KR20060005353A

KR20060005353A - 67ｋＤａ 라미닌ㆍ리셉터를 이용한 약물의 스크리닝 방법및 그것에 의해 얻어지는 약물

Info

Publication number: KR20060005353A
Application number: KR1020057018735A
Authority: KR
Inventors: 히로후미 다치바나
Original assignee: 가부시키가이샤 상가쿠렌케이키코큐슈
Priority date: 2003-04-01
Filing date: 2004-04-01
Publication date: 2006-01-17
Also published as: CN1798975A; US20070021321A1; EP1617218B1; EP1617218A4; US20100222424A1; AU2004227240A1; CA2523186A1; JP2010248201A; US7736856B2; JP4572339B2; JPWO2004090541A1; DE602004031517D1; WO2004090541A1; ATE499613T1; EP1617218A1

Abstract

67kDa 라미닌ㆍ리셉터를 이용한 약물의 신규한 스크리닝 방법 및 그것에 의해 얻어지는 약물을 제공한다. 피험화합물과 67kDa 라미닌ㆍ리셉터와의 결합의 정도를 정성적 또는 정량적으로 측정하고, 그 측정 결과로부터 피험화합물이 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 결합하는 경우에는 그 피험화합물이 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용을 갖는 약물이라고 판단하는 공정을 포함하는, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용을 갖는 약물의 스크리닝 방법 및 그것에 의해 얻어지는 약물.

Description

67ｋＤａ 라미닌ㆍ리셉터를 이용한 약물의 스크리닝 방법 및 그것에 의해 얻어지는 약물{METHOD OF SCREENING DRUG WITH THE USE OF 67kDa LAMININ RECEPTOR AND DRUG OBTAINED THEREBY}

본 발명은 67kDa 라미닌ㆍ리셉터를 이용한 약물의 스크리닝 방법 및 그것에 의해 얻어지는 약물에 관한 것이다.

67kDa 라미닌ㆍ리셉터(이하,「67LR」라고 칭하는 경우도 있다.)는, 295개의 아미노산을 코드하는 mRNA로부터 번역된 37kDa 전구체 단백질이, 세포내에서 지방산 등에 의한 아실화 중합반응을 받아서 호모 이량체 또는 헤테로 이량체화에 의해 67kDa로 된 단백질이며, 그것이 인테그린류와 함께 세포막 표면으로 이행해서 처음으로 라미닌ㆍ리셉터로서 기능한다(Biochemistry, 1995, 34:11276~11287, T.H. Landowski 등, J. Cell. Biochem, 1998, 69:244~251, S. Buto 등). 또한, 37kDa 전구체 단백질은, 리보솜 관련 단백질 p40으로서 단백합성에 관여하고 있다는 것, 또한 다제내성관여 단백질(MGr1-Ag)로서 보고되어 있었던 것과 동일하다는 것이 밝혀져 있다(Cell. Mol. Life Sci., 2002, 59:1577~1583, Y. Shi 등). 이 라미닌ㆍ리셉터의 많은 암세포에서의 높은 발현이라는 데이터에 의해, 범종양 특이적 이식항원으로서의 T세포의 면역원으로서, 종양 태아항원인 것으로 간주되고 있다 (Anticancer Research, 1999, 19:5535~5542, J. H. Coggin, Jr 등). 라미닌ㆍ리셉터는 이미 67LR 이외에 십수 종류 보고되어 있지만, 그 중에서도 67LR의 암과의 관련이 강하게 시사되어 있다.

67LR은 많은 암에 있어서 암세포에서의 검출의 유무로부터, 인간 암환자의 악성도를 나타내는 중요한 예후인자로서 알려져 있고(Breast Cancer Research and Treatment, 1998, 52:137~145, S. Menard 등, Clinical Cancer Research, 1997, 3:227~231, G. Fontanini 등, Clinical Cancer Research, 1996, 2:1777~1780, F. Basolo 등, J. Natl. Cancer Inst, 1991, 83:29~36, V. Cioce 등), 동물 모델 등에서는 암세포의 증식, 이동, 침윤, 전이 등에 관여하는 것이 시사되어 있다. 예를 들면, 유방암 환자에 있어서는 67LR 포지티브의 환자의 생존율은 네거티브한 환자보다 상당히 낮다는 것이 보고되어 있다. 67LR의 리간드인 라미닌의 발현은 예후에는 영향 없지만, 리셉터 67LR의 발현은 예후에 마이너스의 결과를 가져온다는 것이 나타나 있다(Breast Cancer Research and Treatment, 1998, 52:137~145, S. Menard 등).

이러한 지견을 근거로, 67LR의 발현을 억제함으로써 항종양효과를 나타내는 것을 기대해서 행해진 실험이 몇가지 보고되어 있다. 67LR의 안티센스 RNA를 암세포주에 도입해서 제작한 67LR 저발현 세포주는, 원래의 신주(新株) 세포보다도 마우스의 생체내에 있어서 상당히 종양증식능의 저하 및 전이능의 저하가 일어나고, 그 결과 마우스 개체의 생존율이 개선된다는 것이 보고되어 있다(British Journal of Cancer, 1999, 80:1115~1122, K. Satoh 등). 더욱이, 낮은 67LR 발현 세포주는 신주보다도 종양 혈관신생의 저하 및 혈관신생 촉진인자인 VEGF의 산생 그 자체도 저하하고 있다는 것이 보고되어 있다(Cancer Letters, 2000, 153:161~168, M. Tanaka 등). 동일하게, 67LR에 대한 항체를 이용한 종양전이실험에 있어서도, 안티센스 실험과 동일한 효과가 인정되고 있다(Jpn. J. Cancer Res., 1999, 90:425~431, K. Narumi 등).

비종양 관련에 있어서도, 67LR의 기능에 관해서 몇가지 보고가 되어 있다. 허혈동물 모델에 있어서 유도되는 신생혈관의 증생(增生)이 67LR과 결합하는 라미닌 유래 펩타이드(시스테인―아스파라긴산-프롤린-글리신-티로신-이소류신-글리신-세린-아르기닌)나, EGF 유래 펩타이드(시스테인-발린-이소류신-글리신-티로신-세린-글리신-아스파라긴산-아르기닌-시스테인)에 의해 억제되는 것이 보고되어 있다 (Am. J. Pathol, 2002, 160:307~313, D. Gebarowska 등). 혈관 내피세포에 대한 전단력에 의해 유도되는 동맥경화와의 관여가 지적되어 있는 eNOS 발현과 NO 산생이, 67LR과 결합하는 라미닌 유래 펜타펩타이드(티로신-이소류신-글리신-세린-아르기닌)에 의해 억제하는 것이 보고되어 있다(J. Biol. Chem., 1999, 274:15996~16002, T. Gloe 등).

최근의 보고에서는, 67LR이 크로이츠펠트야콥병의 병인(病因)이라 생각되고 있는 프리온 단백질의 리셉터로서 작용하고, 프리온이 결합해서 인터너리제이션된다는 것, 그 결합과 인터너리제이션이 막 도메인을 결핍한 뮤턴트 67LR의 분비에 의해 저해되는 것이 보고되어 있다(EMBO J, 2001, 20:5863~5875, S. Gauczynski 등).

67LR은 또한, T세포의 서브세트인 CD45RO+/CD45RA-의 메모리 세포의 CD4+CD8- 또는 CD4-CD8+의 서브세트군에서 발현하고 있는 것이 보고되어, 67LR의 면역계로의 작용이 시사되어 있다(J. Immunol, 1999, 163:3430~3440, S. M. Canfield 등).

67LR의 mRNA발현에 관한 보고도 몇가지 존재한다. 암억제 인자인 p53이나 항암인자인 TNF-알파, IFN-감마에 의해 그 발현이 억제되는 것이 보고되어 있다 (Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, 251:564~569, N. Clausse 등). 다만, 이와 같이 많이 사용되는 기능에 관여한다고 추정되고 있는 67LR에 대한 저분자 화합물의 보고는 없다.

한편, 카테킨류 중, 에피갈로카테킨갈레이트(이하, 「EGCG」라 칭하는 경우도 있다.)는, 차의 카테킨의 약 50%를 차지하는 주용(主用)성분이다. 그 밖에, 에피갈로카테킨, 에피카테킨갈레이트, 에피카테킨(이하 각각, 「EGC」, 「ECG」, 「EC」라고 칭하는 경우도 있다) 등이 포함된다.

차는 고래부터 약으로서 이용되어 온 오래된 역사가 있고, 근대로부터 그 효능과 성분의 관계가 해석되어 왔다. 그 중 EGCG는 1947년, A. Bradfield 등에 의해 발견된 성분이다(J. Chem. Soc., 1947, 32:2249, A. E. Bradfield 등).

EGCG를 포함해서 차의 카테킨류의 생리작용으로서는, 항산화, 항암, 혈장 콜레스테롤 상승억제, 혈압 상승억제, 혈소판 응집억제, 혈당 상승억제, 치매예방, 항궤양, 항염증, 항알레르기, 항균ㆍ항충치, 항바이러스, 해독, 장내 플로라 개선, 소취 등이 보고되어 있다(차의 기능, 무라마츠케이이치로 등편, 학회출판 센터, 2002).

이 중에서, 항암작용은 상당히 많이 보고되어 있고, 항변이작용, 항발암 프로모션 작용, 항종양 증식억제작용, 항침윤ㆍ전이저해작용, 항혈관신생 저해작용이 있다. 최근의 보고에서는, EGCG는 백혈병 세포의 DNA합성을 저해하여 아포토시스를 유도하는 것(Int. J. Mol. Med., 2001, 7:645~652, D. M. Smith 등), 또한 EGCG가 유방암 세포주의 증식을 억제하는 것이 보고되어 있다(J. Cell. Biochem., 2001, 82:387~398, K. T. Kavanagh 등). 더욱이, EGCG가 정상세포와 비교해서 암세포의 증식을 강하게 억제한다는 등의 보고가 되어 있다(Arch. Biochem. Biophys, 2000, 376:338~346, N. Ahmad 등).

침윤ㆍ전이에 관해서는, 카테킨류가 매트리겔을 이용한 침윤시험에서 고전이 성 세포의 침윤을 억제하는 것, 또한 암세포의 피브로넥틴이나 라미닌으로의 접착을 EGCG가 저해하는 것이 보고되어 있다(Cancer Lett., 1995, 98:27~31, M. Suzuka 등, Cell Biol Int., 1993, 17:559~564, M. Isemura 등, Cancer Lett., 2001, 173:15~20, Y. Suzuki 등).

더욱이, 이들 카테킨 작용의 분자 레벨의 해석이 최근 보고되고 있다. 예를 들면, EGCG는 암과의 관련이 시사되어 있는 Her-2항원 고발현 세포의 증식을 농도의존적으로 억제한다. 그 작용 기서(機序)는 Her-2의 인산화 억제에 의한 그 하류 시그널 전달의 저해라고 보고되어 있다(Cancer Res., 2002, 62:652~655, S. Pianetti 등).

또한, 종양증식과 밀접한 관련이 있는 혈관신생을 EGCG 등 카테킨이 저해하 는 것이 보고되어 있다. 그 메커니즘은 카테킨이 혈관 내피세포의 증식인자인 VEGF의 리셉터 VEGFR-1의 인산화를 억제하는 것에 있다고 나타나 있다. 이것은 카테킨의 항산화ㆍ항라디칼 활성에는 의존하지 않는다고 보고되어 있다(Cancer Res, 2002, 62:381~385, S. Lamy 등).

동일하게, 다른 증식인자인 PDGF-BB에 의한 혈관평활근 세포에서의 PDGF-R베타의 인산화를 카테킨류가 억제하므로써 혈관의 비후(肥厚)를 억제하는 것이 보고되어 있다(FASEB J, 2002, 16:893~895, A. Sachinidis 등).

더욱이, EGF-2에 의한 생체내에서의 혈관신생 및 내피세포의 증식을 EGCG가 억제하는 것이 보고되어 있다(Nature, 1999, 389:381, Y. Cao 등). EGCG가 아포토시스를 유도하는 Fas 단백질과 결합한다는 보고가 있지만(Biochem. Biophys. Res. Commun, 2001, 285:1102~1106, S. Hayakawa 등), 상기 EGCG의 작용이 Fas에 관여된 것인지 밝혀져 있지 않고, 그 밖에 EGCG와 상호작용하는 인자의 존재가 시사되어 있다.

카테킨에는 항종양 효과 이외에도, 여러가지 생리작용이 분자 레벨에서 밝혀져 있다. EGCG는 간세포에서의 글루코오스 산생을 억제하고, 또한 인슐린 리셉터와 IRS-1의 티로신인산화를 촉진함으로써 항당뇨병적 작용이 보고되어 있다(J. Biol. Chem., 2002, 277:34933~34940, M. E. Waltner-Law 등).

또한, 파킨슨 모델 마우스에 있어서 EGCG는 강하게 신경보호작용을 나타낸다는 보고로부터(J. Biol. Chem., 2002, 277:30574~30580, Y. Levites 등), 많은 신경장해를 억제하는 것이 기대되고 있다. 알레르기의 요인인 호염기구(好鹽基球)에 서의 Fc 입실론 RI의 발현을 EGCG나 그 메틸화체가 억제한다는 것(J. Agric. Food Chem, 2002, 50:5729~5734, Y. Fujimura 등), 더욱이 연골에 있어서 IL-1 베타에 의해 유도되는 COX-2나 NO 합성효소2의 발현을 EGCG가 억제한다는 것이 보고되어 있다(Free Radical Biology & Medicin, 2002, 33:1097~2002, S. Ahmed 등).

그러나, 본 발명자들이 아는 한, EGCG가 67LR을 통해서 세포증식 억제인자 등으로서 기능하는 것, 또한, 67LR을 타겟으로 하여 세포증식 억제작용 등을 갖는 저분자 화합물의 약물 스크리닝에 이용가능한 것에 관해서는, 지금까지 일절 보고되어 있지 않다.

(비특허문헌 1)

Biochemistry, 1995, 34:11276~11287

(비특허문헌 2)

J. Cell. Biochem., 1998, 69:244~251

(비특허문헌 3)

Cell. Mol. Life Sci., 2002, 59:1577~1583

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Anticancer Research, 1999, 19:5535~5542

(비특허문헌 5)

Breast Cancer Research and Treatment, 1998, 52:137~145

(비특허문헌 6)

Clinical Cancer Research, 1997, 3:227~231

(비특허문헌 7)

Clinical Cancer Research, 1996, 2:1777~1780

(비특허문헌 8)

J. Natl. Cancer Inst, 1991, 83:29~36

(비특허문헌 9)

Breast Cancer Research and Treatment, 1998, 52:137~145

(비특허문헌 9)

British Journal of Cancer, 1999, 80:1115~1122

(비특허문헌 10)

Cancer Letters, 2000, 153:161~168

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EMBO J, 2001, 20:5863~5875

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J. Chem. Soc., 1947, 32:2249

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차의 기능, 무라마츠케이이치로 등편, 학회출판센터, 2002

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Cell Biol. Int., 1993, 17:559~564

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Cancer Lett., 2001, 173:15~20

(비특허문헌 25)

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FASEB J, 2002, 16:893~895

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Nature, 1999, 389:381

(비특허문헌 29)

Biochem. Biophys. Res. Commun, 2001, 285:1102~1106

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J. Agric. Food Chem, 2002, 50:5729~5734

(비특허문헌 33)

Free Radical Biology & Medicin, 2002, 33:1097~2002

발명의 개시

본 발명자는, 상기 과제에 비추어 예의 검토한 결과, 67LR이 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용을 갖는 약물의 타겟으로서 사용가능하다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 하기한 바와 같다.

[1] 피험화합물과 67kDa 라미닌ㆍ리셉터와의 결합의 정도를 정성적 또는 정량적으로 측정하고, 그 측정결과로부터 피험화합물이 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 결합하는 경우에는 그 피험화합물이 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용을 갖는 약물이라고 판단하는 공정을 포함하는, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용을 갖는 약물의 스크리닝 방법.

[2] 약물이, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용 및/또는 암세포의 전이활성 저해작용을 갖는 약물인 [1] 기재의 스크리닝 방법.

[3] [1] 또는 [2]에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 약물.

[4] 유효성분이 갈로일기를 갖는 화합물인 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 약물.

[5] 화합물이, 카테킨류인 [4] 기재의 약물.

[6] 카테킨류가 에피갈로카테킨 갈레이트인 [5] 기재의 약물.

[7] 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용에 의해 예방 및/또는 치료할 수 있는 질환을 위해 이용되는 [3] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 약물.

[8] 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용 및/또는 암세포의 전이활성 저해작용에 의해 예방 및/또는 치료할 수 있는 질환을 위해 이용되는 [3] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 약물.

[9] 질환이 암인 [8] 기재의 약물.

[10] [3] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 약물을 화학 합성방법에 의해 제조하는 공정 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 배합하는 공정을 포함하는, 의약품 조성물의 제조방법.

[11] [10] 기재의 제조방법에 의해 얻어지는 의약품 조성물.

[12] 갈로일기를 갖는 화합물 및 피험화합물과 67kDa 라미닌ㆍ리셉터와의 결합의 정도를 정성적 또는 정량적으로 측정하고, 그 측정결과로부터 피험화합물과 67kDa 라미닌ㆍ리셉터와의 결합의 정도가, 갈로일기를 갖는 화합물과 67kDa 라미닌ㆍ리셉터와의 결합의 정도를 상회하는 경우에는, 그 피험화합물이 카테킨류가 갖는 약리학적 작용과 동일한 작용을 갖는 약물이라고 판단하는 공정을 포함하는, 약물의 스크리닝 방법.

[13] 갈로일기를 갖는 화합물의 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 대한 결합과, 피험화합물의 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 대한 결합을 경합시킨 결과, 피험화합물의 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 결합하는 사이트와, 갈로일기를 갖는 화합물의 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 결합하는 사이트가 동일할 경우에는, 그 피험화합물은 갈로일기를 갖는 화합물이 갖는 약리학적 작용과 동일한 작용을 갖는 약물이라고 판단하는 공정을 포함하는, 약물의 스크리닝 방법.

[14] 갈로일기를 갖는 화합물이 갖는 약리학적 작용이, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용인 [12] 또는 [13]에 기재된 스크리닝 방법.

[15] 갈로일기를 갖는 화합물이 갖는 약리학적 작용이, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용 및/또는 암세포의 전이활성 저해작용인 [12] 또는 [13]에 기재된 스크리닝 방법.

[16] 화합물이 갈로일기를 갖는 카테킨류인 [12] 내지 [15] 중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법.

[17] 카테킨류가 에피갈로카테킨 갈레이트인 [12] 내지 [15] 중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법.

[18] [12] 내지 [17] 중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 약물.

[19] 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용에 의해 예방 및/또는 치료할 수 있는 질환을 위해 이용되는 [18]에 기재된 약물.

[20] 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용 및/또는 암세포의 전이활성 저해작용에 의해 예방 및/또는 치료할 수 있는 질환을 위해 이용되는 [18] 또는 [19]에 기재된 약물.

[21] 질환이 암인 [20] 기재의 약물.

[22] [18] 내지 [21] 중 어느 하나에 기재된 약물을 화학 합성방법에 의해 제조하는 공정 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 배합하는 공정을 포함하는, 의약품 조성물의 제조방법.

[23] [22]에 기재된 제조방법에 의해 얻어지는 의약품 조성물.

[24] 67kDa 라미닌ㆍ리셉터와 결합하는 화합물로서, 갈로일기를 갖는 화합물이 상기 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 결합하는 사이트와 동일한 사이트에서 결합하는 화합물.

[25] 화합물이 카테킨류인 [24] 기재의 화합물.

[26] 카테킨류가 에피갈로카테킨 갈레이트인 [26] 기재의 화합물.

[27] [24] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 화합물을 포함하는 세포증식 억제제.

[28] [24] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 화합물을 포함하는 혈관신생 저해제(阻害劑).

[29] [24] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 화합물을 포함하는 암세포의 전이활성 저해제.

[30] [24] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 화합물을 포함하는 항암제.

도 1은 실시예 1의 표면 플라즈몬 공명센서에 의한 측정결과를 나타내는 도면이다.

도 2는 실시예 1의 세포증식 시험의 결과를 나타내는 도면이다.

도 3은 실시예 1의 세포증식 시험의 결과를 나타내는 도면이다.

도 4는 실시예 2의 플로우사이트메트리에 의한 해석 결과를 나타내는 도면이다.

도 5는 실시예 3의 세포증식 시험의 결과를 나타내는 도면이다.

도 6은 실시예 3의 표면 플라즈몬 공명센서에 의한 측정결과를 나타내는 도면이다.

도 7은 실시예 4의 표면 플라즈몬 공명센서에 의한 측정결과를 나타내는 도면이다.

도 8은 실시예 4의 세포증식 시험의 결과를 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하 본 발명에 관해서 상세하게 설명한다.

본 발명은, 67LR을 타겟으로 하는 약물의 새로운 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 태양으로서는, 피험화합물과 67LR과의 결합의 정도를 정성적 또는 정량적으로 측정하고, 그 측정결과로부터 피험화합물이 67LR에 결합하는 경우에는 그 피험화합물이 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이 츠펠트야콥병 감염 저해작용을 갖는 약물이라고 판단하는 공정을 포함하는, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용을 갖는 약물의 스크리닝 방법을 들 수 있다.

본 발명에서 이용되는 67LR은 그것 자체가 공지의 단백질이며, 예컨대, GenBank Accession No.NM_002295 등록 cDNA 서열을 가지고, 통상의 방법에 따라 본 단백질을 코드하는 서열을 끼워 넣도록 해서 여러가지 라이브러리를 템플레이트로 하여 PCR을 행하므로써, 67LR의 cDNA를 취득하는 것이 용이하게 가능하다. 또한, 여기에서 얻어진 cDNA를 시판되는 여러가지 벡터에 단백발현이 가능한 형태로 삽입하므로써, 용이하게 본 단백질을 발현한는 세포주 구축 및 본 단백질 본체의 취득이 가능하다. 이것 이외에 몇개의 cDNA 취득과 단백질 발현의 보고가 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85:6394, H. You 등, British Journal of Cancer, 1999, 80:1115~1122, K. Satoh 등, Biochemistry, 1995, 34:11276~11287, T. H. Landowski 등).

또, 67LR은, 유전자로서는 37kDa의 40S 리보솜 결합 단백질이지만, 막에 발현하는 경우에는 67kDa로 되는 것이 알려져 있다. 본 발명에 있어서는, 막에 발현하는 경우에는 67kDa로 되는 단백질로서, 라미닌과 결합하는 접착성을 갖는 단백질이면, 전부 본 발명에 있어서 67LR로서 정의되고, 완전한 단백질 뿐만 아니라, 그 부분 펩티드를 이용하는 것도 가능하다. 또한, 67LR은, 스크리닝의 수단에 따라, 예컨대, 정제한 단백질로서, 가용형 단백질로서, 담체에 결합시킨 형태로서, 또한, 다른 단백질과의 융합 단백질로서, 적당히 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서는 피험화합물과 67LR을 결합시키는 것에 의해, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용을 갖는 약물을 스크리닝한다. 이 때, 피험화합물의 형태로서는, 세포추출물, 세포배양상청, 발효미생물 산생물, 생물추출물, 식물추출물, 정제 또는 조(粗)정제 단백질, 펩티드, 비펩티드성 화합물, 합성 저분자 화합물, 천연화합물, 유전자 라이브러리 등, 통상 약물의 스크리닝에 사용되는 형태이면 좋고, 특별히 제한은 되지 않는다.

피험화합물과 67LR과의 결합은, 피험화합물의 형태에 따라 적당한 수단이 선택되지만, 예컨대, 피험화합물을 67LR 발현세포 배양액중에 첨가하는 방법 등으로 행할 수 있다.

상기한 바와 같이 하여, 피험화합물과 67LR과의 결합의 정도를 측정하지만, 여기에서 이용되는 측정방법은, 정성적 수단 및 정량적 수단의 어느 것이나 이용하는 것이 가능하다. 결합 정도를 측정하는 수단의 일례로서는, 후술하는 실시예에서 나타낸 바와 같은 표면 플라즈몬 공명센서를 이용하는 방법을 들 수 있다.

이와 같이 하여 결합 정도를 측정한 결과, 피험화합물이 67LR에 실질적으로 결합하는 경우에는, 그 피험화합물이, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용을 갖는 약물이라고 판정된다. 그 중에서도, 본 발명의 스크리닝 방법은, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용 및/또는 암세포의 전이활성 저해작용을 갖는 약물의 스크리닝에 이용하는 것이 적합하다.

후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용을 갖는 것이 시사되어 있는 갈로일기를 갖는 화합물이 67LR에 결합하여, 그 세포증식을 현저하게 억제하고 있다.

이것으로부터, 갈로일기를 갖는 화합물은, 67LR을 통해서 세포증식 인자로서 기능하는 것이 시사되고, 더욱이, 갈로일기를 갖는 화합물과 동일하게 67LR에 결합하는 물질은, 갈로일기를 갖는 화합물과 동일한 작용, 즉, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용을 갖는다고 생각된다.

따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 67LR과 결합하는 피험화합물은, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용을 갖는 약물이라고 판단할 수 있다.

또, 상기에서 든 갈로일기를 갖는 화합물로서는, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 그 3-메틸 치환체나 에피카테킨 갈레이트 등의 갈로일기를 갖는 카테킨류, 갈로일기를 갖는 폴리페놀류, 트리갈로일글루코오스, 펜타갈로일글루코오스, 스트릭티닌, 피로갈롤 등을 들 수 있고, 적절하게는, 에피갈로카테킨 갈레이트를 들 수 있다.

다음에 본 발명의 스크리닝 방법으로서, 별도의 태양에 관해서 설명한다.

본 발명에 있어서의 별도의 태양으로서는, 67LR에 더하여, 더욱이 갈로일기를 갖는 화합물을 이용한 약물의 스크리닝 방법을 제공한다. 즉, 갈로일기를 갖는 화합물 및 피험화합물과 67LR과의 결합의 정도를 정성적 또는 정량적으로 측정하고, 그 측정결과로부터 피험화합물과 67LR과의 결합의 정도가, 갈로일기를 갖는 화합물과 67LR과의 결합의 정도를 상회하는 경우에는, 그 피험화합물이 갈로일기를 갖는 화합물이 갖는 약리학적 작용과 동일한 작용을 갖는 약물이라고 판단하는 공정을 포함하는, 약물의 스크리닝 방법을 들 수 있다.

또한, 갈로일기를 갖는 화합물의 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 대한 결합과, 피험화합물의 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 대한 결합을 경합시킨 결과, 피험화합물의 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 결합하는 사이트와, 갈로일기를 갖는 화합물의 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 결합하는 사이트가 동일할 경우에는, 그 피험화합물은 갈로일기를 갖는 화합물이 갖는 약리학적 작용과 동일한 작용을 갖는 약물이라고 판단하는 공정을 포함하는, 약물의 스크리닝 방법을 들 수 있다.

후술한 실시예에 나타낸 바와 같이, 67LR에 대한 모노크로날 항체는, 갈로일기를 갖는 화합물의 67LR로의 결합을 저해하고, 그 결과 갈로일기를 갖는 화합물의 세포증식 억제효과를 저해하고 있다. 역으로, 갈로일기를 갖는 화합물은 항67LR 항체의 67LR로의 결합을 저해하고 있다. 즉, 갈로일기를 갖는 화합물의 결합 부위와 항체인식 부위가 겹쳐 있다. 이것으로부터, 갈로일기를 갖는 화합물 및 피험화합물을, 67LR로의 경합반응에 제공하는 것에 의해, 피험화합물이 갈로일기를 갖는 화합물과 동일한 사이트에 결합하는 경우에는, 그 피험화합물은 갈로일기가 갖는 화합 물이 갖는 작용과 동일한 작용을 갖는다고 생각된다.

본 발명의 다른 태양인, 갈로일기를 갖는 화합물을 사용하지 않는 스크리닝 방법에 관한 상세한 설명을 전술했지만, 그들의 기재는, 갈로일기를 갖는 화합물을 사용하는 본 발명의 태양의 경우에도 적용된다. 또, 여기에서 서술하는 본 발명의 태양에 있어서 스크리닝에 제공되는 갈로일기를 갖는 화합물은, 예컨대, 후술의 실시예 나타낸 바와 같이 PBS 등의 버퍼로 적당히 희석해서 사용하는 것이 가능하다. 또한, 피험화합물과 갈로일기를 갖는 화합물을, 67LR 발현세포 배양액중에 첨가하는 것에 의해 그들의 경합반응을 일으키게 하는 경우에 있어서, 피험화합물과 갈로일기를 갖는 화합물의 첨가순서에 특별히 제한은 없다.

상기한 바와 같이 하여 스크리닝된 약물은, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용에 의해 예방 및/또는 치료할 수 있는 질환을 위한 약물로서 사용가능하다. 이들의 질환 중, 본 발명에 있어서 가장 적절한 질환으로서는 암을 들 수 있다.

또, 본 발명에 있어서는, 일단 약물이 스크리닝에 의해 선택된 후에는, 그 약물은 통상의 화학합성 방법 등에 의해 제조하는 것이 가능하다. 또한, 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 배합하는 것도 가능하다. 즉, 본 발명에 있어서는, 상기에서 나타낸 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 약물을, 화학 합성방법에 의해 제조하는 공정 및 약학적으로 허용되는 담체를 배합하는 공정을 포함하는, 의약 조성물의 제조방법 및 당해 제조방법에 의해 얻어지는 의약 조성물도 그 요지에 포함된다.

의약 조성물로서 이용하는 경우에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체로서는, 예컨대, 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정화제 등을 들 수 있고, 이들과 약물을 적당히 조합시켜 제제화하여 제공하는 것이 가능하다. 또한, 환자로의 투여는, 예컨대, 동맥내 주사, 정맥내 주사, 피하주사 등 이외에, 경구적 투여도 가능하고, 약물에 따라, 또한, 환자의 체중이나 연령, 증상 등에 따라서 적절하게 선택할 수 있다. 투여량에 관해서도 동일하게, 약물에 따라서, 또한, 환자의 체중이나 연령, 증상 등에 따라서, 적당한 투여량을 선택하는 것이 가능하다. 또, 피험화합물이 DNA에 의해 코드될 수 있는 것이면, 당해 DNA를 유전자 치료용 벡터에 조립하여, 유전자 치료를 행하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서는, 67LR과 결합하는 화합물로서, 갈로일기를 갖는 화합물이 상기 67LR에 결합하는 사이트와 동일한 사이트에서 결합하는 화합물도 본 발명의 그 요지에 포함된다. 이들은, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 67LR에 대한 모노크로날 항체는, 갈로일기를 갖는 화합물의 67LR로의 결합을 저해하고, 그 결과 갈로일기를 갖는 화합물의 세포증식 억제효과를 저해하고 있는 것; 역으로, 갈로일기를 갖는 화합물은 항67LR 항체의 67LR로의 결합을 저해하고 있는 것; 즉, 갈로일기를 갖는 화합물의 결합 부위와 항체인식 부위가 겹쳐 있는 것에 의해, 충분히 뒷받침되어 있다. 이들 화합물은, 갈로일기를 갖는 화합물이 갖는 작용과 동일한 작용을 갖는 것으로 생각되기 때문에, 세포증식 억제제, 혈관신생 저해제, 암세포의 전이활성 저해제, 즉, 항암제로서의 사용이 가능하다.

이하에 실시예를 들어서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

(1). 세포 및 세포배양

본 실험에 이용한 인간 폐암세포주 A549(ATCC Number:CCL-185)는 10% 소 태아혈청(FBS)(Bio Source Internationa1, Camarillo, CA)첨가 ERDF배지(극동제약)에서 37℃, 수증기 포화한 5% CO₂ 조건하에서 계대, 유지했다. ERDF배지 1L중에 1.125g의 NaHCO₃(와코준야쿠, Osaka, Japan)을 가했다. 세포는 대수증식기에서 배양 유지했다. 사람 버킷 림프종 세포주 DND39는, 5% FBS첨가 RPMI-1640배지(Nissui, Japan)에서 37℃, 수증기 포화한 5% CO₂ 조건하에서 계속, 유지했다. RPMI-1640 배지 중에는 100U/mL 페니실린(Meiji pharmaceutical Company, Tokyo, Japan), 100mg/mL 스트렙토마이신(Meiji pharmaceutical Company), 12.5mM NaHCO₃(와코준야쿠), 그리고 10mM HEPES(와코준야쿠)를 첨가했다.

(2). 녹차카테킨

녹차카테킨 에피갈로카테킨-3-0-갈레이트(EGCG), 에피카테킨-3-0-갈레이트(ECG), 에피갈로카테킨(EGC), 에피카테킨(EC), 카테킨(C), 에피갈로카테킨-3-(3-0-메틸)-갈레이트(EGCG3”Me)는 5mM의 농도로 되도록 인산 버퍼(PBS)에 용해했다. 사용하는 경우에는 적당히 해동해서 이용했다. PBS는, 초순수 1L에 대해서, NaCl(Nacalai tesque, Inc.) 8.0g, KCl(Nacalai tesque, Inc.) 0.2g, Na₂HPO₄(Nacalai tesque, Inc.) 1.15g, KH₂PO₄(Nacalai tesque, Inc.) 0.2g을 용해하여 조제했다.

Caffeine 및 quercetin은 Nacalai tesque, Inc.로부터 구입하고, 전자는 PBS에 후자는 디메틸설폭사이드(DMSO)(Nacalai tesque, Inc.)에 5mM의 농도로 되도록 현탁하여 조제했다.

(3). 시약 및 기기

트리판블루(와코준야쿠)을 1%의 농도가 되도록 PBS에 현탁하고, 121℃, 20분 오토클레이브 멸균했다. All-trans-retinoic acid(ATRA)은 Sigma(St. Louis, MO)로부터 구입하여 에탄올에 용해했다.

RNA 추출에 이용한 TRIzol은 Invitrogen(Carlsbad, CA)으로부터 구입했다. 0.1% 디에틸피로카보네이트(DEPC)수는 Sigma(St. Louis, MO)로부터 구입했다. RNA 용해에 이용한 DEPC 용액은 DEPC가 최종 농도 0.1%로 되도록 증류수에 가해서 2시간 교반한 후, 오토클레이브해서 조제했다.

0ligotex-dT30 및 인간 태반유래 RNase 인히비터는 Takara(Kyoto, Japan)로부터, Moloney murine leukemia virus(MMLV) 역전사 효소는 Amersham Pharmacia Biotech(Buckinghamshire, UK)로부터 구입했다. 프라이머 등의 올리고뉴클레오티드는 BIOSYNTHESIS(Japan)에 합성을 의뢰했다. Taq DNA polymerase는 Fermentas(Vilnius, Lithuania), Ex Taq는 Takara로부터 구입했다. Polymerase chain reaction(PCR)은 GeneAmp PCR System 2400(Parkin-Elmer, Tokyo, Japan)을 사용했다. 아가로스는 울트라퓨어 아가로스(Sawaday Technology, Tokyo, Japan)를 사용했다.

클로닝의 벡터는, pT_ARGET^TM Mammalian Expression Vector System(Promega, Madison, WI)을 이용했다. 정제에는 QIAGEN Plasmid Midi Kit 또는, EndoFree Plasmid Maxi Kit(모두 QIAGEN)를 이용했다.

LB 배지는 Bacto Tryptone(Becton Dickinson, Sunnyvale, CA) 10g 및 Bacto Yeast Extract(DIFCO LABORATORIES, Detroit, MI) 5g, NaCl 5g을 초순수 1L에 용해하고, 오토클레이브했다. 60℃로 식히고 나서, 150mg/mL의 앰피실린(앰피실린나트륨(와코준야쿠)을 150mg/mL로 되도록 초순수에 용해후, 필터 멸균했다)을 1000mL 가했다. LB 플레이트는 Bacto Tryptone 2g, Bacto Yeast Extract 1g, NaCl 2g, Bacto Agar(DIFCO) 5g 가하고, 초순수 200mL에 용해하여 오토클레이브했다. 60℃로 식히고 나서, 150mg/mL의 앰피실린을 200mL 가하고, 10mL dish(Falcon)에 10mL씩 분주(分注)했다. 이소프로필-b-D(-)-티오갈락토피라노사이드(IPTG)는 와코준야쿠로부터 구입하고, 0.1M이 되도록 조제했다.

5-브로모-4-클로로-3-인돌일-b-D-갈락토피라노사이드(X-gal)(와코준야쿠)를 20mg/mL가 되도록 N,N-디메틸-포름아미드(와코준야쿠)에 용해했다. SOC는, Bacto Tryptone 3g, Bacto Yeast Extract 0.75g, NaCl 0.078g, KCl 0.027g, H₂O를 전량이 148.5mL로 될때까지 가했다. 이 용액을 오토클레이브했다. 이것과는 별도로 오토클 레이브한 2M Mg² ⁺액(12.324g의 MgSO₄ㆍ7H₂O, 10.165g의 MgCl₂ㆍ6H₂O을 초순수에 섞어 50mL로 했다)을 1.5mL 가했다. 이 용액 100mL에 1mL의 2M 글루코오스를 가해서 작성했다.

DNA 서열기로는 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems, Tokyo, Japan)를 이용하고, 그 경우, ABI PRISM BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits Version2.0(Applied Biosystems)을 이용했다. Template Suppression Reagent(TSR)는 Applied Biosystems로부터 구입했다.

유전자 도입에는, FuGENE^TM 6 Transfection Reagent(Roche Diagnistics Gmbh, Mannheim, Germany)를 이용해서 행하였다.

플로우사이트메트리 해석용 항인간 라미닌 리셉터 항체는 NEOMARKERS(Fremont, CA)로부터 구입했다. 네거티브 컨트롤 항체의 마우스 IgM항체는 Zymed Laboratories, Inc.(San Francisco, CA)을 이용했다. Fluorescein isothiocyanate(FITC) 표식 항마우스 IgM 염소 항체는 Southern Biotechnology Associates, Inc.(Birmingham, AL)로부터 구입했다. 플로우사이트미터는, FACSCalibur(Becton Dickinson)을 사용했다.

(4). RNA 추출 및 cDNA 합성

미리 1mM ATRA에서 37℃, 24시간 처리한 세포를 PBS로 세정한 후, 1x10⁷cells에 대하여 1mL의 Trizol을 가해서 신속하게 현탁해서 완전히 용해시켰다. 실온에 5분간 정치후, 0.2mL의 클로로포름을 첨가해서 격렬하게 전도교반했다. 실온에 3분간 정치후, 12000xg, 4℃에서 15분간 원심했다. 원심상청에 0.5mL의 2-프로판올을 첨가해서 격렬하게 전도교반하고, 실온에 10분간 정치후, 12000xg, 4℃에서 10분간 원심했다. 이 상청을 제거하고, 1mL의 75% 에탄올로 침전을 린스했다. 12000xg, 4℃에서 5분간 원심후, 상청의 에탄올을 가능한 한 제거하고, 침전한 토탈 RNA를 20mL의 DEPC수에 용해시켰다. cDNA 합성은 이하에 나타낸 바와 같이 했다. 우선, 10mg의 토탈 RNA에 0.5mg/mL의 (dT)₂₀ 프라이머를 1mL 가하고, 70℃에서 10분간 둔 후, 즉시 냉각함으로써 어닐링을 행하였다. 다음에, 10mM dNTP를 2mL, RNase inhibitor를 0.1mL, MMLV-역전사 효소에 첨부된 5x버퍼를 4mL 가하고, DEPC 수로 전량이 20mL가 되도록 했다. 이 혼합액을 37℃에 1시간 두어 cDNA를 합성하고, 97℃에서 5분간 두어 효소를 실활시켰다.

(5). 67kDa 라미닌 리셉터(67LR) 발현 벡터의 구축

DND39 세포를 1mM ATRA로 37℃, 24시간 처리한 후, RNA 추출을 행하여 cDNA를 합성했다. Full-1ength cDNA(Yowetal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:6394~6398(1988))을 참고로 해서 프라이머를 작성했다(H-LamininR-F;5'-ATGTCCGGAGCCCTTGATGTCC-3', H-LamininR-R;5'-TTAAGACCAGTCAGTGGTTGCTC-3'). 프라이머는 20mM로 조정했다. 합성한 cDNA 1mL, Ex Taq 0.1mL, 10 x Taq 버퍼 2mL, 2.5mM dNTP 1.6mL, 프라이머를 각각 0.5mL, dH20 14.3mL를 현탁하여, PCR을 행하였다. 조건은, 초기변성 95℃에서 5분간, 변성반응 94℃에서 30초간, 어닐링 58℃에 서 30초간, 신장반응 72℃에서 30초간 행하고, 변성반응, 어닐링 및 신장반응을 25사이클 행하였다. 1.2% 아가로스겔에서 전기영동을 행하고, 목적의 밴드를 Wizard SV Gel 및 PCR Clean-Up System(Promega)을 이용해서 정제했다. 이 시퀀스를 행하여, 목적물인 것을 확인했다. T4 DNA Ligase 10 x buffer 1mL, pT_ARGET^TMVector 1mL, T4 DNA Ligase 1mL 및 PCR산물 2.82mL, dH20 4.18mL 가해서 4℃에서 밤새 방치하여 라이게이션을 행하였다. 이하는, 서브클로닝과 동일한 조작을 행하였다. 콜로니 PCR에서 정반대 판정을 행하고, 콜로니를 백금이(白金耳)로 집어서 LB배지에 옮기고, 37℃, 150rpm에서 밤새 진탕배양했다. 이것을 집균하고, EndoFree Plasmid Maxi Kit에서 정제했다. 이 시퀀스를 행하여, 67LR인 것을 확인했다.

(6). 67LR의 일과성 발현계의 구축

구축한 67LR 발현벡터(pT_ARGET-hLamininR)를 FuGENE^TM 6 Transfection Reagent 를 이용해서 A549 세포에 도입했다. 상세한 것은 이하에 기술하는 바와 같다. 세포를 1 x 10⁴cells/mL(10% FBS-ERDF배지)에 조정해서 뿌려 넣었다. 24시간, 37℃에 두고 세포를 접착시킨 후, 튜브에 새롭게 ERDF배지를 취해 FuGENE^TM6(유전자량의 3배)을 직접 가하고, 온건하게 섞었다. 다음에 pT_ARGET-hLamininR을 가해 온건하게 섞고, 실온에 30분간 방치했다. 이것을, 배지중에 가해 48시간, 37℃에서 정치하였다. 배지로 세정후, 신선한 배지로 바꾸었다.

(7). 67LR 강제 발현세포에 미치는 각종 성분의 영향

67LR 일과성 발현세포에 대하여, 각종 성분을 여러가지 농도로 첨가하고, 5 % FBS함유 ERDF배지에서 37℃, 48시간 처리했다. 처리후, 세포수의 계측 및 트리판블루 염색법에 의한 생존율의 측정을 행하였다.

또한, EGCG 전처리에 관해서는, 최종농도 10㎍/mL(1% FBS함유 ERDF배지)의 항67LR 항체를 37℃, 30분간 처리한 후, EGCG처리를 행하고, 항체처리 세포에 대한 영향도 검토했다. 네거티브 컨트롤하여 마우스 IgM에서도 동일한 처리를 행하였다.

(8). 67LR 강제 발현세포에 대한 각종 성분의 결합성 해석

각종 성분 5μM와 세포와의 결합성을 표면 플라즈몬 공명센서 SPR670(Nippon Laser and Electronic Lab., Nagoya, Japan)에 의해 측정했다. 측정은 우선, 단백질 등의 표준적인 고정화법을 이용해서 세포를 금막(Nippon Laser and Electronic Lab.)에 고정했다. 10mM의 4,4-디티오디부티르산;DDA(동경화성공업, Tokyo, Japan) 에탄올 용액(10mL의 99% 에탄올중에 2.38mg의 DDA를 용해하고, 에탄올로 1/100로 더 희석했다)에 금막을 담그어서(금의 면을 위로) 온건하게 실온에서 30분간 교반했다. 다음에, 에탄올로 2회, 금 표면에 수압을 걸지 않도록 세정해서 자기조직화막(SA막)을 도입했다. 25mg 수용성 카르보디이미드;EDC(와코준야쿠)를 1mL 초순수에, 15mg N-히드록시숙신이미드;NHS(와코준야쿠)를 9mL 1,4-디옥산(Nacalai tesque, Inc.)에 각각 용해했다. 각각의 용액을 혼합하고, SA막 처리제의 금막을 담그어, 온건하게 실온에서 10분간 교반했다. 이것에 10mL의 초순수를 가하고, 실온에서 5분간 더 교반했다. 초순수에서 2회, 금 표면에 수압을 걸지 않도록 세정하 고, 건조(풍건)시켜서 카트리지에 탑재했다. 세포를 3 x 10⁵cells/mL(플로우 버퍼인 PBS)로 조정하고, 금막상에 20μL 적하하여 30분간 실온에서 세포를 고정화했다. 그 후, PBS로 1, 10, 25, 50μM로 희석한 녹차 카테킨을 주입하고, 표면 플라즈몬 공명각도(Angle)의 변화를 측정함으로써 세포로의 결합성을 모니터했다.

또한, EGCG와 항67LR 항체와의 결합 경합성 시험은, 최종농도 10㎍/mL(1% FBS함유 ERDF배지)의 항67LR 항체를 37℃, 30분간 처리한 후, 세포를 금막에 고정화해서 표면 플라즈몬 공명센서를 이용해서 상기와 동일하게 행하였다. 이 경우, 네거티브 컨트롤로서 마우스 IgM에서도 동일한 처리를 행하여 측정했다.

(9). 플로우사이트메트리 해석

67LR은 세포 표면에 발현하고 있는 것이 알려져 있으므로, 세포 표면상에 발현한 67LR을 항인간 라미닌 리셉터(LR) 항체를 이용한 플로우사이트메트리 해석에 의해 검출했다. 세포를 회수하고, 1.5mL 에펜도르프 튜브에서 총량 100μL의 1% FBS-PBS 중에 세포가 1 x 10⁶cells 포함되도록 조정하고, 1차 항체로서 항인간 LR항체를 최종농도 10㎍/mL가 되도록 첨가했다. 4℃에서 30분간 인큐베이트한 후, PBS로 1회 세정했다. 다음에, 2차 항체로서 LR항체의 아이소 타입을 인식하는 항마우스 IgM FITC 표지 항체를 총량 25μL의 1% FBS-PBS 중에서 최종농도 12.5㎍/mL가 되도록 첨가했다. 4℃에서 30분간 인큐베이트한 후에 PBS로 2회 세정하고, 다시, PBS에 재현탁하여 플로우사이트미터에 의해 해석을 행하였다. 네거티브 컨트롤IgM항체를 동일한 농도(10㎍/mL)로 반응시켰다. 세포표면 67LR 발현량은 LR의 형광강 도의 중간치로 나타냈다.

또한, EGCG처리가 67LR 세포표면 발현에 미치는 영향을 검토하기 위해서, 1차 항체를 작용시키기 전에, 최종농도 50μM이 되도록 조제한 EGCG첨가 1% FBS-PBS로 세포를 처리하고, 37℃에 30분간 두었다. 이것을, PBS로 1회 세정했다. 이후는 상술한 작용을 1차 항체로부터 행하여, 측정을 행하였다. 또한, EGCG를 포함하지 않는 1% FBS-PBS로 처리를 행하여, 대조군으로 했다.

(10). 통계계산

실험결과의 통계처리에는, Student's, t검정을 이용했다.

실시예 1 EGCG의 세포결합성 및 증식 활성에 미치는 67LR 유전자 도입의 영향

67LR 발현벡터(pT_ARGET-hLamininR)를 FuGENE^TM 6 Transfection Reagent를 이용하여 이하의 방법에 의해 A549 세포에 도입했다. 세포를 1 x 10⁴cells/mL(10% FBS-ERDF배지)로 조정해서 파종했다. 24시간 후, 튜브에 새롭게 ERDF배지를 취해 FuGENE^TM6(유전자량의 3배)을 직접 가하고, 온건하게 섞었다. 다음에 여러가지 농도로 pT_ARGET-hLamininR을 가해 온건하게 섞고, 실온에 30분간 정치했다. 이것을, 배지중에 가하여 48시간, 37℃로 배양을 계속했다. 이 67LR 일과성 발현세포에 대하여, EGCG를 각종 농도로 첨가하고, 5% FBS함유 ERDF배지에서 37℃, 48시간 처리했다. 처리후, 세포수의 계측 및 트리판블루 염색법에 의한 생존율의 측정을 행하였 다.

그 결과, 67LR을 일과성으로 발현시킨 세포에 있어서 EGCG 농도 의존적으로 세포증식 억제가 확인되었다. 또한, 세포에 도입시킨 67LR 유전자량에 비례해서 세포증식의 억제도 확인되었다.

67LR은 세포막에 존재하는 막 단백질이며, 이 유전자의 발현벡터를 도입한 세포에서 EGCG의 효과가 증강된 것은, EGCG의 결합성이 증대했기 때문인 것은 아닌가 라고 생각된다. 따라서, 이 세포에 대한 EGCG의 결합성을 표면 플라즈몬 공명센서에 의해 측정했다. EGCG는 5μM 이용했다.

우선, 빈 벡터를 도입한 A549 세포에서는, 약간의 각(Angle)의 변화(결합량)밖에 관찰되지 않은 것에 대해서, 67LR 발현 벡터를 도입한 세포에서는, 0.25㎍ 도입세포에서 이미 각의 대폭적인 증대가 확인되고, 더욱이 0.5㎍ 도입한 세포에서는 보다 한층 증대가 확인되었다. 이것에 의해, 67LR 발현벡터 도입에 의해 EGCG의 세포표면으로의 결합성이 증대한 것이 나타났다.

실시예 1의 결과를 도 1, 도 2 및 도 3에 나타낸다.

실시예 2 67LR의 세포 표면 발현량의 측정

67LR 발현벡터를 도입함으로써, EGCG의 세포 표면으로의 결합성이 증대하는 것은 나타났다. 따라서, 이 결합성의 증대가 실제로 세포막상에 67LR 발현이 증대했기 때문인지 여부를 플로우사이트메트리를 이용해서 검토했다.

우선, 세포표면의 67LR의 발현량의 측정을 행하였다. 컨트롤의 A549 세포에서 약간의 발현이 확인되었다. 이 세포에 빈 벡터(0.5㎍)를 도입한 세포에서는 그 발현량에 거의 영향은 확인되지 않았다. 그런데, 67LR 발현벡터(0.5㎍)를 도입한 세포에서는, 발현량이 대폭 증가하고 있어, 이것으로부터, 세포 표면에 67LR이 발현하고 있는 것이 밝혀졌다.

더욱이, EGCG가 이 67LR을 통해서 결합하고 있는지를 명백하게 하기 위해서, 항67LR 항체를 작용시키기 전에 EGCG를 작용시켰다. 그렇게 하면, 컨트롤 세포에서 확인되고 있었던 67LR의 발현이 겉보기상, 없어지고 있었다. 또한, 이 현상은, 빈 벡터를 도입한 세포에서도 동일했다. 더욱이, 67LR 도입세포에서도 동일했다. 이것은, EGCG를 미리 세포에 작용시키므로써 세포 표면의 67LR에 EGCG가 먼저 결합해 버려서, 항67LR 항체가 세포막상의 67LR에 결합할 수 없게 되었기 때문에, 겉보기상 67LR의 발현이 검출되지 않았다고 생각된다.

이들의 결과로부터, 67LR 발현벡터를 도입함으로써 세포 표면의 67LR 발현이 증대하는 것이 밝혀지고, EGCG의 결합성의 증대가 67LR의 세포막 발현증대인 것이 나타났다. 또한, 이 67LR을 통해서 EGCG는 세포에 결합하는 것이 시사되었다. 즉, 67LR이 EGCG의 수용체라고 나타났다.

실시예 2의 결과를 도 4에 나타낸다.

실시예 3 EGCG의 결합성 및 증식 억제 활성에 미치는 항67LR 항체의 영향

상기에서, 67LR을 통해서 EGCG가 세포에 결합하고, 증식 억제 활성을 발현하고 있는 것이 나타났다. 이것을 보다 명확하게 하기 위해서, 이번에는 67LR 강제 발현세포에 항67LR 항체로 미리 처리를 행한 뒤에, EGCG의 결합성 및 증식 억제활성에 영향이 확인되지 않을지 검토를 행하였다.

우선은, 결합성에 미치는 항체의 영향을 표면 플라즈몬 공명센서에 의해 검토했다. 항67LR 항체를 작용시키면, 각의 변화량으로부터 EGCG의 결합속도 및 결합량 자체의 감소가 확인되었다. 그러한 효과는 음성 컨트롤 항체에서는 발견되지 않았다.

또한, EGCG의 암 세포증식 억제에 미치는 항체의 영향도 검토했다. 67LR 강제 발현세포에서는 0.1μM 농도의 EGCG에서도 약간의 증식 억제활성이 확인되지만, EGCG를 작용시키기 전에 항체처리를 행한 바, 그 증식 억제효과가 소실했다. 이 때, 생존율에는 영향은 확인되지 않았다. 이 결과로부터, EGCG의 결합 뿐만 아니라, 증식 억제활성도 67LR로의 EGCG의 결합을 통해서 행해지는 것이 나타났다.

실시예 3의 결과를 도 5 및 도 6에 나타낸다.

실시예 4 다른 차 성분의 결합성 및 증식 억제활성에 미치는 67LR 발현의 영향

EGCG가 67LR을 통해서 세포막에 결합하는 것, 또한, 암 세포증식 억제활성을 발현하고 있는 것을 나타내고 있다. 이 67LR을 통한 효과가 EGCG 특유의 것인가 검토를 행하였다. 따라서, 다른 차 성분으로서, 주요한 녹차 카테킨으로서 ECG, EGC, EC, C 및 강한 항알레르기 작용을 갖고 생체내에서 안정하게 존재한다는 보고가 있는 EGCG3"Me를 이용했다. 카테킨과 동일하게 여러가지 생리기능을 갖고 있는 카페인, 또한, 동일하게 많은 생리기능이 보고되어 있는 프라바놀류의 일종인 쿼세틴(quercetin)도 검토했다.

우선, 67LR 강제 발현세포의 증식에 미치는 영향을 검토했다. 지금까지와 동 일하게, 0.5㎍의 pT_ARGET-hLamininR을 A549세포에 리포펙션법에 의해 도입하고, 48 시간, 37℃에서 배양후의 세포에 대하여 각종 차 성분을 최종농도 5μM로 되도록 작용시켰다. 이 상태에서, 37℃에서 48시간 더 배양후의 세포수 및 생존율의 측정을 행하였다. 그 결과, C, EC, EGC, 카페인 및 쿼세틴에서는 유전자의 도입의 유무에 관계 없이, 생존율 및 세포수에는 영향은 확인되지 않았다. 한편, EGCG와 동일하게 갈로일기를 갖고 있는 ECG 및 EGCG3"Me에서는, EGCG와 동일한 증식 억제효과가 확인되었다. 이 결과로부터, 갈로일기를 갖도록 한 성분은 67LR 강제 발현세포에서 증식 억제활성을 발현하는 것이 시사되었다.

또한, 67LR 강제 발현세포로의 각종 차 성분의 결합성을 표면 플라즈몬 공명 바이오센서에 의해 측정했다. A549 세포에 대하여 C, EC, EGC는 결합성을 나타내지 않고, 이것은 67LR 강제 발현세포에서도 변화는 확인되지 않았다. 또한, 카페인 및 쿼세틴도 세포결합성을 나타내지 않고, 강제 발현세포에서도 변화는 확인되지 않았다. ECG 및 EGCG"3Me는 어느 것이나 EGCG 정도는 아니지만, 세포결합성을 나타내고 있어, 67LR 강제 발현세포에서는 이 결합성이 증대한 것이 밝혀졌다.

실시예 4의 결과를 도 7 및 도 8에 나타낸다.

본 발명에 의하면, 67kD 라미닌ㆍ리셉터를 타겟으로 하는 약물의 신규한 스크리닝 방법이 제공가능하다.

또, 본 출원은, 일본국 특원 2003-097652호를 우선권 주장해서 출원된 것이 다.

Claims

피험화합물과 67kDa 라미닌ㆍ리셉터와의 결합의 정도를 정성적 또는 정량적으로 측정하고, 그 측정결과로부터 피험화합물이 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 결합하는 경우에는 그 피험화합물이 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용을 갖는 약물이라고 판단하는 공정을 포함하는, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용을 갖는 약물의 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 약물이, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용 및/또는 암세포의 전이활성 저해작용을 갖는 약물인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1항 또는 제 2항에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 약물.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 유효성분이 갈로일기를 갖는 화합물인 것을 특징으로 하는 약물.
제 4항에 있어서, 화합물이 카테킨류인 것을 특징으로 하는 약물.
제 5항에 있어서, 카테킨류가 에피갈로카테킨 갈레이트인 것을 특징으로 하는 약물.
제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용에 의해 예방 및/또는 치료할 수 있는 질환을 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 약물.
제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용 및/또는 암세포의 전이활성 저해작용에 의해 예방 및/또는 치료할 수 있는 질환을 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 약물.
제 8항에 있어서, 질환이 암인 것을 특징으로 하는 약물.
제 3항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 기재된 약물을 화학 합성방법에 의해 제조하는 공정 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 배합하는 공정을 포함하는, 의약품 조성물의 제조방법.
제 10항에 기재된 제조방법에 의해 얻어지는 의약품 조성물.
갈로일기를 갖는 화합물 및 피험화합물과 67kDa 라미닌ㆍ리셉터와의 결합의 정도를 정성적 또는 정량적으로 측정하고, 그 측정결과로부터 피험화합물과 67kDa 라미닌ㆍ리셉터와의 결합의 정도가, 갈로일기를 갖는 화합물과 67kDa 라미닌ㆍ리셉터와의 결합의 정도를 상회하는 경우에는, 그 피험화합물이 갈로일기를 갖는 화합물이 갖는 약리학적 작용과 동일한 작용을 갖는 약물이라고 판단하는 공정을 포함하는, 약물의 스크리닝 방법.
갈로일기를 갖는 화합물의 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 대한 결합과, 피험화합물의 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 대한 결합을 경합시킨 결과, 피험화합물의 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 결합하는 사이트와, 갈로일기를 갖는 화합물의 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 결합하는 사이트가 동일할 경우에는, 그 피험화합물은 갈로일기를 갖는 화합물이 갖는 약리학적 작용과 동일한 작용을 갖는 약물이라고 판단하는 공정을 포함하는, 약물의 스크리닝 방법.
제 12항 또는 제 13항에 있어서, 갈로일기를 갖는 화합물이 갖는 약리학적 작용이, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 12항 또는 제 13항에 있어서, 갈로일기를 갖는 화합물이 갖는 약리학적 작용이, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용 및/또는 암세포의 전이활성 저해작용인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 12항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 카테킨류인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 12항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 카테킨류가 에피갈로카테킨 갈레이트인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 12항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 약물.
제 18항에 있어서, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용, 암세포의 전이활성 저해작용, 신경 보호작용, 항알레르기 작용, 항동맥경화 작용 및/또는 크로이츠펠트야콥병 감염 저해작용에 의해 예방 및/또는 치료할 수 있는 질환을 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 약물.
제 18항 또는 제 19항에 있어서, 세포증식 억제작용, 혈관신생 저해작용 및 암세포의 전이활성 저해작용에 의해 예방 및/또는 치료할 수 있는 질환을 위해 이 용되는 것을 특징으로 하는 약물.
제 20항에 있어서, 질환이 암인 것을 특징으로 하는 약물.
제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 기재된 약물을 화학 합성방법에 의해 제조하는 공정 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 배합하는 공정을 포함하는, 의약품 조성물의 제조방법.
제 22항에 기재된 제조방법에 의해 얻어지는 의약품 조성물.
67kDa 라미닌ㆍ리셉터와 결합하는 화합물로서, 갈로일기를 갖는 화합물이 상기 67kDa 라미닌ㆍ리셉터에 결합하는 사이트와 동일한 사이트에서 결합하는 화합물.
제 24항에 있어서, 화합물이 카테킨류인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 25항에 있어서, 카테킨류가 에피갈로카테킨 갈레이트인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 24항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 기재된 화합물을 포함하는 세포증식 억제제.
제 24항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 기재된 화합물을 포함하는 혈관신생 저해제.
제 24항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 기재된 화합물을 포함하는 암세포의 전이활성 저해제.
제 24항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 기재된 화합물을 포함하는 항암제.