JPH0348700A - アガラクトシルＩｇＧおよび診断薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアガラクトシルＩｇＧおよびこれを使用した診
断薬に関する。更に詳しくは、β−ガラクトシダーゼで
処理して得られたヒトＩｇＧであり、ガラクトースを含
んでおらず、かつ所定の理化学的性状を示す物質および
それを使用する診断薬に関する。

〔従来技術〕

慢性関節リウマチ患者（以下ＲＡ患者と略す）の血清中
にはいわゆるリウマチ因子といわれる自己免疫抗体が存
在し、これはヒト免疫グロブリンＧ　（ＩｇＧと略す）
のＦｃ部位に存在する抗原を認識することが知られてい
る（文献１）。ところで、最近、ＲＡ患者の血清中のＩ
ｇＧのＦｃ部位に存在する糖鎖について詳細な分析が加
えられ、その結果、該糖鎖は健常人の血清中のＩｇＧの
Ｆｃ部位における糖鎖に比較してガラクトース含有量が
著しく減少していることが本発明者の一部によって見出
された（文献２．３）。即ち、健常人血清中のＩｇＧの
Ｆｃ部位における糖部分は互いに構造の異なる複数の種
類の糖鎖から構成されており、種類間の存在比率は個体
間でほぼ一定であることが明らかにされた（文献４）。

ところが、ＲＡ患者の血清中のＩｇＧのＦｃ１位におけ
る糖部分を調べてみると、構造の異なる複数の種類の糖
鎖から構成されており、種類間の比率は健常人の場合と
同様に個体間でほぼ一定となるが、全体にガラクトース
の含有量が著しく減少していることが判明した。更に具
体的に述べれば、健常人血清中のＩｇＧのＦｃ部位の糖
部分にはガラクトースをそれぞれ２分子、１分子および
０分子含む三種類の糖鎖が約２＋２：１の比率で存在す
るが、ＲＡ患者血清中のＩｇＧのＦｃ部位の糖部分では
ガラクトースを２分子含む種類の糖鎖が著しく減少し、
全体にガラクトースを欠損した糖鎖が大幅に増加してい
ることが判明したのである（文献２．３）。この事実に
基づけばＲＡ患者血清中のＩｇＧのＦｃ部位の糖部分に
は糖鎖についての構造異常が起こっており、この構造異
常を把握することが可能となれば、それはＲＡのマーカ
ーとして使用することができることが知られるのである
（文献５）。

以下に列挙する文献１〜５は以上の知見をより詳細に記
述したものであり、本発明において参照される。

文献 １）　Ｋｕｎｋｅｌ、Ｈ２Ｃ，ａｎｄ　Ｔａｎ、　Ｅ、
　Ｍ、　（１９６４）　　：Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ　ａｎｄ　ｃｌｉｓｅａｓｅ、　Ａｄｖ、　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、。

４：３５１ ２）水溶次男、谷口隆弘、長野吉伸、竹内二十夫、松多
邦雄、宮本昭正、木幡陽「リウマチ患者におけるＩｇＧ
糖鎖の構造異常」第２８回りウマチ学会総会（昭和５９
年５月２４日）にて口頭発表く講演番号２８８〉 ３）　Ｍｉｚｕｏｃｈｉ、　Ｔ、、　Ｔａｎｉｇｕｃｈ
ｉ、　ＴｌＭａｔｓｕｔａ、　　Ｋｌｅｔ　ａｌ、　　
（１９８５）　　：　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　
ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　ｐ
ｒｉｍａｒｙ　ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ｗｉｔ
ｈｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔ
ｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆｔｏｔａｌ　ｓｅｒｕｍ
　ＩｇＧ、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１６．４５２−４５７
４）　Ｍｉｚｕｏｃｈｉ、　Ｔ、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、
　Ｔｏ、　Ｓｈｉｍｉｚｕ、　Ａ、。

Ｋｏｂａｔａ、　Ａ、、　（１９ｇ２）　５ＴＲＬＩＣ
ＴＩＪＲＡＬ　ＡＮＤ　ＮＩＪ！、ＩＥＲＩｃＡＬＶＡ
ＲＩＡＴｒＯＮＳ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＣＡＲＢＯＨＹＤＲ
ＡＴＥ　ＭＯＩＥＴＹ　ＯＦ１！、１ＭＵＮＯＧＬＯＢ
ＵＬＩＮ　Ｇ’　：　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１
２９．　２０１６２０２０ ５）　　Ｍｉｚｕｏｃｈｉ、　　Ｔ、、　（１９８５）
　：　Ｒｅａｃｔａｎｔ　ｔｏ　ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ
ｆａｃｔｏｒ　：　ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ　ｉｎ　ｔ
ｈｅ　ｓｕｇａｒ　ｃｈａｉｎｓｏｆ　ＩｇＧ　　ｉｎ
　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ
　ａｒｔｈｒｉ−ｔｉｓ、　　Ｃｌ１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、１７．　９７７−９８４さて、上記したところより
明らかなごとく血清中［ｇＧのＦｃ部位の糖部分におけ
るガラクトース欠損を把握する測定がＲＡの診断にあた
り有用となることが知られるのであるが、この測定が容
易となるためには該被測定対象物のモデル物質として、
ガラクトースを欠損した糖鎖を持つＩｇＧ　、即ち、い
わゆるアガラクトシルＩｇＧが用意されることが望まれ
る。そのようなアガラクトシルＩｇＧが用意されれば、
例えばそれのモノクロナール抗体を用意することができ
、これを使用してＲＡの診断をより容易にかつ正確に行
うことができるようになる。また咳アガラクトシルＩｇ
Ｇを使用して血清中のりウマチ因子を直接に測定するこ
とにより、ＲＡを診断することができる。

しかし、このようなアガラクトシルＩｇＧはヒトＩｇＧ
をどのような酵素によって処理して得られ、かつどのよ
うな理化学的性状を有するものであるべきかについては
未だ知られていない。

〔解決手段〕

本発明者らは種々の検討の結果、ヒＨｇＧをβ−ガラク
トシダーゼによって処理することにより得られ、所定の
理化学的性状を有する新規なアガラクトシルＩｇＧを得
ることに成功し、更に該物質の診断上の有用性を確認し
て本発明を完成するに至った。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明アガラクトシルＩｇＧはヒトＩｇＧをβガラクト
シダーゼによって処理することによって得られる。ヒト
ＩｇＧは例えばシグマ社より提供される粉末１ｇＧを人
手して使用すればよい。

β−ガラクトシダーゼによる処理は酵素処理のための通
常の方法によって行えばよいが、後記実施例において示
されるごとくなるべく緩徐な条件で行うのがよく、急云
な反応となることを避けるようにした方がよい。また、
β−ガラクトシダーゼ処理を行うに先立って予めシアリ
ダーゼ処理などの脱シアル化処理を行うのが望ましいが
、本発明はそれらの前処理によって限定されない。ガラ
クトシダーゼ処理後は適当な精製方法、例えばプロティ
ンＡセファロースを使用するアフィニティークロマトに
よって精製すればよい。

本発明アガラクトシルＩｇＧは下記の理化学的性状（ｉ
）〜（ｖｉ）によって特徴づけられる。

（ｉ）分子量１５０〜１７０ＫＯ（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）
（ｉｉ　）抗ヒトＩｇＧ抗体と反応する（　ｉｉｉ　）
プロティンＡまたはプロティンＧと反応する （ｉｖ）　　リシナスコミニスアグルチニン（ＲＣＡ、
□。）と反応しない （Ｖ）コンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ八）、　レンズカリ
ナリスアグルチニン（ＬＣＡ）、パンデーラシンブリシ
ホリャＩｔ　（ＢＳＩＩ）との反応性がヒト１ｇＧより
も大きい （ｖｉ）糖部分が次のａ鎖〜ｄ鎮のみより構成される Ｆｕｃα１ ↓ Ｇ１ｃＮＡｃβ１ ↓ ５Ｏ３−ＰＡＧＥによる分子量測定は常法によって行え
ばよい。抗ヒトＩｇＧ抗体との反応性は例えばシグマ社
のマウス抗ヒＮｇＧ抗体を使用してオフタロニー法ｊこ
より確Ｓ忍すればよい。プロティンＡまたはプロティン
Ｇとの反応性はそれぞれ市販のものに試料をミックスし
、放置後に複合体が形成して沈澱が生ずるか否かを観察
すればよい。リシナスコミニスアグルチニン（ＲＣＡ、
２．）との反応性は、まず試料をニトロセルロース膜に
ドツトプロットし、ここに標識ＲＣＡ　、□。、例えば
パーオキシダーゼＲＣＡＩ２ｏを加え、更に常法により
パーオキシダーゼ基質を加えて発色の有無を観察すれば
よい。Ｃｏｎ　Ａ、　ＬＣＡ、　ＢＳＩＩとの反応性の
大きさを観察するためには、まず試料およびヒトＩｇＧ
をそれぞれニトロセルロース膜にドツトプロットし、こ
こに例えばパーオキシダーゼあるいはビオチンで標識し
た標識Ｃｏｎ　ＡＳ標識ＬＣＡ、標ｍＢｓｎを加え、そ
れぞれ常法により発色させ、試料にあける発色の度合と
ヒトＩｇＧにおける発色の度合とを比較すればよい。

構成糖鎖の分析は水溶らの方法に従って行えばよい。即
ち、試料からヒドラジン分解法（文献６１文献７）によ
りアスパラギン結合糖鎖を定量的に遊離し、これを、Ｎ
−アセチル化後、ＮａＢ’Ｌで還元してトリチウム標識
少糖画分を得、次にこの両分をｐＨ５，４の高圧濾紙電
気泳動で分画し、各両分を直接シアリダーゼ消化し、得
られた中佐少糖混合物をＢｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ−４カラム
を用いた液体クロマトグラフィーにかけて分子サイズに
よる分画を行い、各両分についてその糖鎖構造の帰属を
エキソグリコシダーゼを用いて決定する。

文献 ６）　Ｔａｋａｓａｋｉ、　Ｓ、、　Ｍｉｚｕｏｃｈｉ
、　Ｔ、　＆　Ｋｏｂａｔａ、　Ａ、　：Ｈｙｄｒａｚ
ｉｎｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−１ｉ
ｎｋｅｄ　ｓｕｇａｒｃｈａｉｎｓ　　ｔｏ　　ｐｒｏ
ｄｕｃｅ　　ｆｒｅｅ　　ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉ
ｄｅｓ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　８３　：　２６
３．１９８２゜７）水溶次男、木帽　陽：マーカーの各
種測定法と関連技術の開発−糖蛋白質の糖鎖構造とその
癌性変化、最新医学、　３６：９０１．１９８１゜本発
明アガラクトシルＩｇＧについて上記構成糖鎖の分析を
行うと前記ａ　ｉＪｌ　−ｄ鎮のみが検出される。この
事実より本発明アガラクトシルＩｇＧは全くガラドース
を含有しないことが知られる。

また構成ｕ鎖の存在比率を求めてみるとａ鎖、ｂ鎖、ｃ
ｗＡ、　ｄ鎮ハ（−レぞれ例えば約１：２０：１：４の
比率となる。しかしこの比率によって本発明は限定され
ない。

本発明診断薬は、本発明アガラクトシルｒｇＧを使用す
るりウマチ診断薬であり、従って本発明アガラクトシル
ＩｇＧの用途発明である。アガラクトシルＩｇＧは血清
中のりウマチ因子と結合するのでリウマチの診断に使用
することができる。

本発明診断薬を使用して診断を行う方法は例えば基本的
には以下のように行えばよい。まずニトロセルロース膜
に本発明アガラクトシルＩｇＧを固定し、ここに試料血
清を加えて反応させ、次にパーオキシダーゼＲＣＡ１２
゜を加え、洗浄後パーオキシダーゼの基質液を発色させ
測定する。

この方法において本発明診断薬はアガラクトシルＩｇＧ
を必須の要素として提供しており、測定操作の過程で使
用されるその他の成分、例えば燐酸緩衝液、ブロッキン
グ液、ニトロセルロース膜、パーオキシダーゼＲＣＡ１
２０．　）リス緩衝液、基質溶液、反応停止液等は測定
者の便益のために診断薬のセットの中に適宜に加えれば
よく、これらの添加によって本発明は限定されない。

後記実験例によって示されるごとく本発明診断薬を使用
してリウマチの診断テストを行ったところ、健常人血清
とリウマチ患者血清との間には明瞭な差が観察された。

従って、本発明診断薬により、従来から診断が困難とさ
れたりウマチを簡便かつ正確に診断することができるこ
とがわかった。即ち、リウマチ患者血清中にはりウマチ
因子が存在するので、これはニトロセルロース膜に固定
化された本発明アガラクトシルＩｇＧにトラップされ、
次に標識レクチン、例えばパーオキシダーゼＲＣＡ＋２
ａと定量的に反応し、呈色するに至る。反対に健常人血
清には十分な景のりウマチ因子が存在しないので、パー
オキシダーゼＲＣＡ　ｌ　２゜はアガラクトシルＩｇＧ
と反応せず、洗浄により除去され、その結果、基質を加
えても呈色しない。

〔実施例〕

以下実施例によって本発明を更に具体的に説明する。

実施例１ １、　アガラクトシルＩｇＧの調整法 ヒトＩｇＧタンパク１０＋＋＋ｇ／ｍｌ！を０．１Ｍ酢
酸バッファー（ｐＨ５，０）中でシアリダーゼ処理（５
００ｍＵ／ｒｎｌ）シた後、０．１Ｍクエン酸−リン酸
バッファー（ｐＨ７，０）を加え、β−ガラクトシダー
ゼで処理する。これらの酵素処理後試料溶液量の１０倍
量のグリシンバッフｙ−（１，５ＭＧ１ｙｃｉｎｅ−）
ｔｃｌ、　３ＭＮａＣ１，ｐＨ８，９；結合バフ　７　
ｙ−）を加え、酵素処理溶液中に含まれているＢＳＡあ
るいはシアリダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等を除去す
るために、ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　−３ｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−４Ｂを用いて酵素処理溶液中からアガラクトシル
ＩｇＧを精製した。即ち、予め結合バッファーで平衡化
しておいたｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　−３ｅ−ｐｈａｒｏｓ
ｅ　ＣＬ−４Ｂ　＜　１．　Ｘ　７．８ｃｍ）に酵素処
理試料を添加した後、十分にカラムを結合バッファーで
洗浄した後、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ　（ｐＨ３）に
より本発明試料を回収した。なお、回収の際には、本発
明試料をｐＨ３，０の状態に長時間放置するのを回避す
るために分画容量と同量の結合バッファーをチューブに
入れておいた。

回収後、本発明試料はリン酸バッファー（１０ｍＭリン
酸塩、０．１５ＭＮａＣ１，ｐＨ７，２）に十分透析し
た。

２、調整したＡｇａｌａｃｔｏｓｙｌ　ＩｇＧを適当な
固相体（例えばニトロセルロース膜やカップなど）に結
合させる。即ち、Ａｇａｌａｃｔｏｓｙｌ　ＩｇＧ　（
２５０、ｕｇ／ｒｎｌ）を５０ｒｎＭリン酸バッフｙ　
−（０，１５ＭＮａｃ１゜ｐＨ７，４）に溶かし、その
２０μ２をニトロセルロース膜にドツトブロッティング
を行い、３０分間吸引乾燥を行う。乾燥後、ブロッキン
グバッフｙ−（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　０．１
５ＭＮａＣ１，０，０５％ＮＰ−４０，２，５％ゼラチ
ン（ｗ／ｖ）　、　ｐ）１７．４）でブロッキングを行
い、本発明診断薬とする。

実施例２ （１）調整した試料（１０μｇ／ｍ１２）をＬａｅ＋ｎ
ｍ１ｉ系の５Ｏ３−ＰＡＧｔ！により５〜２０％のグラ
ジェントゲルを用いて、純度および分子量を調べた。

（２）本発明試料が抗ヒＨｇＧ抗体との反応性が保持さ
れているか否かを検討するために、調整した試料（２５
０μｇ／ｍｌ）の２０μａをニトロセルロース膜にドツ
トプロットし、乾燥後ブロッキングバッフｙ　　　（５
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣ１，０，１５ＭＮａＣ１，０
，０５％ＮＰ　−４０，２，５％ｇｅｌａｔｉｎ（ｗ／
ｖ）でブロッキングを６０分間、室温にて行った。

ブロッキング終了後、マウス抗ヒトＩｇＧ−ｐｅｒ−ｏ
ｘｉｄａｓｅ　　（市販の溶液を５００倍に希釈したも
の）５００μβを加えて６０分反応させ、ブロッキング
バッファーで洗浄した後、ＴＢＳ　　（２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣＩ、　０．５ＭＮａＣ１，ｐＨ７，４）でリン
ス後、パーオキシダーゼの基質である４−クロロナフト
ール液を加え、発色を観察した。また、調整した試料を
常法によりＳＯ３−ＰＡＧＢ後ウェスつン会プロットし
、抗ヒトＩｇＧ　−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅと反応させた
。

（３）調整した試料２５０μｇ／ｍｊ！とマウス抗ヒト
ＩｇＧ抗体を用いて、常法によるオフタロ二−免疫二重
拡散法にて２４時間室温にて反応させた。

（４）本発明試料がプロティンＡとの反応性が保持され
ているかを検討するために、調整した試料溶液（１ｍｇ
／ｍ）にプロティンＡ（１ｍｇ／ｍｊり溶液を１０：１
の割合で混合し、室温にて放置し、複合体沈澱物の有無
を観察した。

（５）本試料とＲＣＡ　ｌ　２゜との反応性を検討する
ために調整した試料／２５０μｇ／ｍｊりおよび１ｎｔ
ａｃｔヒト１ｇＧ　　（２５０μｇ／ｍｊりをニトロセ
ルロース膜にドツトプロットした後、ブロッキングバッ
フアーにてブロッキングし、ＲＣＡ１２１１−ｐｅｒｏ
ｘｉｄａｓｅ（１０μｇ／−）を５００μｌ加え、６０
分間反応させた。よく洗浄した後、ｐｅｒｏｘｉｄａｓ
ｅ−基質溶液（４−クロロナフトール）を加え発色させ
、発色の有無を観察した。

（６）本試料と１ｎｔａｃｔヒトＩｇＧの各種レクチン
との反応性の比較を検討するために調整した試料（２５
０μｇ／ｍｆ）　＃よび１ｎｔａｃｔヒトＩｇＧ　（２
５０μｇ／ｍｌ）をそれぞれ２０μａずつドツトプロッ
トし、ブロッキング後、Ｂｉｏｔｉｎ−ｃｏｎｃａｎａ
ｖａｌ　ｉｎＡ　（Ｃｏｎ　Ａ）　、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌ
ｅｎｓ　ｃｕｌｉｎａｒｉｓ　（ＬＣＡ）、Ｂｉｏｔｉ
ｎ−Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ　ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉ
ａ　（ＢＳＩＩ）、Ｂｉｏｔｉｎ−ｐｈｙｔｏｌａｃｃ
ａ　ａｍｅｒｉｃａｎａｌＢｉｏｔｉｎ　−Ｌｙｃｏｐ
ｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ　、　Ｂｉｏｔ
ｉｎ−Ｄｏｌｉｃｈｏｓｂｉｆ　ｔｏｒｕｓ　（２０μ
ｇ／　ｍｌ）を５００μｒ加え、６０分間反応させ、ブ
ロッキングバッファーでリンス後洗浄し、つづいて５ｔ
ｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ＝ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ５００
μｌを加え、６０分間反応させた。反応後、洗浄し、酵
素基質液（クロロナフトール５００μｇ／ｒｒｄ！、）
　３ｒｎｌを加え、発色反応を開始させた。

実施例３ 実施例１で作られたＡｇａｌａｃｔｏｓｙｌ　ＩｇＧを
結合させたニトロセルロースを用い、リウマチ因子の検
出を行った。即ち、固相化Ａｇａｌａｃｔｏｓｙｌ　Ｉ
ｇＧにブロッキングバッファーで５０倍希釈したヒト血
清１ｒｎｌを加え、６０分間室温で反応させ、リウマチ
因子を選択的に結合させる。リンス洗浄後、標識レクチ
ン（ＲＣＡ　、　、　。−ｐｅｒｏｘ　１ｄａｓｅ）を
加え、６０分間反応させた。

洗浄後、酵素基質（４−クロロナフトール；５００μｇ
／ｍ１２．　３ｍｆｆ１）を加え、発色させた。その発
色シグナルにより、リウマチ因子の検出および定量を行
った。発色シグナルの定量化は、Ｄｕａｌ−ｗａｖｅｌ
ｅｎｇｔｈ　Ｆｌｙｉｎｇ−ｓｐｏｔ　５ｃａｎｎｅｒ
　Ｃ５−９０００（胚性）を用い、波長５４０ｎｍで行
った。

結果 （１）調整した試料をしａｅｍｍｌｉ系による５ＤＳ−
Ｐへ肝を行った結果、分子堡約１６万ダルタンに１本の
バンドを認め、他の領域にはバンドは認められなかった
。また、そのバンドの位置は１ｎｔａｃｔヒト１ｇＧの
位置と一致していた（図１）。

（２）調整した試料をニトロセルロース膜にドツトプロ
ットし、抗ヒト１ｇＧ抗体−ペルオキシダーゼと反応さ
せた結果、抗ヒＨｇＧと反応性を示し、抗原性は失われ
ていないことが示された。また、試料をウェスタンプロ
ットし、抗ヒトＩｇＧ抗体−ｐｅｒｏｙ：　１ｄａｓｅ
と反応させた結果、分子量１６万のバンドが染色され、
そのバンドの領域はヒト　Ｉｎｔａｃｔ　ＩｇＧと同一
の位置であり、ＩｇＧであることが示された（図２）。

（３）調整した試料をオフタロニー免疫二重拡散法によ
り抗ヒＨｇＧとの反応性を調べたところ、抗ヒＨｇＧ抗
体と反応し、−本の沈降ラインが認められた。

（４）　　ｗＩ整した試料とプロティン八との反応性を
調べたところ、試料とプロティンＡは反応し、反応して
できた複合体が沈澱となって観察された。

以上の結果は本試料が各種酵素処理によりタンパク質部
分は分解されておらず、ＩｎｔａｃｔＩｇＧと同様の諸
性質、即ち分子量１６万ダルトン（非還元）、抗ヒトＩ
ｇＧ抗体と反応すること、プロティンＡと反応すること
などが示された。

（５）調整した試料をドツトプロットし、Ｒ島１２゜−
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅで反応させた結果、全く反応しな
かった。一方、１ｎｔａｃｔヒトＩｇＧはＲＣＡ＋１ｏ
−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅに強い反応性を示した（表１）
。

これらの結果はインククトヒトＩｇＧのガラクトース残
基を検出するのにはＲＣＡ、２．が有効なプローブであ
ること、また本発明試料は、ＲＣＡ、ｏとはまったく反
応しないことからガラクトースを含まないヒトＩｇＧで
あることを示す。

（６）調整した試料および１ｎｔａｃｔ　ＩｇＧをそれ
ぞれドツトプロットし、各種レクチンとの反応性の違い
を検討したところ、Ｃａｎ　Ａ　、　Ｌ［’Ａ　ＳＢＳ
■が１ｎｔａｃｔヒトＩｇＧと比べて本試料とよく反応
することがわかった（表２）。

表　１　本発明試料のＲＣＡ　、□。との反応性表　２
　本発明試料と１ｎｔａｃｔヒ目ｇＧとの各種レクチン
との反応性の比較 ・本発明試料をＲＣＡ、２゜と反応させると、全く反応
しない。一方、１ｎｔａｃｔヒトＩｇＧはＲＣＡ１２ｏ
に強く反応する。

略語説明およびｆｕｌｌｎａｍｅ ■ＣｏｎＡ　；　ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ＾■Ｐｈｙ
ｔｏｌａｃｃａ　ａｍｅｒ１ｃａｎａ■　しｙｃｏｐｅ
ｒｓｉｃｏｎ　　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ■Ｄｏｌｉｃｈ
ｏｓ　ｂｉｆｌｏｒｕｓ■　日Ｓ−Ｕ　　；　　Ｂａｎ
ｄｅｉｒａｅａ　　ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ■ＰＨ
Ａ−Ｅ４；　ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕ１ｇａｒ＋ｓ■
　ＬＣＡ　；　Ｌｅｎｓ　ｃｕｌｉｎａｒｉｓ■ＷＧＡ
　；　Ｔｒｉｔｉｃｕ＋＋＋　ｖｕ１ｇａｒｉｓ■ＰＮ
Ａ　；　Ａｒａｃｈｉｓ　ｈｙｐｏｇａｅａ・Ａｇａｌ
ａｃｔｏｓｙｌ　ＩｇＧと１ｎｔａｃｔ　ＩｇＧの各種
レクチンとの反応性を調べた。１ｎｔａｃｔ　ＩｇＧと
はほとんど反応しないかわずかしか反応しないレクチン
の中でＣｏｎＡ、　ＬＣＡがＡｇａｌａｃｔｏｓｙｌ　
ＩｇＧとは強く反応するようになる。また、ＰＨＡ−Ｅ
、は、Ａｇａｌａｃｔｏｓｙｌ　ＩｇＧ　１１！：Ｉｎ
ｔａｃｔ　ＩｇＧの両者に強く反応する（反応の場合は
＋、−で表示し、十は陽性、は陰性を示す）。

〔発明の効果〕

実験例 １、試料 慢性関節リウマチ患者および健常人血清を調整し、実験
に使用した。

方法 Ａｇａｌａｃｔｏｓｙｌ　ＩｇＧ　　（２５０μｇ／−
）をリン酸バッフｙ−（５０ｍＭリン酸塩、　０．１５
ＭＮａＣ１，ｐＨ７，４）に溶解し、その２０μｌをニ
トロセルロース膜にドツトプロットし、乾燥後、ブロッ
キングバッフｙ−［５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　０．
１５ＭＮａＣｌ。

０．０５％ＮＰ−４０，２，５％ゼラｆ”Ｊ　（Ｗ／Ｖ
）、　ｐＨ７，４〕でブロッキングを行い、リウマチ因
子の検出および定量に用いた。

ＲＡ患者および健常人血清をブロッキングバッファーで
希釈後、上記Ａｇａｌａｃｔｏｓｙｌ　ＩｇＧをプロッ
トしたニトロセルロース膜に加え、６０分間室温にて反
応させリウマチ因子を選択的に結合させる。反応後、ブ
ロッキングバッファーで軽くリンスし、５分間の洗浄を
２回繰り返した後、ＲＣＡ＋　２Ｏ−Ｐｅｒｏｘｉｄａ
ｓｅ（１０μｇ／　ｍｊ２）を５００μ！加え、６０分
間、室温で反応させる。

反応後、上記と同様の方法でリンス、洗浄を繰り返した
後、ＴＢＳ　（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、０．５
ＭＮａＣ］、ｐＨ７，４）でリンスした後、ペルオキシ
ダーゼの基質溶液（４−クロロナフトール；５００μｇ
／ｍ１．）を加え、発色反応を開始する（５〜１０分）
、反応終了後、蒸留水でよく洗浄した後、乾燥し、ニト
ロセルロース膜上の発色シグナルを定量化した。定量化
はＤｕａｌ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈＦｌｙｉｎｇ−ｓｐ
ｏｔ　５ｃａｎｎｅｒ　Ｃ５−９０００（胚性）（λ＝
５４０ｎｍ）によって行われた。

結果 リウマチ患者７例、健常人６例の血清を用いてリウマチ
因子の検出、定量を行った結果、平均カウント数が健常
人で（８４０３）　、’Ｊウマチ患者で（３１１０８）
の結果が得られ、Ｒへ患者グループで高値を示すことが
判明した（図３）。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明試料及びヒトＩｇＧについて５Ｏ８−ＰＡ
ＧＥ後、クーマシープル染色によりバンドの検出を行っ
た結果を示す図である。なお、試料はどちらも還元処理
はしていない。 図中、１のレーンは本発明試料（ヒトＩｇＧをシアリダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ処理して得たＡｇａｌａｃ
ｔｏｓｙｌ　ＩｇＧ　）を、２のレーンはヒトＩｇＧ　
　（酵素未処理）を示す。 図２は試料をウェスタンプロットし、マウス抗ヒトｒｇ
Ｇ抗体−ｐｅｒｏｘｉｄａｒｅで処理した後、発色させ
バンドの検出を行った結果を示す図である。なお、発色
は４−クロロナフトールを用いた。 図中、１のレーンは本発明試料（ヒＨｇＧをシアリダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ処理して得たＡｇａｌａｃｔ
ｏｓｙｌ　ＩｇＧ　）を、２のレーンはヒトＩｇＧ　　
（酵素未処理）を示す。 図３はＲＡ患者及び健常人血清中のリウマチ因子をＲＣ
Ａ　Ｉ　２゜でステイニング後、それぞれのカウント数
を比較したグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ヒトＩｇＧをβ−ガラクトシダーゼによって処理し
   て得られ、下記の理化学的性状（ｉ）〜（ｖｉ）を有す
   るアガラクトシルＩｇＧ＿０（ｉ）分子量１５０〜１７
   ０ＫＤ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（ｉｉ）抗ヒトＩｇＧ抗体
   と反応する （ｉｉｉ）プロテインＡまたはプロテインＧと反応する （ｉｖ）リシナスコミニスアグルチニン（ＲＣＡ＿１＿
   ２＿０）と反応しない （ｖ）コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、レンズカリナリ
   スアグルチニン（ＬＣＡ）、バンデーラシンプリシホリ
   ヤII（ＢＳII）との反応性がヒトＩｇＧよりも大きい （ｖｉ）糖部分が次のａ鎖〜ｄ鎖のみより構成される ａ鎖）▲数式、化学式、表等があります▼ ｂ鎖）▲数式、化学式、表等があります▼ ｃ鎖）▲数式、化学式、表等があります▼ ｄ鎖）▲数式、化学式、表等があります▼ ２　請求項第１項記載のアガラクトシルＩｇＧを使用す
   ることを特徴とするリウマチ診断薬。 ３　アガラクトシルＩｇＧがニトロセルロース膜に固定
   化されることを特徴とする請求項第２項記載のリウマチ
   診断薬。