CN116396942A - 杂交瘤细胞、抗p4hb的单克隆抗体和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种杂交瘤细胞、抗P4HB的单克隆抗体和试剂盒。该杂交瘤细胞的保藏编号为CCTCC NO：C2022109。该杂交瘤细胞产生的单克隆抗体识别并结合P4HB的灵敏度高，且特异性好，用于检测肝癌时能够提高肝癌的早期检出率。

Description

杂交瘤细胞、抗P4HB的单克隆抗体和试剂盒

技术领域

本申请涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种杂交瘤细胞、抗P4HB的单克隆抗体和试剂盒。

背景技术

原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。肝细胞癌是原发性肝癌的主要病理类型，约占70％～85％。肝癌常规筛查策略为血清甲胎蛋白检测及超声影像检查，两者的灵敏度和特异性不高。由于肝细胞癌发病快且缺乏显著特征，超过60％的患者确诊时已进入晚期或已发生转移。

P4HB定位于17号染色体，由508个氨基酸组成，分子质量为57.2kDa。P4HB是蛋白质二硫键异构酶家族的一员，在体内发挥多种生物学功能。P4HB能够催化氧化，还原和异构化三类硫基-二硫键的交换反应，从而影响蛋白质的折叠。此外，P4HB还具有分子伴侣功能，参与蛋白质的折叠和分泌。有研究表明，P4HB在肝细胞癌组织高表达，不仅高于癌旁组织，且随着肝癌恶性程度的增加其表达量也增加。因此，P4HB可作为肝细胞癌的诊断或预后分析的标志物。然而目前已有的产品检测P4HB的灵敏度和特异性不够高，仍会影响肝细胞癌的诊断或预后分析。

发明内容

基于此，本申请提供一种杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞产生的单克隆抗体识别并结合P4HB的灵敏度高，且特异性好，用于检测肝癌时能够提高肝癌的早期检出率。

此外，还提供一种单克隆抗体、检测肝癌的试剂、试剂盒及应用。

一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞的保藏编号为CCTCC NO：C2022109。

一种抗P4HB的单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述杂交瘤细胞分泌。

上述杂交瘤细胞或以上任一实施例所述的单克隆抗体在制备检测肝癌的产品中的应用。

一种检测肝癌的试剂，所述试剂包括上述单克隆抗体。

在其中一个实施例中，所述试剂还包括可与单克隆抗体结合的标记抗体。

在其中一个实施例中，所述标记抗体连接有标记物，所述标记物包括三联吡啶钌、吖啶酯、辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、荧光素、生物素或胶体金中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述标记物包括辣根过氧化物酶。

在其中一个实施例中，所述标记抗体为IgG抗体。

一种检测肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括上述任一实施例所述的试剂。

在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括通过免疫组织化学法、免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法、放射性免疫分析法、免疫扩散法、流式细胞荧光分选法进行蛋白水平检测的试剂。

在其中一个实施例中，所述试剂盒检测的样本包括组织样本。

附图说明

图1为实施例1中筛选的杂交瘤细胞株的定株结果图；

图2为实施例3中鉴定实施例2中制备得到的单克隆抗体的亚类和亚型的结果示意图；

图3为实施例3中对实施例2中纯化的单克隆抗体的SDS-PAGE凝胶电泳结果示意图；

图4为实施例3中检测实施例2中纯化的单克隆抗体亲和力的实验结果示意图；

图5为实施例4中2例Ⅰ期肝细胞癌患者的癌症组织和癌旁组织的染色结果图；

图6为实施例4中2例Ⅱ期肝细胞癌患者的癌症组织和癌旁组织的染色结果图；

图7为实施例4中1例Ⅲ期肝细胞癌患者的癌症组织和癌旁组织的染色结果图；

图8为实施例4中2例健康人的肝脏组织的染色结果图。

具体实施方式

为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

本文所述的“杂交瘤细胞”是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征的细胞。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞。脾淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞，从而可以筛选得到杂交瘤细胞。

所述的“抗体”又称为免疫球蛋白，是一种由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，上述靶抗原包括蛋白质、糖类、多核苷酸、脂质、多肽或小分子化合物。

本申请一实施方式提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞的保藏编号为CCTCCNO：C2022109。

该杂交瘤细胞为小鼠杂交瘤细胞1A9E3，于2022年5月18日保藏于在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)并于2022年5月22日由该保藏中心鉴定为存活，地址：中国武汉市武汉大学。该杂交瘤细胞的保藏号为CCTCC NO：C2022109，分类命名：杂交瘤细胞株1A9E3。

此外，本申请一实施方式还提供了一种抗P4HB的单克隆抗体，该单克隆抗体由上述杂交瘤细胞分泌。

上述保藏号为CCTCC NO：C2022109的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体记为1A9E3，该单克隆抗体识别并结合P4HB的灵敏度高，且特异性好，用于检测肝癌时能够提高肝癌的早期检出率。

本申请一实施方式还提供了一种上述杂交瘤细胞或以上任一实施例所述的单克隆抗体在制备检测肝癌的产品中的应用。

本申请一实施方式还提供了一种检测肝癌的试剂，该试剂包括上述单克隆抗体。

上述试剂具有检测灵敏度高，特异性好的优点。

在其中一个实施例中，上述试剂还包括辅助检测剂，例如缓冲液。

在其中一个实施例中，上述单克隆抗体可以不标记标记物。例如将该单克隆抗体作为包被抗体应用于肝癌的检测试剂中，具体例如：作为ELISA中的包被抗体。

在其中一个实施例中，上述试剂还包括可与单克隆抗体结合的标记抗体，用于捕获和P4HB特异性结合的单克隆抗体。

在其中一个实施例中，上述标记抗体连接有标记物，该标记物包括三联吡啶钌、吖啶酯、辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、荧光素、生物素或胶体金中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述标记抗体为IgG抗体。

此外，本申请一实施方式还提供了一种检测肝癌的试剂盒，该试剂盒包括上述任一实施例所述的试剂。

在其中一个实施例中，上述试剂盒还可通过免疫组织化学法、免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法、放射性免疫分析法、免疫扩散法、流式细胞荧光分选法进行蛋白水平检测，此时上述试剂盒包括各方法对应的试剂。

所述的“免疫组织化学法”应用抗原和抗体结合的原理，检测细胞内多肽或蛋白质等大分子物质的分布。具体来说，直接或间接带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位和定量测定的一种方法。

所述的“免疫印迹法”是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。它将凝胶电泳与固相免疫结合，首先通过蛋白质电泳技术将需要区分的蛋白质转移至固相载体如NC膜等上，再借助酶免疫、放射免疫等技术进行测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子质量。

所述的“酶联免疫吸附测定法”简称酶联免疫法，或者ELISA法。该法使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；再使与抗原或抗体对应的抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

所述的“放射性免疫分析法”利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法。具体原理为，使放射性标记抗原和未标记抗原(待测物)与不足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。

所述的“免疫扩散法”是以琼脂作为抗原抗体的免疫沉淀反应的惰性载体，通过观测沉淀与抗原浓度的关系，即可定量测定抗原(待测样品中蛋白质)的含量。免疫扩散法分为环状免疫单扩散法和双向扩散法两种。其中，环状免疫单扩散法是将一定量的抗体与含缓冲液的琼脂糖凝胶混匀铺成适当厚度的凝胶板，再把抗原滴进凝胶板的小孔中，在合适的浓度和湿度环境中，抗原由小孔向四周扩散(呈辐射状)，经过一定的时间后抗原与在琼脂糖凝胶中的抗体相互作用。双向扩散法又称琼脂扩散法，是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应，通过扩散作用使分处两处的抗原和相应抗体相遇，形成抗原-抗体复合物，比例合适时将出现沉淀现象。

所述的“流式细胞荧光分选法”是对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传或分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析发方法。当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。流式细胞分选，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选，能复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离，单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯化、高通量单克隆分选或细胞芯片制备。分选后的细胞能直接用于培养、移植、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。硬件中样本细胞丢弃的比例低于5％，保证样本中目标细胞的高回收率。

在其中一个实施例中，上述试剂盒检测的样本包括组织样本。

另外，本申请一实施方式还提供了一种肝癌样本的确认方法，该方法包括步骤a1和步骤a2。具体地：

步骤a1：对待测肝脏组织样本进行免疫组织化学染色，获得待测肝脏组织样本染色结果；其中，采用保藏号为CCTCC NO：C2022109的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为一抗；或直接采用标记有标记物的保藏号为CCTCC NO：C2022109的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。

在一个可选的具体示例中，采用保藏号为CCTCC NO：C2022109的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为一抗，以及采用标记有辣根过氧化物酶(HRP)的二抗；或直接采用标记有辣根过氧化物酶的保藏号为CCTCC NO：C2022109的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。

在一个可选的具体示例中，采用DAB显色液使待测肝脏组织样本显色。

步骤a2：根据待测肝脏组织样本染色结果确认该样本是否为肝癌样本。

具体地，上述肝癌包括肝细胞癌。

在一个可选的具体示例中，上述肝癌为肝细胞癌。

在一个可选的具体示例中，根据待测肝脏组织样本染色的深浅程度评估该样本中的肝癌阳性细胞比例，以确认待测样本是否为肝癌样本。具体地，阳性细胞比例大于10％时，确认待测样本为肝癌样本；细胞没有着色或者阳性细胞比例小于或等于10％时，确认待测样本为非肝癌样本。

上述检测肝癌的方法，通过保藏号为CCTCC NO：C2022109的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，结合免疫组织化学染色的方法，通过单克隆抗体对蛋白质分子抗原的特异性识别，以及化学标记(荧光素、酶、金属离子或同位素等)的第二抗体的显色等作用来检测组织细胞内目标抗原的表达量及其亚细胞定位，能够提高对肝癌的检测灵敏度和特异性，提高肝癌的检出率。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

分泌抗人P4HB单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备

1.动物免疫

用弗氏完全佐剂乳化人P4HB蛋白(购自北京义翘神州科技股份有限公司，货号为10827-H08H)，皮下注射BALB/c小鼠(50μg/只)。四周后对小鼠连续3次加强免疫(25μg/只)，每次间隔两周，皮下注射用弗氏不完全佐剂乳化后的人P4HB蛋白。

2.细胞融合

(1)脾脏细胞的制备

在小鼠最后一次加强免疫3天后，摘小鼠眼球取血。小鼠经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡10分钟，于无菌操作台中取出其脾脏，于注射器内芯挤压脾脏，将脾细胞置于DMEM培养基中，重悬细胞制成脾细胞单细胞悬液。

(2)饲养细胞的制备

取4周龄～6周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟。无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10mL的含20％(v/v)胎牛血清的的DMEM培养基注入小鼠腹腔，吹打数次后，吸取含有巨噬细胞的培养基注入含20％(v/v)胎牛血清的DEME培养基中，充分混匀后以100μL/孔平铺于96孔细胞培养板中备用。

(3)细胞融合

选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0，取2×10⁷个SP2/0细胞与约10⁸个上述步骤(1)得到的脾细胞加入融合管中混匀，1000RPM离心5分钟后弃上清，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。随后在60s内加入1mL预热的PEG，然后分批次加入4mLDMEM培养基，第1mL培养基加入时间总计1min，第2mL培养基加入时间总计30s，第3mL培养基加入时间总计30s，第4mL培养基加入时间总计15s(中途左手一直匀速旋转离心管)。之后用DMEM培养基加至50mL，1000RPM离心5分钟后弃上清，加入2×HAT培养基，充分混匀后，以100μL/孔加入步骤(2)中的96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养，一周后取上清进行检测。

3.抗人P4HB蛋白特异性杂交瘤细胞株的筛选

(1)检测板的准备

用包被稀释液将人P4HB蛋白(北京义翘神州科技股份有限公司)稀释至2μg/mL，包被96孔ELISA酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜后，弃去孔内液体；每孔加入200μL封闭液，37℃封闭1h，洗涤，拍干备用。

(2)阳性克隆的筛选

将待检细胞的培养上清分别取100μL/孔加入上述检测板中，于37℃作用1h后洗涤并拍干，加入100μL/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃作用1h后洗涤并拍干，加入100μL/孔的显色液，于37℃避光显色15min，每孔加入50μL的终止液终止反应，并于OD450处读取数值。

阳性孔确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。选取阳性克隆株进行细胞克隆化筛选，直到单克隆细胞株阳性率为100％，即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。定株结果如图1所示，根据图1可知，杂交瘤细胞株1A9E3为单克隆细胞株。

实施例2

单克隆抗体的制备与纯化

(1)单克隆抗体的制备

取健康BALB/c雌性小鼠，每只小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL，2周后备用。取实施例1中制备得到的阳性克隆杂交瘤细胞株1A9E3，调至10⁶/mL，向上述液体石蜡预处理后的小鼠腹腔注射1mL/只阳性克隆杂交瘤细胞，9天后收集腹水，3000RPM离心10min，弃脂质层和细胞层，收集中间澄清层，制备得到单克隆抗体，分装，于-20℃保存。

(2)单克隆抗体的纯化

取上述步骤(1)中腹水的中间澄清液，加入等体积的巴比妥缓冲液，加入适量二氧化硅粉末，室温放置30min后于4℃，2000g离心20min，得到澄清的腹水。

于上述澄清腹水加入两份0.06M(pH＝5.0)的乙酸缓冲液，调节pH为4.8后，在30min内逐滴缓慢加入辛酸，4℃静置2h后，15000RPM离心30min，弃沉淀，0.45μm过滤后加入1/10体积的PBS，调节pH至7.4。在冰浴下30min内加入0.5g/mL的硫酸铵，静置1h。15000RPM离心30min，弃上清后溶于含137mM NaCl、2.6mM KCl和0.2mM EDTA的PBS溶液(pH＝7.4)中，透析过夜，制备得到纯化的单克隆抗体，于-20℃保存。

实施例3

单克隆抗体的鉴定

(1)单克隆抗体亚类和亚型的鉴定

使用齐一生物科技(上海)有限公司的单克隆抗体亚型鉴定ELISA试剂盒鉴定实施例2中制备得到的单克隆抗体的亚类和亚型。鉴定时同时使用试剂盒内自带的阴性对照品和阳性对照品进行对照实验。单克隆抗体的亚类和亚型分析结果表明(如表1和图2所示)，实施例2中制备得到的单克隆抗体是IgG亚类，IgG1亚型，包含KAPA轻链。

表1

OD值	阴性对照	阳性对照	1A9E3
				IgG1	0.051	4.711	2.784
IgG2a	0.056	4.580	0.146
				IgG2b	0.055	4.885	0.253
IgG3	0.044	4.642	0.116
				IgM	0.048	4.586	0.052
IgA	0.044	4.572	0.043
				Kappa	0.050	4.656	3.496
Lambda	0.044	4.495	0.043

(2)单克隆抗体纯度鉴定

采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定实施例2中纯化的单克隆抗体的纯度。配制10％分离胶和5％浓缩胶，分别上样标准蛋白及抗体，恒压下电泳1小时。检测结果如图3所示，可见，实施例2中纯化的单克隆抗体条带清晰无杂带，两条清晰的条带分别为抗体的重链和轻链，纯度在95％以上。

(3)单克隆抗体亲和力检测

1.检测板的准备：用包被稀释液将人P4HB蛋白(购自北京义翘神州科技股份有限公司)稀释至1ug/mL，包被96孔ELISA酶标板，100μL/孔，2～8℃包被过夜，弃去孔内液体；每孔加入200μL封闭液，37℃封闭1h，洗涤，拍干备用。

2.将纯化后的抗体用PBS溶液稀释至1mg/ml之后，从A到G孔一次梯度稀释为2000倍，4000倍，8000倍，16000倍，32000倍，64000倍，128000倍，256000倍，100μL/孔加入上述检测板中，重复五次，同时加入100ulPBS作为空白对照，于37℃作用1h后洗涤并拍干，加入100μL/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃作用1h后洗涤并拍干，加入100μL/孔的显色液，于37℃避光显色15min，每孔加入50μL的终止液终止反应，观察显色反应，同时测量OD值。检测结果如图4所示，由图4可知，单克隆抗体稀释256000倍后，与空白对照的OD值比值依然大于2.0，可见该单克隆抗体与抗原的亲和力较高。

实施例4

肝细胞癌的检测

1.免疫组织化学检测

(1)脱蜡和水化：将肝细胞癌和癌旁组织石蜡切片于60℃中放置1h后，将石蜡切片先后浸入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各10min。然后按无水酒精、90％(v/v)酒精、85％(v/v)酒精、75％(v/v)酒精的顺序逐级降酒精浓度进行水化，每次5min。随后使用PBS洗涤3次，每次5min。

(2)抗原热修复：将经过步骤(1)脱蜡和水化完成的切片置于0.01mol/LpH6.0的枸橼钠缓冲液中，微波炉加热至沸腾后断电，间隔10min，反复2次后，置于25℃自然冷却。

(3)消除内源性过氧化物酶活性：将步骤(2)中修复完成的切片用0.01mol/LpH7.4的PBS洗涤3次，每次5min。用3％(v/v)H₂O₂于25℃孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。随后用pH6.0的PBS洗涤3次，每次5min。

(4)一抗孵育：滴加适当至5ug/ml的一抗(实施例2中纯化的单克隆抗体)到切片上，4℃孵育16h后，用pH7.4的PBS洗涤3次，每次5min。

(5)二抗孵育：滴加稀释后的二抗(购自北京鼎国昌盛生物有限责任公司，货号为SH-0012)到切片上，于37℃孵育1小时，取出后用pH7.4的PBS洗涤3次，每次5min。

(6)DAB显色：取1mlDAB显色液I以及50μlDAB显色液II各50微升加至1mL的水中，配成DAB工作液(现配现用)，滴加到切片上，于25℃显色，显微镜下控制反应时间为5-10min，若无背景出现则可继续显色。显色完成后立即用蒸馏水充分洗涤以终止反应。

(7)观察显色后自来水冲，苏木目精复染1-2min，自来水冲10min，梯度酒精脱水，二甲本苯透明，中性树胶封片，干燥，分析拍照

2.结果分析

光学显微镜视野下，蓝色为细胞核，棕黄色为阳性着色。阳性着色通过着色强度、着色密度和着色部位三方面进行评估。着色部位应为胞膜或胞浆着色，，着色强度可根据经验对着色的深浅程度进行判别区分，每种评价结果需着色部位的细胞满足相应的着色强度或者着色密度要求。评价结果包括“-”、“+”、“++”、“+++”四种，“-”表示肝细胞癌阴性，“+”、“++”、“+++”表示肝细胞癌阳性，每种评价结果的评价标准如表2所示。其中，阳性细胞是指阳性着色的细胞，着色密度是指阳性细胞占整个视野细胞的比例。

表2

评价结果	着色深度评价说明	着色密度评价说明
			-	没有着色或轻微着色	阳性细胞小于10％
+	轻微着色	阳性细胞占10％～25％
			++	轻度至中等度着色	阳性细胞占26％～49％
+++	中等度至重度着色	阳性细胞占50％以上

3.样本检测

收集5例肝细胞癌患者癌症组织石蜡包埋切片以及对应的癌旁组织石蜡包埋切片和两例肝脏正常组织石蜡包埋切片，对患者的临床信息进行收集，发现5例肝细胞癌患者中包括2例Ⅰ期肝细胞癌患者，2例Ⅱ期肝细胞癌患者，1例Ⅲ期肝细胞癌患者。肿瘤分期由临床医生判断后给出。对5例肝细胞癌患者癌症组织石蜡包埋切片以及对应的癌旁组织石蜡包埋切片的染色结果进行统计，染色结果如图5、6、7和8所示，其中，图5为2例Ⅰ期肝细胞癌患者的癌症组织和癌旁组织的染色结果图，图6为2例Ⅱ期肝细胞癌患者的癌症组织和癌旁组织的染色结果图，图7为1例Ⅲ期肝细胞癌患者的癌症组织和癌旁组织的染色结果图，图8为2例健康人的肝脏组织的染色结果图。染色结果表明，所有患者的癌症组织染色均为阳性，所有癌旁组织染色均为阴性，两例肝脏正常组织均为阴性，可见本实施例的试剂盒具有较高的灵敏性和特异性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞的保藏编号为CCTCCNO：C2022109。

2.一种抗P4HB的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌。

3.如权利要求1所述的杂交瘤细胞或如权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测肝癌的产品中的应用。

4.一种检测肝癌的试剂，其特征在于，所述试剂包括如权利要求2所述的单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括可与单克隆抗体结合的标记抗体。

6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述标记抗体连接有标记物，所述标记物包括三联吡啶钌、吖啶酯、辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、荧光素、生物素或胶体金。

7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述标记抗体为IgG抗体。

8.一种检测肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4～6任一项所述的试剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括通过免疫组织化学法、免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法、放射性免疫分析法、免疫扩散法、流式细胞荧光分选法进行蛋白水平检测的试剂。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测的样本包括组织样本。

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