CN116042534A - 杂交瘤细胞、单克隆抗体、试剂和试剂盒 - Google Patents

杂交瘤细胞、单克隆抗体、试剂和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种杂交瘤细胞、单克隆抗体、试剂和试剂盒。该杂交瘤细胞的保藏编号为：CCTCC NO：C2022108，其可分泌抗P4HB蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体与P4HB蛋白的亲和力高，能够用于食管鳞状细胞癌的诊断，且能够提高食管鳞状细胞癌的早期检出率。

Description

杂交瘤细胞、单克隆抗体、试剂和试剂盒
技术领域
本申请涉及生物医学检测领域，特别是涉及一种杂交瘤细胞、单克隆抗体、试剂和试剂盒。
背景技术
食管是连接口咽和胃部的一条肌性管状结构，发生在食管黏膜上皮的恶性肿瘤就是食管癌，是一种十分常见的消化道恶性肿瘤。在全球范围内，目前食管癌的发病率和死亡率均排在前十位，且近年来食管癌等食管疾病逐渐呈现出上升的趋势，严重威胁着人类的生命健康。
食管癌有两种类型，即食管腺癌和食管鳞状细胞癌。虽然食管癌的主要类型是食管腺癌，但食管鳞状细胞癌的比例也达到了30％，对人类健康的影响不容小觑。与其他恶性肿瘤类似，食管鳞状细胞癌同样也是治疗越早，治疗效果越好。但食管鳞状细胞癌早期的症状并不明显，且至今仍没有能作为食管鳞状细胞癌早期诊断“金标准”的检测手段，导致早期对食管鳞状细胞癌的确诊有困难，易错过最佳治疗时机。
发明内容
基于此，本申请提供一种杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞的保藏编号为：CCTCCNO：C2022108，其可分泌抗P4HB蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体与P4HB蛋白的亲和力高，能够用于食管鳞状细胞癌的诊断，且能够提高食管鳞状细胞癌的早期检出率。
此外，还提供一种单克隆抗体、试剂和试剂盒。
一种可分泌抗P4HB蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞的保藏编号为CCTCC NO：C2022108。
一种单克隆抗体，所述单克隆抗体上述杂交瘤细胞分泌。
上述杂交瘤细胞或上述单克隆抗体在制备诊断食管鳞状细胞癌的产品中的应用。
一种诊断食管鳞状细胞癌的试剂，所述试剂包括上述单克隆抗体。
在其中一个实施例中，所述试剂还包括可与单克隆抗体结合的标记抗体。
在其中一个实施例中，所述标记抗体上连接有标记物，所述标记物包括三联吡啶钌、吖啶酯、辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、荧光素、生物素或胶体金中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述标记抗体为IgG抗体。
一种诊断食管鳞状细胞癌的试剂盒，所述试剂盒包括以上任一实施例所述的试剂。
在其中一个实施例中，所述试剂盒用于执行以下至少一种检测方法：免疫组织化学法、免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法、放射性免疫分析法、免疫扩散法、流式细胞荧光分选法。
在其中一个实施例中，所述试剂盒检测的样本包括组织样本。
附图说明
图1为实施例1中筛选的杂交瘤细胞株的定株结果图；
图2为实施例3中鉴定实施例2中制备得到的单克隆抗体的亚类和亚型的结果示意图；
图3为实施例3中对实施例2中纯化的单克隆抗体的SDS-PAGE凝胶电泳结果示意图；
图4为实施例3中检测实施例2中纯化的单克隆抗体亲和力的实验结果示意图；
图5为实施例4中1例Ⅰ期食管鳞状细胞癌患者及其癌旁组织的染色结果图；
图6为实施例4中6例Ⅱ期食管鳞状细胞癌患者及其癌旁组织的染色结果图；
图7为实施例4中2例Ⅲ期食管鳞状细胞癌患者及其癌旁组织的染色结果图。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
本文所述的“杂交瘤细胞”是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征的细胞。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞。脾淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞，从而可以筛选得到杂交瘤细胞。
所述的“抗体”又称为免疫球蛋白，是一种由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，上述靶抗原包括蛋白质、糖类、多核苷酸、脂质、多肽或小分子化合物。
本申请一实施方式提供了一种可分泌抗P4HB蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞的保藏编号为CCTCC NO：C2022108。
该杂交瘤细胞为小鼠杂交瘤细胞3B1D9，于2022年5月18日保藏于在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)并于2022年5月22日由该保藏中心鉴定为存活，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。该杂交瘤细胞的保藏编号为CCTCC NO：C2022108，分类命名：杂交瘤细胞株3B1D9。
基于上述，本申请一实施方式还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体由上述杂交瘤细胞分泌。
将上述保藏编号为CCTCC NO：C2022108的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体记为3B1D9，该单克隆抗体与P4HB蛋白的亲和力高，识别并结合P4HB蛋白的灵敏度高，且特异性好，用于诊断食管鳞状细胞癌时能够提高早期检出率。
本申请一实施方式还提供了一种上述杂交瘤细胞或上述单克隆抗体在制备诊断食管鳞状细胞癌的产品中的应用。
本申请一实施方式提供了一种诊断食管鳞状细胞癌的试剂，该试剂包括上述单克隆抗体。
在其中一个实施例中，上述单克隆抗体可以不标记标记物。例如将该单克隆抗体作为包被抗体应用于食管鳞状细胞癌的检测试剂中，具体例如：作为ELISA中的包被抗体。
在其中一个实施例中，上述试剂还包括可结合单克隆抗体的标记抗体，该标记抗体作为二抗用于捕获上述特异性结合P4HB的单克隆抗体。
在其中一个实施例中，上述标记抗体连接有标记物，该标记物包括三联吡啶钌、吖啶酯、辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、荧光素、生物素或胶体金中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述标记物为辣根过氧化物酶。
在其中一个实施例中，所述标记抗体为IgG抗体。
此外，本申请一实施方式还提供了一种诊断食管鳞状细胞癌的试剂盒，该试剂盒包括以上任一实施例所述的试剂。
在其中一个实施例中，上述试剂盒用于执行以下至少一种检测方法：免疫组织化学法、免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法、放射性免疫分析法、免疫扩散法、流式细胞荧光分选法。
所述的“免疫组织化学法”应用抗原和抗体结合的原理，检测细胞内多肽或蛋白质等大分子物质的分布。具体来说，直接或间接带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位和定量测定的一种方法。
所述的“免疫印迹法”是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。它将凝胶电泳与固相免疫结合，首先通过蛋白质电泳技术将需要区分的蛋白质转移至固相载体如NC膜等上，再借助酶免疫、放射免疫等技术进行测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子质量。
所述的“酶联免疫吸附测定法”简称酶联免疫法，或者ELISA法。该法使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；再使与抗原或抗体对应的抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
所述的“放射性免疫分析法”利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法。具体原理为，使放射性标记抗原和未标记抗原(待测物)与不足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。
所述的“免疫扩散法”是以琼脂作为抗原抗体的免疫沉淀反应的惰性载体，通过观测沉淀与抗原浓度的关系，即可定量测定抗原(待测样品中蛋白质)的含量。免疫扩散法分为环状免疫单扩散法和双向扩散法两种。其中，环状免疫单扩散法是将一定量的抗体与含缓冲液的琼脂糖凝胶混匀铺成适当厚度的凝胶板，再把抗原滴进凝胶板的小孔中，在合适的浓度和湿度环境中，抗原由小孔向四周扩散(呈辐射状)，经过一定的时间后抗原与在琼脂糖凝胶中的抗体相互作用。双向扩散法又称琼脂扩散法，是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应，通过扩散作用使分处两处的抗原和相应抗体相遇，形成抗原-抗体复合物，比例合适时将出现沉淀现象。
所述的“流式细胞荧光分选法”是对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传或分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析发方法。当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。流式细胞分选，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选，能复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离，单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯化、高通量单克隆分选或细胞芯片制备。分选后的细胞能直接用于培养、移植、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。硬件中样本细胞丢弃的比例低于5％，保证样本中目标细胞的高回收率。
在其中一个实施例中，所述试剂盒检测的样本包括组织样本。
另外，本申请一实施方式还提供了一种食管鳞状细胞癌的诊断方法，该诊断方法包括步骤a1和步骤a2。具体地：
步骤a1：对待测食管组织样本进行免疫组织化学染色，获得待测食管组织样本染色结果；其中，采用保藏编号为CCTCC NO：C2022108的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为一抗。
在一个可选的具体示例中，采用保藏编号为CCTCC NO：C2022108的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为一抗，以及采用标记有辣根过氧化物酶(HRP)的二抗。
在一个可选的具体示例中，采用DAB显色液使待测食管组织样本显色。
步骤a2：根据待测食管组织样本染色结果诊断该样本是否为食管鳞状细胞癌样本。
在一个可选的具体示例中，根据待测食管组织样本染色的深浅程度评估该样本中的食管鳞状细胞癌阳性细胞的比例，以确认待测样本是否为食管鳞状细胞癌样本。具体地，着色细胞比例大于10％时，确认待测样本为食管鳞状细胞癌样本；待测食管组织样本没有着色或轻微着色且着色细胞比例在小于或等于10％时，确认待测样本为非食管鳞状细胞癌样本。
上述食管鳞状细胞癌的诊断方法，通过保藏编号为CCTCC NO：C2022108的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，结合免疫组织化学染色的方法，通过单克隆抗体对P4HB蛋白分子的特异性识别，以及化学标记(荧光素、酶、金属离子或同位素等)的第二抗体的显色等作用来检测组织细胞内目标抗原的表达量及其亚细胞定位，能够提高对食管鳞状细胞癌的检测灵敏度和特异性，提高食管鳞状细胞癌的检出率。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
分泌抗人P4HB单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备
1.动物免疫
用弗氏完全佐剂乳化人P4HB蛋白(购自北京义翘神州科技股份有限公司，货号为10827-H08H)，皮下注射BALB/c小鼠(50μg/只)。四周后对小鼠连续3次加强免疫(25μg/只)，每次间隔两周，皮下注射用弗氏不完全佐剂乳化后的人P4HB蛋白。
2.细胞融合
(1)脾脏细胞的制备
在小鼠最后一次加强免疫3天后，摘小鼠眼球取血。小鼠经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡10分钟，于无菌操作台中取出其脾脏，于注射器内芯挤压脾脏，将脾细胞置于DMEM培养基中，重悬细胞制成脾细胞单细胞悬液。
(2)饲养细胞的制备
取6周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟。无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10mL的含20％(v/v)胎牛血清的的DMEM培养基注入小鼠腹腔，吹打数次后，吸取含有巨噬细胞的培养基注入含20％(v/v)胎牛血清的DEME培养基中，充分混匀后以100μL/孔平铺于96孔细胞培养板中备用。
(3)细胞融合
选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0，取2×107个SP2/0细胞与约108个上述步骤(1)得到的脾细胞加入融合管中混匀，1000RPM离心5分钟后弃上清，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。随后在60s内加入1mL预热的PEG，然后分批次加入4mLDMEM培养基，第1mL培养基加入时间总计1min，第2mL培养基加入时间总计30s，第3mL培养基加入时间总计30s，第4mL培养基加入时间总计15s(中途左手一直匀速旋转离心管)。之后用DMEM培养基加至45mL，1000RPM离心5分钟后弃上清，加入2×HAT培养基，充分混匀后，以100μL/孔加入步骤(2)中的96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，一周后取上清进行检测。
3.抗人P4HB蛋白特异性杂交瘤细胞株的筛选
(1)检测板的准备
用包被稀释液将人P4HB蛋白(北京义翘神州科技股份有限公司)稀释至2μg/mL，包被96孔ELISA酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜后，弃去孔内液体；每孔加入200μL封闭液，37℃封闭1h，洗涤，拍干备用。
(2)阳性克隆的筛选
将待检细胞的培养上清分别取100μL/孔加入上述检测板中，于37℃作用1h后洗涤并拍干，加入100μL/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃作用1h后洗涤并拍干，加入100μL/孔的显色液，于37℃避光显色15min，每孔加入50μL的终止液终止反应，并于OD450处读取数值。
阳性孔确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。选取阳性克隆株继续进行细胞克隆化筛选，直到单克隆细胞株阳性率为100％，即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。如图1所示，杂交瘤细胞株3B1D9所有细胞株均为阳性，证明3B1D9为单克隆细胞株。
实施例2
单克隆抗体的制备与纯化
(1)单克隆抗体的制备
取健康BALB/c雌性小鼠，每只小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL，1周后备用。取实施例1中制备得到的阳性克隆杂交瘤细胞株3B1D9，调至106/mL，向上述液体石蜡预处理后的小鼠腹腔注射1mL/只阳性克隆杂交瘤细胞，9天后收集腹水，3000RPM离心10min，弃脂质层和细胞层，收集中间澄清层，制备得到单克隆抗体，分装，于-20℃保存。
(2)单克隆抗体的纯化
取上述步骤(1)中腹水的中间澄清液，加入等体积的巴比妥缓冲液，加入适量二氧化硅粉末，25℃放置30min后于4℃，2000g离心20min，得到澄清的腹水。
于上述澄清腹水加入两份0.06M(pH＝5.0)的乙酸缓冲液，调节pH为4.8后，在25min内逐滴缓慢加入辛酸，4℃静置2h后，10000RPM离心30min，弃沉淀，0.45μm过滤后加入1/10体积的PBS，调节pH至7.4。在冰浴下30min内加入0.25g/mL的硫酸铵，静置1h。12000RPM离心30min，弃上清后溶于含137mM NaCl、2.6mM KCl和0.2mM EDTA的PBS溶液(pH＝7.4)中，透析过夜，制备得到纯化的单克隆抗体，于-20℃保存。
实施例3
单克隆抗体的鉴定
(1)单克隆抗体亚类和亚型的鉴定
使用齐一生物科技(上海)有限公司的单克隆抗体亚型鉴定ELISA试剂盒鉴定实施例2中制备得到的单克隆抗体的亚类和亚型。鉴定时同时使用试剂盒中自带的阴性对照品和阳性对照品进行对照实验。单克隆抗体的亚类和亚型分析结果表明(如表1和图2所示)，实施例2中制备得到的单克隆抗体是IgG亚类，IgG1亚型，包含KAPA轻链。
表1
OD值 阴性对照 阳性对照 3B1D9
IgG1 0.051 4.711 2.697
IgG2a 0.056 4.580 0.122
IgG2b 0.055 4.885 0.066
IgG3 0.044 4.642 0.045
IgM 0.048 4.586 0.046
IgA 0.044 4.572 0.044
Kappa 0.050 4.656 3.447
Lambda 0.044 4.495 0.044
(2)单克隆抗体纯度鉴定
采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定实施例2中纯化的单克隆抗体的纯度。配制10％分离胶和5％浓缩胶，分别上样蛋白maker及抗体，120V恒压下电泳1小时。检测结果如图3所示可见，实施例2中纯化的单克隆抗体轻链与重链两条条带清晰且无其他杂带，证明纯度在95％以上。
(3)单克隆抗体亲和力检测
1.检测板的准备：用包被稀释液将人P4HB蛋白(购自北京义翘神州科技股份有限公司)稀释至1ug/mL，包被96孔ELISA酶标板，100μL/孔，2～8℃包被过夜，弃去孔内液体；每孔加入200μL封闭液，37℃封闭1h，洗涤，拍干备用。
2.将纯化后的抗体用PBS溶液稀释至1mg/ml之后，从A到G孔一次梯度稀释为2000倍，4000倍，8000倍，16000倍，32000倍，64000倍，128000倍，256000倍，100μL/孔加入上述检测板中，重复五次，同时加入100ulPBS作为空白对照，于37℃作用1h后洗涤并拍干，加入100μL/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃作用1h后洗涤并拍干，加入100μL/孔的显色液，于37℃避光显色15min，每孔加入50μL的终止液终止反应，观察显色反应,同时测量OD值。检测结果如图4所示，由图可知，单克隆抗体稀释256000倍后，与空白对照的OD值比值依然大于2.0，可见该单克隆抗体与抗原的亲和力较高。
实施例4
食管鳞状细胞癌的检测
1.免疫组织化学检测方法
(1)脱蜡和水化：将肝细胞癌和癌旁组织石蜡切片于60℃中放置1h后，将石蜡切片先后浸入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各10min。然后按无水酒精、90％(v/v)酒精、85％(v/v)酒精、75％(v/v)酒精的顺序逐级降酒精浓度进行水化，每次5min。随后使用PBS洗涤3次，每次5min。
(2)抗原热修复：将经过步骤(1)脱蜡和水化完成的切片置于0.01mol/LpH6.0的枸橼钠缓冲液中，微波炉加热至沸腾后断电，间隔10min，反复2次后，置于25℃自然冷却。
(3)消除内源性过氧化物酶活性：将步骤(2)中修复完成的切片用0.01mol/LpH6.0的PBS洗涤3次，每次5min。用3％(v/v)H2O2于25℃孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。随后用pH6.0的PBS洗涤3次，每次5min。
(4)一抗孵育：滴加稀释成5ug/ml的一抗(实施例2中纯化的单克隆抗体)到切片上，4℃孵育16h后，用pH7.4的PBS洗涤3次，每次5min。
(5)二抗孵育：滴加稀释后的二抗(购自北京鼎国昌盛生物有限责任公司，货号为SH-0012)到切片上，于37℃孵育1小时，取出后用pH7.4的PBS洗涤3次，每次5min。
(6)DAB显色：取1mlDAB显色液I与50ulDAB显色液II混匀，配成DAB工作液(现配现用)，滴加到切片上，于25℃显色，显微镜下显色5-10min。显色完成后立即用蒸馏水充分洗涤以终止反应。
2.结果解释
光学显微镜视野下，蓝色为细胞核，棕黄色为阳性着色。阳性着色通过着色深度、着色密度和着色部位三方面进行评估。着色部位应为胞膜或胞浆着色，着色强度可根据经验对着色的深浅程度进行判别区分，每种评价结果需着色部位的细胞满足相应的着色强度或者着色密度要求，评价标准具体如表2所示。
表2
评价结果 着色深度评价说明 着色密度评价说明
- 没有着色或轻微着色 阳性细胞小于10％
+ 轻微着色 阳性细胞占10％～25％
++ 轻度至中等度着色 阳性细胞占26％～49％
+++ 中等度至重度着色 阳性细胞占50％以上
其中，“-”表示评价结果为食管鳞状细胞癌阴性，“+”“++”“+++”均表示评价结果为食管鳞状细胞癌阳性。阳性细胞是指棕黄色着色的细胞，着色密度是指阳性细胞占整个视野细胞的比例。
3.样本检测
通过公司临床运营中心部门收集9例食管鳞状细胞癌患者组织石蜡包埋切片以及对应的癌旁组织石蜡包埋切片，通过对患者的临床信息进行收集，发现9例食管鳞状细胞癌患者中包括1例Ⅰ期食管鳞状细胞癌患者，6例Ⅱ期食管鳞状细胞癌患者，2例Ⅲ期食管鳞状细胞癌患者。肿瘤分期由临床医生判断后给出。对各样本的P4HB染色结果进行统计学分析，染色结果图5、6、7所示，相关评价结果如表3所示，其中，图5为1例Ⅰ期食管鳞状细胞癌患者及其癌旁组织的染色结果图，图6为6例Ⅱ期食管鳞状细胞癌患者及其癌旁组织的染色结果图，图7为2例Ⅲ期食管鳞状细胞癌患者及其癌旁组织的染色结果图。统计学分析利用SPSS软件的T检测进行，分析结果发现P4HB的表达情况在食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中有显著性差异，P值＜0.01。
表3
评价结果 - + ++ +++
癌旁组织 8 1 0 0
食管鳞状细胞癌组织 0 2 4 3
以上实验结果说明，本实施例的P4HB单克隆抗体能够有效区分食管鳞状细胞癌组织样本和癌旁组织样本，进而用于食管鳞状细胞癌的辅助诊断。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种可分泌抗P4HB蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞的保藏编号为CCTCC NO：C2022108。
2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞或权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断食管鳞状细胞癌的产品中的应用。
4.一种诊断食管鳞状细胞癌的试剂，其特征在于，所述试剂包括如权利要求2所述的单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括可与单克隆抗体结合的标记抗体。
6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述标记抗体连接有标记物，所述标记物包括三联吡啶钌、吖啶酯、辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、荧光素、生物素或胶体金中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述标记抗体为IgG抗体。
8.一种诊断食管鳞状细胞癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求4～6任一项所述的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于执行以下至少一种检测方法：免疫组织化学法、免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法、放射性免疫分析法、免疫扩散法、流式细胞荧光分选法。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测的样本包括组织样本。
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