NO178893B - Fremgangsmåte for fremstilling av antistoff mot sykdomspatogen - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av minst ett antistoff mot et sykdomspatogen og anvendelse derav for identifisering av antigenet hos patogenet i en rå aritigenblanding, anvendelse derav immobilisert på en egnet bærer for rensing av et antigen, hvori en rå antigenblanding underkastes affinitetskromatografi ved bruk av det immobiliserte antistoff, og isolering av det rensede antigen hos patogenet som gjenkjennes av det immobiliserte antistoff, en fremgangsmåte for fremstilling av et antigen knyttet til et sykdomspatogen, samt en fremgangsmåte for fremstilling av et beskyttende antigen som gir beskyttelse til et dyr mot et sykdomspatogen.

Betraktelig anstrengelse er allerede nedlagt i utvikling av vaksiner for å kontrollere parasittiske, bakterielle og andre infeksjoner i dyr, inkludert husdyr. Imidlertid er det blitt oppnådd lite fremgang inntil nå i løpet av de siste 5 år, selvom den beslektede teknologi i produksjon av fremmede produkter i store mengder i eukariote og prokariote organismer har gjort enorme fremskritt. Identifiseringen av beskyttende antigener i viktige patogene infeksjoner i dyr, f.eks., har forblitt den prinsipielle barriere for dannelsen av vaksiner.

En av hovedgrunnene til dette er den enorme kompleksitet hos f.eks. parasittiske organismer som kan ha opptil 10, % av den genetiske informasjon av et pattedyr, og følgelig har evnen til å produsere en enorm mengde produkter på forskjellige stadier av sin livssyklus, hvorav bare noen få behøver å være viktige i utvikling av en effektiv vaksine. I de fleste tilfeller blir forskeren konfrontert med hundrevis av potensielle antigener. Det sentrale problem som fortsatt står igjen, er hvilke som er de parasittiske antigener som gir vertsbeskyttende immunresponser. Kloningen av et parasitt-antigen valgt på grunnlag av håp eller inspirasjon, kan med betraktelig vanskelighet, pengeforbruk og tid i teorien resultere i utvikling av en effektiv vaksine. Imidlertid har i de fleste tilfeller denne tilnærming resultert i nederlag. Innen den tidligere fagkunnskap har, når det gjelder parasittiske infeksjoner, hovedvekten blitt lagt på kart-legging av råparasitt-antigenblandinger, parasitt cDNA eller genomiske samlinger med fullserum-antistoffet anvendt som "prober". Serum inneholder store antall antistoffer mot andre patogener og antigener. I tillegg er de fleste antistoffer mot parasitten rettet mot ikke-beskyttende antigener.

Veldig liten anstrengelse er blitt gjort for å forbedre antistoff-probene anvendt til å kartlegge råparasitt-antigenblandinger eller parasitt-cDNA-samlinger, selvom dette er vesentlig for påvisningen av beskyttende antigener og målingen av beskyttende epitoper i disse antigener under deres påfølgende molekulære kloning.

For eksempel er Haemonchus contortus en tarmparasitt i

sau som lokaliserer seg i abomasum (fjerde mage). Sene larve-og voksen-stadier av parasitten lever av fullblod. Parasitten er ansvarlig for et betydelig økonomisk tap for saueindustrien i Australia og betraktelig tap på andre kontinenter, da den er en potensiell dødelig sykdom. På tross av disse tap er ingen

vellykket vaksine blitt utviklet på dette området mot denne parasitten.

Kaseøs lymfadenitt (forkortet CLA, også kalt "osteaktig kjertel" er en kronisk infeksjon i sau og geit som er forårsaket av bakterien Corynebacterium pseudotuberculosis (syn. C. ovis). En kompleks celle-fri vaksine for CLA ( GLANVAC, Commonwealth Serum Laboratories) er tidligere kjent og blir vanligvis administrert enten alene eller som del av en 6 komponent antibakteriell vaksine (6 i 1). Beskyttelsen som gis av denne vaksine er tilskrevet den inaktiverte toksin

(dvs. toksoid) komponent. Toksinet har en relativ molekylvekt på omtrent 31 k dalton når det kjøres på 12,5 % SDS-PAGE under reduserende betingelser. Mens denne tidligere vaksine gir noe beskyttende virkning, er vaksinen kompleks og dyr, og

signifikante antall infeksjoner kan fortsatt forekomme.

Fasciola hepatica (leverikte) er en parasittinfeksjon som utvikler seg i leveren og gallekanalene i sau og storfe. Leverikte kan forårsake kroniske og akutte tap i sau og storfe-industrien. Tallrike profylaktiske og terapeutiske behandlinger er kjent innen den tidligere fagkunnskap, mén deres virkninger har vist seg å være begrensete, og leverikte forblir en kronisk veterinærsykdom.

Taenia hvdatigena er en parasittinfeksjon som også utvikler seg- i leveren til sau. Den overføres fra dyr til dyr ved infiserte hunder og kan gi noe tap 'i saueindustrien. Ingen vellykket vaksine er blitt utviklet innen den tidligere fagkunnskap mot denne parasitt.

Det er følgelig et mål for den foreliggende oppfinnelse å overvinne, eller i det minste bøte på, en eller flere av vanskelighetene innen kjent teknikk.

Følgelig gir den foreliggende oppfinnelse i et første aspekt en fremgangsmåte for å produsere minst ett antistoff mot et patogen, idet fremgangsmåten inkluderer

a) tilveiebringelse av en biologisk prøve fra et immunt dyr tatt en kort tid etter det immune dyr er blitt angrepet med et patogen eller patogenpreparat, hvilken biologiske prøve er tatt fra et infeksjonssted, eller et lesjons-område, eller et område nær eller som tømmer infekssjons-stedet eller lesjonen innbefattet tømmende lymfeknuter; b) isolering av de antistoffproduserende celler fra den biologiske prøve; c) dyrking av de antistoffproduserende celler fra den biologiske prøve in vitro i et egnet kulturmedium, og d) høsting av antistoffet produsert av de antistoffproduserende celler.

Dyret hvorfra den biologiske prøve kan tas, kan være av en hvilket som helst egnet type. Dyret hvorfra den biologiske prøve blir tatt, kan være et immunt dyr. Den biologiske prøve kan tas en kort tid etter at det immune dyr er blitt smittet med en patogen infeksjon. Dyret kan være et pattedyr inkludert mennesker. Pattedyret kan være et husdyr slik som sau eller storfe.

I den følgende beskrivelse vil det refereres til en fremgangsmåte for å identifisere parasittiske og bakterielle immunogener som er viktige i sykdommer på sau og storfe, spesifikt for parasitt - infeksjoner Taenia hvdati<g>ena (cetode), Haemonchus cortortus (namatode), Fasciola hepatica (trematode) og det bakterielle patogen Corynebacterium pseudotuberculosis.

Det skal imidlertid være klart at slike immunogener og

patogener kun er illustrerende, og fremgangsmåten er hovedsakelig anvendbar i forbindelse med dyr og mennesker. Spesielt kan fremgangsmåten beskrevet her anvendes til å påvise immunogene i auto-immune sykdommer.

Den biologiske prøve fra dyr kan være av en hvilken som helst egnet type. Den biologiske prøve kan være fra dyrevev, organer, blod, lymfe eller lymfeknuter. Den biologiske prøve kan tas fra et hvilket som helst snitt fra det infiserte dyr. Imidlertid er det foretrukket at prøvene tas fra det infiserte sted eller et område med en skade som kan dannes i visse sykdommer eller et område nært det infiserte, sted eller en skade slik som i lymfeknutene.

Imidlertid er serum/plasma prøver ikke foretrukne som biologiske prøver i henhold til av dette aspekt av den foreliggende oppfinnelse. Det er blitt funnet at majoriteten av antistoffer funnet i en serum/plasmaprøve er irrelevante for beskyttelse eller spesifikk diagnostikk av et patogen eller er urelaterte til patogenet. I tillegg kan andre serum/plasma-komponenter interferere med de spesifikke reaksjoner mellom patogene komponenter og antistoffer mot dem.

Derimot er probene beskrevet i den foreliggende oppfinnelse høyt anriket i patogen-spesifikke antistoffer og kan selekteres til å være begrenset til det patogene stadium av spesiell viktighet for beskyttende immunitet.

Det er foretrukket at de biologiske prøver tas fra dyrene på et forutbestemt tidspunkt i utviklingen av en sykdom. For en parasitt-infeksjon er det hovedsakelig blitt funnet at de biologiske prøver bør tas en kort tid etter en infeksjon med et patogen eller etter injeksjon med produkter oppnådd fra et patogen. Det er postulert at en parasitt er sårbar bare en kort tid etter at den går inn i individet, hvoretter den forandrer struktur og ikke lenger er sårbar overfor immunangrep og ikke lenger kan indusere beskyttende antistoffer.

Cellene isolert fra den biologiske prøve kan inkludere B celler. Cellene kan isoleres på samme måte på et tidspunkt kjent for å inkludere en sekresjon og/eller antistoff produserende perioder. Alternativt kan cellene inkludere minneceller som kan dannes på et senere stadium i visse sykdommer.

Således blir cellene fortrinnsvis tatt en kort tid etter in vivo stimulering, fortrinnsvis innen omtrent 2 til 13 dager etter dette, med f.eks. relevante parasitt-stadium, hvilket derved resulterer i in vivo induksjon av antistoffdannede celler som vil utskille spesifikke antistoffer inn i kulturmediet etter in vitro inkubering. Ingen eller veldig få antistoffer kan utskilles i kulturmedium uten forutgående in vivo stimulering av hvilende lymfocytter.

In vitro sekresjon av antistoffer i kulturmediet ved nylig aktiverte B celler kan forbedres ved tilsetning av hjelpefaktorer til kulturene. Hjelpefaktorene kan være cytokiner anvendt alene eller i kombinasjon> inkludert Interleukin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 og 8, kolonistimulerende faktorer, interferoner og alle andre faktorer som kan vises å ha en forbedrende virkning på spesifikk B celle sekresjon.

Fremgangsmåten for å produsere et antistoff i henhold til dette aspekt av den foreliggende oppfinnelse kan inkludere et videre trinn med aktivering av de isolerte celler til å formere seg og utskille og/eller frigjøre antistoffer.

Celleaktiveringstrinnet kan inkludere tilsetning av et celleaktiverende agens til kulturmediet. Det celleaktiverende agens kan være dannet fra parasitt eller kan være valgt fra mytogener og hjelpefaktorer produsert av leukocytter eller deres syntetiske ekvivalenter eller kombinasjoner av disse..

Mitogenene kan være valgt fra produkter dannet fra kermesbær (Phytolacca americana) også kjent som kermesbærmitogen (PWM), polyvinylpyrrolidon (PVP), polyadenylpolyuridylsyre (poly(A-U), renset proteinderivat (PPD), polyinosin-polycytidilsyre (poly(I-C), lipopolysakkarid (LPS), stafylokokk organismer eller produkter av disse, bacto-streptolysin 0 reagens (SLO), stafylokokkfaglysat (SPL), Epstein-Barr virus (EBV), Nocardia vannløselig mitogen (NWEM), fytohemagglutinin (PHA), Concanavalin A (Con A) og dekstran-sulfat og blandinger av disse. Celle-formeringsagenset kan være et hvilket som helst middel som indirekte eller direkte resulterer i B-celleformering og/eller antistoff-sekresjon slik som fast-fase anti-immunoglobulin. Hjelpefaktorene kan være cytokiner, inkludert interleukin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 og 8, kolonistimulerende faktorer, interferoner og alle andre hjelpefaktorer som kan vises tilsatt alene eller i kombinasjon med andre faktorer og midler, å ha en forbedrende virkning på spesifikk B-celleformering og/eller antistoff-sekresjon. Dette er på ingen måte ment å være en uttømmende liste over mitogener og celle-påvirkende agens inkludert hjelpefaktorer.

In vitro dyrkingen av cellene kan utføres med eller uten forhåndstrinn for å adskille subpopulasjoner av celler. Høstningen av antistoffer kan utføres ved høstning av supernatanten fra kulturmediet. Denne supernatant inneholder antistoffer utskilt av disse celler under in vitro dyrkingen eller kunstig frigjort fra B cellene, f.eks. ved lysis av B cellene. Det er overraskende blitt funnet at de antistoff-inneholdende supernatanter kan anvendes direkte til å påvise antigener i et patogen.

Følgelig tilveiebringer et videre aspekt av den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å fremstille et antigen knyttet til et sykdomspatogen ved

a) tilveiebringelse av en prøve av et patogen tatt fra et sykt dyr på et utviklingsstadium hvorunder det antas å

være mest utsatt for angrep,

b) tilveiebringelse av en antistoffprobe inneholdende minst ett antistoff mot et sykdokspatogen, hvilket antistoff er

fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge hvert av kravene

1-7, c) prøving av patogenprøven med antistoffproben for å påvise minst ett antigen gjenkjent av antistoffet, og

d) isolering av det påviste antigen.

Sykdomspatogenet kan være av en hvilket som helst egnet type. Sykdomspatogenet kan være dannet fra alle infeksiøse agenser, inkludert virus, chlamydier, rickettsier, myco-plasmer, bakterier, spirocheter, sopp, protozoer, innvolls-ormer (trematoder, nematoder, cestoder) og ectoparasittiske arthropoder (f.eks. flått, midd, spyfluer) eller kan være et autoantigen eller tumorantigen.

Sykdomspatogenet er fortrinnsvis en parasitt, et parasitt-ekstrakt eller et parasitt-snitt av denne. Sykdomspatogener kan velges fra Haemonchus contortus, en tarmparasitt på sau, Fasciola hepatica (leverikte) en parasittinfeksjon som utvikler seg i leveren og gallekanalene i sau og storfe eller Taenia hydatiaena, en parasittinfeksjon som også utvikler seg i leveren i sau. Andre parasitter inkluderer Lucilia cu<p>rina. Trichostronqylus spp, Boophilus spp, Osterta<g>ia spp, Schistosome spp, Taenia spp og Echinococcus spp. Imidlertid er oppfinnelsen ikke begrenset til dette, og beskrivelsen som følger, er bare illustrert ved referanse til disse parasitter.

I et alternativt aspekt kan den patogene prøve tas fra en bakterie. For eksempel kan bakterien Corvnebacterium pseudotuberculosis anvendes.

I et foretrukket aspekt av fremgangsmåten blir en prøve av et sykdomspatogen tatt fra et sykdomspatogen i et uviklingsstadium hvorunder det antas å være mest følsomt for angrep.

Sykdomspatogenet hvorfra en prøve kan tas, kan tas på et utviklingsstadium av patogene hvorunder det er tenkt å være mest følsomt for angrep. For eksempel, for en parasittisk cestodeinfeksjon, kan det være egnet å ta prøven fra onkosfære-stadiet. Det er blitt funnet at antigenene tilstede i onkosfære-stadiet i en parasittinfeksjon ikke er tilstede i f.eks. metacestode-stadiet. For en parasittisk orminfeksjon kan det være egnet å ta prøven fra larve-, fortrinnsvis sent larve-stadium. For en parasittisk ikte-infeksjon kan det være egnet å ta prøven fra det unge iktestadium.

Prøven av sykdomspatogen kan blandes med en standard-bufferløsning og plasseres på en standard bærer slik som en

SDS-poly-akrylamidgel for å separere proteinene inneholdt i denne. De separerte proteiner kan så overføres til nitrocellulose, nylon eller andre plater.

Probingen med et egnet antistoff kan videre inkluderer at man underkaster produktet produsert ved dette en påvisnings-måling. Påvisningsmålingen kan inkludere Western blot teknikker. Påvisningsmålingen kan være en immunopresipiter-ingsmåling, en radioimmuno-assay, en enzymbundet immunoassay eller immunofluoriserende assay.

Det i det minste ene antistoff produsert som beskrevet ovenfor kan anvendes ganske enkelt i form av supernatanten innhøstet fra kulturmediet. Alternativt kan antistoffene separeres og renses.

Antigenet lokalisert som beskrevet ovenfor, kan påvises ved å anvende enhver egnet målingsteknikk.

I et videre foretrukket aspekt av den foreliggende oppfinnelse kan antistoffet i kulturmediet anvendes til affinitetsrensing, fortrinnsvis immuno-affinitetsrensing av antigen.

Antigenet renses fra en råantigenblanding ved bruk av

et antistoff mot et sykdomspatogen immobilisert på en egnet bærer, idet dette antistoff er fremstilt ved at det tas en biologisk prøve fra et dyr infisert med eller smittet av patogenet eller patogenekstraktet; isolering av celler fra den biologiske prøve; dyrking av celler in vitro i et egnet kulturmedium; og høsting av antistoffer produsert fra nevnte celler; idet den rå antigenblanding affinitetskromatograferes ved å anvende det immobiliserte antistoff; og det således dannede rensede antigen isoleres.

Antistoff kan oppnås fra kultursupernatantproben ved konvensjonelle fremgangsmåter. For eksempel kan vanlige fremgangsmåter til å rense immunoglobuliner fra serum eller plasma, f.eks. presipitering med ammoniumsulfat, fraksjonering med kaprylsyre, ionebytter-kromatografering eller ved binding og eluering fra immobilisert protein G eller protein A, anvendes. Antistoff oppnådd på denne måten, kan så bindes til egnede bærere, f.eks. CNBr-aktivert Sefarose 4B (PHarmacia) Affi-gel (Bio-RAD) eller andre affinitetskromatograferings-bærere i stand til å binde proteiner.

Immobilisert antistoff kan så anvendes til fraksjonering og rensing av spesifikt antigen fra komplekst parasittekstrakt ved affinitetskromatografering. Etter binding av antigen til immobilisert antistoff kan ubundede makromolekulære stoffer vaskes bort fra den faste bærer med f.eks. buffere som inneholder 1,5 M NaCl. Videre kan antigenet elueres fra affinitets-kolonnen med f.eks. lav eller høy pH buffer eller buffere som inneholder kaotropiske ioner, f.eks. 0,5-3,0 M natriumtiocyanat.

Anvendelsen av antistoffprobene til affinitetskromatografering muliggjør at tilstrekkelige mengder av spesifikke antigener hurtig kan isoleres fra en kompleks råekstraksjons-blanding for biokjemisk karakterisering, aminosyresekvensering og vaksinering av dyr for begrensete beskyttelsesstudier. Anvendelse av affinitetskromatografering for å oppnå antigen(er) omgår vanskelighetene som ofte møtes når man anvender konvensjonelle biokjemiske teknikker til rensing av et antigen når få eller ingen data er kjent. Det omgår også behovet for å danne polyklonale eller monoklonale antistoffer til "analytisk" affinitetskromatograferingsformål. Fremstilling i stor skala kan imidlertid kreve fremstilling av polyklonale eller mono-klonale antistoffer.

Antigenene som blir isolert eller lokalisert kan anvendes ved fremstilling av monoklonale antistoffer. De monoklonale antistoffer kan danne grunnlaget for en passiv behandling av sykdommen diskutert ovenfor. Når man har identifisert antigenet (ene), kan molekulærbiologi eller kjemiske teknikker, f.eks. kloningsteknikker, anvendes til å produsere ubegrensede mengder av dette antigen, eller alternativt kan syntetiske peptider som korresponderer med forskjellige fragmenter av de identifiserte antigener, anvendes som en måte å produsere en vaksine på.

I et videre aspekt av den foreliggende oppfinnelse fremstilles et beskyttende antigen mot et sykdomspatogen ved

a) tilveiebringelse av en prøve av patogenet,

b) tilveiebringelse av en antistoffprobe inneholdende minst ett antistoff mot et antigen i forbindelse med et patogen

produsert ved en fremgangsmåte ifølge krav 10,

c) prøving av patogenprøven med antistoffproben for å påvise minst ett beskyttende antigen, og d) isolering av antigenet som gir beskyttelse til et dyr mot patogenet. .De beskyttende antigener kan anvendes som diagnostiske antigener som diskutert nedenfor.

Følgelig, i et foretrukket aspekt av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et beskyttende antigen mot Taenia hvdati<g>ena infeksjoner, valgt fra antigener som har omtrentlige molekylvekter på 25 og 34 kilodalton, som beskrevet heretter. Da kryssbeskyttelse mellomforskjellige cestoder er dokumentert, kan like antigener også påvises i andre cestodearter, f.eks. T. saginata, T. ovis, T. solium, Echinococcus granulosus, mot Haemonchus contortus infeksjoner som har en omtrentlig molekylvekt på 67 til 75 kilodalton som beskrevet heretter. I et videre foretrukket aspekt av den foreliggende oppfinnelse er det gitt et beskyttende antigen mot Fasciola hepatica infeksjoner, som har en omtrentlig molekylvekt på 120 til 125 kilodalton, som beskrevet heretter, eller mot Corynebacterium pseudotuberculosis infeksjoner, som har en omtrentlig molekylvekt på 38 til 40 kilodalton, som beskrevet heretter. Dette antigen er et proteinantigen.

Et monoklonalt antistoff mot et antigen der et sykoms-patogen kan fremstilles av en B-celle i stand til å produsere antistoffer mot nevnte antigen og oppnådd fra et dyr immunisert med et beskyttende antigen mot sykdomspatogenet som beskrevet ovenfor; og en myelomcelle; sammensmelting av B-cellen med myelomcellen; propagering av et hybridom dannet ved dette, og ved innhøsting av antistoffet produsert av nevnte hybridom.

Den foreliggende oppfinnelse kan benytte et diagnostisk testsett, derunder et diagnostisk antigen mot et sykdomspatogen identifisert og renset som beskrevet ovenfor.

Det diagnostiske testsett kan anvendes til å påvise infeksjoner i dyr inkludert Taenia hydati<g>ena, Haemonchus contortus, Fasciola hepatica og Corynebacterium pseudotuber-culosis.

Den foreliggende oppfinnelse vil nå bli nærmere beskrevet under henvisning til følgende eksempler.

I figurene:

FIGUR IA - H. Contortus

Western blot fra en 12,5 % SDS polyakrylamidgel som viser antigener i L3 og L4 preparatet (merket med piler) identifisert ved kultursupernatanten fra immunsmittet sau. Formerkede molekylvektstandarder (BIORAD) er angitt.

FIGUR IB - H. contortus

Western blot.fra en 7,5 til 15 % gradient SDS-polyakryl-amid-gel som viser antigener i L4 preparatet (merket med piler) identifisert ved kultursupernatant fra immunsmittet sau. Formerkede molekylvekt (BIORAD) er angitt.

FIGUR 2 - H. contortus

Sølvfarget gel av affinitetsrensede proteiner på en 12,5 % SDS-polyakrylamidgel under ikke-reduserende betingelser. De affinitetsrensede proteiner er i felt 1 og molekylvektstandarder (Pharmacia) er gitt (mw x IO3) . Området med antistoffreaktivitet er i klamme.

FIGUR 3 - H. contortus

Western blot av affinitetsisolerte antigener etter probing med kultursupernatant fra et immunsmittet dyr (felt A). Formerkede molekylvektmarkører (BIORAD) som i fig. 1.

FIGUR 4 - H. contortus

Western blot av affinitetsisolert antigen etter inkubering med proteinase K (felt A) , trypsin (felt B), glykopeptidase F (felt C) og kontroll (ikke noe enzym) (felt D) . Molekylvekter (Pharmacia) (mw x IO<3>) er angitt.

FIGUR 5 - H. contortus

IEF-kapilær-overføring til mikrocellulose fra et agarose-IEF-gel-amfolyttområde 3-5 og probet med kultursupernatant fra et immunt dyr. Ph området når man anvender IEF standarder (BIORAD) er gitt.

FIGUR 6 - F. hepatica

Western blot fra en 7,5 - 15 % SDS-PAGE gel MW=formerkede molekylvektmarkører (BIORAD) som i fig. 1.

Felt 1 & 4 - NEJ antigen preparat

Felt 2 Sc 5 - Voksent flått antigen preparat

Felt 3 & 6 - 12 dagers gammelt flått antigen preparat

Felt 1, 2 og 3 ble probet med kultursupernatant fra HLN celler fra infisert storfe.

Felt 4, 5 og 6 ble probet med en blanding av kultur-supernatanter fra HLN fra 10 dagers smittet sau med en forkortet eller kronisk primærinfeksjon.

Klammer = foreliggende antigen.

FIGUR 7 - F. hepatica

(A) 7,5 - 15 % SDS-PAGE gel farget med sølvnitrat,

felt 1 - høymolekylvektmarkører (BIORAD) i reduserende prøvebuffer.

felt 2 - formerkede molekylvektmarkører (BIORAD). felt 3 - nylig ekscystert juvenilt (NEJ) antigen-preparat i ikke-reduserende prøvebuffer.

Klammer = posisjon av foreliggende antigen.

(B) 10 % SDS-PAGE gel farget med sølvnitrat.

felt 1: normalt museserum i ikke-reduserende

buffer.

felt 2 & 3 n-butanol-ekstrahert antigen preparat i ikke-reduserende prøvebuffer. Pellet (2) og supernatant (3) etter 100.000 g sentrifugering i 50 minutter.

felt 4 & 5 supernatant fra NEJ ultralydbehandlet.

Pellet (4) og supernatant (5) etter 100.000 g sentrifugering i 50 minutter.

Klammer = foreliggende antigen.

FIGUR 8 - F. hepatica

10 % SDS gel farget med sølvnitrat.

Bundet (felt 2) og ikke-bundet (felt 3) fraksjon etter affinitetsrensing av ultralydbehandlet NEJ-antigen-preparat.

Klammer = posisjon av foreliggende antigen.

Felt 1 = formerkede molekylvektmarkører (BIORAD) som i fig. 1.

FIGUR 9 - T. hydatiqena

Western blot fra en 10 % SDS-PAGE gel av onkosfære-antigen i ikke-reduserende prøvebuffer probet med kultursupernatant fra leverlymfocytter isolert fra immun-smittet ( ) eller ikke-smittet ( ) sau.

FIGUR 10 - T. hydatiqena

Probing av Western blot av onkosfære antigen (O) ved fortynninger på 1/2 og 1/4 og probing av Western blot fra blærevegg metacestode antigen (B) preparater og scolex metacestode antigen (S)' preparater med den positive kultursupernatant som i fig. 9. 10 % SDS-PAGE gel.

Piler = foreliggende antigener.

Sigma molekylvektmarkører kjørt i reduserende buffer.

FIGUR 11 - T. hydatiqena

Probing av Western blot av onkosfære antigen med negativt serum ( - ) eller positivt serum ( + ) tatt fra samme sau på samme tid etter infeksjon som den positive kultursupernatant ( ). 12 % SDS-PAGE gel. Serumfortynning 1/20.

FIGUR 12 - T. hydatiqena

Western blot av onkosfære antigener probet med negativ (1) eller positiv (2) serum- eller kultursupernatant fra leukocytter isolert fra lever (3), hepatisk lymfeknute (4) eller preskapulær lymfeknute (5) fra nylig infiserte dyr. 10 % SDS-PAGE gel.

FIGUR 13 - C. pseudotuberculosis

Western blot på nitrocellulose fra 12,5 % SDS-PAGE prøver løst i reduserende buffer.

A. Farget med amidsvart.

Felt 1 - molekylvektstandarder

Felt 2 - WA 1030 isolatcelle ekstrakt.

B. WA 103 0 isolatcelle-ekstrakt probet med sera ved 1:1000 fortynning oppnådd fra en sau infisert med C. pseudotuber-culosis.

Felt 1 - serum tatt umiddelbart før infeksjon.

Felt 2-2 dager etter infeksjon

Felt 3-4 dager etter infeksjon

Felt 4-7 dager etter infeksjon

Felt 5-11 dager etter infeksjon

Felt 6-14 dager etter infeksjon

Piler = foreliggende proteinantigen

FIGUR 14 - C. psueidotuberculosis

Isoelektrisk fokusering av C. pseudotuberculosis antigen. Antigen har pH mellom 6,8 og 6,9.

EKSEMPEL 1

Haemonchus contortus

Haemonchus contortus er en tarmparasitt fra sau som oppholder seg i abomasum (fjerde mage). Sene larve- og voksne stadier av parasitten lever av fullblod. Parasitten er ansvarlig for betydelig økonomisk tap for saueindustrien i Australia og betraktelig tap på andre kontinenter og er en potensielt fatal sykdom. På tross av disse tap er ingen vellykket vaksine blitt utviklet tidligere mot denne parasitten.

Parasitt og forsøksdyr

H. contortus tredje stadiums larver (L3) ble oppsamlet fra fecale kulturer fra donorsau eksperimentelt infisert med parasitten. Immune dyr ble oppnådd ved gjentatte ganger å infisere sau med H. contortus larver og så kontrollere antall egg i faeces. Når en smittedose ikke produserte noen egg i faeces, ble dyret ansett å være immun. Så snart det var immunt, fikk sauen være i fred i minst 4 uker før den ble smittet med 50.000 - 200.000 L3 larver og så drept 5 dager etter smitte.

Fremstilling av kultursupernatanter

Abomasum-lymfeknuter som drenerer infeksjonsområdet (abomasum), ble fjernet og cellesuspensjoner fremstilt som beskrevet for T. hydatigena nedenfor. Kulturer med volumer på 10 - 50 ml ble satt opp i kultur-kolber (Miles) ved konsentrasjon på 2 - 4 x IO<6> celler/ml i kulturmedium. Forhånds-forsøk stadfestet at de fleste av antistoffene i kultursupernatanten ble produsert av antistoff-utskillende celler tilstede i de in vivo stimulerte lymfeknuter, og at dette ikke ble videre økt ved stimulering med kermesbærmitogen (PWM).

PWM ble derfor deletert fra kulturene og kultursupernatanter ble innhøstet etter en 5 dagers inkubering av celler ved 3 7°C i en 5 % C02 atmosfære og lagret ved -20°C inntil anvendt.

Stadium- spesifikk gjenkjennelse av antigener ved kultursupernatant

Tredje-stadiums larver av H. contortus ble antihylster-behandlet med 0,05 % natriumhypoklorit i 10 minutter ved 37°C for å fjerne annen-stadium-hylstere. Larvene ble så gjentatte ganger vasket og sentrifugert ved 3.000 g i 10 minutter i fosfatbuffret saltvann (PBS) pH 7,4. Etter den sjette vasken ble de overført til 500 ml DME medium pH 6,8 i nærvær av 200 U/ml penicillin og 0,2 /xg/ml streptomycin og dyrket ved 39°C med 20 % C02 i luft i 5 dager. Kulturmediene ble så sentrifugert ved 3.000 g i 15 minutter ved 20°C. L3, in vitro skiftet L4 og voksne parasitter ble fjernet og mekanisk homogenisert ved å anvende en teflon-morter og et matt glassrør i 2 0 minutter ved 4°C i nærvær av 0,1 % Empigen zwitterion detergent (Calbiochem) i PBS og 5 mM fenylmetyl-sulfonylfluorid (PMSF). De homogeniserte larver ble umiddelbart delt i aliquote mengder og lagret ved -70°C. Frosne aliquote mengder ble tint og blandet 1:1 med SDS ikke-reduserende prøvebuffer og kokt i 5 minutter før de ble sentrifugert i 2 minutter ved 5.000 g kjørt på en 12,5 % SDS-polyakrylamid minigel (BIORAD) i henhold til fremgangsmåten til Laemmli (197a). Gelen ble så elektroforetisk overført til nitrocellulose (Kerlero de Rosbo et al., 1984) og probet med serum eller kultursupernatanter fra abomasum lymfeknuteceller fra immune smittede eller ikke-smittede immune sauer. Western blot ble blokkert med 0,5 % Tween 2 0 i PBS, og alle vaskinger ble gjort i 0,05 % Tween 20 i PBS. Det andre antistoff var et kanin anti-saue immunoglobulin bundet til pepperot-peroksidase (Dako) og så utviklet med 3'3-diaminobenziden (Sigma) og hydrogenperoksyd.

Larveantigener ble påvist mellom omtrent 67-75 kilodalton (Kd) i de in vitro dyrkede fjerde-stadiums-larver (L4) og tredje-stadiums (L3) antihylsterbehandlede larver fra H. contortus probet med kultursupernatant fra immunisert sau (fig. 1). Ingen antigener ble identifisert i molekylvektene nevnt ovenfor for voksne Haemonchus preparater (data ikke vist). Det var ingen reaksjon når supernatant fra ikke-smittet immun sau ble anvendt til å probe "blottene" (ikke vist), hvilket indikerte at alle antistoffene produsert i kultur-supernatanten fra den immune smittede sau ble indusert ved 5 dagers in vivo smitte. Lik probing av Western blottene med serum fra de samme dyr tatt samtidig reagerte med flere bånd i alle tre parasitt-stadier, men fremhevet ikke 67 - 75 kD antigenet (ikke vist). I motsetning til kultursupernatanten derimot, kunne ingen forskjell påvises mellom serum fra immunisert eller immun ikke-smittet sau.

Fremstillin<g> av L, antigen for affinitetsrensing

Råantigen for affinitetsrensing ble fremstilt ved å skjær-kraftomrøre in vitro omskiftede L4 larver med en polytron vev-homogenisator i 30 sekunder på is i nærvær av 0,05 % Empigen i 0,1 M Tris pH 8,0 og 5 mM PMSF. Etter polytron-behandling ble SDS tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 2 %, og prøven kokt i 3 minutter i vannbad, så sentrifugert ved 35.000 rpm i 30 min. ved 4°C. Etter sentrifugering ble SDS fjernet fra supernatant ved å presipitere proteinet i henhold til "fremgangsmåte A" beskrevet av Henderson, Oroszlan og Konigsberg (1979) . Etter SDS-fjerning ble 7 M Guanidin hydroklorid (IBI) tilsatt til proteinpresipitatet og tillatt å stå i 5 timer på is. Et likt volum av 25 % glycerol i destillert vann ble tilsatt, og hele prøven dialysert mot PBS og 0,05 % Empigen pH 7,4. Prøven ble så påført til en affinitetskolonne.

Affinitetsrensing av antigen

En affinitetskolonne ble konstruert for å isolere det spesifikke antigen ved først å fjerne antistoffer fra kultursupernatanten fra immun-smittet sau ved å anvende både protein G Sepharose (Pharmacia/LKB) og esel anti-saue antistoffer (Dako) bundet til Affi-prep (BIORAD) i henhold til produsentens beskrivelser. De rensede antistoffer ble så bundet til Affi-prep (BIORAD) i henhold til produsentens instruksjoner og kolonnen ekvilibrert i PBS og 0,05 % Empigen detergent.

L4 antigener ble satt på affinitetskolonnen og ubundete proteiner fjernet ved å anvende 0,5 M NaCl pH 7,4 og 0,05 % Empigen. Bundne proteiner ble eluert ved å anvende 1 M NH4SCN (Ajax) i PBS. Eluatet ble kontrollert ved OD280 . Etter eluering ble prøven nøye dialysert mot 0,005 M Tris pH 8,3, lyofilisert og lagret ved -70°C. Prøver ble resuspendert i destillert vann og anvendt til videre analyse.

Sølvfarging og Coomassie farging av affinitetsisolert antigen

På vanlige SDS-PAGE geler kunne flere bånd sees når man sølvfarget gelene i henhold til fremgangsmåten til Morrissey

(1981) figur 2. Immunoblotting og probing med kultursupernatanter fra immunisert sau resulterte i en veldig sterk antistoff-respons i 67 - 75 kd område i det affinitetsisolerte preparat (fig. 3). Imidlertid kunne ingen bånd, verken på sølv eller coomassie fargede geler, korreleres positivt med dette område av antistoff-reaktivitet. Det skulle derfor vise seg at dette spesielle molekyl ikke farges med de konvensjo-nelt anvendte proteinfarger.

Enzvmdigestioner

6 ( ig av af f initetsisolert antigen fra fjerde stadiums larver ble inkubert over natten ved 37°C med enten Glycopeptidase F (20 ( il) (Boehringer Mannheim) eller proteinase K (10 ( ig) (Sigma) i 0,1 M Na-f osf atbuf f er pH 8,0 som inneholdt 10 mM EDTA, 0,1 % SDS, 0,5 % Triton-X-100 og 0,1 % S-merkaptoetanol. I tillegg ble antigenet inkubert med trypsin (10 izg) (Difco) i PBS. Etter inkubering ble alle prøver blandet med SDS ikke-reduserende buffer, kokt i 5 minutter og satt på en 12,5 % SDS-polyakrylamidgel, overført til nitrocellulose og probet med kultursupernatant som tidligere beskrevet. Både proteinase K- og trypsinbehandling resulterte i nedbrytning av proteinet, slik at det ikke var noen gjenkjennelse av antistoffer i kultursupernatanten (hhv. felt A og B). Glykopeptidase F hadde ingen virkning på antigenet, som ga det samme resultat som kontrollinkubering (felt C og D). Dette indikerer at antigenet har en protein-komponent som er nedbrytbar med proteinase K og trypsin. Imidlertid viser proteinet seg å ikke inneholde asparagin-bundede glykaner under disse betingelser.

Iso- elektrisk punkt for antigenet

Tynnskikt-iso-elektrisk fokuserings(IEF)geler ble fremstilt ved å anvende en plast templat (Corning Immuno-elektroforeseplate) i henhold til fremgangsmåten til McLachlan og Cornell (1978). Hver IEF gel besto av 0,95 % v/v av IEF agarose (BIORAD), 11,4 % v/v D-sorbitol (Sigma), 4,8 % bærer amfolytter (BIORAD) område 3-5 eller 3 - 10 og destillert vann. Vannet, sorbitol og agarose ble kokt, så plassert på et 56°C vannbad. Amfolinene ble så tilsatt, løsningen helt på templaten og et stykke Gelbond (FMC Pharmacia) lagt over. Templaten ble plassert i en plastpose og lagret ved 4°C i minst 2 timer før anvendelse. 1 fj. 1 af f initetsrenset antigen ble påført og gelen ble kjørt ved 1 watt konstant i 45 minutter. Etter avslutning ble gelen overlagt med nitrocellulose (Schleicher og Schuell) fulgt av flere stykker filterpapir og en glassplate som vekt. Proteiner diffunderte så fra gelen til membranen i 1 time, hvoretter membranen ble blokkert og probet med kultursupernatant som tidligere beskrevet. Resultatene indikerte tilstedeværelse av et sterkt surt protein med et iso-elektrisk punkt under 4,65 som angitt ved IEF standarder (BIORAD) fig. 5.

EKSEMPEL II

Fasciola hepatica

Fasciola hepatica (leverikte) er en parasitt fra trematode-familien som kan utvikle seg i leveren og gallekanalene i mange pattedyr og er av spesiell økonomisk viktighet for sau og storfe-industrien. Ingen profilaktiske behandlinger, slik som vaksiner mot leverikte, er på markedet. Mens sau ikke utvikler noen immunitet mot F. hepatica, kan storfe bli delvis resistent mot reinfeksjon. Selvom mekanismen for resistens hos storfe ikke er blitt fulgt ut belyst, er det en mulighet for at storfe gjenkjenner et forskjellig (beskyttende) antigen enn sau. Teknikken beskrevet ovenfor ble derfor anvendt til å. studere den forskjellige antigengjenkjennelse hos sau og storfe.

Anti<q>enpreparater

1. Nvli<q> ekcysterte unge individer ( NEJ)

F. hepatica metacercarier (Mc) ble kjøpt fra Baldwin Aquatics (Monmouth, Oregon, USA) . Metacercarier ble ekcystert ved hjelp av suspensjon i 20 ml DME medium som inneholdt 100 mg Na-Tauro-cholinsyre, 80 mg L-cystein. Suspensjonen ble gasset i en blanding av 40 % C02, 10 % 02 og 50 % N2, inkubert ved 37°C og NEJ oppsamlet etter filtrering gjennom metallnett. Sedimentert NEJ ble resuspendert i fosfatbuffret saltvann som inneholdt protease-inhibitorer (PBS-PI) (5 mM jodacetamid og 1 mM PMSF) og ultralydbehandlet. Aliquote mengder ble lagret ved -70°C.

2. Unge ikter

Mus ble infisert oralt med 3 0 Mc og drept 12 dager senere. Knuste levere ble vasket gjennom en tesil,og de unge ikter ble utvunnet ved differensiell sentrifugering. Antigen ble fremstilt som ovenfor.

3. Voksen ikte

Infiserte levere fra sau eller storfe ble oppnådd fra et slakteri. Voksne ikter ble utvunnet fra galle-kanalen, homogenisert med en vevskvern, delt i aliquote mengder og frosset ved -70°C.

SDS- polyakrylamidgel elektroforese ( SDS- PAGE) og Western blotting

Som for Haemonchus, men bare 7,5 - 15 % gradientgeler eller 10 % SDS-PAGE geler ble kjørt. Alle antigener ble blandet 1:1 med ikke reduserende buffer. Storfe og saueantistoffer ble påvist ved å anvende hhv. peroksydase-konjugert kanin-anti-storfe eller saue-immunoglobuliner

(DAKO).

Butanolekstraksi on

Nylig excysterte unge individer suspendert i PBS-PI ble ultralydbehandlet og sentrifugert i 10 minutter ved 5.000 g. Supernatanten ble anvendt til affinitetsrensing som beskrevet senere. Pelleten ble resuspendert i PBS-PI, og et likt volum av kald n-butanol ble tilsatt. Blandingen ble inkubert på is i 10 min. med vortexblanding av og til, og så sentrifugert ved 5.000 g i 5 minutter. Den vann-løselige fraksjonen ble oppsamlet i bunnlaget.

Af finitetsrensing

Antistoffer ble renset fra kultursupernatanten fra infisert storfe (se senere) ved å anvende sefarosebundet protein G (Pharmacia) og anvendt til fremstilling av en affinitetskolonne i det vesentlige som beskrevet for H. contortus.

Triton X-100 R-S (Sigma) ble tilsatt til en NEJ ultralydbehandlet supernatant (se ovenfor) ved en sluttkonsentrasjon på 2 %. Den ultralydbehandlede supernatant ble satt på affinitets-kolonnen og ubundede fraksjoner vasket gjennom med PBS som inneholdt 0,1 % Triton X-100 R-S og 1 mM PMSF fulgt av 1,5 M NaCl.' Den bundne fraksjonen ble eluert med 2 M NH4SCN i PBS, dialysert mot destillert vann og frysetørket. Frysetørkede fraksjoner ble resuspendert i PBS for videre anvendelse.

Fremstilling av kultursupernatant

Tre sauer og tre storfe ble infisert oralt med 400 metacercarier. 18 dager senere ble de dosert med FASINEX 120 (CIBA-GEIGA Australia Ltd.) for å eliminere primærinfeksjonen. Dyrene fikk være i fred i 3 5 dager til før de ble smittet oralt med 400 metacercarier.. De ble drept 10 dager etter smitte. Hepatisk lymfeknuter (HLN) ble fjernet, celler isolert og inkubert ved 2 - 4 x IO<6> celler/ml i kulturmedium med PWM som beskrevet for T. hydatigena og supernatantene innhøstet etter 7 dager in vitro kultur. Tilleggskultur-supernatant ble oppsamlet fra HLN celler fra sau som bar en ubehandlet primær F. hepatica infeksjon (80 Mc) og smittet med 300 Mc 10 dager før slakting.

Resultater

Probing av Western blot med kultursupernatant fra HLN celler fra infisert storfe resulterte i sterk antistoff-reaktivitet mot et dublett antigen i NEJ antigenpreparatet lokalisert kort ovenfor den høyeste formerkede molekylvekt-markør (Fig. 6). Bare ett bånd på det høyere molekylvektnivå i NEJ dubletten var samsvarende tilstede i 12 dagers gamle ikte-preparater, mens et likt bånd i det voksne iktepreparat ikke kunne påvises på pålitelig måte i flere gjentatte forsøk. Derimot ble ingen reaksjoner med NEJ antigen observert på Western blot ved probing med kultursupernatant fra likt infisert (forkortet primær og 10 dagers smitte) sau (ikke vist). Når antigenpreparatene ble probet med en blanding av denne saue-kultursupernatant og kultursupernatant fra kronisk infisert og smittet sau, ble ingen reaksjon observert med båndet gjenkjent av storfesupernatant, selvom andre bånd ble sterkt gjenkjent (fig. 6).

Forskjellig fra den begrensede reaktivitet i kultursupernatant en, reagerte like Western blot probet med serum fra samme dyr samtidig mye diffusere med en rekke bånd i alle 3 parasitt-stadier, og ingen åpenbar forskjell mellom storfe- og saue-serum kunne observeres (ikke vist).

Sølvfarging av det totale NEJ preparat farget ikke tydelig antigenet gjenkjent av storfekultursupernatanten, hvilket tydet på at den er en mindre komponent av den totale molekylsamling hos parasitten (fig. 7a). Ved å måle posisjonen til antigenet på et replikat Western blot i forhold til den høyeste formerkede molekylvektmarkør, ble dets omtrentlige molekylvekt på SDS-PAGE gel ved å anvende BIORAD høy MW markører brukt som standarder beregnet ved 12 0-125 Kd. Klar sølvfarging av dubletten i NEJ preparatet kunne sees når en n-butanol-ekstrahert løselig fraksjon av en NEJ ultralydbehandlet pellet ble kjørt på en SDS-PAGE gel (fig. 7b) .

Affinitetsrensing på okse-antistoffkolonnen resulterte i en tydelig reduksjon av antigenet fra den ikke-bundne fraksjon og høy anrikning i den bundne fraksjon (fig. 8). I tillegg var det også et sterkt lavmolekylvekt (+ 24 Kd) bånd i den bundne fraksjonen, som også reagerte sterkt med vevskultur-supernatanten på Western blot (ikke vist), hvilket tydet på at lav MW båndet skyldtes nedbrytning av 120 - 125 Kd antigenet under affinitetsprosedyren.

EKSEMPEL 3

Taenia Hydatiqena

MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER

Parasitt og forsøksdyr

T. h<y>datiqena egg ble oppsamlet fra modne orm-segmenter etter å ha skaffet avføring fra infisete hunder med arecolin hydrobromid. 2 års gamle sauer holdt på gårder ble anvendt.

I denne alder har sau hovedsakelig ervervet immunitet mot T. hydatigena gjennom naturlig eksponering, og dette ble bekreftet i forhåndsforsøk. Positive sera og positive kultursupernatanter ble samlet fra sau drept 13 dager etter intraruminal injeksjon av 40 - 50.000 T.hydatigena egg. Negative kultur-supernatanter ble samlet fra sau uten forutgående smitteinfeksjon. Negativt serum ble samlet fra 5 måneders gamle sauer oppdrettet under ormfrie betingelser.

Fremstillin<g> av leucocytt- suspensjoner

Leverleucocytter ble utvunnet ved hjelp av følgende fremgangsmåte. Saueleveren ble fjernet og gjennomskylt via protalvenen med 1 liter fosfatbuffret saltvann (PBS) ved romtemperatur fulgt av 0,5 1 kaldt PBS ved kontinuerlig og forsiktig massasje av leveren. Denne fremgangsmåte resulterte i fullstendig bleking av hele leveren. Omtrent 100 g levervev ble homogenisert i en matprosessor (Goldair, Australia) ved lav hastighet i 8-10 sek. Den homogeniserte lever ble så presset gjennom et metallnett, fikk sedimentere i 8 - 10 minutter, og ble filtrert gjennom bomullsgas. Cellene ble vasket to ganger ved sentrifugering ved 400 g i 8 min., fulgt av en lav sentrifugering ved 10 g i 5 min. for å fjerne små klumper og majoriteten av hepatocytter. Supernatanten fra den siste sentrifugering ble oppsamlet, og de gjenværende hepatocytter og døde celler fjernet ved sentrifugering over Ficoll/Isopaque gradienter.

Leucocytter ble også utvunnet fra lymfeknuter ved å skjære og presse knutene over et finmasket nett. Døde celler og klumper ble fjernet ved sentrifugering over Ficoll.

Fremstilling av kultursupernatant

Leucocytter ble resuspendert ved en konsentrasjon på 2-4 x 10<6>/ml i kulturmedium som besto av DME hvortil det var tilsatt 10 mM HEPES, 100 /xg/ml penicillin, 100 /xg/ml streptomycin, 2,5 x 10"<5> M 2-merkaptoetanol, 2 mM glutamin, 1 mM pyruvat og 10 % fetal kalveserum. 2 ml kulturer ble satt opp i 24 brønns Linbro plater, stimulert med 25 rø/ml kermesbær mitogen (PWM, Gibco Labs., Grans Island, NY) og inkubert ved 3 7°C i en 5 % C02 atmosfære. Etter 7 dager ble kulturene oppsamlet og cellene sedimentert ved sentrifugering. Supernatanten ble lagret ved -20°C inntil den ble anvendt.

Fremstilling av antigener

(a) Onkosfære antigen (0)

T. hydatigena egg utvunnet fra modne ormsegmenter ble klekket ut med natrium hypoklorit, og de frigjorte onkosfærer ble renset over 100 % Percoll. En total mengde på 2,3 x IO<5 >onkosfærer ble resuspendert i 1 ml PBS som inneholdt protease inhibitorer (PBS-PI) (5 mM jodacetimid og 1 mM fenylmetyl-sulfanyl-fluorid) og frosset ved -20°C. Dette preparat ble senere tint, ultralydbehandlet med en MSE 150W ultrasonisk disintergrator (Crawley, England), delt i alikvote mengder og lagret ved -20°C.

(b) Metacestode antigener

Metacestoder ble samlet fra peritonealhulen til sau ved slakting. Cystefluidet ble fjernet, scolex og blærevegger separert og frosset i PBS-PI ved -20°C. Preparatene ble senere tint, homogenisert i en Kinematica Homogeniser (Polytron, Luzern, Sveits) ultralydbehandlet og sentrifugert ved 1400 opm x 15 min. Supernatantene ble delt i aliquote mengder og frosset ved -20°C.

Påvisning av antigener ved Western blot- teknikk

40 iil antigen fraksjoner ble blandet med 40 ixl SDS ikke-reduserende prøvebuffer, kokt i 5 minutter, sentrifugert i 10 minutter ved 5000 g og kjørt på en 10 eller 12 % SDS-poly-akrylamidgel. De separerte proteiner ble overført til nitrocelluloseark over natten. Arkene ble blokket med 3 % kylling ovalbumin (OVA) og skåret i strimler. Spesifikke antigener på strimlene ble åpenbart etter følgende inkuberingstrinn:

(1) kultursupernatant eller serum,

(2) biotinylert esel-anti-saue-Ig (Amersham)

(3) streptavidin-biotinylert pepperrot-peroksydase-kompleks (Amersham) (4) peroksydase-substrat (0,6 mg/ml diaminobenzidin i PBS som inneholdt 0,05 % H202) .

Reagenser ble anvendt ved produsentens anbefalte fortynninger.

(1) Probing av Western blot av onkosfære antigenpreparater åpenbarte at det var 2 adskilte antigenbånd spesifikt gjenkjent av kultursupernatanten oppsamlet fra lever-leucocytter fra nylig infisert sau ( (+) ) , som ikke ble gjenkjent ved kultursupernatanten oppsamlet fra lever-leucocytter fra usmittet, sau ( (£) ) (fig. 9, piler). Disse to antigenbånd ble fortsatt påvist ved den positive kultursupernatant når onkosfærepreparatet ble fortynnet 1/2 og 1/4 og hadde omtrentlige molekylvekter

på 22 K og 35 K (fig. 10).

(2) Når man anvendte den samme positive leverkultur-supernatant for å probe Western blottene fra blærevegg

(B) eller scolex (S) preparater, ble de to onkosfære-antigen-båndene ikke påvist (fig. 10). Dette indikerer

at de to antigen-bånd spesifikt påvist i onkosfærepreparatet er stadium-spesifikke for onkosfæren, parasittstadiet som mest sansynlig vil være følsomt mot

immunangrep.

(3) De to antigenbånd påvist når positiv leverkultur-supernatant ble anvendt til å "probe" onkosfære Western blottene, ble ikke påvist når serum tatt fra den samme sau samtidig etter infeksjonen ble anvendt som probe

(fig. 11).

(4) De to onkosfære-antigenbånd ble også påvist når man anvendte kultursupernatant fra leucocytter isolert fra

lymfeknutene hos nylig infiserte dyr (fig. 12).

EKSEMPEL 4

Corynebacterium pseudotuberculosis Lymphadinitis Caseosa (forkortet CLA, også kalt "Osteaktig kjertel" er en kronisk infeksjon hos sau og geit som er forårsaket av bakterien Corynebacterium pseutotuberculosis (syn. C. ovis). En kompleks cellefri vaksine mot CLA (GLANVAC, Commonwealth Serum Laboratories) er kjent innen det tidligere fagområde og blir vanligvis administrert enten alene eller som del av en 6-komponent antibakteriell vaksine (6 i 1). Beskyttelsen denne vaksine gir, tilskrives den inaktiverte toksin(dvs. toksoid)komponent. Toksinet har en relativ molekylvekt på omtrent 31 k dalton kjørt på 12,5 % SDS-PAGE under reduserende betingelser. Mens den tidligere kjente vaksinen gir noe beskyttende virkning, er vaksinen kompleks og dyr, og signifikante antall infeksjoner kan fortsatt forekomme.

Dette eksempel beskriver isoleringen av et beskyttende antigen fra Corynebacterium pseudotuberculosis-infeksjoner med en omtrentlig molekylvekt på 38 - 40 k dalton.

Identifisering av antigen

Kultursupernatanter ble oppnådd ved å anvende i det vesentlige de samme fremgangsmåter som beskrevet for Heamonchus contortus (eks. 1). Smitte-infeksjoner av immun og uberørt sau ble lokalisert til det nedre ben ved injeksjon av en suspensjon av levende C. pseudotuberculosis, og popliteal-lymfeknuten ble tatt ut og satt i kultur 5 til 7 dager senere.

Western blot analyse av fullceller ved å anvende kultur-supernatanter viste: (i) immun sau gjenkjente et komplekst mønster av antigener, men hos majoriteten av dyr var 38-40 kilodalton antigenet immunodominant (ii) uberørte (ikke-immune) dyr gjenkjente sterkt 38-40 kilodalton antigenet og viste vanligvis liten annen reaktivitet.

Ekstraksion av antigen

Sammenflytende vekst av C. pseudotuberculosis oppnås på Brain Hearth Infusion agar ved aerob inkubering ved 3 7°C i mellom 1 og 3 dager. Celler oppnås ved å skrape fra det faste medium.

Bakteriemassen blir resuspendert i sterilt vann og vasket i vorteksblander, så sentrifugert ved 3000 Xg i 15 minutter. Supernatanten dekanteres, og den våte cellepellet ekstraheres ved resuspensjon i omtrent 4 ganger sitt volum med en løsning av 1,0 % (v/v) natrium-dodecylsulfat (SDS) i vann og opp-varming til mellom 70 - 100°C i 10 minutter. Celler og cellerester fjernes ved sentrifugering ved 10.000 Xg i 15 minutter. Råblandingen inneholder antigener forskjellige fra det inngitte.

Proteinantigenet kan renses fra den komplekse blanding ekstrahert fra SDS fra fullceller av C. pseudotuberculosis som beskrevet ovenfor eller fra cellefri kultursupernatant. Konvensjonelle biokjemiske teknikker kan anvendes, inkludert, ionebytte-og molekylsikt-kromatografering, ammoniumsulfat-fraksjonering sammen med hydrofob kromatografering. I tillegg kan affinitetskromatografering anvendes ved å anvende antistoff isolert fra proben,. immobilisert på en egnet fast fase. Alternativt kan polyklonale eller monoklonale antistoffer dannes ved immunisering av dyr med renset antigen.

Antigenet forblir løselig i ammoniumsulfat-løsninger opptil 50 % metning.

Karakterisering av 3 8 - 4 0 kD antigen

Proteinet har en molekylvekt som viser seg å være mellom 38 - 4 0 kilodalton kjørt under reduserende betingelser på en 12,5 % SDS-polyakrylamidgel. Det kan farges med Coomassie brilliantblå R250 og med sølvfarge. En aminsvart farge på nitrocellulose etter Westernblotting kan også anvendes. Resultater er illustrert i fig. 13a.

Tynnsjikt-isoelektrisk fokusering i 0,95 % agarose som inneholder 11,4 % sorbitol og pH 5 - 8 amfoliner, lokaliserer antigenet til en pH 6,8 - 6,9 ved å anvende, følgende Biorad IEF markører (se fig. 14): fycocyanin - 4,65, B-laktoglobulin B-5,10, storfekarbonisk anhydrase 6,0, human karbonisk anhydrase 6,5, heste myoglobin 7,0, human hemoglobin A 7,1, human hemoglobin C 7,5, cytokrom C 9,6.

Aminosyresekvensanalyse av det naturlige antigen som var blitt eluert fra en SDS-polyakrylamidgel, viser at en del av sekvensen ved eller nær aminoterminus er (idet man beveger seg mot karboksyterminus):

ESATLSKEPLKASPGRADT, VGVQ

(eller om foretrukket Glu, Ser, Ala, Thr, Teu, Ser, Lys, Glu, Pro, Leu, Lys, Ala, Ser, Pro, Gly, Arg, Ala, Asp, Thr, Val, Gly, Val, Gin).

Forskjellige modifikasjoner og/eller forandringer kan gjøres innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse som er beskrevet her.

Referanser

- Henderson, L.E., Oroszlan, S. og Konigsbert, W. 1979 Analytical Biochemistrv 93: 153 - 157. - Kerlero de Rosbo, N., Carnegie, P.R., Bernard, C.C.A. og Linthicum, D.S. 1984. Neurochemistry Research, 9: 1359-1369.

- Laemmli, U.K. 1970. Nature (London) 227: 680 -685.

- McLachlan, R., og Cornell, F.N. 1978 Patholocry, 10: 395 . - Morrissey, J.H. 1981. Analytical Biochemisty, 117: 307-310 . - Ward, E.S., Gussow, D., Griffiths, A.D., Jones, P.T. og Winter, G. 1989, Nature 341: 544-546.

Claims (19)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av minst ett antistoff mot et sykdomspatogen, karakterisert ved kombinasjonen av trinnene: a) tilveiebringelse av en biologisk prøve fra et immunt dyr tatt en kort tid etter det immune dyr er blitt angrepet med et patogen eller patogenpreparat, hvilken biologiske prøve er tatt fra et infeksjonssted, eller et lesjons-område, eller et område nær eller som tømmer infekssjons-stedet eller lesjonen innbefattet tømmende lymfeknuter; b) isolering av de antistoffproduserende celler fra den biologiske prøve; c) dyrking av de antistoffproduserende celler fra den biologiske prøve in vitro i et egnet kulturmedium, og d) høsting av antistoffet produsert av de antistoffproduserende celler.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den biologiske prøve tas fra et dyr i den perioden som patogenet er følsomt for immunangrep etter at dyret er blitt angrepet av patogenet eller patogenekstraktet.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at de antistoffproduserende celler isolert fra den biologiske prøve er B-celler isolert i et tidsrom kjent for å medføre en sekresjon og/eller et antistoffproduserende tidsrom.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at B-cellene isoleres i et tidsrom som parasitten eller patogenet er følsomt for immunangrep etter at dyret er blitt angrepet med patogenet eller patogenekstrakt.

5. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-4, karakterisert ved at de antistoffproduserende celler isolert fra den biologiske prøven innbefatter hukommelses-B-celler.

6. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-5, karakterisert ved at den videre medfører trinnene å tilsette et celleaktiverende reagens til dyrknings-mediet for å aktivere og/eller formere de dyrkede antistoffproduserende celler isolert fra den biologiske prøve for å utskille og/eller frigjøre antistoffer.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at de celleaktiverende middel er valgt fra mitogener og hjelpefaktorer eller deres syntetiske ekvivalenter, patogenavledede molekyler eller en kombinasjon derav.

8. ■ Anvendelse av minst ett antistoff dannet mot et sykdomspatogen, hvilket antistoff er blitt produsert ved en fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-7, for identifisering av antigener hos patogenet i en rå antigenblanding.

9. Anvendelse av et antistoff mot et sykdomspatogen, hvilket antistoff er immobilisert på en egnet bærer og er blitt fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-7, for rensing av et antigen, hvori en rå antigenblanding underkastes affinintetskromatografi ved bruk av det immobiliserte antistoff, og isolering av det rensede antigen hos patogenet som gjenkjennes av det immobiliserte antistoff.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et antigen knyttet til et sykdomspatogen, karakterisert ved: a) tilveiebringelse av en prøve av et patogen tatt fra et sykt dyr på et utviklingsstadium hvorunder det antas å være mest utsatt for angrep, b) tilveiebringelse av en antistoffprobe inneholdende minst ett antistoff mot et sykdokspatogen, hvilket antistoff er fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-7, c) prøving av patogenprøven med antistoffproben for å påvise minst ett antigen gjenkjent av antistoffet, og d) isolering av det påviste antigen.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av et beskyttende antigen som gir beskyttelse til et dyr mot et sykdomspatogen, karakterisert ved: a) tilveiebringelse av en prøve av patogenet, b) tilveiebringelse av en antistoffprobe inneholdende minst ett antistoff mot et antigen i forbindelse med et patogen produsert ved en fremgangsmåte ifølge krav 10, c) prøving av patogenprøven med antistoffproben for å påvise minst ett beskyttende antigen, og d) isolering av antigenet som gir beskyttelse til et dyr mot patogenet.

12. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-11, karakterisert ved at prøven av patogenet velges fra parasitter, tumorer, virus, clamydia, rickettsias, mycoplasmaer, bakterier, spirocheter, sopp, protozoer, helmynter, ektoparasittiske artropoder eller autoantigener hvor antigenet er knyttet til en autoimmun sykdom.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at parasitten er valgt fra Haemonchus contortus. Fasciola hepatica og Taenia hydatiqena.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at patogenprøven er en bakterie eller et bakterieekstrakt.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at bakterien er Coryne-bakterium pseudotuberculosis.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at prøven tas fra et sykdomspatogen på et utviklingsstadium hvorunder det antas å være mest ømfintlig for angrep.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at sykdomspatogenet er en parasittisk cestode-infeksjon, og prøven tas fra onkosfære-stadiet .

18. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at sykdomspatogenet er en parasittisk orminfeksjon og prøven tas på larvestadiet.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at sykdomspatogenet er en parasittisk ikteinfeksjon, og prøven tas på det juvenile iktestadiet.