnten jedoch keine Banden auf entweder mit Silber oder Coomassie angefärbten Gelen positiv in Zusammenhang gebracht werden mit diesem Bereich von Antikörper- Reaktivität. Daraus geht hervor, daß dieses spezielle Molekül nicht angefärbt wird mit den üblicherweise angewandten Färbemitteln für Protein.

Enzymabbau

6 µg durch Affinität isoliertes Antigen von dem vierten Larvenstadium wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert mit entweder Glycopeptidase F (20 µl) (Boehringer Mannheim) oder Proteinase K (10 µg) (Sigma) in 0,1 M Na-phosphat-Puffer, pH 8,0, enthaltend 10 mM EDTA, 0,1 % SDS, 0,5 % Triton -X-100 und 0,1 % β-Mercaptoethanol. Außerdem wurde das Antigen mit Trypsin (10 µg) (Difco) in PBS inkubiert. Nach der Inkubation wurden alle Proben mit SDS nicht-reduzierendem Puffer vermischt, 5 min zum Sieden erhitzt und auf 12,5 % SDS-Polyacrylamid-Gel aufgebracht, auf Nitrocellulose überführt und mit Kulturüberstand wie oben beschrieben untersucht. Sowohl die Proteinase K- als auch die Trypsin- Behandlung führten zu einem Abbau des Proteins, so daß keine Erkennung durch Antikörper in dem Kulturüberstand auftrat (Bahnen A bzw. B). Glycopeptidase F hatte keine Wirkung auf das Antigen und ergab das gleiche Ergebnis wie die Kontrollinkubation (Bahnen C und D). Das zeigt, daß das Antigen eine Protein-Komponente enthält, die durch Proteinase K und Trypsin abgebaut werden kann, das Protein scheint jedoch kein Asparagin-gebundenen Glycan unter diesen Bedingungen zu enthalten.

Isoelektrischer Punkt des Antigens

Isoelektrisch fokusierende (IEF) Dünnschicht-Gele wurden hergestellt, unter Verwendung einer Kunststoff-Matrize (Corning Immunoelectrphoresis-Platte) nach der Methode von McLachlan und Cornell (1978). Jedes IEF-Gel bestand aus 0,95 % (Gew./Vol.) IEF-Agarose (Bio-Rad), 11,4 % (Gew./Vol.) D-Sorbit (Sigma), 4,8 % Träger-Ampholyten (Bio-Rad) Bereich 3 bis 5 oder 3 bis 10 und destilliertem Wasser. Das Wasser, Sorbit und Agarose wurden zum Sieden erhitzt und dann auf ein 56ºC Wasserbad gestellt. Die Ampholine wurden dann zugegeben, die Lösung auf die Matrize gegossen und ein Stück Gelbond (FMC Pharmacia) darübergelegt. Die Matrize wurde in einen Plastikbeutel gelegt und vor der Verwendung mindestens 2 h bei 4ºC gelagert.
1 µl durch Affinität gereinigtes Antigen wurde aufgebracht und das Gel mit einer konstanten Leistung von 1 Watt 45 min betrieben. Nach vollständigem Lauf wurde das Gel mit Nitrocellulose (Schleicher und Schuell) überlagert, gefolgt von einigen Stücken Filterpapier und einer Glasplatte, die als Gewicht diente. Proteine diffundierten dann von dem Gel in die Membran während 1 h, woraufhin die Membran blockiert und untersucht wurde mit Kulturüberstand, wie oben beschrieben. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein eines stark sauren Proteins an mit einem isoelektrischen Punkt unter 4,65, wie gezeigt wurde durch IEF-Standards (Bio-Rad) Figur 5.

Beispiel II

Fasciola hepatica

Fasciola hepatica (Leberegel) ist ein Parasit aus der Trematoden-Familie, der sich in der Leber und den Gallengängen von vielen Säugetieren entwickeln kann und von besonderer wirtschaftlicher Bedeutung für die Schaf- und Rinderindustrie ist. Es sind keine prophylaktischen Behandlungsmöglichkeiten wie Impfstoffe gegen Leberegel auf dem Markt. Während Schafe keine Immunität gegen F. hepatica bilden, können Rinder teilweise resistent werden gegen eine Wiederinfektion. Obwohl der Mechanismus der Resistenz bei Rindern noch nicht vollständig aufgeklärt ist, besteht eine Möglichkeit darin, daß Rinder ein anderes (schützendes) Antigen erkennen als Schafe. Die oben beschriebene Technik wurde daher angewandt, um die unterschiedliche Antigenerkennung zwischen Schafen und Rinder zu untersuchen.

Antigenzubereitungen

1. Neu aus einer Zyste ausgetretene Jugendformen (NEJ)

F. hepatica metacerariae (Mc) wurden von Baldwin Aquatics (Monmouth, Oregon, USA) gekauft. Metacercariae wurden aus der Zyste gewonnen durch Suspendieren in 20 ml DME-Medium, enthaltend 100 mg Na-taurocholsäure, 80 mg L-Cystein. Die Suspension wurde mit einem Gemisch aus 40 % CO&sub2;, 10 % O&sub2; und 50 % N&sub2; begast, bei 37ºC inkubiert und NEJ nach Filtration durch ein Metallsieb gesammelt. Die sedimentierten NEJ wurden erneut in mit Phosphat gepufferter Salzlösung, enthaltend Protease-Inhibitoren (PBS-PI) (5 mM Iodacetamid und 1 mM PMSF) suspendiert und beschallt. Anteile wurden bei -70ºC gelagert.

2. Juvenile Egel

Mäuse wurden oral mit 30 Mc infiziert und 12 Tage später getötet. Die macerierten Lebern wurden mit Hilfe eines Teesiebs gewaschen und die juvenilen Egel durch Differentialzentrifugieren gewonnen. Das Antigen wurde wie oben hergestellt.

3. Adulte Egel

Infizierte Lebern von Schafen oder Rindern wurden von einem Schlachthaus erhalten. Adulte Egel wurden aus den Gallengängen gewonnen, mit einer Gewebemühle homogenisiert, in Anteile aufgeteilt und bei -70ºC gefroren.

SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) und Western- Blotting

Es wurden wie bei Haemonchus aber nur 7,5 bis 15 % Gradienten-Gele oder 10 % SDS-Page-Gele laufen gelassen. Alle Antigene wurden 1:1 mit nicht-reduzierendem Puffer vermischt.
Rinder- und Schaf-Antikörper wurden nachgewiesen unter Verwendung von mit Peroxidase konjugiertem Antirinder- bzw.- schaf-Immunoglobulinen (DAKO) vom Kaninchen.

Butanol-Extraktion

Neu aus Zysten ausgetretene Juvenile, die in PBS-PI suspendiert waren, wurden beschallt und 10 min bei 5 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde zur Affinitätsreinigung, wie später beschrieben, verwendet. Die Perle wurde erneut in PBS- PI suspendiert und ein gleiches Volumen kaltes n-Butanol wurde zugegeben. Das Gemisch wurde unter gelegentlichem Wirbeln auf Eis 10 min inkubiert und dann bei 5 000 g 5 min zentrifugiert. Der wasserlösliche Anteil wurde in der Bodenschicht gesammelt.

Affinitätsreinigung

Antikörper wurden gereinigt aus dem Kulturüberstand von infizierten Rindern (siehe später) unter Verwendung von Sepharose-gebundenem Protein G (Phamacia) und angewandt zur Herstellung einer Affinitätssäule im wesentlichen wie für H. contortus beschrieben.
Triton X-100 R-S (Sigma) wurde zu einem Überstand eines NEJ- Sonikats (siehe oben) mit einer Endkonzentration von 2 % zugegeben. Das Sonikat wurde auf die Affinitätssäule aufgebracht und nicht-gebundene Fraktionen wurden durch das PBS, enthaltend 0,1 % Triton X-100 R-S und 1 mM PMSF, und anschließend 1,5 M NaCl ausgewaschen. Die gebundene Fraktion wurde mit 2 M NH&sub4;SCN in PBS eluiert, gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Gefriergetrocknete Anteile wurden erneut in PBS zur weiteren Verwendung suspendiert.

Herstellung von Kulturüberstand

Drei Schafe und drei Rinder wurden oral mit 400 Metaceracarien infiziert. 18 Tage später erhielten sie FASINEX 120 (CIBA-GEIGY Australia Ltd.), um die Primärinfektion auszuschalten. Die Tiere wurden weitere 35 Tage stehen gelassen, bevor sie oral mit 400 Metacercarien belastet wurden. Sie wurden 10 Tage später getötet. Leberlymphknoten (HLN) wurden entfernt und Zellen isoliert, und 2 bis 4 x 10&sup6; Zellen/ml in Kulturmedium mit PWM, wie für T. hydatigena beschrieben, inkubiert und die Überstände nach 7 Tage langer in vitro Kultur geerntet. Weiterer Kulturüberstand wurde gewonnen von HLN-Zellen von Schafen mit einer nicht-behandelten F. hepatica Primärinfektion (80 Mc) und die 10 Tage vor dem Schlachten mit 300 Mc belastet worden waren.

Ergebnisse

Die Untersuchung von Western-Blots mit Kulturüberstand von HLN-Zellen von infizierten Rindern führte zu einer starken Antikörper-Reaktivität gegen ein Dublett-Antigen in der NEJ Antigenzubereitung, das nur etwas oberhalb des vorgefärbten Molekulargewichtsmarkers lag (Figur 6). Nur eine Bande bei dem höheren Molekulargewicht des NEJ-Dubletts war gleichmäßig vorhanden bei 12 Tage alten Egel-Zubereitungen, während eine ähnliche Bande bei der erwachsenen Egel-Zubereitung nicht zuverlässig nachgewiesen werden konnte bei verschiedenen wiederholten Versuchen. Im Gegenteil wurde, wenn die Antigenzubereitungen untersucht wurden mit einem Gemisch dieses Schafkulturüberstands und Kulturüberstands von chronisch infizierten und belasteten Schafen, keine Reaktion beobachtet mit dem Band, das durch den Rinderüberstand erkannt wurde, obwohl andere Banden stark erkannt wurden (Figur 6). Im Gegensatz zu der begrenzten Reaktivität des Kulturüberstandes reagierten ähnliche Western-Blots, wenn sie mit Serum untersucht wurden, das von den gleichen Tieren zum gleichen Zeitpunkt entnommen worden war, sehr viel diffuser mit einer Anzahl von Banden in allen drei Parasitenstadien und es konnte kein offensichtlicher Unterschied zwischen Rinder- und Schafserum beobachtet werden (nicht gezeigt).
Beim Anfärben mit Silber der gesamten NEJ-Zubereitung wurde das von dem Rinder-Kulturüberstand erkannte Antigen nicht deutlich angefärbt, was nahelegt, daß es eine geringere Komponente des gesamten molekularen Aufbaus des Parasiten darstellt (Figur 7a). Durch Messung der Lage des Antigens auf einem Western-Blot-Replikat, bezogen auf den höchsten vorgefärbten Molekulargewichtsmarker, wurde sein ungefähres Molekulargewicht auf SDS-PAGE-Gel, unter Verwendung von BIORAD MG-Markern als Standards, zu 120 bis 125 kD berechnet. Eine deutliche Anfärbung mit Silber des Dubletts in der NEJ- Zubereitung konnte beobachtet werden, wenn eine mit n-Butanol extrahierte lösliche Fraktion einer NEJ-Sonikat-Perle auf einem SDS-PAGE-Gel lief (Figur 7b).
Die Affinitätsreinigung auf der Rinder-Antikörper-Säule führte zu einer deutlichen Verarmung an dem Antigen in der nicht-gebundenen Fraktion und starken Anreicherung in der gebundenen Fraktion (Figur 8). Außerdem trat auch eine starke Bande bei niedrigem Molekulargewicht (±24 kD) in der gebundenen Fraktion auf, die auch stark mit dem Rinder- Kulturüberstand auf einem Western-Blot (nicht gezeigt) reagierte, was naheliegt, daß die niedermolekulare Bande zurückzuführen war auf den Abbau des 120 bis 125 kD-Antigens während des Affinitätsverfahrens.

Beispiel 3

Taenia hydatigena

Materialien und Methoden

Parasit und Versuchstiere

T. hydatigena-Eier wurden aus Segmenten des reifen Wurms gesammelt, nach einer Abführbehandlung bei infizierten Hunden mit Arecolinhydrobromid. Zwei Jahre alte Schafe, die auf Farmen gehalten wurden, wurden verwendet. In diesem Alter haben Schafe im allgemeinen eine Immunität gegen T. hydatigena erworben, indem sie in der Natur (diesem Parasit) ausgesetzt waren, und dies wurde durch Vorversuche bestätigt. Positive Sera und positive Kulturüberstände wurden gesammelt von Schafen, die 13 Tage nach der intraruminalen Injektion von 40 bis 50 000 T. hydatigena-Eiern infiziert worden waren. Negative Kulturüberstände wurde gesammelt, von Schafen ohne daß sie vorher einer Infektion ausgesetzt waren. Negatives Serum wurde von 5 Monate alten Schafen gewonnen, die unter wurmfreien Bedingungen gehalten worden waren.

Herstellung von Leukozyten-Suspensionen

Leber-Leukozyten wurden nach dem folgenden Verfahren gewonnen. Die Schafleber wurde entfernt und über die Portalvene mit 1 l mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) bei Raumtemperatur und anschließend 0,5 l kaltem PBS unter kontinuierlichem und leichtem Massieren der Leber perfundiert. Dieses Verfahren führte zu einem vollständigen Ausbleichen der gesamten Leber. Etwa 100 g Lebergewebe wurden in einer Vorrichtung zur Bearbeitung von Lebensmitteln (Goldair, Australien) mit geringer Geschwindigkeit 8 bis 10 s behandelt. Die homogenisierte Leber wurde dann durch ein Metallsieb gedrückt, konnte sich 8 bis 10 min absetzen und wurde durch Baumwollgaze futriert. Die Zellen wurden zweimal gewaschen durch Zentrifugieren mit 400 g während 8 min und anschließend bei geringer Geschwindigkeit mit 10 g während 5 min, um kleine Klumpen und den Hauptteil der Hepatocyten zu entfernen. Der Überstand des letzten Zentrifugierens wurde gesammelt und die verbliebenen Hepatocyten und toten Zellen entfernt durch Zentrifugieren über Ficoll/Isopaque-Gradienten.
Leukozyten wurden auch gewonnen aus Lymphknoten durch Zerschneiden und Hecheln der Knoten über ein feinmaschiges Drahtsieb. Tote Zellen und Klumpen wurden durch Zentrifugieren über Ficoll entfernt.

Herstellung von Kulturüberstand

Leukozyten wurden wieder mit einer Konzentration von 2 bis 4 x 10&sup6;/ml suspendiert in Kulturmedium, bestehend aus DME, zu dem 10 mM HEPES, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 2,5 x 10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat und 10 % fötales Kälberserum zugegeben worden waren. 2 µl Kulturen wurden in Linbro -Platten mit 24 Vertiefungen angesetzt, mit 25 µg/ml Kermesbeerenmitogen (PWM, Gibco Labs., Grand Island, NY) stimuliert und in einer Atmosphäre mit 5 % CO&sub2; bei 37ºC inkubiert. Nach 7 Tagen wurden die Kulturen zusammengegeben und die Zellen durch Zentrifugieren sedimentiert. Der Überstand wurde bis zur Verwendung bei -20ºC gelagert.

Herstellung von Antigenen

(a) Onkosphären-Antigen (O)

T. hydratigena-Eier, die von reifen Wurmsegmenten gewonnen worden waren, wurden mit Natriumhypochlorit zum Schlüpfen gebracht und die freigesetzten Onkosphären über 100 % Percoll gereinigt. Es wurden insgesamt 2,3 x 10&sup5; Onkosphären wieder in 1 ml PBS, enthaltend Protease-Inhibitoren (PBS-PI) (5 mM Iodacetimid und 1 mM Phenyl-methyl-sulfanyl-fluorid) suspendiert und bei -20ºC eingefroren. Diese Zubereitung wurde später aufgetaut, mit einem MSE 150W Ultraschall-Desintegrator (Crawley, England) beschallt, in einzelne Anteile aufgeteilt und bei -20ºC gelagert.

(b) Metazestoden-Antigene

Metazestoden wurde aus der Bauchhöhle von Schafen beim Schlachter gesammelt. Die Zysten-Flüssigkeit wurden entfernt, Bandwurmköpfe und Blasenwände abgetrennt und in PBS-PI bei -20ºC gefroren. Die Zubereitungen wurden später aufgetaut, in einem Kinematica Homogenisierer (Polytron, Luzern, Schweiz) homogenisiert, beschallt und mit 1400 UpM 15 min zentrifugiert. Die Überstände wurden in einzelne Anteile aufgeteilt und bei -20ºC gefroren.

Nachweis von Antigenen durch das Western-Blotting-Verfahren

40 µl Antigen-Fraktionen wurden mit 40 µl SDS nichtreduzierendem Probenpuffer vermischt, 5 min zum Sieden erhitzt, 10 min mit 5 000 g zentrifugiert und liefen über ein 10- oder 12 %-SDS-Polyacrylamid-Gel. Die aufgetrennten Proteine wurden über Nacht auf Nitrocellulose-Bahnen übertragen. Die Bahnen wurden mit 3 % Hühnernovalbumin (OVA) blockiert und in Streifen geschnitten. Spezifische Antigene auf den Streifen wurden nach den folgenden Inkubationsstufen entdeckt.
(1) Kulturüberstand oder Serum,
(2) biotinyliertes Esel-Antischaf-Ig (Amersham),
(3) Streptavidin-biotinylierter Meerrettichperoxidase- Komplex (Amersham),
(4) Peroxidase-Substrat (0,6 mg/ml Diaminobenzidin in PBS, enthaltend 0,05 % H&sub2;O&sub2;).
Die Reagenzien wurden entsprechend der Empfehlung des Herstellers verdünnt angewandt.
(1) Untersuchung von Western-Blots von Onkosphären- Antigen-Zubereitungen, von denen nachgewiesen wurde, daß zwei unterschiedliche Antigenbanden speziell erkannt wurden durch Kulturüberstand von Leberleukozyten von vor kurzem infizierten Schafen ( ), die nicht erkannt wurden durch Kulturüberstand, gesammelt von Leberleukozyten von nichtexponierten Schafen ( ) (Pfeile in Figur 9).
Diese beiden Antigenbanden wurden noch nachgewiesen durch einen positiven Kulturüberstand, wenn die Onkosphären- Zubereitung 1/2 und 1/4 verdünnt worden war und etwaige Molekulargewichte von 22 k und und 35 k besaß (Figur 10).
(2) Wenn der gleiche positive Leberkulturüberstand angewandt wurde, um die Western-Blots von Blasenwand-(B) oder Bandwurmkopf-(S) Zubereitungen zu untersuchen, wurden die beiden Onkosphären-Antigen-Banden nicht nachgewiesen (Figur 10). Das zeigt, daß die zwei Antigenbanden, die spezifisch in der Onkosphären-Zubereitung nachgewiesen wurden, stadiumspezifisch für die Onkosphären sind, dem Parasitenstadium, das am wahrscheinlichsten für die Immunattacke verantwortlich ist.
(3) Die beiden Antigenbanden, die nachgewiesen wurden, wenn positive Leberkulturüberstände angewandt wurden, um die Okosphären-Western-Blots zu untersuchen bzw. zu sondieren, wurden nicht nachgewiesen, wenn das Serum von dem gleichen Schaf zum gleichen Zeitpunkt nach der Infektion als Sonde verwendet wurde (Figur 11).
(4) Die beiden Onkosphären-Antigen-Banden wurden auch nachgewiesen, wenn Kulturüberstand von Leukozyten verwendet wurde, die aus dem Lymphknoten von vor kurzem infizierten Tieren isoliert worden waren (Figur 12).

Beispiel 4

Corynebacterium pseudotuberculosis

Lymphknotenverkäsung (abgekürzt CLA, auch als Cheesy Gland bezeichnet) ist eine chronische Infektion von Schafen und Ziegen, die hervorgerufen wird durch das Bakterium Corynebacterium pseudotuberculosis (Syn. C. ovis). Ein komplexer zellfreier Impfstoffe für CLA (GLANVAC , Commonwealth Serum Laboratories) ist bekannt und wird zur Zeit entweder allein oder als Teil eines 6-Komponenten antibakteriellen Impfstoffs (6 in 1) verabreicht. Der durch diesen Impfstoffe hervorgerufene Schutz wird der inaktivierten Toxin (d.h. Toxoid)-Komponente zugeschrieben. Das Toxin besitzt ein relatives Molekulargewicht von etwa 31 kD wenn es auf 12,5 % SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen läuft. Während dieser bekannte Impfstoffe eine gewisse Schutzwirkung hervorruft, ist der Impfstoff kompliziert und teuer und es treten noch deutliche Zahlen von Infektionen auf.
Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung eines Schutz- Antigens vor Corynebacterium pseudotuberculosis-Infektionen mit einem ungefähren Molekulargewicht von 38 bis 40 kD.

Identifizierung von Antigen

Kulturüberstände wurden erhalten unter Anwendung im wesentlichen der gleichen Methoden wie für Haemonchus contortus (Beispiel 1). Künstlich hervorgerufene Infektionen von immunen und naiven (nicht immunen) Schafen wurden an dem Unterbein durch Injektion einer Suspension von lebensfähigen C. pseudotuberculosis lokalisiert und der Lymphknoten der Kniekehle wurde 5 bis 7 Tage später entnommen und in einer Kultur angesetzt.
Die Western-Blot-Analyse von ganzen Zellen unter Verwendung von Kulturüberständen zeigte:
(i) immune Schafe erkannten ein komplexes Muster von Antigenen aber bei der Mehrzahl der Tiere war das 38 bis 40 kD-Antigen immun-dominant.
(ii) naive (nicht immune) Tiere erkannten deutlich das 38 bis 40 kD-Antigen und zeigten üblicherweise geringe sonstige Reaktivität.

Extraktion von Antigen

Ein konfluentes Wachstum von C. pseudotuberculosis wird erhalten auf Hirn-Herz-Infusionsagar durch aerobe Inkubation zwischen 1 und 3 Tagen bei 37ºC. Die Zellen werden durch Abkratzen von dem besten Medium erhalten.
Die Bakterienmasse wird wieder in sterilem Wasser suspendiert und gewaschen durch Wirbeln und anschließendes Zentrifugieren mit 3 000 g während 15 min. Der Überstand wird dekantiert und die nasse Zellperle extrahiert durch erneutes Suspendieren in etwa dem Vierfachen ihres Volumens einer Lösung von 1,0 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat (SDS) in Wasser und Erwärmen auf 70 bis 100ºC während 10 min. Zellen und Zelltrümmer werden entfernt durch Zentrifugieren mit 10 000 g während 15 min. Das rohe Gemisch enthält andere Antigene als die beanspruchten.
Das Proteinantigen kann von dem komplexen Gemisch, das mit SDS von ganzen Zellen von C. pseudotuberculosis extrahiert worden ist, gereinigt werden, wie oben beschrieben, oder aus zellfreiem Kulturüberstand. Übliche biochemische Verfahren können angewandt werden, einschließlich Ionenaustausch und Molekularsieb-Chromatographie, Ammoniumsulfat-Fraktionierung zusammen mit hydrophober Chromatographie. Außerdem kann Affinitäts-Chromatographie angewandt werden, wobei Antikörper verwendet werden, die von der Sonde isoliert und auf einer geeigneten festen Phase immobilisiert worden sind. Alternativ können polyklonale oder monoklonale Antikörper erzeugt werden durch Immunisierung der Tiere mit gereinigtem Antigen.
Das Antigen bleibt in Ammoniumsulfat-Lösungen bis zu 50 % Sättigung löslich.

Charakterisierung des 38 bis 40 kD-Antigens

Das Protein besitzt ein scheinbares Molekulargewicht zwischen 38 und 40 kD, wenn es unter reduzierenden Bedingungen auf einem 12,5 % SDS-Polyacrylamid-Gel läuft. Es kann angefärbt werden mit Coomassie Brilliantblau R250 und Silber. Eine Amidoschwarz-Anfärbung auf Nitrocellulose nach Western- Blotting kann ebenfalls angewandt werden. Die Ergebnisse sind in Figur 13A angegeben.
Die Dünnschicht-isoelektrische Fokusierung in 0,95%iger Agarose, enthaltend 11,4 % Sorbit und pH 5 bis 8 Ampholine lokalisiert das Antigen auf pH 6,8 bis 6,9 unter Verwendung der folgenden Biorad IEF-Marker (siehe Figur 14): Phycocyanin - 4,65, B-Lactoglobulin B-5,10, Rinder-Kohlensäureanhydrase 6,0, Human-Kohlensäureanhydrase 6,5, Pferdemyoglobin 7,0, Humanhämoglobin A 7,1, Humanhämoglobin C 7,5, Cytochrom C 9,6.
Die Aminosäure-Sequenzanalyse des nativen Antigens, das von einem SDS-Polyacrylamid-Gel eluiert worden ist, zeigt, daß ein Teil der Sequenz an oder nahe dem Aminoende wie folgt ist (fortschreitend auf das Carboxy-Ende hin):
ESATLSKEPLKASPGRADT,VGVQ
(oder soweit bevorzugt, Glu, Ser, Ala, Thr, Teu, Ser, Lys, Glu, Pro, Leu, Lys, Ala, Ser, Pro, Gly, Arg, Ala, Asp, Thr, Val, Gly, Val, Gln.)

Literatur:

- Henderson, L. E., Oroszlan, S. und Konigsberg, W. 1979. Analytical Biochemistry 93: 153 - 157.
- Kerlero de Rosbo, N., Carnegie, P. R., Bernard, C. C. A. und Linthicum, D. S. 1984. Neurochemistry Research, 9: 1359 - 1369.
- Laemmli, U. K. 1970. Nature (London) 277: 680 - 685.
- McLachlan, R. und Cornell, F. N. 1978. Pathology, 10: 395.
- Morrissey, J. H. 1981. Analytical Biochemistry, 117: 307 - 310.
- Ward, E. S., Gussow, D., Griffiths, A. D., Jones, P. T. und Winter, G. 1989, Nature 341: 544 - 546.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von mindestens einem Antikörper gegen einen Krankheitserreger, wobei dieses Verfahren darin besteht, die folgenden Verfahrensschritte zu kombinieren:

(a) Bereitstellen einer biologischen Probe, welche antikörperproduzierende Zellen eines immunen Tieres enthält, welches mit einem Erreger oder Erregerextract infiziert oder angegriffen ist, wobei die biologische Probe innerhalb einer geeigneten Periode aus einem Infektionsherd, oder einem Bereich einer Läsion, oder einem Bereich nahe an dem Infektionsherd oder der Läsion oder einem diesen dränierenden Bereich entnommen wurde;

(b) Isolieren der antikörperproduzierenden Zellen aus der biologischen Probe;

(c) Kultivieren der antikörperproduzierenden Zellen aus der biologischen Probe in vitro in einem geeigneten Kulturmedium; und

(d) Ernten des durch die antikörperproduzierenden Zellen produzierten Antikörpers.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die biologische Probe von dem Tier in der Periode entnommen wird, in welcher der Erreger empfindlich ist gegen eine Immunattacke, nachdem das Tier durch den Erreger oder Erregerextrakt infiziert worden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die von der biologischen Probe isolierten antikörperproduzierende Zellen B-Zellen sind, welche in einer Periode isoliert worden sind, von welcher man annimmt, dass sie eine Sekretions- und/oder eine antikörperproduzierende Periode enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem die B-Zellen innerhalb einer Periode isoliert werden, in welcher der Erreger empfindlich auf eine Immunattacke ist, nachdem das Tier durch den Erreger oder Erregerextrakt infiziert worden ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welchem die antikörperproduzierenden Zellen, die von der Probe isoliert worden sind, Gedächtnis-B-Zellen sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches desweitern den Schritte enthält: Hinzufügen eines zellenaktivierenden Mittels zum Kulturmedium, um die kultivierten antikörperproduzierenden Zellen, welche von der biologischen Probe isoliert worden sind, anzuregen und/oder zu vermehren, um Antikörper abzuscheiden und/oder freizusetzen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem das zellaktivierende Mittel ausgewählt wird aus Mitogenen und Hilfsfaktoren oder ihren synthetischen ''- Äquivalenten, aus von Erregern abgeleiteten Molekülen oder einer Kombination derselben.

8. Antikörper, welcher durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellt wurde.

9. Antikörperprobe mit wenigstens einem Antikörper gegen einen Krankheitserreger, wobei der Antikörper nach einem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellt worden ist.

10. Verfahren zur Identifizierung von Antigenen, welches besteht aus:

(a) Bereitstellen einen rohen Antigenmischung;

(b) Bereitstellen mindestens eines Antikörpers gegen einen Krankheitserreger, wobei der Antikörper nach einem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellt worden ist; und

(c) Kupplung der rohen Antigenmischung mit dem Antikörper, um Antigene des Erregers, welcher vom Antikörper gegen den Erreger erkannt worden ist, zu identifizieren.

11. Verfahren zum Läutern eines Antigens, welches Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen einer rohen Antigenmischung;

(b) Bereitstellen eines Antikörpers gegen einen Krankheitserreger, wobei der Antikörper auf einem geeigneten Träger immobilisiert ist und gemäss einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellt worden ist;

(c) Aussetzen der rohen Antigenmischung einer Affinitätschromatographie unter Verwendung des immobilisierten Antikörpers; und

(d) Isolieren des geläuterten Antigens des Erregers, welches von dem immobilisierten Antikörper erkannt worden ist.

12. Verfahren zur Herstellung eines einem Krankheitserreger zugeordneten Antigens, wobei diese Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen einer Probe eines von einem kranken Tier, in einem Entwicklungsstadium entnommenen Erregers, in welchem man annimmt, dass er am empfindlichsten auf einen Angriff ist;

(b) Bereitstellen einer Antikörperprobe gemäss Anspruch 9;

(c) Koppeln der Antigenprobe mit der Antikörperprobe, um wenigstens ein vom Antikörper erkanntes Antigen festzustellen; und

(d) Isolieren des festgestellten Antigens.

13. Verfahren zum Herstellen eines schützenden Antigens, welches einem Tier einen Schutz gegen einen Krankheitserreger verleiht, wobei dieses Verfahren die folgenden Verfahrensschritte umfasst:

(a) Bereitstellen einer Probe des Erregers;

(b) Bereitstellen einer Antikörperprobe gemäss Anspruch 9, welche wenigstens einen Antikörper gegen ein diesem Erreger zugeordnetes Antigen enthält;

(c) Koppeln der Erregerprobe mit der Antikörperprobe, um wenigstens ein schützendes Antigen festzustellen; und

(d) Isolieren des Antigens, welches einem Tier Schutz gegen den Erreger bietet.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 10 bis 13, bei welchem die Erregerprobe ausgewählt ist aus Parasiten, Tumoren, Viren, Manteltieren, Rickettsien, Mykoplasmen, Bakterien, Spirochätten, Pilzen, Protozoen, Würmern, ektoparasitische Gliederfüssern oder Autoantigenen, bei welchen das Antigen einer autoimmunen Krankheit zugeordnet ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei welchem die Parasiten ausgewählt sind von Haemonchus contortus, Fasciola hepatica und Taenia hydatigena.

16. Verfahren nach Anspruch 14, bei welchem die Erregerprobe eine Bakterie oder ein Bakterienextrakt ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei welcher die Baktere das Corynebacterium pseudotuberculosis ist.

18. Verfahren nach Anspruch 18, bei welchem die Probe von einem Krankheitserreger in einem Entwicklungsstadium genommen wird, in welchem angenommen wird, dass er am empfindlichsten auf einen Angriff ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, bei welchem der Krankheitserreger eine parasitäre Bandwurminfektion ist und die Probe im onkosphäre Stadium genommen wird.

20. Verfahren nach Anspruch 18, bei welchem der Krankheitserreger eine parasitäre Wurminfektion ist und die Probe im Larvenzustand genommen wird.

21. Verfahren nach Anspruch 18, bei welchem der Krankheitserreger eine parasitäre Saugwurminfektion ist und die Probe im juvenilen Stadium des Saugwurmes genommen wird.

22. Schützendes Antigen, welches durch das Verfahren gemäss Anspruch 13 hergestellt worden ist, welches einem Tier Schutz gegen Taenia hydatigena Infektionen gibt, welches von den Antigenen ausgewählt worden sind, welche ein Molekulargewicht von 25 bis 34 Kilodalton, wie es nach SDS-PAGE bestimmt wird, haben.

23. Schützendes Antigen, welches nach dem Verfahren gemäss Anspruch 13 hergestellt worden ist, welches einem Tier Schutz gegen Haemonchus contortus Infektionen gibt, welche ein Molekulargewicht von 67 bis 75 Kilodalton, wie sie nach SDS-PAGE bestimmt wird, haben.

24. Schützendes Antigen, welches nach dem Verfahren gemäss Anspruch 13 hergestellt worden ist, welches einem Tier Schutz gegen Fasciola heptica Infektionen gibt, welches ein Molekulargewicht von 120 bis 125 Kilodalton, wie es auf SDS-PAGE bestimmt wird, hat.

25. Schützendes Antigen, welches nach dem Verfahren gemäss Anspruch 13 hergestellt worden ist, welches einem Tier Schutz gegen Corynebacterium pseudotuberculosis Infektionen gibt, welches ein Molekulargewicht von 40 Kilodalton, wie es nach SDS-PAGE bestimmt wird, hat.

26. Schützendes Antigen, welches nach dem Verfahren gemäss Anspruch 13 hergestellt worden ist, welches einem Tier Schutz gegen Corynebacterium pseudotuberculosis Infektionen gibt, welches eine NH&sub2; Endsequenz von Glu, Ser, Ala, Thr, Leu, Ser, Lys, Glu, Pro, Leu, Lys, Ala, Ser, Pro, Gly, Arg, Ala, Asp, Thr, Val, Gly, Val, Gln hat.

27. Verfahren zur Herstellung eines synthetischen antigenen Polypeptid, welches einem Tier Schutz gegen einen Krankheitserreger gibt, welches Verfahren umfasst:

(a) Herstellen einer cDNS Bibliothek, oder einer Genomen-Bibliothek, welche aus einer Probe eines Krankheitserregers abgeleitet worden ist;

(b) Bereitstellen einer Antikörperprobe gemäss Anspruch 9;

(c) Erzeugen synthetischer Polypeptide von der cDNS Bibliothek oder Genomen-Bibliothek;

(d) Koppeln den synthetischen Polypeptiden mit der Antikörperprobe; und

(e) Isolieren des synthetischen antigenen Polypeptids, welches dadurch festgestellt wird.

28. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen ein Antigen eines Krankheitserregers, welches Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen einer B-Zelle, welche Antikörper gegen das Antigen produzieren kann und, welches von einem mit einem schützenden Antigen gegen den Krankheitserreger, welches nach dem Verfahren gemäss Anspruch 13 hergestellt worden ist, immunisiert ist, und einer Myelomazelle;

(b) Verschmelzen der B-Zelle mit der Myelomazelle;

(c) Vermehren der dadurch gebildeten Hybrodome; und

(d) Ernten der durch dieses Hybrodom erzeugten Antikörpers.

29. Monoklonale Antikörper gegen ein mit dem Verfahren gemäss Anspruch 28 hergestelltes schützendes Antigens.

30. Impfstoff oder veterinäre Zusammensetzung mit einer prophylaktisch wirksamen Menge von wenigstens einem schützenden Antigen, welches durch das Verfahren gemäss dem Anspruch 13 hergestellt worden ist, gegen einen Krankheitserreger, welcher aus Taenia hydatigena, Haemonchus contortus, Fasciola hepatica und Corynebacterium pseudotuberculosis ausgewählt ist.

31. Impfstoff oder veterinäre Zusammensetzung mit einer therapeutisch wirksamen Menge von wenigstens einem monoklonalen Antikörper nach Anspruch 29.