MXPA01010984A - Inmuno ensayo en tadem para el cancer. - Google Patents

Abstract

La identificacion y la caracterizacion de los factores de riesgo y sus implicaciones moleculares en la patofisiologia de las enfermedades humanas tales como el cancer es esencial para disenar ensayos de diagnostico eficientes y compuestos terapeuticos. Los esteroides estrogenicos, bajo condiciones fisiologicas normales, han demostrado que juegan una funcion critica en varios tejidos. La respuesta de tal variedad de tejidos a la estimulacion con estrogenos puede explicar en parte su papel activo en el desarrollo y progreso de diferentes enfermedades humanas, sobre todo el cancer mamario. En la busqueda de los factores celulares que responden a estrogenos en celulas maternas de carcinomas mamarios primarios humanos obtenidos de biopsias de tumores, dos marcadores celulares, una isoenzima de la supuesta leucina aminopeptidasa (LAPasa; EC 3.4.11. 1) de las celulas maternas de carcinomas mamarios humanos primarios obtenidos a partir de biopsias de tumores, y NDP-cinasa/NN123 (EC 2.7.4.6) citosolica de celulas HL60 se identificaron. Los anticuerpos monoclonales contra cada marcador celular se han producido. La determinacion de la presencia de estos dos marcadores ya sea solos o combinados, se pueden usar para detectar el cancer mamario, y en particular, la metastasis asociada. De esta manera, este invento se refiere al uso de anticuerpos monoclonales para LAP y NDP-cinasa junto con un inmunoensayo basado en un tandem de matriz solida para las pruebas confirmativas de primera linea basadas en sangre para el cancer mamario.

Description

INMUNOENSAYO EN TÁNDEM PARAEL CÁNCER El presente invento se relaciona con el uso de anticuerpos para la detección del cáncer. Más específicamente, este invento se relaciona con anticuerpos específicos para NDP-cinasa/Nm23 y Leucina Aminopeptidasa estimulada por estrógenos (es-LAPasa) y su uso para el diagnostico de carcinomas de los conductos in situ (DCIS-Ductal Carcinomas in situ) y la metástasis asociada con el cáncer mamario. El presente invento también se relaciona con un sistema de diagnóstico que usa un anticuerpo para la NDP-cinasa junto con un anticuerpo especifico para la es-LAPasa estimulada por estrógenos para detectar los niveles en sangre, suero, plasma o tejido de la NDP-cinasa y la LAPasa.

.. ANTECEDENTES DEL INVENTO La identificación y la caracterización de factores de riesgo y sus implicaciones moleculares en la patofisiología de enfermedades humanas tales como el cáncer mamario es esencial para diseñar ensayos de diagnostico eficientes y compuestos terapéuticos. Sobre todo, el diagnostico exacto del tipo de cáncer y su agresividad (etapa) es critica para la elección de la estrategia terapéutica óptima. La determinación de la etapa se basa en una combinación de análisis incluyendo, pero no limitándose a, la histología del tumor, la detección de los componentes sanguíneos y la detección de los marcadores celulares.

Los ensayos de diagnóstico están disponibles para el cáncer mamario. Por ejemplo, las técnicas de imagen tales como los ultrasonidos y los rayos X (mamografías) se usan ampliamente para detectar tumores. Estas técnicas de imagen, sin embargo, sufren de una limitación en la resolución de la imagen lo que evita la detección de tumores por debajo de un cierto tamaño. Además, los fibroadenomas o quistes con frecuencia comparten patrones mamográficos similares como aquellos encontrados en los tumores invasivos malignos, haciendo difícil el determinar la malignidad del tumor sobre la única base de la mamografía. Estudios recientes realizados por Elmore (Lancet, 1999) y Gotéese (Lancet, 2000) han subrayado tempranamente las limitantes de la exploración mamográfica.

El análisis histológico de las biopsias también es un procedimiento común para el diagnostico del cáncer mamario y esta técnica se basa en la identificación de fenotipos visibles de las células. Sin embargo, este análisis es algo subjetivo y depende de la habilidad del examinador.

El análisis de citometría de flujo del ADN de células obtenidas a partir de biopsias también pueden analizarse por su contenido de ADN como una medida de la diploidia de las células, lo cual puede correlacionarse con la presencia de cáncer. In embargo, tal análisis requiere biopsias y procesamiento amplio de la muestra y acceso a instrumentación costosa.

Entre los diversos factores de riesgo asociados al inicio de eventos tempranos que conducen al cáncer mamario, el estrógeno y los compuestos parecidos al estrógeno con una actividad que imita a la de los estrógenos, sigue siendo una de . las más importantes determinantes en los eventos tempranos y el progreso de la carcinogenesis mamaria. Bajo condiciones fisiológicas normales, hay varios tejidos por medio de los cuales se ha demostrado que los esteroides estrogénicos juegan una función crítica. Estos incluyen el desarrollo del aparato reproductor, sobre todo órganos secundarios, tales como las glándulas mamarias. Además, los estrógenos también están involucrados en la regulación fina del crecimiento ósea, en la función hepática y cardiovascular y el ciclo del estro, probablemente a través de la inducción de la proliferación celular en los tejidos blanco [Sutherland, R.L., Watts, C.K.W., y Clarke, C.L. (1998). Hormones and Their Action: Part 1 (van der Molen, H.J., King, R.J.B., Cooke, B.A., eds) pp. 197-215, Elsevier Science Publishing B.V., Amsterdam; Shekhar, P.V.M., Werdell, J., y Basryr, V.S. (1997). Environmental Estrogen Stimulation of Growth and estrogen Receptor Function on Preneoplasic and Cancerous Human Breast Cell Lines. J. Nati. Cáncer. Inst, 89:1774-1782]. La respuesta de tal variedad de tejidos a la estimulación por estrógeno puede explicar en parte su papel activo en el desarrollo y progreso de diferentes carcinomas humanos y en particular del cáncer mamario. Sin el deseo de atarnos a ninguna teoría, se cree que los estrógenos regulan diversas funciones fisiológicas estando involucrados en los eventos "tempranos-inmediatos" y "tempranos" de la función celular. A este respecto, parece que los eventos tempranos inmediatos inducidos por el estrógeno conducen a una proliferación celular elevada con más probabilidad a través déla reducción en el ciclo celular acelerando la velocidad a la cual las células progresan de la fase Gi hacia la fase S. Recientemente, se ha propuesto que el estrógeno promueve la proliferación celular Coactivando a concentraciones de estrógeno similares, la expresión de la ciclina Dl-CdK4 y la ciclina E.Cdk2, dos péptidos reguladores de Gi críticos y potencialmente interrelacionados "Prall, O.W.J., Sarcevic, B., Musgroive, E.A., Watts, C.K.W. y Sutherland, R.L.-(1997). La activación de Cdk4 y Cdk2 inducida por estrógenos durante el progreso de la fase Gi a S está acompañada por una expresión elevada de Ciclina DI y una asociación disminuida del Inhibidor de la cinasa dependiente de la ciclina E-Cdk 2. J. Biol.. Chem., 272: 10882-10894].

Los ensayos de diagnóstico moleculares basados en estrógeno están disponibles. El ensayo usado más ampliamente mide los receptores de estrógeno y progesterona en las células obtenidas a partir de las biopsias. Es particularmente útil para determinar si un tipo particular de cáncer responderá a la terapia hormonal. Sin embargo, este ensayo es de utilidad limitada para evaluar la etapa o el progreso de la enfermedad y en particular do permite la detección de la presencia de metástasis. Esta ensayo también sufre del hecho de que es necesario obtener una biopsia. Aparte del hecho de que esto constituye un procedimiento invasivo, requiere que el tumor sea lo suficientemente grande para ser detectado mediante el tacto con aparatos de imagen. Puede que tales tumores grandes ya estén en una etapa muy avanzada.

La actividad de la NDP-cinasa se ha relacionado con diversos procesos fisiológicos incluyendo la síntesis de ADN y RNA, la producción de AMP cíclico, el metabolismo de los superóxidos y la activación del complejo enzimático involucrado en la reparación del ADN. En general, la actividad de la NDP-cinasa se ha comparado con la proliferación celular, es decir, que se detecta una actividad promovida de la NDP-cinasa citosólica durante la proliferación celular. Además, el gen nm23 por el cual se reducen los niveles de RNA en las células de los tumores de alto potencial metastásico, poseen un alto grado de homología con el gen que codifica para la NDP-cinasa.

El nucleosido difosfato-cinasa facilita la conversión intracelular de los difosfatos desoí y ribonucleótidos a sus formas fosforiladas. Aunque la mayoría de la actividad de la nucleosido difosfato cinasa (NDP-cinasa) se encuentra en el citosol de diversos tipos de células, la enzima también está presente en otros constituyentes de la célula tal como los anillos de proteína de los microtúbulos multiméricos, membranas plasmáticas aisladas de plaquetas humanas y de conejo, y material en partículas del cerebro de res. La amplia distribución de la NDP-cinasa refleja sus papel activo en diversos procesos celulares fundamentales relacionados con el metabolismo de los nucleótidos y del superóxido, la síntesis del AMP cíclico y en general a la proliferación y diferenciación celular.

Su papel en la proliferación y diferenciación celular hace a la NDP-cinasa una candidata, como marcador celular, para la detección del cáncer. Esta avenida e ha explorado mediante análisis inmuno-histoquímicos de secciones de tejido de biopsias de tumor. Sin embargo, no hubo correlación clara en estos estudios entre la presencia de la NDP-cinasa y la presencia de células cancerosas [Sawan A. Et al., NDP-K/nm23 Expression in Human Breast Cáncer in Relation to relapse, Survival and Other Prognostic factors: an Immunohistochemical study, Journal of Patology 1994 Jan; 172 (1): 27-34; Kobayashi S. Et al., Estrogen receptor, c-erB-2 y nm23/NDP Kinase Expression in the Intraductal and Invasive Components of Human Breast Cancers, Japanese Journal of Cáncer research 1992 Aug; 83 (8): 859-65; Srivarsa P.J. et al., Elevated nm23 Protein expression is Correlated with Diminished Progression-Free Survival in patients with Epithelial Ovarían Carcinoma, Gynecology Oncology 1996 Mar; 60(3): 363-72].

Otros marcadores celulares han sido estudiados por su correlación con el cáncer en general y con el cáncer mamario en particular. Entre estos marcadores se ha encontrado que la LAPasa sérica se correlaciona con la invasividad del cáncer mamario (Gupta S.K. et al, Serum leucine Aminopeptidase estimation: A Sensitive prognostic Indicator of Invasiveness in Breast Carcinoma, Indian Journal of Pathology in Microbiology 1989 Oct; 32(4): 301-5]. Sin embargo, las variaciones en el nivel de LAPasa sérica también están asociadas con otros tipos de cáncer y otras condiciones de enfermedad tales como el lupus eritematoso sistémico [Inokuma S. Et al., Serum leucine Aminopeptidase as an Activity Indicator in Systemic Lupus Erythematosus: A study of 46 Consecurtive Cases, Rheumatology (Oxford) 1999 Aug; 38(8): 705-8], infarto al miocardio [Gupta S.K. et al., Prognostic Significance of serum leucine Aminopeptidase in Myocardial Infarction with left Ventricular Failure, Journal of Assoc. Physicians India 1987 Nov; 35(11):760-2] e infecciones virales [Pancheva-haschen R. Et al., Serum Leucina Aminopeptidase for Monitoring Viral Infections with Plasmacytoid Reaction, Enzyme 1986; 36(3): 179-86] entre otros.

Haciendo un diagnóstico basado en un ensayo enzimático de la LAPasa sérica no especifica. Sin el- deseo de atarnos a ninguna teoría, esta no-especificidad puede estar relacionada con la presencia de varias isoenzimas de LAPasa.

Claramente, hay necesidad de métodos más rápidos, más sensibles y menos invasivos para diagnosticar y determinar la etapa del cáncer mamario. Sobre todo, los marcadores celulares, los cuales reflejan la presencia de metástasis y los marcadores indicativos de la actividad de los estrógenos son altamente deseables.

El presente invento proporciona tal método. El método se basa en anticuerpos monoclonales específicos para la NDP-cinasa y la LAPasa estimulada por estrógenos capaz de detectar estos marcadores celulares en la sangre y los tejidos. Los niveles y la actividad enzimática de estos marcadores e correlaciona con la agresividad en general y la presencia de metástasis en pacientes con cáncer y cáncer mamario en particular. Este ensayo basado en la inmunología se puede hacer en muestras de sangre o tejidos de biopsias. Una ventaja adicional del ensayo del presente invento es que al usar dos marcadores, la probabilidad de falsos positivos se reduce en gran parte. Un resultado falso positivo puede surgir cuando se usa un solo marcador si los niveles sanguíneos de este marcador se alteran por otras condiciones fisiológicas en el paciente.

RESUMEN DEL INVENTO El presente invento se relaciona con el uso de anticuerpos para la detección del cáncer. Más específicamente, este invento se relaciona con anticuerpos específicos para la NDP-cinasa/nm23 y la Leucina Aminopeptidasa estimulada por estrógenos (es-LAPasa) y su uso para el diagnostico de los carcinomas de los conductos in situ (DCIS- Ductal Carcinomas In Situ) y la metástasis asociada con el cáncer mamario. El presente invento también se relaciona con un sistema diagnóstico que usa un anticuerpo para la NDP-cinasa junto con un anticuerpo especifico para una LAPasa estimulada por estrógenos para detectar los niveles en sangre o suero, plasma o tejidos de la NDP-cinasa y la LAPasa.

En una representación del presente invento se proporciona un método para detectar el cáncer mamario en una paciente determinando el nivel de NDP-cinasa y de la es-LAPasa en una muestra.

También de acuerdo con el presente invento se proporciona un método para detectar un cáncer metastásico en un paciente determinando el nivel de NDP-cinasa y de es-LAPaea en una muestra.

El presente invento también se relaciona con un sistema diagnostico que utiliza un anticuerpo contra la NDP-cinasa junto con un anticuerpo especifico para la es-LAPasa estimulada por estrógenos para detectar los niveles en sangre, suero, plasma o tejido de NDP-cinasa y LAPasa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIAGRAMAS Estas y otras características del invento se harán más aparentes a partir de la siguiente descripción en la cual se hace referencia a los diagramas adjuntos en donde: FIGURA 1 muestra la reactividad de Mab 4A12 en Western blots de muestras no desnaturalizadas que contienen NDP-cinasa/Nm23. después de una PAGE sin desnaturalización, la preparación citosólica sin purificar (carril 1), la preparación purificada de NDP-cinasa/Nm23 a partir de células HL 60 (carril 2) y Nm23-Hl recombinante (carril 3) se hicieron reaccionar con Mab 4A12. En todas las muestras el mismo componente proteico con idéntica movilidad electroforética fue reconocido por Mab 4A12.

FIGURA 2 muestra la reactividad del anticuerpo monoclonal anti-NDP-cinasa/Nm23 sobre extractos celulares sin purificar después de la PAGE sin desnaturalización. Un extracto celular sin purificar se tiñó para la actividad de NDP-cinasa/Nm23 (carril 1) y otro se transfirió a nitrocelulosa y se hizo reaccionar con el anticuerpo monoclonal Mab 4A12 anti-NDP-cinasa Nm23 (carril 2).

FIGURA 3 muestra un análisis bivariante de la gráfica de puntos de anti-CD 19/anti-NDP-Cinasa/Nm23 células sanguíneas periféricas doblemente marcadas de mujeres sanas. El análisis bivariante de la gráfica de puntos (dispersión secundaria contra anti-CD 19 [LF2] marcado con ficoeritrina) se realizó en PBMC's doblemente marcadas usando Mab 4A12 como marca secundaria detectada con anticuerpos FITC de cabra anti-ratón. Las muestras control- se hicieron reaccionar con las inmunoglobulinas IgGl pre-inmunes control seguido de anticuerpos conjugados FITC- IgG de cabra anti-ratón. Sección I: Análisis bivariante de la gráfica de puntos en células de sangre periférica total. Sección IA: células [LF2] marcadas CDl 9+ se condensaron electrónicamente y subsiguientemente se analizó su actividad simultánea contra los anticuerpos monoclonales anti-NDP-cinasa/Nm23. Como se muestra en la Sección IB, las células [LF2] anti-CD19+ graneadas contra los anticuerpos monoclonales anti-NDP-cinasa/NM23 4A12 muestran que aproximadamente el 93% de las células-B doblemente marcadas reaccionaron contra los anticuerpos monoclonales Mab 4A12 anti-CD 19 y anti-NDP-cinasa/Nm23 (Sección IB, cuadrante 2). Como se muestra en la Sección II, los linfocitos totales que reaccionaron con las inmunoglobulinas IgGl pre- inmunes control permanecieron sin reaccionar mientras que sólo los linfocitos que habían reaccionado con anti-CD 19 y anti-NDP-cinasa separaron selectivamente as las células B marcadas (Sección II, anti-NDP/CD-19, cuadrante 2).

DESCRIPCIÓN DE LA REPRESENTACIÓN PREFERIDA El presente invento se relaciona con el uso de anticuerpos para la detección del cáncer. Más específicamente, este invento se relaciona con anticuerpos específicos para la NDP-cinasa/Nm23 y la Leucina Aminopeptidasa estimulada por estrógenos (es-LAPasa) y su uso para el diagnóstico de carcinomas de los conductos in situ (DCIS) y la metástasis asociada con el cáncer mamario. El presente invento adicionalmente se relaciona con un sistema de diagnóstico que comprende a un anticuerpo especifico para la NDP-cinasa/NM23 para detectar los niveles sanguíneos, plasmáticos o en tejidos de la NDP-cinasa junto con un anticuerpo especifico para la LAPasa estimulada por estrógenos para detectar los niveles sanguíneos, séricos, plasmáticos y en tejidos de la NDP-cinasa y la LAPasa.

En estudios anteriores [Cheng et al., Biochemistry 12:5 (1973)] se sugirió que la NDP-cinasa podría existir como diferentes isoenzimas con puntos isoeléctricos y pesos moleculares característicos. Por el contrario, los estudios (cinética enzimática, mapeo de péptidos e inmunoblot) realizados sobre la NDP-cinasa asociada a la membrana y la citosólica [Kimura et al., J Biol. Chem 263:4647 (1988)], han demostrado que ambas enzimas son formas monoisozimicas idénticas de la NDP-cinasa. Los inventores han descubierto que la NDP-cinasa citosólica activa purificada de células HLóO es un oligomero de aproximadamente 67 kDa compuesto de dos subunidades distintas de aproximadamente 17 kDa y 33 kDa respectivamente, y que la NDP-cinasa citosólica es monoisozimica y las diversas isoenzimas aparentes son el -resultado de diferentes estados de fosforilación de la proteína, y no el producto de la proteolisis de la NDP-cinasa.

De acuerdo con el presente invento, hemos preparado anticuerpos monoclonales contra la NDP-cinasa citosólica purificada de células HLóO. Uno de los anticuerpos monoclonales (Mab4A12) puede reaccionar selectivamente con el oligomero activo de la NDP-cinasa. Después de la desnaturalización, los componentes monoméricos de esta enzima ya no son reconocidos por lo tanto, la conformación nativa de la NDP-cinasa se requiere para que se una al anticuerpo Mab4A12. La NDP-cinasa se ha encontrado en el citoplasma y como un complejo asociado a la membrana. Además, se han reportado propiedades cinéticas y fisicoquímicas idénticas para la NDP-cinasa en ambos sitios.

Adicionalmente de acuerdo con el presente invento se proporciona un anticuerpo especifico para un estrógeno o un análogo de estrógeno estimuló a la leucina aminopeptidasa (es-LAPasa). La preparación de este anticuerpo se describe a detalle en la solicitud de patente endiente de los aspirantes titulada "Un anticuerpo monoclonal contra la leucina Aminopeptidasa estimulada por estrógeno", y el cual se incorpora aquí como referencia.

El anticuerpo monoclonal del presente invento se preparó mediante procedimientos convencionales, generalmente siguiendo los métodos de Campbell (1984, En: Laboratory Techniques in biochemistry and molecular Biology (Burdon, R.H., Knippenberg P.H.V., eds) Ámsterdam, Elsevier: 219-223) y Lietzke, R. Y Unsicker, K (J. Immunol. Methoids 76:223-228, 1985). De acuerdo con este método, células de mieloma de ratón adaptadas al medio de cultivo de tejidos se fusionan con células productoras de anticuerpos de ratones inmunizados para obtener células híbridas que produzcan grandes cantidades de una sola molécula de anticuerpo. En general, las células productoras de anticuerpos se preparan inmunizando al animal, por ejemplo, ratón, rata, conejo, oveja, caballo o bovino, con una -antígeno. El esquema de inmunización y la concentración del antígeno en la suspensión es tan importante para proporcionar cantidades útiles de células productoras de anticuerpos cebadas adecuadamente. Estas sellas productoras de anticuefos pueden ser ya sea células del bazo, timocitos, células de los nodulos linfáticos y/o linfocitos de sangre periférica.

Las células productoras de anticuefos entonces se fusionan con células de mieloma, se pueden usar las líneas celulares que se originan a partir de diversos animales tales como los ratones, ratas, conejos, y humanos, usando un promotor adecuado de la fusión. Muchas líneas de mieloma de raón son conocidas y están disponibles generalmente con los miembros de la comunidad académica y iversos depósitos, tales como el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. La línea celular de mieloma usada preferentemente debe ser sensible al medio para que las células de mieloma que no se fusionen no sobrevivan en medios selectivos. Mientras que los híbridos si puedan sobrevivir. La línea celular usada más comúnmente es la línea celular resistente a la 8-azaguanina, la cual carece de la enzima hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasa y por lo tanto no será mantenida por el medio HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). En general, la línea celular también es preferentemente del tipo "no-secretora", en que esta no produce ningún anticuefo. El promotor de la fusión preferido es el polietilenglicol que tiene un peso molecular entre 1000 y 4000. También se pueden usar otros promotores de la fusión tales como el alcohol polivinilico, un virus o un campo eléctrico.

Las células inmortalizadas (hibridoma) entonces pueden examinarse por tamizaje para elegir a aquellas que secreten anticuefos de la especificidad correcta. El tamizaje inicial generalmente se lleva a cabo usando un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA). Específicamente, los sobrenadantes de los cultivos de hibridomas se agregan a placas de microtitulación o membranas de nitrocelulosa las cuales han sido previamente recubiertas con el antígeno, en esta caso la NDP-cinasa/NM23 purificada a partir de células HLóO. U anticuefo especifico ligado de los sobrenadantes de los cultivos puede detectarse usando un segundo anticuefo marcado , por ejemplo, IgG anti-ratón de cabra marcado con peroxidasa el cual está disponible comercialmente. Los cultivos que son positivos contra el antígeno de NDP-cinasa entonces se someten a clonación mediante el método de dilución limitante. Los cultivos secundarios de hibridoma entonces se re- examinan por tamizaje como se describe anteriormente. Los cultivos entonces se evalúan para determinar si el anticuefo se une o no y para determinar el perfil cinético de la unión del antígeno. Los cultivos elegidos basándose en estos resultados se someten a una clonación adicional hasta que se obtenga la estabilidad y clonabilidad del cultivo. Inmediatamente después de la hibridización, los productos de la fusión tendrán aproximadamente 80 cromosomas, y como estas células continúan dividiéndose , éstas perderán aleatoriamente algunos de estos cromosomas. El proceso de clonación es para elegir a aquellas células que todavía tengan los cromosomas que codifican para la producción de anticuefos.

El proceso de clonación se repite hasta que el 100% de la sub-población muestre la producción de un anticuefo especifico, lo cual es indicativo de la "estabilidad" del hibridoma. Además, los pozos de cultivo de- hibridoma con frecuencia tienen múltiples colonias algunas de las cuales puede que no produzcan anticuefos. El proceso de clonación permite la selección de un híbrido positivo el cual proviene de una sola célula.

En un ejemplo del presente invento, una línea celular de hibridoma 4A12, que produce el anticuefo monoclonal 4A12, se preparó. Este anticuefo monoclonal es especifico para la NDP-cinasa Nm23. Esta línea celular de hibridoma se depositó en la American Type Culture Collcetion el 27 de mayo de 1994 y ha sido reconocida con el número de serie CRL 11634.

El anticuefo 4A12 es del subtipo de IgG2a y reconoce la forma de la NDP-cinasa/nm23 que se encuentra en la membrana y en la forma citosólica. El anticuefo muestra una unión detectable a muchos tipos de células, incluyendo células del linaje hematopoyético. Sin embargo, el anticuefo es especifico para el linfocito B y no reconoce a otros linfocitos. Al respecto, las pacientes con cáncer mamario con enfermedad metástasica presentan una disminución notable de las células B positivas para NDP-cinasa. Por lo tanto esto reconocería que el anticuefo del presente invento es muy útil en el diagnóstico de la enfermedad metástasica en tales pacientes.

En un ejemplo del presente invento, una línea celular de hibridoma 7B6, que produce el anticuefo monoclonal 7B6, se preparó. Este anticuefo monoclonal es especifico para la LAPasa estimulada por estrógenos. Esta línea celular de hibridoma se depositó en la Autoridad Internacional de Depósitos de Canadá el 23 de marzo de 2000 bajo el número de acceso IDAC 230300-1.

El presente invento también abarca los anticuefos del presente invento y cualquiera de los fragmentos del mismo que contengan la región de unión activa de los anticuefos tales como los fragmentos Fab, F(ab)2 y FV. Estos fragmentos pueden obtenerse a partir del anticuefo 7B6 ó 4a 12 usando técnicas bien conocidas para aquellos entrenados en el área (Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121 : 663-69, Academic Press, 1986).

Una representación adicional del presente invento abarca anticuefos o fragmentos de los mismos capaces de unirse al mismo determinante antigénico que el anticuefo 7B6 o el 4A12. Incluyendo, pero no limitándose a, anticuefos que poseen la misma especificidad antigénica como el anticuefo 7B6 o el 4A12 pero originándose de diferentes especies o teniendo un isotipo diferente o mostrando diferentes afinidades de unión. Se cree que la clase y las variantes de isotipo del anticuefo del presente invento pueden prepararse usando técnicas de cambio de clase recombinante y de fusión que son bien conocidas para aquellas personas especializadas en la profesión (vea por ejemplo: Tamaña et al. Eur. J. Im unol, 13:614, 1983; Oi et al., Biotechnologies, 4(3):214-221, Liu y col. Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 84: 3439-43, 1987; Neuberger et al, Nature 312:604-608, 1984 y Spira et al. J. Immunol. Meth., 74:307-15, 1984).

El anticuefo monoclonal del presente invento puede producirse ya sea usando un bioreactor o a partir de líquido de ascitis, ambos procedimientos son bien conocidos por los especialistas de la profesión.

Los anticuefos monoclonales del presente invento pueden usarse para aplicaciones de diagnóstico para la detección de la metástasis y la etapa en que se encuentra el cáncer mamario y otros tipos de cánceres tales como el cáncer cerebral de origen glial usando sistemas de inmunoensayo para determinar los niveles de NDP-cinasa/nm23 junto con los niveles de la es-LAPasa en sangre y tejidos.

En un aspecto del presente invento, los inmunoprecipitados que usan Mab 4A12 de fracciones celulares de células maternas parecidas a células epiteliales asiladas a partir de biopsias de rumores de mujeres con carcinomas mamarios indican que la actividad de la NDP-cinasa se reduce en la fracción del estroma y se elevan en las fracciones citofolicas. Además, los inmunoprecipitados de plasma usando Mab 4A12 también indican un aumento en los niveles de NDP-cinasa/nm23 en mujer-es con carcinomas de los conductos in situ (DCIS) y enfermedad metástasica.

En un aspecto adicional del presente invento, el Mab 4A12 del presente invento puede usarse para detectar células que presentan NDP-cinasa/nm23 en la superficie o asociados a la membrana. Sobre todo, la reactividad y la distribución de Mab4A12 en las células humanas de sangra periférica ha sido analizada. Se ha encontrado que los monocitos y los granulocitos reaccionan con Mab4A12, pero que sólo una fracción de los linfocitos reaccionan con el anticuefo. Los análisis posteriores han demostrado que sólo los linfocitos B y más específicamente los linfocitos CDl 9+ reaccionan con el anticuefo anti-NDP-cinasa/nm23 del presente invento. En este aspecto del invento, se prueba que la detección del antígeno reconocida por MAB4A12 sobre las células B CDl 9+ de pacientes con cáncer mamario y sobre las células de tumores cerebrales de origen glial, se ha correlacionado inversamente con la presencia de metástasis y aumento de la agresividad del tumor. Además, el presente invento usa Mab7B6 junto con Mab4A12 para detectar células que exhiban NDP-cinasa/nm23 y es-LAPasa de superficie o asociada a la membrana.

Los inmunoensayos involucran el contacto de una muestra tal como tejido o sangre con los anticuefos del presente invento y detectar la presencia de la aducción anticuefo-antígeno. También, la muestra puede inmunoprecipitarse y los niveles o actividad de la enzima en el inmunoprecipitado puede medirse.

Ciertos inmunoensayos utilizan un método de anticuefo doble para detectar la presencia de un antígeno. Estas técnicas se revisan en "Basic Principales of Antigen-Antibody Reaction", Elvin A. Labat, (Methods in Enzymology, 70, 3-70, 1980). Con frecuencia se hace referencia a tales sistemas como sistemas de formato rápido debido a qye se adaptan a determinaciones rápidas de la presencia de un antígeno. El sistema requiere alta afinidad entre el anticuefo y el antígeno.

De acuerdo con una representación del presente invento, la presencia de NDP-cinasa/nm23 se determina usando un par de anticuefos, cada uno especifico para NDP-cinasa/nm23. Uno de los pares de anticuefos mencionados se refiere aquí como "anticuefo detector" y el otro anticuefo del par mencionado se refiere aquí como "anticuefo de captura". Los anticuefos monoclonales del presente invento pueden usarse ya sea como anticuefo de captura o anticuefo detector. Los anticuefos monoclonales del presente invento también pueden usarse como anticuefos de captura y de detección, juntos en un solo ensayo. Una representación del presente invento de esta manera usa el método del sandwich con dos anticuefos para detectar la NDP-cinasa en una muestra de líquido biológico. En este método, el antígeno queda atrapado en medio de anticuefo detector y del anticuefo de captura, el anticuefo de captura se inmoviliza irreversiblemente sobre un soporte sólido. El anticuefo detector contendrá una etiqueta detectable, para identificar la presencia del sandwich anticuefo-antígeno y de esta manera la presencia del antígeno. En un aspecto del presente invento cada marcador, la NDP-cinasa y la es-LAPasa se someten a un ensayo en un sistema individual, usando un anticuefo especifico para cada marcador, con el método del sandwich de anticuefo doble, descrito anteriormente.

Las primeras formas comunes de soportes sólidos fueron placas, tubos o cuentas de poliestireno que eran bien conocidas en el campo del radioinmunoensayo y el inmunoensayo por enzimas. Más recientemente, una serie de materiales porosos tales como el nylon, la nitrocelulosa, el acetato de celulosa, las fibras de vidrio y otros polímeros porosos se han empleado como soportes sólidos.

Una representación del presente invento usa un aparato de inmunoensayo del tipo de flujo continuo. Valkirs et al. (Patente EUA No. 4,632,901) revela un aparato que contiene al anticuefo, especifico para el analito que es el antígeno, unido a una membrana porosa o a un filtro al cual se agrega una muestra líquida. Conforme el líquido fluye a través de la membrana, los analitos blanco se unen al anticuefo. La adición de la muestra es seguida por la adición de un anticuefo marcado. La detección visual del anticuefo marcado proporciona una indicación de la presencia del analito blanco en la muestra.

Otro ejemplo de un aparato de flujo continuo es revelado por Kromer et al. (EP-A 0 229 359), que describió un sistema de liberación de reactivo que contiene una matriz saturada con un reactivo o componentes de los mismos dispersos en un polímero soluble en agua para controlar la velocidad de disolución del reactivo a liberar a una matriz de reacción posicionada por debajo de la matriz.

En los ensayos del tipo migratorios, una membrana se impregna con los reactivos necesarios para realizar el ensayo. Se proporciona una zona de detección del analito en la cual el analito marcado se une y se lee el ensayo. Por ejemplo, vea Tom et al. (Patente EUA No. 4,366,241), y Zuk (EP-A 0143 574). Los aparatos para ensayos de migración normalmente incoforan dentro de ellos reactivos que han sido anexados a etiquetas coloridas de esta manera permitiendo la detección visible de los resultados del ensayo sin la adición de sustancias adicionales.- Vea por ejemplo Bernstein (Patente EUA No. 4,770,853), may et al. (WO 88/08534), y Ching et al. (EP-A 0 299 428). El anticuefo monoclonal del presente estudio puede usarse en todos estos tipos conocidos de aparatos de flujo continuo. Estos aparatos de flujo continuo también pueden usarse cuando se tiene que detectar más de un analito en una sola muestra. De esta manera, de acuerdo con una representación del presente invento los aparatos de lujo continuo pueden usarse para la detección de leucina aminopeptidasa estimulada por estrógenos y la NDP-cinasa citosólica/Nm23.

Las etiquetas directas son un ejemplo de etiquetas que pueden usarse de acuerdo con el presente invento. Una etiqueta directa se ha definido como una identidad, la cual en su estado natural, es fácilmente visible, ya sea a simple vista, o con la ayuda de un filtro óptico y/o estimulación aplicada, por ejemplo la luz UV para promover la fluorescencia. Entre los ejemplos de etiquetas coloridas, que puede usarse de acuerdo con el presente invento, incluyen a partículas sol metálicas, por ejemplo, partículas sol de oro como aquellas descritas por Leuvering (Patente EUA No. 4,313,734); partículas sol de colorantes tales como las descritas por Gribnau et al. (Patente EUA No. 4,373,9 32) y May et al. (WO 8); ); o colorantes encapsulados en liposomas como son descritos por Campbell et al (Patente ). Otras etiquetas directas incluyen a un radionucleotido, una entidad fluorescente o una entidad luminiscente. Además de estos aparatos de mareaje directo, también se pueden usar marcas indirectas compuestas por enzimas de acuerdo con el presente invento. Diversos tipos de inmunoensayos ligados a enzimas son bien conocidos en el área, por ejemplo, fosfatasa alcalina y preoxidas de rábano, lisozima, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, ureasa, estas y otras han sido discutidas a detalle por Eva Engvall en Enzime Immunoassay ELISA and EMIT in Methods in Enzymology, 70.419-439, 1980 y en la Patente EUA No 4,857,453.

Otros ejemplos de aparatos para diagnostico biológico, que pueden usarse para la detección de la NDP-cinasa/nm23 y la es-LAPasa, usando los anticuefos monoclonales del presente invento, incluyen los aparatos descritos por G. Grenner, P.B. Diagnostics Systems, Inc., en las Patentes EUA 4,906,439 y 4,918,025.

En una representación del presente invento, la prueba diagnostica usa un tubo con muestra de sangre el cual se usa comúnmente para obtener las muestras de sangre de los pacientes. La pared interior del tubo actúa como portador de los anticuefos monoclonales o policlonales y los agentes requeridos o los medios de detección, necesarios para producir una señal medible. En esta representación el anticuefo de captura se inmoviliza sobre la pared del tubo de ensayo. Después de obtener la muestra del paciente, el usuario simplemente agita la muestra con el anticuefo detector en el tubo para que el anticuefo detector reaccione con cualquier NDP-cinasa/Nm23 o es-LAPasa en la sangre. En este ejemplo de anticuefos monoclonales del presente invento puede ser el anticuefo de captura o el anticuefo detector. Puede que sea necesario usar una muestra en donde los eritrocitos hayan sido extraídos, para que los eritrocitos no interfieran con el análisis de los resultados. Si el analito está presente en la sangre, quedará atrapado en el sandwich entre el anticuefo de captura y el anticuefo detector el cual contiene una etiqueta adecuada para la detección directa o reacciona con los reactivos en un ensayo indirecto. El soporte sólido (el tubo de ensayo) entonces puede enjuagarse para descartar el material etiquetado libre sin unirse. Se puede usar una variedad de soportes sólidos de acuerdo con este método, por ejemplo, paredes del tubo de ensayo, tazas de plástico, cuentas, bolas de plástico y cilindros incluyendo las placas de microtitulación, papel y fibra de vidrio.

Actualmente hay varios tipos de aparatos automáticos de ensayo que pueden emprender ensayos de formato rápido en una serie de muestras contemporáneamente. Estos aparatos automatizados de análisis incluyen a los aparatos de ensayo de acceso continuo / aleatorio. Los ejemplos de tales sistemas incluyen a OPUS™ de PB Diagnostic System, Inc. Y al IMX™ Analyzer presentado por Abbott laboratories del Norte de Chicago, Illinois en 1988. En general, una muestra del líquido de prueba se proporciona típicamente en una taza de muestra y todos los pasos del proceso incluyendo la transferencia de la muestra con pipeta hacia el elemento de prueba del ensayo, la incubación y la lectura de la señal obtenida se llevan a cabo automáticamente. Los sistemas automatizados de ensayo generalmente incluyen una serie de estaciones de trabajo cada una de las cuales realiza uno de los pasos en el procedimiento de prueba. El elemento del ensayo puede transportarse de una estación de trabajo a la siguiente mediante diversos medios tales como el carrusel o la repisa movible para permitir que los pasos de la prueba se logren secuencialmente. Los elementos del ensayo también pueden incluir reservorios para almacenar reactivos, líquidos de mezcla, para diluir las muestras, etc. Los elementos del ensayo también incluyen una abertura para permitir la administración de una cantidad predeterminada de líquido de muestra, y si es necesario, cualquier otro agente requerido a una membrana porosa. El elemento de la muestra también puede incluir una ventana para permitir la visualización de la señal obtenida como resultado de los pasos del proceso, típicamente un cambio fluorescente o colorimétrico en los reactivos presentes sobre la membrana porosa a ser leídos, tales como por medio de un espectroscopio o fluorometro que se incluyen dentro del sistema de ensayo.

Los instrumentos automatizados de ensayo de PB Diagnostic Systems, Inc. Se describen en las patentes EUA 5,051,237; 5,138,868; 5,141,871 y 5,147,609.

Una descripción del IMX™ Analyzer se incluye en el "Sistema Analizador de Inmunoquímica Auitomatizado Abbott IMX" por Fiore, M. Et al., Clinical Chemistry, 35, No. 9, 1988. Un ejemplo adicional de estos analizadores ha sido descrito en la Patente EUA No 4,956,148 titulada "Repisa de fijación y Cartucho desechable de muestra" emitido a C.J. Grandone el 1 de septiembre de 1990, y asignado a Abbott Laboratories, el cual describe un carrusel para soportar una pluralidad de celdas de reacción para usarse en conexión con el sistema Abbott IMX™. Un desarrollo posterior en el área ha sido descrito en la Solicitud de Patente canadiense 2,069,531, Chadwick M. Dunn et al., asignada a Abbott Laboratories en donde el sistema analizador inmunoquímico, descrito en esta aplicación anterior, tiene la capacidad de examinar hasta tres o cuatro analitos en un mismo lote durante una sola corrida usando la instrumentación actualmente disponible. El sistema descrito en la solicitud Canadiense mencionado anteriormente permite a los usuarios agrupar tres lotes pequeños de ensayos en lugar de correr tres análisis por separado. El anticuefo monoclonal del presente invento puede usarse en estos analizadores automáticos.

Una clase adicional de sistemas analizadores inmunoquímicos, en el cual los anticuefos monoclonales del presente invento pueden usarse, son los biosensores o sistemas inmunosensores ópticos. En general un biosensor óptico es un dispositivo el cual usa cuantitativamente los principios ópticos para convertir las concentraciones químicas o bioquímicas o actividades de interés a señales eléctricas. Estos sistemas pueden agruparse dentro de cuatro categorías principales: técnicas de reflexión; resonancia plasmon de superficie; técnicas de fibra óptica y dispositivos ópticos integrados.

Las técnicas de reflexión incluyen a la elipsometría, ala espectroscopia de reflexión integral múltiple, y los dispositivos de llenado capilar fluorescentes. Las técnicas de fibra óptica incluyen a la fluorescencia de campo evanescente, el tubo capilar de fibra óptica, y a los sensores fluorescentes de fibra óptica. Los dispositivos ópticos integrados incluyen a la fluorescencia de campo evanescente , al inmunosensor acoplador de gradución de entrada, interferometro Mach-Zehnder, Interferometro Hartman y sensores de interferometro de diferencia. Estos ejemplos de inmunosensores ópticos se describen en general en un artículo de revisión de G.A. Robins (Advances in Biosensors), Vol. 1, pp 229-256,- 1991. Una descripción más especifica de estos dispositivos se encuentra por ejemplo en las Patentes EUA 4,810,658; 4,978,503; 5,186,897; R.A. Brady et al. (Phil. Trans. R. Soc. Land. B 316, 143-160, 1987) y G.A. Robinson et al. (en Sensors and Actuatoirs, Elsevier, 1992).

Otro método inmunoquímico de análisis es la citometría de flujo. En la citometría de flujo la muestra que contiene el antígeno se hace reaccionar con una forma marcada fluorescentemente del anticuefo monoclonal del presente invento. La muestra se pasa en frente de un rayo láser de una longitud de onda dada capaz de excitar el cromóforo que está en el anticuefo. Cada partícula o célula que tengan el anticuefo unido a ellas fluorescerá y será detectada. Esta técnica permite el análisis de tipos de células especificas y en particular de tipos de células sanguíneas especificas. Por lo tanto se usa para la detección de la célula B que presenta los antígenos NDP-cinasa Nm23 o el es-LAPasa.

Las actividades de la NDP-cinasa y de la LAPasa también pueden determinarse usando inmunoprecipitados de plasma obtenidos mediante inmunoprecipitación usando Mab 4A12 y Mab7B6 covalentes cada uno unido a un soporte sólido. Brevemente, el plasma o una dilución del plasma se agregó a los Mabs unidos covalentemente y se incubó durante un tiempo suficiente para asegurar que cualquier marcador en la muestra se unió a los anticuefos monoclonales. Las actividad de cada enzima individual puede determinarse.

En una representación del presente invento, los analitos se detectan en una muestra de sangre, suero, plasma o tejidos usando el anticuefo monoclonal del presente invento, en un dispositivo compuesto por un filtro de membrana o un soporte sólido con una sección de detección y una sección de captura. La sección de detección contiene un anticuefo (un anticuefo detector), el cual reaccionará con la NDP-cinasa/Nm23. El anticuefo detector se inmoviliza reversiblemente sobre el soporte sólido y migrará con la muestra, cuando esté en uso. Se prefiere que el anticuefo detector está marcado, por ejemplo con un radionucleotido, una enzima, una entidad fluorescente, una entidad luminiscente o una etiqueta colorida tal como las descritas en el trabajo anterior, y discutidas anteriormente.

La sección de captura contiene un anticuefo de captura, el cual se inmoviliza irreversiblemente sobre el soporte sólido. Los anticuefos, el anticuefo de captura y el detector, y los reactivos necesarios se inmovilizan sobre el soporte sólido usando técnicas estándar reconocidas en el área, como se revela en los dispositivos de inmunoensayo del tipo de flujo continuo discutidos anteriormente. En general, los anticuefos se absorben sobre los soportes sólidos como resultado de las interacciones hidrofóbicas entre las subestructuras proteicas no-polares y el material no-polar de la matriz de soporte.

En una representación adicional del presente invento, el anticuefo que reaccionará con la NDP-cinasa/Nm23 puede usarse, en un ensayo en tándem, junto con otro anticuefo, más específicamente el anticuefo especifico para la es-LAPasa humana. La LAPasa sérica es más elevada en las pacientes con cáncer mamario y todavía más levada en las pacientes con cáncer mamario con enfermedad metástasica (vea ejemplos abajo). Además, la es-LAPasa está más elevada en el sobrenadante de cultivos de células de carcinoma mamario que han sido expuestas a estrógenos. De esta manera en el ensayo en tándem, ambos anticuefos se usan simultáneamente para detectar los niveles de NDP-cinasa/nm23 y es-LAPasa en el suero de muestras sanguíneas. El ensayo en tándem se sobrepone a las limitaciones de los trabajos anteriores ya que usa dos marcadores que son ambos sensibles a la presencia de metástasis en pacientes con cáncer mamario. Por lo tanto, la especificidad y la exactitud del ensayo para el cáncer mamario se eleva al disminuir la probabilidad de falsos positivos.

En una representación adicional de este invento el ensayo en tándem también puede usarse para monitorear pacientes que están en riesgo de desarrollar cáncer mamario. Sobre todo, porque la es-LAPasa sérica y la NDP-cinasa/nm23 se ven afectadas por los estrógenos, las personas con riesgo pueden incluir a aquellas que consumen pildoras anticonceptivas basadas en estrógenos, terapia de reemplazo hormonal o personas que tienen patrones hormonales anormales. De esta manera, de acuerdo con este aspecto del presente invento, si una mujer está siendo tratada con un estrógeno terapéutico, sus niveles de estos dos marcadores en su suero pueden monitorearse para determinar si el nivel de NDP-cinasa y de es-LAPasa aumentan. Por lo tanto, como los niveles elevados de NDP-cinasa y de es-LAPasa se correlacionan con un aumento en el riesgo de desarrollar cáncer mamario, tales mujeres podrían reducir su riesgo reduciendo su consumo de estrógenos.

Alguien entrenado en esta área reconocería que, un nivel basal de NDP-cinasa/NM23 y de es-LAPasa puede estar presente en las pacientes normales. De esta manera, en el presente invento, en ciertas representaciones, se determinarán niveles de NDP-cinasa/Nm23 y de es-LAPasa por encima de lo normal. Esto puede lograrse ya sea comparando los resultados con los resultados de una paciente normal, o ajustando la sensibilidad del inmunoensayo para que sólo valores por encima de un cierto umbral muestren un resultado positivo.

Alguien entrenado en esta área reconocería que, las representaciones anteriormente descritas de este invento puede que tengan que modificarse para distinguir entre la NDP-cinasa/Nm23 citosólica o la asociada a la membrana.

Para que el invento descrito aquí se entienda más, se establecen los siguientes ejemplos. Se debe entender que -estos ejemplos son con propósitos ilustrativos y que no se debe considerar que limitan el alcance de este invento de ninguna manera.

EJEMPLO Ejemplo 1: Aislamiento y purificación de la NDP-cinasa citosólica de las células HL60 La NDP-cinasa citosólica de las células HLóO se purificó como lo describe Pulido-Cejudo et al [FASEB J 3: 608a (1989)]. Brevemente, la fracción citosólica de los extractos celulares obtenidos se 15 gramos (peso húmedo) de los paquetes de células HLóO lavadas con solución salina amortiguada de fosfatos (PBS) se aplicaron a una columna de celulosa fosfato (Pl l) (1.6 cm X 28.0 cm) previamente equilibrada en amortiguador de fosfatos A [fosfato de potasio 50mM pH 7.0, MgCl2 2 mM, PMSF 1 mM, DTT lmM y glicerol al 10%]. La columna se lavó con 300 ml del mismo amortiguador a una velocidad de flujo de 0.1 ml/min. La protema que no se unió se concentró a 10 ml mediante ultrafiltración usando la membrana YM5 (5000 M.W. cutoff, Amicon Div., Danvers, MA., USA).

El concentrado se aplicó a una columna de celulosa DEAE (2.6 cm X 28.5 cm) se equilibro y se lavó con buffer Tris [ Tris-HCl 50 mM a pH 7.5; MgCl2 2 mM; PMSF 1 mM; DTT 1 mM y glicerol al 10% (v/v)]. La NDP-cinasa/Nm23 se eluyó usando un gradiente lineal (NaCl 0 a 1M en buffer Tris) a una velocidad de flujo de 0.50 ml/min. La determinación de la actividad del material purificado que contiene NDP-cinasa/Nm23 se determinó como lo describe G. Pulido-Cejudo et al[J. Chromatogr. B 660 (1994) 37-47)]. Brevemente, la actividad de la NDP-cinasa/Nm23 se determinó midiendo la cantidad de dATP consumido con dADP como aceptor de fosfatos y una cantidad fija de enzima. El papel de intercambio iónico DEAE (DE81) se uso para separar el 3HdATP del resto de 3HdADP después de la transferencia de fosfato mediada por la NDP-cinasa/Nm23 al dADP sin marcador. Antes de usarse, todos los desoxinucleotidos y ribonucleótidos se purificaron mediante una cromatografía de intercambio aniónico. Soluciones con una concentración de 23 mM de cada nucleotido se cargaron en una columna analítica Partisil 10SAX equilibrada con NH4H2P04, a pH 3.9. La elusión isocrática de las dos muestras fue de 1700 a 1800 psi (Waters HPLC system Modelo 510). El pH del material purificado se ajustó a 7.0 con amoniaco, y se determinó la concentración final espectrofotométricamente a 260 nm. Las fracciones que contenían NDP-cinasa/Nm23 se combinaron y se concentraron subsiguientemente mediante ultrafiltración. El concentrado de NDP-cinasa/Nm23 se cargó en una columna Sephacryl S-200 (2.6 cm X 51 cm) pre-equilibrada en buffer Tris y el material activo se recuperó después de este paso de purificación. La concentración de proteínas después de cada paso de purificación se determinó como lo describe Pulido- Cejudo [J. Chromatogr. B 660 (1994) 37-47)]. Brevemente, muestras (100 - 200 µl) se dializaron contra agua deionizada y 2 - 20 µl de cada una se colocaron en tubos de polipropileno. Las muestras se secaron durante 60 min a 110°C durate 90 minutos y se neutralizaron subsiguientemente con 250 µl de ácido acético glacial. Entonces las muestras e hicieron reaccionar con 500 µl de la siguiente solución de ninhidrina-hidrindantina: 2 g de ninhidrina y 150 mg de hidrindantina (Sigma) se disolvieron en 65 ml de 2-metoxietanol y después 35 ml de acetato de sodio 4M (pH 5.5) se agregaron. Los tubos se incubaron a 110°C durante 15 minutos. Antes de leer la absorbancia délas muestras a 570 nm, se agregaron 2.5 ml de etanol al 5% (v/v). El contenido proteico se determinó mediante intefolación sobre una curva de absorbancia obtenida con las muestras de BSA (1 - 10 µg). En la Tabla 1 se establece un resumen de la purificación de la NDP-cinasa/Nm23 citosólica de células HLóO.

Tabla 1 Resumen de la purificación de la NDP-cinasa de las sellas HLóO Paso Proteína1 Actividad Actividad Pliegue Rendimiento (mg) total2 especifica % (nmol/min) (nmol/min) Homogenado 875 125 0.14 1 100 Sobrenadante 623 102 0.16 1.15 81.60 Fosfato de 135 100 0.74 5.21 80.00 celulosa 1.18 14 11.86 83.52 11.20 DEAE 0.006 6 1000 7042 4.80 Sephacryl S- 200 1- La cantidad de proteína se determinó después de la hidrólisis alcalina y la detección cuantitativa de ninhidrina del material hidrolizado. 2- determinada con un ensayo de primer orden (Pulido-Cejudo et al. J. Chromatogr.

B. 660, 37-47.

Ejemplo 2: Aislamiento y purificación de Leucina aminopeptidasa estimulada por estrógenos (es-LAPasa) Las células maternas primarias de carcinoma mamario obtenidas de biopsias de tumores humanos se estimularon con 17-ß-Estradiol 100 nM durante 24 horas o con medio de cultivo para células solo como control. El medio de cultivo para las células fue el medio RPMI 1640 + 10% FCS + Penicilina 100 U/ml + Estreptomicina 100 µg/ml. Entonces se recolectaron los sobrenadantes celulares y se dializaron contra PBS en mangueras de celulosa sin suturas (MW 12,400) durante 12 horas a 4°C. La LAP se purificó subsiguientemente a partir de los sobrenadantes celulares dializados usando HPLC-por permeación en gel seguida por cromatografía de afinidad DEAE-Celulosa y Bestatina-Sepharose. Brevemente, el sobrenadante celular se aplicó a una columna Bio-Sil SEC-250 (600 X 7.5 mm) previamente equilibrada en un amortiguador que contenía buffer de fosfato de sodio 100 mM pH 6.8, Na2SO4 100 mM, ZnCl2 1 µM, y glicerol al 10%. La columna se lavo con 300 ml del mismo buffer a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. La proteína se concentró a 10 ml mediante ultrafitración usando la membrana YM5 (5000 M.W. cutoff, Amicon Div., Danvers, MA., EUA). El concentrado se aplicó a una columna de celulosa DEAE (2.6 x 28.5 cm) equilibrada y lavada con buffer Trsi-HCl 50 mM pH 7.5; ZnCl2 1 µM; y glicerol al 10% (v/v). La LAP se eluyó usando un gradiente lineal (NaCl 0 a 1M en buffer Tris) a una velocidad de flujo de 0.50 ml/min. Se preparó una columna de afinidad por Bestatina usando Ultralink EDC/matriz de enlaces amida DADPA (Pierce, Roxkford, IL USA) haciendo reaccionar 100 mg de Bestatina pura con la matriz carbodiimida EDC/DADPA siguiendo el procedimiento proporcionado por el fabricante. Antes de cargar el eluyente que contenía a la LAPasa, la columna de afinidad de Bestatina se equilibro con Tris-HPLC 10 mM a pH 8.0 que contenía ZnCl2 lµM y se lavó con 300 ml de este buffer de unión. La es-LAPasa se re-circuló a través del sistema usando una bomba peristáltica a una velocidad de flujo de 0.10 ml/min, por 2 horas. Después de esta recirculación, la columna se lavó con ocho volúmenes de la columna de buffer de unión. La es-LAPasa unida a la Bestatina se eluyó con un gradiente lineal (NaCl 0 a 0.5 M) preparado en buffer de unión de Tris-HCl 10 mM a pH 8.0 que contiene ZnCl2 1 µM. La concentración de proteínas LAPasa después de cada paso de purificación se determino como lo describe Pulido-Cejudo [J. Chromatogr. B 660 (1994) 37-47)]. Explicado brevemente, muestras de (100 - 200 µl) se dializaron contra agua desionizada y 2-20 µl de cada uno se colocaron en tubos de polipropileno. Las muestras se secaron durante 60 minutos a 110°C durante 90 minutos y se neutralizaron subsiguientemente con 250 µl de ácido acético glacial. Entonces las muestras reaccionaron con 500 µl de la siguiente solución de ninhidrina-hidrindantina: 2 g de ninhidrina y 150 mg de hidrindantina (Sihma) se disolvieron en 65 ml de 2-metoxietanol y después se agregaron 35 ml de acetato de sodio 4M (pH 5.5). Los tubos se incubaron a 110°C durante 15 minutos. Antes de leer la absorbancia de las muestras a 570 nm, se agregaron2.5 ml de etanol al 5% (v/v). El contenido de proteína se determinó mediante la intefolación en una curva de absorbancia obtenida con muestras- de BSA (1 -10 µg).

Ejemplo 3: Producción y purificación de los anticuerpos monoclonales Mab 7B6 (Anti.LAPasa) y Mab 4A12 (Anti-NDP-cinasa) Los protocolos para la preparación de antígenos para inmunización;' la preparación de las células del bazo de animales inmunes, la fusión délas células del bazo con células de mieloma y el cultivo en placa de las células fusionadas en medio HAT selectivo se condujo siguiendo los lineamientos detallados descritos por Campbell [Burdon RH, Knippenberg PHV (eds): laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Amsterdam, Elsevier, p219 (1984)] y por Lietzke y Unsicker [Lietzke R. Unsicker K: A Statistical Approach to determine Monoclonality After Limiting Cell Plating of a Hybridoma Clone, J Immunol Methods 76: 223 (1985)].

Contrario a la mayoría de los procedimientos estándar usados para la producción de los anticuefos monoclonales, la inmunización primaria se realizó con NDP-cinasa altamente purificada ( pliegue de purificación 7000 - vea la Tabla 1) y no con preparaciones de enzima sin purificar o parcialmente purificada: La producción del líquido de ascitis se logró cebando ratones BALB/C com 500 L de pristane una semana antes de la inyección intraperitoneal- de 3X106 células de hibridoma. El líquido de ascitis se recolectó después de 20 días drenando la cavidad peritoneal. La purificación de las inmunoglobulinas IgG de líquidos de ascitis se realizó mediante cromatografía de afinidad en una columna de protema G Sepharose 4 FF de 3 ml (Pharmacia, Uppsala, Suecia) siguiendo el protocolo del fabricante.

El tamizaje de los anticuefos monoclonales contra NDP-cinasa se realizó mediante una inmunotionción de manchas puntuales sobre nitrocelulosa. Explicado brevemente, 0.5 a 1 µg de NDP-cinasa (5 µl) se colocaron sobre una membrana de nitrocelulosa seca y bloqueada durante una hora a 37°C con PBS/ BSA al 3% (solución de bloqueo). Los anticuefos monoclonales de ratón (dilucionbes 1/100 y 1/500) se prepararon en solución de bloqueo y se hicieron reaccionar con NDP-cinasa inmovilizada a 37°C durante 17 horas y después de detectó usando un método de inmunoperoxidasa.

Un anticuefo monoclonal Mab 4A12, se depositó con la American Type Culture Collection el 27 de mayo de 1994, bajo el número de acceso CRL 11634.

En la producción de la línea celular 7B6 de hibridoma que secreta los anticuefos monoclonales de ratón contra LAPasa que responde al 17-ß-estradiol, se prepararon los protocolos para la preparación de antígenos para la inmunización, la preparación de las células del bazo a partir de animales inmunes, la fusión de las células bazo con células de mieloma y el cultivo en placas de células fusionadas en medios selectivos se condujo después de los lineamientos detallados descritos por Campbell [Burdon RH, Kippenberg PHV (eds): Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biologyu, Amsterdam, Elsevier, p219 (1984)] y por Lietzke y Unsicker [Leitzke R Unsicker K: A Statistical Approach to determine Monoclonality After Limiting Cell Plating of a Hybridoma Clone, J Immunol Methods 76:223 (1985)].

Explicado de manera breve, la inmunización primaria se realizó con es-LAPasa purificada después del procedimiento de salting out. Se realizaron estímulos con es-LAPasa purificada en los días 14, 35 y 56. Se exploraron mediante pruebas de tamizaje los ratones BALB/c en los días 24 y 45. Los ratones se sacrificaron en el día 59 y las células del bazo del ratón con mejor respuesta se fusionaron con células de mieloma. Se realizó el tamizaje mediante una inmunotinción de la mancha puntual sobre nitrocelulosa.

El clon de hibridoma 7B6 se obtuvo mediante la clonación de una sola célula usando diluciones limitantes. Se prepararon cuatro tubos de dilución en serie que contenían células de hibridoma con suplemento para medio con FBS al 20% + 2X OPI. 100 µl de cada dilución se cultivaron en pozos de una placa con 96-pozos con 50 µl de células de alimento para las células de bazo en cada pozo y se colocaron dentro de un incubador a 37°C con 5% de CO2. En el día 7, el sobrenadante de cada pozo se retiró y se sometió a las pruebas de tamizaje mediante inmunotinción de manchas puntuales sobre nitrocelulosa.

Las células 7B6 clonadas del hibridoma se transfirieron de la placa de 96 pozos a 0.5 ml de medio complementado con FBS al 20% + 1XHAT en una placa de 24 pozos. Una vez que las células estaban densas, se transfirieron a 5 ml en un recipiente de 60 mm y después se transfirieron a 10 ml en un recipiente de 100 mm. Una vez en el recipiente de 60 mm, a las células se les excluyó la hipoxantina, timidina y aminopterina. Las células 7B6 de hibridoma se continuaron cultivando hasta la fase log del crecimiento. El anticuefo Mab 7B6 anti- es-LAPasa se aisló a partir del sobrenadante de células de hibridoma 7B6 recolectado mediante cromatografía de afinidad usando IgG inmunopura como lo describe el fabricante. El tamizaje se realizó mediante una inmunotinción de manchas puntuales sobre nitrocelulosa.

Se determinaron los isotipos de Mab 4A12 y los de Mab 7B6 usando el Kit de Inmunotipifícación de Sigma. Explicado de manera breve, el ensayo involucra la unión de los monoclonales a una tira de membrana de nitrocelulosa de isotipificación previamente recubierta seguida de la inmunodetección usando un sistema de detección sensible al sistema biotina-avidina-enzima. El isotipo de la inmunoglobulina se revela por auto-descripción. El isotipo de Mab 4A12 fue IgG2a y el de Mab 7B6 se determinó que era IgGla.

Ejemplo 4: Efecto del estrógeno sobre la actividad de NDP-Cinasa/Nm23 en las fracciones citosólicas y de las células del estroma de líneas celulares maternas primarias de carcinoma mamario Las líneas celulares maternas primarias de carcinoma mamario se incubaron con 17-ß-Estradiol 100 nM durante 24 horas. Las células se incubaron solo con medio de cultivo para células como control. Las fracciones citosólicas y de las células del estroma se aislaron como lo describen Pulido-Cejudo et al [1994, J. Chromatogr. B. 660: 37-47]. La actividad de la NDP-cinasa/Nm23 se determinó en cada fracción celular mediante cromatografía de líquidos de alta resolución de intercambio aniónico como los describen G. Pulido-Cejudo et al. [1994, J. Chromatogr. B. 660: 37-47].

Las fracciones citosólicas y de las células del estroma junto con la NDP-cinasa/NM23 purificada de células HLóO y Nm23-Hl recombinantes se sometieron a electroforesis bajo condiciones no-desnaturalizantes. Los geles se sometieron a un procedimiento de electroblott sobre membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con solución salina Tris amortiguada (TBS) a 37°C durante 1 hora y se probaron con anti-NDP-cinasa/Nm23 (Mab 4A12) diluida 1 :100 en TBS, Las bandas se visualizaron incubando las manchas (blots) con fosfatasa alcalina de cabra anti-ratón diluida a 1 :500 en TBS seguido por detección colorimétrica en buffer de sustrato de fosfatasa alcalina (pH 9.5) usando BCIP y NBT como sustratos.

Los trozos de gel que contenían NDP-cinasa/Nm23 se corrieron bajo condiciones no-desnaturalizantes y se tiñeron para ver la actividad de la NDP-cinasa/NM23 como lo describen Lam y Packham [1986, Biochem. Pharmacol. 35: 4449-4455]. Las muestras que contienen NDP-cinasa/Nm23 se inmunoprecipitaron con el anticuefo monoclonal Mab 4A12 previamente adsorbidas en cuentas de proet+ina -A- Sepharose. Primero, ña matriz de inmunoafinidad de proteína- A-Sepharose-Mab 4A12 se bloqueó durante 2 horas con FCS al 10%-RPMI 1640, y se lavaron con Tris-HCL 10 mM pH 8.

Las muestras (100 pl) con una actividad conocida de NDP-cinasa/Nm23 se incubaron ya sea con cuentas de pro teína- A- Sepharose, o con una matriz de proteína-A-Sepharose Mab 4A12, y se incubaron durante toda la noche a 4°C con agitación constante. Después de la incubación, la actividad de la NDP-cinasa/Nm23 en el sobrenadante se detyerminó como lo describen Larn y Packham [1986, Biochem. Pharmacol. 35: 4449-4455].

Como se muestra en la Tabla 2, bajo la estimulación con estrógenos, la actividad de la NDP-cinasa/Nm23 en la fracción citosólica fue casi de cuarenta veces más que la observada en el control. Como la exposición al estrógeno aumenta la actividad de la NDP-cinasa/Nm23 en el citosol, se ve el efecto reverso en la actividad de la NDP-cinasa/Nm23 unida a la membrana.

Tabla 2 Actividad de la NPD-cinasa/Nm23 en las fracciones celulares del estroma y citosólicas Actividad NDP-cinasa/Nm23 µmol dATP/µg) Condición Del estroma Citosólica Control 6.5 ± 0.2 x 10"' 1.8 ± 0.2 Estrógeno 1.1 ± 0.1 x 10"2 44.8 ± 2.1 (100 nM) Las actividades enzimáticas de la NDP-cinasa/Nm23 se determinaron como lo describen G. Pulido-Cejudo et al. [10] La distribución en la superficie celular de la NDP-cinasa/Nm23 en células intactas se analizó. Como se muestra en la Figura 1, Western Blots realizados bajo una PAGE no desnaturalizante, ya sea de preparaciones citosólicas sin purificar (carril 1) o NDP-cinasa/Nm23 purificada de células HLóO (carril 2) y Nm23-Hl recombinante (carril 3) muestran un perfil electroforético similar, revelando una sola banda homogénea en todas las muestras que usaron el anticuefo monoclonal Mab 4A12 anti-NDP-cinasa/Nm23.

Se realizaron experimentos adicionales para caracterizar la identidad de las bandas de proteína reconocidas por el Mab 4A12 en extractos celulares sin purificar después del PAGE no-desnaturalizante y transfiera a la nitrocelulosa. Como se muestra en la Figura 2, una muestra se tino para la actividad de la NDP-cinasa/Nm23 (carril 1) y el segundo reaccionó con el anticuefo monoclonal Mab4A12 anti-NDP-cinasa/Nm23 (carril 2). Las bandas de proteína que contienen actividad de NDP-cinasa (carril 1), se corrieron exactamente en la misma posición que aquellas identificadas mediante el Western blot usando el anticuefo monoclonal Mab 4A12 (carril 2). Colectivamente, estos resultados confirman la especificidad del anticuefo monoclonal Mab 4a 12 y sugieren que el último anticuefo reconoce al oligomero citosólico activo de NDP-cinasa/NM23. Finalmente, este anticuefo se uso para estudiar la distribución celular de la NDP-cinasa/Nm23 en las células de la sangre periférica aisladas de personas normales y de mujeres con enfermedad metástasica (pulmón/cerebro).

Ejemplo 5: La distribución celular de la citometría de flujo de la NDP-cinasa/Nm23 en células de sangre periférica se personas sanas y mujeres con carcinomas mamarios metástasicos La sangre total de mujeres normales y con enfermedad metástasica se sometieron a centrifugación a 1500 fm en una centrífuga refrigerada durante 10 minutos a 4°C. La cubierta amarillenta se aspiro, y se diluyo con un volumen igual de PBS y se aplicó sobre Ficoll-Paque. Las células se centrifugaron a 1500 fm durante 30 minutos adicionales y las las PBMC se recolectaron en la interfase. Las células se lavaron tres veces con PBS.

Las células de sangre total se tiñeron usando un método inmunofluorescente de dos colores. Explicado de manera breve, 20 µl de anticuefos Mab 4A12 (200 µg/ml), o IgGl control se agregó a 100 µl de sangre. Después de una incubación inicial de 30 minutos, las células se lavaron y se resuspendieron en 100 µl de PBS frío y se agregó anticuefo IgG de cabra-anti-ratón conjugado con FITC. La mezcla se incubo durante 20 minutos, se lavo otra vez y las células se resuspendieron en 100 µl de PBS. Las células sanguíneas más tarde se incubaron con 20 ul de uno de los siguientes anticuefos de ratón conjugados a la ficoeritrina: IgG-PE (control); Leu 3-PE (anti-CD4); Leu2-PE (anti-CD8); Leu 4-PE (anti-CD3); Leu 12-PE (anti-CDI9); Leullc-PE (anti-CD16); Leu 19-PE (anti CD56). Después de 15 minutos de incubación, los eritrocitos se procesaron en una estación de trabajo automatizada Q-prep la cual libera secuencialmente un agente para lisar los eritrocitos, un estabilizador de leucocitos y un fijador.

Después de la lisis de los eritrocitos, as células se lavaron dos veces con PBS a 4°C y se fijaron con 1 ml de paraformaldehído al 2%. Las muestras se analizaron en un citometro ¿de flujo equipado con un láser iónico de argón enfriado por aire que opera a 10 mwatt. La excitación simultánea de los conjugados de FITC y PE se logra fijando la longitud de onda de excitación a 488 nm. Los linfocitos se distinguieron claramente de los monocitos y de los granulocitos en base a su dispersión hacia adelante de la luz (FAS -Forward Light Scatter) y la dispersión lateral de la uz (SS Side Scatter) en una exhibición bi variable. Una reja electrónica colocada alrededor de la población de células que soportan las características de dispersión de la luz de los granulocitos, monocitos y linfocitos se activaron para el análisis.

En el ciclo celular, se ha propuesto que la NDP-cinasa/Nm23 unida a la membrana podría modular la actividad de la adenilato ciclasa reponiendo los niveles de GTP requeridos para la activación de las proteínas G (Gs y Gl) las cuales a su vez median la estimulación hormonal y la inhibición de la adenilato ciclasa respectivamente [Kimura, N. Y Shimada, N., 1983, J. Biol.. Chem. 258: 2278-2283; Kimura, N. and Shimada, N., 1986, Biochem. Biophys. Res. Commun. 134: 928-936; Gilman, A.G. 1987, Ann. Rev. Biochem., 56: 615-649]. Esta observación nos incitó a determinar la reactividad de los anticuefos anti-NDP-cinasa (Mab 4a 12) hacia las células sanguíneas de sangre periférica (PBMC). Estudios de inmunofluorescencia de dos colores se llevaron a cabo usando los anticuefos Mab 4A12 y diversos anticuefos monoclonales conjugados a fícoeritrina, reconociendo epitopos característicos expresados por diferentes subconjuntos de linfocitos. Se encontró que en las PBMC obtenidas a partir de mujeres sanas, sólo los linfocitos que portan la glicoproteína integral de membrana CDl 9 característica de las células B (Células B CD19+), se etiquetaron simultáneamente con anticuefos monoclonales anti CDl 9 (Fig 3, IA) y anticuefos monoclonales MAB 4A12 (Fig 3, IB). A este respecto, cerca del 93% de las linfocitos B CDl 9+ (como se muestra en la reja electrónica de la Fig 3, 1 A) expresaron el antígeno reconocido por Mab 4A12 en PBMCs aislados de mujeres sanas (como se muestra en el cuadrante 2 de la Fig 3, IB así como en la Fig 3, II, cuadrante 2 anti-NDP-CD19 etiquetada). Por el contrario, una disminución notable en la población de linfocitos B doblemente marcados CD19+-NDP-cinasa+ se observó en mujeres con enfermedad metástasica (vea la Tabla 3).

Tabla 3 Porcentaje de células B circulantes doblemente marcadas anti-CD 19/anti-NDP-cinasa de la sangre periférica. % de linfocitos B doblemente marcados anti-CD 19/anti-NDP-cinasa (reja-B) Personas normales 93.30 ± 1.02 Mujeres con enfermedad metástasica 2.91 ± 0.82 (pulmón/cerebro) Ninguna de las otras poblaciones posibles de linfocitos se etiquetaron selectivamente con el anticuefo monoclonal cultivados contra la NDP-cinasa/Nm23 citosólica. Basado en este análisis, parece que el anticuefo monoclonal NDP-cinasa/Nm23 únicamente etiqueta a linfocitos B, reaccionando más probablemente con el oligomero de la NDP-cinasa/Nm23 asociado a la membrana.

Ejemplo 6: Análisis por ELISA de las células maternas de carcinoma mamario humano El análisis ELISA de las líneas celulares maternas de carcinoma mamario humano se condujo para demostrar la reactividad de Mab 4a 12 y Mab 7B6 contra NDP-K y LAPasa respectivamente. Explicado brevemente, 50000 células maternas se cultivaron en placas por pozos en una placa de 96 pozos en medio RPMI 1640 + FCS al 10% + Penicilina 100 U/ml + Estreptromicina 100 µg/ml de estreptomicina. Las células en las placas se cultivaron a 37°C, con 5% de C02, durante 24 horas. Los sobrenadantes celulares se retiraron, las células se lavaron con PBS y subsiguientemente se fijaron con glutaraldehído al 1% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. El lavado con PBS ocurrió antes del bloqueo con caseína durante 1 hora a 37°C y 5% de C02. Siguiendo otro lavado con PBS, diluciones en serie de Mab 4a 12 ó Mab 7B6 se agregaron a los pozos y se dejaron incubando durante 2 horas a 37°C y 5% de C02. La demostración de la reactividad de Mab 4a12 y Mab 7B6 fue evidente al agregar el segundo anticuefo, anti-(IgG + IgM) IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa + IgM (H + L) seguido por un sustrato, OPD.

El resumen de las lecturas tomadas a los 490 nm usando Mab 7B6 contra la LAP humana se muestra abajo en la Tabla 4 Tabla 4 Resumen de la reactividad de Mab 7B6 contra LAP de células maternas de carcinoma mamario humano.

Ejemplo 7: Actividades de la NDP-cinasa/Nm23 y de la es-LAPasa en el plasma de mujeres con cáncer mamario Las actividades de la NDP-cinasa/Nm23 y de la es-LAPasa en el plasma de pacientes con recaída con cáncer mamario primario comparadas con los controles de las edades correspondientes de mujeres sanas, se determinaron mediante HPLC (Pulido-Cejudo et al. 1994, J. Chromatogr. B., 660:37-47) para la actividad de la NDP-cinasa/NM23. se determinó la actividad de la es-LAPasa fluorometricamente usando leucina-ß-naftilamida como el sustrato como lo describen Kuramochi y sol. La reacción se detuvo calentando a ebullición las muestras a 100°C durante 10 minutos, seguido de centrifugación a 780 g a 4°c durante 10 minutos. Los valores obtenidos representan el promedio de la actividad de la es-LAPasa determinado por triplicado en 16 pacientes de cada grupo de prueba.

Se determinaron las actividades de NDP-cinasa/NM23 y la es-LAPasa usando infliunoprecipitados de plasma obtenidos por inmunoprecipitación usando matrices covalente de Mab 4A12(igG2a)-Proteína G y Mab 7B6(igGia) LAPasa-Proteína G. Explicado brevemente, el plasma se centrífugo a 500 x g durante lOminutos a 4°C. El plasma se retiró mediante aspiración y se centrífuga una vez más a 500x g durante 5minutos a 4°C. El plasma resultante se diluyó 1 :10 con PBS y 800 µl de la dilución del plasma se agregó a las natrices covalentes de Mab 4A12(igG2a)-Proteína G y Mab 7B6(igGia) LAPasa-Proteína G que contiene 5 µg de anticuefo en 200 ul de cuentas pre-incubadas con buffer de bloqueo [50 mM Tris-HCl; lecha seca descremada al 0.5% (NFDM_Non-Fat Dried Milk)]. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente (~22°C) durante 15 minutos con rotación suave constante en tubos Eppendorf pre-cubiertos con BSA al 0.5%. Después de la incubación, las muestras se centrifugaron a 250x g en la centrífuga Eppendorf-Microfuge a temperatura ambiente, los sobrenadantes se retiraron. Las cuentas que contenían actividad de NDP-cinasa/Nm23 o de es-LAPasa se lavaron tres veces con PBS; con NFDM al 0.5% y finalmente se resuspendieron en solución de Hank libre de calcio haciendo un volumen final de reacción de 600 µl y 1-leucina-ß-naftilamida 182µM. Un blanco correspondiente de cuentas de Mab 4A12([gG2a)-Proteína G y Mab 7B6(igGia) LAPasa-Proteína G recubiertas con NFDM al 0.5% se uso como valor basal.

Los inmunoprecipitados de plasma que usaron Mab 4a 12 (anti-NDP-Cinasa/NM23) y Mab 7B6 /anti-es-LAPasa) mostró consistentemente niveles más altos de marcadores dependientes de estrógenos en mujeres con carcinomas de los conductos no invasivos y carcinomas metástasicos cuando se comparan con los niveles plasmáticos de mujeres de oto modo sanas. Un resumen de los resultados obtenidos se muestra en las Tabla 5 y 6.

Tabla 5 Tabla 6 Niveles de NDP-cinasa/Nm23 en el lasma de mu eres con cáncer mamario Ejemplo 8: La detección flujocitometrica de la es-LAPasa unida a la membrana y la NDP-cinasa/Nm23 en las células maternas de carcinoma mamario obtenidas de biopsias de tumor parecidas a las células epiteliales La tinción inmunofluorescente indirecta de células parecidas a células epiteliales de biopsias de tumores se realizo incubando las sellas adherentes con anticuefos séricos humanos pre-adsorbidos Mab 4 A12 o Mab 7B6. Explicado de manera breve, las células confluentes se levaron rápidamente con PBS y se incubaron a 37°C con 20 µl de anticuefos Mab 4a 12 ó Mab 7B6 (200 µg/ml) o IgGl de ratón control en un volumen final de 2 ml. Después de 20 minutos las celdas de incubación se lavaron rápidamente una vez más con PBS y se incubaron con anticuefos de ratón anti-IgG-PE o conjugados de ratón anti-IgG-FITC durante 15 minutos. Las células se lavaron subsiguientemente tres veces con PBS, se tripsinizaron parcialmente y se analizaron en un citometro de flujo equipado con un láser iónico de argón enfriado con aire que opera a 10 mwatt. La excitación simultánea de los conjugados FITC y PE se logró fijando la longitud de onda de excitación a 488 nm.

Los niveles de NDP-cinasa/Nm23 y de es-LAPasa en el plasma de mujeres con cáncer mamario primario comparadas con los controles de edades correspondientes de mujeres de otra manera sanas, se determinaron mediante ELISA SANDO LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES Mab 4 A12 y Mab 7B6 respectivamente.

Después de la purificación de los anticuefos monoclonales Mab 4A12 y Mab 7B6, sus isotipos correspondientes IgG2a (Anti-NDP-Cinasa/Nm23) e IgGl (Anti-es-LAPasa) se inmovilizaron subsiguientemente a través de un sistema de enlace cruzado DSS obtenido con Pierce (Rockford, IL, USA) de acuerdo con los procedimientos descritos por el -fabricante.

Las matrices Mab 4a 12 y Mab 7B6 Proteína G se usaron para inmunoprecipitar selectivamente la NDP-Cinasa/Nm23 y es-LAPasa del plasma o de las fracciones unidas a la membrana celular antes de determinar las actividades de las enzimas correspondientes.

Los resultados se muestran el la Tabla 7.

Tabla 7 Actividad de la NDP-cinasa Nm23 en fracciones de estromas y citosólicos de células parecidas al epitelio aisladas de biopsias de tumor de mujeres con carcinomas mamarios comparadas con mujeres con quistes/fibroadenomas benignos Actividad de la NDP-cinasa/Nm23 (µmol dATP/µg) Condición Del estroma Citosólico Fibroadenomas/Quistes 80.24 ± 1.22 3.18 ± DCIS (no-invasivo) 3.22 ± 0.12 25.34 ± Metastasico (Pulmón/cerebro) 0.15 ± 0.04 102 ± 2.3 Las referencias científicas, las Patentes y las solicitudes de patentes referidas en la solicitud se incoforan aquí mediante referencias.

El presente invento se define en términos de ciertos ejemplos, los cuales con deben considerarse como limitantes. El alcance total del presente invento se define en las siguientes declaraciones.

Claims (1)

1. LAS REPRESENTACIONES DEL INVENTO EN LAS CUALES SE RECLAMA UNA PROPIEDAD DEL PRIVILEGIO, SE DEFINEN DE LA SIGUIENTE MANERA: 1. Un método para detectar cáncer mamario en una paciente determinando el nivel de NDP-cinasa y de es-LAPasa en una muestra. 2. El método de acuerdo con la declaración 1 en donde el nivel de NDP-cinasa y de es-LAPasa se determinan por un método elegido a partir del grupo que consiste en: Determinar la actividad de la NDP-cinasa y de la es-LAPasa en una muestra, y determinando la presencia de la NDP-cinasa y de la es-LAPasa en una muestra mediante inmunoensayo. 3. El método de acuerdo con la declaración 2 en donde la presencia de NDP-cinasa se determina mediante un inmunoensayo usando un anticuefo monoclonal el cual es especifico para la NDP-cinasa citosólica y unida a la membrana de las células hl60 humanas. 4. El método de acuerdo con la declaración 3 en donde el anticuefo monoclonal es producido por la línea celular de hibridoma 4A12, depositada en la ATCC bajo el número de acceso CRL 11634. 5. El método de acuerdo a la declaración 2 en donde la presencia de es-LAPasa se determina mediante un inmunoensayo usando un anticuefo monoclonal el cual es especifico para la es-LAPasa. El método de acuerdo con la declaración 5 en donde el anticuefo monoclonal es producido por la línea celular de hibridoma 7B6, depositada en la Autoridad Internacional de Depósitos de Canadá bajo el número de acceso IDAC-230300-1. Un método para detectar un cáncer metastásico en una paciente determinando el nivel de NDP-cinasa y de es-LAPasa en una muestra. El método de acuerdo con la declaración 7 en donde el nivel de NDP-cinasa y de es-LAPasa se determinan por un método elegido de un grupo que consiste de: determinar la actividad de la NPD-cinasa y de la es-LAPasa en una muestra, y determinando la presencia de la NDP-cinasa y de es-LAPasa en una muestra mediante un inmunoensayo. El método de acuerdo con la declaración 8 en donde la presencia de NDP-cinasa se determina por un inmunoensayo usando un anticuefo monoclonal el cual es especifico para la NDP-cinasa citosólica y unido a la membrana de las células humanas hl60. El método de acuerdo con la declaración 9 en donde el anticuefo monoclonal es producido por una línea celular de hibridoma 4A12, depositado con la ATCC bajo el número de acceso CRL 11634. El método de acuerdo con la declaración 8 en donde la presencia de es-LAPasa es determinada por un inmunoensayo usando un anticuefo monoclonal el cual es especifico para la es-LAPasa. 12. El método de acuerdo con la declaración 11 en donde el anticuefo monoclonal es producido por una línea celular de hibridoma 7B6, depositado con la Autoridad Internacional de Depósitos de Canadá bajo el número de acceso IDAC-230300-1. 13. Un método para detectar un riesgo para desarrollar cáncer mamario determinado el nivel de NDP-cinasa y de es-LAPasa en una muestra. 14. El método de acuerdo con la declaración 13 en donde el nivel de NDP-cinasa y de es-LAPasa se determinan por un método elegido del grupo que consiste en: determinar la actividad de la NDP-cinasa y de la es-LAPasa en una muestra, y determinando la presencia de la NDP-cinasa y de la es-LAPasa en una muestra mediante un inmunoensayo. 15. El método de acuerdo con la declaración 14 en donde la presencia de NDP- cinasa se determina mediante un inmunoensayo que usa un anticuefo monoclonal el cual es especifico para la NDP-cinasa citosólica o unida a la membrana de las células humanas h 160. 16. El método de acuerdo con la declaración 15 en donde el anticuefo monoclonal se produce mediante la línea celular de hibridoma 4A12, depositada en la ATCC bajo el número de acceso CRL 11634. 17. El método de acuerdo con la declaración 14 en donde la presencia de la es- LAPasa se determina mediante un inmunoensayo usando un anticuefo monoclonal el cual es especifico para la es-LAPasa. 18. El método de acuerdo con la declaración 17 en donde el anticuefo monoclonal es producido por la línea celular de hibridoma 7B6, depositada con la Autoridad Internacional de Depósito de Canadá bajo el número de Acceso IDAC-230300- 1. 19. Un sistema de diagnostico para determinar el nivel de NDP-cinasa y de es- LAPasa en una muestra usand?- un inmunoensayo que contenga un primer anticuefo monoclonal el cual es especifico para la NDP-cinasa citosólica y unida a la membrana de las células h 160 y un segundo anticuefo monoclonal especifico para la LAPasa estimulada por estrógenos, en donde el sistema de diagnostico mencionado se usa para determinar un estado elegido del grupo que consiste en cáncer mamario, cáncer metastásico un riesgo de desarrollar cáncer mamario. 0. El sistema diagnostico de acuerdo con la declaración 19, en donde el primer anticuefo monoclonal es producido por la línea celular de hibridoma 4A12, depositada con la ATCC bajo el número de acceso CRL 11634 y en donde el segundo anticuefo monoclonal es producido por una línea celular de hibridoma 7B6, depositado con la Autoridad Internacional de Depósitos de Canadá bajo el número de acceso IDAC-2303001. 1. Un método para detectar cáncer de mama en un paciente determinando los niveles de NDP-cinasa en una muestra mediante un inmunoensayo utilizando el anticuefo monoclonal producido por el hibridoma de la línea celular 4A12, depositado en la ATCC bajo el número de acceso CRL 11634. 22. Un método de detección de cáncer metastático en un paciente determinando los niveles de NDP-cinasa en una muestra mediante un inmunoensayo utilizando el anticuefo monoclonal producido por el hibridoma de la línea celular 4A12, depositado en la ATCC bajo el número de acceso CRL 11634. 23. Los métodos de las reclamaciones 21 y 22 en donde dichos niveles de la NDP- cinasa son determinados en células B circulantes, CDl 9 positivas. 24. Un método para detectar cáncer de mama en un paciente determinando los niveles de NDP-cinasa y es-LAPasa en una muestra mediante un inmunoensayo utilizando los anticuefos producidos por el hibridoma de la línea celular 4A12, depositado en la ATCC bajo el número de acceso CRL 11634 y por el hibridoma de la línea celular 7B6, depositado en la Autoridad Internacional de Depósito de Canadá bajo el número de acceso IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000. 25. Un método de detección de cáncer metastático en un paciente determinando los niveles de NDP-cinasa y de es-LAPasa en una muestra mediante inmuoensayo utilizando los anticuefos monoclonales producidos por el hibridoma de la línea celular 4A12, depositado en la ATCC bajo el número de acceso CRL 11634 y por el hibridoma de la línea celular 7B6, depositado en la Autoridad Internacional de Depósito de Canadá bajo el número de acceso IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000. 26. Un sistema de diagnosis para detectar los niveles de la NDP-cinasa y es-LAPasa en una muestra utilizando un inmunoensayo que contenga un primer anticuefo monoclonal específico contra la forma citosólica y membranar de la NDP-cinasa de las células hl60 y producido por el hibridoma de la línea celular 7B6, depositado en la Autoridad Internacional de Depósito de Canadá bajo el número de acceso IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000 en donde dicho sistema de diagnosis es utilizado para determinar el estadio seleccionado de un grupo consistente de cáncer de mama, cáncer metastático y a riesgo de desarrollar cáncer de mama.