JPS60500974A - 結合分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞マトリクス受容体系とガン診断及び治療における利用 背景技術 基底膜は、器官の実質細胞とコラーゲン様間質とを仕切る細胞外マ）　ＩＪクス の特殊な形態であり、生体内に床机に分布している。細胞とこのマトリクスとの 相互作用は、正常細胞および新生細胞の作用として重要である。正常細胞は生存 、増殖および分化に関し細胞外マトリクス全必要とすると思われるが、一方、移 動性の細胞は正常細胞であろうと新生細胞であろうと、ある組織から別の組織へ 移動する際に必ず基底膜を通過する。特に、鱗状上皮または腺上皮から発生した 転移性ガン細胞は循環系やリン・や系に入るとき、基底膜を必ず通過する（血管 内異物侵入）。体内を循環している新生細胞は、一般に器官の毛細血管床に捕捉 され、血管壁に侵入しそして基底膜を通過して、血管外組織へと移動する（浴出 ）。そこで第２の腫瘍が確立される。細胞の基底膜との相互作用はこのような理 由により大きな興味の的となっている。

細胞と細胞外マ）　ＩＪクスとの相互作用は細胞が自身をマトリクスに付着させ る能力に応じて異なる。この付着現象は特異的な糖タン・９りによや仲介されて 起こることが知られている。その糖夕／ノヤクは細胞を、７）ＩＪクスに存在す る様々な型のコラーゲンに結びっける。例として、フィブロネクチンを仲介とし た、線維芽細胞、筋原細胞および平滑筋細胞の間質性■型、■型コラーダンへの 付着、さらにコンドロネクチンを仲介とした、軟骨細胞の軟骨組織■型コラーダ ンへの付着がある。

正常細胞と新生細胞は同様な仲介を受けて基底膜へ付着することがわかっている 。基底膜の基本的な構成成分は■型コラーダン、糖タンパクおよびプルチオグリ カンである。糖タンＡ’りであるラミニンは、上皮細胞と新生細胞の基底膜への 付着の仲介役ヲナし、それらの細胞ｅｆｆ型コラーゲンへ結合させる。以後にそ の機構を記載する。上記のごとく、転移性腫瘍細胞が転移過程の分裂段階で基底 膜を必ず通過するという理由および転移過程の第一段階は腫瘍細胞の基底膜への 付着であるという理由から、この機構全解説し、腫瘍細胞のこの膜への付着を促 進または阻害する特異的付着因子の特性を記述することは、ガンの診断および治 療において重大な意味を有するものである。

ラミニンに対して特有な細胞マトリクス受容体を完全に単離し精製することおよ びラミニン分子の基質特異的結合領域の特性を決定することにより、本発明によ るガ゛ンの診断および治療の方法が可能になった。

ノロテアーゼにより誘導されたラミニンフラグメント上の基質に基づいてこれら の領域を単離することによって、特異的結合能をもったフラグメントに選択する ことが可能となる。というのはそれぞれのフラグメントが完全な分子に存在する これらの領域の少くともひとつ（すべてではない）を含むからである。ｖｊに興 味の的となるのは、細胞マトリクス受容体に対する結合部位をただひとつ有する フラグメントである。この受容体はラミニン分子上の受容体結合領域に対して高 い親和性をもつが、ヒトのガン細胞及びおそらく上皮細胞に特徴的なものである 。この受容体はこれらの細胞表面上に存在していて、原形質膜の抽出物から単離 することができる。

本発明の範囲内のこの模式に基づいた生物検定には免疫検定、特に予後に用いら れる放射免疫検定が含まれる。そしてこれらは臨床標本ＶＣ適用されるが、転移 性細胞によって発現されたラミニン細胞受容体の検出と定量のため、あるいは混 じり合った細胞群から高い転移性をもった腫瘍細胞全分離するために、行なわれ る。治療手段としては、ラミニン分子に作用的あるいは拮抗的なラミニンフラグ メン）ｋ用いて宿主を処理することが考えられ、その結果ラミニンフラグメント は腫瘍細胞のＩＶ型コラーケ゛ンへの付着を阻害し、転移のために造血因子が増 えることを抑える。適当なうミニンフラグメントけ、既知のあるいは実駁的化学 療法剤に対するリガンドとしても使用されることがある。

すなわちこれらのフラグメントと毒素を結合することによシ、その結合体を転移 性の腫瘍細胞に直接取り込ませることができ、ガンの生体内での治療が可能にな り、あるいは生体内または生体外での薬剤の評価が可能になる。今述べたモデル は、ガ゛ンの化学療法に使用のための合成結合部位をもつ類似化合物を評価する 上にも役立つものである。他に提案されている治療的用途として、細胞の■型コ ラーゲンへの接着を促すため、例えば火傷治療において上皮細胞の接着および増 殖を促すためにラミニンあるいは適当なラミニン断片を使用することが挙げられ る。これらの断片およびラミニン自体は受容体細胞に対して増殖因子として広く 作用し得る。そして細胞の付着及び分散を促進したり、細胞分裂を促進したりす る。

発明を実施するための最良の形態 糖タンパクであるラミニンは基底膜に特異的に局在しており、膜の糖タン・やり 構成成分の主要なものである。ラミニン受容体を有する細胞は、基底膜のラミニ ン成分へ直接結合することが可能であるが、侵入細胞にとって好ましい経路には 、ラミニン仲介による基底膜の■型コラーダン成分への付着がある。転移性の細 胞からラミニンが分泌されることにより、侵入が容易になる。

ラミニン（分子量ｔｏ）−６還元してボリアクリルアミドダル電気泳動にかける と、見かけの分子量２００．０００（α３サブユニツト）と４００．０００（β サブユニット）をもった２つのサブユニットに分かれる。電子顕微鏡技術によれ ば、ラミニンの立体構造は１本の長い腕（７７ｎｍ）と３本の同じ長さの短かい 腕（３７ｎｍ）とを有するラテン十字架と同じであることが示された。十字架の ３本の短かい腕はα３サブユニツ）ｋ含み、３本の同一（分子量２００．０００ 　）　の鎖より成っているが、一方、十字架の長い腕はβサブユニット（分子量 ４００．０００　）　’に含んでいる。すべての腕は末端に球状の単位を有して いる。

ラミニンは細胞マトリクス受容体（ｋｄ＝２ｎｍ’）および■型コラーダンさら にペパリンに対しても高い親和性をもつ。本発明によれば、分子の異なる部位に 存する基質特異的結合領域は、ラミニンの酵素消化産物を使った細胞付着および コラーゲン結合分析法によっテソの特性が決められた。αトロンビン、ペゾシン およびカテプシンＧを用いて分子を消化すると、完全なラミニンが示す結合能よ りも限られた結合能しかもたないフラグメントが生じる。完全なラミニンおよび これらのフラグメントの構造上の特性全図１に示す。ラミニンをα−トロンビン で消化することにより生じるα３フラグメントは長鎖（分子量４００．０００　 ）フラグメントを欠くが、末端の球状領域を備えた短鎖を有している。ラミニン をペゾシンまたはカテゾシンＧで酵素消化すると、それぞれＰＩ（分子量２８０ ．０００）おｊびＣ１（分子量３５０．０００）フラグメントを生じる。これに よってその分子の長鎖は欠落し、短鎖末端の球状領域も変化をうける。完全なラ ミニンとα３．Ｃ１およびＰ１フラグメントの機能的特徴を図１および表１に総 語する。同じような分子量と結合能を有するＣ１およびＰ１フラグメントは、ラ ミニンをグラスミンまたはキモトリノシンで消化することによっても得られる。

表　１ ラミニンおよびラミニンフラグメントの、■型コラーゲンへの結合率およびヒト 乳ガン腫細胞を■型コラーゲンへ付着せしめる率 ７ラグメント　結合　％　ＭＣＦ’−７Ｔ４７−Ｄラミニン　８０　８４　２８ α３　８５　８１　２９ Ｐｉ　１５　１３’１ｌ Ｃ１１０ゑｌ　１０ 無添加　４８２２ （注）　ラミニンおよびラミニン断片の■型プロコラーダンにトロセルロースに 固定化されている）への結合を測定したが、これに用いたラミニンは完全分子の ものとグロテアーゼによシ消化され精製したものである。リガンド１０マイクロ グラム’ｔｌＶ型コラ−ダンに添加した。ＭＣＦ−７およびＴ４７−Ｄ細胞の■ 型コラーダン基質への付着ｉ９−セントを示したが、これは様々なラミニンフラ グメント存在下で得られた。トリゾシン処理したでの細胞を、血清を含まないダ ルベツコ−型のイーグル培地（分子量６００．０００のラミニン１μｇ／ｄ、α ３ラミニンフラグメント１μｇ肩、Ｐ　Ｌラミニンフラグメント１００μｇ／ｍ ｇまたはＣ１ラミニンフラグメント１００μｇ／ｍｌ添加）で３時間培養した。

未付着細胞を除培養ざらから剥して電気的に計数した。データは４回の平均をと ったが、どの値も平均値の１０％以内の範囲に入っていた。感受性は１００μｇ ｚＷ程度の低さであった０ ラミニンをαトリジシンで消化しても、それによって得られるα３フラグメント の細胞受容体あるいは■型コラーダンへの結合能は何ら変化しない。Ｐｌまたは Ｃｌフラグメントは、樹立ヒト乳がン腫細胞’ｋｌＶ型コラ−ダンへ仲介する能 力を持たないが一方α３フラグメントは完全ラミニン分子に匹敵する仲介能を有 している。すなわち、どちらも付着を促進する。図２８ に見られるように、Ｐｌフラグメントはヒト乳ガン腫細胞の■型コラーダンへの 付着を抑制する。同様にＣｌフラグメントもガン細胞の■型コラーゲンへの付着 を示さないが）では、ｐＨｃｌフラグメントはｌμｇ／ｒｎｌの濃度で使用する ときＭＣＦ−７の■型コラーダンへの付着を完全に抑制する。比較のために、ラ ミニンが仲介するヒトガン細胞の付着に関する投与量−反応曲線を図３に示す。

フィブロネクチンは細胞のＩ型コラ−ダンへの付着を仲介するが、同じ投与量範 囲でラミニンは細胞のＩ型コラ−ダンへの付着を促進しなかった（７′−夕は示 さない）。特異的付着因子の非存在下、樹立細胞のＩ型、■型コラーダンへの正 常結合能を表２に総語する。

表　２ ヒト乳ガン腫細胞の付着 ＭＣＦ−７２２６８ ＺＲ−７５−１５４４４ Ｔ４７−Ｄ　６２　３３ （注）　Ｉ型および■型コラーダンを塗布した培養ざらに対して細胞の付着率を 、血清を含まないダルベツコ−型イーグル培地中で３時間培養後に測定した。付 着のための定量法は図３の説明において詳述する。データは５％以上異ならない ４つの値の平均である。

ラミニン分子上に存在する結合領域はデータに基づいて特徴すけし、図１に示し たように図化した。細胞マトリクス受容体は、グロテアーゼ耐性で、ジスルフィ ド結合により結合された、ラミニン分子の３つの短かい腕の交差部分に結合する 。■型コラーゲンへの結合領域は短かい腕の球状部分がその近くに存在する。

一方ラミニン分子の長腕はへ２４リン硫酸グロテオグリカンに結合する。α３フ ラグメントは細胞結合領域とコラ−ダン結合領域の両方を備えているので、この フラグメントは完全ラミニン分子の仲介能と等しい仲介能を有する。ペゾシンま たはカテプシンＧで短腕の球状部分を除去すると、■型コラーダンに対する結合 領域が消えることになる。従って、そうしてできた７ラグメントは基底膜への細 胞の付着を仲介することができない。しかしながらＰＬおよびＣ１フラグメント は細胞受容体への結合領域を維持しており、受容体を占有することができ、ラミ ニンの完全分子と拮抗し合う。

細胞マトリクス受容体の単離と精製は原形質膜からの表面活性剤による抽出およ びラミニンアフィニティークロマトグラフィーを使って行なわれた。精製した受 容体の分子量は約５０Ｄ００から約７５ρｏｏ（ｓＤｓポリアクリルアミド電気 泳動）である。そしてその受容体はラミニンに対し１大きな結合親和性（ｋｄ＝ ２ｎｍ）を有するが１．この親和性は原形質膜や完全細胞のそれに近い。その受 容体はヒトの腫瘍細胞とネズミの一瘍細胞において同定された。

ヒトガン細胞特にガン腫細胞の受容体を持った細胞を診断するための方法の開発 が進められているが、それは組織や細胞の診断学的生検のような臨床標本に基づ いたガンの診断や予後に有力なものとして企図されたものである。

一般に、免疫検定法型の結合分析法がよく知られておジ有効である。例と１−７ では放射免疫検定法あるいは酵素免疫検定法がある。それらには、標識リガ゛ン ドであるラミニンと１−で生物学的に活性な細胞受容体部位をもった適当なラミ ニンフラグメントが用いられるか又は純粋な細胞受容体に対する、ウサギやヤギ といった異種の動物から得られた抗体、若しくは望ましい親和性や特異性をもっ たモノクロナール抗体が使用される。代表的な分析法として、細胞受容体の原形 質膜抽出物の上で拮抗的に結合を起こさせる分析法が従来からある。これには固 定化されたリガ゛ンドや受容体が使われる。これらの結合法を実施するための診 断用キットは本発明に属す。これらは、例えば遊離又は固定化放射標識ラミニン 又はラミニンフラグメントラ含み、もし抗体を用いるならばサンドイッチ型のキ ットも含む・そのサンドイッチ型キットには例えば標識抗体および抗−抗体が含 まれている。結果は、標本の特異的結合をスキーｖｙチャード分析（Ｓｃａｔｃ ｈａｒｄ＋　Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ。

Ａｃａｄ、　８ｃｉ、５１：　６６０−６７２　、１９４９　）により評価し、 関連する型を培養ガン腫細胞の結合親和性と比較するのに適している。ヒト乳ガ ゛ン腫細胞のスキャッチャード結合分析法によれば推定ｋｄ値は転移性ガン膝（ ＭＣＦ−７）細胞に対して、５０２．２　ｎｍとなり、細胞あたりの受容体は計 算上すべての型のガン腫に対して約１０Ｊ）００から１００ＤＯＯとなる。これ に対して、新生細胞を含まない哺乳類の線維芽組織の場合、スキャソテヤード分 析によれば結合の特異性けみられなかった。

細胞受容体結合部位を有し、コラーゲン結合領域を欠いたラミニンフラグメント （ＰｌおよびＣ１）は診断用の結合検定法に有用であるとともに、転移を抑制し てガン治療上有効であると期待が集まっている。

試験管内でのマウスの試験において、各７ラグメントは外来のラミニン存在下Ｂ Ｌ６マウス黒色肺細胞の■型コラーゲンへの付着を抑制した。Ｃ１フラグメント は、ＢＬ６黒色腫細胞と前培養するとき、生体内で投与量に依存して造血組織へ の転移を顕著に抑制し、阻害する。さらにフラグメントには実験動物において毒 性がなく、免疫上の副作用も見られない。また、これらのフラグメントは効果的 な化学療法剤を標的薬剤とする場合に有用であシ、既知の効果的な抗腫瘍剤の坦 面に局在させることができる。例えばリシンのような薬剤を既知の方法によって リガンドに結合させることができ、このような方法はそのような薬剤を腫瘍関連 抗原に対する抗体を結合するのに使われる。

本発明の概念は、細胞分化、有糸分裂生殖形態形成および腫瘍形成を含む多様な 生物的過程に対する示唆を含んでいる。ここで述べる方法は次のような仮説に基 づいているところもある。すなわちすべての良性腫瘍や潜在ガ′ンにおいて、基 底膜は連続的な構造を保ち、良性細胞の場合、ラミニン受容体は基底膜へ付着す ることによって占められるという仮説である。ガンが侵入性であることは、侵入 性の腫瘍細胞のまわシに基底膜が形成されないことによって証明される。このよ うな侵入性の腫瘍細胞は細胞表面に発現された多数のラミニン受容体を含むこと があるが、上皮細胞や良性腫瘍とは対照的にリガンドに結合しない。転移性ガン 腫細胞上のラミニン受容体部位の独自の有効性が解明されれば、ガンの治療およ び診断に関する重要な概念が明らかになろう。

（実施例） 例示した概念は次の出版物に詳しく述べられている。これらはこの明細書に組み 入れられたものとする。

Ｔｅｒｒａｎｏｖａら＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。８０　：　 ４４４−４４８（１９８３）およびＲａｏら＊　ＪａＢｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、＋２ ５７：９７４０−９７４４（８月、１９８２）。

１１ＮＦＩＪ１．　ラミニンフラグメントの調製Ａ、材料と方法 １、　精製したαトロンビンはＪｏｈｎ　Ｗ、　Ｆｅｎｔｏｎ（Ｎ、Ｙ、　Ｄｅ ｐｔ、ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、　Ａｌｂａｎｙ）から譲り受けた。αトロンビンに よる消化はＰＨ７，６，２５Ｃで、酵素対基質の重量比１：１００として行なり た（　Ｔｈｒｏｍ、Ｒｅｓ、＋２１：６６３−６７３に記載のごとく）。トロン ビンの消化はヒルジン（シグマ社）を二培量添加することにより阻害された。ペ プシン、αトロンビンおよヒカテゾシンＧによるラミニンの消化は次の文献どう ｐＶｃＰｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　３６１　：　ｌ　６５１−．１６６ ０（１９８０）：Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　２５７：　９７４０−９７４４ （１９８２）、およびＡｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈａｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　２１９：６５−７０（１９８２）。キ モトリプシンおよびプラスミンによるラミニンの消化は同じくこれらの出版物の 中に記載されており、これらはこの明細書に組み入れられたものとする。

２、　ｆロチアーゼフラグメントは、上記のＴｅｒｒａｎｏｖａらおよびＲａｏ らの文献どう９にＴ（ＰＬＯ（ペックマン）を使って単離し、ＳＤＳ　’ｉｉ含 んだ５％ポリアクリルアミドスラブダルを使った電気泳動により検討した。プラ スミンまたはペプシンによるラミニンの消化によって得られたＰ１７ラグメント の特徴およびキモトリプシンまたけカテプシンＧによるラミニンの消化によって 得られたＣ１フラグメントの特徴は上記の文献に記載されている。α３フラグメ ントの特徴も同様に記載されている。

実施例■　結合分析法 Ａ、材料と方法 １６．樹・立細胞系 ＭＣＦ−７樹立ヒト乳ガン細胞はミシガンガン財団から供与を受けた。ヒトおよ び哺乳類起源のこの細胞の特徴はすでに要約した。この細胞はヌードマウスに対 しで侵入性と転移性を示した。ヒト羊膜結合組織を障壁として使用した場合、こ の細胞は試験管内でも侵入性を示した。

ＺＲ−７５−１およびＴ４７−Ｄ樹立ヒト乳ガン細胞はり、　Ｅｎｇｅｌ（国立 ガン研究所、病理学研究室）から送られた。これらの細胞は、電子顕微鏡により ガン腫細胞の特徴をもつこと、また核型分析によりヒト由来であること、さらに 乳腺特有の分泌性の乳タンパクを含んでいることが確認された。これらの樹立細 胞のどちらもヌードマウスにおいて増殖が遅く、大きな転移ば見られなかった。

たとえ、生後間もないヌードマウスに異種間の皮下移動が行なわれたときでさえ そうであった。正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＣＲＬ　１５０７およびＣＲＩ。

１４’７７　）は米国タイプカルチャーコレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）から供与をうけた。

２、　基質、付着因子およびラミニンフラグメントの調製 ラミニンフラグメントは実施例Ｉで記載したように調製した。■型コラーゲンは エジプト豆中毒症のラットの皮膚から調製した（Ｂｉｏｃｈａｍｉｓｔｒｙ、　 ５：　３４６０−３４７３（１９６６））。■型コラーゲンはエンジェルブレス ・ホルム−スワン腫から調製した（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１２７：２５７−２ ６２　、　（１９８１）およびＪＩＩＢｉｏｌ−Ｃｈｅｍ、＋　２５４：９９３ ３−９９３７　、　（１９７９））。ラミニンはラクトパーオキシダーゼ法によ りヨウ素化した（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙａ、　Ａｅｔａ＋２５Ｇ　３ ６３−３６９．１９６９）。

３、結合分析法 分析法はＴｅｒｒａｎｏｒａら記載（Ｃｅｌｌ、　２２：　７１９−７２８゜１ ９８０）のようなりレープ（Ｋｌｅｂｅ　）の方法を採用した。

４、細胞の結合、 ラミニンのＭＣＦ−７およびＴ４７−Ｄ乳ガン腫細胞および成人ヒト線維芽細胞 ＣＦＬ１７７およびＣＲＬ　１５０７への結合は単細胞培養層を用いて行なった 。すべての樹立細泡は完全培地を用いて多数の孔のある培養ざら（ＦＢ−６−Ｔ ｃ　、　Ｌｉｍｂｒｏ　）　ｆｃレプリカした。細胞が５０から７０％に増えた とき、細胞を２時間洗うために培地を牛血清アルブミン０．１％含んだダルベツ コ−型イーグル培地と交換した。結合時に用いる培地はダルベツコ−型イーグル 培地、０．１％牛血清アルブミンおよび２０ｍＭへッヘスハッファ−（ｐＨ７， ４）かう成ってい念。

７ラグメントといっしょにして、リン酸加塩緩衝液た放射活性をサール（５ｋｏ ｋｉｅ、ＩＬ　）のオートガ゛ンマカウンターによって測定した。比結合は結合 した放射活性の合計からｉｏｏ倍量の未標識物質の加剰存在下で結合した楡を差 引いた値と定義した。

５、コラ−ダン結合 ■型プロコラーゲンを０．５Ｍ酢酸に溶解し、つづいて０．０５Ｍ）リスＨＣ７ １０，９Ｍ　ＮａＣＡ　（ｐＨ７，４）溶液で中和した。溶液（２５μｇ）のう ち５μｌを８μｍの細孔径をモクｆｃ　１３−朋ｓｃｗｐニトロセルロースＰ紙 （ミリホカの上にのせた。それからその沢紙を牛血清アルブミンし、相対湿度１ ００％の容器中で２０分間イ・ンキュベ６、ロータリーシャドーイング（Ｒｏｔ ａｒｙａｈａｄｏｗｉｎｇ　）および電子顕微鏡による観察これらの手法は上記 Ｒａｏが記載したイーグルらの変法に従って行なった。

Ｂ、結果 １　細胞のコラーゲンへの付着 トリプシン処理後間もないＭＣＦ−７、ｌ−７５−１およびＴ４７−Ｄ細胞を様 々な基質に加えた場合、ＭＣＦ−７細胞はｌ型コラ−ダンやグラスチックよりも ■型コラーダンに選択的に付着した（Ｉ型、■型コラーケ゛ンに対するデータを 表２に示す）。すべての実験においてＭＣＦ−７細胞はＺＲ−７５−１およびＴ ４７−Ｄ細胞に比べて、より急速に、より広範囲に■型コラーケ゛ンに結合した 。

細胞が特異的接着因子の存在により仲介作用をうけて特異的物質に付着するかど うかを決めるためＩ型および■ｆｆｌコラーゲンへの細胞の付着に関しで、外来 性ラミニンおよびフィブロネクチンの効果をそれぞれ試験した。これらの因子が 細胞内合成されてから接着に及ばず影響を排除するために、細胞を培養液の中に てシクロヘキサミンで処理してタン／？り合成を損害した。

シクロへキサミドの存在下、ラミニンは３つの樹立細胞系のすべてを刺激して■ 型コラーゲンへのそれらの付着を惹起した。ラミニンはＭＣＦ−７細胞に対し８ 倍の刺激効果をもたらしたカζこれと比較してＺＲ−７５−１細胞に対しては４ 倍、Ｔ４７−Ｄ細胞に対しては２倍の刺激効果をもたらした（図３）。シクロヘ キサミド存在下■型コラーゲンにフィブロネクチンを加えるとＴ４７−Ｄ細胞の 付着は７倍に増大し、ＺＲ−７５−１細胞の付着は５倍、ＭＣＦ−７細胞の付着 は２倍に増大した（図３）。これらのデータが示すところによれば、ＭＣＦ細胞 は基質として■型コラーゲンを特異的に選択し、ラミニンを接着因子とするとい うことがわかる。ラミニンを同一の投与範囲で添加しても、これらの細胞のｌ型 コラ−ダンへの付着は促進されない。対照的にＴ４７−Ｄ細胞はフィブロネクチ ン全仲介としてｌ型コラ−ダンへ選択的に結合する。ところがＺＲ−７５−１細 胞がラミニンまたはフィブロネクチンを仲介因子として、それぞれ■型またはｌ 型コラーゲン基質へ付着する現象ばみられなかった０ ２、ラミニンフラグメントの結合特性 ラミニン分子のどの領域が細胞の■型コラーダンへの接着に別して仲介役を担う かを検討するために、ラミニンをプロテアーゼ処理して得られたフラグメントに 対してそれらの結合特性に関する試験を実施した。

αトロンビン処理して得られるラミニンのα３フラグメントは、完全なラミニン 分子が示すと同程度に、ＭＣＦ−７細胞の■型コラーダンへの付着を促進した（ 表１）。α３フラグメントはミクログラム単位では活性を示すが、分子数単位で は完全なラミニン分子よりも低い活性全示す。ラミニンのβ成分は接着活性を示 さない。そのデーテから結論として言えることは、ラミニンのα３成分は細胞お よびコラ−ダン双方に対して結合する生物的に活性な部位を有しているというこ とである。ＭＣＦ−７および’ｒ４７−Ｄ細胞のＩ型および■型コラーゲンへの 結合能に関する、α３ラミニン成分およびペプシン処理によって得られるＰｌす なわち分子量２８０．０００のラミニンフラグメントの効果は完全なラミニン分 子の存在下で測定した。α３成分は■型コラーゲンへの接着を促進したが、一方 Ｐ１フラグメントは接着を著しく抑制した（表１）。オたフラグメントはｌ型コ ラ−ダンへの接着効果を示さなかった（データは示さない）。しかしながらＴ４ ７−Ｄ細胞はラミニンまたはラミニンフラグメントを仲介として■型コラーケ゛ ンヘ付着したが、付着の度合は高くなか、た。Ｐｉフラグメントを使った投与量 対反応性の実験を図４に示す。ＭＣＦ細胞およびＴ４７−Ｄ細胞双方の■型コラ ーダンへの付着はＰ１フラグメント濃度１，０μｇ／ｍ７！によって完全に抑制 される。さらにＭＣＦ−７細胞の■型コラーダンへの付着は、カテプシンＧによ って消化されて得られるラミニンフラグメント（分子量３５，０００、Ｃｌと呼 ぶ）を１μｇ７ｍｌの濃度で添加した場合、完全に抑制された。

３、細胞へのラミニンの結合 ラミニンが上皮細胞の■型コラーゲンへの付着を仲介するならば、この細胞はラ ミニン認識に関与する特異的な表面受容体を持つている可能性がある◇さらに、 線維芽細胞のような細胞は接着因子としてラミニンよりもフィブロネクチンを利 用するので、ラミニン測定する実験を行なった。ラミニンのＭｅＦ−７、Ｔ４７ −ＤおよびＣＦＬ　１４７７と１５０７樹立線維芽細胞への結合は時間依存性を 示した。結合は試験したすべての樹立細胞で９０分後に平衡に達した（図４およ び５）。ヒト樹立繊維芽細胞ＣＲＬ　１４７７および１５０７においては特異的 ラミニン受容体の証拠は見られなかった（図５）。ところが上皮性Ｔ４７細胞は ＭＣＦ−７細胞と比較した場合、低いながらもラミニン結合性を示した。スキャ ッチャー〇結合分析（ＭＣＦ−７細胞を使用して）によると、はぼ直線に近いカ ーブが得られた。推定ｋｄ値は５０から２．２ｎＭであった。計算上、細胞あた ｐの結合部位はｔ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏからｔ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏとなる。ラミニ ンに対する受容体は０．１％トリトン×１００を使って細胞膜より抽出すること ができ、ラミニンアフィニティークロマトグラフィーを使って単離するとその分 子量は６０ＤＯＯから７５ρＯＯであった。ラミニンフラグメントα３およびＰ ｌは双方とも１２５Ｉラミニンと拮抗し、完全ラミニン分子と同様なレベルで結 合した（図４）。ラミニンは付着しているＭＣＦ−７細胞と懸濁しているＭＣＦ −７細胞との両方に結合した。後者の場合、結合はトリプシン処理して、０．５ ％牛血清アルブミンを含んだダルベツコ−型イーグル培地中で培養後２時間たっ て確認された。熱変性ラミニンおよびフィブロネクチンは、１２５Ｉラミニンと 拮抗させて結合させるとその有効性は完全ラミニン分子に対して５０分の１から ５００分の１で双方とも結合分析に用いた場合、生物的活性を保持していた。そ れ故に、ＭＣＦ−７およびＴ４７−Ｄ細胞に結合するラミニンの主要部位はα３ ラミニン成分およびＣ１またはＰＩラミニン７ラグメントの双方に残っている（ 図４、表１）。

４、コラ−ダンへのラミニンの結合 前記の事項とは対照的に、同一のラミニンフラグメント（α３およびＰＩ）はニ トロセルロースに固定化された■型コラーゲンへのそれらの結合性において著し い違いを示した。完全ラミニン分子およびα３フラグメントは■型コラーゲンに 同時によく結合した（表１）。ＰＩあるいはＣＩフラグメントは■型コラーダン への結合性を示さなかった。様々なラミニンフラグメントの構造上および結合性 に関する特性は図１に要約する。

実施例■、腫瘍細胞が有するラミン受容体の単離Ａ、材料と方法 転移性のＲＬ６黒色腫はＩａｍ　Ｈａｒｔ博士（メリーランド州フレデリック） により供与された。この腫瘍細胞の付着特性は今までに記載されてきた。ＢＬ６ 細胞はｌＯ％牛脂児血清を補ったＰＲＭＩ　１６４０培地中で培養した。原形質 膜は対数増殖期の細胞から単離した（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、＋　２５５．１７２２−１７３１．１９８０　）　、原 形質膜ホモジーネー）　’＆　０．１％トリトン×１００で可溶化した（１．０ −２．０ダタンノ９り／ｍｅ）。４５分間３０．０００ｇで遠心したあと、上清 を集めトリトンを除くために８Ｍ２バイオヘツド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）でインキ ュベートした。ラミニンリガンドおよび原形質膜抽出物の単離は上記のラクト・ 臂−オキシダーゼ法を用いて実施した。

ラミニン受容体は懸濁している生細胞上に認められた。

トリジシン処理後完全培地中でＢＬ６細胞１３７ｃ。

２時間一定の攪拌条件下で培養した。標識リガンドと２５０倍の過剰の未標識り Ｉンドを添加し２５℃で２時間さらに培養をつづけた。細胞に結合したりＩンド と遊離のリガ′ンドを遠心して分離した。原形質膜への結合分析は、固相ニトロ セルロースの円型ミリポアーｓｃｗｐ　（上記Ｔｅｒｒａｎｏｖａらの方法）ま たは臭化シアンで活性化したセフ丁ロース４Ｂに結合させたり〃ンドまたは受容 体対を使って実施した。後者の場合方法は次のとう９゜ラミニンまたは原形質膜 抽出タン・平り２５μｇを臭化シアンで活性化したセフ丁ロース４Ｂ（１００μ ｔ）に結合させ、それに２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　５ｍＭＭｇＣＺ　１５ｍＭ　 Ｃａ　Ｃ１０のｐＨ７，４溶液を等量およびＯ，１％牛血清アルブミンを含むこ の緩衝液１００μｌ’ｘ加えた。

ｄ４婁識原形質膜抽出物（ｌ　０．９　ｃｐｒｒｖｆｖ）またはｆｆ１ 度の未標識ラミニン溶液または未標識原形質膜抽出物（２から２０μｇ）を用い て実施した。結合分析のための混合物音４℃で一晩インキーペートした。ラミニ ンセフ丁ロース粒子を５．００　Ｏｒｐｍ３０分間の遠心で集め、取れたペレッ トをＯ，ｌチ牛血清アルブミンを含む緩衝液２．０ｒｎｌで２回洗った。最初の 遠心で得られた上清中のタンノ＋りとそのペレットをレムジー法による７チスラ ブダルを使った電気泳動にかけ、つづいてオ−トラジオグラフィーを行って同定 した。ラミニンアフィニティクロマトグラフィーは精製ラミニンで架橋しイーカ ラム（ＩＸ１５ｃｃ）中で１５時間インキエペートした。放射活性をもった未結 合抽出物′（ｉ−２５ｒｒＭＴｒｉｇ、５ｍＭ　ＣａＣｌ２．　５ｍＭ　ＭｇＣ ｌ２．　０．９％ＮａＣＡのｐｌ（７，４溶液４０ｒｎ！、で洗い出し、１．０ 　Ｍ　Ｔｒｉｓ生理食塩水で中和し、凍結乾燥した。タン・千りはスラグダル電 気泳動およびオートラジオグラフィーで同定した。ラミニン受容体部位およびｋ ｄ値はスキャッチャー分析により計算ＢＬ６黒色腫のラミニンとの結合には飽和 点があった。スキャッチャー分析によれば、細胞あたシ１１０ｆ）００の結合部 位があり、ｋｄ　＝　２．２　ｎｍの高い親和性（図６Ａ）’（ｚ示した。ラミ ニンの腫瘍細胞への結合はトリプシン処理によって妨害された。血清を含まない 培地あるいは血清を含んだ培地中で細胞を２時間培養すると、受容体が再生した 。コラ−ダン、変性ラミニン、フィブロネクチン、血清は結合に対して拮抗しな っていた。過剰の未標識ラミニンを加えると、固相に固定化したラミニンへの可 溶化した膜受容体の結合に対して拮抗反応がみられた。拮抗反応前と後において 、ラミニンに結合した膜タン・母りの可溶化物をダル電気泳動にかけると、受容 体は単一の分子量ヲもっていることがわかった（図７）。それ故、その受容体を 単離するためにラミニンクロマトグラフィーを実施した（図８．７ａ）。その結 果、膜の粗抽出物に対して９００倍で精製された。受容体の分子量は還元したの ちポリアクリルアミドダル電気泳動にかけると６７ρＯＯとわかった。単離した 受容体はラミニンに対して大きな結合親和性（ｋｄ＝２ｎｍ）を保持していた（ 図６ｃ）。

実施例■、ヒト乳ガン腫細胞におけるラミニン受容体の測定。

Ａ、材料と方法 ヒト乳ガン組織の標本は、生検により侵入性孔管ガン腫とわかった乳房の切除術 時に得らねた。組織全液体窒素で凍結し）、粉砕した。粉砕した組織ｉ　２５　 ｍＭＴｒｉｇ＋　０．３　Ｍシヨ糖のＰＨ７，４清液を用い１：４の容量比で希 釈し、ポリトロン（ｐｏｌｙｔｒｏｎ　）　ｋ使って０℃でホモシュネートした 。そのホモジーネート溶液ヲ２０分間１５ρＯＯＩで遠心し、脂肪層を捨て上清 を取ってさらに４℃６０分間１００Ｄ０１’で遠心した。ペレ、トヲ１．５　ｍ Ｍ　Ｍｇ　Ｓｏ　４および０．１５　ｍＭ　ＣａＣ６ｚ　ｋ含む２５　ｍＭ　Ｔ ｒｉｍ緩衝液（ｐｌ４７．４　）中に懸濁し、この膜調製液’１１００ＴＶ１０ ０ｍｌになるように希釈した。

２、結合分析 ラミニンあるいはラミニンフラグメントに前記のごとく精製し、ヨウ素化した。

結合分析は室温で一９０分間、膜分画１ｏｏ−と２．３Ｘ１０−９Ｍ当Ｆ）　７ ０１）００ｃｐｎ用して測定した。結合したりガントおよび遊離のリガンド全５ ，０００ｇで３０分間遠心して分離した。

Ｂ、結果 ヒト乳ガン組織から得た原形質分画は経時的検討を行なうと、ラミニンとの結合 において飽和点全示した（図９）。１時間後結合はグラトーに達した（２５℃） 。

プラトー期に達し穴径１０００倍の未標識リガンドを加えて、すばやく標識リガ ンドと交換した。特異的結合はスキャップヤー分析によると直線性が得られ、結 合部位は単一であることがわかった（γ＝０．８５）（図１０）。新生細胞を含 まない哺乳類の線維硬化組織から得られた試料では特異的結合は認められなかっ た。膜分画を熱変性すると結合活性がなくなった。フィブロネクチン、上皮性増 殖因子または血清は拮抗反［６に関与しなかった。ラミニン分子の精製フラグメ ントを使用すると（図１１）様々な結合機能全有するラミニンの領域を同定する ことができた。完全ラミニン分子はクロス−バイ−ロータリーシャドーイング電 顕法によれば４本の腕があるように見える。長腕を欠くフラグメントはラミニン 受容体に対する結合活性を完全にもっていて、細胞への接矯を仲介し、■型コラ ーゲンへ結合する。一方長腕と短腕の末端球状部位を欠くフラグメントは完全ラ ミニン分子に匹敵する親和性をもち、拮抗しながら受容体−＼特異的に結合した 。

実施例■、ラミニン受容体に対する抗体の調製。

実施例■に従っで精製した受容体に対する抗体は、ニューシーラント白つザギに 、７０インド完全アジユバントに乳濁した単離受容体を３回注射（１回当シ２５ ０／Ｊｇ）’して調製した。抗体の特異性は標準固相免疫検定法によシ確認した 。抗体を放射標識し、ラミニン受容体に対する従来からの放射免疫検定法に用い る。

実施例■、生体内におけるＣ１ラミニンフラグメントによる治療 ＢＬ６黒色腫細胞（実施例■）をラミニンのＣ１フラグメント（実施例Ｉのよう にして得た）と共に、Ｃ１濃度は細胞１ｄ当シ１ダおよび１０■として、前培養 した。培養した細胞を集め、マウスの標準観察記録（（従ってヌードマウスの生 体内へ注入した。対堀マウス３匹、処理マウス６匹を３週間後解剖して、その肺 を調べた。対照マウスの肺には数多くの転移が見られたが、１１ｎＶｆＩＬｌの Ｃ１を処理した３匹のマウスの肺では転移の数が減っており、１１１９旬のＣＩ を処理した３匹のマウスの肺では実質上転移は見られなかった。

実験を７回繰り返し、比較しうる結果を得た。ひとつの実験から得られた肺を表 わす代表的な写真を図１２に示す。

ＦＩＧ、１ Ｐ１７ラグメンｌ−（ｍｇ／ＩｎＤ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ ｒ） ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、　８ 耗鱈麦北：輔鴇１祷を神−に ヲミ；ンの褪合 峙勾（今） ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、　１０ ＦＩＧ、１ｌ ＦＩＧ、　１１： ＦＩＧ、Ｉ２ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．　ラミニンに対する細胞受容体。 ２１．受容体がガン細胞表面で発現している請求の範囲第１項記載の発明。 ３、ガン細胞はヒト乳ガ゛ン細胞である請求の範囲第２項記載の発明。 ４、受容体が上皮細胞の表面で発現している請求の範囲第１項記載の発明。 ５、受容体の分子量が約５０．０００から約７５，０００である請求の範囲第１ 項記載の発明。 ６、キモトリジシンまたはカテプシンＧによるラミニンの酵素消化により得られ る請求の範囲第２６項記載のＣ１ラミニンフラグメント。 ７、プラスミンまたはペゾシンによるラミニンの酵素消化により得られる請求の 範囲第２６項記載のＰ１ラミニンフラグメント。 ８、αトロンビンによるラミニンの酵素消化に得られるα３ラミニンフラグメン ト。 ９、標識リガンドと結合する未知試料中の物質の存在を検出するために、その標 識リガンドが使われる型の結合分析法において試料中の転移性腫瘍細胞を検出す るために請求の範囲第１項記載の細胞受容体に対する標識リガンドを用いること 全特徴とする方法。 ｔｏ、標識すｊｆ　ｙドが０１ラミニンフラグメントである請求の範囲第９項記 載の方法。 １１、標識リガンドがＰｌラミニンフラグメントである請求の範囲第９項記載の 方法。 １２、標識リガンドが前記細胞受容体に対する抗体である請求の範囲第９項記載 の方法。 １３、ｃｌラミニン７ラグメントが放射標識されている請求の範囲第１０項記載 の方法。 １４、Ｐｌフラグメントが放射標識されている請求の範囲第１１項記載の方法。 １５、抗体が放射標識されている請求の範囲第１２項記載の方法。 １６、　結合分析法に前記抗体とともに抗−抗体全使用する請求の範囲第１５項 記載の方法。 １７、　結合分析法に拮抗結合法を用い、さらに細胞受容体との結合において、 標識ＩＪ　、ｆンドと拮抗する未標識リガンドを用いる請求の範囲第９項記載の 方法。 １８、　ＩＪガントが基材に固定化されている請求の範囲第９項記載の方法。 １９、　化学療法剤ヲ諸求の範囲第１２項記載の細胞受容体に対するりＩンドと 結合することを含む・その薬剤を細胞表面に局在させる方法。 加、リガンドがＰＬまたはＣＩラミニンフラグメントである請求の範囲第１９項 記載の方法。 ２１、リガンドが細胞受容体に対する抗体である請求の範囲第１９項記載の方法 。 乙、化学療法剤と請求の範囲第２項記載の細胞受容体に対するリガンドとの結合 体をある群のガン細胞と相互作用させることを含む、その薬剤の有効性を評価す る方法。 ２３、ＰＬラミニンフラグメント、Ｃ１ラミニンフラグメントおよび前記細胞受 容体に対する抗体から成る群より選ばれる標識リガンド？含む、請求の範囲第９ 項記載の結合分析法を行なうための診断用キットＯ逼、標識リガンドが放射標識 されている請求の範囲第２３項記載の診断用キット。 ６、分析法が拮抗分析法であり細胞受容体との結合において、標識リガ゛ンドと 拮抗する未標識リガンドをさらに含む請求の範囲第２４項記載の診断用キット。 が、請求の範囲第１項記載の細胞受容体に対する結合部位をもつが、■型コラー ダンに対して結合部位を欠くラミニンの７ラグメント。