DK157346B - Fremgangsmaade til bestemmelse af tumor-associeret glycobinding samt fremgangsmaade ved diagnose af cancer - Google Patents
Fremgangsmaade til bestemmelse af tumor-associeret glycobinding samt fremgangsmaade ved diagnose af cancer Download PDFInfo
- Publication number
- DK157346B DK157346B DK339381A DK339381A DK157346B DK 157346 B DK157346 B DK 157346B DK 339381 A DK339381 A DK 339381A DK 339381 A DK339381 A DK 339381A DK 157346 B DK157346 B DK 157346B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- tag
- lectin
- fluid
- labeled
- glycoprotein
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
- Y10S436/813—Cancer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/827—Lectins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
DK 157346 B
Den foreliggende opfindelse angâr en fremgangs-mâde til bestemmelse af tumor-associeret glycobinding (herefter forkortet til TAG), dvs. sukkerrester med en bindingsspecifitet for jordnoddelectin eller ricinusfro-5 lectin eller med sukker beslægtede substanser, der in-deholder nævnte sukkerrester soin en endegruppe. Endvi-' dere angâr opfindelsen en fremgangsmâde ved diagnose af cancer.
Sorti fremgangsmâde til diagnose af cancer har man 10 tidligere malt et specifikt glycoprotein, der specielt findes hos patienter, der lider af cancer. Denne fremgangsmâde g0r hovedsagelig brug af antigeniciteten af glycoproteinets proteindel. Det er f.eks. kendt at diagnosticere primær levercancer ved at mâle a^-15 foetoprotein samt at diagnosticere cancer i et for-dçSjelsesorgan, navnlig rectalcancer, ved at mâle CEA ["Igaku no Ayumi (Progress in Medicine)", Vol. 106, nr. 5, Fifth Saturday Spécial Issue, side 235-250 (1978)]. Anvendeligheden af disse diagnostiske fremgangsmâder 20 er imidlertid forholdsvis begrænset, og der har eksisteret et 0nske om en diagnostisk fremgangsmâde til diagnose af mange forskellige cancersygdomme.
Man har ikke hidtil kendt nogen fremgangsmâder til diagnose af cancersygdomme ved anvendelse af 25 bindingsspecificiteten af sukkerresten i tumor-associeret glycobinding.
Det har vist sig, at vævsvæske fra en patient med cancer indeholder TAG tilvejebragt af udifferenti-erede celler (hovedsagelig cancerceller) og afgivet 30 til væsken, og at TAG er meget forskelligartet med hensyn til kulhydratkædestruktur, kulhydratkædelængde og arten af de indgâende kulhydratrester, og det har, som résultat af vidtstrakte unders0gelser, vist sig,
DK 157346 B
2 at denne TAG omfatter glycoproteiner, glycopeptider, glycolipider og/eller kulhydrater med galactose-(β1-*3 eller β1-*-4)-N-acetylglucosamin-endegruppe eller galactose-(β1·*3 eller β1-*-4) -N-acetylgalactosamin-ende-5 gruppe, at denne TAG specifikt forener sig med lectin, og at man kan fâ kendskab til tilstedeværelsen eller fraværelsen af cancerceller, graden af prolifération og cellernes trivsel og nedbrydning og lignende ved at bringe legemsvæske-TAG til reaktion med lectinen, 10 hvorved cancer kan diagnosticeres. Den foreliggende opfindelse er baseret pâ denne iagttagelse.
I ÜS patentskrift nr. 4.146.603 beskrives tumor-specifikke glycoproteiner (TSGP), der er ekstraheret fra legemsvæske fra patienter med cancer under anvendelse af 15 perchlorsyre. Dette tumorspecifikke glycoprotein har imidlertid affinitet til hvedekimagglutinin, dvs. lectin med specifitet for en N-acetylglucosamin- eller N-ace-tylneuraminsyre endegruppe. Det lectin, der benyttes ifolge den omhandlede fremgangsmâde omfatter imidlertid 20 lectiner, der kan kombineres specifikt med galactose-(81-»3 eller β1-*4)-N-acetylglycosamin eller galactose-{ β 1 —»3 eller 81 —>4 )N-acetylgalactosamin, f.eks. jordnod-delectin og ricinusfrelectin.
I Amer. J. Clin. Nutr. 32, 133-138 (1979) beskri-25 ves anvendelsen af lectiner som et middel til kvantitativ bestemmelse af lectinreceptorer pâ celleoverflader fra rotters tyndtarm. Det fremgâr eller antydes pâ ingen mâde, at lectinreceptorer (f.eks. TAG i legemsvæske) kan benyttes til diagnose af cancer.
30 Chem. Abstr., vol 74 (1971), 138285 omhandler pâvisningen af receptorsteder for hvedekimagglutinin pâ humane tumorcellemembraner.
Chem. Abstr., vol 80 (1974), 12154 omhandler anvendelsen af forskellige lectiner til pâvisning af 35 lectinreceptorer pâ overfladen af lymphoïde celler hos rotter.
DK 157346 B
3 I Chem. Abstr., vol 81 (1974), 167549 beskrives bindingen af forskellige lectiner til overfladen af hu-mane erythrocyter.
I Chem. Abstr., vol 84 (1976), 70691 beskrives 5 interaktionen mellem forskellige lectiner og Ehrlich ascites carcinomacellens overflade.
Medens de ovenfor anforte litteraturhenvisninger alene beskriver tilstedeværelsen af lectinreceptorer pâ forskellige cellers overflader og tilstedeværelsen af tumorspecifikt glucoprotein (TSGP), som adskiller sig fra den ovenfor beskrevne TAG, er det ifolge den fore-liggende opfindelse erkendt, at den ikke tidligere kendte tilstedeværelse af TAG i legemsvæske hos en patient med cancer er meget specifik og med fordel kan benyttes som 15 tumormarkor.
Et formai for den foreliggende opfindelse er derfor at tilvejebringe en fremgangsmâde til mâling af niveauet af legemsvæske-TAG ved hjælp af en konkur-rence-procès eller en sandwich-procès samt tilveje-20 bringe en fremgangsmâde til diagnose af cancer ved mâling af TAG-niveauet.
Dette formai opnâs ved fremgangsmâden ifelge op-findelsen, der er ejendommelig ved, at man konkurrerende omsætter legemsvæske TAG, der skal mâles, og en forudbestemt mæng-25 de, gennem kemisk eller fysisk binding til en uoploselig bærer uoploseliggjort TAG eller TAG-lignende materiale, dvs. galactose-{ 81~»3 eller 81—>4)-N-acetylglucosamin, galactose-(81—»3 eller 81—>4)-N-acetylgalactosamin eller et kulhydrat_derivât, der indeholder nævnte kulhydratkæ-00 de som en.endegruppe, med en forudbestemt mængde, med et enzym, et fluorescerende materiale eller et radioaktivt materiale mærket jordnoddelectin eller ricinusfrolectin, skiller det uoploseliggjorte TAG eller TAG-lignende ma-teriale, der er bundet til mærket lectin, og ubundet 35 lectin fra hinanden ved centrifugering, filtrering eller dekantering, og mâler mærkningsmidlets aktivitet i en af
DK 157346 B
4 disse fraktioner. En variant, son angivet i krav 6, er ejendommelig ved, at man konkurrerende omsætter legemsvaeske TAG, der skal mâles, og en forudbestemt mængde med et enzym, et fluorescerende materia-le eller et radioaktivt materiale mærket TAG eller mærket TAG-lig-5 nende materiale, dvs. galactose-( β 1 ^-3 eller β1 —>4)-N-acetylglu-cosamin, galactose-( $1-> 3 eller 31-*4)-N-acetylgalactos-amin eller et kulhydratderivat, der indeholder nævnte kulhydratkæde som en endegrupp^med en forudbestemt mængde jordnoddelectin eller ricinusfrolectin eller 10 gennem kemisk eller fysisk binding til en uopleselig bæ-rer uoploseliggjort lectin, skiller det mærkede TAG eller mærkede TAG-lignende materiale, der er bundet til lectin eller uoplaseliggjort lectin og ubundet mærket TAG eller mærket TAG-lignende materiale fra hinanden ved 15 centrifugering, filtrering, dekantering, chromatografi, elektroforese, udsaltning, fraktionering, dialyse, adsorption eller under anvendelse af gel, og mêler mærkningsmidlets aktivitet i en af disse fraktioner.
En anden variant, som angivet i krav 11, er ejendommelig 20 ved, at man konkurrerende omsætter legemsvaeske TAG, der skal mâles, med et gennem kemisk eller fysisk binding til en uoploselig bærer uopleseliggjort jordnoddelectin eller ricinusfrolectin til dannelse af et TAG-uoplose-liggjort lectin-kompleks, omsætter dette kompleks med en 25 forudbestemt mængde med et enzym, et fluorescerende materiale eller et radioaktivt materiale mærket lectin, skiller det til det mærkede lectin bundne kompleks og ubundet mærket lectin fra hinanden ved centrifugering, filtrering eller dekantering, og mêler mærkningsmidlets 30 aktivitet i en af disse fraktioner. v Hensigtsmæssige udforelsesformer for fremgangsmâ- den ifolge opfindelsen og for de ovennævnte varianter er angivet i henholdsvis krav 2-5, 7-10 og 12-14.
DK 157346 B
5
Som den legemsvæske, der skal benyttes if01ge op-findelsen, kan anvendes forskellige legemsvæsker, deriblandt blod, vævsvæske, lymfe, thoraxvæske, abdomi-nalvæske, fostervand, mavesaft, urin, bugspyt, cerebro-5 spinalvæske og spyt. Af disse foretrækkes. blod i form af sérum eller blodplasma. Den mængde legemsvæske, der skal benyttes .til bestemmelsen, andrager fra ca. 1 til ca. 10 ml, fortrinsvis fra 2 til 5 ml. Denne legemsvæske kan endvidere renses for at isolere de glyco-10 binding-indeholdende materialer, sâsom glycoproteiner, glycopeptider, glycolipider og/eller saccharider.
Til opnâelse af et materiale med et h0jt indhold af glycobindingen fra legemsvæsker anvendes sædvanlige metoder til ekstraktion eller séparation af glyco-15 binding, sâsom udsaltning, udfældelse, ekstraktion, centrifugering, dialyse, molekylsimetode, inaktivering af enzym eller en kombination deraf. Mere specielt fremstilles en sâdan fraktion ved at sætte sulfosali-cylsyre, trichloreddikesyre eller zinksulfat til sérum 20 eller plasma.eller ved at opvarme sérum eller plasma, frafiltrere et sâledes dannet bundfald til fjernelse af albumin, immunoglobulin osv. og udf0relse af dialyse.
Ved bestemmelsesmetoden if01ge opfindelsen kan udtagne legemsvæskepr0ver, bortset fra blod, benyttes 25 som de er som fors0gspr0ver (i det f01gende forkortet til npr0ver"). For at forhindre pr0ver i at blive denatureret og for at accellerere reaktionen med lectin kan der imidlertid til pr0verne sættes proteiner med lavere sukkerindhold, sâsom okseserumalbumin (BSA) 30 eller lignende som beskyttende proteiner. I nogle tilfælde vil endvidere tilsætning af en egnet mængde beskyttende protein til en pr0ve, hvorfra albumin, immunoglobulin eller lignende er blevet fjernet, give gode resultater. Nâr der er taie om en blodpr0ve,kan 35 sérum opnâet ved en kendt serum-indsamlingsmetode eller plasma opnâet ved en plasma-indsamlingsmetode under anvendelse af et antikoaguleringsmiddel, sâsom heparin, EDTA, citronsyre eller lignende,benyttes som pr0ve,
DK 157346 B
6 idet det foretrækkes at benytte serumpr0ven indsamlet og fremstillet under anvendelse af heparin som anti-koaguleringsmiddel. Nâr TAG-niveauet er forholdsvis h0jt som ved ascites, kan pr0ver om 0nsket fortyndes 5 med en passende pufferopl0sning.
Som eksempler pâ det lectin, der kan benyttes if0lge opfindelsen, skal nævnes de lectiner, der kan kombineres specifikt med galactose-(βΙ^-3 eller β1-*4)-N-acetylglucosamin eller galactose- (β1->·3 eller β1-*-4)-Ν-10 acetylgalactosamin [J.B.C., 250, 8518-8523 (1975)?
Biochem. Biophys. Res. Comm., 62, 144 (1975)? Z. Immu-nitaetsforch, 138, 423-433 (1969)? Br. J. Exp. Pathol., 27, 228-236 (1946)? Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, nr. 5, 2215-2219 (1978)? Biochemistry, 13, 196-204 15 (1974)? Carbohydrate Research, 51, 107-118 (1976)], sâsom jordn0ddelectin, ricinusfre (Ricinus comnunis) lectin osv.
Som eksempler pâ mærkningsmateriale til mærkning af lectin og TAG eller TAG-lignende materiale kan 20 nævnes forskellige enzymer, forskellige fluorescerende materialer og forskellige radioaktive materialer osv.
Sâdanne enzymer omfatter f.eks. glucoamylase, glucose-oxidase, peroxidase, alkàliphosphatasé, β-galactosidase og aktivt fragment af hemoctapeptid osv., fluoresceren-25 de materialer omfatter f.eks. fluorescein, fluorescein-isothiocyanat, rhodamin, dansylchlorid (dvs. 5-dimethyl-amino-l-naphthalensulfonylchlorid) osv.,og radioaktive materialer omfatter f.eks. radioaktivt iod (f.eks.
125i, osv.), radioaktivt tritium osv.
30 I foreliggende beskrivelse betyder udtrykket „ "TAG-lignende materiale" galactose-(β1-Κ3 eller βΙ-^-4)-N-acetylglucoasmin, galactose- (β 1-^-3 eller β1-*-4)-Ν-acetylgalactosamin og kulhydratderivater der indeholder en sâdan glycobinding ved en af enderne. Som sâdanne 35 kulhydratderivater kan f.eks. nævnes glycoprotein fra humant gastrisk mucin, glycoprotein opnâet ved fjernelse af endestillet fucose fra sulfateret glycoprotein fra svine-maveslimhinde, humant IgG glycoprotein
DK 157346 B
*7 / eller dettes asialoderivat, okse-IgG glycoprotein, asialoderivat af glycoprotein fra svine-thyroglobulin-glycobinding B, glycoprotein fra ovomucoid-p-subenhed, glycoprotein B-l fra humant IgE eller dets asialo-5 dérivât, asialoderivat af glycoprotein B-2 eller B-3 fra humant IgE og asialoderivat af glycoprotein II-C ' fra humant IgA·^, asialoderivat af glycoprotein II-B eller II-A fra humant IgA^, asialoderivat af human transferrin-glycoprotein, asialoderivat af okse-10 foetuinglycoprotein, deasialoderivat af glycoprotein, der deltager i optagelse af asialoglycoprotein fra kaninlevercelleprotoplasmamembran, sulfateret glycoprotein fra svine-maves1imhinde, asialoderivat af humant surt glycoprotein, asialoderivat af glyco-15 folin, glycoprotein eller glycopeptid af T-antigen eller lignende, beskrevet i "Biochemical Data Book I" (kompileret af Japanese Chemical Society og udgivet af Tokyo Kagaku Dojin, Nov. 26, 1979), s. 503-510; og asialo GM-^AM·^ og glycolipider af okse-erytrocyt 20 beskrevet i samme litteratursted side 840-841. Af disse foretrækkes asialoderivat af okse-foetuin-glycoprotein, sulfateret glycoprotein af svine-mave-slimhinde, sulfateret glycoprotein af human maveslim-hinde og asialoderivat af humant a1 surt glycoprotein.
25 Uopl0seliggjort TAG, uopl0seliggjort TAG-lignende materiale og .uopl0seliggjort lectin fremstilles ved ke-misk eller fysisk omsætning mellem TAG, TAG-lignende materiale eller lectin med en uopl0selig bærer. Som eksempler pâ en sâdan uopl0selig bærer kan iiævnes 30 cellulosepulver, Sephadex, Sepharose, polystyren, filterpapir, carboxymethylcellulose, ion-bytterharpiks, dextran, plastfilm, plastr0r , nylon, glaskugler, silke, polyamin-methylvinylether-maleinsyre-copolymer, amino-syrecopolymer, ethylen-maleinsyrecopolymer osv. Uopl0se-35 ligg0relsen kan udf0res ved en procès, hvorved der dannes en covalent binding [dvs. en diazoproces, en peptidproces(f.eks. en syreamid-afledt procès, en carboxychloridharpiks-proces, en carbodiimidharpiks-
DK 157346 B
8 procès, en maleinsyreanhydrid-afledt procès, en iso-cyanat-afledt procès, en cyanbromid-aktiveret poly-saccharid procès, en cellulosecarbonat-afledt procès, en procès hvorved der benyttes et kondensationsmiddel 5 osv.), en alkyleringsproces, en bærer-bindingsproces, hvorved der benyttes et tværbindingsmiddel, sâsom glutaraldehyd, hexamethylenisocyanat, osv.], en bærer-bindingsproces if01ge ügi reaktion, og lignende; en ionbindingsproces, hvorved der benyttes en sâdan bærer 10 som ionbytterharpiks; og en fysisk adsorptionsproces, hvorved der benyttes por0st glas, sâsom glaskugler, som bærer. Af disse foretrækkes den cyanbromidaktive-rede polysaccharidproces indenfor de processer, hvorved der dannes en covalent binding,og den bærer-bindings-15 procès, hvorved der benyttes et tværbindingsmiddel.
If0lge den cyanbromidaktiverede polysaccharidproces kan uopl0seliggjort TAG, uopl0seliggjort TAG-lignende materiale eller uopl0seliggjort lectin opnâs ved at omsætte TAG osv. med en 10 til 1000 gange sa stor 20 mængde af en cyanbromidaktiveret bærer i et egnet opl0sningsmiddel ved 0 til 40°C, fortrinsvis ved 20 til 30°C,i 2 til 4 timer.
Uopl0seliggjort TAG osv. kan ogsâ fremstilles if0lge en strâlingsinduceret' polymerisationsproces.
25 Det vil sige, der fremstilles en vandig dispersion af en polymeriserbar monomer indeholdende TAG eller TAG-lignende materiale og dispersionen bestrâles med lys eller ioniserende strâling til polymérisation af den monomère. Til fremstilling af den vandige dis-30 persion kan en hydrofob polymeriserbar monomer [A] - dispergeres i en 0,1 til 5 vægt% vandig opl0sning af vandopl0selig polymer [B]. Alternativt kan hydrofil polymeriserbar monomer [C] eller en blanding af hydrofob polymeriserbar monomer [A] og hydrofil polymeri-35 serbar monomer [C] dispergeres i en 3 til 20 vægt%'s vandig saltopl0sning, eller hydrofob polymeriserbar monomer [A] kan dispergeres i en vandig opl0sning indeholdende 0,01 til 5 vægt% overfladeaktivt middel [D].
DK 157346 B
9 Nâr den sâledes opnâede dispersion bestrâles med lys eller ioniserende strâling polymeriseres den polymeri-serbare monomère/ der forefindes deri som dispers fase, til dannelse af en polymer matrix for TAG eller lig-5 nende. Om 0nsket kan denne formes til et ark eller partikler.
Som specielle eksempler pâ den hydrofobe polymer iserbare monomer [A] skal nævnes glycidylmethacrylat/ ethylenglycoldimethacrylat, diethylenglycoldimethacrylat, 10 triethylenglycoldimethacrylat, trimethylolpropantrime-thacrylat/ polyethylenglycol-200-dimethacrylat/ dipro-pylenglycoldimethacrylat/ 1,4-butylenglycoldimethacry-lat/ 1/6-hexanglycoldimethacrylat, methoxydiethylen-glycoldimethacrylat/ methylmethacrylat/ ethylmethacrylat, 15 butylmethacrylat og de tilsvarende acrylater deraf. I almindelighed kan en vilkârlig vanduopl0selig monomer/ der kan polymeriseres ved strâling med lys eller anden strâling,benyttes uanset dens art.
Som specielle eksempler pâ den hydrofile polymeri-20 serbare monomer [C] kan nævnes 2-hydroxyethylmethacrylat, methoxytetraethylenglycolmethacrylat, methoxypolyethy-lenglycol-400-methacrylat, methoxypolyethylenglycol-1000-methacrylat/ polyethylenglycol-400-dimethacrylat/ poly-ethylenglycol-600-dimethacrylat og de tilsvarende 25 acrylater samt methacrylsyre/ acrylamid/ N-vinyl-2-pyrrolidon osv. I almindelighed kan en hvilken som helst vandopl0selig monomer/ der kan polymeriseres ved bestrâling med lys eller anden strâling, benyttes uanset arten deraf.
30 Som specielle eksempler pâ den vandopl0selige polymer [D] kan nævnes polyvinylpyrrolidon, polymetha-crylsyre, polyacrylsyre, polyvinylalkohol, hydroxy-propylcellulose, gurami arabicum osv.
Som specielle eksempler pâ det overfladeaktive 35 middel [D] skal nævnes natriumlaurylsulfat, kaliumoleat, natriumoleat, sorbitanmonolaurat/ sorbitanmonostearat, sorbitanmonooleat, propylenglycolmonolaurat, oliesyre/ natriumdodecylbenzensulfonat osv. Imidlertid kan der
JC DK 157346 B
'10 benyttes et vilkârligt overfladeaktivt middel, som kan
tilbageholde den polymeriserbare monomer eller TAG
eller TAG-lignende materiale opl0st i den polymeriser- bare monomer i micellen uanset arten deraf.
5 TAG mærket med radioaktivt materiale/ TAG- lignende materiale mærket med radioaktivt materiale og lectin mærket med radioaktivt materiale kan frem- stilles ved at indf0re et radioaktivt iodatom, sâsom 1 9 R 131 I eller I, i TAG/ TAG-lignende materiale eller 10 lectin. Indf0ring af radioaktivt iod udf0res ved almindelige ioderingsprocesser, f.eks.en oxidativ
ioderingsproces/ hvorved der benyttes chloramin T
[Nature/ 194/ s. 495 (1962); Biochem. J., 89/ s. 114 (1963)]. Herved udf0res sâdan iodering i et egnet 15 opl0sningsmiddel [f.eks. en pufferopl0sning med pH 6-8, fortrinsvis 0,2M phosphatpufferopl0sning (pH 7)] ved omkring stuetemperatur i 5-60 sekunder i nærværelse af chloramin T. Radioaktivt iod og chloramin T benyttes fortrinsvis i mængder pâ henholdsvis 1 til 5 mCi og 20 10 til 100 nano mol pr. nano mol tyrosin indeholdt i TAG eller lignende. Det sâledes mærkede TAG eller lignende isoleres og fraskilles pâ sædvanlige mâde og opbevares om n0dvendigt i lyofiliseret form.
Enzym-mærket TAG, enzym-mærket TAG-lignende 25 materiale og enzym-mærket lectin kan fremstilles ved en kendt koblingsproces [f.eks. B.F. Erlanger et al..
Acta. Endocrinol. Suppl., 168, 206 (1972) og M.H. Karol et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 57, 713 (1967].
Det vil sige TAG eller lignende omsættes med enzym i 30 en pufferopl0sning med pH 4-6 (f.eks. 1 mM acetatpuffer- ' opl0sning (pH 4,4)) ved stuetemperatur i 2 til 5 timer i nærværelse af et oxidationsmiddel sâsom NalO. efter- 4 fulgt af reduktion med NaBH^ eller lignende. Enzymet benyttes i en mængde pâ 1 til 3 mol pr. mol TAG eller 35 lignende. Oxidationsmidlet benyttes i en mængde pâ 100 til 300 mol pr. mol TAG eller lignende, og reduktions-midlet benyttés i en mængde pâ 1 til 2 mol.
Med fluoréscerende materiale mærket TAG, med
DK 157346 B
11 fluorescerende materiale mærket TAG-lignende materiale og med fluorescerende materiale mærket lectin fremstil-les ved at omsætte TAG eller lignende med et kendt fluorescerende materiale sâsom fluoresceinisothiocyanat 5 (FITC) eller tetramethylrhodaminisothiocyanat (RITC) i vand eller fysiologisk saltopl0sning ved pH 6-8 ved 0°C indtil stuetemperatur, fortrinsvis ved stuetempe-ratur, i 1/2 til 3 timer ( fluorescerende-anti s tof-procès; "Ikagaku Jikkenho Koza, No. 4", s. 263-270). Det fluo-rescerende materiale benyttes fortrinsvis.i en mængde pâ 1/50 TAG eller lignende.
Bestemmelsesprocessen if01ge opfindelsen i form af konkurrenceprocessen eller sandwichprocessen vil blive beskrevet nedenfor.
15 Ved de to processer udf0res reaktionerne i et egnet opl0sningsmiddel ved 45°C eller lavere, fortrinsvis ved 4 til 40°C,og mest foretrukket ved 20 til 40°C.
Som opl0sningsmiddel foretrækkes sâdanne som ikke ind-virker ugunstigt pâ reaktionen mellem TAG eller TAG-20 lignende materiale og lectin, sâsom vand og pufferopl0s-ninger med pH 6 til 7,8 (f.eks. 0,1 til 0,3 M tris-salt-syre-pufferopl0sning (pH ca. 7,5), 0,1 M phosphatpuffer-opl0sning (pH ca. 7,4) osv.). Reaktionerne udf0res i 5 til 40 timer, fortrinsvis 15 til 25 timer.
25 Adskillelsen af det til lectin bundne TAG (eller TAG-lignende materiale) fra ubundet lectin eller TAG (eller TAG-lignende materiale) kan udf0res pâ kendt mâde. Nâr der benyttes uopl0seliggjort TAG (eller TAG-lignende materiale) eller uopl0seliggjort lectin er 30 sâledes simpel adskillelse af fast fase fra flydende fase (ved centrifugering, filtrering eller dekantering) tilstrækkelig og i andre tilfælde kan benyttes chroma-tografi, elektroforese, udsaltning, fraktionering, dialyse, gelfiltrering, adsorption eller en kombination 35 deraf, eller der kan benyttes en adskillelsesproces, hvorved der benyttes agargel, agarosegel eller polyacryl-amidgel (japansk patentans0gning (OPI) nr. 151263/80) (det her benyttede udtryk "OPI" betyder en offentlig-
DK 157346 B
12 gjort ikke-patenterbarhedspr0vefcjapansk patentans0gning).
Mærkningsmiddel-aktiviteten af det sâledes fra-skilte produkt mâles ved at udvælge en passende metode afhængigt af mærkningsmidlets art. Ved anvendelse af 5 et enzym kan f.eks. vælges et passende enzymsubstrat for et colorimetrisk analyseSystem, emissionsanalyse-system eller fluorescensanalysesystem og om 0nsket be-nyttes et farvestof, et luminescerende middel eller et farvende middel til at mâle enzymaktiviteten,eller, 10 nâr der som mærkningsmiddel benyttes et fluorescerende middel eller et radioaktivt materiale, mâles fluore-scensintensiteten eller radioaktiviteten. Pâ denne mâ-de kan omsat eller ikke-omsat TAG, TAG-lignende materiale eller lectin bestemmes,og pâ grundlag heraf 15 kan mængden af det pâgældende materiale fastlægges.
Som ovenfor beskrevet g0r den foreliggende op-findelse det muligt at bestemme TAG i legemsvæske pâ fordelagtig mâde. Og pâ grundlag af den sâledes opnâede TAG mængde kan cancer pâ et vilkârligt trin fra tid-20 ligt trin til sidste trin diagnosticeres. Denne frem-gangsmâde er særlig nyttig til konstatering af cancer pâ et tidligt trin. Da man ved den foreliggende frem-gangsmâde bestemmer glycobinding,kan denne diagnose-metode endvidere benyttes i forbindelse med et bredere 25 omrâde af cancersygdomme end de konventionelle anti- stof-baserede fremgangsmâder (α-feetoprotein, CEA osv.), hvorved hovedsagelig proteindelen bestemmes, sâsom ma-vecancer, brystcancer, carcinoma i tyktarmen, rektal cancer, ovariecancer, cancer i munden, pâ tungen, stru-30 becancer, prostatacancer, liposarcoma, ondartet mela-noma, blærecancer, primær sarcoma i maven osv.
Fremgangsmâden if01ge opfindelsen er endvidere karakteristisk ved, at den er overordentlig specifik overfor cancersygdomme og ikke kryds-reagerer med 35 determinanter af lignende stoffer i legemsvæsker hos . gravide kvinder og hos patienter, der lider af andre sygdomme end cancer,sâsom gastritis, mavesâr, duodenal sâr, colitis, pancreatitis, diabètes mellitus, nephri-
DK 157346 B
13 tis, cystitis, blæresten, cholecystitis, galdesten, collagensygdomme, cerebro malacia, apoplexi, angina pectoris, hjertesvigt, myocardial infarct, hypertension, arteriitis, dépréssion, allergisk coryza, purpura, 5 pneumonia, pulmonal pneumatosis, bronchitis, asthma, akut hepatitis, kronisk hepatitis, osv.
Endvidere muligg0r den foreliggende fremgangs-mâde at bestemme galactose-(31^3 eller 31-*-4 ) -N-acetyl-glucosamin eller galactose- (31+3 eller 31+4)-N-acetyl-10 ga.lactosamin eller kulhydrater eller kulhydratderivater (f.eks. glycoproteiner, glycopeptider, glycolipider, glycoterpen, glycosteroider osv.) med nævnte glycobin-ding i endestilling
Fig. 1 viser en standardkurve opnâet ved 15 konkurrence-processen- if0lge opfindelsen.
Fig. 2 viser en kalibreringskurve for konkurrence-processen if0lge opfindelsen.
Fig. 3 viser TAG-niveauer for raske personer malt ved konkurrence-processen if01ge opfindelsen.
20 Fig. 4 viser TAG-niveauet hos cancerpatienter mâlt ved konkurrence-processen if01ge opfindelsen.
Fig. 5 viser en kalibreringskurve for sandwich-processen if01ge opfindelsen.
Fig. 6 viser en kalibreringskurve for konkurrence-25 processen if01ge opfindelsen.
Fig. 7 viser TAG-niveauer hos cancerpatienter malt ved konkurrenceprocessen if0lge opfindelsen.
Fig. 7a viser TAG-niveauer hos raske personer mâlt ved konkurrenceprocessen if0lge opfindelsen.
30 Fig. 7b og 7c viser TAG-niveauer hos patienter med cancer mâlt ved konkurrence-processen if0lge opfindelsen, og fig. 7d viser TAG-niveauer hos patienter, der lider af andre sygdomme end cancer eller hos gravide 35 kvinder.
DK 157346 B
14
Eksempel 1 (i) Aktivering af peroxidase.
5 mg peroxidase (fra peberrod) blev opl0st i 1 ml af en 0,3 M vandig natriumhydrogencarbonatopl0s-5 ning. Til den resulterende opl0sning sattes 0,1 ml af en 0,1 M ethanolisk. fluordinitrobenzenopl0sning og efter forsigtig omr0ring i 1 time ved stuetemperatur tilsat-tes 0,1 ml af en 0,06 M NaIO^-opl0sning efterfulgt af forsigtig omr0ring i 30 minutter ved stuetemperatur.
10 Til reaktionsblandingen sattes yderligere 1 ml 0,16 M ethylenglycol, og den resulterende opl0sning blev om-r0rt forsigtigt ved stuetemperatur i 1 time. Derpâ blev opl0sningen dialyseret mod 0,01 M kulsyre-natriumhydro-gencarbonatpufferopl0sning (pH 9,5) ved 4°C i en dag 15 og en nat.
(ii) Fremgangsmâde til mærkning af lectin med peroxidase (lectin-peroxidase).
5 mg jordn0ddelectin blev opl0st i 3 ml af den if0lge (i) opnâede aktiverede peroxidase og omr0rt for-20 sigtigt ved stuetemperatur i 2 til 3 timer til opnâelse af reaktion. Der blev tilsat 5 mg NaBH^ og omsat ved 4°C i 3 timer, Derefter blev denne opl0sning dialyseret mod en 0,1 M tris-saltsyrepufferopl0sning (pH 7,4) i en dag og en nat og underkastet Sephadex G 150 gel-25 s0jlechromatografi (elueringsmiddel: 0,1 M tris-salt-syrepufferopl0sning, pH 7,4) for udf0relse af gelfil-trering. Hver fraktion blev malt ved 0^280 ^D403' og fraktioner med toppe for O°280 OD403 °Psam_ let.
DK 157346 B
15 (ii') Fremgangsmâde til fremstilling af renset lectin-peroxidase.
20 ml lectin-peroxidase som opnâet if0lge (ii) blev pâf0rt galactose-agarose (AGALACTOPYRANOSYL AGARO-5 SE ^fremstillet af P.L. LaB. USA) og vasket med 200 ml fysiologisk saltopl0sning. S0jlen blev elueret med 0,2 M natriumchloridopl0sning indeholdende 0,5 M lactose,og de f0rste 10 ml fraktioner med toppe for C^qq og blev opsamlet og dialyseret mod fysiologisk saltopl0s-10 ning i en dag og en nat til opnâelse af renset lectin-peroxidase. Produktets proteinindhold, der blev mâlt if0lge Lowry's metode (Lowry O.H., et al., J. Biol.
Chem, 193, s. 265 (1951)), er ca. 1 g. Den rensede lectin-peroxidase blev lyofiliseret.
15 (iii) Fremgangsmâde til fremstilling af uopl0seliggjort lectin (fremgangsmâde til fremstilling af PNA-aga-rose).
15 g CNBr-aktiveret agarose blev suspenderet i 3 liter 0,001 N saltsyre og, efter henstand i 30 minut-20 ter, vasket med 1 liter 0,1 M natriumhydrogencarbonat (pH 8,5) pâ et glasfilter. Der opnâedes herved en total mængde pâ ca. 50 ml aktiveret agarose. Denne blev suspenderet i 200 ml 0,1 M natriumhydrogencarbonat (pH 8,5), og der blev tilsat 5 ml af en 0,01 M phosphatpufferop-25 l0sning (pH 7,7) indeholdende 50 mg jordn0ddelectin (i det f0lgende forkortet til PNA) efterfulgt af omsæt-ning ved stuetemperatur i 2 timer med lejlighedsvis omr0ring. Efter afslutning af omsætningen blev reak-tionsopl0sningen vasket pâ et glasfilter, og reaktions-
DK 157346 B
16 produktet blev sat til 200 ml af en 1 M monoethanol-aminopl0sning (pH 8,5) og omsat i 2 timer ved stuetem-peratur. Derpâ blev reaktionsproduktet vasket pâ et glasfilter med 1 liter 0,1 M eddikesyrepufferopl0sning 5 (indeholdende 0,5 M NaCl) og 1 liter af en0,1 M borsyre-pufferopl0sning (indeholdende 0,5 M NaCl) skiftevis tre gange.
(iv) Fremgangsmâde til fremstilling af TAG-lignende materiale.
10 1 g sulfateret glycoprotein fra svine-maveslim- hinde (i det f01gende forkortet til PGM) blev suspen-deret i 100 ml af en 0,05 M phosphatpufferopl0sning (pH 7,0),og der blev drâbevis tilsat en 1 N vandig NaOH-opl0sning til indstilling af pH-værdien pâ 11.
15 Efter omr0ring i 30 minutter ved stuetemperatur blev blandingen centrifugeret i 10 minutter ved 3000 omdr./ min. Supernatanten blev dialyseret mod 10 liter af en 0,01 M phosphatpufferopl0sning (pH 7,0) natten over til opnâelse af renset TAG-lignende materiale (rent 20 PGM).
(iv') Fremgangsmâde til fremstilling af TAG-lignende materiale.
Alternativt sattes rât PGM (100 g) til 1 liter destilleret vand, og man lod henstâ natten over. Efter 25 at blandingen var blevet dialyseret mod destilleret vand natten over, blev den centrifugeret (100.000 g x 1 time).
Derpâ blev supernatanten opsamlet og lyofiliseret til opnâelse af ca. 5,5 g renset PGM.
(v) Fremgangsmâde til fremstilling af mærket TAG.
30 (a) Mærkning med et enzym (PGM-peroxidase).
4 mg peroxidase fra peberrod (HRPO) (0,1 yM) blev opl0st i 1 ml destilleret vand. Hertil sattes 0,2 ml 0,1 M NalO^ og, efter omr0ring ved stuetemperatur i 20 minutter, blev opl0sningen dialyseret mod 1 mM eddike-syrepufferopl0sning (pH 4,4) i en dag og en nat til fjernelse af uomsat NaIC>4. Til denne dialyserede reak-tionsopl0sning sattes ca. 60 yl af en 0,2 M hydrogen-carbonatpufferopl0sning (pH 9,5) til indstilling af op- 17
DK 157346 B
10sningens pH-værdi pâ 9,0. Derpâ blev der til denne opl0sning straks sat 0,6 ml PGM (10 mg/ml) opl0st i en 0,01 M hydrogencarbonatpufferopl0sning (pH 9,5,), der blev blandet i 2 timer ved stuetemperatur, hvorpâ 5 der blev tilsat 0,1 ml af en 4 mg/ml NaBH4-opl0sning 1 destilleret vand, efterfulgt af henstand ved 4 C i 2 timer. Denne opl0sning blev yderligere dialyseret mod en 0,01 M phosphatpufferopl0sning (pH 7,5) i -en dag og en nat og renset under anvendelse af Sephadex fi-200 10 (1,5 x 150 cm) til opnâelse af ren PGM-peroxidase (PGM-POX). Gel-eluanten blev opsamlet i 5 ml portioner, hvis absorption blev mâlt ved OD2gQ °9 OD403* X 2 5 (b) Mærkning med isotop ( I-PGM).
125 PGM blev mærket med I if0lge en oxidativ 15 ioderingsproces ved hvilken der anvendtes chloramin T.
10 yg PGM blev opl0st i 50 μΐ af en 0,2 M
phosphatpufferopl0sning (pH 7,0), og der blev tilsat 125 10 yl 1 mCi Na I (bærerfri; N.E.N.) og 50 yg/10© μΐ chloramin T opl0sning i en 0,2 M phosphatpufferoplr0s- 20 ning, og efter blanding ved stuetemperatur i 30 sekun- der tilsattes 100 yg/100 yl Na2S2O^-opl0sning i en 0,2 M phosphatpufferopl0sning. Derpâ tilsattes 1 mg
Na^25! og der blev blandet. Det sâledes opnâede ^^1- PGM blev renset pâ Sephadex G-50 (1 x 30 cm). Det sa- 125 25 ledes fremstillede I-PGM havde en radioaktivitet pâ ca. 1-2 yCi/yg.
(vi) Bestemmelsesfremgangsmâde.
125 0,1 ml I-PGM (100 ng 0,17 yCi svarende itil 5 ca. 2,4 x 10 cpm) opnâet if0lge (v), 0,1 ml af det 30 rene standard PGM (0,1 yg/ml, 0,2 yg/ml, 0,5 yg/ml, 1 yg/ml, 2,5 yg/ml, 5 yg/ml og 10 yg/ml) opnâet i£01ge
(iv), 0,1 ml PNA (10 yg/ml) og 0,2 ml af en 0,05 M
phosphorsyrepufferopl0sning (0,15 M NaCl, 0,1% BSA: 0,02% NaN3) blev blandet i et 10 x 75 mm glasr0r og 35 inkuberet ved 25°C i 1 time. Efter afslutning af reak- tionen sattes 0,1 ml anti-PNA-kaninserum (fremstlllet af E.Y. Laboratory; 10 gange fortyndet opl0sning) til 125 det til PNA bundne I-PGM og til PNA ikke bundne
DK 157346 B
18 ^^I-PGM og efter inkubering ved 25°C i 1 time blev reaktionsop!0sningen centrifugeret ved 4°C i 30 minut-ter ved 3000 omdr./minut. Radioaktiviteten af et bund- i ? t: fald ( I-PGM bundet til PNA) blev tait til fremstil-5 ling af en standardkurve (fig. 1) . Soin det fremgâr af de sâledes opnâede résultater, var procenten af bundet materiale (B/T) sædvanligvis 20-25% og der opnâe-des 50%'s hæmning ved en koncentration pâ 0,6 yg/ml.
(vii) Fremstilling af uopl0seliggjort TAG-lignende mate-10 riale.
Der tilsattes overskud af PGM til 100 ml af en 0,01 M phosphatpufferop!0sning (pH 7,0) til fremstilling af en suspension. Hertil blev sat 0,01 N NaOH-op-l0sning til indstilling af suspensionens pH-værdi pâ 15 ca. 11, efterfulgt af centrifugering ved 3000 omdr./min. i 20 minutter til opnâelse af supernatanten. Til denne supernatant sattes drâbevis 0,03 N HCl til indstilling af pH-værdien pâ 7,0, og der blev atter centrifugeret ved 3000 omdr./min. i 20 minutter. Supernatanten blev 20 dialyseret mod en 0,01 M phosphatpufferopl0sning (pH 7,0) til fremstilling af en PGM-opl0sning. Hvad angâr opl0sningens kulhydratindhold og proteinindhold blev hexoseindholdet mâlt til 5 til 7 mg/ml if0lge en phe-nol-svovlsyre-metode under anvendelse af glucose som 25 standard, og proteinindholdet blev mâlt til at være 1 til 2 mg/ml under anvendelse af BSA som standard. PGM-Opl0sningen blev underkastet nedenstâende strâ-lings-inducerede polymérisation.
Den strâlings-inducerede polymérisation blev 30 udf0rt som f01ger: Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) (benyttet som monomer) blev blandet med den ovenfor beskrevne PGM-opl0sning i et blandingsforhold pâ 33:67, og den resulterende blanding blev anbragt i et 1 cm x 15 til 20 cm glasr0r og hurtigt lyofiliseret til -70°C 35 eller derunder. Derefter blev den bestrâlet med 1 x g 10 rad γ-strâler til polymérisation af den monomère.
Ethvert af de sâledes fikserede PGM-materialer blev fremstillet ved at opskære polymerstangen til skiver
DK 157346 B
19 med en tykkelse pâ 10 μια til dannelse af runde skiver.
(viii) Fremstilling af uopl0seliggjort TAG-lignende materiale.
15 g (t0r vægt) CNBr-aktiveret Sepharose 4B 5 (fremstillet af Pharmacia AB) blev suspenderet i 3 liter 0,001 N saltsyre og, efter henstand i 30 minutter, vasket med 1 liter 0,1 M natriumhydrogencarbonat (pH 8,5) pâ et glasfilter til opnâelse af ca. 50 ml aktive-ret Sepharose. Denne blev suspenderet i 200 ml 0,1 M 10 natriumhydrogencarbonat (pH 8,5) , og der blev tilsat 5 ml af en 0,01 M phosphatpufferopl0sning (pH 7,7) indeholdende 50 mg PGM efterfulgt af omsætning ved stuetemperatur i 2 timer under lejlighedsvis omr0ring.
Efter afslutning af omsætningen blev reaktions-15 opl0sningen vasket pâ et glasfilter, og reaktionspro-duktet blev sat til 200 ml af en 1 M monoethanolamin-opl0sning (pH 8,5) efterfulgt af omsætning ved stuetemperatur i 2 timer. Derpâ blev reaktionsopl0sningen vasket pâ et glasfilter med 1 liter 0,1 M eddikesyre-20 pufferopl0sning (indeholdende 0,5 M NaCl) og 1 liter 0,1 M borsyrepufferopl0sning (indeholdende 0,5 M UaCl) skiftevis 3 gange.
(viii') Fremgangsmâde til fremstilling af uopl0selig-gjort TAG-lignende materiale (fremstilling af 25 PGM-kugle).
10.000 Polystyrenkugler med en diameter pâ 6,4 mm fremstillet af Précision Plastic Co., Ltd., ü.S.A. blev vasket med en fortyndet opl0sning af syntetisk sæbe (Mamalemon , fremstillet af Lion Co., Ltd.) 30 ved en koncentration pâ 1,5 ml/1 liter destilleret vand og derpâ med destilleret vand. Kuglerne blev endvi-videre efter at hâve været neddyppet i 0,5 M vandig MaOH-opl0sning i 3 dage vasket omhyggeligt, indtil vaske-væskens pH-værdi var ca. 6. De sâledes vaskede 10.000 35 kugler blev sat til 2,5 liter af en 35 (vægt/rumfang) % PGM-opl0sning i 50 mM eddikesyrepuffer indstillet pâ pH 4,5 med 10 N NaOH,cmr0rt ved ca. 10 omdr./min. i 24 timer, filtreret og vasket med 8 liter destilleret vand
DK 157346 B
20 4 gange. Derpâ blev kuglerne sat til 2,5 liter glutar-aldehydopl0sning med en slutkoncentration pâ 1 (rum-fang/rumfang)% i 50 mM natriumphosphatpuffer (pH 7), omr0rt ved 10 omdr./min. i 2 timer, filtreret og vasket 5 med destilleret vand pâ samme mâde som ovenfor angivet.
De sâledes behandlede 10.000 kugler blev sat til 2,5 liter 1 M glycinopl0sning i 50 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,0), omr0rt ved 10 omdr./min. i 2 timer, filtreret og vasket med destilleret vand pâ samme mâde 10 som ovenfor beskrevet efterfulgt af t0rring ved 37°C natten over til opnâelse af PGM-kugler. Kuglernes over-fladeareal blev bestemt if01ge Orcinol-E^SO^-metoden (M. Schonenberger, et al., Z. Physiol. Chem. 309, 145 (1957)), og det opnâede résultat var 2,7 ± 0,2 yg PGM/ 15 kugle.
(ix) Fremstilling af fors0gspr0ver.
Der blev taget 5 ml blod fra patienter med cancer, patienter med andre sygdomme, gravide kvinder og raske personer under anvendelse af heparin (500 enheder)-20 behandlede spr0jter, pr0verne blev centrifugeret i 10 minutter ved 2000 omdr./min., og supernatanten blev op-samlet til fremstilling af fors0gspr0ver.
Eksempel 2
Konkurrencefremgangsmâde.
25 En rund skive (uopl0seliggjort TAG-lignende mate- riale fremstillet if0lge (vii)) blev anbragt i 50 yl PNA-bundet peroxidase (mærket lectin fremstillet if01ge (ii)) og 200 yl af pr0ven (fors0gspr0ve fremstillet if01ge (ix)) og inkuberet ved 25°C i 20 timer. Skiven 30 blev derpâ vasket med PBS og anbragt i 2,0 ml af en vandig saltopl0sning, og der blev tilsat 0,5 ml af et peroxidasemateriale efterfulgt af inkubation ved 25°C i 1 time. Derpâ blev der tilsat 1,0 ml 3 N saltsyre, og absorbansen blev mâlt ved 492 nm. Samtidig blev 35 absorbansen mâlt pâ samme.mâde under udskiftning af pr0ven med forskellige koncentrationer af et standard-materiale (PGM) til fremstilling af en kalibrerings-
DK 157346 B
21 kurve (fig. 2). Endvidere blev TAG i fors0gspr0verne opnâet if0lge (ix) bestemt under anvendelse af kalibre-ringskurven. De sâledes opnâede resultater er vist i fig. 3 og 4.
5 Som det fremgâr af fig. 3 og 4, var der en tyde- lig forskel i TAG niveau hos raske personer og patienter, der led af forskellige cancersygdomme.
Eksempel 3
Sandwich-fremgangsmâde.
10 200 yg PNA-agarose fremstillet if0lge (lit) blev sat til 100 μΐ af en 0,05 M phosphatpufferopl0sning (pH 7,0) , hvori der var opl0st 1 til 10 ug/ml PGM,, og der blev inkuberet ved 25°C i 1 time under omr0ring.
Efter vask af reaktionsopl0sningen 3 gange med en 15 0,05 M phosphatpufferopl0sning (pH 7,0) blev der tilsat 6 yg PNA mærket med peroxidase opnâet if0lge eksempel 1, (ii) og 100 μΐ af en 0,05 M phosphatpufferopl0sning (pH 7,0) efterfulgt af inkubering ved 25°C i 1 time under omr0ring. Efter centrifugering ved 3000 omdr./min.
20 i 10 minutter blev bundfaldet udvundet og vasket 3 gange med en 0,05 M phosphatpufferopl0sning (pH 7,0), og ab-sorbansen blev malt ved 492 nm. De sâledes opnâede resultater er vist i fig. 5.
Eksempel 4 25 Konkurrence-fremgangsmâde.
100 μΐ af en pr0ve (fors0gspr0ve opnâet if0lge fremgangsmâde (ix) ovenfor) blev anbragt i et pr0ver0r, hvortil der blev sat 500 μΐ 0,3 M tris-HCl-puffer (pH 7,4) indeholdende sluttelig 0,22 (vægt/rumfang) % 30 gélatine, 5 mM CaC^ og 5 mM MgC^. Een PGM-kugle (uopl0seliggjort TAG-lignende materiale fremstillet if01ge fremgangsmâde (viii1)) og 100 μΐ lectin-peroxida-se (det lyofiliserede mærkede lectin fremstillet ±f0lge fremgangsmâde (ii1) ovenfor ved en koncentration pâ 35 1 mg/1 af den ovenfor beskrevne tris-HCl-puffer) blev sat til pr0ven,og efter omr0ring blev blandingen inkube-
DK 157346 B
22 ret i 24 timer. Reaktionsblandingen blev fjernet under anvendelse af en aspirator, og kuglen blev vasket med 2 ml fysiologisk saltopl0sning efterfulgt af fjernelse af vaskevæsken under anvendelse af en aspirator. Denne 5 vaskeoperation blev gentaget 3 gange.
60 mg ortho-phenylendiamin blev opl0st i 20 ml 0,2 M Mcllevein-puffer (pH 5,8), og der blev til den resulterende opl0sning sat til en slutkoncentra- tion pâ 0,02(rumfang/rumfang) %, og blandingen blev om-10 r0rt til dannelse af et farvningsmiddel.
I et pr0ver0r anbragtes 2 ml fysiologisk salt-opl0sning og 500 μΐ af farvningsmidlet samt den vaskede kugle, og der blev inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. Derpâ blev den enzymatiske reaktion standset 15 med 1 ml 3 N HCl. Reaktionsblandingens optiske tæthed blev malt ved 492 nm. Samtidig blev absorbansen malt pâ samme mâde bortset fra, at pr0ven blev udskiftet med forskellige koncentrationer af et standardmateriale (PGM) til fremstilling af en kalibreringskurve (fig.6).
20 Endvidere bestemtes TAG i de fors0gspr0ver, der var opnâet if0lge (ix) ovenfor under anvendelse af kali-breringskurven. De opnâede resultater er vist i figurer-ne 7a, 7b, 7c og 7d.
Opfindelsen er ovenfor blevet beskrevet i enkelt-25 heder og under henvisning til specielle udf0relsesfor-mer, men det vil være klart for fagmanden, at der kan foretages adskillige ændringer uden at man kommer uden for opfindelsens omfang.
Claims (15)
1. Fremgangsmâde til bestemmelse af tumor-associ-eret glycobinding (TAG), dvs. sukkerrester med en bin-dingsspecifitet for jordnoddelectin eller ricinusfro- 5 lectin eller med sukker beslægtede substanser, der In-deholder nævnte sukkerrester som en endegruppe, kendetegnet ved, at man konkurrerende omsæt-ter legemsvæske TAG, der skal mâles, og en forudbestemt mæng-de gennem kemisk eller fysisk binding til en uoplaselig 10 baerer uoploseliggjort TAG eller TAG-lignende materlale, dvs. galactose-(β 1 —>3 eller 31->4)-N-acetylglucosami)n, galactose-!31—>3 eller β 1—»4)-N-acetylgalactosamin eller et kulhydratderivat, der indeholder nævnte kulhydratkæ-de som en endegruppe, med en forudbestemt mængde, med et 15 enzym, et fluorescerende materiale eller et radioaktivt materiale mærket jordnoddelectin eller ricinusfrolectin, skiller det uoploseliggjorte TAG eller TAG-lignende materiale, der er bundet til mærket lectin, og ubundet lectin fra hinanden ved centrifugering, filtrering eller 20 dekantering, og mêler mærkningsmidlets aktivitet i en af disse fraktioner.
2. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendetegnet ved, at lectinet er jordnoddelectin.
3. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendeteg-25 n e t ved, at legemsvæsken er blod, vævsvæske, lymfe- væske, thoraxvæske, abdominalvæske, fostervand, mavesaft, urin, bugspyt, cerebrospinalvæske eller spyt.
4. Fremgangsmâde ifolge krav 3, kendetegnet ved, at legemsvæsken er blodserum eller blod- 30 plasma.
5. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendetegnet ved, at det nævnte TAG-lignende materiale er asialoderivat af bovint foetuin glycoprotein, sulfateret glycoprotein fra svin, humant glycoprotein fra maveslim- 35 hinde eller asialoderivat af humant surt glycoprotein. DK 157346 B
6. Fremgangsmâde til bestemmelse af tumor-associ-eret glycobinding (TAG), dvs. sukkerrester med en bin-dingsspecifitet for jordnoddelectin eller ricinusfro-lectin eller med sukker beslægtede substanser, der in- 5 deholder nævnte sukkerrester som en endegruppe, k e n -detegnet vedf at man konkurrerende omsætter le-gemsvæske TAG, der skal mâles, og en forudbestemt mængde med et enzym, et fluorescerende materiale eller et radioak-tivt materiale mærket TAG eller mærket TAG-lignende ma-10 teriale, dvs. galactose-(β1-> 3 eller β 1 —>4 )-N-acetylglu-cosamin, galactose- ( β H3 eller B1-»4)-N-acetylgalactos-amin eller et kulhydratderivat, der indeholder nævnte kulhydratkæde som en endegruppe med en forudbestemt mængde jordnoddelectin eller ricinusfrolectin eller 15 gennem kemisk eller fysisk binding til en uoploselig bæ-rer uoploseliggjort lectin, skiller det mærkede TAG , eller mærkede TAG-lignende materiale, der er bundet til lectin eller uoploseliggjort lectin og ubundet mærket TAG eller mærket TAG-lignende materiale fra hinanden ved 20 centrifugering, filtrering, dekantering, chromatografi, elektroforese, udsaltning, fraktionering, dialyse, adsorption eller under anvendelse af gel, og mâler mærkningsmidlets aktivitet i en af disse fraktioner.
7. Fremgangsmâde ifolge krav 6, kendeteg-25 n e t ved, at lectinet er jordnoddelectin.
8. Fremgangsmâde ifolge krav 6, kendeteg-n e t ved, at legemsvæsken er blodserum eller blodpàas-ma.
9. Fremgangsmâde ifolge krav 6, kendeteg-30 n e t ved, at det TAG-lignende materiale er asialoderi- vat af bovint foetuin glycoprotein, sulfateret glyco-protein fra svin, humant glycoprotein fra maveslimhinde eller asialoderivat af humant surt glycoprotein. DK 1S7346 B
10. Fremgangsmâde if0lge krav 6, kendeteg-n e t ved, at legemsvæsken er blod, vævsvæske, lymfe-væske, thoraxvæske, abdominalvæske, fostervand, mave-saft, urin, bugspyt, cerebrospinalvæske eller spyt.
11. Fremgangsmâde til bestemmelse af tumor-associ- eret glycobinding (TAG), dvs. sukkerrester med en bin-dingsspecifitet for jordnoddelectin eller ricinusfro-lectin eller med sukker beslægtede substanser, der in-deholder nævnte sukkerrester som en endegruppe, k e n -10 detegnet ved, at man konkurrerende omsætter le-gemsvæske TAG, der skal mâles, med et gennem kemisk eller fysisk binding til en uoploselig bærer uoploselig-gjort jordnoddelectin eller ricinusfrolectin til dan-nelse af et TAG-uoploseliggjort lectin-kompleks, omsætter 15 dette kompleks med en forudbestemt mængde med et enzym, et fluorescerende materiale eller et radioaktivt materia-le mærket lectin, skilier det til det mærkede lectin bundne kompleks og ubundet mærket lectin fra hinanden ved centrifugering, filtrering eller dekantering, og mâ-20 1er mærkningsmidlets aktivitet i en af disse fraktioner.
12. Fremgangsmâde ifolge krav 11, kendeteg-n e t ved, at legemsvæsken er blod, vævsvæske, lymfe-væske, thoraxvæske, abdominalvæske, fostervand, mavesaft, urin, bugspyt, cerebrospinalvæske eller spyt.
13. Fremgangsmâde ifolge krav 11, kendeteg- n e t ved, at lectinet er jordnoddelectin.
14. Fremgangsmâde ifolge krav 11, kendeteg-n e t ved, at legemsvæsken er blodserum eller blodplas-ma.
15. Fremgangsmâde ved diagnose af cancer, kendetegnet ved, at man mâler niveauet af tumor-associeret glycobinding i legemsvæske fra en patient ved fremgangsmâden ifolge krav 1, 6 og 11, samt sammenligner det sâledes mâlte niveau med niveauet hos 35 en person med normalt helbred.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10478680A JPS5729949A (en) | 1980-07-30 | 1980-07-30 | Determination of sugar branch related to cancer and diagnostic technique of cancer |
| JP10478680 | 1980-07-30 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK339381A DK339381A (da) | 1982-01-31 |
| DK157346B true DK157346B (da) | 1989-12-18 |
| DK157346C DK157346C (da) | 1990-05-14 |
Family
ID=14390143
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK339381A DK157346C (da) | 1980-07-30 | 1981-07-29 | Fremgangsmaade til bestemmelse af tumor-associeret glycobinding samt fremgangsmaade ved diagnose af cancer |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4571382A (da) |
| JP (1) | JPS5729949A (da) |
| CH (1) | CH658132A5 (da) |
| DE (1) | DE3129923C2 (da) |
| DK (1) | DK157346C (da) |
| ES (1) | ES504989A0 (da) |
| FR (1) | FR2487984B1 (da) |
| GB (1) | GB2083623B (da) |
| IT (1) | IT1143216B (da) |
| NL (1) | NL8103606A (da) |
| SE (1) | SE453947B (da) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU561066B2 (en) * | 1982-03-22 | 1987-04-30 | Biocarb Ab | Antibacterial composition containing an oligosaccharide |
| AU561067B2 (en) * | 1982-03-22 | 1987-04-30 | Biocarb Ab | Anti-bacterial composition containing an oligosaccharide |
| WO1983004311A1 (en) * | 1982-06-03 | 1983-12-08 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for preparing fucose antigen and antibody for distinguishing it, measurement of tumor-associated sugar chain utilizing the same, and kit for the measurement |
| JPS5915858A (ja) * | 1982-07-16 | 1984-01-26 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 腫瘍関連抗原特異的免疫複合体の測定法 |
| FR2549230B1 (fr) * | 1983-06-14 | 1986-04-11 | Bio Merieux | Procede de detection d'un oligomere dans un milieu liquide contenant des monomeres correspondants, dispositif pour la mise en oeuvre de ce procede et application notamment a la recherche d'allergenes |
| DK150403C (da) * | 1983-07-15 | 1987-07-13 | Radiometer As | Blodproevetagningsudstyr |
| US4814275A (en) * | 1985-05-13 | 1989-03-21 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Monoclonal hybridoma antibody specific for a human epithelial antigen |
| EP0227822A1 (en) * | 1985-07-01 | 1987-07-08 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Lectin-antibody sandwich assay for desialylated glycoproteins |
| US4863854A (en) * | 1985-08-12 | 1989-09-05 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to mucin-like human differentiation antigens |
| GB2181840B (en) * | 1985-10-16 | 1989-11-29 | Farmos Group Ltd | Method for the immunoassay of a macromolecular analyte |
| JPH0792458B2 (ja) * | 1986-03-14 | 1995-10-09 | 郁男 山科 | 糖鎖特異抗体アツセイプレ−ト及びその製造方法 |
| US4857457A (en) * | 1986-07-24 | 1989-08-15 | Shamsuddin Abulkalam M | Screening test for large intestinal cancer |
| JPH0718875B2 (ja) * | 1987-06-19 | 1995-03-06 | ヤマサ醤油株式会社 | 血中または体液中の微量物質含有量の測定法 |
| EP0420848B1 (en) * | 1987-12-09 | 1996-02-07 | The General Hospital Corporation | Carcinoma-associated antigens, and antibodies which recognize these antigens |
| US5212085A (en) * | 1987-12-09 | 1993-05-18 | The General Hospital Corporation | Sf-25 colon adenocarcinoma antigen, and antibodies with recognize this antigen |
| US5051354A (en) * | 1988-04-15 | 1991-09-24 | Abbott Laboratories | Detection of altered IGA1 in fluid samples |
| US5162202A (en) * | 1989-12-12 | 1992-11-10 | Shamsuddin Abulkalam M | Rectal mucus test and kit for detecting cancerous and precancerous conditions |
| EP0429542B1 (en) * | 1988-08-15 | 1995-12-06 | Brigham And Women's Hospital | Leukocyte adhesion inhibitor |
| EP0406404B1 (fr) * | 1989-01-20 | 1994-06-22 | Diagnostica Stago | Particules sumicroniques, preparation et utilisation dans l'immunodiagnostic |
| US6165710A (en) * | 1989-10-23 | 2000-12-26 | Robinson; James E. | Method for immobilizing viral glycoproteins for use in solid-phase immunoassays |
| AU657102B2 (en) * | 1991-04-12 | 1995-03-02 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | CA 195-like immunoreactive antigen from human amniotic fluid |
| JP3978226B2 (ja) * | 1991-09-25 | 2007-09-19 | サーマル マクローフ | アルコール中毒患者を同定しアルコール消費を監視するためのイムノアッセイ |
| US5376531A (en) * | 1992-09-03 | 1994-12-27 | Northwestern University | Method of detecting cancer |
| US5571783A (en) * | 1993-03-09 | 1996-11-05 | Clintec Nutrition Company | Composition and method for treating patients with hepatic disease |
| GB9719644D0 (en) * | 1997-09-17 | 1997-11-19 | Horsell Graphic Ind Ltd | Planographic printing |
| US5998534A (en) * | 1998-06-19 | 1999-12-07 | Ppg Industries Ohio, Inc. | Water-soluble or water-dispersible addition copolymer |
| US7306919B1 (en) | 2001-10-31 | 2007-12-11 | Thornthwaite Jerry T | Antigen-antibody cancer recognition system |
| US20070111327A1 (en) * | 2005-05-05 | 2007-05-17 | Jay Gregory D | Methods of detecting lubricin |
| US20210062241A1 (en) * | 2019-08-29 | 2021-03-04 | AbulKalam Mohammed Shamsuddin | Screening method, device, and kit for detecting mucosal carbohydrates and associated conditions |
| US20210063402A1 (en) * | 2019-08-29 | 2021-03-04 | AbulKalam Mohammed Shamsuddin | Screening method, device and kit for detecting mucosal carbohydrates and associated conditions |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4196186A (en) * | 1975-10-09 | 1980-04-01 | Samuel Bogoch | Method for diagnosing malignant gliol brain tumors |
| US4132769A (en) * | 1974-10-30 | 1979-01-02 | Osther Kurt B | Cancer antigen, cancer therapy, and cancer diagnosis |
| US4147764A (en) * | 1975-02-19 | 1979-04-03 | National Patent Development Corporation | Hydrophilic absorbents |
| US4016043A (en) * | 1975-09-04 | 1977-04-05 | Akzona Incorporated | Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies |
| US4035316A (en) * | 1975-11-24 | 1977-07-12 | California Institute Of Technology | Cell specific, variable density, polymer microspheres |
| US4160817A (en) * | 1976-09-29 | 1979-07-10 | Research Corporation | Application of protein-protein interaction as an assay for the detection of cancer |
| US4146603A (en) * | 1977-02-18 | 1979-03-27 | Research Corporation | Tumor specific glycoproteins and method for detecting tumorigenic cancers |
| DE2721267C2 (de) * | 1977-05-11 | 1985-05-02 | Hans A. Dipl.-Chem. Dr. 8000 München Thoma | Antikörpergel |
| EP0001223A3 (en) * | 1977-09-19 | 1979-12-12 | F.Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft | Latex coated with a polyhydroxy compound, process for the preparation of this latex, immunological reagent containing this latex, process for the preparation of this reagent, application of this reagent, testing procedure utilising this reagent and reagent kit containing this reagent |
| US4289747A (en) * | 1978-12-26 | 1981-09-15 | E-Y Laboratories, Inc. | Immunological determination using lectin |
| CH645728A5 (fr) * | 1979-01-30 | 1984-10-15 | Otsuka Pharma Co Ltd | Procede de determination de la teneur en substances contenant des liaisons glucosidiques associees aux tumeurs, application de ce procede et necessaire pour sa mise en oeuvre. |
| US4334017A (en) * | 1979-04-16 | 1982-06-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for detecting cancer in mammalian tissue |
| JPS56154660A (en) * | 1980-04-30 | 1981-11-30 | Nippon Koutai Kenkyusho:Kk | Titration of sugar side chain relating to cancer diagnosis of cancer and kit for diagnosis of cancer |
| SE447028B (sv) * | 1980-06-30 | 1986-10-20 | Erik Audunn Cerven | Bestemning av endstaende sackaridgrupper i glykoprotein |
-
1980
- 1980-07-30 JP JP10478680A patent/JPS5729949A/ja active Granted
-
1981
- 1981-07-29 DK DK339381A patent/DK157346C/da not_active IP Right Cessation
- 1981-07-29 IT IT49004/81A patent/IT1143216B/it active
- 1981-07-29 DE DE3129923A patent/DE3129923C2/de not_active Expired
- 1981-07-29 SE SE8104597A patent/SE453947B/sv not_active IP Right Cessation
- 1981-07-30 FR FR8114853A patent/FR2487984B1/fr not_active Expired
- 1981-07-30 US US06/288,445 patent/US4571382A/en not_active Expired - Fee Related
- 1981-07-30 CH CH4939/81A patent/CH658132A5/de not_active IP Right Cessation
- 1981-07-30 ES ES504989A patent/ES504989A0/es active Granted
- 1981-07-30 NL NL8103606A patent/NL8103606A/nl not_active Application Discontinuation
- 1981-07-30 GB GB8123381A patent/GB2083623B/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1143216B (it) | 1986-10-22 |
| SE8104597L (sv) | 1982-03-10 |
| GB2083623B (en) | 1984-09-26 |
| JPS5729949A (en) | 1982-02-18 |
| NL8103606A (nl) | 1982-02-16 |
| IT8149004A0 (it) | 1981-07-29 |
| ES8302315A1 (es) | 1983-01-01 |
| DE3129923A1 (de) | 1982-04-08 |
| GB2083623A (en) | 1982-03-24 |
| US4571382A (en) | 1986-02-18 |
| FR2487984B1 (fr) | 1985-09-06 |
| ES504989A0 (es) | 1983-01-01 |
| DK157346C (da) | 1990-05-14 |
| DE3129923C2 (de) | 1984-06-20 |
| JPS6116945B2 (da) | 1986-05-02 |
| FR2487984A1 (fr) | 1982-02-05 |
| SE453947B (sv) | 1988-03-14 |
| CH658132A5 (de) | 1986-10-15 |
| DK339381A (da) | 1982-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK157346B (da) | Fremgangsmaade til bestemmelse af tumor-associeret glycobinding samt fremgangsmaade ved diagnose af cancer | |
| US4389392A (en) | Determination of tumor associated glycolinkage and diagnosis of cancers | |
| NL8200334A (nl) | Werkwijze voor het bepalen van met tumoren geassocieerde glucosidische bindingen en werkwijze voor de diagnose van kanker. | |
| EP3159694B1 (en) | Sandwich assay using labeled lectin and kit therefor | |
| Dalton et al. | The measurement of CA 125 and placental protein 14 in uterine flushings in women with recurrent miscarriage; relation to endometrial morphology | |
| JPS60500974A (ja) | 結合分析法 | |
| CN111208297A (zh) | 一种微流控芯片检测外泌体gpc1蛋白的方法及其在胰腺癌早期诊断中的应用 | |
| EP0283779B1 (en) | Method of assaying high molecular hyaluronic acid | |
| JPS6057254A (ja) | 免疫学的測定法による糖脂質の定量方法 | |
| EP3550304B1 (en) | Method for estimating gleason score of prostate cancer, method for estimating pathological stage, and method for acquiring supplementary information, all on the basis of specific psa content in specimen | |
| US20040132118A1 (en) | Method of diagnosing breast cancer | |
| EP0057236A1 (en) | Method for determining tumor-associated glucose side chain, method for diagnosing tumors, and kit for diagnosing tumors | |
| CN110333355A (zh) | 多蛋白组合物及应用与先天性心脏病肺动脉高压筛查试剂盒 | |
| JPS6326872B2 (da) | ||
| Prasad et al. | Detection of antimicrofilarial ES antigen-antibody in immune complexes in Bancroftian filariasis by enzyme immunoassay | |
| Kellokumpu et al. | Identification of glycoproteins expressing tumour-associated PNA-binding sites in colorectal carcinomas by SDS-GEL electrophoresis and PNA-labelling | |
| Keel et al. | Characterization of human alpha fetoprotein charge microheterogeneity during fetal development | |
| DK154859B (da) | Fremgangsmaade til bestemmelse af tumor-associerede glycobindinger og udstyr til brug ved denne fremgangsmaade | |
| JPS6217711B2 (da) | ||
| JPS58129363A (ja) | 癌関連糖側鎖の定量法 | |
| CN215728197U (zh) | 一种快速定量联检心衰三项免疫层析试剂卡 | |
| JPS5830668A (ja) | 癌関連糖側鎖の定量法及び癌の診断法 | |
| JPH02264864A (ja) | Ｇｓａ―２結合性蛋白質の免疫学的測定試薬及びそれを用いた免疫学測定用キット | |
| JPH1183858A (ja) | Ｍｍｐ−９関連の新規腫瘍特異的抗原 | |
| Hasija | Changes in Erythrocyte Membrane Glycoproteins During Oral Cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |