JPH0387199A - 防御抗原、対病原体抗体、それを含むワクチン、それらの製造方法及び診断用キット - Google Patents
防御抗原、対病原体抗体、それを含むワクチン、それらの製造方法及び診断用キットInfo
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、種々の抗体プローブ、これらのプロブを多く
の防御抗原及び診断性抗原の検出及び精製のために使用
する方法、それらの製造方法及びそれらをワクチン調剤
の製造に用いる方法に関２ する。
の防御抗原及び診断性抗原の検出及び精製のために使用
する方法、それらの製造方法及びそれらをワクチン調剤
の製造に用いる方法に関２ する。
［従来の技術］
従来、寄生体による、細菌による、又はその他の原因に
よる、家畜を含む種々の動物の感染症を制御するための
ワクチンの開発に多大の努力がなされてきた。しかしな
がら過去５年間に種々の真核生物及び原核生物において
異物性生産物を大量に製造する技術は極めて発展したけ
れども、上記の結果についてはあまり進展が見られなか
った。
よる、家畜を含む種々の動物の感染症を制御するための
ワクチンの開発に多大の努力がなされてきた。しかしな
がら過去５年間に種々の真核生物及び原核生物において
異物性生産物を大量に製造する技術は極めて発展したけ
れども、上記の結果についてはあまり進展が見られなか
った。
例えば種々の動物での重要な病原体性感染症における防
御抗原の同定は各種ワクチンを生成する上で大きくつま
ずいている。
御抗原の同定は各種ワクチンを生成する上で大きくつま
ずいている。
それに対する大きな理由の一つは、例えば種々の寄生体
は哺乳動物の遺伝情報の１０％までもの遺伝情報を持ち
えるが、その結果として該寄生体の生命サイクルの種々
の段階において極めて多種多様な生産物を作り出す能力
を有していることによる途方もない複雑性であるが、そ
れらの生産物のうち、有効なワクチンの開発に重要なも
のは極めて僅かしかない。殆どの場合に研究者は多数の
３ 潜在的な抗原に遭遇する。その場合になお残される最大
の難問は宿主防御の免疫応答を引き出させるのがどの寄
生体抗原であるかということである。希望とインスピレ
ーションの原理に基づいて選び出される或る寄生体抗原
の、著しい困難と費用及び時間とを費やすクローニング
は理論の」二では有効なワクチンの開発をもたらすかも
知れないけれども、このような試みの殆どは失敗に終る
。
は哺乳動物の遺伝情報の１０％までもの遺伝情報を持ち
えるが、その結果として該寄生体の生命サイクルの種々
の段階において極めて多種多様な生産物を作り出す能力
を有していることによる途方もない複雑性であるが、そ
れらの生産物のうち、有効なワクチンの開発に重要なも
のは極めて僅かしかない。殆どの場合に研究者は多数の
３ 潜在的な抗原に遭遇する。その場合になお残される最大
の難問は宿主防御の免疫応答を引き出させるのがどの寄
生体抗原であるかということである。希望とインスピレ
ーションの原理に基づいて選び出される或る寄生体抗原
の、著しい困難と費用及び時間とを費やすクローニング
は理論の」二では有効なワクチンの開発をもたらすかも
知れないけれども、このような試みの殆どは失敗に終る
。
寄生体による感染症の従来技術水準においては損害生体
抗原混合物、寄生体ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリを、
全血清抗体を「プローブ」として用いてスクリーニング
することに重点が置かれていた。血清は他の種々の病原
体及び抗原に対する多数の抗体を含んでいる。加えて、
寄生体に対する殆どの抗体は非防御の抗原に対して指向
されている。
抗原混合物、寄生体ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリを、
全血清抗体を「プローブ」として用いてスクリーニング
することに重点が置かれていた。血清は他の種々の病原
体及び抗原に対する多数の抗体を含んでいる。加えて、
寄生体に対する殆どの抗体は非防御の抗原に対して指向
されている。
損害生体抗原混合物或は寄生体ｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングするために用いる抗体プローブの改良は
、これが防御抗原を検出するため及びこれらの抗原をつ
づいて分子的クローニング］ ４ する間に４５いて該抗原の防御エピトープを検出するた
めには非常に重要であるにもかがわらず、これには殆ど
努力が払われてきていない。
スクリーニングするために用いる抗体プローブの改良は
、これが防御抗原を検出するため及びこれらの抗原をつ
づいて分子的クローニング］ ４ する間に４５いて該抗原の防御エピトープを検出するた
めには非常に重要であるにもかがわらず、これには殆ど
努力が払われてきていない。
例えばＨａ ｅ ｍ ｏ ｎ ｃ ｈ ｕ ｓ ｃ ｏ
ｎ ｔ ｏ ｒ ｔ ｕ ｓは羊の胆管内寄生体であ
ってアボマスム（第４胃袋）中に極在する。この寄生体
の幼生後期段階及び成虫段階のものは全血によって成育
する。この寄生体はオーストラリアにおける羊産業のか
なりの経済的損失の原因となり、そしてこれが致命的に
なりえる疾病であるために海外における著しい損失をも
たらす。このような損失にもかかわらず、この寄生体に
対してこれまで従来技術においては有効なワクチンが開
発されていない。
ｎ ｔ ｏ ｒ ｔ ｕ ｓは羊の胆管内寄生体であ
ってアボマスム（第４胃袋）中に極在する。この寄生体
の幼生後期段階及び成虫段階のものは全血によって成育
する。この寄生体はオーストラリアにおける羊産業のか
なりの経済的損失の原因となり、そしてこれが致命的に
なりえる疾病であるために海外における著しい損失をも
たらす。このような損失にもかかわらず、この寄生体に
対してこれまで従来技術においては有効なワクチンが開
発されていない。
乾酪性リンパ節炎（ＣＬ Ａ・と略記する、チーズ腺と
も呼ばれる）は羊及び山羊の慢性感染症のってあってバ
クテリアＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ５ｅｕｄ
。
も呼ばれる）は羊及び山羊の慢性感染症のってあってバ
クテリアＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ５ｅｕｄ
。
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｊｓ （Ｃ，ｏｖｉｓと同意）に
よって引き起こされる。このＣＬＡに対する無細胞の複
雑なワクチン（ＧＬＡＮＶＡＣ： Ｃｏｍｍｏｎｗｈｅ
ａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
社）が従来技術において知られており、５ そして通常、単独で、又は６成分抗菌性ワクヂン（６を
合一）の一部として投与される。このワクチンによって
得られる防御はその非活性化された毒素（すなわちトキ
ソイド）成分に帰せられる。
よって引き起こされる。このＣＬＡに対する無細胞の複
雑なワクチン（ＧＬＡＮＶＡＣ： Ｃｏｍｍｏｎｗｈｅ
ａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
社）が従来技術において知られており、５ そして通常、単独で、又は６成分抗菌性ワクヂン（６を
合一）の一部として投与される。このワクチンによって
得られる防御はその非活性化された毒素（すなわちトキ
ソイド）成分に帰せられる。
この毒素は還元条件のもとで１２．５％の５ＤＳＰＡＧ
Ｅの上に流したときに約３１キロダルトンの相対的分子
量を有する。この従来技術のワクチンは若干の防御作用
を作り出すけれども、このワクチンは複雑で高価であり
、しかもなお相当数の感染症が起り得る。
Ｅの上に流したときに約３１キロダルトンの相対的分子
量を有する。この従来技術のワクチンは若干の防御作用
を作り出すけれども、このワクチンは複雑で高価であり
、しかもなお相当数の感染症が起り得る。
Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅ ａｔｉｃａ （肝臓吸虫）
は羊及び牛の肝臓及び胆管系中で発育する感染性寄生体
である。肝臓吸虫は羊及び牛の産業において慢性及び急
性の損失をもたらす。従来技術において多数の予防的処
置及び治療的処置が知られているけれどもそれらの作用
は限定されており、そして肝臓吸虫はなお慢性的な獣医
学的疾病として残されている。
は羊及び牛の肝臓及び胆管系中で発育する感染性寄生体
である。肝臓吸虫は羊及び牛の産業において慢性及び急
性の損失をもたらす。従来技術において多数の予防的処
置及び治療的処置が知られているけれどもそれらの作用
は限定されており、そして肝臓吸虫はなお慢性的な獣医
学的疾病として残されている。
Ｔａｅｎｉａ ｈｙｄａｔｉｇｅｎａは羊の肝臓中で同
様に発育する感染性寄生体である。このものは感染した
犬 ６ によって動物から動物へと移され、そして羊産業におい
て若干の損失を生じさせる。この寄生体に対しては従来
技術ではまだ成功したワクチンは開発されていない。
様に発育する感染性寄生体である。このものは感染した
犬 ６ によって動物から動物へと移され、そして羊産業におい
て若干の損失を生じさせる。この寄生体に対しては従来
技術ではまだ成功したワクチンは開発されていない。
［発明が解決しようとする課題］
従って本発明の目的の一つは上述の従来技術に関連する
問題点の一つ、又はそれ以上を克服し、又は少なくとも
改善することである。
問題点の一つ、又はそれ以上を克服し、又は少なくとも
改善することである。
〔課題を解決するための手段］
従って本発明は、その第１の態様において或る病原体に
対する少なくとも一つ以上の抗体を産生ずるための方法
を提供することであり、この方法は、 その病原体又は病原体抽出物に感染しているか又はそれ
を接種した動物から生物学的試料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これら細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そし
て それら細胞からその作り出された抗体を回収 ７ すること を上記抗体プローブである。
対する少なくとも一つ以上の抗体を産生ずるための方法
を提供することであり、この方法は、 その病原体又は病原体抽出物に感染しているか又はそれ
を接種した動物から生物学的試料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これら細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そし
て それら細胞からその作り出された抗体を回収 ７ すること を上記抗体プローブである。
上記生物学的試料が採取される動物は如何なる適当な型
のものであってもよい。生物学的試料の採取される動物
は免疫動物であることができる。
のものであってもよい。生物学的試料の採取される動物
は免疫動物であることができる。
この生物学的試料はその免疫動物が病原体感染症の作用
を受けてしまった後、短時間のうちに採取することがで
きる。この動物は人を含むことができる。この動物は羊
や牛のような家畜であってもよい。
を受けてしまった後、短時間のうちに採取することがで
きる。この動物は人を含むことができる。この動物は羊
や牛のような家畜であってもよい。
以下の記述においては羊及び牛の疾病において重要な寄
生体性及び細菌性免疫原を同定する方法を、そしてより
特別にはＴａｅｎｉａ ｈｙｄａｔｉ ｅｎａ （多節
条虫） 、 Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｒｔ、ｏｒｔ
、ｕｓ （線形動物）、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅ ａｔ
ｉｃａ （ＩＪｉ虫類）及び細菌性病原体Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ５ｅｕｄｏｔ、ｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ による寄生体的感染を記述する。しかし
ながら、そのような免疫原及び病原体は単なる説明的の
ものであってその方法が人を含めて一般的に種々の動物
に適用可能であることを理解すべきである。中でちこ
８ こに記述する方法は自己免疫性疾病における免疫原の検
出に用いることができる。
生体性及び細菌性免疫原を同定する方法を、そしてより
特別にはＴａｅｎｉａ ｈｙｄａｔｉ ｅｎａ （多節
条虫） 、 Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｒｔ、ｏｒｔ
、ｕｓ （線形動物）、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅ ａｔ
ｉｃａ （ＩＪｉ虫類）及び細菌性病原体Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ５ｅｕｄｏｔ、ｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ による寄生体的感染を記述する。しかし
ながら、そのような免疫原及び病原体は単なる説明的の
ものであってその方法が人を含めて一般的に種々の動物
に適用可能であることを理解すべきである。中でちこ
８ こに記述する方法は自己免疫性疾病における免疫原の検
出に用いることができる。
生物学的な動物試料は如何なる適当な型のものであって
もよい。この生物学的試料は種々の動物の組織、器官、
血液、リンパ液またはリンパ節であることができる。生
物学的試料は感染した動物のいかなる部位から採取した
ものであってもよい。しかしながらそれら試料を感染部
位又は或種の疾病において形成され得る病巣の領域から
、或はまたそのような感染部位や病巣に近い領域、例え
ばリンパ節から採取するのが好ましい。
もよい。この生物学的試料は種々の動物の組織、器官、
血液、リンパ液またはリンパ節であることができる。生
物学的試料は感染した動物のいかなる部位から採取した
ものであってもよい。しかしながらそれら試料を感染部
位又は或種の疾病において形成され得る病巣の領域から
、或はまたそのような感染部位や病巣に近い領域、例え
ばリンパ節から採取するのが好ましい。
しかしながら、血清／血漿試料は本発明のこの態様に従
う生物学的試料としてはあまり好ましくはない。血清／
血漿の試料中に見出される大部分の抗体は或る病原体の
特異的診断又は防御に不適当であるか又はその病原体に
無関係であることが見出されている。加えて、他の血清
／血漿成分が各病原体成分とそれに対する抗体との間の
特異的反応を妨害する場合がある。
う生物学的試料としてはあまり好ましくはない。血清／
血漿の試料中に見出される大部分の抗体は或る病原体の
特異的診断又は防御に不適当であるか又はその病原体に
無関係であることが見出されている。加えて、他の血清
／血漿成分が各病原体成分とそれに対する抗体との間の
特異的反応を妨害する場合がある。
対照的に、本発明において記述するプローブ類９
は病原体特異性抗体に非常に冨んでおり、そして防御免
疫に対して特に重要な病原体段階に限定されるように選
ぶことができる。
疫に対して特に重要な病原体段階に限定されるように選
ぶことができる。
生物学的試料を或る疾病の進展の予め定められた時期に
動物から採取するのが好ましい。一般に、或る寄生体に
よる感染症については、或る病原体に感染させた後、又
は或る病原体から得られた生産物を注入した後に短時間
のうちに生物学的試料を採取すべきであることが見出さ
れている。
動物から採取するのが好ましい。一般に、或る寄生体に
よる感染症については、或る病原体に感染させた後、又
は或る病原体から得られた生産物を注入した後に短時間
のうちに生物学的試料を採取すべきであることが見出さ
れている。
寄生体は対象物中に侵入した後はんの僅かな期間だけし
か受攻性でなく、その後はこれはその構造を変化させて
もはや免疫的攻撃を受けず、そしてもはや防御的抗体を
誘発することがないとされている。
か受攻性でなく、その後はこれはその構造を変化させて
もはや免疫的攻撃を受けず、そしてもはや防御的抗体を
誘発することがないとされている。
生物学的試料から分離された細胞はＢ細胞を含／υでい
る。これらの細胞は、分泌及び／又は抗体産生期が含ま
れることが知られている或る時期において同様に分離す
ることができる。これに代えて、それらの細胞は或る種
の疾病において比較的後期の段階で作り出される記憶細
胞を含むことが ０ できる。
る。これらの細胞は、分泌及び／又は抗体産生期が含ま
れることが知られている或る時期において同様に分離す
ることができる。これに代えて、それらの細胞は或る種
の疾病において比較的後期の段階で作り出される記憶細
胞を含むことが ０ できる。
従って、それらの細胞は試験管中での、例えば適当な寄
生体段階による生体内刺激の後で短時間のうちに、好ま
しくはその後約２ないし１３０以内に採取され、それに
よって生体内で抗体形成細胞の誘導をもたらし、これが
試験管中での培養の後で培養培地中に特異的抗体を分泌
する。予め生体内の休眠中のリンパ球を刺激しないとき
は全く、又は極めて僅かな抗体しか培養培地中に分泌さ
れない。
生体段階による生体内刺激の後で短時間のうちに、好ま
しくはその後約２ないし１３０以内に採取され、それに
よって生体内で抗体形成細胞の誘導をもたらし、これが
試験管中での培養の後で培養培地中に特異的抗体を分泌
する。予め生体内の休眠中のリンパ球を刺激しないとき
は全く、又は極めて僅かな抗体しか培養培地中に分泌さ
れない。
活性化されて間もないＢ細胞による、培養培地中への種
々の抗体の抜験警内分泌はその培地にヘルパー因子を加
えることによって高めることができる。それらのヘルパ
ー因子は、インターロイキンｌ、２．３．４．５．６．
７及び８を含むような、単独で、又は組み合わせて用い
られるシトキン類（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｌ 、コロニー
刺激因子、インクフエロン及び特定のＢ細胞分泌に促進
効果を有することが示されている他の諸因子のいかなる
ものであることもできる。
々の抗体の抜験警内分泌はその培地にヘルパー因子を加
えることによって高めることができる。それらのヘルパ
ー因子は、インターロイキンｌ、２．３．４．５．６．
７及び８を含むような、単独で、又は組み合わせて用い
られるシトキン類（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｌ 、コロニー
刺激因子、インクフエロン及び特定のＢ細胞分泌に促進
効果を有することが示されている他の諸因子のいかなる
ものであることもできる。
１
本発明のこの態様に従う抗体を製造する方法は、分離さ
れた細胞を活性化して種々の抗体を増殖させ、分泌させ
、及び／又は放出させるちうつの段階を含むことができ
る。この細胞ン占性化段階はその培養培地に細胞活性化
剤を加えることを包含することができる。細胞活性化剤
は、寄生体から誘導され、又はマイトジェン（ｍｉｔｏ
ｇｅｎ） 類及び白血球から産生されたヘルパー因子、
それらの合成的等価物又はそれらの組み合わぜから選ば
れることができる。
れた細胞を活性化して種々の抗体を増殖させ、分泌させ
、及び／又は放出させるちうつの段階を含むことができ
る。この細胞ン占性化段階はその培養培地に細胞活性化
剤を加えることを包含することができる。細胞活性化剤
は、寄生体から誘導され、又はマイトジェン（ｍｉｔｏ
ｇｅｎ） 類及び白血球から産生されたヘルパー因子、
それらの合成的等価物又はそれらの組み合わぜから選ば
れることができる。
それらのマイトジェンは、ポークライードマイトジェン
（ＰＷＭと略記する）としても知られているアメリカや
まごぼう（Ｐｈｙｒｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉ −ｃａ
ｎａＬポリビニルピロリドン（ＰＶＰと略記される）、
ポリアデニル−ポリウリジル酸［Ｐｏ１．ｙ（ＡＵ）と
略記される］、精製蛋白質誘導体（ＰＰＤと略記される
）、ポリイノシンーポリシチシル酸［Ｐｏ１．ｙ（１−
Ｃ） と略記される］、リポポリザラカライド（Ｌ Ｐ
Ｓと略記される）、ブドウ球菌族生物又はその産生物
、バクトストレプトリシン０試薬２ （ｓ ｒ−ｏと略記される）、ブドウ球菌性ファージ溶
菌物（Ｓ Ｐ Ｌと略記される） 、Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶと略記される）ノカルジア水
溶性マイトジェン（ＮＷＥＭと略記される）、植物性赤
血球凝集素（ＰＩ（Ａと略記される）、コンカナバリン
Ａ（Ｃｏｎ Ａと略記される）及びデキストランザル
フェート並びにそれらの混合物から選ぶことができる。
（ＰＷＭと略記する）としても知られているアメリカや
まごぼう（Ｐｈｙｒｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉ −ｃａ
ｎａＬポリビニルピロリドン（ＰＶＰと略記される）、
ポリアデニル−ポリウリジル酸［Ｐｏ１．ｙ（ＡＵ）と
略記される］、精製蛋白質誘導体（ＰＰＤと略記される
）、ポリイノシンーポリシチシル酸［Ｐｏ１．ｙ（１−
Ｃ） と略記される］、リポポリザラカライド（Ｌ Ｐ
Ｓと略記される）、ブドウ球菌族生物又はその産生物
、バクトストレプトリシン０試薬２ （ｓ ｒ−ｏと略記される）、ブドウ球菌性ファージ溶
菌物（Ｓ Ｐ Ｌと略記される） 、Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶと略記される）ノカルジア水
溶性マイトジェン（ＮＷＥＭと略記される）、植物性赤
血球凝集素（ＰＩ（Ａと略記される）、コンカナバリン
Ａ（Ｃｏｎ Ａと略記される）及びデキストランザル
フェート並びにそれらの混合物から選ぶことができる。
細胞増殖剤は例えば固相抗免疫グロブリンのような間接
的に、又は直接的にＢ細胞増殖及び／又は抗体分泌をも
たらすいかなる薬剤であってもよい。ヘルパー因子は、
インクロイキン１．２．３．４．５．６．７及び８を含
むようなシトキン類（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ） 、コロニ
ー刺激因子、インターフェロン、及び特定のＢ細胞増殖
及び／又は抗体分泌に促進効果を有することが示されて
いる他の諸因子と組み合わせて、又単独で用いたときに
示される他のいかなるヘルパー因子であることができる
。但しこれらはマイトジェン類やヘルパー因子を含む細
胞活性化剤の全てのリストをあげたものではない。
的に、又は直接的にＢ細胞増殖及び／又は抗体分泌をも
たらすいかなる薬剤であってもよい。ヘルパー因子は、
インクロイキン１．２．３．４．５．６．７及び８を含
むようなシトキン類（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ） 、コロニ
ー刺激因子、インターフェロン、及び特定のＢ細胞増殖
及び／又は抗体分泌に促進効果を有することが示されて
いる他の諸因子と組み合わせて、又単独で用いたときに
示される他のいかなるヘルパー因子であることができる
。但しこれらはマイトジェン類やヘルパー因子を含む細
胞活性化剤の全てのリストをあげたものではない。
３
細胞の試験管内培養は、細胞の分化形成集落を分離する
段階を採用し又は採用することな〈実施することができ
る。抗体の収集は、その培地から」二澄液を採集するこ
とによって行なうことができる。この上澄液はそれら細
胞が試験管中で培養されている間にそれら細胞によって
分泌され、又は例えばＢ細胞の溶菌によってＢ細胞から
人工的に放出させた抗体を含有する。驚くべきことにそ
れら抗体含有上澄液が或る病原体の抗原を検出するのに
直接使用できることが見出された。
段階を採用し又は採用することな〈実施することができ
る。抗体の収集は、その培地から」二澄液を採集するこ
とによって行なうことができる。この上澄液はそれら細
胞が試験管中で培養されている間にそれら細胞によって
分泌され、又は例えばＢ細胞の溶菌によってＢ細胞から
人工的に放出させた抗体を含有する。驚くべきことにそ
れら抗体含有上澄液が或る病原体の抗原を検出するのに
直接使用できることが見出された。
従って本発明の第２の態様において、或る病原体に伴う
抗原を調製する方法が提供されるが、この方法は、 或る病原体又は病原体抽出物に感染しているか又ははこ
れを接種した動物から生物学的試料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これらの細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そ
して これら細胞から生産された抗体を収集する ４ こと を含む方法によってつくられた少なくとも一つ以上の対
病原体抗体を含む抗体プローブと、病原体の試料と を準備し、 上記病原体試料を上記抗体プローブによってプローブし
て少なくとも一つ以上の抗原を検出し、そして その検出された抗原を分離すること を包含する。
抗原を調製する方法が提供されるが、この方法は、 或る病原体又は病原体抽出物に感染しているか又ははこ
れを接種した動物から生物学的試料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これらの細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そ
して これら細胞から生産された抗体を収集する ４ こと を含む方法によってつくられた少なくとも一つ以上の対
病原体抗体を含む抗体プローブと、病原体の試料と を準備し、 上記病原体試料を上記抗体プローブによってプローブし
て少なくとも一つ以上の抗原を検出し、そして その検出された抗原を分離すること を包含する。
病原体はいかなる適当な型のものであってもよい。この
病原体は、ウィルス、クラミジェ、リケッチア、マイコ
プラズマ、細菌類、スピロへ夕、黴類、プロトゾア、嬬
虫（吸虫類、線形動物、多節条虫）及び外部寄生体的節
足動物（例えばマグニ、ダニ又はクロバエ）を含むいか
なる感染性剤から誘導されたものであってもよく、或は
また自己抗原又は腫瘍抗原であることができる。
病原体は、ウィルス、クラミジェ、リケッチア、マイコ
プラズマ、細菌類、スピロへ夕、黴類、プロトゾア、嬬
虫（吸虫類、線形動物、多節条虫）及び外部寄生体的節
足動物（例えばマグニ、ダニ又はクロバエ）を含むいか
なる感染性剤から誘導されたものであってもよく、或は
また自己抗原又は腫瘍抗原であることができる。
病原体は好ましくは寄生体、寄生体抽出物又はそれらの
寄生的部分であるのがよい。病原体は羊 ５ の腸管肉寄生体であるＨ ａ ｅ ｍ ｏ ｎ ｃ ｈ
ｕ ｓ ｃ ｏ ｎ １； ｏ ｒ ｔ ｕ ｓ 。
寄生的部分であるのがよい。病原体は羊 ５ の腸管肉寄生体であるＨ ａ ｅ ｍ ｏ ｎ ｃ ｈ
ｕ ｓ ｃ ｏ ｎ １； ｏ ｒ ｔ ｕ ｓ 。
羊及び牛の肝臓や胆管系中で発育する感染性寄生体であ
るＦａｓｃｉ、ｏｌ、ａ ｈｅｐＬａｔｉｃａ （肝
臓吸虫）又は同様に羊の肝臓内で発育する感染性寄生体
であるＴａｅｎｉａ ｈｙｄａｔｉ ｅｎａ から選
ばれることができる。他の寄生体はｒ、ｕｃｉｌｉａ
Ｃｕ ｒｉｎａ、 Ｔｒｊｃｈｏｓｔｒａｎ匠ｌ」ヨ
土！ 種 、 旦１リエ２ＪＬＬ１２Ｌ互 ｆ重
、 Ｏｓ ｔ、±ロー１ｊとＢ二ｉａｉ重 、Ｓｃ
ｈｉｓｔｏｓｏｍｅ種、Ｔａｅｎｉａ 種及びＥｃｈ
ｎｏｃｏｃ−ｃｕｓ種が包含される。しかしながら本発
明はこれらのみに限定されるものではなく、そして以下
にあげる記述ではこれらの寄生体は説明するためにのみ
あげである。
るＦａｓｃｉ、ｏｌ、ａ ｈｅｐＬａｔｉｃａ （肝
臓吸虫）又は同様に羊の肝臓内で発育する感染性寄生体
であるＴａｅｎｉａ ｈｙｄａｔｉ ｅｎａ から選
ばれることができる。他の寄生体はｒ、ｕｃｉｌｉａ
Ｃｕ ｒｉｎａ、 Ｔｒｊｃｈｏｓｔｒａｎ匠ｌ」ヨ
土！ 種 、 旦１リエ２ＪＬＬ１２Ｌ互 ｆ重
、 Ｏｓ ｔ、±ロー１ｊとＢ二ｉａｉ重 、Ｓｃ
ｈｉｓｔｏｓｏｍｅ種、Ｔａｅｎｉａ 種及びＥｃｈ
ｎｏｃｏｃ−ｃｕｓ種が包含される。しかしながら本発
明はこれらのみに限定されるものではなく、そして以下
にあげる記述ではこれらの寄生体は説明するためにのみ
あげである。
更にもう一つの別な態様において、病原体試料はバクテ
リアから採取することができる。例えばバクテリアＣｏ
ｒ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ５ｅｕｄｏｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓを使用することができる。
リアから採取することができる。例えばバクテリアＣｏ
ｒ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ５ｅｕｄｏｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓを使用することができる。
好ましい態様の一つにおいて、或るーっの病原体に伴う
抗原を製造するための方法が提供されるが、この方法は 或る免疫動物からこの動物が或る病原体又６ は病原体抽出物の接種を受けた後短時間のうちに採集し
た生物学的試料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これらの細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そ
して これら細胞から生産された抗体を収集すること を上記抗体プローブによってつくられた、或る病原体に
対する少なくとも一つ以上の抗体を含む抗体プローブと
、 攻撃に対して最も敏感であると考えられる発育段階にお
いて病原体から採取した試料とを準備することを包含す
る。
抗原を製造するための方法が提供されるが、この方法は 或る免疫動物からこの動物が或る病原体又６ は病原体抽出物の接種を受けた後短時間のうちに採集し
た生物学的試料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これらの細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そ
して これら細胞から生産された抗体を収集すること を上記抗体プローブによってつくられた、或る病原体に
対する少なくとも一つ以上の抗体を含む抗体プローブと
、 攻撃に対して最も敏感であると考えられる発育段階にお
いて病原体から採取した試料とを準備することを包含す
る。
試料の採取される病原体は、この病原体の発育において
最も攻撃を受けやすいと考えられる段階において採取す
ることができる。例えば寄生的多節条虫の感染＋につい
ては試料をそのオンコスフェラの段階から採取するのが
好適である。
最も攻撃を受けやすいと考えられる段階において採取す
ることができる。例えば寄生的多節条虫の感染＋につい
ては試料をそのオンコスフェラの段階から採取するのが
好適である。
寄生体感染のオンコスフェラ段階において存在する各種
抗原は例えば多節条虫によるメタセスト７ ダ（ｍｅｔ；ａｃｅｓｌ；ｏｄｅ１段階においては存在
しないということが見出されている。寄生１敷による感
染ついてはこの試料を幼生、好ましくは後期幼生段階か
ら採取するのが適している。感染性寄生吸虫については
試料を幼若吸虫段階から採取するのが適している。
抗原は例えば多節条虫によるメタセスト７ ダ（ｍｅｔ；ａｃｅｓｌ；ｏｄｅ１段階においては存在
しないということが見出されている。寄生１敷による感
染ついてはこの試料を幼生、好ましくは後期幼生段階か
ら採取するのが適している。感染性寄生吸虫については
試料を幼若吸虫段階から採取するのが適している。
病原体の試料は標準緩衝溶液と混合して例えば５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲルのような標準的支持材の上に置
いて、その中に含まれている各種蛋白質を分離させるこ
とができる。それら分離された蛋白質は次にニトロセル
ローズ、ナイロン又はその他でできたシートの上に移す
ことができる。
ポリアクリルアミドゲルのような標準的支持材の上に置
いて、その中に含まれている各種蛋白質を分離させるこ
とができる。それら分離された蛋白質は次にニトロセル
ローズ、ナイロン又はその他でできたシートの上に移す
ことができる。
適当な抗体によるブロービングは更に、それにより形成
された生成物を検出操作にかけることを包含することが
できる。この検出操作はウェスタンプロット法を包含す
る。この検出方法は免疫沈殿法、ラジオ免疫検出法、酵
素結合免疫検出法又は免疫蛍光検出法であることができ
る。
された生成物を検出操作にかけることを包含することが
できる。この検出操作はウェスタンプロット法を包含す
る。この検出方法は免疫沈殿法、ラジオ免疫検出法、酵
素結合免疫検出法又は免疫蛍光検出法であることができ
る。
上述のようにして作られた少なくとも一つ以上８
の抗体はその培養培地から単に収集された上澄液の形で
用いることができる。また、各抗体を分離し、精製する
ことも可能である。
用いることができる。また、各抗体を分離し、精製する
ことも可能である。
上述のように分離された抗原はいかなる適当な分析技術
によってでち検出することができる。
によってでち検出することができる。
本発明の更にもう一つの好ましい態様においで、その培
養培地中に含まれている抗体は抗原のアフィニティー精
製、好ましくは免疫アフィニティー精製のために使用す
ることができる。
養培地中に含まれている抗体は抗原のアフィニティー精
製、好ましくは免疫アフィニティー精製のために使用す
ることができる。
従って好ましい態様の一つにおいて本発明によれば抗原
を精製する方法が提供され、この方法は、抗原を精製す
るにあたり、 粗抗原混合物と 適当な支持材の上で固定された、或る病原体に対する抗
体と を準備し、その際この抗体は下記の方法、すなわち 或る病原体又は病原体抽出物に感染しているか又はこれ
を接種した動物から生物学的試料を準備し、 ９ この生物学的試料から細胞を分離し、 これらの細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そ
して これら細胞から生産された抗体を収集すること を上記抗体プローブによって作られたちのであり、上記
粗抗原混合物を上記固定された抗体を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーにかけ、そして そのようにして形成された精製抗原を分離すること を包含する。
を精製する方法が提供され、この方法は、抗原を精製す
るにあたり、 粗抗原混合物と 適当な支持材の上で固定された、或る病原体に対する抗
体と を準備し、その際この抗体は下記の方法、すなわち 或る病原体又は病原体抽出物に感染しているか又はこれ
を接種した動物から生物学的試料を準備し、 ９ この生物学的試料から細胞を分離し、 これらの細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そ
して これら細胞から生産された抗体を収集すること を上記抗体プローブによって作られたちのであり、上記
粗抗原混合物を上記固定された抗体を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーにかけ、そして そのようにして形成された精製抗原を分離すること を包含する。
抗体は培養上澄液プローブから通常の種々の方法で得る
ことができる。例えば血清や血漿から免疫グロブリン類
を精製するのに通常用いられる、例えば、硫酸アンモニ
ウムによる沈殿法、カプリンＡに結合させ、溶離させる
分画法を用いることができる。そのようにして得られた
抗体は次に適 ０ 当な支持材、例えばＣＮＢｒで活性化させたセファロー
ズ４ Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） 、Ａｆｆｉ−Ｇ
ｅｌ （Ｂｉｏ ＲＡＤ社）又はその他の種々の蛋白質
を結合させることのできるアフィニティークロマトグラ
フィー支持材等に結合させることができる。
ことができる。例えば血清や血漿から免疫グロブリン類
を精製するのに通常用いられる、例えば、硫酸アンモニ
ウムによる沈殿法、カプリンＡに結合させ、溶離させる
分画法を用いることができる。そのようにして得られた
抗体は次に適 ０ 当な支持材、例えばＣＮＢｒで活性化させたセファロー
ズ４ Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） 、Ａｆｆｉ−Ｇ
ｅｌ （Ｂｉｏ ＲＡＤ社）又はその他の種々の蛋白質
を結合させることのできるアフィニティークロマトグラ
フィー支持材等に結合させることができる。
固定した抗体は次に、複雑な寄生体抽出物からアフィニ
ティークロマトグラフィーによるそれぞれの抗原の分画
及び精製操作に適用することができる。固定した抗体に
抗原を結合させた後に未結合の巨大分子種はその固体支
持材から例えば１．５ＭＮａＣｌ を含む緩衝液等に
よって洗浄除去することができる。次いでその抗原は例
えば０．５−３．０Ｍのチオシアン酸ナトリウムのよう
な、カオトロピックイオンの含まれた低ｐＨ又は高ｐＨ
の緩衝液等によりアフィニティーカラムから溶出させる
ことができる。
ティークロマトグラフィーによるそれぞれの抗原の分画
及び精製操作に適用することができる。固定した抗体に
抗原を結合させた後に未結合の巨大分子種はその固体支
持材から例えば１．５ＭＮａＣｌ を含む緩衝液等に
よって洗浄除去することができる。次いでその抗原は例
えば０．５−３．０Ｍのチオシアン酸ナトリウムのよう
な、カオトロピックイオンの含まれた低ｐＨ又は高ｐＨ
の緩衝液等によりアフィニティーカラムから溶出させる
ことができる。
この抗体プローブをアフィニティークロマトグラフィー
に適用することによって、特定抗原の充分な量が生物化
学的キャラクタリゼーション、アミノ酸配列決定及び限
定的防御の研究のために動１ 物にワクチン接種するために、複雑な粗抽出混合物から
迅速に分離されることを可能にする。抗原を得るために
アフィニティークロマトグラフィを用いることは、通常
の生化学的方法をまったく又は殆どデータが知られてい
ない抗原の精製に適用した場合にしばしば遭遇する種々
の難点を排除させる。これはまた「分析的」アフィニテ
ィークロマトグラフィーの目的のためにポリクローナル
抗体又はモノクローナル抗体を培養する必要もなくす。
に適用することによって、特定抗原の充分な量が生物化
学的キャラクタリゼーション、アミノ酸配列決定及び限
定的防御の研究のために動１ 物にワクチン接種するために、複雑な粗抽出混合物から
迅速に分離されることを可能にする。抗原を得るために
アフィニティークロマトグラフィを用いることは、通常
の生化学的方法をまったく又は殆どデータが知られてい
ない抗原の精製に適用した場合にしばしば遭遇する種々
の難点を排除させる。これはまた「分析的」アフィニテ
ィークロマトグラフィーの目的のためにポリクローナル
抗体又はモノクローナル抗体を培養する必要もなくす。
しかしながら大規模に製造するためにはポリクローナル
抗体又はモノクローナル抗体を作ることが必要となるで
あろう。
抗体又はモノクローナル抗体を作ることが必要となるで
あろう。
そのように分離された抗原はモノクローナル抗体の調製
に使用することができる。モノクローナル抗体は上述し
た疾病の受動的処置の基礎をなすことができる。抗原が
同定されてしまったならばこの抗原の無制限の量を製造
するため、分子生物学的又は化学的技術、例えばクロー
ニング技術を用いることができ、又はそれに代えてその
同定された抗原のいろいろ異なった断片に相当する合成
２ ペプチドをワクチン製造のための手段として用いること
ができる。
に使用することができる。モノクローナル抗体は上述し
た疾病の受動的処置の基礎をなすことができる。抗原が
同定されてしまったならばこの抗原の無制限の量を製造
するため、分子生物学的又は化学的技術、例えばクロー
ニング技術を用いることができ、又はそれに代えてその
同定された抗原のいろいろ異なった断片に相当する合成
２ ペプチドをワクチン製造のための手段として用いること
ができる。
従って本発明の好ましい態様の一つにおいて、或る一つ
の病原体に対する抗原性合成ポリペプチドを調製する方
法が提供され、この方法は、或る病原体の試料から引き
出されたｃＤＮＡライブラリ又はゲノムライブラリから
合成されたポリペプチド及び 前述した抗体プローブ、これから導かれたモノクローナ
ル抗体又はその誘導体よりなる群から選ばれた抗体プロ
ーブ を準備し、 上記ｃＤＮＡライブラリ又はゲノムライブラリからの合
成ポリペプチドを上記抗体プローブによってプローブし
、 それにより検出された抗原性合成ポリペプチドを分離す
る ことを包含する。
の病原体に対する抗原性合成ポリペプチドを調製する方
法が提供され、この方法は、或る病原体の試料から引き
出されたｃＤＮＡライブラリ又はゲノムライブラリから
合成されたポリペプチド及び 前述した抗体プローブ、これから導かれたモノクローナ
ル抗体又はその誘導体よりなる群から選ばれた抗体プロ
ーブ を準備し、 上記ｃＤＮＡライブラリ又はゲノムライブラリからの合
成ポリペプチドを上記抗体プローブによってプローブし
、 それにより検出された抗原性合成ポリペプチドを分離す
る ことを包含する。
ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリを使用することができる
。このｃＤＮＡ又はゲノムライブラリは転写及び引き続
く、原核生物性宿主（例えばバクテリア）中又は真核生
物性宿主（例えば哺乳動物細胞）の中にそのクローンＤ
ＮＡを発現させることのできるような適当な発現ベクタ
ーの中に組み込むことができる。それらのプローブは好
ましくは下記、すなわち イ）上述のように同定され且つ精製された抗原のアミノ
酸配列に基づく合成オリゴヌクレオチドプローブ ロ）上述のように作り出された培養培地から得られた種
々の抗体類 ハ）上述のように同定され且つ精製された抗原に対して
作り出されたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗
体 二）例えばＷａｒｄ、らにより °’Ｎａｔｕｒｅ”
２４１．５４４５４６頁 （１９８９１に記述されてい
るような、その抗原に対する特異性を有する組換え体又
は合成斡モノクローナル抗体或はポリペプチド類 から選ぶことができる。
。このｃＤＮＡ又はゲノムライブラリは転写及び引き続
く、原核生物性宿主（例えばバクテリア）中又は真核生
物性宿主（例えば哺乳動物細胞）の中にそのクローンＤ
ＮＡを発現させることのできるような適当な発現ベクタ
ーの中に組み込むことができる。それらのプローブは好
ましくは下記、すなわち イ）上述のように同定され且つ精製された抗原のアミノ
酸配列に基づく合成オリゴヌクレオチドプローブ ロ）上述のように作り出された培養培地から得られた種
々の抗体類 ハ）上述のように同定され且つ精製された抗原に対して
作り出されたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗
体 二）例えばＷａｒｄ、らにより °’Ｎａｔｕｒｅ”
２４１．５４４５４６頁 （１９８９１に記述されてい
るような、その抗原に対する特異性を有する組換え体又
は合成斡モノクローナル抗体或はポリペプチド類 から選ぶことができる。
従って本発明の更に別な態様において、或る病原体に対
する防御抗原が提供され、このちのは或る病原体又は病
原体抽出物に感染しているか叉はこれを接神した動物か
ら生物学的試料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これらの細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そ
して これら細胞から生産された抗体を収集すること によってつくられた、或る病原体に対する少なくとも一
つ以上の抗体を含む抗体プローブと、 病原体の試料と を準備することを上記抗体プローブによって作られる。
する防御抗原が提供され、このちのは或る病原体又は病
原体抽出物に感染しているか叉はこれを接神した動物か
ら生物学的試料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これらの細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そ
して これら細胞から生産された抗体を収集すること によってつくられた、或る病原体に対する少なくとも一
つ以上の抗体を含む抗体プローブと、 病原体の試料と を準備することを上記抗体プローブによって作られる。
これらの防御抗原は以下に記述するように診断用抗原と
して機能することができる。
して機能することができる。
従って本発明の好ましい態様の一つにおいて、以下に記
述するように、２５キロダルトンと３４キロダルトンと
の各近似的分子量を有する抗原から選ばれた、Ｔａｅｎ
ｉａ ｌ＋ｙｄａｔｉｇｅｎａ による感染に５ 対する防御抗原が提供される。種々の多節条虫の間の交
叉防御は既に説明されているので、類似の抗原が、例え
ばＴ、 ｓａ １ｎａｔａ、 Ｔ、 ｏｖｉｓ、Ｉ゛
ｓｏｄｉｕｍ、 Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａ
ｎｕｌｏｓｕｓ のような他の多節条虫抽においてち
検出することができるであろう。
述するように、２５キロダルトンと３４キロダルトンと
の各近似的分子量を有する抗原から選ばれた、Ｔａｅｎ
ｉａ ｌ＋ｙｄａｔｉｇｅｎａ による感染に５ 対する防御抗原が提供される。種々の多節条虫の間の交
叉防御は既に説明されているので、類似の抗原が、例え
ばＴ、 ｓａ １ｎａｔａ、 Ｔ、 ｏｖｉｓ、Ｉ゛
ｓｏｄｉｕｍ、 Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａ
ｎｕｌｏｓｕｓ のような他の多節条虫抽においてち
検出することができるであろう。
本発明の別なもう一つの好ましい態様において、以下に
記述するように、Ｈａ ｅ ｍ ｏ ｎ ｃ ｈ ｕ
ｓ ｃ ｏ ｎｔ ｏ ｒ ｔ ＩＩ Ｓ にする感
染に対する、近似的分子量６７ないし７５キ、ロダルト
ンを有する防御抗原が提供される。
記述するように、Ｈａ ｅ ｍ ｏ ｎ ｃ ｈ ｕ
ｓ ｃ ｏ ｎｔ ｏ ｒ ｔ ＩＩ Ｓ にする感
染に対する、近似的分子量６７ないし７５キ、ロダルト
ンを有する防御抗原が提供される。
本発明の更にもう一つの好ましい態様において、以下に
記述するように、Ｆａｓｃｉｏｌａ １ｌｅｐａｔｊｃ
ａの感染に対する、近似的分子量１２０ないし１２５キ
ロダルトンを有する防御抗原が提供される。
記述するように、Ｆａｓｃｉｏｌａ １ｌｅｐａｔｊｃ
ａの感染に対する、近似的分子量１２０ないし１２５キ
ロダルトンを有する防御抗原が提供される。
本発明の更に別なもう一つの好ましい態様において、以
下に記述するように、 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ の感染に対
する、近似的分子量３８ない、し４０キロダルトンを有
する防御抗 ６ 原が提供される。この抗原は蛋白質抗原の１種である。
下に記述するように、 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ の感染に対
する、近似的分子量３８ない、し４０キロダルトンを有
する防御抗 ６ 原が提供される。この抗原は蛋白質抗原の１種である。
従って本発明の更に別な態様の一つにおいて、或る一つ
の病原体の抗原に投与することを含む、動物を製造する
ための方法が提供されるが、この方法は 上記抗原に対する抗体を産生ずることかでき且つ上述し
たように上記病原体に対する防御抗原で免疫された動物
から得られるＢ細胞と 或る骨髄腫細胞とを 準備し、 上記Ｂ細胞を」１記骨髄腫細胞と融合させ、それにより
形成されたハイブリドーマを増殖させ、そして 上記ハイブリドーマにより産生された抗体を採集するこ
と を包含する。
の病原体の抗原に投与することを含む、動物を製造する
ための方法が提供されるが、この方法は 上記抗原に対する抗体を産生ずることかでき且つ上述し
たように上記病原体に対する防御抗原で免疫された動物
から得られるＢ細胞と 或る骨髄腫細胞とを 準備し、 上記Ｂ細胞を」１記骨髄腫細胞と融合させ、それにより
形成されたハイブリドーマを増殖させ、そして 上記ハイブリドーマにより産生された抗体を採集するこ
と を包含する。
本発明のなお別なもう一つの態様において、種々の動物
の疾病を防止する方法が提供されるが、 ７ この方法は」１記の方法で作られた少なくとも一つの防
御抗原の、治療的に有効な量を動物に投与することを含
む。好ましくはこの防御抗原は上記の５ｅｕｄｏｔｕｂ
ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ よりなる群から選ばれる病原体
に対する抗原である。
の疾病を防止する方法が提供されるが、 ７ この方法は」１記の方法で作られた少なくとも一つの防
御抗原の、治療的に有効な量を動物に投与することを含
む。好ましくはこの防御抗原は上記の５ｅｕｄｏｔｕｂ
ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ よりなる群から選ばれる病原体
に対する抗原である。
本発明のなお別な態様において、種々の動物における疾
病を処置する方法が提供されるがこれは、上記のように
作られた防御抗原に投与することを含む、動物の、治療
的に有効な量を動物に投与することを含む。
病を処置する方法が提供されるがこれは、上記のように
作られた防御抗原に投与することを含む、動物の、治療
的に有効な量を動物に投与することを含む。
本発明は更に、以下に記述するように、Ｔａｅｎｉａｃ
ｕｌｏｓｉｓよりなる群から選ばれた病原体に対する、
少なくとも一つ以上の防御抗原の、予防的に有効な量を
含むワクチン組成物を提供する。
ｕｌｏｓｉｓよりなる群から選ばれた病原体に対する、
少なくとも一つ以上の防御抗原の、予防的に有効な量を
含むワクチン組成物を提供する。
本発明はまた更に、上記のように作られた少なくとも一
つ以上のモノクローナル抗体の治療上有８ 効な量を含むワクチン又は獣医学的組成物を提供する。
つ以上のモノクローナル抗体の治療上有８ 効な量を含むワクチン又は獣医学的組成物を提供する。
本発明に従うワクチン又は獣医学的組成物は経口的に、
又は非経口的に（例えば筋肉内注射、皮下注射又は静脈
注射等により）投与することができる。必要な量はその
活性成分の抗原活性に従って変化するが、存在している
ワクチンの典型的な免疫応答を誘発するのに充分な量だ
けを必要とするのみである。
又は非経口的に（例えば筋肉内注射、皮下注射又は静脈
注射等により）投与することができる。必要な量はその
活性成分の抗原活性に従って変化するが、存在している
ワクチンの典型的な免疫応答を誘発するのに充分な量だ
けを必要とするのみである。
反応性試験を行なうことによって必要な量は容易に決定
することができる。ワクチン組成物や獣医学的組成物の
典型的な初期投与量は体重１ ｋｇ当たり約０．００］
−１ｍｇ の活性成分の範囲であることができる。
することができる。ワクチン組成物や獣医学的組成物の
典型的な初期投与量は体重１ ｋｇ当たり約０．００］
−１ｍｇ の活性成分の範囲であることができる。
投与率は所望の防御水準をもたらすのに要求される量に
より増加し、又は多重投与を採用することができる。
より増加し、又は多重投与を採用することができる。
本発明に従うワクチン又は獣医学的組成物はまた史に、
獣医学的に受容性のある担体、稀釈剤又はそれの賦形剤
を含むことができる。好ましくは活性成分は担体の中に
懸濁させるか又は溶解させ９ ることかできる。担体は動物に対して無毒であって活性
成分と相容性を有するいかなる固体又は溶媒であっても
よい。適当な担体は、例えば通？＋ｌ； ０）塩類及び
生理学的濃度又はその近傍において、１１（毒な他の無
毒性塩類のような液体担体やタルク又はシュクローズの
ような固体の担体を包含する。例えばフロイント完余丁
シュバンド又はフロイント不完余丁シュバンドのような
補助剤、或は例えばシトキン類のような免疫モジュレー
タを所望の場合にそのみ抗原の抗原活性を高めるために
加えることができる。気管を介して投与するのに使用す
る場合にはワクチンはエアゾールの形で存在するのが適
している。
獣医学的に受容性のある担体、稀釈剤又はそれの賦形剤
を含むことができる。好ましくは活性成分は担体の中に
懸濁させるか又は溶解させ９ ることかできる。担体は動物に対して無毒であって活性
成分と相容性を有するいかなる固体又は溶媒であっても
よい。適当な担体は、例えば通？＋ｌ； ０）塩類及び
生理学的濃度又はその近傍において、１１（毒な他の無
毒性塩類のような液体担体やタルク又はシュクローズの
ような固体の担体を包含する。例えばフロイント完余丁
シュバンド又はフロイント不完余丁シュバンドのような
補助剤、或は例えばシトキン類のような免疫モジュレー
タを所望の場合にそのみ抗原の抗原活性を高めるために
加えることができる。気管を介して投与するのに使用す
る場合にはワクチンはエアゾールの形で存在するのが適
している。
本発明の更にもう一つの態様において、」二連のように
同定され精製された病原体に対する診断性抗原の含まれ
た診断用キットが提供される。このｓｉｓによるものを
含む感染を検出するのに用いる ０ ことができる。
同定され精製された病原体に対する診断性抗原の含まれ
た診断用キットが提供される。このｓｉｓによるものを
含む感染を検出するのに用いる ０ ことができる。
［実施例１
以下に本発明を実施例によって更に詳細に説明する。し
かしながら以下の記述は単に説明だけのためにあげるも
のであって、以上に記述した本発明の一般的な普遍性を
いかなる態様においても制限するちのでないことを理解
すべきである。
かしながら以下の記述は単に説明だけのためにあげるも
のであって、以上に記述した本発明の一般的な普遍性を
いかなる態様においても制限するちのでないことを理解
すべきである。
実施例１
Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓＩＩ ａ
ｅ ｍ ｏ ｎ ｃ ｂ ｕ ｓ ｃ ｏ ｎ ｔ；
ｏ ｒ ｔ； ｕ ｓ は羊の腸管内の寄生虫であ
ってアポマスム（第４胃袋）の中に極在する。この寄生
虫の後期幼生段階及び成虫段階のものは全血によって成
育する。この寄生体はオーストラリアにおける羊産業に
おいてかなりの経済的損失の原因となっており、そして
海外における著しい損失の原因であって死に至りつる疾
病である。このような種々の損害にもかかわらず従来技
術においてはこの寄生体に対して効果的なワクチンはま
だ開発されていない。
ｅ ｍ ｏ ｎ ｃ ｂ ｕ ｓ ｃ ｏ ｎ ｔ；
ｏ ｒ ｔ； ｕ ｓ は羊の腸管内の寄生虫であ
ってアポマスム（第４胃袋）の中に極在する。この寄生
虫の後期幼生段階及び成虫段階のものは全血によって成
育する。この寄生体はオーストラリアにおける羊産業に
おいてかなりの経済的損失の原因となっており、そして
海外における著しい損失の原因であって死に至りつる疾
病である。このような種々の損害にもかかわらず従来技
術においてはこの寄生体に対して効果的なワクチンはま
だ開発されていない。
寄生 び 駆動物
１
第３幼生段階（Ｌ、）のＩｌ、 ｃｏｎｌ、ｏｒｌ；ｕ
ｓをこの寄生体で実験的に感染させたドナー羊の糞便の
培養物から捕集した。羊にＨ、ｃ ｏ ｎ ｔ ｏ ｒ
ｔ ｕ ｓ幼生を繰り返し感染させて糞便中に出てく
る卵の数を検査することによって免疫動物を得た。その
ような実験投与によって糞便中に卵が見出されなくなっ
たときにその動物は鬼疫にｋったとした。鬼疫になった
ならばその羊を５０．０００ないし２００．０００
個のり、幼生により感染させる前に少なくとも４週間放
置し、そしてこの強制感染の後５日後に屠殺した。
ｓをこの寄生体で実験的に感染させたドナー羊の糞便の
培養物から捕集した。羊にＨ、ｃ ｏ ｎ ｔ ｏ ｒ
ｔ ｕ ｓ幼生を繰り返し感染させて糞便中に出てく
る卵の数を検査することによって免疫動物を得た。その
ような実験投与によって糞便中に卵が見出されなくなっ
たときにその動物は鬼疫にｋったとした。鬼疫になった
ならばその羊を５０．０００ないし２００．０００
個のり、幼生により感染させる前に少なくとも４週間放
置し、そしてこの強制感染の後５日後に屠殺した。
■“養土澄液の調−“
感染の領域（アポマスム）に通じているこの胃袋のリン
パ節を取り出し、そして細胞懸濁液を下記のＴ、 Ｈｙ
ｄａｔｉｇｅｎ’ａ について記述するように調製し
た。 １０−５０ ｒ＋＋Ｊ２のバルク培養物を培養フ
ラスコ（Ｍｉｌｅｓｌ の中て培養培地１ｍｆｆあた
り２４ Ｘ １０６個の細胞濃度で作った。予備実験に
よって、その培養物の上澄液中の抗体の大部分がその生
体内で刺激されたリンパ節中に存在する抗原分２ 泌性細胞によって作り出されたこと、及びこれがアメリ
カやまごぼうマイトジェン（ＰＷＭ）での刺激によって
それ以上増加しないことが確認された。ＰＷＭは従って
この培養から削除し、そして培養上澄液を５％Ｃ０２の
雰囲気中で３７℃において細胞を５日間培養した後に収
集し、そして使用するまで一２０℃において貯蔵した。
パ節を取り出し、そして細胞懸濁液を下記のＴ、 Ｈｙ
ｄａｔｉｇｅｎ’ａ について記述するように調製し
た。 １０−５０ ｒ＋＋Ｊ２のバルク培養物を培養フ
ラスコ（Ｍｉｌｅｓｌ の中て培養培地１ｍｆｆあた
り２４ Ｘ １０６個の細胞濃度で作った。予備実験に
よって、その培養物の上澄液中の抗体の大部分がその生
体内で刺激されたリンパ節中に存在する抗原分２ 泌性細胞によって作り出されたこと、及びこれがアメリ
カやまごぼうマイトジェン（ＰＷＭ）での刺激によって
それ以上増加しないことが確認された。ＰＷＭは従って
この培養から削除し、そして培養上澄液を５％Ｃ０２の
雰囲気中で３７℃において細胞を５日間培養した後に収
集し、そして使用するまで一２０℃において貯蔵した。
養土澄液による抗原の 段 毎の確認
＋ｔ、 ｃｏｎｔｏｒｔ、ｕｓの第３幼生段階のものを
３７℃において１０分間０．０５％濃度の次亜塩素酸ナ
トリウム中で脱鞘して第２段階の翅鞘を除いた。それら
の幼生を次に燐酸塩緩衝したｐＨ７，４の塩水溶液（Ｐ
ＢＳ）の中で繰り返し洗浄し、そして３０００ Ｇ
の加速度において １０分間遠心分離した。第６回目の
洗浄の後でそれらを２００μ７ｍ１ｌのペニシリン及び
０．２μｇ／ｍ １２のストレプトマイシンの存在の
ちとにｐｎ ６．８のＤＭＥ培地５００ｍ、９に移し、
そして空気中で２０％のＧＯ□ とともに３９℃におい
て５日間培養した。培養培地を次に２０℃において １
５分間３０００ Ｇの加速度で遠心３ 分離した。Ｌ３、試験管中で変化したＬ４及び成虫にな
った寄生体を取り出してテフロン乳棒とすりガラス管と
を用いて０．１％ＩＥｍｐｊｇｅｎ 両性イオン性洗
剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ 社）の存在のもとにＰＢ
Ｓ及び５ミリモルのフェニルメチルスルホニルフルオラ
イド（ＰＭＳＦ）の中で４°Ｃにおいて２［）分間機械
的に均質混合した。この幼生均質混合物を直ちに幾つか
の分画に分割して一７０°Ｃにおいて貯蔵した。その凍
結した幾つかの分画を解凍し、ＳＤＳ非還元性試料緩衝
液でｌ：ｌの割合で混合し、そして５分間斉沸した後５
０００ Ｇにおいて２分間遠心分離し、そしてＬａｅｍ
ｍｌｉ （１９７０）の方法に従って１２．５％ ５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）
の上に流した。次にこのゲルを電気泳動的にニトロセル
ローズ［Ｋｅｒｌ、ｅｒｏ ｄｅＲｏｓｂｏら （１９
８４１］へ移し、そして免疫後感染させ、又は強制感染
なく免疫になっていた羊のアポマスムのリンパ節細胞か
らの培養上澄液又は血清によりプローブした。ウェスタ
ンプロットをＰＢＳ中の０．５％濃度Ｔｗｅｅｎ ２０
によってプロワ ４ りし、そして洗浄は全てＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０の中で行なった。第２抗体はホースラジッシュベ
ルオキシダーゼ（ＤＡＫＯ社）に結合させた兎の抗羊免
疫グロブリンであり、これは次に３．３ジアミノベンチ
ジン（Ｓｉｇｍａ社）及び過酸化水素によって現像した
。
３７℃において１０分間０．０５％濃度の次亜塩素酸ナ
トリウム中で脱鞘して第２段階の翅鞘を除いた。それら
の幼生を次に燐酸塩緩衝したｐＨ７，４の塩水溶液（Ｐ
ＢＳ）の中で繰り返し洗浄し、そして３０００ Ｇ
の加速度において １０分間遠心分離した。第６回目の
洗浄の後でそれらを２００μ７ｍ１ｌのペニシリン及び
０．２μｇ／ｍ １２のストレプトマイシンの存在の
ちとにｐｎ ６．８のＤＭＥ培地５００ｍ、９に移し、
そして空気中で２０％のＧＯ□ とともに３９℃におい
て５日間培養した。培養培地を次に２０℃において １
５分間３０００ Ｇの加速度で遠心３ 分離した。Ｌ３、試験管中で変化したＬ４及び成虫にな
った寄生体を取り出してテフロン乳棒とすりガラス管と
を用いて０．１％ＩＥｍｐｊｇｅｎ 両性イオン性洗
剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ 社）の存在のもとにＰＢ
Ｓ及び５ミリモルのフェニルメチルスルホニルフルオラ
イド（ＰＭＳＦ）の中で４°Ｃにおいて２［）分間機械
的に均質混合した。この幼生均質混合物を直ちに幾つか
の分画に分割して一７０°Ｃにおいて貯蔵した。その凍
結した幾つかの分画を解凍し、ＳＤＳ非還元性試料緩衝
液でｌ：ｌの割合で混合し、そして５分間斉沸した後５
０００ Ｇにおいて２分間遠心分離し、そしてＬａｅｍ
ｍｌｉ （１９７０）の方法に従って１２．５％ ５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドミニゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）
の上に流した。次にこのゲルを電気泳動的にニトロセル
ローズ［Ｋｅｒｌ、ｅｒｏ ｄｅＲｏｓｂｏら （１９
８４１］へ移し、そして免疫後感染させ、又は強制感染
なく免疫になっていた羊のアポマスムのリンパ節細胞か
らの培養上澄液又は血清によりプローブした。ウェスタ
ンプロットをＰＢＳ中の０．５％濃度Ｔｗｅｅｎ ２０
によってプロワ ４ りし、そして洗浄は全てＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０の中で行なった。第２抗体はホースラジッシュベ
ルオキシダーゼ（ＤＡＫＯ社）に結合させた兎の抗羊免
疫グロブリンであり、これは次に３．３ジアミノベンチ
ジン（Ｓｉｇｍａ社）及び過酸化水素によって現像した
。
幼生の抗原は、免疫−感染の羊からの培養上澄液でプロ
ーブしたところ、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの試験管中で
培養した第４段階の幼生（Ｌ４）及び第３段階（Ｌ３）
の脱鞘した幼生中で約６７−７５ キロダルトン（Ｋ
ｄ）の間で検出された（第１図）。
ーブしたところ、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの試験管中で
培養した第４段階の幼生（Ｌ４）及び第３段階（Ｌ３）
の脱鞘した幼生中で約６７−７５ キロダルトン（Ｋ
ｄ）の間で検出された（第１図）。
成虫Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓの調製物については上述の分
子量において抗原は確認されなかった（データは後に示
す）。非強制感染−免疫の羊からの上澄液を各プロット
（図示せず）のプローブに用いたときは反応がなく、こ
のことは免疫−感染の羊の培養上澄液中に作り出された
全ての抗体が５日間の生体内感染テストによって誘発さ
れたものであったことを示している。同一の動物から同
時に採取した血清によるウェスタンプロットの同様なプ
ロー５ ピングを全３つの寄生体段階において幾つかのバンドで
反応させたけれども６７−７５ Ｋｄの抗体を検出され
なかった（図示しない）。また、培養上澄液の場合に反
し、免疫−感染の羊の血清と免疫非強制感染の羊の血清
との間にはなんらの差異も見出すことができなかった。
子量において抗原は確認されなかった（データは後に示
す）。非強制感染−免疫の羊からの上澄液を各プロット
（図示せず）のプローブに用いたときは反応がなく、こ
のことは免疫−感染の羊の培養上澄液中に作り出された
全ての抗体が５日間の生体内感染テストによって誘発さ
れたものであったことを示している。同一の動物から同
時に採取した血清によるウェスタンプロットの同様なプ
ロー５ ピングを全３つの寄生体段階において幾つかのバンドで
反応させたけれども６７−７５ Ｋｄの抗体を検出され
なかった（図示しない）。また、培養上澄液の場合に反
し、免疫−感染の羊の血清と免疫非強制感染の羊の血清
との間にはなんらの差異も見出すことができなかった。
アフィニティー 製のためのＬ４抗原の製造試験管中で
スイッチしたＬ４幼生を、 ｐｌ＋８．０の０．１ Ｍ
トリスと５ｍＭＰＭＳＦとの中で００５％Ｅｐｍｐｉ
ｇｅｎ の存在のもとに氷の」二で３０秒間にわたり
ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織ホモジナイザにより剪断するこ
とによって、アフィニティー精製用の粗製の抗原をつく
った。Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ処理の後でＳＤＳを最終濃度が
２％になるように加え、そして試料をつオータパス中で
３分間煮沸し、次いで４°Ｃにおいて ３５０００ｒｐ
ｍで３０分間遠心分離した。遠２心分離の後にＳＤＳを
、Ｉｆ ｅ ｎ ｄ ｅ ｒ ｓ ｏ ｎ、Ｏｒ ｏ
ｓ ｚ Ｉ ａ ｎ及びＫｏｎｉｇｓｂｅｒｇ （１９
７９１によって記述された「方法Ａ」に従い蛋白質を沈
殿させることにより、−に澄液から除去した。ＳＤＳ除
去の後に蛋白質沈殿に ６ ７モルの塩酸グアニジン（ＩＯ２社）を加え、そして氷
の」二で５時間保った。蒸留水中の２５％濃度グリセロ
ール液の同容積を加え、そして全試料をｐＨ７，４のＰ
ＢＳ及び０．０５％Ｅｍｐｉｇｅｎに対して透析した。
スイッチしたＬ４幼生を、 ｐｌ＋８．０の０．１ Ｍ
トリスと５ｍＭＰＭＳＦとの中で００５％Ｅｐｍｐｉ
ｇｅｎ の存在のもとに氷の」二で３０秒間にわたり
ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織ホモジナイザにより剪断するこ
とによって、アフィニティー精製用の粗製の抗原をつく
った。Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ処理の後でＳＤＳを最終濃度が
２％になるように加え、そして試料をつオータパス中で
３分間煮沸し、次いで４°Ｃにおいて ３５０００ｒｐ
ｍで３０分間遠心分離した。遠２心分離の後にＳＤＳを
、Ｉｆ ｅ ｎ ｄ ｅ ｒ ｓ ｏ ｎ、Ｏｒ ｏ
ｓ ｚ Ｉ ａ ｎ及びＫｏｎｉｇｓｂｅｒｇ （１９
７９１によって記述された「方法Ａ」に従い蛋白質を沈
殿させることにより、−に澄液から除去した。ＳＤＳ除
去の後に蛋白質沈殿に ６ ７モルの塩酸グアニジン（ＩＯ２社）を加え、そして氷
の」二で５時間保った。蒸留水中の２５％濃度グリセロ
ール液の同容積を加え、そして全試料をｐＨ７，４のＰ
ＢＳ及び０．０５％Ｅｍｐｉｇｅｎに対して透析した。
次にこの試料をアフィニティーカラムに送り込んだ。
抗原のアフィニティー精製
プロティンＧセファローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫ
口）及びＡｆｆｉ−ｐｒｅｐ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ 社
）と結合させたろばの抗羊抗体（Ｄａｋｏ 社）を用
いてメーカの仕様に従い上記免疫−感染の羊の培養上澄
液から最初に各抗体を除去することによって特定の抗原
を分離するようにアフィニティーカラムを構成した。づ
−なわち、まず上記精製抗体をメーカの仕様に従いＡｆ
ｆｉ−ｐｒｅｐ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ 社）に結合させ
、そしてこのカラムをＰＢＳ及び０．０５％Ｅｍｐｉｇ
ｅｎ洗剤の中で平衡化させた。
口）及びＡｆｆｉ−ｐｒｅｐ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ 社
）と結合させたろばの抗羊抗体（Ｄａｋｏ 社）を用
いてメーカの仕様に従い上記免疫−感染の羊の培養上澄
液から最初に各抗体を除去することによって特定の抗原
を分離するようにアフィニティーカラムを構成した。づ
−なわち、まず上記精製抗体をメーカの仕様に従いＡｆ
ｆｉ−ｐｒｅｐ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ 社）に結合させ
、そしてこのカラムをＰＢＳ及び０．０５％Ｅｍｐｉｇ
ｅｎ洗剤の中で平衡化させた。
各Ｉ−４抗原を上記のアフィニティーカラムにチャージ
し、そして結合しなかった蛋白質はｐＨ７゜４の０．５
Ｍ Ｍａｉｌ 及び０．０５％Ｅｍｐｉｇｅｎを用
いて ７ 除去した。結合された蛋白質はＰＢＳ中の１ＭＮ１１４
ＳＣＮ （Ａｊａｘ 社）を用いて溶離させた。溶離
液は０Ｄ２８ｏ によってモニターした。溶離の後で
試料をｐＨ８，３の０．００５ Ｍ ＋−リスに対し
でてきるだけ充分に透析し、凍結乾燥させ、そして−７
０’Ｃにおいて保存した。各試料は蒸留水に懸濁させ、
そして次の分析に用いた。
し、そして結合しなかった蛋白質はｐＨ７゜４の０．５
Ｍ Ｍａｉｌ 及び０．０５％Ｅｍｐｉｇｅｎを用
いて ７ 除去した。結合された蛋白質はＰＢＳ中の１ＭＮ１１４
ＳＣＮ （Ａｊａｘ 社）を用いて溶離させた。溶離
液は０Ｄ２８ｏ によってモニターした。溶離の後で
試料をｐＨ８，３の０．００５ Ｍ ＋−リスに対し
でてきるだけ充分に透析し、凍結乾燥させ、そして−７
０’Ｃにおいて保存した。各試料は蒸留水に懸濁させ、
そして次の分析に用いた。
通常の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上でこのゲルをＭｏｒｒ
ｉｓｓｅｙ （１９８１）の方法に従い銀で着色させた
ときに幾つかのバンドを見出すことができた（第２図）
。免疫−感染の羊がらの培養」二澄液による免疫プロッ
ティング及びブロービングは、アフィニティー分離され
た調剤中て６７−７５ Ｋｄ領域中において非常に強い
抗体応答をもたらした（第３図）。しかしながら銀で着
色したゲル又はクーマツシーで着色させたゲルの上のい
ずれのバンドもこの領域の抗体反応性と積極的に関連さ
せることはできなかった。従ってこの特別な分子は従来
用 ８ いられた蛋白質染色法によっては着色しないもののよう
であった。
ｉｓｓｅｙ （１９８１）の方法に従い銀で着色させた
ときに幾つかのバンドを見出すことができた（第２図）
。免疫−感染の羊がらの培養」二澄液による免疫プロッ
ティング及びブロービングは、アフィニティー分離され
た調剤中て６７−７５ Ｋｄ領域中において非常に強い
抗体応答をもたらした（第３図）。しかしながら銀で着
色したゲル又はクーマツシーで着色させたゲルの上のい
ずれのバンドもこの領域の抗体反応性と積極的に関連さ
せることはできなかった。従ってこの特別な分子は従来
用 ８ いられた蛋白質染色法によっては着色しないもののよう
であった。
醒」Ｕ４北
第４段階幼生からのアフィニティー分離した抗原６ｕｇ
を、１０ ｍＭ のＥＤＴＡ、０．１ ％
のＳＤＳ、０．５％ノドリド：／ Ｘ−１００及び０．
１％のβ−メルカプトエタノールの含まれたｐＨ８，０
の０．１Ｍ 燐酸ナトリウム緩衝液中で、グリコベブチ
グーゼＦ （２０ｇ Ｉ２．： Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）又はブロテイナーゼＫ （１０
ｕｇ； Ｓｉｇｍａ 社）＃井弁を用いて ３７℃に
おいて１夜培養した。
を、１０ ｍＭ のＥＤＴＡ、０．１ ％
のＳＤＳ、０．５％ノドリド：／ Ｘ−１００及び０．
１％のβ−メルカプトエタノールの含まれたｐＨ８，０
の０．１Ｍ 燐酸ナトリウム緩衝液中で、グリコベブチ
グーゼＦ （２０ｇ Ｉ２．： Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）又はブロテイナーゼＫ （１０
ｕｇ； Ｓｉｇｍａ 社）＃井弁を用いて ３７℃に
おいて１夜培養した。
又、別に上記抗原をＰＢＳ中のトリプシン（１０μｇ
； Ｄｉｆｃｏ 社）を用いて培養した。この培養
の後で全部の試料を非還元性のＳＤＳ緩衝液と混合し、
５分間煮沸し、そして１２゜５％のＳＤＳポリアクリル
アミドゲルの上に載せ、ニトロセルローズへ移し、そし
て既述の培養上澄液でプローブした。プロティナーゼＫ
による処理もトリプシンによる処理もともに、培養上澄
液中の抗体による検出がない程度にその蛋白質の分解を
もたらした（第４図、それぞれレーンＡ及びＢ）。グリ
コペプチターゼＦは抗原に対してなんらの作用も持たず
、対照群の培養物（レーンＣ及びＤ）と同じ結果をもた
らした。このことは、その抗原がプロテイナーゼＫ及び
トリプシンによって減成分解され得る蛋白質成分を有し
ているけれどもこの蛋白質がこのような条件のもとてア
スパラギンと結合したグリカン類を含まないもののよう
であることを示している。
； Ｄｉｆｃｏ 社）を用いて培養した。この培養
の後で全部の試料を非還元性のＳＤＳ緩衝液と混合し、
５分間煮沸し、そして１２゜５％のＳＤＳポリアクリル
アミドゲルの上に載せ、ニトロセルローズへ移し、そし
て既述の培養上澄液でプローブした。プロティナーゼＫ
による処理もトリプシンによる処理もともに、培養上澄
液中の抗体による検出がない程度にその蛋白質の分解を
もたらした（第４図、それぞれレーンＡ及びＢ）。グリ
コペプチターゼＦは抗原に対してなんらの作用も持たず
、対照群の培養物（レーンＣ及びＤ）と同じ結果をもた
らした。このことは、その抗原がプロテイナーゼＫ及び
トリプシンによって減成分解され得る蛋白質成分を有し
ているけれどもこの蛋白質がこのような条件のもとてア
スパラギンと結合したグリカン類を含まないもののよう
であることを示している。
火星型亙１盈
薄層等電点電気泳動（Ｉ ＥＦ）用のゲルをＭｃＬａｃ
ｈｌａｎ及びＣｏｒｎｅｌｌ （１９７８）の方法に従
いブスチックテンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ免疫電気泳
動プレート）を用いて作った。それぞれのＩＥＦゲルは
０．９５ Ｗ／Ｖ％のＩＥＦアガロース（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ社）、１１．４ Ｗ／Ｖ％の Ｄ−ソルビトール（
ｓ ｉ ｇｍａ社）、４．８％の両性イオン担体（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社、３−５又は３−１Ｏ領域）及び蒸留水よ
りなっていた。これら水、ソルビトール及びアガロース
を煮沸し、次いで、５６℃のウォータハスの上に置いた
。次に両性イオンを加え、その溶液を上記テンプレート
の上に流してＧｅｌｂｏｎｄ（ＦＭ（：： Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａｌの１片で覆った。このテンプレートをプラス
チックの袋の中に入れて使用前に少なくと６２時間以上
４℃において貯蔵した。
ｈｌａｎ及びＣｏｒｎｅｌｌ （１９７８）の方法に従
いブスチックテンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ免疫電気泳
動プレート）を用いて作った。それぞれのＩＥＦゲルは
０．９５ Ｗ／Ｖ％のＩＥＦアガロース（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ社）、１１．４ Ｗ／Ｖ％の Ｄ−ソルビトール（
ｓ ｉ ｇｍａ社）、４．８％の両性イオン担体（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社、３−５又は３−１Ｏ領域）及び蒸留水よ
りなっていた。これら水、ソルビトール及びアガロース
を煮沸し、次いで、５６℃のウォータハスの上に置いた
。次に両性イオンを加え、その溶液を上記テンプレート
の上に流してＧｅｌｂｏｎｄ（ＦＭ（：： Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａｌの１片で覆った。このテンプレートをプラス
チックの袋の中に入れて使用前に少なくと６２時間以上
４℃において貯蔵した。
１μ℃のアフィニティー精製した抗原を適用し、そして
ゲルを４５分間１定電圧でＩＷ において電気泳動し
た。この操作が完了した後でゲルをニトロセルローズ（
５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｕｅ１．ｌ）で覆い、
次いで数枚の濾紙とガラス板とを重しとして載せた。蛋
白質は次にゲルから膜へ向かい１時間にわたり拡散させ
、その後で膜をブロックし、そして既述のように培養上
澄液でプローブした。結果は第５図のＩＥＦ標準（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社）によって示されるように４．６５以下の
等重点を有する高度に酸性の蛋白質の存在を示した。
ゲルを４５分間１定電圧でＩＷ において電気泳動し
た。この操作が完了した後でゲルをニトロセルローズ（
５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｕｅ１．ｌ）で覆い、
次いで数枚の濾紙とガラス板とを重しとして載せた。蛋
白質は次にゲルから膜へ向かい１時間にわたり拡散させ
、その後で膜をブロックし、そして既述のように培養上
澄液でプローブした。結果は第５図のＩＥＦ標準（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社）によって示されるように４．６５以下の
等重点を有する高度に酸性の蛋白質の存在を示した。
笈息豊ス
Ｆａｓｃｊｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａＦ ａ ｓ ｃ
ｉ ｏ ］、ａ ｈ ｅ ｐ ａ Ｌ、ｊ ｃ ａ
（肝臓吸虫類）は多くの咄乳動物の肝臓及び胆管系中
で育成することのでき１ る吸虫科の寄生体であり、そして羊及び牛の産業にとっ
て経済」二特に重要である。肝臓吸虫類に対するワクチ
ンのような予防処置は市場にはない。
ｉ ｏ ］、ａ ｈ ｅ ｐ ａ Ｌ、ｊ ｃ ａ
（肝臓吸虫類）は多くの咄乳動物の肝臓及び胆管系中
で育成することのでき１ る吸虫科の寄生体であり、そして羊及び牛の産業にとっ
て経済」二特に重要である。肝臓吸虫類に対するワクチ
ンのような予防処置は市場にはない。
羊はＦ、 ｈｅ ａｔｉｃａ に対する免疫を発現さ
せないけれども牛は再感染に対して部分的に抵抗性とな
ることができる。牛における抵抗性の機構は完全には説
明されていないけれども、一つの可能性としては、牛が
羊よりも強く相違（防御）抗原を識別すると言うことで
ある。従って上に記述した技術を羊と牛との間の差別的
な抗原識別の研究に用いた。
せないけれども牛は再感染に対して部分的に抵抗性とな
ることができる。牛における抵抗性の機構は完全には説
明されていないけれども、一つの可能性としては、牛が
羊よりも強く相違（防御）抗原を識別すると言うことで
ある。従って上に記述した技術を羊と牛との間の差別的
な抗原識別の研究に用いた。
抗原の調製
１ 新しく脱血した幼若体（ＮＥＪ）
Ｂａｌｄｗｉｎ Ａｑｕａｔｉｃｓ 社（米国オレゴ
ン州モンマウス）から Ｆ 、 ｈ ｅ ａ ｔ； ｉ
ｃ ａ のメタケル力リア（Ｍｃ） を購入した
。メタケル力リアを １００ ｍｇのタウロコリン酸ナ
トリウムと ８０ ｍｇ のＬ−システィンの含まれ
ている２０ｍ１ のＤＭＥ媒質中に懸濁させることに
よって脱血さセｌこ。この懸濁ンルをｃｏ２４０％、０
□１０％及びＮ２５０％ の混合ガ ２ スで気易し、３７℃において培養し、そしてＮＥＪを金
属網で濾過して捕集した。沈降させたＮＥＪをプロテア
ーゼインヒビター（ＰＢＳ−ＰＩ ： ５ミリモルのヨ
ードアセタミド及び１ミリモルのＰＭＳＦ）を含む燐酸
塩緩衝した塩溶液中に再懸濁させ、そして音波処理した
。幾つかに分けた分画を一７０℃において貯蔵した。
ン州モンマウス）から Ｆ 、 ｈ ｅ ａ ｔ； ｉ
ｃ ａ のメタケル力リア（Ｍｃ） を購入した
。メタケル力リアを １００ ｍｇのタウロコリン酸ナ
トリウムと ８０ ｍｇ のＬ−システィンの含まれ
ている２０ｍ１ のＤＭＥ媒質中に懸濁させることに
よって脱血さセｌこ。この懸濁ンルをｃｏ２４０％、０
□１０％及びＮ２５０％ の混合ガ ２ スで気易し、３７℃において培養し、そしてＮＥＪを金
属網で濾過して捕集した。沈降させたＮＥＪをプロテア
ーゼインヒビター（ＰＢＳ−ＰＩ ： ５ミリモルのヨ
ードアセタミド及び１ミリモルのＰＭＳＦ）を含む燐酸
塩緩衝した塩溶液中に再懸濁させ、そして音波処理した
。幾つかに分けた分画を一７０℃において貯蔵した。
２、幼若吸虫類
多数のマウスをそれぞれ３０個のＭｅにより経口的に感
染させて １２日後に屠殺した。解離させた肝臓を茶渡
しを通して洗浄し、そして各幼若吸虫を分１画遠心分離
によって回収した。抗原は上記と同様にした作った。
染させて １２日後に屠殺した。解離させた肝臓を茶渡
しを通して洗浄し、そして各幼若吸虫を分１画遠心分離
によって回収した。抗原は上記と同様にした作った。
３、成虫の吸虫類
屠殺場から羊や牛の感染した肝臓を人手した。
成虫の吸虫類は胆管系から回収した組織グラインダで均
質化し、いくつかの分画にわけて一７０℃において凍結
させた。
質化し、いくつかの分画にわけて一７０℃において凍結
させた。
３
Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ については７．５−１５％だ
けの濃度勾配ゲル又は１０％の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで
実験した。全ての抗原を非還元性緩衝液と１＝１の割合
で混合した。牛及び羊の各抗体をペルオキシダーゼ−複
合した兎の抗生又は羊免疫グロブノン（Ｄａｃｏ 社
）をそれぞ用いて検出した。
けの濃度勾配ゲル又は１０％の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで
実験した。全ての抗原を非還元性緩衝液と１＝１の割合
で混合した。牛及び羊の各抗体をペルオキシダーゼ−複
合した兎の抗生又は羊免疫グロブノン（Ｄａｃｏ 社
）をそれぞ用いて検出した。
ブタノール抽１物
ＰＢＳ−Ｐ Ｉの中に懸濁させた新しく脱血した幼若体
を音波処理し、そして５０００ Ｇの加速度において１
０分間遠心分離した。上澄液を後に述べるようにアフィ
ニティー精製のために用いた。ペレットをＰＢＳ−ＰＩ
の中に再懸濁させ、そして等容積の冷たい ｎ−ブタノ
ールを加えた。この混合物を時々撹拌しながら氷の」二
で １０分間培養し、次いで５０００ Ｇの加速度で５
分間遠心分離した。底層中の水溶性分画を捕集した。
を音波処理し、そして５０００ Ｇの加速度において１
０分間遠心分離した。上澄液を後に述べるようにアフィ
ニティー精製のために用いた。ペレットをＰＢＳ−ＰＩ
の中に再懸濁させ、そして等容積の冷たい ｎ−ブタノ
ールを加えた。この混合物を時々撹拌しながら氷の」二
で １０分間培養し、次いで５０００ Ｇの加速度で５
分間遠心分離した。底層中の水溶性分画を捕集した。
アフィニティー 製
感染させた牛の培養上澄液（後述）からセファローズ結
合プロティンＧ （Ｐｌ＋ａｒｍａｃｊｓ社）を用いて
各抗体を精製し、そして前記Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓに
４ ついて記述したと本質的に同様なアフィニティーカラム
の調製のために用いた。
合プロティンＧ （Ｐｌ＋ａｒｍａｃｊｓ社）を用いて
各抗体を精製し、そして前記Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓに
４ ついて記述したと本質的に同様なアフィニティーカラム
の調製のために用いた。
ＮＥＪ音波処理」二澄液（上記）にトリＩ−ンＸ１００
Ｒ−３（Ｓｊｇｍａ 社）を最終濃度が２％になる
ように加えた。この超音波処理物をアフィニティ力ラム
に送り込んで結合されなかった分画分を０．１％ のト
リ）−：／ Ｘ−１０ＯＲ−３及び１ミリモルのＰＭＳ
Ｆの含まれたＩ） Ｂ Ｓを用い、次いで１．５Ｍ Ｎ
ａＣ］を用いて洗い流した。結合された分両分をＰＢＳ
中２ Ｍ （７） ＮＨ４ＳＣＮ テ溶離させ、蒸
留水に対して透析し、そして凍結乾燥させた。凍結乾燥
させた分画をＰＢＳ中に再懸濁させて次の使用に供した
。
Ｒ−３（Ｓｊｇｍａ 社）を最終濃度が２％になる
ように加えた。この超音波処理物をアフィニティ力ラム
に送り込んで結合されなかった分画分を０．１％ のト
リ）−：／ Ｘ−１０ＯＲ−３及び１ミリモルのＰＭＳ
Ｆの含まれたＩ） Ｂ Ｓを用い、次いで１．５Ｍ Ｎ
ａＣ］を用いて洗い流した。結合された分両分をＰＢＳ
中２ Ｍ （７） ＮＨ４ＳＣＮ テ溶離させ、蒸
留水に対して透析し、そして凍結乾燥させた。凍結乾燥
させた分画をＰＢＳ中に再懸濁させて次の使用に供した
。
培養上澄液の調製
３匹の羊及び３匹の牛にそれぞれ４００ 匹のメタケ
ル力リアを経口的に感染させた。 １８日後にそれら動
物に ＦＡＳＣＩＮＥＸ １２０ （Ｃｉｂａ Ｇｅｉ
ｇａＡｕｓｔ、ｒａｌｉａ Ｌｔｄ、社）を投与して一
次感染症を除いた。これらの動物はそれぞれ４００
匹のメタケル力リアで更に経口的に感染させるに先立っ
て更に ５ ３５日間そのままに放置した。この感染の後ＩＯ日たっ
てそれら動物を屠殺した。肝臓リンパ節（ＨＬ Ｎ ）
を取り出し、細胞を解離させ、そして上にＴ 、 ｈ
ｙ ｄ ａ ｔ ｉ ｇｅ ｎ ａについて記述したと
同様にＰＷＭを含む培養培地中でＩｎ＋ｊ２当たり２−
４×１０６個の細胞濃度で培養し、そして」二澄液を７
日間の試験管培養の後に採集した。処理されていないＦ
、 ｈ ｅ ｐ ａ ｆ； ｉ ｃ ａ で−次感
染（Ｍａ２Ｏ匹）している羊を屠殺の １０日前に ３
００ 匹のＭｃを感染させ、その羊のＨＬ Ｎ細胞か
ら別な培養」二澄液を採集した。
ル力リアを経口的に感染させた。 １８日後にそれら動
物に ＦＡＳＣＩＮＥＸ １２０ （Ｃｉｂａ Ｇｅｉ
ｇａＡｕｓｔ、ｒａｌｉａ Ｌｔｄ、社）を投与して一
次感染症を除いた。これらの動物はそれぞれ４００
匹のメタケル力リアで更に経口的に感染させるに先立っ
て更に ５ ３５日間そのままに放置した。この感染の後ＩＯ日たっ
てそれら動物を屠殺した。肝臓リンパ節（ＨＬ Ｎ ）
を取り出し、細胞を解離させ、そして上にＴ 、 ｈ
ｙ ｄ ａ ｔ ｉ ｇｅ ｎ ａについて記述したと
同様にＰＷＭを含む培養培地中でＩｎ＋ｊ２当たり２−
４×１０６個の細胞濃度で培養し、そして」二澄液を７
日間の試験管培養の後に採集した。処理されていないＦ
、 ｈ ｅ ｐ ａ ｆ； ｉ ｃ ａ で−次感
染（Ｍａ２Ｏ匹）している羊を屠殺の １０日前に ３
００ 匹のＭｃを感染させ、その羊のＨＬ Ｎ細胞か
ら別な培養」二澄液を採集した。
紋理
感染させた牛のＨＬ Ｎ細胞の培養」二澄液によるウェ
スタンプロットをプローブしたところ、予め染色して」
３いた最高分子量マーカの僅かに上に存在するような、
ＮＥＪ抗原抗原生剤ダブレノ１〜抗原に対する強い抗体
活性がもたらされた（第６図）。ＮＥＪダブレットの高
い分子量水準のところのただ１本のバンドが１２日齢の
吸虫の調剤において常に存在していたが、成虫の吸虫調
剤の中６ では同様なバンドは何回かの繰り返し実験において信頼
性をもって検出することはできなかった。
スタンプロットをプローブしたところ、予め染色して」
３いた最高分子量マーカの僅かに上に存在するような、
ＮＥＪ抗原抗原生剤ダブレノ１〜抗原に対する強い抗体
活性がもたらされた（第６図）。ＮＥＪダブレットの高
い分子量水準のところのただ１本のバンドが１２日齢の
吸虫の調剤において常に存在していたが、成虫の吸虫調
剤の中６ では同様なバンドは何回かの繰り返し実験において信頼
性をもって検出することはできなかった。
これと対照的に、同様に感染させた（−次感染を短縮さ
れて１０日間の感染試験を受けた）羊の培養上澄液ヱ゛
プローブしたときにはウェスタンプロットにおいてＮＥ
Ｊ抗原との反応は観測されなかった（図示せず）。この
羊の培養上澄液と、慢はその他のバンドが強く確認され
たにもかかわらず上記中の培養上澄液で存在したような
反応は観測されなかった（第６図）。
れて１０日間の感染試験を受けた）羊の培養上澄液ヱ゛
プローブしたときにはウェスタンプロットにおいてＮＥ
Ｊ抗原との反応は観測されなかった（図示せず）。この
羊の培養上澄液と、慢はその他のバンドが強く確認され
たにもかかわらず上記中の培養上澄液で存在したような
反応は観測されなかった（第６図）。
この培養上澄液の制限された反応性とは異なって、同一
の動物から同一時に採集した血清でプローブされた同様
なウェスタンプロットは、それら全３つの寄生体段階に
おいて多数のバンドとともに強く拡散した態様で反応し
、そして牛と羊との間でなんらの明らかな差異は観測で
きなかった（図示せず）。
の動物から同一時に採集した血清でプローブされた同様
なウェスタンプロットは、それら全３つの寄生体段階に
おいて多数のバンドとともに強く拡散した態様で反応し
、そして牛と羊との間でなんらの明らかな差異は観測で
きなかった（図示せず）。
全ＮＥＪ調剤の銀着色では、牛の培養上澄液で確認され
た抗原は明瞭には着色されず、このことはこれがこの寄
生体を構成する全分子の副次的な成分であることを示唆
している（第７ａ図）。再現ウェスタンプロット上のそ
の抗原の位置を予め着色しておいた最高分子量マーカと
の比較で測定することによれば、このものの近似的分子
量は５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上でｌ１ｉｏ−Ｒａｄ
社の高分子量マーカを標準として用いて １２０−１２
５ Ｋｄと計算された。ＮＥＪの調剤中のタブレットの
明瞭な銀による着色はＮＥＪ音波処理ペレットのｎ−ブ
タノール抽出された可溶性分画を５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル
の上に流したときに認めることができた（第７ｂ図）。
た抗原は明瞭には着色されず、このことはこれがこの寄
生体を構成する全分子の副次的な成分であることを示唆
している（第７ａ図）。再現ウェスタンプロット上のそ
の抗原の位置を予め着色しておいた最高分子量マーカと
の比較で測定することによれば、このものの近似的分子
量は５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上でｌ１ｉｏ−Ｒａｄ
社の高分子量マーカを標準として用いて １２０−１２
５ Ｋｄと計算された。ＮＥＪの調剤中のタブレットの
明瞭な銀による着色はＮＥＪ音波処理ペレットのｎ−ブ
タノール抽出された可溶性分画を５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル
の上に流したときに認めることができた（第７ｂ図）。
牛抗体カラムでのアフィニティー精製は非結合の分画か
らの抗原の明確な溶離と、結合された分画の高濃縮とを
もたらした（第８図）。加えて、結合した分画中に強い
低分子量（±２４ Ｋｄ ）のバンドが存在し、これは
またウェスタンプロット」二で牛の培養上澄液と強力に
反応した（図示せず）が、このことはこの低分子量バン
ドは、アフィニティー繰作の間に １２［］ −１２５
Ｋｄの抗原が裂断したことによるものであることを示唆
している。
らの抗原の明確な溶離と、結合された分画の高濃縮とを
もたらした（第８図）。加えて、結合した分画中に強い
低分子量（±２４ Ｋｄ ）のバンドが存在し、これは
またウェスタンプロット」二で牛の培養上澄液と強力に
反応した（図示せず）が、このことはこの低分子量バン
ドは、アフィニティー繰作の間に １２［］ −１２５
Ｋｄの抗原が裂断したことによるものであることを示唆
している。
実施例３
Ｔａｅｎｉａ ｈｙｄａｔｉ ｅｎａ
材料及び方法
寄生体 び６ 勿
感染させた犬をアレコリンヒドロプロミドで駆虫した後
でＴ、 ｈ ｄａｔｉｇｅｎａ の卵を成虫から集め
た。牧場で飼育した２才の羊を用いた。羊は一般にこの
年齢で自然の暴露によってＴ、ｈｙｄａｔｉ ｅｎａに
対する免疫を獲得しているが、このことは予備実験で確
認した。４０−５０，０００匹のＴ、 ｈｙｄａｎｔｉ
■皿 の卵を胃内注入してから １３日後に層殺した羊
より、陽性の血清及び陽性の培養上澄液を得た。陰性の
培養上澄液は予め強制感染させなかった羊から得た。陰
性血清は虫の存在しない条件のもとで飼育した５ヶ月齢
の羊から得た。
でＴ、 ｈ ｄａｔｉｇｅｎａ の卵を成虫から集め
た。牧場で飼育した２才の羊を用いた。羊は一般にこの
年齢で自然の暴露によってＴ、ｈｙｄａｔｉ ｅｎａに
対する免疫を獲得しているが、このことは予備実験で確
認した。４０−５０，０００匹のＴ、 ｈｙｄａｎｔｉ
■皿 の卵を胃内注入してから １３日後に層殺した羊
より、陽性の血清及び陽性の培養上澄液を得た。陰性の
培養上澄液は予め強制感染させなかった羊から得た。陰
性血清は虫の存在しない条件のもとで飼育した５ヶ月齢
の羊から得た。
白血球懸濁２の言。製
肝臓白血球を下記の操作によって採取した 羊の肝臓を
取り出してその門脈から、１℃の燐酸塩で緩衝した塩溶
液（ＰＢＳ）で室温において濯流し、次いで肝臓を継続
的に且つ温和にマツサージしながら０．５４の冷たいＰ
ＢＳで潅流した。この９ 操作によって全肝臓の完全なあく扱き （ｂ ］、ａ
ｎ ｃ ｈｉｎｇｌ がもたらされた。肝臓組織の約
１００ｇ を食品加工機〔オーストラリア、Ｇｏｌｄ
ａｊｒ社）の中で低速で８ないし １０秒間ホモジナイ
ズした。このホモジナイズされた肝臓を次に金網を通し
て押し出し、８ないし １０分間沈降させるために放置
し、そして綿ガーゼを通して濾過した。４００Ｇにおい
て８分間、次いで低い回転数で１０ Ｇにおいて５分間
遠心分離することによって細胞を２回洗浄して小塊と肝
細胞の大部分とを取り除いた。最後の遠心分離の上澄液
を捕集し、そして残余の肝細胞及び死んだ細胞をフィコ
ール（Ｆｉｃｏｌｌｌ ／ Ｉｓ。
取り出してその門脈から、１℃の燐酸塩で緩衝した塩溶
液（ＰＢＳ）で室温において濯流し、次いで肝臓を継続
的に且つ温和にマツサージしながら０．５４の冷たいＰ
ＢＳで潅流した。この９ 操作によって全肝臓の完全なあく扱き （ｂ ］、ａ
ｎ ｃ ｈｉｎｇｌ がもたらされた。肝臓組織の約
１００ｇ を食品加工機〔オーストラリア、Ｇｏｌｄ
ａｊｒ社）の中で低速で８ないし １０秒間ホモジナイ
ズした。このホモジナイズされた肝臓を次に金網を通し
て押し出し、８ないし １０分間沈降させるために放置
し、そして綿ガーゼを通して濾過した。４００Ｇにおい
て８分間、次いで低い回転数で１０ Ｇにおいて５分間
遠心分離することによって細胞を２回洗浄して小塊と肝
細胞の大部分とを取り除いた。最後の遠心分離の上澄液
を捕集し、そして残余の肝細胞及び死んだ細胞をフィコ
ール（Ｆｉｃｏｌｌｌ ／ Ｉｓ。
ｐａｑｕｅ勾配剤を分配剤遠心分離することによって除
いた。
いた。
白血球もリンパ節を細かな金網で切断し、すくことによ
って回収した。死んだ細胞及び小塊はフィコールを介し
て遠心分離することにより除去した。
って回収した。死んだ細胞及び小塊はフィコールを介し
て遠心分離することにより除去した。
培養上澄液の調製
白血球を １０ミリモ）Ｌ、 （７） ＨＥ Ｐ Ｅ
Ｓ、１（］。
Ｓ、１（］。
０
μｇ／ ｍ君のペニシリン、１００μｇ／ｌＴ１１２の
ストレプトマイシン、２．５Ｘ１０−５モルの２−メル
カプトエタノール、２ミリモルのグルタミン、１ミリモ
ルのピルベート及び１０％の牛脂仔血清の加えられてい
るＤＭＥからなる培養培地の中でその１ｍ℃当たり２−
４ ｘ １０６個の細胞濃度に再懸濁させた。２ｍ℃の
培養液を２４ウエルのＬｉｎｂｒｏプレートの中に調製
し、アメリカやまごぼうマイトジェン（ＰＷＭ ：ニュ
ーヨーク州グランドアイランドのＧｉｂｃｏＬａｂｓ、
社）の２５μｇ／ｍｌで刺激し、そして５％ＣＯ３雰囲
気中で３７℃において培養した。７日の後にそれらの培
養物を集めて、そして細胞を遠心分離によって沈降させ
た。上澄液は使用に供するまで一２０°Ｃにおいて貯蔵
した。
ストレプトマイシン、２．５Ｘ１０−５モルの２−メル
カプトエタノール、２ミリモルのグルタミン、１ミリモ
ルのピルベート及び１０％の牛脂仔血清の加えられてい
るＤＭＥからなる培養培地の中でその１ｍ℃当たり２−
４ ｘ １０６個の細胞濃度に再懸濁させた。２ｍ℃の
培養液を２４ウエルのＬｉｎｂｒｏプレートの中に調製
し、アメリカやまごぼうマイトジェン（ＰＷＭ ：ニュ
ーヨーク州グランドアイランドのＧｉｂｃｏＬａｂｓ、
社）の２５μｇ／ｍｌで刺激し、そして５％ＣＯ３雰囲
気中で３７℃において培養した。７日の後にそれらの培
養物を集めて、そして細胞を遠心分離によって沈降させ
た。上澄液は使用に供するまで一２０°Ｃにおいて貯蔵
した。
髭星坐鳳１
イ）オンコスフェラ抗原（０）
成虫から回収したＴ、 ｈｙｄａｔｉ ｅｎａ の卵
を次亜塩素酸ナトリウムによって新化させ、そしてその
放出されたオンコスフエラを１００％ パーコールによ
って精製した。合計２．３Ｘ １０５個のオンコス１ フェラをプロテアーゼインヒビター（ＰＢＳ−ＰＩ：５
ミリモルのヨードアセトイミド及び１ミリモルのフェニ
ルメヂルスルファニルフルオライド）の含まれたＩｎ＋
Ｊ２のＰＢＳ中に再懸濁させ、そして−２０°Ｃにおい
て凍結させた。この調剤を後に解凍し、ＭＳＨの１５０
Ｗ 超音波分解機（英国Ｃｒａｗ１．ｅｙ社）で音波
処理し、幾っがの分画にわりて一２０°Ｃにおいて貯蔵
した。
を次亜塩素酸ナトリウムによって新化させ、そしてその
放出されたオンコスフエラを１００％ パーコールによ
って精製した。合計２．３Ｘ １０５個のオンコス１ フェラをプロテアーゼインヒビター（ＰＢＳ−ＰＩ：５
ミリモルのヨードアセトイミド及び１ミリモルのフェニ
ルメヂルスルファニルフルオライド）の含まれたＩｎ＋
Ｊ２のＰＢＳ中に再懸濁させ、そして−２０°Ｃにおい
て凍結させた。この調剤を後に解凍し、ＭＳＨの１５０
Ｗ 超音波分解機（英国Ｃｒａｗ１．ｅｙ社）で音波
処理し、幾っがの分画にわりて一２０°Ｃにおいて貯蔵
した。
口）多節条虫抗原
羊の腹膜腔から層殺に際して多節条虫類（Ｍｅｔ；ａｃ
ｅｓｔｏｄｅｓｌ を捕集した。嚢胞液を除去し、頭部
及び嚢壁を分離し、そしてＰＢＳ−ＰＩの中で一２０℃
において凍結させた。この調剤を後で解凍し、Ｋｉｎｅ
ｍａｔｉｃａ ホモジナイザ（スイス国Ｌ ＩＩ Ｚ
ｅ ｒ ｎのＰｏ１ｙｔｒｏｎ 社）の中でホモジ
ナイズし、音波処理して１４００ ｒｐｍにおいて１５
分間遠心分離した。
ｅｓｔｏｄｅｓｌ を捕集した。嚢胞液を除去し、頭部
及び嚢壁を分離し、そしてＰＢＳ−ＰＩの中で一２０℃
において凍結させた。この調剤を後で解凍し、Ｋｉｎｅ
ｍａｔｉｃａ ホモジナイザ（スイス国Ｌ ＩＩ Ｚ
ｅ ｒ ｎのＰｏ１ｙｔｒｏｎ 社）の中でホモジ
ナイズし、音波処理して１４００ ｒｐｍにおいて１５
分間遠心分離した。
上澄液をいくつかの分画にわけて一２０’Ｃにおいて凍
結させた。
結させた。
ウェスタンプロット法による抗原の
４０．１（７）各抗原分画を４０ＬＬ、９（７）ＳＤＳ
非還元２ 性試料緩衝液と混合し、５分間煮沸し、５０００ Ｇに
おいて １０分間遠心分離し、そして１０％又は１２％
の５ＤＳ−ポリアクリルアミドの上に流した。分離され
た各蛋白質を二ｌ−口セルローズシトに１夜の間に移し
た。このシートを３％濃度のにわとりオポアルブミン（
ＯＶＡ）でブロックし、そして条片に切断した。それら
の条片の上の特定の抗原を下記の培養段階の後に検出し
た：１）培養上澄液又は血清 ２）ビオチニル化したろば抗羊Ｉｇ （Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ社） ３）ストレプトアビジン−ビオチニル化したホスラジッ
シュベルオキシダーゼコンプレックス（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ 社） ４）ペルオキシダーゼ基質（０，０５％ の１１２０□
を含むＰＨ５中の０．６ ｍｇ／ｍβのジアミノベン
ヂジン これらの試薬はメーカーの推奨する稀釈度において用い
た。
非還元２ 性試料緩衝液と混合し、５分間煮沸し、５０００ Ｇに
おいて １０分間遠心分離し、そして１０％又は１２％
の５ＤＳ−ポリアクリルアミドの上に流した。分離され
た各蛋白質を二ｌ−口セルローズシトに１夜の間に移し
た。このシートを３％濃度のにわとりオポアルブミン（
ＯＶＡ）でブロックし、そして条片に切断した。それら
の条片の上の特定の抗原を下記の培養段階の後に検出し
た：１）培養上澄液又は血清 ２）ビオチニル化したろば抗羊Ｉｇ （Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ社） ３）ストレプトアビジン−ビオチニル化したホスラジッ
シュベルオキシダーゼコンプレックス（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ 社） ４）ペルオキシダーゼ基質（０，０５％ の１１２０□
を含むＰＨ５中の０．６ ｍｇ／ｍβのジアミノベン
ヂジン これらの試薬はメーカーの推奨する稀釈度において用い
た。
（１）オンコスフェラ抗原調剤のウェスタンプ３
０ツトのブロービングによって、つい最近感染した羊（
＋）の肝臓白血球から捕集した培養上澄液によっては特
異的に確認されたけれども強制感染させなかった羊（−
）の肝臓白血球から捕集した培養上澄液によっては確認
されなかった明瞭な２本の抗原バンドの存在することが
明らかにされた（第９図矢印参照）。この２本の抗原バ
ンドは、オンコスフエラ調剤をｌ／２ 及び１／４
にそれぞれ稀釈したときにもなお上記陽性培養上澄液
によって検出され、そして２２Ｋｄ と ３５ Ｋｄ
とのそれぞれの近似的分子量を有していた（第１Ｏ
図）。
＋）の肝臓白血球から捕集した培養上澄液によっては特
異的に確認されたけれども強制感染させなかった羊（−
）の肝臓白血球から捕集した培養上澄液によっては確認
されなかった明瞭な２本の抗原バンドの存在することが
明らかにされた（第９図矢印参照）。この２本の抗原バ
ンドは、オンコスフエラ調剤をｌ／２ 及び１／４
にそれぞれ稀釈したときにもなお上記陽性培養上澄液
によって検出され、そして２２Ｋｄ と ３５ Ｋｄ
とのそれぞれの近似的分子量を有していた（第１Ｏ
図）。
（２）同し陽性の肝臓培養上澄液を嚢壁調剤（Ｂ）又は
頭部調剤（Ｓ）のウェスタンプロットの検出に用いた場
合に、」−記２本のオンコスフェラ抗原バンドは検出さ
れなかった（第１０図）。このことは、上記オンコスフ
ェラ調剤中で特異的に検出された２本の抗原バンドは特
異的にオンコスフェラ段階であり、この寄生体段階が免
疫攻撃に対して感受性であることを極め４ て強く示唆するものである。
頭部調剤（Ｓ）のウェスタンプロットの検出に用いた場
合に、」−記２本のオンコスフェラ抗原バンドは検出さ
れなかった（第１０図）。このことは、上記オンコスフ
ェラ調剤中で特異的に検出された２本の抗原バンドは特
異的にオンコスフェラ段階であり、この寄生体段階が免
疫攻撃に対して感受性であることを極め４ て強く示唆するものである。
（３）オンコスフェラのウェスタンプロットをプローブ
するために陽性の肝臓培養上澄液を用いたときに検出さ
れた上記２本の抗原バンドは同じ羊から感染の後で同し
時に採取した血清をプローブとして用いたときは検出さ
れなかった（第１１図）。
するために陽性の肝臓培養上澄液を用いたときに検出さ
れた上記２本の抗原バンドは同じ羊から感染の後で同し
時に採取した血清をプローブとして用いたときは検出さ
れなかった（第１１図）。
（４）上記２本のオンコスフェラの抗原バンドはまたつ
い最近感染した動物のリンパ節から分離した白血球から
の培養上澄液を用いたときも同様に検出された（第１２
図）。
い最近感染した動物のリンパ節から分離した白血球から
の培養上澄液を用いたときも同様に検出された（第１２
図）。
実施例４
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ、ｅｒｉｕｍ ５ｅｕｄｏｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ乾酪性リンパ節炎（ＣＬＡと略記
する、チーズイブランドとも呼ばれる）は羊及び山羊の
慢性感染症であって細菌Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ （Ｃ，ｏ
ｖｉｓと同じ）によって引き起こされる。ＣＬ Ａに対
する複雑な無細胞ワクチン（ＧＬＡＮＶＡＣ： Ｃｏｍ
ｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ社製）が従来技術において知られており、そして
こ５ れは通常単独で、又は６成分の抗バクテリアワクチン（
ミックス イン ワン）の一部として投与される。この
ワクチンによって得られる防御はその非活性化された毒
素（ずなわちＴｏｘｏｉｄ ）成分に帰せられる。この
毒素は還元条件で１２．５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥの上に
流したときに約３１ Ｋｄの相対分子量を有している。
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ乾酪性リンパ節炎（ＣＬＡと略記
する、チーズイブランドとも呼ばれる）は羊及び山羊の
慢性感染症であって細菌Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ （Ｃ，ｏ
ｖｉｓと同じ）によって引き起こされる。ＣＬ Ａに対
する複雑な無細胞ワクチン（ＧＬＡＮＶＡＣ： Ｃｏｍ
ｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ社製）が従来技術において知られており、そして
こ５ れは通常単独で、又は６成分の抗バクテリアワクチン（
ミックス イン ワン）の一部として投与される。この
ワクチンによって得られる防御はその非活性化された毒
素（ずなわちＴｏｘｏｉｄ ）成分に帰せられる。この
毒素は還元条件で１２．５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥの上に
流したときに約３１ Ｋｄの相対分子量を有している。
この従来技術のワクチンは或る程度の防御作用を発生さ
せるけれどもこのワクチンは複雑であって高価であり、
しかも相当数の感染症がなお起り得る。
せるけれどもこのワクチンは複雑であって高価であり、
しかも相当数の感染症がなお起り得る。
この実施例はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ５ｅ
ｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの感染症から、近似的
に３８−４０ Ｋｄの分子量の防御抗原を分離すること
を記述する。
ｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの感染症から、近似的
に３８−４０ Ｋｄの分子量の防御抗原を分離すること
を記述する。
抗原の同定
培養上澄液を前のＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒ
ｔｕｓについて記述した（実施例１）と本質的に同し方
法を用いて得た。免疫された羊及び自然のままの羊の強
制感染試験は、生きているＣ、 ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓの懸濁液を下脚に局部的に注射してそ
の膝窩のリンパ節を取り出し、そして５−７日後に ６ 培養開始した。
ｔｕｓについて記述した（実施例１）と本質的に同し方
法を用いて得た。免疫された羊及び自然のままの羊の強
制感染試験は、生きているＣ、 ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓの懸濁液を下脚に局部的に注射してそ
の膝窩のリンパ節を取り出し、そして５−７日後に ６ 培養開始した。
培養上澄液を用いての全細胞のウェスタンプロット分析
は下記を示した。
は下記を示した。
ｌ）免疫羊は抗原の複雑なパターンを識別したけれども
大部分の動物においては３８−４０ Ｋｄの抗原が免疫
の主体（Ｉｍｍｎｏｄｏｍｉｎａｎｔｌ であった。
大部分の動物においては３８−４０ Ｋｄの抗原が免疫
の主体（Ｉｍｍｎｏｄｏｍｉｎａｎｔｌ であった。
２）自然の（非免疫の）動物は３８−４０ Ｋｄの抗原
を強く識別し、そして一般に他の活性は殆ど示さなかっ
た。
を強く識別し、そして一般に他の活性は殆ど示さなかっ
た。
抗原の抽出
Ｃ，５ｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｊｓ のコンフ
レア１〜成育が３７℃において１ないし３日にわたり好
気的培養によってＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔｈ Ｉｎｆｕ
ｓｉｏｎ Ａｇａｒの上に得られる。細胞はその固体培
地から掻き取ることによって得られる。
レア１〜成育が３７℃において１ないし３日にわたり好
気的培養によってＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔｈ Ｉｎｆｕ
ｓｉｏｎ Ａｇａｒの上に得られる。細胞はその固体培
地から掻き取ることによって得られる。
バクテリアの集塊を滅菌水中に再懸濁させ、そして撹拌
しながら洗浄し、次いで３０００ Ｇにおいて １５分
間遠心分離する。上澄液を傾瀉し、そしてその約４倍体
積の、 １．０％（Ｗ／Ｖｌ ナトリウム７ ドデシルザルフェート（ＳＤＳ）水溶液中に再懸濁させ
て７０−１００’Ｃにおいて１［］分間加熱することに
よって湿潤細胞ペレットを抽出する。細胞及びデブリス
を １００００ Ｇ において１５ 分間遠心分離
することにより除去する。この粗混合物は目的外の種々
の抗原を含んでいる。
しながら洗浄し、次いで３０００ Ｇにおいて １５分
間遠心分離する。上澄液を傾瀉し、そしてその約４倍体
積の、 １．０％（Ｗ／Ｖｌ ナトリウム７ ドデシルザルフェート（ＳＤＳ）水溶液中に再懸濁させ
て７０−１００’Ｃにおいて１［］分間加熱することに
よって湿潤細胞ペレットを抽出する。細胞及びデブリス
を １００００ Ｇ において１５ 分間遠心分離
することにより除去する。この粗混合物は目的外の種々
の抗原を含んでいる。
蛋白質抗原は上述のようにし胚」歩出仇旺望１ｏｓｉｓ
の全細胞からＳＤＳで抽出された複雑な混合物又は無細
胞の培養上澄液から精製することができる。通常の生化
学的方法を用いることができるが、これにはイオン交換
、分子篩クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ーと組み合された硫酸アンモニウム分画法等が含まれる
。加えて、プローブから分離して適当な固体相の上に固
定させた抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィ
ーを利用することができる。またそれらに代えて、精製
した抗原で動物を免疫化することによってポリクローナ
ル抗体又はモノクローナル抗体を得ることができる。
の全細胞からＳＤＳで抽出された複雑な混合物又は無細
胞の培養上澄液から精製することができる。通常の生化
学的方法を用いることができるが、これにはイオン交換
、分子篩クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ーと組み合された硫酸アンモニウム分画法等が含まれる
。加えて、プローブから分離して適当な固体相の上に固
定させた抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィ
ーを利用することができる。またそれらに代えて、精製
した抗原で動物を免疫化することによってポリクローナ
ル抗体又はモノクローナル抗体を得ることができる。
この抗原は硫酸アンモニウム溶液中に５０％飽８
和まで可溶のままである。
３Ｂ −４０Ｋｄ の 原の
この蛋白質は還元条件のもとで１２．５％のＳＤＳポリ
アクリルアミドゲルの上に流したときに３８−４０ Ｋ
ｄ の見掛は分子量を有する。こればクーマツジ−ブ
リリアントブルーＲ２５０で染色することができ、また
銀によって着色させることができる。又、ウェスタンプ
ロットを行った後にアミドにより黒色着色させてもよい
。結果を第１３［ｆｆ１．（Ａ）（Ｓ示ｊ（￥ＤＩ、３
（じ）１叡照）。
アクリルアミドゲルの上に流したときに３８−４０ Ｋ
ｄ の見掛は分子量を有する。こればクーマツジ−ブ
リリアントブルーＲ２５０で染色することができ、また
銀によって着色させることができる。又、ウェスタンプ
ロットを行った後にアミドにより黒色着色させてもよい
。結果を第１３［ｆｆ１．（Ａ）（Ｓ示ｊ（￥ＤＩ、３
（じ）１叡照）。
ｐＨ５−８の両性イオン及び１１．４％のソルビトール
を含む０．９５％のアガロース中での薄層等電点電気泳
動により、この抗原は下記のＢｉｏｒａｄＩＥＦの各マ
ーカの使用によると ｐ＋４６．８−６．９である（第
１４図参照）。
を含む０．９５％のアガロース中での薄層等電点電気泳
動により、この抗原は下記のＢｉｏｒａｄＩＥＦの各マ
ーカの使用によると ｐ＋４６．８−６．９である（第
１４図参照）。
フィコシアニン：４．６５、Ｂ−ラクトグロブリンＢ：
５．ＩＱ、牛カルボン酸アンヒドラーゼ：６．０、 ひ
とカルボン酸アンヒドラーゼ＝６．５、エクインミオグ
ロプリン：７．０、ひとヘモグロビンＡニア、１．ひと
ヘモグロビンＣ７，５、シトクロームＣ：９．６ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから溶離させた生来の
抗原のアミノ酸配列分析はそのアミノ末端基のところ、
又はその近傍の配列部分が（カルボキシル末端側へ向か
って） ＥＳＡＴＬＳＫＥＰＬＫＡＳＰＧＲＡＤＴ、 ＶＧＶＱ
（又はより一般的にはＧｌｕＳｅｒＡｌａＴｈｒＬｅｕ
ＳｅｒＬｙｓＧｌｕＰｒｏＬｅｕＬｙｓＡｌａＳｅｒＰ
ｒｏＧｌｙＡｒｇＡｌａＡｓｐＴｈｒＶａｌＧｌｙＶ
ａ ｉ Ｇ Ｉ ｎ ）で表わされる。
５．ＩＱ、牛カルボン酸アンヒドラーゼ：６．０、 ひ
とカルボン酸アンヒドラーゼ＝６．５、エクインミオグ
ロプリン：７．０、ひとヘモグロビンＡニア、１．ひと
ヘモグロビンＣ７，５、シトクロームＣ：９．６ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから溶離させた生来の
抗原のアミノ酸配列分析はそのアミノ末端基のところ、
又はその近傍の配列部分が（カルボキシル末端側へ向か
って） ＥＳＡＴＬＳＫＥＰＬＫＡＳＰＧＲＡＤＴ、 ＶＧＶＱ
（又はより一般的にはＧｌｕＳｅｒＡｌａＴｈｒＬｅｕ
ＳｅｒＬｙｓＧｌｕＰｒｏＬｅｕＬｙｓＡｌａＳｅｒＰ
ｒｏＧｌｙＡｒｇＡｌａＡｓｐＴｈｒＶａｌＧｌｙＶ
ａ ｉ Ｇ Ｉ ｎ ）で表わされる。
最後に、以上に記述した本発明の技術思想から逸脱する
ことなく多くの他の変法及び／又は４’Ｉ ｌ’１ｌｌ
ｉが可能であることを理解すべきである。
ことなく多くの他の変法及び／又は４’Ｉ ｌ’１ｌｌ
ｉが可能であることを理解すべきである。
参照文献：
○Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、 Ｌ、Ｅ、、０ｒｏｓｚｌａｎ
、 Ｓ 及びＫｏｎｉｇｓｂｅｒｇ、 Ｗ、：”Ａｎ
ａｌｙｔｊｃａｌ Ｂｊｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”９３：
１５３、−１５７ （１９７９１ ０Ｋｅｒｌｅｒｏ ｄｅ Ｒｏｓｂｏ、 Ｎ、 、 Ｃ
ａｒｎｅｇｊｅ、 Ｐ、Ｒ，、＋３ｃｒｎａｒｄ、 Ｃ
，Ｃ，Ａ、及びＬｉｎｔｈｊｃｕｍ、 Ｄ、Ｓ。
、 Ｓ 及びＫｏｎｉｇｓｂｅｒｇ、 Ｗ、：”Ａｎ
ａｌｙｔｊｃａｌ Ｂｊｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”９３：
１５３、−１５７ （１９７９１ ０Ｋｅｒｌｅｒｏ ｄｅ Ｒｏｓｂｏ、 Ｎ、 、 Ｃ
ａｒｎｅｇｊｅ、 Ｐ、Ｒ，、＋３ｃｒｎａｒｄ、 Ｃ
，Ｃ，Ａ、及びＬｉｎｔｈｊｃｕｍ、 Ｄ、Ｓ。
”Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅ５ａｅｒｃｂ”
９．１３５９−１３６９（１９８４） ○Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｕ、に、： ”Ｎａｔｕｒｅ （
Ｌｏｎｄｏｎｌ” ２７７、６８０６８５ ［１９７０
） ０ ○ＭｃＬａｃｈｌａｎ、 Ｒ及びＣｏｒｒ＋ｅ１１．
Ｆ、Ｎ、： ”Ｐａｔｈｏｌｏｙｇ” １０． ３９
５ （１９７８）○ Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、 Ｊ、
Ｈ，： ”八ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ
月７． ３０７ − ３１０ （１９８１１○ Ｗａ
ｒｄ、 Ｅ、Ｓ、 、 Ｇｕｓｓｏｗ、 Ｄ、
、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、 Ａ、Ｄ、、Ｊｏｎｅｓ、
Ｐ、Ｔ、及びＷｉｎｔｅｒ、 Ｇ、： ”Ｎａｔｕｒｅ
” ３４１５４４ − ５４６ （１９８９）
９．１３５９−１３６９（１９８４） ○Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｕ、に、： ”Ｎａｔｕｒｅ （
Ｌｏｎｄｏｎｌ” ２７７、６８０６８５ ［１９７０
） ０ ○ＭｃＬａｃｈｌａｎ、 Ｒ及びＣｏｒｒ＋ｅ１１．
Ｆ、Ｎ、： ”Ｐａｔｈｏｌｏｙｇ” １０． ３９
５ （１９７８）○ Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、 Ｊ、
Ｈ，： ”八ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ
月７． ３０７ − ３１０ （１９８１１○ Ｗａ
ｒｄ、 Ｅ、Ｓ、 、 Ｇｕｓｓｏｗ、 Ｄ、
、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、 Ａ、Ｄ、、Ｊｏｎｅｓ、
Ｐ、Ｔ、及びＷｉｎｔｅｒ、 Ｇ、： ”Ｎａｔｕｒｅ
” ３４１５４４ − ５４６ （１９８９）
第１Ａ図はＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓによって感染テスト
した羊からの培養上澄液により同定されたＬ３及びＬ４
の調剤中の抗原（矢印を入れた）を示す１２、５％ Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲルによるウェスタンプロット
の結果を示す図面に代る比較写真である。予め着色させ
た分子量標準（ＢＩＯＲＡＤ）も示しである。 第１Ｂ図ばＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓによって感染テスト
した羊からの培養上澄液により同定されたＬ４の調剤中
の抗原（矢印を入れた）を示す７．５−１５％の勾配Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル上のウェスタンプロットの
結果を示す図面に代る比較写真１ である。予め着色させた分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
も示しである。 第２図ばＨ、ｃ ｏ ｎ ｔ ｏ ｒ ｔ： ｕ ｓに
ついての非還元条件のもとての１２５％５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル上でのアフィニティー精製した蛋白質
の銀着色ゲルを示す図面に代る比較写真である。アフィ
ニティー精製した蛋白質は第ル−ンに、そして分子量標
準（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は第２レーンに示しである（
分子量は×１０３の値）。抗体活性の部分を括弧で括っ
て示しである。 第３図はＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓを用いた免疫−テスト
感染の動物からの培養上澄液でプローブした後のアフィ
ニティー分離した抗原のウェスタンプロットを示す図面
に代る比較写真である（レーンＡ）。第１図と同様に、
予め着色させた分子量標準マーカ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
も示しである。 第４図はｌ−１，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓを用いた場合の以
下の培養を行なった後にアフィニティー分離した抗原の
ウェスタンプロットを示す図面に代る比較写真である。 すなわち、レーンＡはプロテイナーセに２ とともに、レーンＢはトリプシンとともに、そしてレー
ンＣはグリコペプチダーゼＦとともにそれぞれ培養した
ものを、またレーンＤは酵素を用いないコントロールを
示す。分子量（Ｐｈａｒｍａｃｉａ： ＭＷＸ１０３）
も示しである。 第５図はＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓを用いた場合のアガロ
ースＩＥＦゲル両性イオン範囲３−５からのニトロセル
ローズへのＩＥＦ毛管トランスファを示した図面に代る
比較写真であり、これは免疫動物からの培養上澄液でプ
ローブしたものである。ＩＥＦ標準（Ｂｉｇ−Ｒａｄ）
を用いたｐＨ範囲が載せである。 第６図はと」」１■■ を用いた場合の７．５１５％
５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのウェスタンプロットを示す
図面に代る比較写真である。分子量は第１図と同様子め
着色された分子量マーカ（ＢＩＯＲＡＤ）である。レー
ン１及び４はＮＥＪ抗原調剤、レーン２及び５は成虫の
吸虫抗原調剤、レーン３及び６は１２日齢の吸虫の抗原
調剤である。レーン１．２及び３は感染した牛のＨＬＮ
細胞からの培養上澄液でプローブしたものであり、レー
ン４．５及び６は一次感染を短縮した及び慢性となった
羊の１０日テスト感染のＨＬＮからの培養上澄液混合物
でプローブしたものである。括弧は特許請求の範囲に記
載されている抗原を示す。 第７Ａ図はＦ、 ｈｅ ａｔｉｃａ を用いた場合の
硝酸銀で着色させた７、５−１５％ ５ＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルを示す図面に代る比較写真である。レーン１は還元
性試料緩衝液中の高分子量マーカ（Ｂｉｏｒａｄ）を、
レーン２は予め着色した分子量マーカ （Ｂｉｏｒａｄ
）を、そしてレーン３は非還元性試料緩衝液中の新しく
脱嵌した若生（ＮＥＪ’）の抗原調剤のものを示し、括
弧は特許請求の範囲に記載の抗原の位置を示す。第７Ｂ
図は同じく硝酸銀で着色させた １０％５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲル示す図面に代る比較写真である。レーン１は非還
元性緩衝液中の標準マウス血清、レーン２及びレーン３
は非還元性試料緩衝液中のｎ−ブタノール抽出した抗原
調剤のものであり、１０００００ Ｇ、５０ 分間の
遠心分離の後の上澄液（レーン３）及びペレット（レー
ン２）のものである。レーン４及び５はＮＥＪ音波処理
物を１０００００ Ｇ で５０分間遠心分離した後の
ペレット（レーン４）及び上澄液（レーン５）のもので
ある。括弧の部分は特許請求の範囲に記載の抗原成分の
部分である。 第８図はＬ」月１牡並 を用いた場合の硝酸銀で着色さ
せた１０％ＳＤＳゲルを示し、音波処理したＮＥＪ抗原
創剤のアフィニティー精製後の結合分画（レーン２）及
び非結合分画（レーン３）を示す図面に代る比較写真で
ある。括弧は特許請求の範囲に１己載の抗原の位置を示
す。レーン１ば第１図と同様子め着色した分子量マーカ
（ＢＩＯＲＡＤ）である。 第９図はＴ、 ｈ ｄａｔｉ ｅｎａ を用いた場合
の免疫ｌテスト感染（＋）の、又は無テスト感染（−）
の羊から分離した肝臓リンパ球からの培養上澄液でプロ
ーブした非還元性試料緩衝液中のオンコスフェラ抗原の
１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのウェスタンプロット
を示す図面に代る比較写真である。 ５ 第１０図はＴ、 ｈ ｄａｔｉ ｅｎａ を用いた場
合のオンコスフェラ抗原の１／２ 稀釈及び１／４
稀釈のもの（０％及び０％）のウェスタンプロット及
び多節条虫嚢壁抗原調剤のウェスタンプロット（Ｂ）及
び多節条虫頭部抗原調剤のそれ（Ｓ）の第９図と同じ陽
性培養上澄液によるブロービングを示す図面に代る比較
写真である。 １０％５ＤＳＰＡＧＥゲルを使用した。 シグマ分子量マーカは還元性緩衝液中で作用する。矢印
は特許請求の範囲に記載の抗原を示す。 第１１図はＴ、 ｈ ｄａｔｉ ｅｎａ を用いた場
合の陽性培養上澄液（＋）と感染後の同じ時に同し羊か
ら採取した陰性血清（−）又は陽性血清（＋）てル。血
清稀釈率ｌ／２０゜ 第１２図はＬｌ■巾土二 を用いた場合の陰性血清で
（１）、陽性血清で（２）又はごく最近感染した動物の
肝臓から分離した白血球の培養」二澄液で（３）、肝臓
リンパ節からの白血球の上澄 ６ 液で（４）又は膝窩リンパ節からの白血球の培養上澄液
で（５）それぞれプローブしたオンコスフェラ抗原のウ
ェスタンプロットを示す図面に代る比較写真である。１
０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル。 第１３図はＣ，５ｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ
を用いた場合で還元性緩衝液に溶解した試料の１２．
５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのニトロセルローズげ上
水７ ウェスタンプロットシ珈面に代る比較写真であり（Ａ）
はアミド黒色により着色したもので、レーン１は分子量
標準、レーン２はＷＡ １０３０分離細胞抽出物のもの
である。（Ｂ）はＣ，５ｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓに感染した羊から得られた１：１００．４ｆｆ稀釈
血清でＷＡ１０３０分離細胞抽出物をプローブしたもの
で、レーン１は血清を感染直前に採集したもず。矢印は
特許請求の範囲に記載の蛋白質抗原を表わす。 第１４図はＣ，５ｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ
を用いた場合その抗原の等電点電気泳動性斑点を示す
図面に代る比較写真であり、 該抗原は ６．９ の を有している。
した羊からの培養上澄液により同定されたＬ３及びＬ４
の調剤中の抗原（矢印を入れた）を示す１２、５％ Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲルによるウェスタンプロット
の結果を示す図面に代る比較写真である。予め着色させ
た分子量標準（ＢＩＯＲＡＤ）も示しである。 第１Ｂ図ばＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓによって感染テスト
した羊からの培養上澄液により同定されたＬ４の調剤中
の抗原（矢印を入れた）を示す７．５−１５％の勾配Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル上のウェスタンプロットの
結果を示す図面に代る比較写真１ である。予め着色させた分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
も示しである。 第２図ばＨ、ｃ ｏ ｎ ｔ ｏ ｒ ｔ： ｕ ｓに
ついての非還元条件のもとての１２５％５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル上でのアフィニティー精製した蛋白質
の銀着色ゲルを示す図面に代る比較写真である。アフィ
ニティー精製した蛋白質は第ル−ンに、そして分子量標
準（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は第２レーンに示しである（
分子量は×１０３の値）。抗体活性の部分を括弧で括っ
て示しである。 第３図はＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓを用いた免疫−テスト
感染の動物からの培養上澄液でプローブした後のアフィ
ニティー分離した抗原のウェスタンプロットを示す図面
に代る比較写真である（レーンＡ）。第１図と同様に、
予め着色させた分子量標準マーカ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
も示しである。 第４図はｌ−１，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓを用いた場合の以
下の培養を行なった後にアフィニティー分離した抗原の
ウェスタンプロットを示す図面に代る比較写真である。 すなわち、レーンＡはプロテイナーセに２ とともに、レーンＢはトリプシンとともに、そしてレー
ンＣはグリコペプチダーゼＦとともにそれぞれ培養した
ものを、またレーンＤは酵素を用いないコントロールを
示す。分子量（Ｐｈａｒｍａｃｉａ： ＭＷＸ１０３）
も示しである。 第５図はＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓを用いた場合のアガロ
ースＩＥＦゲル両性イオン範囲３−５からのニトロセル
ローズへのＩＥＦ毛管トランスファを示した図面に代る
比較写真であり、これは免疫動物からの培養上澄液でプ
ローブしたものである。ＩＥＦ標準（Ｂｉｇ−Ｒａｄ）
を用いたｐＨ範囲が載せである。 第６図はと」」１■■ を用いた場合の７．５１５％
５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのウェスタンプロットを示す
図面に代る比較写真である。分子量は第１図と同様子め
着色された分子量マーカ（ＢＩＯＲＡＤ）である。レー
ン１及び４はＮＥＪ抗原調剤、レーン２及び５は成虫の
吸虫抗原調剤、レーン３及び６は１２日齢の吸虫の抗原
調剤である。レーン１．２及び３は感染した牛のＨＬＮ
細胞からの培養上澄液でプローブしたものであり、レー
ン４．５及び６は一次感染を短縮した及び慢性となった
羊の１０日テスト感染のＨＬＮからの培養上澄液混合物
でプローブしたものである。括弧は特許請求の範囲に記
載されている抗原を示す。 第７Ａ図はＦ、 ｈｅ ａｔｉｃａ を用いた場合の
硝酸銀で着色させた７、５−１５％ ５ＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルを示す図面に代る比較写真である。レーン１は還元
性試料緩衝液中の高分子量マーカ（Ｂｉｏｒａｄ）を、
レーン２は予め着色した分子量マーカ （Ｂｉｏｒａｄ
）を、そしてレーン３は非還元性試料緩衝液中の新しく
脱嵌した若生（ＮＥＪ’）の抗原調剤のものを示し、括
弧は特許請求の範囲に記載の抗原の位置を示す。第７Ｂ
図は同じく硝酸銀で着色させた １０％５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲル示す図面に代る比較写真である。レーン１は非還
元性緩衝液中の標準マウス血清、レーン２及びレーン３
は非還元性試料緩衝液中のｎ−ブタノール抽出した抗原
調剤のものであり、１０００００ Ｇ、５０ 分間の
遠心分離の後の上澄液（レーン３）及びペレット（レー
ン２）のものである。レーン４及び５はＮＥＪ音波処理
物を１０００００ Ｇ で５０分間遠心分離した後の
ペレット（レーン４）及び上澄液（レーン５）のもので
ある。括弧の部分は特許請求の範囲に記載の抗原成分の
部分である。 第８図はＬ」月１牡並 を用いた場合の硝酸銀で着色さ
せた１０％ＳＤＳゲルを示し、音波処理したＮＥＪ抗原
創剤のアフィニティー精製後の結合分画（レーン２）及
び非結合分画（レーン３）を示す図面に代る比較写真で
ある。括弧は特許請求の範囲に１己載の抗原の位置を示
す。レーン１ば第１図と同様子め着色した分子量マーカ
（ＢＩＯＲＡＤ）である。 第９図はＴ、 ｈ ｄａｔｉ ｅｎａ を用いた場合
の免疫ｌテスト感染（＋）の、又は無テスト感染（−）
の羊から分離した肝臓リンパ球からの培養上澄液でプロ
ーブした非還元性試料緩衝液中のオンコスフェラ抗原の
１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのウェスタンプロット
を示す図面に代る比較写真である。 ５ 第１０図はＴ、 ｈ ｄａｔｉ ｅｎａ を用いた場
合のオンコスフェラ抗原の１／２ 稀釈及び１／４
稀釈のもの（０％及び０％）のウェスタンプロット及
び多節条虫嚢壁抗原調剤のウェスタンプロット（Ｂ）及
び多節条虫頭部抗原調剤のそれ（Ｓ）の第９図と同じ陽
性培養上澄液によるブロービングを示す図面に代る比較
写真である。 １０％５ＤＳＰＡＧＥゲルを使用した。 シグマ分子量マーカは還元性緩衝液中で作用する。矢印
は特許請求の範囲に記載の抗原を示す。 第１１図はＴ、 ｈ ｄａｔｉ ｅｎａ を用いた場
合の陽性培養上澄液（＋）と感染後の同じ時に同し羊か
ら採取した陰性血清（−）又は陽性血清（＋）てル。血
清稀釈率ｌ／２０゜ 第１２図はＬｌ■巾土二 を用いた場合の陰性血清で
（１）、陽性血清で（２）又はごく最近感染した動物の
肝臓から分離した白血球の培養」二澄液で（３）、肝臓
リンパ節からの白血球の上澄 ６ 液で（４）又は膝窩リンパ節からの白血球の培養上澄液
で（５）それぞれプローブしたオンコスフェラ抗原のウ
ェスタンプロットを示す図面に代る比較写真である。１
０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル。 第１３図はＣ，５ｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ
を用いた場合で還元性緩衝液に溶解した試料の１２．
５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのニトロセルローズげ上
水７ ウェスタンプロットシ珈面に代る比較写真であり（Ａ）
はアミド黒色により着色したもので、レーン１は分子量
標準、レーン２はＷＡ １０３０分離細胞抽出物のもの
である。（Ｂ）はＣ，５ｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓに感染した羊から得られた１：１００．４ｆｆ稀釈
血清でＷＡ１０３０分離細胞抽出物をプローブしたもの
で、レーン１は血清を感染直前に採集したもず。矢印は
特許請求の範囲に記載の蛋白質抗原を表わす。 第１４図はＣ，５ｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ
を用いた場合その抗原の等電点電気泳動性斑点を示す
図面に代る比較写真であり、 該抗原は ６．９ の を有している。
Claims (36)
- （１）或る病原体に対する少なくとも一つ以上の抗体を
製造する方法において、 その病原体又は病原体抽出物に感染しているか又はそれ
を接種した動物から生物学的試料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これら細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そし
て それら細胞からその作り出された抗体を回収すること を包含する方法。 - （２）生物学的試料を免疫動物から採取する、請求項１
記載の方法。 - （３）生物学的試料を、免疫動物が病原体又はその抽出
物の作用を受けた後、短時間のうちに採取する、請求項
１記載の方法。 - （４）生物学的試料が感染部位又は病巣領域、或は感染
部位又は病巣の近傍の部分から採取される、請求項１記
載の方法。 - （５）病原体が寄生体、腫瘍、細菌、ウィルス、マイコ
プラズマ、クラミジア、リケッチア、スピロヘータ、黴
類、プロトゾア、蠕虫類及び外部寄生性節足動物よりな
る群から選ばれるか、又は自己抗原である、請求項１記
載の方法。 - （６）生物学的試料から分離された細胞が、分泌物及び
／又は抗体を産生する期間の含まれていることの知られ
ている時期において分離されたＢ細胞である、請求項２
記載の方法。 - （７）Ｂ細胞が免疫動物が病原体又は病原体抽出物の作
用を受けた後、短時間のうちに分離される、請求項６記
載の方法。 - （８）生物学的試料から分離された細胞が記憶細胞を包
含する、請求項１記載の方法。 - （９）前記培地に細胞活性化剤を加え、前記分離された
細胞を活性化及び／又は増殖させて種々の抗体を分泌及
び／又は放出させる ことを更に包含する、請求項１記載の方法。 - （１０）細胞活性化剤がマイトジェン類及びヘルパー因
子類、又はそれらの合成的等価物或はそれらの組み合わ
せよりなる群から選ばれる、請求項９記載の方法。 - （１１）抗原を精製するにあたり、 粗抗原混合物と 適当な支持材の上に固定した、或る病原体に対する抗体
と を準備し、その際この抗体は下記の方法、すなわち 或る病原体又は病原体抽出物に感染しているか又はこれ
を接種した動物から生物学的試料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これらの細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そ
して これら細胞から生産された抗体を収集すること を包含する方法によって作られたものであり、上記粗抗
原混合物を上記固定された抗体の利用のもとにアフィニ
ティークロマトグラフィーにかけ、そして そのようにして形成された精製抗原を分離すること を包含する、精製方法。 - （１２）下記、すなわち 或る病原体又は病原体抽出物に感染しているか又はこれ
を接種した動物から生物学的試料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これらの細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そ
して これら細胞から生産された抗体を収集すること を包含する方法によってつくられた、或る病原体に対す
る少なくとも一つ以上の抗体を含む抗体プローブ。 - （１３）下記の方法、すなわち 或る病原体又は病原体抽出物に感染しているか又はこれ
を接種した動物から生物学的試料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これらの細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そ
して これら細胞から生産された抗体を収集する方法 によってつくられた、或る病原体に対する少なくとも一
つ以上の抗体を含む抗体プローブと、病原体の試料と を準備し、 上記病原体試料を上記抗体プローブによってプローブし
て少なくとも一つ以上の抗原を検出し、そして その検出された抗原を分離すること を包含する、或る病原体に伴う抗原の製造方法。 - （１４）病原体の試料が寄生体、腫瘍、細菌、ウィルス
、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチア、スピロヘ
ータ、黴類、プロトゾア、蠕虫類及び外部寄生性節足動
物よりなる群から選ばれる、請求項１３記載の方法。 - （１５）病原体の試料が寄生体、寄生体の抽出部分又は
寄生体の分画部分である、請求項１４記載の方法。 - （１６）寄生体が￥Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓｃｏｎｔｏｒ
ｔｕｓ￥、￥Ｆａｓ￥−ｃｉｏｌａｈｅｐａｔｉｃａ￥
及び￥Ｔａｅｎｉａｈｙｄａｔｉｇｅｎａ￥よりなる群
から選ばれたものである、請求項１５記載の方法。 - （１７）病原体の試料が細菌又は細菌の抽出部分である
、請求項１３記載の方法。 - （１８）バクテリアが￥Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｐｓｅｕｄｏ￥−￥ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ￥であ
る、請求項１７記載の方法。 - （１９）攻撃に対して最も敏感であると考えられる発育
段階において、病原体から試料を採取する、請求項１３
記載の方法。 - （２０）病原体が寄生性多節条虫による感染であり、試
料をそのオンコスフェラの段階において採取する、請求
項１９記載の方法。 - （２１）病原体が寄生体による感染であり、そして試料
をその幼若段階から採取する、請求項１９記載の方法。 - （２２）病原体が寄生性吸虫類による感染であり、試料
をその吸虫類の幼若段階から採取する、請求項１９記載
の方法。 - （２３）下記、すなわち 或る免疫動物からこの動物が或る病原体又は病原体抽出
物の接種を受けた後短時間のうちに採集した生物学的試
料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これらの細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そ
して これら細胞から生産された抗体を収集すること を包含する方法によってつくられた、或る病原体に対す
る少なくとも一つ以上の抗体を含む抗体プローブと、 攻撃に対して最も敏感であると考えられる発育段階にお
いて病原体から採取した試料と を準備することを包含する、或る病原体に伴う抗原の製
造方法。 - （２４）下記、すなわち 或る病原体又は病原体抽出物に感染しているか又はこれ
を接種した動物から生物学的試料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これらの細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そ
して これら細胞から生産された抗体を収集すること によってつくられた、或る病原体に対する少なくとも一
つ以上の抗体を含む抗体プローブと、病原体の試料と を準備することを包含する方法によって作られた、或る
病原体に対する防御抗原。 - （２５）２５キロダルトンと３４キロダルトンとの各近
似的分子量を有する抗原から選ばれた、本文記述の通り
の、￥Ｔａｅｎｉａｈｙｄａｔｉｇｅｎａ￥による感染
に対する防御抗原。 - （２６）６７ないし７５キロダルトンの近似的分子量を
有する、本文記述の通りの、￥Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ￥
￥ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ￥による感染に対する防御抗原。 - （２７）１２０ないし１２５キロダルトンの近似的分子
量を有する、本文記載の通りの、￥Ｆａｓｃｉｏｌａ￥
￥ｈｅｐｔａｔｉｃａ￥による感染に対する防御抗原。 - （２８）３８ないし４０キロダルトンの近似的分子量を
有する、本文記載の通りの、￥Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
￥−￥ｒｉｕｍｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ
￥による感染に対する防御抗原。 - （２９）或る病原体に対する抗体を産生することができ
且つ該病原体に対する防御抗原で免疫された動物から得
られるＢ細胞と 或る骨髄腫細胞とを 準備し、 上記Ｂ細胞を上記骨髄腫細胞と融合させ、 それにより形成されたハイブリドーマを増殖させ、そし
て 上記ハイブリドーマにより産生された抗体を採集するこ
と を包合する、或る病原体の抗原に対するモノクローナル
抗体の製造方法。 - （３０）請求項２９の方法によって作られた防御抗原に
対するモノクローナル抗体。 - （３１）下記、すなわち 或る病原体の試料から引き出されたｃＤＮＡライブラリ
又はゲノムライブラリから合成されたポリペプチド及び 前述した抗体プローブ、これから導かれたモノクローナ
ル抗体又はその誘導体よりなる群から選ばれた抗体プロ
ーブ を準備し、 上記ｃＤＮＡライブラリ又はゲノムライブラリからの合
成ポリペプチドを上記抗体プローブによってプローブし
、 それにより検出された合成の抗原性ポリペプチドを分離
する ことを包含する、或る病原体に対する合成的抗原性ポリ
ペプチドの製造方法。 - （３２）下記の方法、すなわち 或る病原体又は病原体抽出物に感染しているか又はこれ
を接種した動物から生物学的試料を準備し、 この生物学的試料から細胞を分離し、 これらの細胞を試験管中で適当な培地の中で培養し、そ
して これら細胞から生産された抗体を収集すること によってつくられた、或る病原体に対する少なくとも一
つ以上の抗体を含む抗体プローブと、病原体の試料と を準備し、 上記病原体試料を上記抗体プローブによってプローブし
て少なくとも一つ以上の抗原を検出し、そして その検出された抗原を分離すること を包含する方法によってつくられた、或る病原体に対す
る診断性抗原の含まれた診断用キット。 - （３３）前記した、￥Ｔａｅｎｉａｈｙｄａｔｉｇｅｎ
ａ￥、￥Ｈａｅｍｏｎ￥−￥ｃｈｕｓｃｏｎｔｏｒｔｕ
ｓ￥、￥Ｆａｓｃｉｏｌａｈｅｐａｔｉｃａ￥及び￥Ｃ
ｏ−ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓ￥よりなる群から選ばれた病原体に対
する、少なくとも一つ以上の防御抗原の有効量を動物に
投与することを含む、動物の疾病の防止方法。 - （３４）請求項３０記載の防御抗原に対するモノクロー
ナル抗体の、治療的に有効な量を動物に投与することを
含む、動物の疾病の処置方法。 - （３５）前記した、￥Ｔａｅｎｉａｈｙｄａｔｉｇｅｎ
ａ￥、￥Ｈａｅｍｏｎ￥−￥ｃｈｕｓｃｏｎｔｏｒｔｕ
ｓ￥、￥Ｆａｓｃｉｏｌａｈｅｐａｔｉｃａ￥及びロー
￥ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ￥よりなる群から選ばれた病原体に対す
る、少なくとも一つ以上の防御抗原の、予防的に有効な
量を含むワクチン又は獣医学的組成物。 - （３６）請求項３０記載の少なくとも一つ以上のモノク
ローナル抗体の治療上有効な量を含むワクチン又は獣医
学的組成物。
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