MXPA01010985A - Metodo y composicion para prevenir o reducir la infeccion por vih por uso de inhibidores para leucina aminopeptidasa. - Google Patents

Abstract

A pesar de haber logrado una estructura genetica amplia y profunda del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y la de sus diversas estructuras y clusters (racimos) geograficos, se ha logrado un exito muy limitado en la prevencion y el tratamiento del SIDA. Descrito aqui hay un metodo para prevenir o reducir la capacidad de infeccion del VIH usando un anticuerpo especifico para la aminopeptidasa de leucina estimulada por estrogenos (es-LAPasa), o uno o mas inhibidores de la actividad de la LAPasa, o una combinacion de los mismos. Tambien se describe un metodo para prevenir o reducir la capacidad de infeccion del VIH usando un anticuerpos especifico para es-LAPasa, uno o mas inhibidores de la actividad de la es LAPasa y un compuesto anti-estrogenos. Tambien se definen los compuestos nuevos.

Description

MÉTODO Y COMPOSICIÓN PARA PREVENIR O REDUCIR LA INFECCIÓN POR VIH POR USO DE INHIBIDORES PARA LEUCINA AMINOPEPTIDASA El presente invento se relaciona con un método para inhibir la infección por VIH 10 usando un anticuerpo contra la leucina aminopeptidasa estimulada por estrógenos (es- LAPase) o uno o más inhibidores de la actividad de la es-LAPase, o una combinación de los mismos. El invento adicionalmente se relaciona con un método para inhibir la infección por VIH usando un anticuerpo contra es-LAPase, uno o más inhibidores de la actividad de la es-LAPase y un compuesto anti-estrógeno. Las composiciones novedosas que inhiben la 15 infección por VIH también son parte del presente invento.

ANTECEDENTES DEL INVENTO 20 A pesar de haber logrado una estructura genética amplia y profunda del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y la de sus diversas estructuras y clusters (racimos) geográficos, se ha logrado un éxito muy limitado en la prevención y el tratamiento del SIDA. Aunque el VIH y sus variantes están bien caracterizados como los principales -.v^^a» (SIDA), se ha logrado una identificación menos amplia de los factores celulares clave involucrados en los mecanismos moleculares tempranos que conducen al ingreso viral.

Las células T -CD4 son el principal objetivo de la infección por VIH como lo han demostrado los estudios in vitro e in vivo. La glicoproteína CDA en la superficie de las células T presenta una gran afinidad por los viriones del VIH. Otras moléculas, sobre todo las de la familia de los receptores de quimocina, también participan para promover el ingreso viral dentro de las células blanco.

Las modalidades terapéuticas para frustrar el progreso de la enfermedad en los pacientes infectados por el VIH se basan principalmente en dos tipos de medicamentos: Inhibidores de la transcriptasa reversa e inhibidores de la proteasa. Aunque son exitosos para hacer más lenta la replicación del virus, estos están limitados por la alta tasa de mutagenesis en el virus, lo cual resulta en la modificación del sitio de unión de los fármacos y su consiguiente perdida de eficacia. Una propuesta para resolver el problema ha sido administrar simultáneamente varios fármacos para disminuir la probabilidad de desarrollo de cepas resistentes del virus. Sin embargo, este régimen multi-fármacos crea graves efectos secundarios. Por lo consiguiente el apego al tratamiento puede ser bajo.

Además, las terapias actuales para las infecciones por VIH no son especificas para grupos particulares de individuos tales como las mujeres. En un reporte reciente se descubrió que el número de mujeres infectadas con VIH durante 1991 y 1995 aumentó en un 63%, más que cualquier otro grupo de personas que habían contraído SIDA, sin importar la raza o el modo de exposición al virus del VIH [Centro para el control y prevención de enfermedades. (1.996). HIV/AIDS Surveill. Rep. Centers for Disease Control and Prevention; 8. Atlanta, Ga.]. La elevada incidencia de la epidemia de SIDA sobre la morbilidad y mortalidad entre mujeres (edades de 25 a 44) ha sido confirmada recientemente por otros grupos -[Wortley, P.M., y Fleming, P.L. (1997). AIDS in Women in the United States: Recent Trends. JAMA, 278: 911-916.]. En gran parte se desconocen las razones de la elevada incidencia de SIDA en mujeres. No sólo las mujeres son más propensas a la infección que los hombres (supra) sino que los estudios han demostrado que los fármacos anti- VIH trabajan de manera diferente en mujeres y hombres. Por ejemplo, se ha demostrado que las toxicidades, los efectos secundarios y los niveles sanguíneos son específicos de cada género. Las diferencias hormonales entre hombres y mujeres se mencionan para explicar las -diferencias pero no se ha establecido un enlace claro. En vista de la información anterior, hay necesidad de diseñar modalidades terapéuticas para explotar las diferencias en el proceso de infección entre hombres y mujeres para mejorar la eficiencia de los tratamientos.

Independientemente del papel del CD4, el supuesto receptor del VIH, y de los co-receptores ß-quimocina (CKR-5, CCR5 y CXCR-4), hemos descrito el papel importante de la Leucina aminopeptidasa unida a la membrana y extracelular en el ingreso viral del VIH. (Pulido-Cejudo, G. Y col. (1997) Antiviral Research 36, 167-177).

El presente invento supera la limitación de los trabajos anteriores proporcionando un enlace entre la actividad de la LAPasa y el estrógeno. Este enlace ha sido explotado aquí para descubrir nuevos inhibidores del virus del VIH los cuales pueden usarse solos o en combinación con una eficacia mejorada.

RESUMEN DEL INVENTO El presente invento se relaciona con un método para inhibir la infección por VIH usando un anticuerpo para la es-LAPasa o un inhibidor de la es-LAPasa, o una combinación de los mismos. El invento adicionalmente se relaciona con un método para inhibir la infección usando un anticuerpo contra la es-LAPasa, un inhibidor de la actividad de la es-LAPasa y un compuesto anti-estrógeno. Las composiciones novedosas las cuales inhiben a la infección por VIH también son parte del presente invento.

De esta manera de acuerdo con el presente invento se proporciona un método para reducir la capacidad de infección del VIH hacia los linfocitos T comprendiendo un contacto de los linfocitos T mencionados con una cantidad suficiente de un inhibidor de la LAPasa.

En una representación posterior del presente invento se proporciona un método para reducir la capacidad de infección del VIH hacia los linfocitos T comprendiendo el contacto de los linfocitos T antes mencionados con una cantidad suficiente de anticuerpo especifico contra la LAPasa, más específicamente un anticuerpo monoclonal especifico para la es-LAPasa.

Este invento también proporciona un método para reducir la capacidad infecciosa del VIH hacia los linfocitos T comprendiendo el contacto de los linfocitos T mencionados con una cantidad suficiente de un anticuerpo especifico para la es-LAPasa y un inhibidor de la LAPasa.

Este invento también proporciona un método para reducir la capacidad infecciosa del VIH hacia los linfocitos T comprendiendo el contacto de los linfocitos T mencionados con una cantidad suficiente de anticuerpos específicos para la es-LAPasa, un inhibidor de LAPasa y un compuesto anti-estrógeno.

Posteriormente de acuerdo con el presente invento se proporciona un método para prevenir o reducir la infección por VIH comprendiendo la administración a un paciente que necesite, de una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto que comprenda un anticuerpo especifico para es-LAPasa y un portador farmacéuticamente aceptable.

En este invento también se proporciona un método para prevenir o reducir la infección por HIV comprendiendo la administración a un paciente que tenga la necesidad, de una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto que comprenda un inhibidor de la LAPasa y un portador farmacéuticamente aceptable.

Este invento también está dirigido a un método para prevenir o reducir la infección por VIH comprendiendo la administración a un paciente que necesite, una cantidad farmacéuticamente efectiva que comprenda un anticuerpo especifico a es-LAPasa y un inhibidor de LAPasa junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

Este invento también está dirigido a un método para prevenir o reducir la infección por VIH comprendiendo la administración a un paciente que necesite, una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto que comprenda un anticuerpo especifico a es-LAPasa, un inhibidor de LAPasa y un compuesto anti-estrógeno junto con un portador farmacéuticamente aceptable. -- También de acuerdo con el presente invento se proporciona un compuesto que contenga un anticuerpo especifico contra la es-LAPasa y un inhibidor de LAPasa.

También de acuerdo con el presente invento se proporciona un compuesto que comprenda a un anticuerpo especifico a la es-LAPasa, un inhibidor de la LAPasa y un compuesto anti-estrógeno.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIAGRAMAS Estas y otras características del invento se volverán más aparentes a partir de la siguiente descripción en la cual se hace referencia a los diagramas anexos en donde: FIGURA 1 muestra el efecto del estrógeno sobre la actividad de la LAPasa en sobrenadantes de células de líneas celulares maternales primarias de cáncer mamario. FIGURA 2 es una SDS PAGE de la LAPasa sin purificar (carril 1) y purificada (carril 2) seguida por un western blot con Mab 7B6.

FIGURA 3 muestra la cinética de la inhibición de la LAPasa mediante Bestatin, Tioredoxina y glutatión.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA REPRESENTACIÓN PREFERIDA El presente invento se relaciona con un método para inhibir la infección por VIH usando un anticuerpo para la es-LAPasa o un inhibidor de la actividad de la es-LAPasa, o una combinación de los mismos. El invento adicionalmente se relaciona con un método para inhibir la infección por VIH usando un anticuerpo contra la es-LAPasa, un inhibidor de la actividad de la es-LAPasa y un compuesto anti-estrógeno. Los compuestos novedosos que inhiben a la infección por VIH también son parte del presente invento.

Se ha observado que, independientemente del papel del CD4, el supuesto receptor del VIH y del papel de los co-receptores ß-quimocina (CKR-5/CCR5; CXCR-4), la leucina aminopeptidasa ya sea unida a la membrana o extracelular (LAPasa; EC 3.4.1 1.1) puede promover el ingreso de VIH a los linfocitos T (Pulido-Cejudo et al. Antiviral Res. 36:167-177, 1997).

En el presente invento se revela que la actividad de la LAPasa en los linfocitos T y en las células maternas de cáncer mamario pueden estimularse mediante estrógenos, o análogos de estrógenos. Un aspecto de este invento se dirige a la identificación y la purificación de una isoenzima de la LAPasa estimulada por estrógenos, referida aquí como la es-LAPasa. Los detalles de la isoenzima de la LAPasa estimulada por estrógenos se describen en la solicitud pendiente de los aspirantes titulada "Un anticuerpo monoclonal contra la leucina aminopeptidasa estimulada por estrógenos", la cual se incorpora aquí mediante referencia.

Un aspecto adicional del presente invento es la preparación de anticuerpos contra la isoenzima de la es-LAPasa. Los anticuerpos pueden producirse por métodos bien conocidos en la profesión.

En general, las células productoras de anticuerpos se preparan inmunizando al animal, por ejemplo, ratón, rata, conejo, oveja, caballo, o bovinos, con un antígeno. El esquema de inmunización y la concentración del antígeno en la suspensión es tal como para proporcionar cantidades útiles de células productoras de anticuerpos cebadas adecuadamente. Estas células productoras de anticuerpos pueden provenir ya sea de las células de nodulos linfáticos y/o de linfocitos de la sangre periférica.

Las células productoras de anticuerpos entonces se fusionan con células de mieloma, se pueden usar líneas celulares que se originan a partir de diferentes animales tales como ratones, ratas, conejos, y células humanas, usando un promotor adecuado de la fusión. Muchas líneas celulares de mieloma de ratón se conocen y están disponibles generalmente con miembros de la comunidad académica y diversos depósitos, tales como el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. La línea celular de mieloma usada preferentemente debe ser sensible al medio para que las células de mieloma que no se fusionen no sobrevivan en medios selectivos. Mientras que los híbridos si puedan sobrevivir. La línea celular usada más comúnmente es la línea celular resistente a la 8-azaguanina, la cual carece de la enzima hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasa y por lo tanto no será mantenida por el medio HAT (hipoxantina-aminopterina- timidina). En general, la línea celular también es preferentemente del tipo "no-secretora", en que esta no produce ningún anticuerpo. El promotor de la fusión preferido es el polietilenglicol que tiene un peso molecular entre 1000 y 4000. También se pueden usar otros promotores de la fusión tales como el alcohol polivinilico, un virus o un campo eléctrico.

Las células inmortalizadas (hibridoma) entonces pueden examinarse por tamizaje para elegir a aquellas que secreten anticuerpos de la especificidad correcta. El tamizaje inicial generalmente se lleva a cabo usando un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA). Específicamente, los sobrenadantes de los cultivos de hibridomas se agregan a pozos de microtitulación los cuales se han recubierto previamente con el antígeno, en este caso se usa la es-LAPasa. Un anticuerpo especifico ligado de los sobrenadantes de los cultivos puede detectarse usando un segundo anticuerpo marcado, por ejemplo, IgG de cabra anti-ratón marcado con peroxidasa, el cual está disponible comercialmente. Los cultivos que son positivos contra la es-LAPasa entonces se someten a clonación mediante el método de diluciones limitantes. Los cultivos secundarios de hibridoma se re-tamizan como se describe anteriormente, y los cultivos positivos posteriores entonces se examinan usando el sistema Bl Acore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia). Entonces los cultivos se evalúan para determinar si el anticuerpo se une o no al antígeno y para determinar el perfil cinético de la unión al antígeno. Los cultivos elegidos basados en estos resultados se someten a una clonación posterior hasta que se obtenga la estabilidad y clonalidad del cultivo. Inmediatamente después de la hibridización, los productos de fusión tendrán aproximadamente 80 cromosomas, y como estas células continúan dividiéndose, perderán aleatoriamente algunos de estos cromosomas. El proceso de clonación es para seleccionar aquellas células que todavía tienen los cromosomas que codifican para la producción de anticuerpos. El proceso de clonación se repite hasta que el 100%o de la sub-población muestre la producción de un anticuerpo especifico, lo cual es indicativo de la "estabilidad" del hibridoma. Además, los pozos con cultivos de hibridoma con frecuencia tienen múltiples colonias algunas de las cuales puede que no produzcan anticuerpos. El proceso de clonación permite la selección de un híbrido positivo el cual proviene de una sola célula.

En una representación del presente invento se proporciona un anticuerpo monoclonal, especifico contra la es-LAPasa, el cual se ha denominado como Mab7B6. Este anticuerpo monoclonal no inhibe la actividad enzimática de la LAPasa,- Por esta razón se hará referencia a él de aquí en adelante como un anticuerpo monoclonal no-inhibidor. Una línea celular de hibridoma que produce este anticuerpo monoclonal se ha depositado con la Autoridad Internacional de Depósitos de Canadá, Winnipeg, Manitoba el 22 de marzo de 2000, de acuerdo con el Tratado de Budapest.

El presente invento también abarca al Mab 7B6 y a cualquiera de los fragmentos del mismo que contengan la región de unión activa del anticuerpo tal como-los fragmentos Fab, F(ab)2 y FV. Estos fragmentos pueden obtenerse a partir del anticuerpo 7B6 usando técnicas bien conocidas para aquellas personas adiestradas en la profesión (Rousseaux et al.

Methods Enzymology, 121: 663-69, Academic Press, 1986).

Una representación posterior del presente invento abarca anticuerpos o fragmentos de los mismos capaces de unirse a la misma determinante antigénica que el anticuerpo 7B6. Incluyendo, pero no limitándose a, anticuerpos que poseen la misma especificidad antigénica como el anticuerpo 7B6 pero provenientes de una especie diferente o que tengan un isotipo diferente o que muestren diferentes afinidades de unión. Se cree que la clase y las variantes de los isotipos del anticuerpo del presente invento pueden prepararse usando técnicas de cambio de clase recombinante y de fusión que son bien conocidas para aquellas personas especializadas en la profesión (vea por ejemplo: Tamaña et al. Eur. J. Immunol, 13:614, 1983; Oi et al., Biotechnologies, 4(3):214-221, Liu y col. Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 84: 3439-43, 1987; Neuberger et al., Nature 312:604-608, 1984 y Spira et al. J. Immunol. Meth., 74:30-7-15, 1984).

El anticuerpo monoclonal del presente invento puede producirse ya sea usando un bioreactor o a partir de líquido de ascitis, ambos procedimientos son bien conocidos por los especialistas de la profesión.

En una representación del presente invento se proporciona un método para reducir la infección por VIH en donde Mab 7B6 se incuba con linfocitos T antes de y durante la infección con VIH-1. Esta incubación previene o reduce la capacidad infecciosa del VIH-1 hacia los linfocitos T. Aunque no se describe en los ejemplos (infra), esta representación también abarca la incubación de linfocitos T con Mab 7B6 después de que se han infectado con VIH-1 para reducir una infección posterior como sería obvio para una persona entrenada en el campo.

El anticuerpo monoclonal puede agregarse directamente al medio de incubación o puede acoplarse a una matriz sólida. La matriz sólida puede ser cualquier matriz, como lo podrá saber alguien experimentado en el área, sobre la cual el anticuerpo pueda acoplarse mientras este acoplamiento no interfiera con la unión del anticuerpo a su epitope sobre la es-LAPasa. La matriz sólida, puede ser, pero no se limita a, una matriz de proteína G. Sin desear la unión a ninguna teoría, el acoplamiento del anticuerpo a la matriz puede reducir el nivel de la unión no especifica del anticuerpo a su epitope.

La infección por VIH de los linfocitos T puede medirse usando una serie de técnicas. Las tres usadas más comúnmente son la cuantificación de la producción de la proteína p24 de la cápside viral, la ciopaticidad, y la determinación de la carga proviral mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Conway et al., Clin. Diag. Virol. 3:95-104, 1995). Estos métodos son bien conocidos en el área. Otros métodos conocidos por las personas especializadas en el área también pueden usarse para determinar los niveles de capacidad de infección del VIH.

De acuerdo con un aspecto del presente invento se usan los anticuerpos anti- es-LAPasa para reducir la infección por VIH. De acuerdo con esta representación, las células del presente invento pueden tratarse a una concentración de aproximadamente 50 ng a 200 ng de anticuerpo por 10 ml de células, en donde las células están a una densidad de aproximadamente 1.0 x 105 células/ml. La cantidad preferida de anticuerpo puede determinarse empíricamente, por una persona con entrenamiento ordinario en el área. En un ejemplo de esta representación, la concentración usada de anticuerpo es aproximadamente de 100 ng por 10 ml de células.

El presente invento también revela que los compuestos que contienen tioles inhiben inesperadamente la actividad de la es-LAPasa. Por compuestos que contienen tioles se refiere a cualquier compuesto que tenga un grupo SH tal como, pero no limitándose a, los péptidos que tienen residuos de cisteína reducidos. En una representación de este aspecto del invento, se descubrió que la tioredoxina y el glutatión inhiben a la es-LAPasa.

De esta manera, en una representación posterior del presente invento se proporciona un método en donde un inhibidor de la es-LAPasa se incuba con los linfocitos T antes de y durante la infección con VIH. De acuerdo con este aspecto del invento, el inhibidor de la actividad de la es-LAPasa puede ser un inhibidor competitivo, incompetitivo o no-competitivo. El significado de estos términos se tomó en el contexto de la teoría cinética de las enzimas, como la conocen las personas experimentadas el área. En este aspecto del invento, un ejemplo de un competidor incompetitivo es la tioredox-ina y un ejemplo de un inhibidor no competitivo es el glutatión.

El inhibidor de la LAPasa puede agregarse directamente al medio de incubación o puede acoplarse a una matriz sólida. La matriz sólida puede ser cualquier matriz, como lo sabe cualquier persona experimentada en el área, sobre la cual el inhibidor puede acoplarse mientras que este acoplamiento no interfiera con la unión del inhibidor a la es-LAPasa. La matriz sólida puede ser, pero no se limita a, DPDP, una matriz de enlaces amida (Pierce, Rockford, IL, USA).

En este aspecto del presente invento, los inhibidores de la actividad de la es-LAPasa se usan para reducir la infección por VIH. De acuerdo con esta representación del presente invento, las células pueden tratarse con el inhibidor a una concentración de aproximadamente 10"8M a aproximadamente 10"5 M, en donde las células están a una densidad de aproximadamente 1.0 X 105 células/ml. La cantidad preferida de inhibidor puede determinarse-empíricamente, por una persona entrenada en el área. En un ejemplo de esta representación la concentración de inhibidor usada es aproximadamente de 4 ng a aproximadamente 8 ng por mL de células.

En otro aspecto del presente invento se proporciona un ejemplo en donde un anticuerpo contra la es-LAPasa y un inhibidor de la LAPasa pueden combinarse e incubarse con los linfocitos T antes, durante o después de la infección con VIH para reducir la capacidad de infección del VIH. En este aspecto del presente invento, el anticuerpo y el inhibidor se usan juntos de acuerdo con los métodos ya revelados para su uso individual.

En una publicación anterior (Mesange et al. Mol. Pharmacol., 50:75-79, 1996) se ha demostrado que Tamoxifen™, un compuesto anti-estrógenos puede reducir la capacidad de infección del VIH. Sin embargo, la inhibición incompleta de la infección por VIH se observó con concentraciones de Tamoxifen™ de 10"6M o más altas. En un aspecto posterior del presente invento se proporciona un método en donde no sólo el Tamoxifen pero otros anti-estrógenos se pueden usar juntos con un anticuerpo contra la es-LAPasa y un inhibidor de es-LAPasa para reducir la capacidad de infección del VIH.

En este ejemplo del presente invento el compuesto anti-estrógenos se elige a partir de lo siguiente: se usa sólo o en combinación: 4-hidroxiandrostendiona, Raloxifeno, 3ß, 5a-tetrahidro Noretisterona, Tamoxifen, Droloxifeno e Idoxifeno. En este aspecto del presente invento el compuesto anti-estrógenos se usa a una concentración final que va desde 10" M a aproximadamente 10" M. Las concentraciones de los otros componentes en este método se usan como se describe anteriormente.

En un aspecto adicional de este invento, un inhibidor competitivo de la actividad de la es-LAPasa también puede usarse junto con los compuestos anteriormente descritos. Un ejemplo de un inhibidor competitivo adecuado es Bestatin, pero el invento también abarca a otros inhibidores competitivos tales como la Amastatina.

El presente invento también abarca un método para tratar a los pacientes infectados con VIH, o con riesgo de ser infectados, con un anticuerpo contra es-LAPasa o uno o más inhibidores de la actividad de la es-LAPasa o una combinación de los mismos. El presente invento también abarca un método para tratar a pacientes infectados con VIH, o en riesgo de ser infectados, con un anticuerpo contra la es-LAPasa, uno o más inhibidores de la actividad de la es-LAPasa y un anti-estrógeno. En este aspecto del invento se proporciona un compuesto farmacéutico que comprenda a un anticuerpo contra la es-LAPasa. En un aspecto adicional de esta representación, el compuesto farmacéutico comprende a uno o más inhibidores de la actividad de la es-LAPasa. En un aspecto todavía adicional de esta representación, el compuesto farmacéutico comprende un anticuerpo contra es-LAPasa y uno o más inhibidores de la actividad de la es-LAPasa. Todavía en un aspecto posterior, el compuesto farmacéutico comprende un anticuerpo contra la es-LAPasa y uno o más inhibidores de la actividad de la es-LAPasa y un compuesto anti-estrógenos.

Los compuestos farmacéuticos del presente invento incluirán generalmente una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos uno de los compuestos mencionados anteriormente junto con un portador farmacéutico efectivo. El anticuerpo del presente invento puede administrarse por cualquier medio que permita que el agente activo alcance el sitio de acción del agente en el cuerpo de un mamífero. En el caso de los anticuerpos de este invento, el enfoque primario es la capacidad de alcanzar y unirse con la es-LAPasa unida a la membrana o extra celular. Debido a que las proteínas están sujetas a ser digeridas cuando se administran oralmente, la administración parenteral, es decir, intravenosa, subcutánea, intramuscular, ordinariamente se usaría para optimizar la absorción.

Los anticuerpos de este invento pueden administrarse ya sea como agentes terapéuticos individuales o en combinación con otros agentes terapéuticos, como se discutió anteriormente. Estos pueden administrarse solos, pero generalmente se administran con un portador farmacéutico elegido en base a la vía de administración elegida y a la práctica farmacéutica estándar.

La dosis administrada, por supuesto, variará dependiendo de los factores conocidos tales como las características farmacodinámicas del agente en particular, y su modo y vía de administración; edad, salud, y peso del receptor; la naturaleza y el grado de los síntomas, tipo de tratamiento concurrente, frecuencia del tratamiento, y el efecto deseado. Normalmente una dosis diaria de ingrediente activo puede ser aproximadamente de 0.1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Ordinariamente 0.5 a 50, y preferentemente de 1 a 10 miligramos por kilogramo al día administrados en dosis divididas de 1 a 6 veces al día o en forma de liberación sostenida son efectivas para obtener los resultados deseados.

Las formas farmacéuticas (compuesto) adecuadas para la administración interna generalmente contiene a partir de 1 miligramo a aproximadamente 500 miligramos de ingrediente aetivo por unidad. En estos compuestos farmacéuticos el ingrediente activo ordinariamente estará presente en una cantidad de aproximadamente 0.5 a 95% en peso basado en el peso total del compuesto.

Para la administración parenteral, el anticuerpo puede formularse como solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de tales vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y albúmina sérica humana al 5%. Los liposomas y los vehículos no acuosos tales como aceites fijos también pueden usarse. El vehículo o polvo liofilizado puede contener aditivos para mantener la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y estabilidad química (por ejemplo, amortiguadores del pH y conservadores). La formulación se esteriliza mediante técnicas usadas comúnmente.

En representaciones posteriores del presente invento, el anticuerpo puede administrarse junto con uno o mas inhibidores de la LAPasa, como se discutió a detalle anteriormente. En esta representación, los inhibidores de LAPasa pueden agregarse a una dosis de aproximadamente 0.1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal.

En una representación posterior del presente invento, el anticuerpo puede administrarse junto con uno o más compuestos anti-estrógenos, como se discutió en detalle anteriormente. En esta representación, el compuesto anti-estrógeno puede agregarse a una dosis de aproximadamente 0.1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal.

En otra representación del presente invento, el anticuerpo puede administrarse junto con uno o más inhibidores de la LAPasa y uno o más compuestos anti-estrógenos como se discutió en detalle anteriormente. En esta representación, los inhibidores de la LAPasa y los compuestos anti-estrógenos pueden agregarse en dosis de aproximadamente 0.1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal.

El anticuerpo y los inhibidores a incluirse en el compuesto farmacéutico pueden acoplarse a una matriz como se describe anteriormente, mientras la matriz no sea tóxica para los mamíferos. El acoplamiento del anticuerpo y los inhibidores a una matriz adecuada también puede facilitar la incorporación de estos compuestos a los liposomas.

En una representación posterior, el inhibidor de la LAPasa en el compuesto farmacéutico es el inhibidor incompetitivo tioredoxina, la cual puede mantenerse en su estado reducido incluyendo compuestos reductores en el compuesto. Tales compuestos pueden incluir y se limitan a glutatión y cisteína.

Para que el invento descrito aquí pueda entenderse más, se establecen los siguientes ejemplos. Se debe entender que estos ejemplos son con propósitos ilustrativos solamente y no se construyeron para limitar el alcance de este invento de ninguna manera.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Liberación del LAPasa de células HUT78 mediada por estrógenos Las células CD4+ T-HUT78 se incubaron en presencia de diversas concentraciones de 17-ß-Estradiol y los niveles de LAPasa se determinaron como lo describe G. Pulido-Cejudo et al. (Antiviral Research, 36:167-177, 1997).

La Tabla 1 muestra que el estrógeno promovió la liberación de LAPasa en las células HUT78 De una manera dosis-respuesta, con una estimulación máxima observada a 10" M.

Tabla 1 Actividad de LAPasa extracelular de las células HUT78 incubadas con 17-ß-Estradiol [ß-Estradiol] Control Actividad de LAPasa (U* x 10"5/ml) Estimulación con 17-ß- Estradiol 10"5M 4.2 10.8 10"6M 5.6 20.4 10"7M 4.8 148.6 10"8M 5.7 110.7 *Una unidad de LAPasa se define como la cantidad de enzima requerida para hidrolizar 1 µmol de L-leucina-ß-naftilamida a L-leucina y ß-nafiilamida por minuto a pH 7.5 y 37°C.

Después de la estimulación con estrógenos, la liberación máxima de LAPasa de células maternas de carcinoma mamario se observó a una concentración de estrógeno (17ß-Estradiol) de 100 nM después de 24 horas de incubación (vea Fig. 1 en donde la actividad de la LAPasa se determinó en sobrenadantes de líneas celulares maternas primarias inmunoprecipitadas con anticuerpos Mab 7B6 anti-LAPasa-Sepharose. Las células se incubaron en presencia de 17-ß-Estradiol y después de 24 horas de incubación, los sobrenadantes se extrajeron del cultivo primario inmunoprecipitadando y ensayando fluorometricamente la actividad de la LAPasa por el método de Kuramochi et al. [1987, J. Antibio , 40: 1605:1611]. Las células control se cultivaron en ausencia de 17-ß-Estradiol.). Durante el mismo periodo, la LAPasa en los sobrenadantes de células de las células control permaneció sin cambios. Además, la actividad de la LAPasa se determinó en sobrenadantes de líneas celulares maternas primarias inmunoprecipitadas con anticuerpos MAb 7B6 anti-LAP-Proteína G ligados. Estos resultados muestran que la actividad de la LAPasa extracelular de las células estimuladas por estrógenos (100 nM) fue de 7.7 x 10"5 U/ml en comparación con 6.4 x 10" U/ml detectada en el sobrenadante de células maternas incubadas por 24 horas con medio de cultivo celular solo como control.

Además, no hubo efectos de la incubación con estrógenos sobre la actividad de la LAPasa en preparaciones purificadas de esta enzima sola. Colectivamente, estos resultados sugieren que el efecto del estrógeno sobre la actividad de la LAPasa abarca un proceso mediado celularmente.

Ejemplo 2: Purificación de la LAP-asa Las células maternas primarias de carcinoma mamario obtenidas a partir de las biopsias de tumores humanos se estimularon con 17-ß-Estradiol a 100 nM durante 24 horas o con medio de cultivo para células solo como control. El medio de cultivo para células fue el medio RPMI 1640 + FCS al 10% + penicilina lOOU/ml + Estreptomicina 100 µg/ml. Los sobrenadantes de células se recolectaron y después se dializaron contra PBS en mangueras de celulosa sin suturas (MW 12,400) durante 12 horas a 4°C. La es-LAPasa se purificó subsiguientemente a partir de los sobrenadantes de las células dializadas usando HPLC-por permeación en gel seguida de DEAE-Celulosa y cromatografía de afinidad de Bestatina-Sepharose. Brevemente, el sobrenadante de células se aplicó a-una columna Bio-Sil SEC-250 (600x 7.5 mm) previamente equilibrada en un amortiguador que contiene buffer de fosfato de sodio 100 mM a pH 6.8, Na2S04 100 mM, ZnCl2 1 µM, y glicerol al 10%. La columna se lavó con 300 ml del mismo buffer a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. La pro teína se concentró a 10 ml mediante ultrafiltración usando membranas YM5 (5000 M.W. cutoff, Amicon Div., Danvers, MA., USA). El concentrado se aplicó a una columna de celulosa DEAE (2.6 cm X 28.5 cm) equilibrada y lavada con buffer Tris-HCl 50 mM a pH 7.5; ZnCb 1 µM; y glicerol al 10% (v/v). La es-LAP s'é eluyó usando un gradiente lineal (NaCL 0 a 1M en buffer Tris) a una velocidad de flujo de 0.50 ml/min. Se preparó una columna de afinidad a Bestatina usando una matriz de enlace Ultralink EDC/DADPA Amida (Pierce, Rockford, IL, U.S.A.) haciendo reaccionar 100 mg de Bestatina pura con la matriz de carbodiimida EDC/DADPA siguiendo el procedimiento proporcionado por el fabricante. Antes de cargar el eluyente que contenía a la LAPasa, la columna de afinidad de Bestatina se equilibro con Tris-HPLC 10 mM a pH 8.0 que contenía ZnCl2 lµM y se lavó con 300 ml de este buffer de unión. La es-LAPasa se re-circuló a través del sistema usando una bomba peristáltica a una velocidad de flujo de 0.10 ml/min, por 2 horas. Después de Tabla 2 Resumen de la purificación de LAP a partir de células maternas de carcinoma mamario humano "La cantidad de proteína se determinó después de la hidrólisis alcalina y la detección cuantitativa con ninhidrina del material hidrolizado como lo describe Pulido-Cejudo y col. [J. Chromatogr. B 660 (1994) 37-47)]. 2"determinado fluorometricamente usando leucina-ß.naftilamida como un sustrato como lo describe [Kuramochi, H. Et al., (1987) J. Antibiot, 40, 1605-1611].

Ejemplo 3: Producción y purificación de anticuerpos monoclonales En la producción de la línea celular de hibridoma 7B6 secretora del anticuerpo monoclonal de ratón para la LAPasa estimulada por 17-ß-Estradiol, los protocolos para la esta recirculación, la columna se lavó con ocho volúmenes de la columna de buffer de unión.

La es-LAPasa unida a la Bestatina se eluyó con un gradiente lineal (NaCl 0 a 0.5 M) preparado en buffer de unión de Tris-HCl 10 mM a pH 8.0 que contiene ZnC 1 µM. La elusión de ía es-LAPasa unida se monitoreó mediante la absorbancia a 280 nm. Las fracciones de es-LAPasa purificada se distribuyeron en alícuotas de 500 µl y se almacenaron hasta su uso posterior en Tris-HCl 50 mM a pH 7.8 y ZnCl2 50 µM. La concentración de proteína de es-LAPasa se estimó mediante el método de Lowry y col. [J. Biol. Chem 193:265 (1951)] usando albúmina sérica bovina como estándar. Un resumen del proceso de purificación de la LAPasa estimulada por 17-ß-Estradiol a partir de células maternas de carcinomas mamarios humanos se establece en la Tabla 2. La es-LAPasa se purificó aproximadamente 7000 veces después del último paso de la cromatografía de afinidad a Bestatina.

Las actividades de la es-LAPasa se determinaron fluorometricamente usando leucina-b-naftilamida como el sustrato [Kuramochi, H. Et al. (1987) J. Antibiot, 40, 1605-1611]. La reacción se detuvo calentando a ebullición las muestras a 100°C durante 10 minutos, seguido de centrifugación a 780 x g a 4°C durante 10 minutos. Los valores obtenidos representan el promedio de la actividad de la LAPasa determinado por triplicado. preparación de antígenos para inmunización, preparación de células de bazo a partir de animales inmunes, la fusión de células de bazo con células de mieloma y el cultivo en placas de células en medios de cultivo selectivos se condujo siguiendo los lineamientos detallados descritos por Campbell [Burdon RH, Knippenberg PHV (eds): Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Ámsterdam, Elsevier, p219 (1984)] y por Lietzke y Unsicker [Leitzke R. Unsicker K: A Statistical Approach to determine Monoclonality After Limiting Cell Plating of a Hybridoma Clone, J Immunol Methods 76: 223 (1985)].

Brevemente, se realizó la inmunización con es-LAPasa purificada después del procedimiento de salting out. Se realizaron estímulos con es-LAPasa purificada en los días 14, 35 y 56. Se exploraron mediante pruebas de tamizaje los ratones BALB/c en los días 24 y 45. Los ratones se sacrificaron en el día 59 y las células del bazo del ratón con mejor respuesta se fusionaron con células de mieloma. Se realizó el tamizaje mediante una inmunotinción de la mancha puntual sobre nitrocelulosa.

El clon de hibridoma 7B6 se obtuvo mediante la clonación de una sola célula usando diluciones limitantes. Se prepararon cuatro tubos de dilución en serie que contenían células de hibridoma con suplemento para medio con FBS al 20% + 2X OPI. 100 µl de cada dilución se cultivaron en pozos de una placa con 96-pozos con 50 µl de células de alimento para las células de bazo en cada pozo y se colocaron dentro de un incubador a 37°C con 5% de CO2. En el día 7, el sobrenadante de cada pozo se retiró y se sometió a las pruebas de tamizaje mediante inmunotinción de manchas puntuales sobre nitrocelulosa.

Las células 7B6 clonadas del hibridoma se transfirieron de la placa de 96 pozos a 0.5 ml de medio complementado con FBS al 20% + IX OPI + 1XHAT en una placa de 24 pozos. Una vez que las células estaban densas, se transfirieron a 5 ml en un recipiente de 60 mm y después se transfirieron a 10 ml en un recipiente de 100 mm. Una vez en el recipiente de 60 mm, a las células se les excluyó la hipoxantina, timidina y aminopterina. Las células 7B6 de hibridoma se continuaron cultivando hasta la fase log del crecimiento. El anticuerpo Mab 7B6 anti- es-LAPasa se aisló a partir del sobrenadante de células de hibridoma 7B6 recolectado mediante cromatografía de afinidad usando IgG inmunopura como lo describe el fabricante. El tamizaje se realizó mediante una inmunotinción de manchas puntuales sobre nitrocelulosa.

Se determinó el isotipo del Mab 7B6 usando el Kit de inmunotipificación de Sigma.

Brevemente, el ensayo involucra la unión de Mab 7B6 a una tira de membrana de nitrocelulosa pre-cubierta para la isotipificación seguida de inmunodetección usando un sistema de detección sensible a las enzimas biotina-avidina. El isotipo de la inmunoglobulina se revela mediante una auto-descripción.

El análisis por ELISA de las líneas celulares maternas de carcinoma mamario humano se codujo para demostrar la reactividad de Mab 7B6 contra la es-LAPasa humana.

Brevemente, 50 x 103 células maternas se cultivaron en placas por pozos en una placa de 96 pozos en medio RPMI 1640 + FCS al 10% + Penicilina 100 U/ml + Estreptomicina 100 µg/ml. Las células cultivadas en la placa se incubaron a 37°C con 5% de CO2 durante 24 horas. Los sobrenadantes de las células se extrajeron, las células se lavaron con PBS y subsiguientemente se fijaron con glutaraldehído al 1% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. El lavado con PBS ocurrió antes del bloqueo con caseína durante 1 hora a 37°C con 5% de C02. Después de otro lavado con PBS, las series de diluciones de Mab 7B6 se agregaron a los pozos y se permitió la incubación durante 2 horas a 37°C y 5% de CO2. La demostración de la reactividad de Mab 7B6 se reveló al agregar un anticuerpo secundario, anti-(IgG + IgM) IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa + IgM (H + L) seguido por un sustrato, OPD.

Después de la purificación de Mab 7B6, el isotipo IgGla correspondiente se inmovilizó subsiguientemente en un sistema de enlace cruzado DSS obtenido de Pierce (Roxkford, IL, U.S.A.) de acuerdo con los procedimientos descritos por el fabricante.

Como se demuestra en la Figura 2, Mab 7B6 reacciona específicamente con la es-LAPasa en sobrenadantes celulares sin purificar así como con la es-LAPasa purificada después de una SDS PAGE seguida de inmunoelectrotransferencia. La masa molecular de la LAPasa estimulada por 17-ß-Estradiol fue de 315 kDa estimado mediante permeación en gel en una columna Bio-Sil SEC-250 (600 x 7.5 mm) usando tiroglobulina (MW 670kDa); Gama globulina bovina (MW 158 kDa); ovoalbúmina de pollo (MW 44 kDa) y mioglobina de caballo (17 kDa).

Ejemplo 4: Efecto del estrógeno sobre la capacidad elevada de infección de las células HUT78.

El efecto citopático inducido por el VIH y mediado por los estrógenos se determinó como lo describe G. Pulido-Cejudo et al. [Pulido-Cejudo, G., Conway, B., Proulx, P., Brown, R., e Izaguirre, C.A. (1997). Antiviral Research, 36: 167- 177]. La sensibilidad de las células CD4+ T-HUT78 a la infección viral por VIH se determinó midiendo la actividad de la transcriptasa reversa en células infectadas en la presencia / ausencia de 17-ß-Estradiol.

A la luz de las observaciones clínicas que indicaban la hipersensibilidad de las mujeres a la infección por VIH [Centres for Disease Control and Prevention. (1996). HIV/AIDS Surveill. Rep. 8. Atlanta, Ga., Wortley, P.M., and Flemming, P.L. (1997). JAMA, 278: 911-916.] así como el papel de la es-LAPasa en el ingreso viral [Pulido-Cejudo, G., Conway, B., Proulx, P., Brown, R., and Izaguirre, C.A. (1997). Antiviral Research, 36: 167-177], junto con el efecto directo del estrógeno sobre la LAPasa reportado anteriormente, se determinó la sensibilidad de las células HUT78 a la infección viral por VIH. Como se muestra en la Tabla 3, a los 3 días y a los 5 días después de la infección, en presencia de estrógenos, la capacidad de infección viral del VIH determinada mediante la actividad de la transcriptasa reversa (TR) fue aproximadamente 4 veces más alta que en las células control infectadas en ausencia de estrógenos.

Tabla -3 Efecto del estrógeno en la capacidad elevada de infección Ejemplo 5. Inhibidores de la es-LAPasa La ?ioredoxina humana se purificó a partir de células CD4+ T MP6 como lo describen Rosen y col. [Rosen, A. Et al. (1995) Int. Immunol. 7, 625-633] y la compararon con la actividad de la tioredoxina purificada a partir de E.coli comprada a SIGMA-ALDRICH Canadá (Oakville, Ontario Canadá).

La tioredoxina se enlazó covalentemente a través de un enlace amida a la matriz de unión Ultralink EDC/DADPA (Pierce, Rockfrod, IL U.S.A.) haciendo reaccionar 5 mg de Tioredoxina purificada con la matriz carbodiimida EDC/DADPA siguiendo el procedimiento proporcionado por el fabricante.

Las mediciones de la LAPasa se realizaron espectrofotométricamente a 330 nm para medir la formación de producto de ß-naftilamida usando 1-leucina-ß-naftilamida 182 µM como el sustrato. Los ensayos cinéticos se realizaron usando un espectrofotómetro Spectronic Génesis 5 de Milton Roy (Rochester, NY). La absorbancia se registraba cada sesenta segundos, durante un periodo de 30 min. Los ensayos cinéticos enzimáticos se realizaron usando 8.0 x 10"2 U de es-LAPasa en un volumen final de reacción de 600 µl y muestras por triplicado. La mezcla de reacción contenía los siguientes materiales añadidos en orden y todos mantenidos en hielo antes de usarse: es-LAPasa, solución de Hank libre de calcio haciendo un volumen final de reacción de 600 µl y 1-leucina-ß-naftilamida 182 µM. Se uso un blanco correspondiente sin es-LAPasa como valor basal. Ambas celdas se transfirieron al espectrofotómetro en donde la 1-leucina-ß-naftilamida se agregó al último, marcando el tiempo cero de la reacción. Los estudios de inhibición se realizaron en la presencia de Bestatina 167 µM, glutatión reducido 167 µM y tioredoxina reducida 17 µM.

La Figura 3 muestra el efecto inhibitorio de la Bestatina y de dos péptidos que contienen tioles, tioredoxina reducida y glutatión reducido, respectivamente. La es-LAPasa mostró velocidades de reacción significativamente más lentas en presencia de tioredoxina y glutatión en comparación a la observada en la es-LAPasa control. Además, las velocidades de reacción de la es-LAPasa fueron más lentas en presencia de tioredoxina 17 µM cuando se comparó con las observadas en las muestras incubadas con glutatión reducido 167 µM. Además, la Bestatina 167 µM claramente inhibe la actividad de la es-LAPasa.

Como se muestra en la Tabla 4, la tioredoxina reducida es un inhibidor efectivo de la actividad de la es-LAPasa. El análisis de las máximas velocidades de reacción (Vmax), las constantes de Michaelis-Menten (Km) y las constantes de inhibición (Ki) para cada inhibidor como se presentan en la Tabla 4 revela diferencias significativas en las propiedades inhibitorias de cada péptido. Al respecto, la es-LAPasa incubada con Bestatina muestra un valor de Vmax muy similar al observado con la es-LAPasa sola y un valor Km significativamente mayor. Estos datos confirman la naturaleza competitiva de la inhibición de la es-LAPasa. Por el contrario, la es-LAPasa incubada con tioredoxina reducida conduce a una Vmax significativamente más baja y una Km con un valor Ki intermedio cuando se comparó con aquellas obtenidas para Bestatina *y glutatión. Colectivamente estos datos sugieren que la tioredoxina reducida inhibe a la es-LAPasa en una modalidad incompetitiva mientras que la inhibición de la es-LAPasa por glutatión reducido es no competitiva.

Tabla 4 Constantes de Inhibición de es-LAPasa por bestatina, tioredoxina reducida y glutatión Vmax Km Ki (10"6 M/min) (10"4 M) (10"6M) LAPasa sola 36.8 1 1.9 1.67 ± 0.14 N/A Bestatina 167 µM 34.0 ± 3.9 48.7 ± 8.4 6.22 ± 1.61 Tioredoxina 17 µM 5.31 ±0.02 0.234 ± 0.006 3.40 ± 0.58 Glutatión 167 µM 17.2 ± 1.5 1.78 ± 0.25 1.53 ± 0.40 Ejemplo 6: Inhibición del VIH Doce horas antes de la infección con HTLVmb, células HUT78 se incubaron en medios de cultivo virales solas o en la presencia de Anti- es-LAPasa; tioredoxina; Bestatina y Anti-estrógenos de acuerdo con las combinaciones descritas abajo. En la presencia continua de cada uno de los factores antes mencionados, las células se infectaron subsiguientemente a una multiplicidad de dos partículas virales infecciosas por célula durante dos horas a 25°C con agitación constante en un volumen final de 1.0 ml. Las células se lavaron subsiguientemente con solución salina de fosfatos amortiguadora del pH (PBS) y se sembraron a una densidad de 1.0 x 105 células/ml en RPMI 1640, adicionado con FBS al 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/ml en placas de 96 pozos. La formación de sincitio se evaluó mediante microscopía de luz en los días 3, 5 y 7. En puntos de tiempo adecuados, las células en los pozos elegidos se sometieron a la inactivación con psoralen/luz ultravioleta (Watson y col. 1990) se secaron con aire y se fijaron en placas de vidrio con acetona fría. Se realizó la tinción inmunofluorescente indirecta usando una modificación de los procedimientos estándares (Aldovini, A. And Walker, B.D. (1990) Techniques in HIV Research. Stockton Press, New York; Jonson, G.D. and Nogueira Arauji, G.M. (1981) J. Immunol. Methods, 43, 349-350. Las placas se incubaron por 10 minutos en buffer de bloqueo (PBS, suero de cabra al 5%) y se hizo reaccionar ya sea con el suero control de ratón o los anticuerpos monoclonales anti-HIV-1 gag (p24, p55) (Olympus Immunochemicals), los cuales se diluyeron 1: 100 en buffer de bloqueo, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces con PBS y se incubaron durante 30 minutos con anticuerpos FITC de cabra anti-ratón (Beckton and Dickinson). Se montaron las preparaciones en parafenileno-diamina/glicerol [Jonson, G.D. y Nogueira Araujo, G.M. (1981) J. Immunol. Methods, 43, 349-350] y se contaron las células fluorescentes.

Después de la infección de las células HUT-78 por VIH-1, se determinó la carga proviral en cada condición experimental mediante PCR [Conway, B., Shui-Wah Ko, D. Y Cameron, W. (1995) Clin. Diag. Virol. 3, 95-104].

Antes de la infección, las células HUT78 se lavaron tres veces con PBS y se determinó la viabilidad de las células, La infección se realizó como se describe arriba. En intervalos de tiempo indicados, se tomaron alícuotas de 1.0 ml y se cuantificó el antígeno p24 usando el kit comercial ELISA (p24 Antigen capture ELISA, ABBOTT Diagnostics División), siguiendo las instrucciones del fabricante.

El efecto de Mab 7B6, tioredoxina, Bestatina y anti-estrógenos en la viabilidad de las células HUT78 se evaluó de la manera siguiente. Las células HUT78 se sembraron a una densidad de 1.0 x 105 células/ml en RPMI 1640, FBS al 10%, penicilina 100 u/ml, estreptomicina 100 mg/ml en presencia o ausencia de cada uno de los componentes antes mencionados. El medio se cambió cada tercer día y se determinó la viabilidad de las células mediante exclusión con el colorante azul de trifano (trypan blue). La incorporación de timidina también se midió [Noma, T., Klein, B., Cupissol, D., Yata, J. Y Serrou, B. (1984). Int. J. Immunopharmac, 6, 87-92.] en cultivos duplicados en el día 7. Los valores obtenidos representan el promedio ± desviación estándar (n=10).

La incubación de las células HUT 78 con matrices de Mab 7B6-Proteína G, 7 horas antes de la infección con VIH-1 reduce significativamente el número de copias provirales de VIH-1 cuando se comparan con las células control pre-incubadas con matrices de IgGl-Proteína G (vea la Tabla 5).

Tabla 5 Inhibición de las copias provirales de VIH-1 mediante Mab 7B6 anti- es-LAPasa unida a proteína G Días después de la infección Mab 7B6 86±5 189±2 220±24 (lOO ng/lO ml) IgGla control 2014±89 4002±46 5551±92 (lOO ng/lO ml) La incubación de las células HUT 78 con matrices de tioredoxina-EDC/DADPA 7 horas antes de la infección con VIH-1 reduce significativamente el numero de copias provirales de VIH-1 cuando se comparan con las células control pre-incubadas con matrices de IgGl de mioglobina control-Proteína G (vea la tabla 6).

Tabla 6 Inhibición de las copias provirales de VIH-1 mediante la matriz de tioredoxina-EDC/DADPA comparada con la inhibición del VIH por Bestatina Días después de la infección 0 Tioredoxina 0 4±1 12±3 122±8 (40 ng/5 ml) Bestatina 0 7±2 29±3 457±12 (120 µg/ml) Control/Mioglobina 0 2414+178 4122+121 5851±123 (40 ng/ 5 ml) La inhibición independiente mediada por la tioredoxina y los anticuerpos monoclonales anti-LAPasa 7B6 puede sinergizarse mediante su adición simultánea a las células HUT-78 antes de la infección por VIH-1 (Tabla 7). En este contexto, sin desear atarse a ninguna teoría, el efecto sinergista de la tioredoxina y de los anticuerpos monoclonales 7B6 no inhibitorios de LAPasa implican que la actividad LAPasa y las interacciones virales-proteicas pueden requerirse durante la actividad infecciosa del VIH-1. De igual manera sugiere que la elevación de los niveles plasmáticos de tioredoxina detectados en las etapas tardías de la infección por VIH como lo reportaron Nakamura y col. (1996, Int. Immunol. 8, 603-611) puede que no sólo compense el agotamiento del glutatión intracelular sino que también puede estar implicada directamente en la reducción de la carga viral de VIH.

Tabla 7 Inhibición sinergista de las copias provirales de VIH-1 mediante tioredoxina- EDC/DADPA y matrices combinadas Anti-LAPasa 7B6 10 0 Mab 7B6/Tioredoxina 12±3 69±5 88+12 (100 ng/40 ng/10 ml) IgGla control/Mioglobina 1914±55 4330±26 5110112 (100 ng/40 ml) Como se muestra en el Ejemplo 4, la exposición al 17-ß-estradiol disminuyó la 15 actividad de la LAPasa, lo cual a su vez resultó en un aumento en la capacidad de infección del VIH. De esta manera, el aumento selectivo en la capacidad infecciosa del VIH entre 1991-1995 sin importar la raza o el modo de exposición al virus del VIH pudo explicarse en términos del efecto del estrógeno sobre la LAPasa. _¿¿g^^^^^^^ Estas observaciones, junto con el efecto inhibitorio incompetitivo de la tioredoxina sobre la LAPasa hacer surgir la posibilidad del uso de una terapia combinada para la prevención y el tratamiento del SIDA.

El efecto anti- VIH combinado de la inhibición de la LAPasa mediante Mab 7B6, tioredoxina y Bestatina junto con la administración de anti-estrógenos para obstaculizar el efecto del estrógeno sobre la actividad de la LAPasa y por lo tanto de la infección por VIH puede conducir a una terapia prometedora contra el SIDA. Por lo tanto, el Tamoxifen, Droloxifeno, Raloxifeno, Idoxifeno, 4-hidroxiandrostendiona y el derivado 3ß, 5a-tetrahidro de la noretisterona, los cuales todos son compuestos anti-estrógenos, se probaron para examinar su capacidad de sinergizar las propiedades antivirales de la tioredoxina, Bestatin y del Mab 7B6.

Basado en el efecto de los anti-estrógenos sobre las propiedades anti-virales de las matrices combinadas de Mab 7B6/tioredoxina, la combinación más efectiva para la inhibición completa in vitro de la infección por VIH-1 se evaluó de acuerdo con el efecto global sobre la reducción de la citopaticidad, los niveles de p24 y la carga pro viral. Para simplificar estas determinaciones de los experimentos sobre diversos parámetros aquí mencionados, éstas se determinaron en el día 5 después de la infección. Antes de la infección, las células se incubaron simultáneamente con matrices de tioredoxina-EDC/DADPA y Anti-es-LAPasa 7B6. El efecto inhibitorio de estos anti-estrógenos se resume en la Tabla 8. Todos los compuestos anti-estrógenos se usaron a una concentración final de 10"7M.

Tabla 8 Efecto antiviral combinado de las matrices de Mab 7B6 y tioredoxina en combinación con anti-estrógenos Día 5 después de la infección Todas las referencias citadas y las patentes o las solicitudes de patente se incorporan aquí mediante una referencia.

Este presente invento ha sido definido en términos de ciertos ejemplos, los cuales no deben considerarse como limitantes. El alcance total del presente invento se define en las siguientes declaraciones.

Claims (1)

1. LAS REPRESENTACIONES DEL INVENTO EN LAS CUALES SE RECLAMA UNA PROPIEDAD DEL PRIVILEGIO, SE DEFINEN DE LA SIGUIENTE MANERA: 1. Un método para reducir la capacidad de infección del VIH hacia los linfocitos T que comprende el contacto de los linfocitos T mencionados con una cantidad suficiente de un inhibidor incompetitivo de la leucina ammopeptidasa (LAPasa). 2. El método de acuerdo a la declaración 1 en donde el inhibidor incompetitivo es un compuesto que contiene un tiol. 3. El método de acuerdo con la declaración 2 en donde el compuesto que contiene un tiol, es la tioredoxina. 4. Un método para reducir la capacidad de infección del VIH hacia los linfocitos T comprendiendo el contacto de los linfocitos T mencionados con una cantidad suficiente de un anticuerpo especifico para la es-LAPasa. 5. El método de acuerdo con la declaración 4 en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. «t. l¿.t . 6. El método de acuerdo con la declaración 5 en donde el anticuerpo monoclonal es producido por una línea celular de hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósitos de Canadá # IDAC-230300-1, 23 de marzo de 2000). 7. Un método de acuerdo con la declaración 4, en donde el método adicionalmente comprende el contacto de los linfocitos T mencionados con por lo menos un inhibidor de la LAPasa. 8. El método de acuerdo con la declaración 7 en donde el inhibidor se elige a partir del grupo que consiste en Bestatin y un compuesto que contiene un tiol. 9. El método de acuerdo con la declaración 8 en donde el compuesto que contiene un tiol se elige a partir del grupo que comprende a la tioredoxina y al glutatión. 10. El método de acuerdo con la declaración 9 en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 11. El método de acuerdo con la declaración 10 en donde el anticuerpo monoclonal es producido por una línea celular de hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósitos de Canadá # IDAC-230300-1, 23 de marzo de 2000). 12. Un método de acuerdo a la declaración 7, en donde el método adicionalmente comprende el contacto de los linfocitos T mencionados con por lo menos un compuesto anti-estrógenos. 13. El método de acuerdo con la declaración 12 en donde un anti-estrógeno se elige a partir de un grupo compuesto por 4-hidroxiandrostendiona, Raloxifeno, 3ß. 5a- tetrahidro Noretisterona, Tamoxifen, Droloxifeno, Idoxifeno. 14. Un método para prevenir o reducir la infección por VIH que comprenda la administración a un paciente que lo necesite, una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto que contenga a un anticuerpo especifico a la es-LAPasa y un portador aceptable farmacéuticamente . 15. El método de acuerdo con la declaración 14 en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 16. El método de acuerdo con la declaración 15 en donde el anticuerpo monoclonal es producido por una línea celular de hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de depósitos de Canadá # IDAC-230300-1, 23 de marzo de 2000). 17. Un método para prevenir o reducir la infección por VIH que comprenda la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad efectiva farmacéuticamente de un compuesto el cual comprenda un inhibidor incompetitivo de la LAPasa y un portador aceptable farmacéuticamente. 18. El método de acuerdo con la declaración 17 en donde el inhibidor incompetitivo es un compuesto que contiene un tiol. 19. El método de acuerdo con la declaración 18 en donde el compuesto que contiene un tiol es la tioredoxina. 20. El método de acuerdo con la declaración 14 en donde el compuesto adicionalmente comprende a un inhibidor incompetitivo de la LAPasa. 21. El método de acuerdo con la declaración 20 en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 22. El método de acuerdo con la declaración 21 en donde el anticuerpo monoclonal es producido por una línea celular de hibridomas 7B6 (Autoridad Internacional de depósitos Canadá # IDAC-230300-1, 23 de marzo de 2000. 23. El método de acuerdo con la declaración 22 en donde el inhibidor incompetitivo es un compuesto que contiene un tiol. 24. El método de acuerdo con la declaración 23 en donde el compuesto que contiene un tiol es la tioredoxina. 25. El método de acuerdo con la declaración 20 en donde el compuesto adicionalmente comprende un compuesto anti-estrógenos. 26. El método de acuerdo con la declaración 25 en donde el anti-estrógeno se elige a partir del grupo que consiste en 4-hidroxiandrostendiona, Raloxifeno, 3ß,5cc- tetrahidro Norestisterona, Tamoxifeno, Droloxifeno, Idoxifeno. 27. Un compuesto que contenga a un anticuerpo especifico para la es-LAPasa y un inhibidor de la LAPasa. 28. La comparación de acuerdo con la declaración 27 en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. . i 29. El compuesto de acuerdo con la declaración 28 en donde el anticuerpo monoclonal es producido por una línea celular de hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósitos de Canadá # IDAC-230300-1, 23 de marzo de 2000). 30. El compuesto de acuerdo con la declaración 27 en donde el inhibidor se elige a partir del grupo compuesto por Bestatin y un compuesto que contenga un tiol. 31. El compuesto de acuerdo con la declaración 30 en donde el compuesto que contiene un tiol se elige a partir del grupo que consiste de tioredoxina y glutatión. 32. El compuesto de acuerdo con la declaración 27 en donde el compuesto adicionalmente contiene un compuesto anti-estrógeno. 33. El compuesto de acuerdo con la declaración 32 en donde el anti-estrógeno se elige a partir del grupo compuesto de 4-hidroxiandrostendiona, Raloxifeno, 3ß, 5a- tetrahidro Noretisterona, Tamoxifeno, Droloxifeno, Idoxifeno. 34. Un método para reducir la capacidad de infección del VIH hacia los linfocitos T comprendiendo el contacto de los linfocitos T mencionados con una cantidad suficiente de; un inhibidor incompetitivo de LAPasa, un anticuerpo monoclonal especifico para la es-LAPasa y un anti-estrógeno. Un método para reducir la capacidad de infección del VIH hacia los linfocitos T comprendiendo el contacto de los linfocitos T mencionados con una cantidad suficiente de; un inhibidor incompetitivo de la LAPasa, un inhibidor competitivo de la LAPasa, un anticuerpo monoclonal especifico para la es-LAPasa y un anti-estrógeno. Un uso de un compuesto comprendiendo una cantidad suficiente de un inhibidor incompetitivo de LAPasa, un anticuerpo monoclonal específico para la es-LAPasa y un anti-estrógeno para elaborar un medicamento para tratar a paciente infectado con VIH o en riesgo de ser infectado con VIH. Un uso de un compuesto comprendiendo una cantidad suficiente de un inhibidor incompetitivo de LAPasa, un inhibidor competitivo de LAPasa y un anti-estrógeno para elaborar un medicamento para tratar a paciente infectado con VIH o en riesgo de ser infectado con VIH. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T el cual comprende el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente de tioredoxina Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000). Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de Bestatina. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de tioredoxina. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de glutatión. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de Bestatina y una cantidad suficiente de 4-hidroxiandrostendiona. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de Bestatina y una cantidad suficiente de Raloxifeno. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de Bestatina y una cantidad suficiente de 3ß, 5a-tetrahidro Norestisterona. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de Bestatina y una cantidad suficiente de Tamoxifeno. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de Bestatina y una cantidad suficiente de Droloxifeno. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de Bestatina y una cantidad suficiente de Idoxifeno. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo- monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de tioredoxina y una cantidad suficiente de 4-hidroxiandrostendiona. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de tioredoxina y una cantidad suficiente de Raloxifeno. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de tiordoxina y una cantidad suficiente de 3B, 5 -tetrahidro Norestisterona. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de tioredoxina y una cantidad suficiente de Tamoxifeno. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de tioredoxina y una cantidad suficiente de Droloxifeno. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de thioredoxina y una cantidad suficiente de Idoxifeno. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de glutatión y una cantidad suficiente de 4-hidroxiandrostendiona. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de glutatión y una cantidad suficiente de Raloxifeno. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de glutatión y una cantidad suficiente de 3B, 5a-tetrahidro Norestisterona. 58. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo- monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de glutatión y una cantidad suficiente de Tamoxifeno. 10 59. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # 15 IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de glutatión y una cantidad suficiente de Droloxifeno. 60. Un método para reducir la infección producida por el virus de VIH de los linfocitos T que incluye el contacto de los mencionados linfocitos T con una cantidad 20 suficiente del anticuerpo monoclonal específico para es-LAPasa producido por la línea celular del hibridoma 7B6 (Autoridad Internacional de Depósito de Canadá # *%ü»¡aa^teww. «.«_. ^, IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000) y una cantidad suficiente de glutatión y una cantidad suficiente de Idoxifeno. ^gfe^^